Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Мембранная активность факторов патогенности холерного вибриона

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Мембранная активность факторов патогенности холерного вибриона"

РГ6 од

I 1 ".-Ч тпз

II ' 1 1' .

Л К АД ЕМ И Я НАУК Р Е С П У Г> Л И К И' у'зБ Е К1ГС ТЛ Н

ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ И БИОФИЗИКИ

на правах рукописи УДК (515.919:557.352.26

МУРАТХОДЖАЕВ Джавдат Нариманович

МЕМБРАННАЯ АКТИВНОСТЬ ФАКТОРОВ ПАТОГЕННОСТИ ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА

03.00.02 — Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ташкент —

1993

Работа выполнена в Институте физиологии и биофизики АН РУз.

Научный руководитель: д. б. и. Красильников О. В.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, проф. Гагельганс А. И.

кандидат биологических наук, Казаков И.

Ведущая организация — Институт Биофизики

клетки РАМ г. Пущнно

Защита состоится « ' » 1993 года в часов

на заседании Специализированного совета Д 015.01.21 но защите диссертации на соискание ученой степени доктора наук при Институте физиологии и биофизики АН РУз по адресу: 700095, Ташкент, ул. Ниязова, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии и биофизики АН РУз.

Ученый секретарь Специализированного совета дЧб.н. Красильников О. В.

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одной из важнейшей задачей в бактериологии, . микробиологии и медицине является установление механизма действия продуцируемых микроорганизмам! токсинов, которые яе только ответственны за клинические проявления заболевания, но и. создают условия для существования самих бактерий. В настоящей работе мы сосредоточили свое- внимание на изучении механизма действия токсических компонентов, продуцируемых V. cholerae: . холерного токсина (ХГ) и цитолизина (Щ). Холерный токсин (ХГ) относится к группе бинарных бактериальных белковых токсинов, опосредующих свое действие путем модификации внутриклеточных мишеней (Middlebrook and Borland,1984; Olsness and Sandvig, • 1985). Механизм индуцированной'ХГ клеточной интоксикации можно разделить на три основных стадии: 1) связывание токсина с клеткой; 2) транслокации через мембрану; 3) взаимо' действие с цитоплазматической мишенью. Первая' и третья стадии изучены достаточно подробно (Fishraan,1980; í.foss and Vcúghan, 1988), ■ тогда как вторая остается наименее выясненной и соот-■ ветстзенно наиболее дискуссионной... ■ Tait как токсин своей В-субъединицей связывается 'с рецептором, расположенным на плазматической мембране, а модификация 6-бзлка,. ¡соторыЛ активирует аденидатциклазу, может быть осуществлена его' А-субъеди-ницей лишь с-цитоплазматической ..стороны, то,-' следовательно, водорастворимая молекула ХТ-должна каким-то образом пересечь гидрофобный мембранный 'барьер.

Молекулярный механизм действия другого важного токсического компонента .V. cholerae . - цитолизина- - практически не был изучен.

Цель и задача работы. Целью настоящей работы было изучение молекулярного механизма действия токсических компонентов, секретируемых V. cholerae - холерного токсина (ХГ) и термолабильного цитолизина (ХЦУ. • В задачи работы входило:

1) Оценить вклад А-и В-субъединиц холерного тсксина в формирование ХГ-канала в ЕЛМ и влияние•величины рН на этот процесс;

2) Определить основные свойства каналов (проводимость, селективность, рН- и потенциал-чувствительность), индуциру-

. 4 - /

емых цельным холерным токсином и его субъединицами;

3) Установить механизм ХЦ-индуцированного гемолиза;

4) Исследовать влияние параметров внешней среды (величины рН

и фиксированного потенциала, концентрации соли, ферментативной обработки) на функционирование ХЦ-каналов."

Научная новизна полученных результатов.

В настоящей работе впервые продемонстрирована возможность формирования водозаполненных пор холерным токсином (ХТ)" в пла-каркых бислойных мембранах без участия в этом процессе гангли-озида (М. Впервые установлено, что'канадофораенной активностью обладает только В-субъедияица токсина (ХТ-В). Обнаружено, что снижение рН омывающего ВЛЫ раствора резко усиливает каналофор.\;енную активность ХТ и ХГ-Е Впервые измерен диаметр водных пор, индуцированных ХТ-В в КШ, который был идентичен размеру пор, визуализированных с помощью -электронной микроскопий. Исследованы зависимости селективности и проводимости оди- • • ночных ХТ-В каналов от величины р& Ш основании полученных . результатов предполагается, что формирование В-субъединицей водной поры является необходимым этапом для проникновения ферментативной А-субъединицы внутрь, клеток-мишеней. _ ' .

В результате исследования термолабильного цитолизина, вы-рабатывсэмого V. сЬо1егае поп-01 штаммом, было установлено, что этот токсин индуцирует водозаполненные Поры одинакового радиуса кап в природных (эритроциты различных жиботных), та:? и в искусственных (БЛМ) мембранах. Подробно исследованы зависимости функционирования ХЦ каналов от величины рН и Концентра-. ции соли. Выявлено, что ХЦ к^нал сформирован 'из нескольких молекул токсина и расположен асимметрично относительно плоскости * мембраны. На основании полученных результатов предполагается, что в основе цитолитического действия токсина лежит его способность формировать водозаполненные анионоселективные ка-, налы в мембранах клеток-мишеней.

Практическая ценность работы.

Полученные экспериментальные данные существенно расширяют представления о механизме действия токсинов, вырабатываемых V. о-Ъо1егае, о свойствах и условиях. формирования токсинами ионных канатов. Обнар/>мннкй рН-оптимуы каналообразующей актив-

ности цитолизина в модельных и эритроцитарных ыомбргчах (6.0-7.0), позволяет рекомендовать его в качестве вогможг.-сго препарата при химиотерапии опухолей.

