Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Мембранные гликопротеины мозга цыплят после зрительного импринтинга

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Мембранные гликопротеины мозга цыплят после зрительного импринтинга"

АКАДЕМИЯ НАУК ГРУЗИИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИЯ им. И. Ь. ЕЕРИТДШВИЛИ

На правах рукописи

МАЧАИДЗЕ Гиа'Геронткевич,

МЕМБРАННЫЕ ГЛИКОПРОТЕЯНЫ МОЗГД ЦЫПЛЯТ . ПОСЛЕ ЗРИТЕЛЬНОГО ИМПРИНТИНГЙ

03.00.13.- Физиология человека и животных 03.00.04.- Биологическая химия

АВТОГЕФЕРЯТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ТИьЧИС ¡' - П';^

Работа выполнена в Институте Физиологии им. И. С. Беригаивили АН Грузии

Научные руководители: доктор биологических наук

Д. Г. МИКЕЛАДЗЕ доктор биологических наук Р. О. СОЛОМОНИЯ

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук А. Р. КЕЗЕЛИ.

кандитат биологичеслих наук Т. М. ЗЯАЛШНВИЛИ

Ведущая организация:

Защита состоится

ЩШЛ Тбилисского Института усовершенствования врачей МЗ Грузии

—й£_ 1992 г. в час

на заседании специализированного совета д 007. 09. 01 при Институте физиологии им'. И. С. Бериташвили' АН Грузии (380060, Тбилиси,ул. Гогуа, 14).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии им. И. С. Еериташрили АН Грузии. Автореферат разослан __Ш__1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат 6и;.л"ги <<-ских наук

Н. Г- ЕУКИЯ

-i'ii^J ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИК/! РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Исследование молекулярных основ памяти является одной из актуальных проблем современной нейробиологии. Не смотря на то, что Интерес к нейрональным основам хранения информации в мозгу имеет длинную историю и за последние два десятилетия достигнуты немалые успехи в анализе процессор хранения следов памяти, многие вопросы остаются еще неясными. Следует отметить,что успешное изучение этой проблемы зависит от адекватной модели ис-"следования

Существует тип обучении, который может быть удобным предметом экспериментального анализа, - импринтинг у домашней курицы. .]снятие об импринтинге (запечетлевание) было впервые введено Лорени >к (Lorenz,1937). Это явление заключается в установлении связи в определенный период жизни с объектами внешней среды. Импринтинг присущ детенышам тех видов животных, .к от ори. способны ходить и ьегать через несколько часов после- рождения. Птенцовый импринтинг - это процесс, посредством которого у молодых птиц Формируется привязанность к матери или к ее искусствекной замене На сегодняшний дет импринтинг является одной из лучших моделей для изучения и анализа биохимических механизмов обучения и хранения информации. (Horn, 1985) На основе многолетних мультидисциллинарных исследовании доказано, что участком мозга цыплят, -■тветственным за выработку и хранение предпочтения в процессе импринтинга, является интермедиальная часть медиального вентрального гиперстриатума (НМВГ) мозга цыплят (Horn, 1985).

Следует также отметить Факт наличия асимметрии между полушариями мозга цыплят при обработке имг:инт-информации ЙМВГ левого полушария Обладает функцией хранения следов памяти импринтинга и сам является его хранилищем, а ИМВГ правого пелушария играет роль "временного буфера" хранения следов памяти импринтинга (Horn, 1985).

Все выше перечисленное указывает на t-идъшую актуальность исследования биохимических основ памяти на модели имприйтинга У птиц.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего л сл-давания бы

ло изучение биохимических исследовании иа уровне м ем бра йнызг структур ИМВГ ноз:о цыплят после процесса зрительного импркнтинга и соответствующих контрольных манипуляций. Основное внимание уделялось гликопротеиновым компонентам мембран.

Для достижений данной цели были поставлены следующие задачи: выявлены* количественных и качественных изменении гдвкозо- и ман-ноэосодс-ржажих гликопротеннов ь ИМВГ мозга цыплят в' процессе консолидации следов памяти импринтинга; изучение перераспределения наружных белковых компонентов мембран; Выявление доказательства и количественный анализ участия в вышеуказанных процессах белков адгезии нейрональных клеток (К-БКА); отработка быстрого метода его очистки.

Научная новизна результатов исследования. Впервые показано, что процесс консолидации следоь памяти - импринтинга сопровождается увсдич.'-нием количества гликопротеннов с молекулярными массами 180 и 170 КД. Обнаружено, что часть из них Соответствует Н-БКА. Увеличение количества Н-БКА лрямо пропорционально степени запоминания характеристик импринт-объекта. Полученные данные впервые демонстрируют участие имиуногяобулнно-подобных белков клеточной адгезии в процессах консолидации следов памяти. Охарактеризированнь: мембранные гликопротепны нейрональных и глиальных клеток мозга куриных эмбрионов.

