Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы возникиовения химерных элементов и их использование для изучения взаимодействия между регуляторными элементами на больших дистанциях уDrosophila melanogaster

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Механизмы возникиовения химерных элементов и их использование для изучения взаимодействия между регуляторными элементами на больших дистанциях уDrosophila melanogaster"

На правах рукописи УДК 575.22:595.773.4.

РГБ ОД

1 3 ДЕК 2003

ГОЛОВНИН АНТОН КЛЕМЕНСОВИЧ

Механизмы возникновения химерных элементов и их использование для изучении взаимодействия между регуляторными элементами на больших дистанциях у йгоБоркИа melanogas^er

Специальность 03.00.26 - молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2000

Работа выполнена в лаборатории регуляции генетических процессов Института биологии гена РЛН

Научный руководитель:

Чл.-корр. РАН., доктор биологических наук, профессор Георгиев П.Г. Официальные оппоненты:

академик РАН, доктор биологических наук, профессор Ильин Ю.В. кандидат биологических наук Симонова О.Б.

Ведущая организация: Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН.

Диссертационного совета Д 200.30.01 при Институте биологии гена РАН по адресу: И" Москва, ул. Вавилова, д. 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 117334, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

Защита диссертации состоится

ноября 2000 года в

час. на засед

Автореферат разослан

октября 2000 года.

Ученый секретарь

Диссертационного совета

Грабовская Л.С.

Еочо.М,о

Общая характеристика работы

Актуалыгость проблемы. Геномы, как правило, содержат разнообразные мобильные элементы (транспозоны). Частота перемещений элементов довольно низкая, но поскольку число их велико, транспозиции оказывают большое влияние на изменчивость видов, так как часто оказываются причиной различных хромосомных перестроек и генных мутаций. Наиболее исследованным мобильным элементом у Drosophila melanogaster является Р элемент, который имеет на концах короткие инвертированные повторы. Ранее были описаны супернестабильные мутации, которые были индуцированы в результате активных транспозиций Р элемента (Georgiev and Yelagin, 1992). Для супернестабильных мутаций были характерны: 1) высокая частота аллельных переходов, достигающая нескольких десятков процентов; 2) разнообразие фенотипичсского проявления аллелей от полной инактивации гена до его супер-акгивации. Молекулярный анализ супернестабильных мутаций выявил, что некоторые га них индуцированы химерным элементом, который состоит из уникальных фрагментов генома дрозофилы, окруженных копиями Р элемента (Georgiev et. al. 1997). Мобилизация активности Р элемента приводит к инверсиям последовательности между Р элементами, увеличениям или уменьшениям размера фрагмента ДНК, заключенного между Р элементами и другим событиям. При этом внутренние части химерного элемента, содержащие регуляторные последовательности, могут позитивно или негативно влиять на экспрессию рядом расположенного гена, что, вероятно, может играть роль в эволюции регуляторных последовательностей гена. Химерные элементы удобны как модельные системы, так как можно получать любые изменения как внутри химерного элемента так и инверсии между химерным элементом и Р элементом, расположенном на небольшом расстоянии.

Одной из нерешенных задач является механизм действия инсуляторов. Инсуляторы - это регуляторные элементы, которые способны блокировать взаимодействия между энхансером и промотором гена в случае нахождения между ними. Выяснение механизмов действия инсуляторов представляет интерес для изучения принципов организации генома и регуляции, экспрессии с независимой от окружающих последовательностей экспрессией генов (Roseman ct al. 1995). Наиболее хорошо исследованный инсулятор находится в 5' области ретротранспозона МДГ4 дрозофилы. В настоящее время проводится систематическое изучение действия инсулятора, расположенного на небольших расстояниях от промотора и энхансера. Научный интерес вызывают также взаимодействия между инсулятором и регуляторными элементами, расположенными на больших расстояниях. Для этого были использованы модельные системы, основанные на супернестабильных мутациях.