Полученные данные о свойствах и механизме действия холерных токсинов открывают перспективы для их использования в ка-цестве инструмента исследования механизмов конного транспорта а липид-белковых взаимодействий. Результаты выполненной работы могут найти применение в биофизике, биохимии и экспериментальной медицине при исследовании причин нарушения гомеестаоа при кишечных инфекциях, а также для поиска путей нейтрализации патогенного действия вибрионов.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на 2-ой Всесоюзной конференции "Бактериальные токсины" (Юрмала,1989)Всесоюзном симпозиуме "Ионные каналы в биологических мембранах" (Кара-Дат, 1990), ' IX-Европейском симпозиуме по . животным, растительным и бактериальным.токсинам (Лохуоа-лу,1990), Всесоюзной конференции "Молекулярные механизмы развития инфекционных.заболеваний" (Звенигород,1990), Первом Международном'совещаний " Парообразующие токсины" (Италия, 1991), научных семинарах Института Физиологии и Биофизики АН РУз.

Структура и- объем диссертации. Работа изложена :ia 1С5 страницах машинописного- текста и состоит из введения, гр^-х ■ глав, включающих обзор литературных данных, описания методов у. использованных материалов, изложения и'обсуждения лс.чучэнкь'х результатов, выводов и списка цитированной .литературы, содержащего 226 наименований. Диссертация содержит 2 таблицы и 15 рисунков.

MATEPKAJ2J И МЕТОДЫ

В работе использовали:

- холерный токсин и его А- и В-субъединицы, любезно предоставленные Вороновым С. Е. (Институт Эпидемиологии и Микробиологии им. iL Ф. Гамалея, Москва). Перед использованием препараты субъединиц подвергались рена.турации, как описано ранее (Lai et al,1976);

- холерный цитолизин, любезно предоставленный Ш'.тиером А. О. (Среднеазиатский противочумный научно-мсследозательский

тут, Алма-Ата). Токсин был выделен из кулътуральнсй

- б -

штамма non-01 Vibrio cholerae, который был изолирован из Кал-чагайского водохранилища 8.07.81;

•- хроматографически чистые фосфатидилхолин (ФХ) из яичного желтка и фосфатйдилсерин (ФС) из мозга быка, получали по методам , описанным Бергельсоном с соавт. (1981); холестерин (Хол) •(Sigma); полиэтилэнгликоли (ПЭГ) со средней молекулярной массой (Да): 300 ' (Koch-Light), 400 и 20000 (Schuchordt.Manchen); 1000 (Austranal-Prepárate); 1500, 2000, 3000, 4000 (Lola Chemie); Трис-ОН (Reanal,Siema.Serva); Дити-отреитол (Koch-Light); Папаин (Loba Chemie).. Остальные реактивы были отечественного производства градации "ОСЧ", "ХЧ" или "ЧДА".

Бислойные липиднце ■ мембраны (ВЛЫ) формировали по. методу Монтала-Миллера (Ktontal & Mueller,1972) при температуре 25+1'С. Электрические параметры мембран измеряли в режиме фиксации потенциала-с помощью. I-V-конвертера с сопротивлением обратной связи liéeм - 'ЮГом в зависимости- от условий эксперимента. . Транс-отсек ячейки являлся, виртуальной, землей, и относительно него указан'знак'потенциала •

Катион-анионную избирательность BJIM оценивши по числам' переноса катионов (t+),' которые с учетом активности исноз в растворе рассчитывали по сдедувдзй формуле:

t+ - (Ео-Еа)ДЕс-Еа) ' ' C1J

где.Ео. - потенциал нулевого.тока при наличии градиента концентрации соли ; Ее- и Еа - теоретически Нернстовские потенциалы для катионов и анионов соответственно.

При исследовании зависимостей магаимальной скорости роста числа каналов (Vmax) и стационарного уровня числа каналов (Ns-s) от концентрации токсина и pH были использованы следуйте выражения:

Virax-C ( ál/át) max/Ge} *U [23

Ns-s-C Is-s/Go]*U ÍSi

где U - величина фиксированного потенциала (-20 mV) и Go -проводимость одиночного какала.

При исследовании токсин-индуцированного гемолиза исполь-ёсвался раствор следующего состава- 150 мМ НаС1, 5 mM Трис-HCl, pH 7.5 (НГ-буфер). Конечная концентрация грстроцитоь в смеси составляла 2Z. Одна гемолитическая единица (ГЕ) определялась как количество токсина, вызывающего 50% гемолиз 1 мл

2Х эритроцитарной суспензии в течении f 0 мин. при 37' С.

Концентрацию калия в сулернатанте измеряли с помощью лла-'менного фотометра.

Спределекие размера водных пор, индуцированных токсинами в мембране эритроцитов и в БЛМ проводили, как описано ранее (Сабироз с соаЕт,1991).

Электропроводность водных растворов измеряли с ломоиь» кондуктометра ОК 102/1 (Radelkis .Венгрия).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

I. ХОЛЕРНЫЙ ТОКСИН (ХТ)

1. Канаяойорменнач активность цельного холерного токсина.

Исследуя влияние холерного токсина на проводимость бислойных липидных мембран (БЛМ), 'было обнаружено, что в отсутствии в составе мембран ганглкозида GMí Л не .,:экет формировать каналы в ЪЛ>.1 при нейтральных рН, хотя при рН 4.5 токсин . был способен ■ образовывать анкок-селективные (t+«0.27(0.02) каналы. Среднее значение проводимости образованного ХТ одиночного канала в БЛМ (<К:ФХХол, 1:1:1, ví/w) при 100 мМ КС1, ЗмМ трпс-цитратном . буфере и рН 4.5 было равно , 52+12 пСм (рис. 1,вставка). В отдельных экспериментах было установлено, что наличие в составе0мембранссбразую1цего раствора ганглпозида Gml (до 5%, v/v), при общем уменьшении времени лини мембраны, не сбывалось на проводи;,:ости' одиночных каналов, индуцированных ХТ при рН.4.5. Их мгногеннат вольтамперная характеристика была практически линейной (рис. 2). Некоторое несоответствие свойств ХТ-канала, установленных нами, от прежде описанных в единственной работе, пссв'тезннсй действии ХТ на планарные бислои (Tosteson. & Tosteson,1977) - Б--* 20-40 пСм, t+-0. 67 в 100 мМ NaCl, зарегистрированных автора!,¡и на БЛМ из смеси глицерин моноолеата и ганглиозида Gml при рН 7.0 - является, по-видимому, результатом использования различных экспериментальных условий. Авторы утверждали, что канал сфор;,шрсван комплексом ганглиозид Gnil-XT, причем преобладающее значение э этом процессе отводилось ганглиозиду. Нами ¡as было установлено, что в соответствии с результатами, полученными (Tosteson <3-Tósteson,1977) ХТ способен 1шдуцировать ионные каналы в фосфо-липидных бислоях, но присутствие ганглкозида Gnl не является обязательным для образования токсином иои-лроводяиих структур.