Теоретическое н практическое значение работы. Изучение количественного и качественного изменения синаптосомальных гликопроте-инов в ИМВГ мозга цыплят во время импринтинга имеет существенное значение б понимании нейрохимических механизмов процесса консолидации следов памяти.

Идентификация мембранных гликопротеннов, возрастание количества которых наблюдается в результате обучения, может указывать на перераспределение мембранных компонентов во время развития нервной системы, что в свою очередь, может служить моделью для рассмотрения изменении нервной системы во время эволюционного развития.

Специфическое увеличение количества Н-ЕКА после зрительного импринтинга дает возможность по новому взглянуть на роль инмунс-глобулино-подобных молекул в процессах фиксации следов памяти. Изучение роли таких б*, я ков, котст'их считают эволюционными предшес-

-•.твенникдми современных-иммуноглобулинов, также может* иметь существенное значение для- понимания, пластичности <и развития нервной системы. *"

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на X Объеде-■ й'енном Симпозиуме Биохимических Обшеств СССР и ГДР (Ташкент, 1989), на XX Симпозиуме Федерации Европейских Биохимических Обществ (Будапешт, 1990), на заседании ученого' совета Института физиологии АН Грузии.

Публикации. Основные положения диссертации изложены ь 5 опубликованных работах.

Структура и объем работы.. Диссертация изложела на ¡0i> страницах машинописного текста и состоит из введений оьзора литературы, экспериментальной части, результатов исследования и их обсуждения,, выводов и списка цитируемой литературы. Библиография содержит ]2Ь источника, в том .чиеле ЦЬ зарубежных авторов

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ физиологическая часть эксперимента. Для экспериментов использовались цыплята обоих полов породы белый леггорн. Эмбрионы ъа день до вылупления изолировались в отдельные коробки для устранения каких-либо внешних раздражителей. Как до вылупления, так и после, цыплята содержались в темноте. Эксперименты проводились через 17-20- ч'асов после вылуплений, в сенситивном периоде. Во всех экспериментах цыплят разделяли на три группы: т'емновую контрольную, световую контрольную и импрмнтированную. Каждая группа состояла из 12- 14 цырлят, Импринтинг проводили 'на аппарате Хесса (Hess. 1959) . Нмпринт-объектом служил красный полиэтиленовый цилиндр диаметром 10 см, высотой 14 см, с внутренной лампой. Световой прибор •вращался по кругу с радиусом 60 см. Экспозиция импринт-объекта продолжалась 30 минут. За указанное время цыпленок успевал пробежать не менее 10 кругов, что соответствует приблизительно 25 метрам. Цыплята, которые не следовали за импринт-объектом в течение первых 5-7 минут не использовались в опытах. Животные световой контрольной группы за тот же период времени освещались диффузным светом. После экспозиции цыплят из пмпринтированных и световых контрольных групп возвращали в инкуба ор и до момента декапитации

держали в темноте, в отдельны* коробках: В случав врей'енноА точки - 27 часов после начала эксперимента згивотные в течение '20 минут подвергались дополнительной тренировке' (импринтированная группа) или о сведению, диффузным -светом (световая контрольная - группа) 24 часа спустя' после первой серий эксперименту. После декапитации производили экстирпацию ИИВГ раздельно от каадого полуиария,' согласно методике Хорна (Horn, 1991). Фракции 1ШВГ хранились в жидком азоте. ■ ' .'

Определение уровня предпочитаемости. Для определения степени гпецифичносги импринт-памяти использовали те-ст предпочитаеиости, который проводился следующим образом: спустя "24 часа после первой сесий тренировки цыплятам в течении 5 минут предъявляли aap такой же Формы, как при первой сесий, но желтой'окраски. После Ь минутного перерыва цыплятам в течении 5 минут предъявляли тот же шар, но уже красной окраски. В обоих случаях рёакикк следования измеряли количеством кругов следования за нмпринт-объектом..

Уровень предпочитаеиости определяли по следующей формуле: Ур предп = к-во кругов следования по знакомому объекту х j00

суммарное к-во кругов следования по _ обоим объектам Идентификация и определение количественных изменении конкана-

валин-fl-связывающих белков мозга цыплят. Для идентификации мембранных гликопротеинов основывались на реакцию высокого сродства лек-тина из растение Canavaiia ensiformis крнканавалина'--й-'-.к остаткам глюкозы и маннозы в гликоконьвгатах. Эксперименты проводили на мембранной фракции НМВГ цыплят, которая подвергалась осмотическому шоку, согласна методике Котман и сотр. (Cotaan et al., 1974). Полученный осадок растворяли в 5%-ном растворе. ДДС-Na. Количество белка определяли по методу Петерсона (Peterson, 1974). После добавления некоторых дополнительных компонентов (трис-HCl pH 8.0., f-меркаптоэтанол и глицерин) образцы с равным количеством белка (в области 70-80 мкг) разделяли электрофорезом в градиенте полиакрил-амидного геля (5-12%) в присутствии ДДС-Ыа. Электрофоретическии перенос белков с полиакриламидного геля на нитроцеялюдозные фильтры (размер пор 0.22 мкМ) проводили ло методу Барнет (Barnette, 1931). Б последствии фильтры инкубировались в течение 1 часа в 10% растворе бычьего сывороточного альбумина (БСЙ), затеи в течение 2

