Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы взаимодействия дефенсинов и пиразинов с медленными натриевыми каналами сенсорных нейронов

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы взаимодействия дефенсинов и пиразинов с медленными натриевыми каналами сенсорных нейронов"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рухоппсн

РГБ ОД

2 5 СЕН

ПЛАХОВА Вера Борисовна

МЕХАНИЗМЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ДЕФЕНСИНОВ И ПИРАЗИНОВ С МЕДЛЕННЫМИ НАТРИЕВЫМИ КАНАЛАМИ СЕНСОРПЫХ НЕЙРОНОВ

Специальность: 03. 00. 13 - Физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологически* наук

САНКТ-ПЕТЕРЕУРГ 2000

Работа выполнена в Институте физиологии им, И. П. Павлова РАН

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

академик А. Д 11озярачев

доктор биологических наук, старший научный со грудник Н. А Емельянов

доктор биологических наук, доцент

3. И. Крутсцкая

Ведущее учреждение

Институт эволюционной физиологии и биохимии им И М Сеченова РАН

Зашита состоится "____"___^______ 2000 г п ___ часов на мселаиин

Диссерш»>ютш) о Concia К 061.57 09 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук п Санкт-Негербургскои Государственном Университете по адресу 149034. Caina-HeiepG>pt. Умиверстетская наб , д 7Л> (аул 90)

С диссергациеП мохчю ознакомиться в Научной библиотеке им ЛМ Горького Санкт-Петербургскою Государственного Университета

Автореферат разосла н "____* _ ______2(НЮ гола

Ученый секретарь диссертационного сонета

кандидат биологических наук Р И Коваленко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Задачи исследования молекулярных механизмов взаимосвязи ионных каналов и мембранных рецепторов представляются сегодня особенно актуальными. В первом приближении ионные каналы можно классифицировать как лиганд-управляемые и потенциалочувствительные. Эта классификация, однако, постоянно требует уточнения в связи с обнаружением новых молекулярных структур, образующих единую систему мембранный рецептор-ионный канал. С другой стороны, применение фармакологического подхода редко приводит к четкому представлению о том, принадлежит ли активный центр специализированному мембранному рецептору или же он является частью аминокислотной последовательности изучаемого ионного канала. В последнем случае применима гипотеза о так называемом "модулированном рецепторе" (Stiichartz, 1973; Hille, 1977; Можаева и др., 1980). Этим механизмом, например, можег быть обусловлено взаимодействие с быстрыми натриевыми каналами молекул тетродотоксина и батрахотоксина (Можаева и др. 1984; Nöda et al., 1989) Медленные (тетродотоксиннечувствительные, ТТХГ) натриевые каналы (Веселовский и др., 1979) являются важнейшей молекулярной структурой, обеспечивающей, наряду с кальциевыми и быстрыми натриевыми каналами, возбудимость живой ткани. Их сенсорная функция заключается в том, что они участвуют и в передаче сигналов от мембранных рецепторов. Действительно, начинают появляться новые данные, свидетельствующие о взаимосвязи медленных натриевых каналов с рецепторами серотошша (Cardenas et al., 1997) и с опиоидными рецепторами (Крылов и др., 1999). Если учесть тот факг, что специфическое блокирование или модулирование характеристик медленных натриевых каналов имеет непосредственное отношение к фармакологическим подходам к решению проблемы периферической боли (Gold et al., 1995), то становится еще более очевидной актуальность темы нашего исследования. Представляет интерес также тот факт, что медленные натриевые каналы обнаружены в мембране обонятельного нейрона (Trotier, 1986) Исследование молекулярных механизмов действия "сигнальных молекул" - пиразинов представляется сегодня особенно актуальным не только из-за малоизученное™ этих процессов, но и из-за важности той роли, которую играют пиразины с точки зрения регуляции физиологических функций целостного организма.

Работа посвящена выяснении» мембранных механизмов действия дефенсинов и пиразинов на медленные натриевые каналы сенсорных нейронов. Дефенсины являются катнонными писгеинсолержащими пептидными соединениями, которые впервые

были обнаружены в нентрофильных гранулоцитах млекопитшощих как высокоэффективные универсальные антимикробные вещества (эндогенные антибиотики) (Zeya, Spitznagel, 1971). Пиразииы - это широко распространенные в растительном н животном мире низкомолекулярные гетероциклические соединения. Являясь филогенетически древними веществами, действующими на уровне межорганизменных связей, пиразииы и их производные проявляют себя чаще всего как классические "сигнальные молекулы", выступая в качестве одорантов, феромонов, эктогормоиоп и т.п. (Pevsner et al, 1985, 1986; Brophy, 1989). Дефенсины и пиразины, участвующие в выполнении важнейших физиологических функций, совершенно по-разному могут быть узнаваемыми мембраной нейрона в соответствии с указанными выше альтернативными гипотезами

Цель и задачи исыедования. Целью работы явилось исследование механизмов взаимодействия молекул пираишон и дефенсинов с медленными натриевыми каналами сенсорных нейронов. Были поставлены следующие задачи:

I Количественно изучить возможный молекулярный механизм действия дефенсина NP-1 на потенциалочувстьительность медленных натриевых каналов.

2. Выястггь возможные механизмы действия на медленные натриевые каналы ряда молекул пиразинов, отличающихся по своей способности образовывать водородные связи с актньнымн центрами мембранных ренегпоров

Основные поюжгнич. выносимые на ипцчту;

1. С помощью Пэтч-кламп метода получены доказательства, свидетельствующие о существовании рецептора дефенсина. связанною с медленными натриевыми каналами в мембране сенсорного нейрона

2. Исследование ряда молекул пиразинов показало, что пиразинкарбоновая кислота способна взанмодействать с опноидным рецептором, связанным с медленным натриевым каналом.

Научная налита. Впервые установлена количественная вшимосвязь между концентрацией дефенсина NP-I и потенцналочузствительностью медленных натриевых каналов. Указанный эффект не удалось устранить неспенифнческим антагонистом опнондных рецепторов налтрексоном (NTX) Нами впервые показано, что пиразинкарбоновая кислота (ПКК) способна уменьшать потенциалочувсгвirre л ь ноеть медленных натриевых каналов, причем этот эффект устранялся NTX. Это свидетельствует о возможном участим опиоидных ренегпоров в узнавании этих сигнальных молекул.

• Теоретическое и практичеекпе значение работы. Полученные данные представляются важными для понимания молекулярных механизмов действия

дефенсинов и пиразинов на мембрану сенсорных нейронов. Результаты и выводи работы могут быть использованы для чтения учебных курсов по фармакологии, нейрофизиологии н нейробиологии, а также в медицине и фармакологии при создании новых лекарственных веществ.

Апробация работы. Основные положения работы доложен!,i и обсуждены на: Международном симпозиуме, посвященном памяти академика В. Н. Черниговского (С.-Петербург, 1997), 33 Международном конгрессе по физиологии (Россия, С.Петербург, 1997), Сателлитном симпозиуме 33 международного конгресса по физиологии (Россия, Колтуши, 1997), на III Международном конгрессе патофизиологов (Лахти, Финляндия, 1998), на XXVII Съезде Физиологов России (Ростов-на-Дону, 1998), на международной конференции, посвященной 150-летию И.П. Павлова "Механизмы функционирования висцеральных систем" (Россия, С.Петербург, 1999), на международном симпозиуме, посвященном 150-летию И.П. Павлова "Механизмы адаптивного поведения" (Россия, С.-Петербург, 1999). на заседании Санкт-Петербургского Общества физиологов, биохимиков и фармакологов им. И М. Сеченова (1999).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 108 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, экспериментальных результатов, обсуждения результатов, выводов, заключения и списка литературы, содержащего 131 источник. Работа иллюстрирована 27 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. Для выполнения экспериментальной части работы применяли модифицированный нами метод краткосрочного культивирования диссоциированных сенсорных нейронов (Kostyuk:, et al. 1981; Elliott, Elliott, 1993).