Я. Качадофор;<енная активность Ас к В^. субъедикиц ХГ. Хо^ернк.'! токсин - бинарный токсин и состоит из 5 идентичных В-субъсдкаиц, расположенных в виде кольца вокруг А-субъ-едиаицн (Gil1,1976). С целью изучения вклада А и В субъединиц ток.еииа (XT-А к ХГ-В) в образование ионного канала, были исследованы порообраэукадие способности ХГ-А и ХГ-В в растворах с различны:,¡и рЕ Обнаружено, что ХГ-А не влияло на мембранную прзеоди;»«сть при всех использованных значениях рН среды, даже при конечной концентрации белка 1 г/л/ил. Напротив, добелление ХГ-В с одной стороны БН.1 приводило к ступенчатому увеличению* проводимости мембраны (рис.1). Таким образом, 'только В субъ-едкнща холерного токсина обладала каналоформенной актив-костью. .

lip;: н таких значениях рН (4.5) ХГ-В эффективно модифицировала липиднай бислой, приводя к быстрому увеличению его интегральной проводимости. '.Увеличение рН среды снижало каналообра-ьукгую актпзность ХГ-В, и при рН>7.5 даже использование высо- " ких концентраций В-субгсдиницы не приводило к увеличению проводимости бислоев. В таких случаях снижение рН инициировало CopniipoEaHiio ХГ-В каналов (рис.1).

Полученные результаты'с несомненностью указывают, что ка- . иалообразуедне свойства цельного ХГ полностью обусловлены его В-субъодишщей; н кроме того, позволяют предполагать эндосо-мальный путь проникновения холерного-токсина в клетки-мишени, как это показано для таких бинарных токсинов, . как дифтерийный токсин (Kagan et al. 1981-, De leers et al, 1983; Montecucco et al,1935; Papini et al,1988), оотулинотоксин (Blaustein et al. 1987; Hoch et al, 1985), тетанус-токсин (Boquet & . Duflot,1982; Gambale & Montai,1983; Menestrina et al, 1989) и многих других.

.Следует отметить, что амплитуда проводимости одиночных регистрируемых ХГ-В каналов довольно однородна, их средняя' проводимость составляла 125+13 пСм (100 мМ КС1, рН=4.5). В этих условиях ХГ-В-каналы проявляли анионную селективность (t+-0.2j0.04). Несмотря на более чем двухкратное различие в значениях проводимости медду эт>аш каналами и' каналами, формируем: ¡ми цельным ХГ, которое может быть результатом влияния А- ^убголиниЩк. ми мо:?£Ь! заключить, что влияние рН на канало-;viyij „жидкость 1>ак ХГ, тчк и его Б-субъгдиницы, очевидно

s ■•

Рис. 1. Скачки тега, индуцированные п БШ Б-суСмдлш:-цей холерного токоньа (12. ü МКГ/МЛ). ¡"0 ЛГЛИГ. нулевого

тока; V-+50 мВ. На ьстагко: гистограммы амплитуд нрово-дишетей одиночных ХТ-В каналов и каналов, инлуцчро-ваниых цельным токсином (пунктирнал линия). Среда: 100 \'jf. KCl, 3 rrM трис-цит-рат, pH 4.5.

¥

ZOO

.100

f+аомз f .ГУ а^ъ . .ВДВ

г-t.o

-0.5

3 4

6-7 8

РН

Рис. 2. Потенциал- зависимость функционирования ХТ-2 каналов. Токсин з финальной концентрации 15 мкг/1*п был добавлен з цио отсек гчей-ки. На вставке: игноЕенная (о) и стационарная (Д) ВЛХ ■ ме («ран, модифицированных ХТ-В и ХТ (i'üAX.e). С ре? а: 100 мМ KCl, 3 мН цитрат- ?рис, pH Л. 5.

Рис.3. Влияние pH на катион-анионную селективности к проводимость одиночных ХТ-3 канаков. Число переноса кз-тионов С t+) рассчитывалось из величины потенциала нулевого тока (Vo), измеренного на 3-кратном градиента KCl (120/40 Ш). В№ vrC:iÄ Ход (1:1:1, w/w). Проводи-мость ХТ-В каналов измерялась в ЮОмМ KCl, ЗнМ цитрат-трис.

реализуется через рН-индуцируемые конформационного изменения' ХГ-В. . Это хорошо согласуется с результатами изучения рН-за-внсимых изменений флуоресценции и связывания детергентов XI' и его В-субъединицей (De Wolf et al,1985,1387). Очевидно, что конформационные. изменения, приводя к экспозиции гидрофобной • поверхности ХГ-В, облегчает взаимодействие между XT (ХГ-В) и мембраной.

При изучении свойств ХТ-В каналов, было обнаружено, что повышение рН растворов, омывающих мембрану со встроенными ХТ-В каналами, не приводило к исчезновению индуцированной проводимости, т.е. "разборке" ион-проводящей структуры. Это позволило измерить их проводимость и селективность в широком диапазоне рН (рис. 3). Так, проводимость одиночного канала увеличивалась с 85 до 160 пСм, когда величина рН раствора уменьшалась от 6. б до 3. 5. Одновременно менялась и катион-анионнач селективность ХТ-В от слегка катионной (t+-0.6) при рН 8.0 .до анионной (t+-0.1) при рН 3.5. ' Еыраженная анионная селективность ХТ-В канала при рН<7, расположенного в отрицательно заряженном iC-бпСлое указывает на то, ■ что ХГ-В канал представляет собой пору, окруженную белковыми молекулами В-субъединицы. Мгновенные вольтамлерные характеристики (мВАХ) мембран, модифицированных ХГ-В были близки к линейным, тогда как стационарные (сВАХ)' резко гиполинейны ^?.). Различие между мВАХ.и сВАХ является результатом потенциал-индуцироь&шой. инактивации ХТ-Е каналов. Инактивация была обратимой - при уменьшение величины фиксированного на мембране потенциала (до. 10-15 мВ) проводимость мембраны вбзвращалась к исходным значениям. Фиксация высоких величин трансмембранных потенциалов на БЛМ, модифицированной цельным токсином, приводила к практически аналогичному результату, т.е. к уменьшению трансмембранного тока. Это является дополнительном подгвервдением того, что ХГ каналы сформированы В-субъединицей.