часов » 50 мИ На-<$>ос4ютном буфере рН 7.4., 200 мМ NaCI, БСА и

дав, -' • .. в

1-конканаваяин й (0.1 мг/мл, 1x10 ийп/мин). Фильтры промывались Б раз Иа-фосфагиым солевым буфером, содержащим также 15! NP-40. После высуниваний Фильтры экспонировали в течение 12-24 «сов с применением рентгеновской пленки РМ-В. Специфичность выявленных полос контролировалась инкубированием Фильтров (с тем же количеством белка) "а буфере, содержащего кроме иодированного, лектина так-хе «-метилманозид и «-метилгликозид в конечной концентрации 0.2 М. Построение калибровочной кривой для определения молекулярных масс производилось набором высокомолекулярных белковых стандартов (Sigma, США), хоторме также подвергались блотингу и окрашивались " кумассм R-250 (Burnette, 1981). Проявленные рентгеновские пленки сканировались на лазерном денситометре Ультраскан 2202 (LKB, Швеция) .

125

Исследование вкйюченйя_I-диазогозированнои иодосульФаниловойкислоты g мембранные белки мозга цыплят. Мембранная Фракция ИКВГ мозга цыплят пбсяе. осмотического шока, (Catman .et al.. 1974) промывалась еще 5 раз центрифугированием и использовалась для ре-

12В

акции иодинирования 1-диазотизированной иодосульфониловой кислотой» Реакции иодинирования проводили специальним набором от фирмы шк (США) по рекомендациям фирмы-изготовителя и по Сеарс и др. (Sear&;et al., 1971). Siод'инированию подвергали строго одинаковые количества белков во.всех образцам После реакции иодинирования мембраны „промывали от компонентов реакции центрифугированием 5 раз, вторичнй определяли количество белка согласно методу Петерсо-на (Peterson, 1977)"и количество включенной радиоактивности. Одинаковые количества белков разделяли эяектрофоретически на градиенте полиакриланидного геля (5-12%) в присутствии ДЦС-Na. К-ли окрашивались кумаси R-250, высушивались и экспонировали в течение 1224 часов с применением рентгеновской пленки РМ-В. Проявленные пленки сканировали на лазерном денситометре Улътраскан '202 (LKB, Швеция).

Идентификация и определение количественных изменении Н-БКД мозга цыплят. Идентификация разных форм Н-БКЯ чемьран ШВГ цыплят осуществлялась с п.>моаью высокоспе.шфичных поликлональных антител, которые лвбезно были предоставлен!, ш Проф. Едсльманом и Кроссиным

из Рокфеллерского Университета (Нью-Йорк, СЕД).

Получение мембраных фракций ИМВГ мозга цыплят, определение количества белка, электрофорез и блотинр осуществляли также, как' описано выше. Нитроцеллоэиые фильтры Инкубировались в течение 1 часа в растворе 10%-го БСА, а затем 1 час D растворе 50 мЫ Ыа-фОсфатного буфера, содержащего в конечных концентрациях: 1К БСА, 150 мМ N&C1, 0.6Х детергента Tweeii Z0 и 0.1 мг/мл кроличьих поликлональных антител против Н-БКА. Фильтр отмывали от антител 4 раза тем же буфером без антител и с повышенным содежанием детергента - 0.6%. Продолхите^ность каждой отмывки составлял 15 минут.

Фильтры снова инкубировались э течении 1 часа в растворе 10%-го

126

БСА, а затем в фосфатно-солевом буфере, содержащем 1-меченные антитела от свиньи (DAKO PAT) против иммуноглобулинов кролика. Фильтры отмывали как описано выше в случае первичных антител, сушили и подвергали экспозиции в течение 3-4 дней с применением рентгеновской пленки РМ-В. Проявленные пленки сканировались на лазерном денситометре Удьтраскан 2202 (LKB. Швеция).

Хроматография на белок-А-сефарозе 4В. Белок-А-сефарозу 4В синтезировали реакцией BrCN-активированной сефарози 4В (РЬвг&тьЫь, Швеция) с белком-A иь Staphilococus Aureus согласно рекомендациям фирмы-изготовителя Количество связанного белка равнялось 2 мг на 1 мл сефарози 4Б.