Эксперименты были выполнены на культивируемых изолированных нейронах спинальных ганглиев крыс линии IVtsfar. Неиденгифицированные нейроны спинальных ганглиев выделяли из областей L5 - Si спинного мозга крыс. Затем ганглии помешали в раствор Хэнкса. Ферментативную обработку проводили п течение 5-12 мин. (в зависимости от возраста крыс) при 37 °С в растворе следующего состава: 1 мл раствора Хенкса, 1 мл среды Игла, 2 мг/мл холлагеназы (тип 1А), 1 мг/мл проназы-Е (Kostyuk, et al. 1981). В качестве буфера использовали 10 ммоль/л Нерез Na (рН = 7.4). После фермет-атлвкон обработки ганглии тщательно отмывались путем центрифугирования (1 млн, 900 об'мин) и последующей сменой налоеллочноЛ

жидкости. Для отмывки и культивирования использовалась среда, на основе среды Игла (ЕМЕМ) с добавлением пнотамина (2 ммоль/л), эмбриональной сыворотки коровы (10 %), глюкозы (0.6 %) гектамнцина 40 ед./мл. Механическую диссоциацию производили путем пипетирования. Культуру клеток, состоящую преимущественно из нейронов спииальиых ганглиев, получали с помощью предварительного осаждения ненейронапьных клеток (шванновскнх клеток и фибробластов) на пластиковой поверхности 60-им чашки Петри в течение 25 мин. при 37 °С. Далее клетки культивировали на покрытой коллагеном поверхности 16-мм чашек Петри. Регистрацию электрической активности нейронов производили спустя 2 часа после завершения культивирования. Клеггкн использовали в опытах в течение одних суток.

Регистрация ионных токов. В работе использовали метод локальной фиксации напряжения (patch-clamp метод) ь конфигурации "регистрация тока от целой клетки" ("whole-ccll") (Hainil! et a).r 1481). Эксперименты проводили с помощью аппаратно-программного комплекса (Крылов и др., 1996), включающего в себя усилитель - ЕРС 7 и ШМ-совместимый персональный компьютер.

Растворы. В работе использовались стандартные растворы (концентрации представлены в ммоль'л) для исследования кинетических характеристик натриевых каналов. Внеклеточный раствор NaCI-65, СаСЬ-2, MgClj-2. Choline CI-90, HEPES Na-10, тетродотоксми (TTX) -O.OOOOI, pH=7.4 Внутриклеточный CsF-100, NaCI-10, CsCI-40, MgCb'2,HEPES Na -10, pll=7 2 Исключение ионов калия позволило избавиться or всех компонентов калиевого тока, а ноны фтора во внутриклеточном растворе обеспечивали блокирование кальциевых токов (Kostyulc et al. 1975) В работе использованы реактивы фирмы "Sigma"

Фармакологическое разделение натриевых токол. Дня выделения медленных натриевых токов во внеклеточный раствор вводили 10 нмоль/л тефодотоксина (Almers, Levinson, 1975) Это приводило к полному устранению быстрых натриевых токов. Тетродотокенн в указанной концентрации присутствовал во внеклеточной среде в течение всей регистрации токов н перфузии, что позволило исследовать только медленные каналы.

Кяантово-химичсские расчеты. Равновесная геометрия и электронное строение молекул дефенсина. пгразина (N;C4Hi), 2,5-диметнлпираиша (N-C»Mi) и пнразинкарбоновой кислоты (NjCjRtCh) были исследованы с помощью комплекса квантово-хнмических программ GAUSSIAN 94 YV (Frisch et al., 1995) а базисе 6-3IG* (Hehre et al., 1972) Для проверки соответствия стационарной точки, найденной в процессе оптимизации геометрии молекул, абсолютному минимуму в этой точке с тем же базисным наборов проводился расчет колебательного спектра этих молекул для

проверки отсутствия в спектре отрицательных по знаку частот, которые могли бы свидетельствовать о том, что система не находится в абсолютном минимуме на потенциальной энергетической поверхности.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Зависимость изменения величины эффективного заряда активационнаго воротного устройства меженных натриевых каналов от концентрации дефенсина

Результаты исследования воздействия дефенсина NP-1 на мембрану сенсорного нейрона показали, что потенциалочувствителыюсть медленных натриевых каналов монотонно заснсит от чрезвычайно низких концентраций дефенсина. Действительно, зависимость от дозы агониста была обнаружена при экстремально малых (пикомолярных) концентрациях дефенсина. После внеклеточного приложения 1 пмоль/л дефенсина не происходит явных изменений кинетики активаиионного и инактивационного процессов. Наиболее важным стационарным параметром, определяющим электровозбуднмость, служит эффективный заряд (Z0tr) активационной воротной системы. Именно он был выбран нами в качестве количественного показателя, отражающего эффект воздействия дефенсина. Для этого были построены "пиковые" вольт-амперные характеристики обычным способом (Hodgkin and Huxley, 1952а). При подаче на мембрану последовательности ступенек напряжения (Е) регистрировали амплитудные значения токов (I„m), которые представлены как функция Im„ (Е). Основной эффект, позволяющий обнаружить количественную связь между потенциалочувствительностью активационной воротной системы ' ТТХ, натриевых каналов и концентрацией этого ai-eirra, проявляется в изменении крутизны левой ветви вольт-амперной характеристики. Этот эффект можно представить на графике зависимости хордовой проводимости от потенциала Gn,(E). Эта функция строигся следующим образом:

Gn.(E) = I,.„,(E)/(E-EN.,), (1)

где En, - величина потенциала реверсии натриевого тока, 1™п(Е) - амплитудное значение тока при деполяризующем потенциале Е. Функция Ом«(Е) имеег начальный S-образный участок, крутизна которого отражает особенности потенциалочувствительности актпвацнонного процесса. Иэмененне крутизны именио этого участка четко проявляется при воздействии дефенсина. Впервые величину эффективного заряда активационной системы определили создатели -мембранной ионной теории (Hodgkin, Huxley, 1952 d). Можно предположить, что число открытых

каналоп (N„) пропорционально величине хордовой проводимости Gn.(E), а число закрытых каналов (Nc) соответствует ■{ Gn.™** - Gn. (Ё) К Тогда (Hodgkin, Huxley, 1952d, Keynes, Rojas, 1974; Алмерс, 1981):

Лт(14Ж) = /ím[Gs. (Е)/ { Gn."" - GN. (Е)}] -» Cexp[ZeneE/kT], (2)

Е-+ - 3D Е-+ - » Е-> - »

где С - константа, Zел - эффективный заряд, выраженный в единицах заряда электрона е, к - постоянная Больцмана, Т - абсолютная температура. Очевидно, что при Е—> - <х> указанная функция представляет собой одну экспоненту, которая может быть наглядно представлена с удовлетвор|ггельнон точностью с помощью регрессионной прямой, проходящей через начальный участок кривой лимитирующей проводимости (Алмерс, 1981) Изменения этого термодинамического параметра были выбраны для оценки эффекта при построении зависимости "доза-эффект". Относительное изменение величины эффективною заряда, отражающее возможный процесс лиганд-рецспторного связывания дефенсина, может быть аппроксимировано функцией Хнлла

AZ^=¿Zd¿áZ.<r'={Z«n-ZdIn,"|/{Zdt™-Z.JTm"|-=l-'! 1/(1ЧК,ДД])х]>. (3)

где 7JT и Zcr"'" - максимальное (эффект при максимальном воздействии агента) и минимальное (без его воздействия) значение эффективного заряда, KD - концентрация агента, вызывающей} 50°ó снижение величииы исследуемой функции. [Д] -концентрация дефенсина. X - коэффициент Хилла Использование уравнения Хнлла для описания экспериментальных данных позволило найти значение X. которое оказалось равным 0 9. Величина Кп составила 2 пмоль/л (рис 1) Отметим, что рассматриваемое действие дефенсина нам не удаюсь блокировать на.нрексоном

Исследование влияния дефенсина на инакти«ационнук> ¿ирмпиую систему медленных натриевых каналов

Мы также получили данные о взаимодействии дефснсина в более высоких концентрациях с медленными натриевыми каналами Отметим, что этот эффект не был обнаружен в ответ на приложение пикоиоляркых концентраций Это заставило нас применить микромолярные концентрации дефенсина, причем только его внутриклеточное приложение позволило обнаружить это взаимодействие Мишенью действия дефенсина служит ннзктивационная воротная система медленных натриевых каналов. Нами проведен анализ кинетического поведения этой системы, основанный на предположении о том. что она облазает кинетическими свойствами второго порядка, подобно тому, как это было показано ранее для быстрых натриевых

Рис. 1. Зависимое! ь изменения относительной величины эффективного заряда '¿^к активационной воротной системы ТТХ, натриевых каналов от внеклеточной

концентрации дефенсина Средние значении - черные кружки - н ошибки среднего представляют результат нескольких измерений (п - их число в скобках). Сплошная крива« - результаты расчетов с использованием уравнения (3) при К0 - 2 пмолъ/л и X = 0,9. Ось абсцисс- логарифм концентрации дефенсина |Д], ось ординат - относительное измененяе величины эффективного заряда.