3. Определение размера индуцируемой В-ХГ водной поры.

При измерении размеров пор, индуцируемых ХГ-В в БЛМ был использован метод, разработанный ранее в нашей лаборатории (Сабиров с соавт, 1991). Он основан на изучении изменения электропроводности, растворов и проводимости одиночных каналов до " после добавок в среду, омывающую БЛМ, различных неэлектролитов. Для анализа изменений зтих величин и последующего

установления размера водной поры канал-:, был использован параметр проницаемости (i>), рассчитываемый как: N (Go-G)/Go

t)----С4Э

• (Но-Н)/Но

где Но и Go - электропроводность 100 мМ КС1 раствора и проводимость одиночного канала в этом же растворе, соответственно;

Н и G - электропроводность 100 мМ КС1 раствора, содержаге-го 20;Х (w/v) неэлектролита и проводимость одиночного капала в этом же растворе, соответственно.

Установлено, что параметр проницаемости зависел от гидродинамического радиуса молекул неэлектролитов (рис. 4). Показано, что добавка неэлектролитов с малыми гидродинамическими радиусами в омывающий ВЛМ раствор- приводила к снижению проводи-кости ХТ-В каналов практически пропор'уточально уменьшению электропроводности раствора. Параметр г.роницае.лсти для этих молекул был близок к 1 и, следовательно, двиганно проникающих ■ ионов и- неэле1'.трслитов через XI-B какал аналогично их движения в растворе. Поэтому можно утзерздать, что ХТ-В }с=наш является водонаполненными порами, в- которых ионы движутся путем свободной диффузии. При увеличении размеров молекул используемых неэлектролитов .их параметры проницаемости уменьшались, что завывает на ¿нижние концзнтрации°шлекул неэлектролита в полости канала! При дальнейшем увеличении размеров Кеэлектролл-тов~ их проницаемость череё годную поз'; канг-лоЬ уменьшается до О, привода к формированию нижнего плато на завкедаости параметра проницаемости от'гидродинамического радиуса неэлектролитов (рис.4). Согласно методу, размер водной поры каналов Скгь принят равны;.« размеру наименьшего та неэлектролитов неп-ронркающих через канал, т. е. размеру иакменьшзго неэлектролита •с яаргглетрсм D равным его значению на нижнгм плато. Таким способом упййячакнй диаметр водной поры ХГ-В «акала был оценен п 2. 1+0.2 ir.5. Этл данные хорошо согласуются се згатеяяеч диаметра поры < около 2 to), лолучеянш из эям:трскяс№«рэско-пических исследований цельного холерного токсета я его В-субь-единицы в мембране (Reed et al, 1987; Ludwif- et al,lS85). Тегам образом, исходя пз нагих дажых и эяектрокяо-адв«роскопических исследований, мы моягм уверено заключитъ, что жжяроводящий канал представляет собой виутркбежовую зодонаяолненяую пору составленную из 5-6 В-субъединиц ХГ.

о t г

ГИДродШИАИЧЗСКИЙ

радиус, ШЛ

О . 20 40 проводидость, пСм

Рис.4. Зависимость параметра проницаемости D череа ХТ-В канал от гидродинамического радиуса молекул неэлектролитов. Среда: 100 мМ KCl, 3 мМ цит-рат-трис, • рНЗ. 5.

Рис. 5. Вольт-амперная характеристика каналов, индуцированных ХЦ в пленарных бислоях. БЛМ были сформированы из общих фосфолипидов мозга Среда:, 150 мМ NaCl, 5 мМ трис-цитрат, рН 7.5. ВАХ была получена линейной разверткой (сплошная линия) или ступеньчатым (о) изменением потенциа-. ла. Вставка: а) Ступеньки тока, регистрируемые после внесения ХЦ (0.25 мкг). с цис стороны БЛМ. V--50 мВ; Ь) Гистограмма амплитуд . проводимостей одиночных ХЦ каналов.

гъ

о

I 2

ГндродиналашесмШ рэднус, им

Рис. 6. Зависимость ХЦ-индуцированного гемолиза (о) и .параметра проницаемости БЛЫ О (Д) от величины гидродинамического радиуса молекул неэлектролитов. Среда: 150 мМ NaCl, неэлектролит в концентрации, указанной в Методах, 5 мЫ трис-цитрат, рН 7.5. ХЦ вносили в 27. суспензию кроличьих эритроцитов в концентрации 0.5 нкг/ыл. На БЛМ - 100 мМ КС1, нзэлектролит (202), 5 мМ трис-цитрат, рН 7.0.

I!. ХОЛЕРЕЫЯ ЦИТОЛИЗИН

1. 2мзико-химические свойства цитолизина

ИспользоЕакньй препарат холерного цитолизина (ХЦ) бил гомогенен (а м. 60. ООО) -по данным ДЦС-электрофореза в 10 % поли-акрилачидном геле. Изоэлектрическая точка (pl) была раЕна 6.2+0.3. Анализ аминокислотного состава ХЦ, проведенный в Институте биоорганической химии г. Москва и в Институте биоорганической химии г. Ташкента, позеолил установить, что молекула ХЦ содержит: Asp-65; ' Thr-25; Ser-30; Glu-61; Prc-24; Gly-40; Ala-48; Val-31; ¡vfet-2; Ile-21; Leu-42; Tyr-1; Pno-18; Lys-17; His-11; Arg-18. Токсин термолабилен. Биологичьская активность не изменялась при внесении в среду холестерина или дитиотреитола. Кроме того, выявлено, что токсин не обладал фосфолипазной активностью. • Полученные данные о физико- íí-.k'ii-ческих свойствах исследованного нами цитолизина указывают на его близость, но -не' идентичность гемолизинам, выделенным paiioo из V.cholerae штаммов iíon-01 и Эль-Тор'(Ya^j-cto et al,1386).