Синаптосомальную Фракцию мембран из переднего мозга однодневных цыплят выделяли по методу Джонс и .Матус (Jones_ and Matus, 1974). Осажденную синаптосомальную фракцию суспендировали в буфере: 50 мМ трис-НСЗ pH 7.4 и добавляли равный объем того же раствора дополнительно содержавшего 2% детергента ХАПС. После 1 часового встряхивания при 4°С раствор центрифугировали при 100000g в течение .1 часа. Полученный супернатант разбавляли трнс-буфером в б раз, из расчета, чтобы концентрация детергента снизилась до 0.2%, и добавляли NaCl до конечной концентрации О.ЗМ. Белковый раствор наносили на колонку белок-А-сефарозы 4В, которая была предварительно уравновешена тем же буфером. После промывания колонки, проводили элюцию связанных белков 0.1М глициновым буфером pH 3.0. Элюат диализнровалн против лоды, упаривали и разделяли электрофо-ретическ.«. Ямовцн* геля окрашивали красителем кумасси R-250, а

"ругук> половину подвергали блотингу и-: иммунрхимйческой обработке антителами против н-БКА, как было олисанпо выше.

г-. -

Получение первичных, «ейрональных, глиальных и нейронально-гли-з.аьных, культур с переднего мозга куриных эмбрионов. Первичную клеточную'культуру нейронов получали с переднего мозга' 7-8 дневных «уриных эмбрионов е помощью механической диссоциации,, проведением гкани через специальные сита с размерами пор 48 мкм (Booher arid

Sensenbrenner', '1972) и засеиванием на чаши Петри (диаметр 2.5 см),

в

юкрйтых пбли-Ь-лизином,'. с частотой. 5x10 . • клеток на час./

;Senaenbrenner et el.. .1978). Клетки дергали в минимальной среде

!гла' (2;5мл .на'чашу) . содержащей 20% телячьей фетальной • сыворотки

Flow. Англия). В этих культурах практически не наблюдается нали-

|.ие гдиальных клеток (Sensenbrenner et al. , 1978).

Первичную глиальиую клеточную культуру получали с переднего

юзга 14 дневных куриних эмбрионов с помощью механической диссоци-

щии, проведением ткани через специальные сита с размерами пор 48

[км и засеиванием на чаши Петри (диаметр 2.5 см) без специальных

в

юкрытйй. Частота засеиваемых клеток равнялась 3-4x10 . Клетки дер-али в минимальной среде Игла, содержащей 10Я телячьей фетальной :ывор<М?ки. Б этих культурах практически не наблюдается наличие не-рона'згмшк клеток (Kaderspach and Fajsi. 1S83);

Смешанную нейронально-глиальную культуру получали с переднего озга 8-9 дневник куриных эмбрионов с помощью механической диссс-иации, проведением ткани через специальные сита с размерами .пор

3 микрон (Booher and Sensenbrenner, 1972).- Клетки засевали на ча-

g

и Петри покрытых колагеном или без покрытии с частотой 10 клеток а чаву.

Идентификация конканавалин-А связывающих белков клеточных мем-раь в нейрональных. гдиадьных и смешанных нейронально-глиальных ультурах. Эксперименты для идентификации конканавалин-А связываю-их мембранных белков для нейрональных культур проводили на пятый ень культивирования, для глиалышх культур - на одиннадцатый день ультивирования', а для смешанным непронально-глиальных культур а восьмой день культивирования. Во всех с/учаях культуру тшатель-о промывали раствором Хенкса, клетки соскребали и гомогенизирова-и в буфере 50 мМ трис-HCl рН 7.4 содержащего 1 мкм ЛМСФ. После

осаждения едер;:оГ; фракции супернатант центрифу'гироАали на 100000 g в течение 1 часа. Полученный осадок растворяли -fi растворе 5%-го ДДС-Na, определяли количество белка по методу Петерсона (Peterson et al., 3977) к идентифицировали конканавалин-А связывающие белки вышеописанным истодом (ст.р. 6).

Иоднрозание белков. Мечение- белков (конкакаваднм-А и антитела свиньи против лкауноглобулииов кролика) радиоактивным иодом проводили с помощью реакции хлорамина Т (McConaliey and Dixon, 1980). В обоих случаях уа 1 иг белка использовали 250 икг хлорамина Т, вре- . мя реакции составляло .5 минут. Иодированный белок очищали от ком-.понентов реакции хроматографией на'биогеле Р-10.

Статистическая обработка результатов. Для оброботки получен-. ных результатов использовали метод вариационного анализа, которые обработана ли программой MICB0STA.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Исследование перераспределения наружных мембранных компонентов

ИМВГ мозга цыплят после зрительного импринтинга. Для исследования

перераспределения наружных мембранных компонентов ИМВГ мозга цып-ize

лят была использована I-диазотизированная иодосулфониловая кислота (ДАИСК), которая широко применяется для исследования анатомии и Функций мембран.

... Результаты исследования перераспределения наружных мембранных компонентов ИМВГ цыплят 3.5 часа спустя после начала импримтирова-ния и освещения диффузным светом представлены в таблице 1 и на рис. 1.