каналов (СЬш, 1977; Кгу1оу е1 а!.. 1995). Удалось установить, что замедление кинетики спада заднего фронта тока после воздействия 20 мкмоль/л дефенсина обусловлено изменением лишь. одной постоянной времени ииактивационного процесса. В исследованной нами области деполяризационных мембранных потенциалов дефенсин оказывает влияние на быстрый компонент (Т1) ииактивационного воротного процесса, а его медленный компонент (Т2) остается без изменения. Все это свидетельствует о том, что в данном случае эффект может быть объяснен активацией «модулированного рецептора», т.е. части аминокислотной последовательности медленного натриевого канала. Его инактивационная воротная система взаимодействует с молекулами эндогенных антибиотиков, видимо, именно по этому механизму.

Исследование влияния пиразина и его производных на медленные натриевые каналы. Исследование активационной воротной системы показало, что действие пиразина с наружной стороны мембраны приводит к изменению величины эффективного заряда. Приложения пиразина в концентрации 10 ммоль/л приводили к изменению среднего значения Ъея с 6.2 ± 0.6 (п=17, контроль) до 4.2 ± 0.5 (п=10). Обнаруженный эффект пиразина не устранялся предварительным действием налтрексона (50 мкмоль/л). Исследование инактивационной воротной системы медленных натриевых каналов свидетельствует о том, что пиразин практически не изменяет стационарную ннактивационную характеристику. Эта характеристика, представленная в логарифмическом масштабе, не может быть аппроксимирована одной прямой. Приложение пиразина, однако, не приводит к статистически достоверному изменению характера этой зависимости. Нелинейность исследуемой кривой сохраняется до и после его воздействия. Это свидетельствует о том, что

инактивационное воротное устройство обладает динамическими свойствами второго порядка (СЫи, 1977; Лонский и др., 1989; Кгу1о\' е( а!., 1995). Более заметное влияние пиразина нам удалось обнаружить, применив математический метод исследования кинетики спада заднего фронта тока. Полученные данные показывают, что нет достоверного различия зависимостей от потенциала постоянных времени медленного компонента инакгивационного процесса до и после воздействия пиразина. Исследуемый 8гент, однако, значительно замедлял быстрый компонент инактивационного процесса. Средние значения т, различались в 2 раза при всех исследованных значениях потенциала. Таким обратом, наши данные свидетельствуют о том, что относительно высокая концентрация пиразина уменьшаег величину эффективного заряда активационной воротной системы медленных натриевых каналов и замедляет лишь одну из кинетических характеристик (Т|) инактивационного воротного устройства Следовательно, исследованный агент действует на оба воротных устройства натриевых каналов, причем инактивацнонная система оказывается несколько менее чувствительной к этим воздействиям.

В ответ на приложение 50 мкмольЛл 2,5-лимет11лпирязнна (ДМП) с наружной стороны мембраны происходит, как н при воздействии пиразина, изменение крутизны левой ветви пиковой вольт-амперной характеристики. Изменение крутизны вольт-амперной характеристики связано со снижением величины эффективного заряда, переносимого активационной воротной системой Эффективный заряд уменьшился в данном эксперименте на величину равную 1.5 заряда электрона Отметим, что приложение ДМП в более низкой концентрации (10 м к моль/л) к наружной стороне мембраны приводило к снижению Т^а до -5 2+0 3 (п-19) злрядос электрона Предварительное действие МТХ (50 мкмолъ/л) не оказывало никакого влияния на эффект ДМП. Следовательно, можно эаключеть, что относительные менее высокие конце1ттрацнн ДМП, обладающего более выраженной физиологической активностью на поведенческом уровне, также приводят к изменению характеристик медленных натриевых каналов. Это взаимодействие происходит, видимо, как и в рассмотренном выше случае действия пиразина, непосредственно с активным центром (центрами), принадлежащим аминокислотной последовательности молекулы канала, в соответствии с гипотезой модулированного рецептора.

Эффект пиразинкарбоновой кислоты (ПКК) исследовался в соответствии с программой экспериментов, примененной нами в предыдущих случаях Построение пиковой вольт-амперной характеристики показывает, что происходит изменение крутизны ее левой ветви. Оно обусловлено снижением эффективного заряда активационной воротной системы. Принципиальные отличия действия ПКК от

эффектов пиразина и ДМП заключаются в следующем. Во-первых, действующие концентрации ПКК, ведущие к резкому снижению эффективного заряда, оказались па порядки более низкими Так, концентрация 50 нмоль/л ПКК приводила к изменению эффективного заряда от 6.2Ю.6 (п=17) до 5.1±0.3 (п=23), И, во-вторых, предварительное приложение ЫТХ к наружной стороне мембраны полностью устраняло эффект ПКК.

Таким образом, можно заключить, что ПКК, в отличие от пиразина и ДМП, взаимодействует с мембраной сенсорного нейрона специфическим образом. Действительно (рис 2), только ПКК, эффект которой блокируется ЫТХ, действует в чрезвычайно низких концентрациях.

Zeff

моль/л моль/л моль/л Рис 2 Снижение эффективного заряда агтивационной воротной системы медленных натриевых каналов после воздействия пиразина, ДМП и ПКК Контролыюе тизчеине 7,»1- 6 2*0 6 (п-17) Посте приложен*» 10 ымалк/л пиразина кличша Z^iCOCTa*H.ia 4 2 К) 5 (п-10), после приютски* 10 ukmo.W.1 ДМП m величина равна 5.2Ю.З (в"19), после приложен*« 50 *v<m/.i ПКК • J. 1*0.3 (IK-23)

я

ОБСУЖДЕНИЕ

Данные последних лет свидетельствуют о том, что медленные натриевые каналы связаны с рецепторами серотонина (Cardenas et al., 1997) и опиондными рецепторами (Крылов и др., 1999). Следовательно, физиологически активные вещества, воздействуя на систему мембранной сигнализации мембранный рецептор -медленный натриевый канал, могут иметь несколько рецетттирующих зон, представляющих собой части аминокислотных последовательностей макромолекул

рецептора или (и ) канала. Обнаружение молекулярной мишени соответствующего агониста остается важнейшей задачей, требующей своего решения. В настоящей работе нами предпринята попытка дифференцировать различные механизмы действия исследуемых агентов Как мы уже отмечали выше, хорошо известна гипотеза "модулированного рецептора" (Strichartz, 1973; Hille, 1977; Можаева и др., 1980), согласно которой биологически активное вещество взаимодействует непосредственно с активным центром, представляющим собой часть аминокислотной последовательности ионного канала. Альтернативная гипотеза заключается в следующем. Характеристики мембранного ионного канала модулируются благодаря активации структурно обособленного белка - специализированного мембранного рецептора. При этом априори можно предположить, что эффективные концентрации агонистов должны быть значительно более низкими по сравнению со случаем «неспецифического» модулированного рецептора и, кроме того, должен существовать известный блокатор (например, налтрексон), позволяющий идентифицировать путь мембранной сигнализации. Проведем анализ полученных нами данных именно с этих позиций.

Механизмы действия д'ефенсинов

Существует ли специфический рецептор дефенсина?

Основным результатом этой части нашей работы стало обнаружение связи между низкими концентрациями дефенсина NP-1 и величиной ZeB (рис.1). Оказалось, что возможное лиганд-рецепторное связывание происходит в стехиометрии 0.9 : 1. Этот результат можно трактовать как существование не только специфического рецептора дефенсина, на что указывает чрезвычайно низкая величина KD = 2 пмоль/л, но и наличие одного центра связывания, т.е. одна молекула агониста приводит к изменению функционирования одного ТТХ, натриевого канала. Действие дефенсина не блокировалось налтрексоном, что говорит в этом случае об отсутствии активации опноидных рецепторов, связанных с медленными натриевыми каналами. Поэтому окончательно ответить на вопрос, поставленный в заголовке настоящего параграфа, мы не можем. Тем не менее нами обнаружен совершенно новый механизм действия эндогенных антибиотиков, рассматриваемых здесь как сигнальиые молекулы. Он принципиально отличен от известного действия дефенсина как антибиотика -молекулярного перфоратора мембран (Lehrer et а!., 1993).