Цели и задачи исследования. Основными целями настоящего исследования являются выявление с помощью модельной генетической системы механизмов возникновения химерных элеме1ггов и анализ взаимодействий между регуляторными элементами на больших расстояниях.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Создать модельную систему на основе химерных мобильных элементов для изучения механизмов супернестабильности и взаимодействия между регуляторными элементами на больших расстояниях;

2. Выяснить специфичность взаимодействий между энхансерами и нромотороми, находящихся на больших расстояниях друг от друга;

3. Изучить действие su(Hw) инсулятора на регуляторные элементы, расположенные на больших дистанциях'друг от друга

4. Исследовать механизм и условия возникновения химерных мобильных элементов;

Научная новизна и практическое значение работы. Впервые получена система, позволяющая исследовать механизм возникновения химерных мобильных элементов. Показано, что мобильные элементы, кодирующие транспозазу, могут служить важным фактором в эволюции, образуя генные дупликации и новые регуляторные системы, контролирующие экспрессию рядом расположенного гена.

На основе данной системы также описано новое свойство инсулятора su(Hw) - частично блокировать не изолированные энхансеры, и выявлено отсутствие функциональной границы между соседними транскрипционными доменами: AS-C и локусом yellow.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на летней российско-швейцарской школе "Роль хроматина в регуляции транскрипции" (199S) ИБГ РАН, на межлабораторном семинаре (1999) ИБГ РАН, конференции «25 лет нуклеосоме» в Пэн-Стэйте (США) (1999) и ежегодной дрозофилиной конференции в С-Петербурге (2000 г.)

Публикации. По теме диссертации опубликованы три печатные работы.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на ¡ страницах,

включая таблиц, j ^ рисунков и состоит из разделов: введение, обзор литературы,

материалы и методы, результаты и обсуждения, выводы и список литературы из 148 наименований.

Результаты исследования

1. su(Hw) пнсулятор может блокировать взаимодействие между энханссром н промотором, не находясь непосредственно между ними.

1.1 Молекулярная структура мутаций в исходной линии, /"'sc1™'. Основная часть данного исследования была проведена с использованием у1"*'scлинии, которая содержит мутации в соседних локусах yellow (у2"') и scute {sc"''). Исходный аллель у"" (Рис. 1 А) имеет две инсерции в регуляторной области: мобильный элемент МДГ4 в позиции -700 п.н. и химерный мобильный элемент, размером 19.7 т.п.н., в позиции -69 п.н. по отношению к старту транскрипции гена yellow. Уникальные последовательности химерного элемента ограничены двумя одинаковыми делегированными копиями Р элемента Мухи несущие у"™ имеют окраску тела и крыльев как мухи дикого типа (Рис. 2А). Активация транскрипции гена yellow в теле и крыльях индуцируется энхансерами, которые находятся в химерном элементе. После мобилизации Р элементов в у"" линии, был получен мутант, который имел желтую окраску тела, крыльев и грудных щетинок. Одновременно производный мутант имел выраженный sc-фенотип, т.е. некоторые щетинки либо полностью отсутствовали, либо присутствовали только у части мух. Новые аллели локусоз yellow и scute были обозначены как у1"1'и sc""' (Рис 2А и Б), а соответствующая линия - у1™'scmtl.

Для изучения молекулярных изменений в структуре геномного района yellow-ac-sc локуса в '/'"'sc""1 линии по сравнению с родительской у*ш линией, было проведено клонирование этих районов ДНК выделенных из y^'sc""' линии. Было обнаружено, что комплексная мутация y*"'sc""' была образована инверсией участка генома между Р2 элементом и Р4 элементом. Кроме того, с одной стороны инверсии Р2 элемент граничит с РЗ элементом, который оказался в инвертированной ориентации по отношению к и Р2 элементам. С другой стороны инверсии находится ген yellow, который в положении -69 пн имеет инсерцию РА элемента (Рис. 1Б). Таким образом, инверсия (47 т.п.н.) изменила ориентацию yellow, ас и sc генов(Рис. 1А , ЗА). Мутанты y!m'sc"'' имеют вариабельный sc фенотип (Рис 2Б), что является следствием частичной активности генов ас и sc. Можно предположить, что AS-C энхансеры частично активируют промоторы ас и sc генов, несмотря на то, что в результате инверсии энхансеры удалены от регулируемых ими промоторов. С другой стороны эти мухи лишены окраски в крыльях, кутикуле тела , щетинках брюшка, ног и частично крыльев (Рис. 2А). Такую репрессию гена yellow можно объяснить блокированием транскрипции гена yellow в его новом положении.