Как видно из полученных результатов, процесс-освещения диффузным светом сопровождается резким уменьшением включения (~ 1.6раза) меченной ДАИСК о наружные мембранные белки ИМВГ цыплят. В сбою очередь, процесс импринтинга также сопроваждается резким уменывени-ем включения радиоактивности по сравнению с образцами ИМВГ цыплят группы светового контроля (~ 2раза), таблица 1. На рис. 1 представлена радиоавтограмма иодированных белков ИМВГ после их разделения в градиенте полиакриламидного геля. Результаты денситометрии указывают, что данный процесс затрагивает более или менее все белки и не является специфичным для определенной группы белков.

- И

12С

яблица 1. Включение - •. I-ДАИСК в мембраны ИМВГ цыплят-в зависимости г экспериментальных условии.

Участок мозга цыплят и экспериментальные условия. г 1ÏC .Количество включенной ■ • 1-ДАИСК (пмоль/мг белок)

ИМВГ левого полушария, группа имприктинга. 1.6230Î0.110

.ИМВГ правого полушария, группа импринтинга-. '1:652±0.095

■ИМВГ левого полушария, группа светового контроля. 3.163Î0.252

ИМВГ правого полурария, группа светЬвого контроля. • 3.329*0.275

• ИМВГ левого полушария, группа темнового контроля. 4.740-0.333

ИМВГ правого полушария, группа темнового контроля. 5-.482i0.352

Полученные результаты указывают на ощутимые изменения анато-ши мембран ИМВГ после импрингинга и освещения диффузным светом. 1ри этом, гораздо сильные .изменения наблюдаются в группе обуче-

125

шя • Уменьшение включения 1-ДИЯСК может быть объяснено измекени-гм ультрасгруктуры синаптических контактов, вызывающих уменьшение юступа реактива к. наружным мембранным белкам или повышенным погружением наружных белков в мембранный матрикс.

Согласно результатам данных исследовании ИМВГ правого и левого полушария импринтированных цыплят по указанным характеристикам ме отличаются друг от друга. В то же время, наблюдаестя больаая разница между группами обучения и светового контроля. Исходя из этого мы предполагаем, что данные изменения являются характерными для промежуточной обработки имлринт - информации, и выражается в одинаковых биохимических сдвигах в ИМВГ как правого, так и левого полушария обученных цыплят.

Б В Г

126

Рис. 1. Радиоавтограмма иодированных 1-ДАИСК белков мембран

ИМВГ после их разделения электрофорезом в градиенте полиакриламид-ного геля. А -ИМВГ левого полушария, группа импринтинга, Б - ИМВГ правого полушария той же группы, В -ИМВГ любого полушария, группа светового контроля, Г -ИМВГ правого полушария той же группы, Д ИМВГ левого полушария, группа темпового контроля, Е - ИМВГ правого полушария той же группы.

• 'ду:-.?.!'," ь "О.г.-.'шс;г-сячуч к'^-мсяевня кон*;>»г>н<>япп-А см •

rjLi:::nnporet<!;f <) • 5' ^! г Л v.; ¡'Г ;ч0Д*.'Д нь'плгт noc.'g -ритс-ть- ■ ясго • .:ri?..?:v,iifro. Иол;"-.об уси.тсгном л::.;; г-п-е-гн;:; ¡.егиуг-соргд«'.^:чни его <'е.\:совы:! ксч~

лог.г,!.гоз ло яродсисо е-ОЛю;:;:!:. из^тстчо такзе из других ?кс-

данник, что процесс обрлйоткч is яр.-.ксния

г

чнФопггщшг. согтрсвэгу,jrcn,»c!nsr.u sxr^teiu.n Н--У;у.ози :> сииэпти-:ес"!>Х гямк«-,'.трт-япиг косгл додаст (Содопонч;:, Кякехллсг, 1306). :>ют Щкт гк«г"!5пвт iw »кт.г.^сч4 у?зстке «предвтсипмх глнкопротен-.hod а гц/оцссепя иг.врмитккгл. Целг» па стоял.;; к исследования являлась *|дект(?}ккАцня кеккрот;;«:« пц-.дстасателвй гликопротеинов, специфически участвующих в этих процессах. Для этого ми использовали лехтип коикпкавалг.н-Л, который с высоким сродством связывается•с остатками глюкозы я маннозы з глнкопротеинах.