Механизмы действия пиразина и его производных ' Исследования механизмов мембранной рецепции пиразина и его производных показали, что пиразины способны .4 взаимодействовать со специализированными белковыми структурами в мембране, что ведет к рефляции важнейших

физиологических функций (Pevsner et al., 1985; 1986; Baldaccini et al., 1986). Пиразины способны модулировать свойства рецепторов путем взаимодействия с липидным бислоем, меняя текучесть мембраны (Nie et al., 1994). Показано, что содержащие пиразиновое кольцо карбоновые кислоты проявляют анальгетическую активность (Kaliszan et al., 1985). Именно этот факт нашел свое частичное объяснение в нашей работе, поскольку как опиондные рецепторы, так и медленные натриевые каналы участвуют в передаче болевых сигналов. Причастность к осуществлению разнообразных функций и характер влияния пиразинов на эти функции в живых организмах разных уровней эволюции позволили выдвинуть предположение об универсальности пиразинов как химического «сигнала настройки» в системе межорганизменных связей (Woolfson and Rothschild, 1990).

Как отмечено выше, пиразин обладает ярко выраженными сигнальными свойствами, которые могут изменяться в зависимости от включения в состав молекулы различных радикалов (Makino et al, 1990, Nie et al., 1994). Очевидно, что их присоединение к пир&зиновому кольцу может привести к изменению химической и биологической активности исследуемых молекул Здесь нами предпринята попытка объяснить возможные механизмы взаимодействия исследованных пиразинов с медленными натриевыми каналами, основываясь на детальном анализе квамтово-химической структуры трех молекул пиразина, ДМП, ПКК.

Химическая активность этих молекул евнза' с наличием у каждого из атомов азота неподеленной пары электронной (НП), расположенной в плоскости молекулы и направленной по прямой, соединяющей атомы азота Именно эти НП способны образовывать химические связи с другими молекулами или со структурными компонентами биологических мембран Электронная структура более сложной молекулы 2.5-днмстилпиразнна отличается от пиразина тем, что, с одной стороны, происходит перераспределение части электронной платности с атомов углерода кольца на НГ1 атомов азота Пру этом увеличивается их отрицательный эффективный заряд и, соответственно, повышается их химическая активность. Действующие на агитационную чоротнуто систему медленных натриевых каналов концентрации пиразина и ДМП оказались в диапазоне микро-, ииллимолей на литр (рис.2;. Их эффекты не удалось блокировать антагонистом опноидньгс рецепторов. Это позволило нам предположить, что указанные агенты взаимодействуют с активным цетром (цетрами) молекулы канала в соответствии с механизмом «модулированного peuerrropa». видимо, благодаря участию электронных НП их атомов азота.

Молекула пиразинкарбоновоП кислоты обладает активным гидроксильным фрагментом -ОН карбоксильной группы, способным к образованию водородных

связей, позволяющих ей осуществлять лиганд-рецепторное взаимодействие со структурой мембранного рецептора. Мы предполагаем, что наличие именно этого фрагмента приводит к- образованию водородных связей с соответствующими структурными элементами опиоидного рецептора. Этим обусловлено специфическое лиганд-рецеттгорное взаимодействие, ведущее к активации специализированного рецеггтора и к передаче сигнала от него к медленным натриевым каналам (Крылов и др., 1999). Тот факт, что налтрексон «выключает» этот механизм сигнализации, подтверждает нашу гипотезу.

Участие опиоидпых рецепторов во взаимодействии с «сигнальными молекулами», доказательство которого представлено впервые в настоящей работе, -позволяет по-новому подойти к проблеме универсальности пиразинов как химического «сигнала настройки» в системе межорганизменных связей.

ВЫВОДЫ

1. Величина эффективного заряда активационного воротного устройства медленных натриевых каналов уменьшается в зависимости от концентрации дефенсина №-1, приложенного к наружной стороне мембраны. Установлено, что для данного взаимодействия константа диссоциации составляет 2 пмоль/л, коэффициент Хмлла

" при этом равен 0.9.

2. Дефенсин КР-За, действующий в концентрации 20 мкмоль/л с внутренней стороны мембраны, изменяет постоянную времени лишь быстрого компонента инактивацнонного воротного процесса медленных натриевых каналов.

3. Пиразин в концентрации 10 ммоль/л изменяет эффективный заряд от 6.2±0.6 (п=17) до 4.2±0.5 (п=10) зарядов электрона, постоянная времени быстрого компонента процесса инактивации Т1 при этом изменяется почти в 2 раза. 2,5-диметилпиразин в концентрации 10 мкмоль/л снижает эффективный заряд до 5.2+0.3 (п=19) зарядов электрона. Эффекты пиразина и 2,5 - диметнлпиразина не устраняются налтрексоном.

' 4. Пнразинкарбоновая кислота в концентрации 50 нмоль/п снижает эффективный заряд до 5.110.3 (п=23) заряда электрона. Эффект пкразинкарбоновой кислоты полностью устраняется налтрексоном, что свидетельствует о взаимодействии пираэинкарбоновой кислоты с опиоиднымн рецеттгорами, связанными с медленными ' натриевыми каналами.

5. Теоретический анализ равновесной геометрии и особенностей электронного строения молекул дефенсина и пиразинов, проведенный с помощью квантово-химичесхих расчетов, позволил установить, что физиологическая . активность

исследуемых молекул, участвующих в процессе лиганд-рецепторного связывания, определяется способностью гидрокснльных групп пиразинкарбоновой кислоты и глютаминовой кислоты, входящей в состав молекулы дефенсина, образовывать водородные связи с активными центрами мембранных рецепторов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Ноздрачев А Д , Крылов Б.В., Сабанов B.C., Подзорова С Л., Плахова В.Б., Шамова О.В., Орлов Д.С., Кокряков В Н. Эндогенные антибиотики дефснсины как возможные регуляторы функционирования натриевых каналов нейронов спинномозговых гагнглнев// Доклады Академии наук. 1997. Т 355. Hi 5. С. 705-707.

Plakhova V.B., Sabanov VS., Podzorova S.A., Shamova OS, Orlov DS Endogenous antibiotics defensins probably regulate functions of sodium channels in dorsal root neurons// Abstracts of the 33 International Congress of Physiological Scienccs. 1997. P002.17.

Sabanov V S., Nozdrachev A D., Plahova V.B., Podzorova S.A. Effects of Endogenous antibiotics defensins on Junctions of sodium channels in dorsal root neurons// Molecular and genetic bases of adaptive behavior: Materials of satellite symposium of the 33 International Congress of Physiological Sciences. Koltushi. 1997. P 50.

Плахова В В, Сабанов В С. Возможный механизм взаимодействия натриевых каналов сенсорных нейронов с эндогенными антибиотиками// Проблемы тггероцепцни маг иежлународ. снмп, посвященного 90-лстию со дня рожд. акад. В Н. Черннговского С-Пб, 1997. С. 74.

Sabanov V.S , Plakhova V В , Novikov S.N., Nozdrachev A.D., Krylov B.V. Pyrazine modulates gating characteristics of slow sodium channels// Pathophysiology. 1998. V. 5, suppl. I P 136

Сабанов В С , Плахова В.Б.. Иочдрачев А Д, Новиков С И. Влияние пиразина на воротные характеристики медленных натриевых каналов нейронов спинальных

ОС

ганглнев крыс// Тезисы докладов к 27 съезду физиологов России. Ростов-на-Дону. 1998 С. 373.

Osipenko G S, Pokrovsky A N , Krylov В V., Plakhova V.B. Mathematical modeling of pain sensation // Abstr Of The second Inter. Conference "Tools for Mathematical modelling" St-Petersburg 1999 P. 96

Щеголев Б Ф , Плахова В Б., Сабанов В. С., Подзорова С. А., Ноздрачев А. Д., Крылов Б. В. Новиков С Н, Михайлов Ю. Д Применение квантово-химических расчетов для выяснения молекулярных механизмов рецепции пиразинов // Тезисы на

международную конференцию, поев. 150-летию И.П. Павлова "Механизмы функционирования висцеральных систем" 1999 г. С. 415.