2. Лизис эритроцитов, индуцированный холерным цитолизином.

Шло. установлено, что холерный цитолизин (ХЦ), взаимодействуя с различными эритроцитами, .. эффективно лизировал их (МоСагсЫ! et al,1985; Yaramoto et al,1986). Однако, механизм ХЦ индуцированного гемолиза не был известен. Несколько проспи экспериментов позволили нам сделать вывод о характере лизиса Так изучение кинетики лизиса эритроцитов, обработанных ХЦ выявило, что выход иовов калия предшествовал выходу гемогло5;-,:;а. т. е. гемолизу. Установлено, • что при концентрации токсина 0,25 мкг/мл, почти 100'% выход ионов калия из человеческих эритроцитов происходил в течении 12 минут, в то время как выход молекул гемоглобина начинался лишь с 30-й минуты, при более высоких концентрациях токсина интервал между выходами калия и гемоглобина сокраи&лся, но последовательность событий не менялась. Аналогичные результаты были получены и при использовании кроличьих эритроцитоз. Следовательно, гидродинамический диаметр молекул гемоглобина большз, чем размер ХЦ индуцированных пор в мембране эритроцитов и выход гемоглобина вероятно является результатом осмотического лизиса клеток. Это предположение было подтверждено тем, что негаряжэннке макромолекулы, га-кие как ПЗГ 4000, добавленные в среду с эритроцитами, завдгили

■ - 14 -

клетки от ХЦ-индуцированного лизиса. Так, протекция эритроцитов кролика молекулами ПЭГ 4000 была полной даже при концентрации токсина 5 мкг/мл, хотя концентрация ХЦ, вызывающая 50% лизис этих эритроцитов составляла 0.1 мкг/мл. Следовательно, размер пор, сформированных ХЦ в мембране эритроцитов действительно меньше гидродинамического диаметра гемоглобина. Эффект ЮГ 4000 не был обусловлен влиянием молекул неэлектролитов на зрптроцитарные мембраны, т. к. разбавление или замена незлект-ролит-содержащэ: раствора буфером без неэлектролита вели к быстрому необратимому гемолизу. Таким образом, ХЦ индуцированный гемолиз происходит по коллоидно-осмотическому механизму.

Ячгибиторный эффект неэлектролитов зависел от гидродинамического радиуса их молекул (рис. б). Минимальный гидродинамический радиус молекул неэлектролитов, • которые полностью инги-бировали ХЦ индуцированный гемолиз кроличьих и человеческих эритроцитов составлял 0.55+0.05 км. Следовательно, эффективный диамзтр водных пор,' сформированных ХЦ в'мембране клеток-мишеней, пэ-видыпоуу, ".годится в пределах 1.8-2.0 км. '

Эритроциты различных'животных по их чувствительности к ХЦ расположились в следующий ряд: -кролик» морская свинка» крыса» баран> человек»- курица» голубь»- ивди:> лягушка, с концентрациями ХЦ (мкг/мл), вызывающими 50?. лизис ^ равными 0.11» 0.15» 0.19» 0.25» 0.35» 0.35» 0.56- 0.55» 1.58, соответственно. Результаты этих экспериментов позволяют сделать вывод о том, что ХЦ эффективно разрушает эритроциты - различных животных . • А близкие значения гемолитических концентраций и одинаковые размеры водных пор ХЦ каналов в•эритроцитарных мембранах позволяют предположить и сходный механизм ^политического действия ХЦ - формирование им в мембранах клеток-мишеней пор фиксированного размера.

3. Влияние холерного цитолизина на свойства БЛМ.

Было установлено, что внесение небольшого количества ХЦ в один из отсеков экспериментальной ячейки вело к повышению проводимости БЛМ на несколько порядков. Более высокое разрешение позволяло увидеть ступенчатый рост проводимости, что прямо указывало на формирование цитолизином ионпроводящих структур -каналов (рис. Б).' ХЦ-каналы, индуцированные в мембране, сформированной из обшэй фракции фосфолипидов мозга быка, были анио-носелективны 0.18+0.03) и однородны по проводимости (32+5

рЗ; рис.5, вставка). Форма вольт-амперной характэристики (ВЛХ) одиночного ХЦ качала была асимметричной и определялась собственно свойствами открытого ХЦ ютаяа.

Ври'исследовании зависимостей скорости роста проводимости и числа каналов, индуцируемых ХЦ в ЕЯЗ.', а такте уровня гемолиза кроличьих'эритроцитов от концентращш токсина в среде, было установлено, что в двойных логарифмических координатах наклоны этих зависимостей находились в пределах 1.5-2 (рис. 7). Следовательно, несколько молекул токсина необходимо для формирования им канала как в искусственна, так и природных иомбрачах. 4. Размер водной поры канала, индуцируемого ХД в 1>М_ Эксперименты, проведенные с эритроцитами, указывали на то, что ХЦ каналы, по-видимому, является большими водозапол-нейными порами. Для подтверждения этого нами оы?о исзюдзэшш свойства ХЦ .каналов в БЛМ,' омываемых рестворрми с 1:.;чной концентрацией КСЧ. Было установлено, что проводимость одиночных ХЦ каналов увеличивалась линейно с увеличение"!; активности КС1. Коэффициент корреляции между изменениями проводимости канала и электропроводностью раствора бил равен 0.993. Таким образом, для определения размера водных пор ХЦ каналов полностью применим метод, основанный на измерении проводимости каналов б растворах неэлектролитов. Используя его, было установлено, что эффективный радиус водной поры ХЦ канала з 313.1 равен 0,9-1.0 нм (рис.6). Эга величина идентична размеру пор, индуцируема цитолизином в эритроцитарных мембранах., Такой результат позволяет утверждать, что структуры каналов в этих двух т;.шгс< у;.-д5-рзн. близки. . ' •

5. Влияние £Н на функционирование И} каналов. Прямая зависимость между электропроводностью раствори и проводимостью одиночных ХП каналов, а такта высокая проницаемость этих каналов для низгаэмолекулярных неэлектролитов прямо указывали на то, что ХЦ канал представляет собой водозаполнен-ную пору. Однако, резкая асимметричное!ь ВАХ каналов и относительно высокая их анионная селективность (0.18), даже ?. мембранах с высокой плотностью отрицательных зарядов на своей поверхности, свидетельствуют о наличии фиксированных положительных зарядов, расположенных в канале. Исследование рН-аа-висимости селективности и проводимости одиночных ХЦ кагалов подтверждает это предположение (рис. 8). Совокупность данных

f^lOO-i

10-

-1000-

100

-10

* n!