Для предварительной идентификации гликопротеинов использовали мембранную Фракции ИМВГ мозга цыплят, находящихся в темноте, в возрасте 20 часов после вилуплен'ия. Было показано, что иодированный лектин специфически связывается с 10 гликовратеинами, имеющие, молекулярные массы 240; 220; 205; 190; ,160; 170; 140; .115; 95; и 70 КД, (рис. 2). Наличием перечисленных гликопротеинов характеризуются мембранные фракции ИМВГ как левого так и правого полуиария, хотя при этом количество гликопротеинов в ИМВГ правого полушария изначально на .20% выи®-.п« .сравнению с левым. Исследование распределения конканавалйн-fl связывающих белков после зрительного имприн-тинга и освещения диффузным светом показало, что эти два процесса по сравнению, с образцами темнового контроля не сопроваадаются синтезом качественно нового белка, хотя наблюдаются некоторые количественные изменения (рис. 2). Денситометриче-ский анализ радиоауто-грамм указывает, что во время этих двух процессов имеет место некоторое (недостоверное) снижение суммарного количества гликопротеинов. На общем Фоне понижении количества гликопротеинов в ИМВГ левого полушария, по сравнению с соответствующими контролями, наблюдается увеличение количества белков (40±б.5%) с молекулярными массами 180 и 170 КД.

Полученные результаты указывают, что процесс нмпринтинга и освещения диффузным светом не сопровождается тотальным повышением

Рис. 2. Конканавакин-А связывающие гликопротеииы мембран 1ШВГ мозга цыплят. Б случае групп нмпринУинга и светового контроля исследования проводились 3.5 часа спустя после начала' эксперимента. 1 - ИМВГ левого полушария - группа импринтинга, 2 - ИМВГ правого полушария тойже группы, 3 - ИМВГ левого полушария - 'группа светового контроля, 4 - ИКВГ правого полукария той' же группы, 5 - ИМВГ левого полушарив, группа темпового контроля, 6 - ИМВГ правого полушария той же группы. Молекулярные пассы обозначена в КД.

количества к-оиканаваямн-Л ■ свг^апаяяих глпкопротеинсв я синтезом количественно нового гликопротвинл, напри этом консолидация еле-лов оапечзтьггания ассоцируегсп повышением количества конкаиалин-А •сзазывавпч'ч белков 1Й0 и 170 КД,

,Г!о данном Будок и сотр. (HuHock et л1., 1900) обучение к па-сснснтау избеганию у цыплят -сопровождается снижением количества гликопротемиов с молеасулпрнким кассами ISO и 170 КД. Из за многих существенная различии между этими исследованиями, >: которым, в пергу» очередь относятся разике модели исследовании, разные мембранные Фракции, разные участхи'цозга и т. д. , не является возможным прямое сопоставление этих результатов,, но на наш взгляд, оба из них указывают на исключительно важную функциональную роль мембранных' гликопротеинов с молекуляныии массами 380 - и 170 КД.

Определение количественных изменении Н-БКА в мембранах ИМВГ цыплят после зрительного иипринтинга. Одным из главных форм Н-БКА мозга'цыплят является белок с молекулярной массой 160 КД, который синтезируется в постэмбриональном периоде развития. Н-БКА характеризуется высоким содержанием полисидловой кислота, а также наличием больших количеств остатков маннозы. Таким образом, исходя из величины молекулярной массы и'наличия остатков маннозы в белке, можно предположить, что гликопротеины, имеющие молекулярную массу в области 180 КД и связывающие конканавалин-А, могут быть Н-БКА.

Для идентификации Н-БКА"ислользовались специфичные антитела, которые в,последствии детектировали иодированными вторичными антителами. Данные' проведенных опытов указывают, что 3.5 часа после начала эксперимента в ИМВГ левого полушария обученных цыплят по сравнению с .соответствующими контролями наблюдается достоверное увеличение (~45%) количества изоформы Н-БКА с молекулярной массой 180 КД.(Н-БКЙ мозга цыплят характеризуется наличием разных изоформ, что объясняется различным сплайсингом транскрипта гена Н-БКА, а также разным количеством полиеиаловой кислоты в молекуле). Повторная экспозиция импринт-объекта опять иницирует в ИМВГ левого полушария импринтированных животных более резкое увеличение не только количества изоформ Н-БКА 180 КД (по сравнвнию с правым полушарием ~5G?i, а по сравнению с ИМВГ левого полушария световых контрольных цыплят ~200»),а также изоформ Н-БКА 140 и 315 КД. Надо

огмемить, что кроме увеличения , количества пеие^шсженных. .#аоформ Н-БКД в образцах ИМВГ'левого полушария импинтнрованных цыплсг идентифицируется белок специфический реагирующий с антителами против Н-БКА с молекулярной массой 85 КД. Наличие аналогичного белка в осталтых образцах-не обнаружено (ри.с. 3).

1 2 3 4 5 ' 6

Рис. 3.Мембранные бедки ИМВГ. иозга цыплят реагирующие с антителами против Н-БКД. В случае, групп импрингинга «светового контроля исследования проводились 27 часов после начала эксперимента, возраст цыплят группы темнового контроля соответствовал 45-55 часов '.после Еылупления. 1 - ИМВГ левого полушария.- группа светового контроля, 2 - ИМВГ правого полушария той же группы, 3 - ИМВГ левого полушария, группа импринтинга, 4 - ИМВГ правого полушария той же группы 5 - ИИБГлевого полушария- группа темнового контроля, 6 - ИМВГ правого полушария той же грулш. Молекулярные массы обозначены в КД.