Shchegolev B.F., Plakhova V.B., Rogachevsky I.V., Nozdrachev A.D., Shamova O.V., Orlov DS, Kokryakov V.N. Mechanisms of interaction between the endogenous antibiotic defensin and the rat sensory neuron membrane: application of Patch-Clamp method and quantum-chemical calculations // Abstracts for Int. Symposium ded. To Academician Ivan Pavlov's 150 anniver. "Mechanisms of adaptive behaivor". St. Petersburg, Russia. Dec. 7-9 1999. P.67-68.

Платова В.Б., Сабанов B.C., Щеголев Б.Ф., Подзорова СЛ., Ноздрачев А.Д., Крылов Б.В, Новиков С.Н., Михайлов Ю.Д. Возможные молекулярные механизмы -модификации пиразином и его производными воротных устройств медленных натриевых каналов сенсорных нейронов // Сенсорные системы. 2000. Том 14. № 1. С. 48-59.

Сабанов В. С., Плахова В. Б., Щеголев Б. Ф„ Ноздрачев А. Д., Крылов Б. В., Подзорова С. А., Михайлов Ю. Д, Новиков С. Н. Рецепция пиразинов: возможная роль опиоидных рецепторов сенсорных нейронов II Доклады Академии Наук. 2000. Т. 370. N 1.С. 126-129.

Тип BHUVJf/il. Jat. 23.Тч/)-/оО- I/,/'**"'

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Плахова, Вера Борисовна

Введение

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. ЭНДОГЕННЫЕ АНТИБИОТИКИ ДЕФЕНСИНЫ

1.1.1 Введение

1.1.2. Строение

1.1.3. Происхождение и локализация

1.1.4. Механизмы действия

1.2. СИГНАЛЬНЫЕ МОЛЕКУЛЫ ПИРАЗИНЫ

1.2.1 Распространение пиразинов в природе

1.2.1. Функции пиразинов

1.2.3. Механизмы обонятельной рецепции

1.3. МОЛЕКУЛЯРНАЯ СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ ПОТЕНЦИЛОЗАВИСИМЫХ НАТРИЕВЫХ КАНАЛОВ

1.3.1. Быстрые (тетродотоксинчувствительные, ТТХ8) натриевые каналы

1.3.2. Структура и функции медленных (тетродотоксиннечувствительных, ТТХГ) каналов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы взаимодействия дефенсинов и пиразинов с медленными натриевыми каналами сенсорных нейронов"

Задачи исследования молекулярных механизмов взаимосвязи ионных каналов и мембранных рецепторов представляются сегодня особенно актуальными. В первом приближении ионные каналы можно классифицировать как лиганд-управляемые и потенциалочувствительные. Эта классификация, однако, постоянно требует уточнения в связи с обнаружением новых молекулярных структур, образующих единую систему мембранный рецептор -ионный канал. С другой стороны, применение фармакологического подхода редко приводит к четкому представлению о том, принадлежит ли активный центр специализированному мембранному рецептору или же он является частью аминокислотной последовательности изучаемого ионного канала. В последнем случае применима гипотеза о так называемом "модулированном рецепторе" (Strichartz, 1973; Hille, 1977; Можаева и др., 1980). Медленные натриевые каналы (Веселовский и др., 1979) могут взаимодействовать с лигандами непосредственно благодаря активации лигандом определенной части аминокислотной последовательности канала в соответствии с гипотезой о "модулированном рецепторе". Этим механизмом, например, может быть обусловлено взаимодействие с быстрыми натриевыми каналами молекул тетродотоксина и батрахотоксина (Можаева и др. 1984; Nöda et al., 1989). Медленные натриевые каналы являются важнейшей молекулярной структурой, обеспечивающей, наряду с кальциевыми и быстрыми натриевыми каналами, возбудимость живой ткани. Их важнейшая сенсорная функция заключается в том, что они участвуют и в передаче сигналов от мембранных рецепторов. Действительно, начинают появляться новые данные, свидетельствующие о взаимосвязи медленных натриевых каналов (ТТХг-каналов) с рецепторами серотонина (Cardenas et al., 1997) и с опиоидными рецепторами (Крылов и др., 1999). Если учесть тот факт, что специфическое блокирование или модулирвание характеристик медленных натриевых каналов имеет непосредственное отношение к фармакологическим подходам к решению проблемы периферической боли (Gold et al, 1995), то становится еще более очевидной актуальность темы нашего исследования. Представляет интерес также тот факт, что медленные натриевые каналы обнаружены в мембране обонятельного нейрона (Trotier, 1986). Исследование молекулярных механизмов действия "сигнальных молекул" - пиразинов представляется сегодня особенно актуальным не только из-за малоизученности этих процессов, но и из-за важности той роли, которую играют пиразины с точки зрения регуляции физиологических функций целостного организма.

Работа посвящена выяснению мембранных механизмов действия дефенсинов и пиразинов на медленные натриевые каналы сенсорных нейронов. Эти молекулы, участвующие в выполнении важнейших физиологических функций, совершенно по-разному могут быть узнаваемыми мембраной нейрона в соответствии с указанными выше альтернативными гипотезами.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Плахова, Вера Борисовна

выводы

1. Величина эффективного заряда активационного воротного устройства медленных натриевых каналов уменьшается в зависимости от концентрации дефенсина МР-1, приложенного к наружной стороне мембраны. Установлено, что для данного взаимодействия константа диссоциации составляет 2 пмоль/л, коэффициент Хилла при этом был равен 0.9.

2. Дефенсин КР-За, действующий в концентрации 20 мкмоль/л с внутренней стороны мембраны, изменяет постоянную времени лишь быстрого компонента инактивационного воротного процесса медленных натриевых каналов.

3. Пиразин в концентрации 10 ммоль/л изменяет эффективный заряд от 6.2±0.6 (п=17) до 4.2±0.5 (п=10) зарядов электрона, постоянная времени быстрого компонента процесса инактивации Т] при этом изменяется почти в 2 раза. 2,5-диметилпиразин в концентрации 10 мкмоль/л снижает эффективный заряд до 5.2±0.3 (11=19) зарядов электрона. Эффекты пиразина и 2,5 - диметилпиразина не устраняются налтрексоном.

4. Пиразинкарбоновая кислота в концентрации 50 нмоль/л снижает эффективный заряд до 5.1 ±0.3 (п=23) заряда электрона. Эффект пиразинкарбоновой кислоты полностью устраняется 1ЧТХ, что свидетельствует о взаимодействии пиразинкарбоновой кислоты с

90 опиоидными рецепторами, связанными с медленными натриевыми каналами.

5. Теоретический анализ равновесной геометрии и особенностей электронного строения молекул дефенсина и пиразинов, проведенный с помощью квантово-химических расчетов, позволил установить, что физиологическая активность исследуемых молекул, участвующих в процессе лиганд-рецепторного связывания, определяется способностью гидроксильных групп пиразинкарбоновой кислоты и глютаминовой кислоты, входящей в состав молекулы дефенсина, образовывать водородные связи с активным центром рецептора.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Установлено, что физиологически активные вещества пиразины и дефенсины, взаимодействуя с мембраной сенсорного нейрона, модулирует основные характеристики медленных натриевых каналов. Эндогенный антибиотик дефенсин ЫР-1 уменьшает величину эффективного заряда активационного воротного устройства, причем его действие в чрезвычайно низких концентрациях характеризуется стехиометрией 1:1. Можно предположить, что для каждой молекулы этого агониста существует единственный центр связывания. Дальнейшие эксперименты позволят ответить на вопрос, принадлежит ли он аминокислотной последовательности медленного натриевого канала или является специализированным мембранным рецептором. Наши данные позволяют утверждать, что он не принадлежит к классу опиоидных рецепторов.

Указанные рецепторы могут быть вовлечены в процесс распознавания сигнальных молекул пиразинов. В соответствии с нашими данными действующие концентрации пиразинкарбоновой кислоты, способные достоверно уменьшить эффективный заряд, находятся в пикомолярном диапазоне. Важно, что этот эффект полностью устраняется налтрексоном.