I

"I........V

1 10 Концентрация цитолизина. нМ

Рис.7. Зависимости величины гемолиза (О), скорости роста (VmaxJ и стационарной проводимости (Ns-.s) от концентрации ХЦ в двойных логарифмических координатах. Наклоны гемолиза (О)., Vmax (о) и Ns-s (Д) были 1.5, 1.9 и 1.7, соответственно. Величины Vmax и Ns-s рассчитывались из уравнений [2,31. Среда: 150 мМ NaCl, 5 мМ трис-цитрат, рН 6.0; V—20 MB.

о

На О

1001

15

с с

I

и о

СИ

о о« с

350"1 8

\

V

ff-

о.з

02

0.1

рК

S

Л о

. у S

Рис. 8. Влияние рН на селективность (о), и проводимость одиночных каналов (в), индуцированных ХЦ в БЛМ, сформированной из общей фракции фосфолипидов мозга. Проводимость ХЦ каналов измеряли в 150 мМ NaCl, 5 мМ трис-цитрат. Число переноса катионов (t+) рассчитывали из величины нулевого тока, возникающего . при .внесении в 100 мМ раствор КС1 концентрированных аликвот соли.

■2000 ^

' 1 1500

Sal

О О га

Рис.9. Зависимость ХЦ-индуцированной начальной скорости выхода ионов калия из эритроцитов (О), Ушах (о) и N3-5 (Л) от величины рН среды. Конечная концентрация ХЦ;-1.25 мкг/мл в экспериментах на БЛМ (цис отсек), 0.25 мкг/мл - на 2X суспензии человеческих эритроцитов. Остальные условия как в подписи к рис. 7.

позволяет утверждать, что у входа в ка1?ал или в его полости расположены ионогенные группы, обладающие преимущественно положительными зарядами. Ожидаемое увеличение вклада последних в определение свойств "ХЦ канала при низких значениях рН среды проявляется в увеличении проводимости и селективности одиночных каналов. Соответственно, сдвиг рН среды в щелочную сторону рН приводил к уменьшению как анион-катионной селективности, так и'проводимости ХЦ каналов.

Изменяя рН раствора, мы смогли обнаружить изменения чувствительности ХЦ каналов к трачсмембранному фиксированному потенциалу. Обычно (рН-7.5) при небольших значениях трансмемб-'разного потенциала (<30мВ) ХЦ каналы находились преимущественно в открытом состоянии. При высоких значениях трансмембранного потенциала повышалась вероятность нахождения каналов в закрытом малопроводящем состоянии. Уменьшение величины рН ускоряло процесс перехода ХЦ каналов из открытого в закрытое состояние. Так, проводимость мембраны, модифицированной цитолизином, уменьшалась в е раз при ступенчатом изменении потенциала с . б до 100 мВ за 200-300 сек., при рН 7.5 и за 8-12 сек. при рН •5.0.

При исследовании рН-зависимости формирования и функционирования ХЦ ¡«налов был обнаружен еи£ один инте^с.'.чД Феномен: и скорость роста проводимости и.величина стационарной проводимости были максимальны' при рН омывающего раствора б. 0-5.5 (рис.9). -Эти результаты позволили нам предполо.тать, что небольшое уменьшение (с 7.5 до 6.5) величины рН растгоров, омывающих клетки-мишени, должно увеличивать чувствительность этих клеток к действию цитолизина Для экспериментальной проверки этого был измерен выход ионов калия из эритроцитов, инкубированных с токсином при различных величинах рЕ Выход ионов К бык взят в качестве теста, т.к. нарушение ионных градиентов является первым этапом действия каналоформирующих токсинов на клетку. Обнаружено, что скорость выхода калия из эритроцитов, индуцированная ХЦ, увеличивалась в 5-8 раз при небольшом уменьшении рН и имела максимум при рН 6.5-7.0, т. е. небольшое снижение величины рН монет значительно увеличивать чувствительность клеток-мишзней к токсину. Установленный рН-оптимум для мембранных эффектов ХЦ, а такде способность токсина взаимодействовать с широким кругом клеток млекопитающих позволяет

предложить цитолизин в качестве потенциального противоопухолевого •¡геларата. Основанием для такого предположения является мыеотшй! факт, что рН внеклеточной среды, омывающей опухоле-iJL "1 k-jc'Iku сГ>ыч':с снижен на 0.4-1.0 рН относительно рН ин-терстициалноя жидкости нормальных тканей (F.dc-n et al,1955). Кзлгаяе гглюминить, что необходима прямая проверю противоопухолевой астивности ХЦ как in vitro, так и in vivo.