.По полученный данным,- гяиколротеины, количество которых специфически увеличивается в ИМВГ левого полушария мып.лят, после обу чения {-импринтйнга), могут соответствовать Н-БКА. При этом, н. исключается возможность, что в этой фракции присутствуют другие кёидентифицированные гликолротейны, количество которых также уве лйчирается после имприлтинга. Интересным является наличие в оораь цах ИМВГ левого-полушария обученных цыплят белка с молекулярной массой 85 КД, который практически отсутствует в других образцах и реагируюет с антителами против Н-БКА. Исходя из того, что минимальная молекулярная касса Н-^БКА соответствует 120 'КД, вероятно, что:обнаруженный белок продукт протеолитического расщепления но определенной индивидуальной изоформы Н-ЕКА, синтез которого . ,с-ци-фически активируется в экспериментальных условиях. Не исключено. также, что белок с молекулярной массой 85 КД является продукте.--, гомологичного гена Н-БКА.

Исследование зависимости количества Н-БКА от ур ьня предпо-читаемости инпринтированкя у цыплят. Результаты прс г, ид у а и> опы тов указывают, чт>. проце сс обработки и хранения импричт-лиформашп: связан с увеличением количества Н-БКА с молекулярной массой lf¡c 'КД. Для дальнейшего подтверждения этого результата был<ч исследована зависимость количества Н-БКА ISO КД от уровня прсдпочитаемо'сти к знакомому импринт-объекгу. Данные проведенных опытов приведены на рис. 4. Kaíí видно из' полученных результатов, увеличение, количества Н-БКА 180-~КД строго пропорционально возрастанию уровни пред-почитаемости у цыплят. Для других изоформ Н-БКА такая зависимость Нё наблюдается. Таким образом, полученные результаты являются доказательством' того факта, что увеличение количества H-FKA не представляет собой побочный эффект эксперимента, а является строго специфичным для обработки и записи следов импринт-памяти.

Очистка H-SKfl из мозга цыплят хроматографией на белок-Д-сефа-розе 4В. Как отмечалось, Н-БКА имеет сходство с иммуиоглобулиновы-ми белками по аминокислотной последовательности . При этом, аминокислотная последовательность Н-БКА имеет аналогию как с константными, так и вариабельными участками иммуноглобулинов (Cunningham et al., 1937). Исходя из упомянутых свойств Н-ГКА нами была предпринята попытка его очистки на белок-Л-сефароз£ -1В. Известно, что

белск^А из Stafilococus Aureus специфически взаимодействует с ии-муноглобулиновыми молекулами и успеино .применяется для их очистки. В навих зкспериментак мы следовали универсальным методам очистки иммуноглобулинов. ' '

Уровень иредпочитаемости,.%

рис А. Зависимости количества Н-БКА-380 КД иммунореактивности в относительных процентах от уровня предпочитаемости к знакомому им-¡принт-объекту.

Препарат■ полученный вышеписанным методом содержит около 3-9 лолипептидов, из них два (с молекулярными массами 250 и 180 КД) специфически оеагирух>т с антителами против Н-БКА (рис. 5).

'ис. 5. Электрофорез в градиенте полилкриллмидного геяя с последу->щей окраской красителем кумаси Я-250 :»люата с колонки белок-А -гефарозм -1В (А). Та же - Фракция после электроблотинга и реакции с системой -1-меченных антител для выявления Н-ККА (Б).. Молекулярное массы обозначены.в КД.

Л Б

Таким образом, с тюмйдью onnta'HHoft' методики предстайляется возможным за одну стадии очистки подучить очищенный препарат -Н-БКА мозга цыплят. В указанном препарате присутствуют две изоформи Н-БКА и практически не наблюдаются продукты прогеолитического распада белка, которые реагируют с антителами Против Н-БКА. По-видимоиу это объясняется отсутствием участков связывания в продуктах проте-олитического распада с белком-А. Процесс очистки прободился на Фракции синаптосом, которая-обогащена изоформой Н-БКА с молекулярной массой 180 КД (Fersohn et al., 1989)i что и подтверждается в наших экспериментах.

Идентификация конканаеалин-А связывающих белков клеточных не.-. -4 1 1- '

мбран в нейрональных, глиальных и нейронально-гдиальных культурах. ---к- 1 1 1 .