В связи с этим дальнейшие исследования физиологических функций молекулярной системы мембранный рецептор - медленный натриевый канал представляется особенно важным и перспективным.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Плахова, Вера Борисовна, Санкт-Петербург

1. Алмерс В. Воротные токи и движение зарядов в возбудимых мембранах. В кн.: Мембраны: ионные каналы. М. "Мир". С. 129-236. 1981.

2. Веселовский Н. С., Костюк П. Г., Цындренко А. Я. Разделение ионных токов, ответственных за генерацию потенциалов действия в соматической мембране нейронов новорожденных крыс// Доклады АН СССР. 1979. Т. 249. N 6. С. 1466-1469.

3. Кокряков В.Н. Катионные белки лизосом нейтрофильных гранулоцитов при фагоцитозе и воспалении // Вопр. Мед. химии. 1990. №6. С. 13016.

4. Кокряков В.Н., Борисов А.И., Слепенков C.B., Лызлова С.Н. Сравнительное исследование некоторых физико-химических свойств миелопероксидаз свиньи и коровы // Биохимия. 1982. Т. 47. Вып. 1. С. 100-107.

5. Кокряков В.Н., Алешина Г.М., Слепенков С.Н. и др. О степени структурной гомологии лактоферринов молока и нейтрофильных гранулоцитов//Биохимия. 1988. Т. 53. Вып. 11. С. 1837-1843.

6. Кокряков В.Н. Биология антибиотиков животного происхождения. СПб: Наука. 1999. 162 с.

7. Крылов Б. В., Дербенев А. В., Подзорова С. А., Людыно М. И., Кузьмин А. В., Изварина H. JI. Морфин уменьшает чувствительность к потенциалу медленных натриевых каналов // Физиол. журнал. 1999. Т. 85. № 2. С. 225-236.

8. Крылов Б. В., Вилин Ю. Ю., Подзорова С. А., Чалисова Н. И. Натриевые каналы сенсорных нейронов как возможная молекулярная мишень действия этанола// Сенсорные системы. 1996а. Т. 10. N 4. С. 52-66.

9. Крылов Б. В., Подзорова С. А., Вилин Ю. Ю. Кинетика инактивации натриевых каналов сенсорных нейронов зависит от вида буфера водородных ионов// Российский Физиологический Журнал. 19966. N7. С. 1-10.

10. Можаева Г. Н., Наумов А. П., Носырева Е. Д. Кинетика спада натриевого тока при реполяризации аксональной мембраны в норме и в присутствии токсина скорпиона // Нейрофизиология. 1980. Т. 12. № 5. С. 541-549.

11. Можаева Г. Н., Наумов А. П., Ходоров Б. И. Активация и инактивация модифицированных батрахотоксином натриевых каналов мембраны нервного волокна лягушки//Нейрофизиология. 1984. Т. 16. N 1.С. 18-26.

12. Новиков С. Н. Феромоны и размножение млекопитающих: физиологические аспекты. Л.: "Наука" (ЛО), 1988. 168 с.

13. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. М., 1987. 815 с.

14. Свердлов Л. М., Ковнер М. А., Крайнов Е. П. Колебательные спектры многоатомных молекул. М.: «Наука», 1970. 468 с.

15. Akopian A.N., Sivilotti L., Wood J.N. A tetrodotoxin-resistant voltage-gated sodium channel expressed by sensory neurons // Nature. 1996. Vol. 379. N. 18. P. 257-262.

16. Albone E.S. Mammalian semiochehemistry: the investigation of chemical signals between mammals. London: Wiley. 1984

17. Aimers W., Levinson R. Tetrodotoxin binding to normal and depolarized frog muscle and conductance of a single sodium channel// J. Physiol. 1975. V. 247. N 2. P. 483-509.

18. Anholt R.R.H. Molecular physiology of olfaction // Am. J. Physiol. 1989. Vol. 257. P. C1043-C1045.

19. Anholt R.R., Aebi U., Snyder S.H. A partially purified preparation of isolated chemosensory cilia from the olfactory epithelium of the bullfrog, Rana catesbeiana II J. Neurosci. 1986. Vol. 6. N. 7. P. 1962-1969.

20. Bach A.C., Selsted M.E., Pardi A. Two-dimensional NMR studies of the antimicrobial peptide NP-5 // Biochemistry. 1987. N 26. Vol.14. P. 4389-4397.

21. Baldaccini N.E., Gagliardo A., Pelosi P., Topazzini A. Occurrence of a pyrazine binding protein in the nasal mucosa of some vertebrates // Comp. Biochem. Physiol. 1986. N 84. Vol. 3. P. 249-253.

22. Baker R., Herbert R.H., Lomer R.A. Chemical components of the recent gland of male Dacus cucarbitae the melon fly // Experientia. 1982. Vol. 38. P. 232-233.

23. Brophy J.J. Pyrazines obtained from insects: their source, identification, synthesis and function // Studies in natural products chemistry. 1989. Vol. 5. P. 221-273.

24. Brune K., Spitznagel J.K. Peroxidaseless chicken leukocytes: isolation and characterization of antibacterial granules // J. Infect. Dis. 1973. Vol. 12. N1. P. 84-94.

25. Caffrey J.M., Eng D.L., Black J.A., Waxman S.G., Kocsis J.D. Three types of sodium channels in adult rat dorsal root ganglion neurons // Brain Res. 1992. V. 592. N1-2. P. 283-297.

26. Cardenas C. G., Dei Mar L. P., Cooper B. Y., Scroggs R. S. 5HT4 receptors couple positively to tetrodotoxin-insensitive sodium channels in a subpopulation of capsaicin-sensitive rat sensory neurons // J. Neuroscience. 1997. V. 17. № 19. P. 7181-7189.

27. Carrier G.O., Ikeda S.R. TTX-sensitive Na+ channels and Ca2+ channels of the L- and N-type underlie the inward current in acutely dispersed coeliac-mesenteric ganglia neurons of adult rats // Pfliigers Arch. 1992.V. 421. N1. P. 7-16.

28. Chabal C., Russell L.C., Burchiel K.J. The effect of intravenous lidocaine, tocainide, and mexiletine on spontaneously active fibers originating in rat sciatic neuromas // Pain. 1989. V. 38. N. 3. P. 333-338.

29. Chiu S.Y. Inactivation of sodium channels: second order kinetics in myelinated nerve // J. Physiol. 1977. V. 273. № 3. P. 573-596.

30. Cociancich S., Ghazi A., Hetru C., Hoffmann J.A., Letellier L. Insect defensin, an inducible antibacterial peptide, forms voltage-dependent channels in Micrococcus luteus // J. Biol. Chem. 1993. N 268. Vol. 26. P. 19239-19245.

31. Cohen S.A., Barchi R.L. Voltage-dependent sodium channels // Int. Rev. Cytol. 1993. V.137C: P. 55-103.

32. Daher K.A., Lehrer R.I., Ganz T., Kronenberg M. Isolation and characterization of human defensin cDNA clones // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1988. N 85. Vol. 19. P. 7327-7331.

33. Devys M., Barbier M., Kollmann A., Bosquet J.-F. Septorine and N-methoxy septorine, substituted pyrazines from the fungus Septoria nodorum Berk. Tetrahederon lett. 1978. Vol. 23. P. 5409-5412.

34. Eisenhauer P.B., Harwig S.S., Lehrer R.I. Cryptdins: antimicrobial defensins of the murine small intestine // Infect. Immun. 1992. N 60. Vol. 9. P. 3556-3565.

35. Elliott A. A., Elliott J. R. Characterization of TTX-sensitive and TTX-resistant sodium currents in small cells from adult rat dorsal root ganglia//J. Physiol. (Lond.) 1993. V. 463. P. 39-56.

36. Elsbach P., Weiss J. Oxygen-independent antimicrobial systems of phagocytes // Inflammation. Basic principles and clinical correlates. New York. 1992. P. 603-636.

37. Fors S.M., Olofsson B.K. Alkylpyrazines, voltiles formed in the Maillard rection. II. Sensory properties of five alkylpyrazines // Chem. Senses. 1986. Vol. 2. P. 65-77.