Гэдлололкние ХП канала в мзм5раке и влияние липидного и протеолптической обработки на его свойства. При исследовании рН-эависшости катион-анионной селективности мзмЗран, модифицированных цитолизином, было установлено, что анионная селективность ХЦ какаясв сохранялась

при наличии отрицательно заряженных липидов в составе ьомбрач (p;¡c. 8). Следовательно, водная пора ХЦ канала окружена кзлэдулоки '¿(чхина, а не липида Этот- вывод подтверадаэтся npiK'i: '-'ecxu равными величинами проводимости одиночных ХЦ кана-расположенных в мембранах, сформированных из ФХ или íC (Г:7. 8+¿. 1 и 25. 6+8.3, соответственно) и дополнительно указывает на сгдшкньость устьез ХЦ Канала от плоскости иембракы. Для нсследсг ^ния расположения ХЦ }саналов в мембране были использо-шш о .¡слоя, у которых один 1.:о;юслой был сформирован из .ФХ,' а ípyroí ко СС. Токога всегда бил добавлен в цис-отсек, в то врех'.я расположение ФХ и <1С монослоев менялось. После того, ка-; проводимость гзъбран,' кодифицированных токсином, достигала стационарного уровня измерялась мВАХ. Для численного сравнения различных мВАХ были' попользованы два параметра - асимметрия (А) и нелинейность (Н). Еоофф-лциент асимметрии оцределялся как отношение тока, Померенного при -100 мВ к току - при +100 мВ, а кой$ф;ад:еч? нелинейности определялся как отношепе тока, измеренного при Í00 ыЗ к величине, полученной линейной экстраполяцией значения тока, измеренного при 20 мВ. Результаты этой серии экспериментов, предстазлеиныэ в табл. 1, указывают, что па ¡¿орму мВАХ влияет, в основном, состав транс-монослоя БЖ Ьослодьку очевидно, что чем блкдо устье канала к липидной поверхности, те;.: сильнее в влияние полярных головок лилида, следовательно устья ХЦ канат.?, пжтупшет за пределы бислойной ьенбраны на разное расстояние. Если од;и из входов ХЦ какала, вуатупзюерго из ллоокостл та-мбраны Е раствор, куда был добавлен токсин, назвать "Es" входом то, вероятно, он расположен

дальше от полярных головок лкпидов, чем др^той ~ "¡п" вхо.ч-

Табл. 1

Параметры ВАХ Симметричные бкелои Аскмм-зтшиные Сисдо'.-;

ФХ-транс ФХ-цис 5С~ граче СС-цис ОХ-транс СС-нис 2С-транс ФХ-цис

-II 1.62+0.05 1. 36+0. 09 1. 6810.03 1.85+0. Об

+ Н 0. 70+0. 05 0. 63+0. Об 0. 72+0. 04 0. 621.0. С5

А 2. 95+0. 16 4.1210. 55 3. 25+0. 13 3. 69+0. 12

Дополнительное подтверждение такого расположение ХЦ-канала в мембрано, мы получили, используя ограниченный про-гсолиэ токсина после формирования им ксипроводяией структуры. Было по!сазано, что протсолл-гический фермент - п'-.пеич - изменял катион-анионную селективность ХЦ модифицированных бислойкых некбрэи в двух случаях: при внесении ферм-зита з о>. огоояз экспериментальной ячейки или только в цис-отсек. Так в лереон случае, число переноса катионов (Ь+) ХЦ-модифицированной }?ЛМ увеличился с 0.18+0.02 до 0.36+0.15. Одновременно отмечалось и уменьшение в 2-3 раза стационарной проводимости БЛ1 При эта» форма ВАХ таких мембран оставалась неизменной. Увеличение хотя ч в несколько меньшей степс-пи (до 0.29+0.04), наблгдалось при односторонней-добавке фермента в цис отсек. Енесенио папа-1'на лишь в транс отсек не влияло на'селективность и другие рактеркстики ХЦ каналов. Такт образом, только "Ех" вход XII канала был доступен для папаина. Это подтверждает предполс-*•.-»-пие о том, что именно "Ел" вход располокгн дальше от плоскости мембраны, чем "1п" вход.

ВЬЕОДЫ

1. Обнаружено, что каналообразукгдэй активностью, возрастающей при заселении среды, обладает лкиь В-субгединица холерного токсина. * Ганглиозид Ри1 не является абсолютно необходим;:.» кошс::еатом ВЛМ дм формировании в них ионных каналов холерным токсином.

2. Установлено, что канал, сформированный В-субъединицэй холерного токсина (ХТ-В) является анионоселектнЕ::е-Г! (1+-0.2+0.04) водной порей с проводимостью'равной 125+13 чОм.

- 20 - • ( 100- мМ КС1, рН 4.5) и эффективным диаметром 2.1+0.2 им. Высокие значения фиксированного на мембране потенциала приводят к переходу ХГ-В и XI" каналов в непроводящее состояние. - 3. Показано, * что механизм лизиса эритроцитов, индуцируемый цитолизином V. cholerae (ХЦ) является коллоидно-осмотическим; • 4. Выявлена способность цитолизина V. cholerae (ХЦ) формировать анионоселективные (t+- 0.18+0.03) интербелковые потенци-алчувствительные асимметричные водные поры в природных и модельных мембранах с проводимостью 32+5 пСм (150 мМ NaCl, рН 7.5) и эффективным диаметром 1. 8-2. О нм. •

5. Показано, что способность ХЦ увеличивать проницаемость мембран зависит от рН и максимальна в зоне 6.0-7.0.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ГО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Красильников О. а , Ыуратходжаев Д. Н., Сабиров' Р.' 3., Воронове. Е-, Езепчук JQ.E "Образование\В-субъединидэй холерного Токсина водонешолненнух Пор-в. плосда'ли'пидньбг мембранах". Тезисы 2-ой Всесоюзной конференции "бактериальные токсины", Юрмала, 1989, стр. fin . •

2. Муратходжаев Д. Н. , Красильников О. В.,. Цитцер А. О., Семи-отрочев В. JL "Холерный гемолизин и его влияние на эритроцитар-ные мембраны и-фосфолипидкые бислоп". Тезисы Всесоюзного симпозиума "Ионные каналы в биологических мембранах", 24-27 апреля .1990, Кара-Дат, Москва, 1990, стр.61 .

3. Krasilnikov.O.V., Muratkhodjaev, J. N., Tsitser.A. 0. and Semiotrochev.V. L. "Molecular basis of -V. cholerae cytolysin .action'on' natural'lknd'model ■ lipid membranes".-■ Abstracts of "presentations at the Ninth European symposium on animal, plant and microbial toxins, l.ohusalu, Estonia, 23-26\09\90. Toxicon, 29, 286-287, (1991)

4. Krasilnikov.O. V. , Muratkhod jaev, J. N., Voronov, S. E. and Yezepchuk.Yu. V. "Structure of ion channel induced by B-subunits of cholera toxin". Abstracts of presentations at the Ninth ■European symposium on animal, plant and microbial toxins, Lohusalu, Estonia, 23-2G\09\90. Toxicon, 29, 287, (1991)

5. Муратходжаев Д E , Цктцер A. 0. , Красильников 0. E , Езеп-чук Ю. В. , Семиотрочев R Л. "Порообразующие свойства цитолизина V.cholerae". Материалы Всесоюзной конференции "Молекулярные механизмы развития инфекционных заболеваний", Звенигород.