Гликопротеины играют существенную роль в Адаптивных Функциях нейронов и определяют эффективность межнейрональных контактов (Bogach,1970. Barohdes, 1970; Irwin- et al., 1978). За последнее время появились инт.ресные данные о том, Что включение предшественников синтеза гликопротеинов, Фукозы vi К-ацетил-В-маннозамина выше в глиальных клетках ло сравнению с нейрональными (Pilgrim et al., 1982, Pilgrim and Reisert, 1937). Гак как. в наших исследования» испйльаасалвс!. мембранная фракция р^ , которая хотя я в малых количествах, но содержит мембраны глиальных клеток, перед нами была поставлена задача по возможности изучить принадлежность идентифицированных нами гликопротеинов к нейрональным или глиальным клеткам. Ми исследовали конканавалин-А связывающие белки в мембранах клеток Трех типов первичных культур: глиалькой, нейрональной и не-йронально-гл'иальной.

Результаты исследований представлены на рис. 6-. Во всех типах исследуемых культур встречаются одни и те же гликопротеины молекулярные массы которых равняются 260, 220, 180, 155, 140, 115, J.00, 93, 80, 70, 65, 60, 65, 50, и 45 КД. При этом наблюдаются некоторые количественные изменения. Так например, в смешанной культуре увеличено содержания гликолротеина 260 КД, б глиальной - 155 КД, количество многих гликопротеинов в нейрональной культуре гораздо ниже и т.д. ;

Таким образом, согласно проведенным исследованиям, мембрана клеток глиальных, нейронадьных к нейронально-глиальных культур ка-

Рис. С. Конканавалин-А связывающие гликопротеины клеточных мембран с неиронально-глиальноП (22-А, 100 мкг белка), глиэльной (22-Б, 50 мкг белка) и нейрональной (22-В, 5CI мкг белка) культуры. Молекулярные массы обозначены в КД.

чественньш составом гликопротеинов не огличаюте друг от друга хотя и имеются некоторые количественные различи Выше приведение заключение никак не является универсальным и oi .¡тает лишь состо яние клеток в культуре, на определенной стадии развития.

ВЫВОДЫ

*. Процесс зрительного Нмпринтинга у цыплят сопровождается изменением биохимических компонентов и структурной организации мембран ИМВГ мозга:

а. наблюдаются резкое уменшенне мечения наружных белковых, компонентов мембран ИМВГ;

б. обучение сопровождается увеличением количества конканава-лин-А связываюиих гликопротеинов с молекулярными массами 170 и 1,80 КД в мембрана.х ИМВГ левого полушария, часть которых представляют собой Н-БКЯ - 180 КД Вторичное обучение ведет ► увеличению количества нзоформ И-БКД 140 и 115 КД в мембрана к ИМВГ ле.вого полушарии-

в. увеличение количе тва Н-БКА - 130 КД прямопропорциональна величине уровня предпочитаемости знакомому имприит-объекту и таким образом, является строго специфичным для зрительного импринти нга у цыплят;

г консолидация следов памяти - импринтинга сопровождается появлением новой мембранной формой Н-БКА 65 КД, присутствие которой не наблюдается в других образцах.

2.Показание.что конканавалин-А связывающие гдикопротеины мембранных препаратов,полученых с глиальных, нейронаяьных и со смешанных нейронально-глиальных культур качественно не отличаются друг от дру га.

3. Выяваено, что классическая схема очистки иммуноглобулинов на белок-А-сефарозе Является также приемлемым в случае Н-БКА мозга цыплят и дает возможность получить очищений препарат белка.

Г. Jwifj^y^

список основных работ опубликованных по теме диссертации

1. Качаидзе Г.Г., Соломония P.O., Заалишвили Э.М , Адамия )., Микеладзе Д.Г. Идентификация и характеристика некоторых си-¡тичесских гдикопротеинов мозга цыплят. В материалах X Объели-щого симпозиума биохимических обществ ГДР-СССР "Механизмы регу-|ии клеточной активности", Ташкент, сентябрь, 1989. 52, 1989.

2. Solomon'ia К., Macheffldze G. , Adamla S. , Mikeladze D. Study chick brain concanaValln-A binding glycoproteins during Imprin-B. Abstracts of 20th FEBS Meeting, Budapest, August, 1990. 27 0.

3. Machaidse G.G. , Solomonia R.O. , Sobchmskaya N.M. . Adamla ., MikeladseD.G. Identification and aitrea'ion in the amount concanavalin-A binding glycoproteins of the chipk brain after jal imprinting. Известия АН Грузии, Серия Биологическая, 7. -258, 1991.

4'. Соломония P.O., Йачаидзе Г.Г. , Микеладзе Д.Г. О ' некоторых химических г."мнениях мембран мозга цыплят после визуального ?интинга. Биолгическне.нембраны, 8, 1186-1187, 1991.

5. Соломония P.O., Мачаидзе Г.Г., Микеладзе Д.Г. Синтез синайских гликспротеинов мозга цыплят в процессе импринтинга и ме-его цог.мо.*ной нейротрансмиттерной регуляции.' В "кн. ■точная сигнализация , (под ред.. а.кад. Костюка' П. Г. и чл-корр. •ССГ 0crpcBw..(4) М.Л.), т. 1, 1991.