38. Ganz T., Selsted M.E., Szklarek D., Harwig S.S., Daher K., Bainton D.F., Lehrer R.I. Defensins. Natural peptide antibiotics of human neutrophils // J. Clin. Invest. 1985. N 76. Vol. 4. P. 1427-1435. " '

39. Ganz T. Extracellular release of antimicrobial defensins by human polymorphonuclear leukocytes // Infect. Immun. 1987. Vol. 55. N 3. P. 568571.

40. Ganz T., Oren A., Lehrer R.I. Defensins: microbicidal and cytotoxic peptides of mammalian host defense cells // Med. Microbiol. Immunol. (Berl). 1992. N 181. Vol. 2. P. 99-105.

41. Gennaro R., Dolzani L., Romeo D. Potency of bakterial proteins purified from the large granules of bovine neutrophils // Infect. And Immun. 1983. Vol. 40. N2. P. 684-690.

42. Goodrich B.S., Hesterman E.R., Shaw K.S., Mykytowez R. Identification of some volatile compaunds in the odour of faccal pellets of the rabbit, Oryclolagus cuniculus II J. Chem. Ecol. 1981. Vol. 7. P. 817827.

43. Guy H.R., Conti F. Pursuing the structure and function of Voltage-gated channels// Trends in Neurosciences. 1990. V. 13. N 6. P. 201-206.

44. Hamill O. P., Marty A., Neher E., Sakmann B., Sigworth F. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches// Pflugers Arch. 1981. V. 391. N 1. P. 85-100.

45. Hehre W. J., Ditchfield R., Pople J. A. Self-consistent molecular orbital methods. XII further extensions of Gaussian-Type basis sets for use in molecular orbital studies of organic molecules // J. of Chemical Physics. 1972. V. 56. № 5. P. 2257-2261.

46. Heinemann S.H., Terlau H., Stuhmer W., Imoto K., Numa S. Calcium channel characteristics conferred on the sodium channel by single mutations //Nature. 1992. Vol. 356. N 6368. P. 441-443.

47. Hering P.J. Aspects of bioluminescence of fishes//A. Rev. Oceanogr. Mar. Biol. 1982. Vol. 20. P. 415-470.

48. Hill C.P., Yee J., Selsted M.E., Eisenberg D. Crystal structure of defensin HNP-3, an amphiphilic dimer: mechanisms of membrane permeabilization // Science . 1991. Vol. 251. N 5000. P. 1481-1485.

49. Hille B. Local anesthetics: Hidrophilic and hydrophobic pathways for the drug-receptors interaction // J. Gen. Physiol. 1977. V. 69. № 4. P. 497515.

50. Hodgkin A. L., Huxley A. F. Currents carried by sodium and potassium ions through the membrane of the giant axon of Loligo// J. Physiol. 1952a. V. 116. N 4. P. 449-472.

51. Hodgkin A. L., Huxley A. F. The dual effect of membrane potential on sodium conductance in the giant axon of Loligo// J. Physiol. 1952b. V. 116. N4. P. 497-506.

52. Hodgkin A. L., Huxley A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve// J. Physiol. 1952c. V. 117. N4. P. 500-544.

53. Hodgkin A. L., Huxly A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve// J. Physiol. 1952d. V. 117. N4. P. 500-544.

54. Hodinka R.L., Modrzakowski M.C. Bactericidal activity of granule contents from rat polymorphonuclear leukocytes // Infect. Immun. 1983. Vol. 40. N1. P. 139-146.

55. Hristova K., Selsted M.E., White S.H. Critical role of lipid composition in membrane permeabilization by rabbit neutrophil defensins // J. Biol. Chem. 1997. Vol.'272. N 39. P. 24224-24233.

56. Jeftinija S. The role of tetrodotoxin-resistant sodium channels of small primary afferent fibers //BrainRes. 1994. Vol. 639. N 1. P. 125-134.

57. Jemiolo B., Andreolini F., Novotny M. Chemical and biologicl investigation of femle mouse pheromones // Chemical signals in vertebrates / Eds. Duval D., Muller-Schwarze D., Silverstein R.M. N 4. London. Pienum Press. P. 79-85. 1986.

58. Kagan B.L., Selsted M.E., Ganz T., Lehrer R.I. Antimicrobial defensin peptides form voltage-dependent ion-permeable channels in planar lipid bilayer membranes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. N 87. Vol.1. P. 210-214.

59. Kaliszan R., Pilarski B., Osmialowski K., Strzalkowska-Grad H., Hac E. Analgesic activity of new pyrazine CH and NH acids and their hydrophobic and electron donating properties // Pharm. Weekbl. Sci., 1985. V. 7. №4. P. 141-145.

60. Kayano T., Noda M., Flockerzi V., Takahashi H., Numa S. Primary structure of rat brain sodium channel III deduced from cDNA sequence// FEBS Lett. 1988. V. 228. N 1. P. 187-194.

61. Keynes R., Rojas E. Kinetics and steady-state properties of the charged system controlling sodium conductance in the squid giant axon// J. Physiol. 1974. V. 239. P. 383-434.

62. Kostyuk P. G., Krishtal O. A., Pidoplichko V. I. Effect of internal fluoride and phosphate on membrane currents during intracellular dialysis of nerve cells//Nature. 1975. V. 257. N 5528. P. 691-693.

63. Kostyuk P. G., Veselovsky N. S., Tsyndrenko A. Y. Ionic currents in the somatic membrane of rat dorsal root ganglion neurons.// Neuroscience. 1981. V. 6. N12. P. 2423-2430.

64. Mak P., Wojcik K., Thogersen I.B., Dubin A. Isolation, antimicrobial activities, and primary structures of hamster neutrophil defensins // Infect. Immun. 1996. Vol. 64. N 11. P. 4444-4449.

65. Makino E., Iwasaki N., Yagi N., Ohashi T., Kato H., Ito Y., Azuma

66. H. Studies on antiallergic agents. I. Synthesis and antiallergic activity of novel pyrazine derivatives // Chem. Pharm. Bull. (Tokyo). 199.0. Vol. 38. №1.P. 201-207.

67. Mandel G. Sodium channel regulation in the nervous system: how the action potential keeps in shape // Curr. Opin. Neurobiol. 1993. Vol. 3. N 3. P. 278-282.

68. Matsuda Y., Yoshida S., Yonezawa T. Tetrodotoxin sensitivity and Ca component of action potentials of mouse dorsal root ganglion cells cultured in vitro II Brain Res. 1978. Vol. 154. N 1. P. 69-82.

69. Maue R.A., Dionne V.E. Patch-clamp studies of isolated mouse olfactory receptor neurons // J. Gen. Physiol. 1987. Vol. 90. N1. P. 95-125.

70. Maurer B., Ohloff G. Zurkenntnis der strickstoffhaltigen. Inhaltsstroffe von Castoreum II Helv. Chim. Acta. 1976. Vol. 59. P. 11691185.

71. McCapra F. Review Lecture: the chemistry of bioluminescence // Proc. R. Soc. Lond. B. 1982. Vol. 215. P. 247-272.

72. Michaelson D., Rayner J., Couto M., Ganz T. Cationic defensins arise from charge-neutralized propeptides: a mechanism for avoiding leukocyte autocytotoxicity? // J. Leukoc. Biol. 1992. Vol. 51. N. 6. P. 634639.

73. Moore B.P., Brown W.V. Identification of warning odour components, bitter principles and antifedants in an aposematic beetlie: Metriochyrchus rpipidius (Coleptera; Lycidae) // Insect Biochem. 1981. Vol. 11. P. 493-499.

74. Murphy C.J., Foster B.A., Mannis M.J., Selsted M.E., Reid T.W. Defensins are mitogenic for epithelial cells and fibroblasts // J. Cell. Physiol. 1993. Vol. 155. N. 2. P. 408-413.

75. Nie S. Q., Majarais I., Kwan C. Y., Epand R. M. Analogues of tetramethylpyrazine affect membrane fluidity of liposomes: relationship to their biological activities //Eur. J. Pharmacol. 1994. V. 266. № 1. P. 11-18.

76. Noda M., Ikeda T., Kayano T. Existence of distinct sodium channel messenger RNAs in rat brain// Nature. 1986. V. 320. N 6056. P. 188-192.