1990, CTp. 16 . j...-

6. Krasilnikov.O. V., Sabirov.R.Z., Ternovsky.V. I., Merzliak, ' P. G. and Muratkhodjaev, J. N. "The simple method of determination

of ion channels water' pore radii in planar lipid bilayer membranes". In: First International Workshop "Pore Forming Toxins", Castel Ivano, Italy, 25-29\09\91, p. 48

7. Krasilnikov.O. V., Muratkhodjaev, J. N., Voronov.S. E. ?nd Yeze^chuk, Yu. V. "The ionic channels formed by cholera toxin in planar bilayer lipid membraner. are entirely attributable to its B-subunit". 1991, Biochim. Biophys. Acta, 1067, 166-170

8. Krasilnikov.O. V., Sabirov.R.Z., TernovskyjV. I., Kferzliak, P. G. and Muratkhodjaev,J.N. "A simple method -for the determination of the pore radius of ion channels in planar lipid b.-layer membranes". 1992, FENG Microbiol. Imnun, 105, 93-100

9. Krasilnikov.O. V. ,. Muratkhodjaev, J. ii. and Zitzer, A. 0. "The mode of- action of Vibrio choleras cytolysin. The influences on both erythrocytes and planar lipid bilayers". 1992, Biochim. Biophys. Acta, 1111, 7-16-

/

O

- 22 -

"hZM3KA!J£ ACTIVITY OF V. CHOLERAE PATHOGENIC FACTORS" Murc'.tkhodjaev Javdat Nariiranovich speciality - biophysics

'iha dissertation is staled on 105 pages and contains introduction,- three chapters (Literature Review, Materials & M-'thodr:, Results S Discussion), Conclusion and List of Cited Lite; u'.ure (226 references), 2 Tables and 16 Figures.

The dissertation is devoted to study the inoche.nism of f:l«ji\ of tv.o toxic proteins produced by V. cholerae: cholera toxin (CT) end therirolabilo cholera cytolysin. The main conclusions aro following:

1. It WiVa found that the B-sufcunit of CT only was possessed of chainoIforpine act.ivity which intensified by low pil. Th-3 presence oi gangliosido G;nl in the tnentoraie is not obligatory to produce ion-conductive structure.

4 2. ¡t way o^tablisnod that channel induced by B-subunit -of CT ves anicr, selective (t+»0. 2+0.04) v/aterfilled pore with 2.1+0.2 nr.-; dialler ar.d conductance 1Z5±13 pS at 100 mM KC1, pH -¿.5. The application high transmembrane potential to the BLM modified by teth tte whole toxin or its B-subunit led to transitions of tl.jse channels from open to closed states.

3. It \as demonstrated that lysis of erythrocytes induced by cholera cytolysin occured according to' a colloid osmotic irechanisin.

4. It was shown that cholera cytolysin was able to induce the anion selective (t+-0.18+0. Oo) interprotein ' voltage-gated asymiTictrical xaterfilled pore with 1.8-2.0 nip diameter in both ^ natural and artificial membranes vith conductance 32+5 pS (150 s.V. >kCl, pHV.5).

5. It was noted that cholera cytolysin ability to increase the permeability of the target meirbranes was pH-depsndent and had mximum at pH 6.0-7.0 .

- 23 -

иу.с!то1егае'*<5актериялара патогигак фекторларчнп-лг1 мембракалзрга таъсирк" Муродх^жаев Ясшдят Нйрячонсвич • Биофизика щиат^тсжч'л

Диссертация 105 бет да баён втилган. Тартотбига Кириш с?зи, учта боб (Лдабкег мухокаыаси, Материаллар ва Методлар, Натигаляр ва уларнинг ыухокамаси), Хулоса ва Ддзбиёт р?йх,ати (226 ном), 2 кадвал ва 16 расы киради.

Диссертация choieras ишлаб чикарувчи икки ТОУО'-ТИ оксил ыоддянинг (холера токскпи - ХТ ва термолабил холера цг;тслязини} мембрэзаларг'а таъсир целиш мехашзмига багишгангак. Асосий ху.'.осв куйдагилардан иборат:

1.- Канал хосил здллка хусусиятиДТ-шгаг факз? В-б}.-ьги билэн таъмяклаяади, ион. тзшувчи структура хосил кялея учун <3л'-1 гангляозидишнг мембретада б}лиан шарт эмао.

2. ХТ-нинг- В-б?лага хосил кмувта канал анион-селзктпп

2+0.04), ?ткузувчанлнги 125+13 пСы (100 иМ рН 4,5)

б£лган сув т?лдарилган пора вканлиги ениклякда. Крш каватлк лигад иембряляларга юкора елекгр кучланиш берилганда, упдаги ХТ бч ушнг В-б?лаги хосил адигган каяаллар очиц хслатдсн ёгшд холагта Утиши кузаталади.

3. • Холера -цитоЛиэини вщгроцитларга , таъсир о^ганда, коллсид-огаготик механизм с^йича кечувчл хуаайра ла:?::оа ссд/.р ôfjzçnx к^роатилган.

4. Холере цитслизини 01<сглдан топжил топтал» шшон-солоэтиз

, потенциал билан СошкзрялуБчИ' сув ^¿'д^рьлгак ва дгаыетри ¡,s-2,0 ни б}лган пораларна хам сунъиЛ, за« гяйигй меыбренсларда хосил' кррсатилгзн. Канал $тказувчэьл;гго зз+ь

пСмга (150 M Nsci, рн 7,5 вритиада) геяг.

5. Холера цктолкишининг ^ембраналярга тбъсири мугит кислоталигата боглщ, ва рН 6,0-7,0 максииалдар.

/