77. Noda M., Shimizu S., Tanade T. Primary structure of Electrophorus electricus sodium channel deduced from cDNA sequence// Nature. 1984. V. 312. N5990. P. 121-127.

78. Noda M., Suzuki H., Numa S., Stiihmer W. A single point mutation confers tetrodotoxin and saxitoxin insensitivity on the sodium channel II // FEBS Letters. 1989. V. 259. № 1. P. 213-216.

79. Oh Y., Sashihara S., Waxman S.G. In situ hybridization localization of the Na+ channel beta 1 subunit mRNA in rat CNS neurons // Neurosci. Lett. 1994. Vol. 176. N 1. P.119-122.

80. Okrent D.G., Lichtenstein A., Ganz T. Direct cytotoxicity of PMN granule proteins to human lung-derived cell and endothelial cells // Amer. Rev. Respirât. Disease. 1990. Vol. 141. P. 179-185.

81. Osipchuk Y. V., Timin E. N. Electrical measurements on professed cells. In: Intracellular perfusion of excitable cells. London. 1984. Eds. P. G.Kostyuk and O. A.Kiyishtal. P. 103-129.

82. Ouellette A.J., Greco R.M., James M., Frederick D., Naftilan J., Fallon J.T. Developmental regulation of cryptdin, a corticostatin/defensinprecursor mRNA in mouse small intestinal crypt epithelium // J. Cell. Biol. 1989. Vol. 108. N 5. P. 1687-1695.

83. Panyutich A.V., Ganz T. Activated alpha 2-Macroglobulin is a principal defensin-binding protein // Amer. J. Respirat. Cell and Molec. Biol. 1991. N5. P. 101-106.

84. Panyutich A.V., Voitenok N.N., Lehrer R.I., Ganz T. An enzyme immunouassay for human defensins// J. Immunol. Meth.1991. Vol. 141. P. 149-155.

85. Pardi A., Hare D.R., Selsted M.E., Morrison R.D., Bassolino D.A., Bach A.C. Solution structures of the rabbit neutrophil defensin NP-5 // J. Mol. Biol. 1988. Vol. 201. N. 3. P. 625-636.

86. Pevsner J., Reed R.R., Feinstein P.G., Snyder S.H. Molecular cloning of odorant-binding protein: member of a ligand carrier family // Science. 1988. Vol. 241. N4863. P. 336-339.

87. Pevsner J., Trifiletti R. R., Strittmatter S. M., Snyder S. H. Isolation and characterization of an olfactory receptor protein for odorant pyrazines // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. V. 82. № 9. P. 3050-3054.

88. Pevsner J., Sklar P. B., Snyder S. H. Odorant-binding protein: localization to nasal glands and secretions // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V. 83. № 13. P. 4942-4946.

89. Pusch M., Noda M., Stuhmer W., Numa S., Conti F. Single point mutations of the sodium channel drastically reduce the pore permeability without presenting its gating// Eur. Biophys. J. 1991. V. 20. N 3. P. 127133.

90. Reed R.R. How does the nose know? // Cell. 1990. Vol. 60. N 1. P.1.2.

91. Rogart RB, Cribbs LL, Muglia LK, Kephart DD, Kaiser MW Molecular cloning of a putative tetrodotoxin-resistant rat heart Na+ channel isoforra. Proc Natl Acad Sci U S A 1989 Oct 86:20 8170-4

92. Ronnette G.V., Snyder S.H. Molecular messengers of olfaction // TINS. 1992. Vol. 15. N 12. P. 508-513.

93. Roy M.L., Narahashi T. Differential properties of tetrodotoxin-sensitive and tetrodotoxin-resistant sodium channels in rat dorsal root ganglion neurons // J. Neurosci. 1992. Vol. 12. N6. P. 2104-2111.

94. Selsted M.E., Brown D.M., DeLange R.J., Lehrer R.I. Primary structures of MCP-1 and MCP-2, natural peptide antibiotics of rabbit lung macrophages // J. Biol. Chem. 1983. Vol. 258. N 23. P. 14485-14489.

95. Selsted M.E., Szklarek D., Lehrer R.I. Purification and antibacterial activity of antimicrobial peptides of rabbit granulocytes // Infect. Lmmun. 1984. Vol. 45. N1. P. 150-154.

96. Selsted M.E., Brown D.M., DeLange R.J., Harwig S.S., Lehrer R.I. Primary structures of six antimicrobial peptides of rabbit peritoneal neutrophils // J. Biol. Chem. 1985. Vol. 260. N. 8. P. 4579-4584.

97. Selsted M.E., Harwig S.S. Purification, primary structure, and antimicrobial activities of a guinea pig neutrophil defensin // Infect. Immun. 1987, Vol. 55. N 9. P. 2281-2286.

98. Selsted M.E., Miller S.I., Henschen A.H., Ouellette A.J. Enteric defensins: antibiotic peptide components of intestinal host defense // J. Cell. Biol. 1992. Vol. 118. N. 4. P. 929-936.

99. Selsted M.E. Investigational approaches for studying the structures and biological functions of myeloid antimicrobial peptides // Genet. Eng. (N Y). 1993. Vol. 15. P. 131-147.

100. Spalding B. Properties of toxin-resistant sodium channels produced by chemical modification in frog skeletal muscle// J. Physiol. (Lond). 1980 V. 305. P. 485-500.

101. Spitznagel J.K. Nonoxidative antimicrobial reactions of leukocytes // Contemp. Top. Immunobiol. 1984. Vol. 14. P. 283-343.

102. Strichartz G. R. The inhibition of sodium currents in myelinated nerve by quaternary derivatives of lidocaine // J. Gen. Physiol. 1973. V. 62. № 1. P. 37-57.

103. Stuhmer W. Conti F., Suzuki H., Wang X., Noda M., Yohagi N., Kubo H., Numa S. Structural parts in ved in activation and inactivation of sodium channel//Nature. 1989. V. 339. N 6226. P. 597-603.

104. Svinarich D.M., Wolf N.A., Gomez R., Gonik B., Romero R. Detection of human defensin 5 in reproductive tissues // Am. J. Obstet. Gynecol. 1997. Vol. 176. N 2. P. 470-475.

105. Terlau H., Heinemann S., Stuhmer W., Pusch M., Conti F., Imoto K., Numa S. Mapping the site of block by tetrodotoxin and saxitoxin of sodium channel II//FEBS Lett. 1991. V. 293. N 1-2. P. 93-96.

106. Tonegawa S. Somatic generation of antibody diversity // Nature. 1983. Vol. 302. N 5909. P. 575-581.

107. Trotier D. A patch-clamp analysis of membrane currents in salamander olfactory receptor cells // Pfluegers Arch. 1986. V. 407. № 6. P. 589-595.

108. Valore E.V., Ganz T. Posttranslational processing of defensins in immature human myeloid cells // Blood. 1992. Vol. 79. N 6. P. 1538-1544.

109. Venanzi C. A., Plant C., Venanzi T. J. Molecular recognition of amiloride analogs: a molecular electrostatic potential analysis. 1. Pyrazine ring modifications // J. Med. Chem. 1992. V. 35. № 9. P. 1643-1649.

110. Walton E. The preparation, properties and action on taphylococcus aureus of purified fractions from the cationic proteins of rabbit polymorphonuclear leucocytes // Br. J. Exp. Pathol. 1978. Vol. 59. N 4 P. 416-431.

111. Wheeler J.W., Blum S.M. Alkylpyrazine alarm pheromones in ponerine ants // Science, Wash. 1973. Vol. 182. P. 501-503.

112. Woolfson A., Rothschild M. Speculating about pyrazines // Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 1990. N242. Vol. 1304. P. 113-119.

113. Zeya H.I., Spitznagel J.K., Schwab J.H. Antibacterial action of PMN lysosomal cationic proteins resolved by density gradient electrophoresis // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1966. Vol. 121. N 1. P. 250-253.107 ' ■

114. Zeya H.I., Spitznagel J.K. Characterization of cationic protein-bearing granules of polymorphonuclear leukocytes I I Lab. Invest. 1971. Vol. 24. N. 3.P. 229-236.

115. Zukin R. S., Sugarman J. R., Fitz-Syage M. L., Gardner E. L., Zukin S. R., Gintzler A. R. Naltrexone-induced opiate receptor supersensitivity// Brain Res. 1982. V. 245. N 2. P. 285-292.