1.2 su(Hw) ннсулятор блокирует энхансеры AS-C в мутации y2n*'sc В /'"'sc""' мутации su(Hw)-cBS3biBaiomHfi район не входит в инверсию (Рис. 1В и ЗА). Для определения

Б

mrv

V

y2nslscmesI

sc ас yellow

♦ янверсвя ♦

• I----------!..... !..................^

50 60 70

—Li_

20 10 -

О -10

UJ P2P3

в

генетты

sc^'^sc"

A OR A№ HU PV OC PS APA ASA SC POR PSA

■ ■■■■ИИ И Bail

■ваяиинииап

sc» яипввппп впп

sc» ппппппппппп

/"•sc"; +/+

su(Hw?/su(Hw)"

moti'Vinod''

su(Hw)'/su(Hw}'; mod"/rrtod''

su(Hw)T°/su(HwY~"

su{Hwj/su(Hw)

su(Hwf"/su(HwT'

ЯВЯВВИИЕ НПП

В1ВВППЕ1П П ППП ртипппппппп

ВИ1НИВВ ивпп ВВИВИЯИИРПП

И El И BIB SI П П Rinn

Рисунок I» Структура и свойства исчидной мутации в yeltow, ас и sc локусах. (А) Схематическое изображение yellow, ас a sc районов в у"" линии. Стрелки с треугольниками обозначают инсерцию МДГ 4 и /* элемента в соответствующих мутациях .Размер инсерции соответствует основанию треугольника. Ориентация Í' элементов показана стрелками Тонкие горизонтальные стрелки показывают место, направление и приблизительный размер участков транскрипции. Черный круг обозначает Su(Hw) связывающий фтонМДГ4. Энхансеры обозначены занлрнхованныыи прямоугольниками с соответствующими номерами: 1 - энхансеры тела и крыльев гена yellow, 1 - регуляторная область химерного элемента, 3 - энхансер щетинок, 4 - энхансеры, отвечающие за формирование anterior и posterior doisocentral тцетинок, S - энхапсеры anterior supra-alar и posterior postalar, б - энхансср anterior pestaiar, 7 - ANP энхансср, 8 - scuteUar энхансер. Размер делеции S(f обозначен протяженным белым прямоугольником. Эта деления включает в себя энхансеры, отвечающие за формирование pcstveitical, AOR и ocellar щетинок. (Б) Схематическое изображение yellow, ас и sc районов в у2™ лшщн. Обозначения те же, что и на рисунке 1А.(В) Фенотипы sc мутаций у самцов. Стандартная номенклатура для каждой щетинки обозначена следующим образом: HU, humerais', ASA, anterior supra-alars', APA, anterior post-a!ars\ PS-prosuturals; AOR, anterior orbiials; OC, ocellars; PV, postveriicals; ANP, anterior notopleuials; SC, scutellars. На рисунке представлены только измененные щетинки. Полые квцлраты означают наличие данной щетинки (дикий тип). Квадрата заполненные на одну четверть, на половину н полностью означают, что соответста^ющис щетинки отсутствуют на 10,50 и 90% соответственно. Для scutellars прямоугольники закрашенные на четверть, на половину или полностью означают 3 - 4,2 - 3 или 0-1 scutellar щетинок соответственно. Количество щетинок было определено как сроднее среди ста проанализированных мух. Характеристика фенотипов sc", sc4 sc**"" или sc" была представлена в работе Campuzano et al.

Щетинки Гр II Кр

Бр

a* ft « I i

II »

il . .1!

11 Uli

ANP PV ОС АО* PS АРА ASA HU SC

п Я я

ж

Я Я

ШШШ

Рис. 2. Мутаипше фенопшы.(А) Мутангныс у-фенотняы у самцов. Количество кружков соответствует уровню пигментации в Т - кутикуле тела, Кр- крыльях, Гр - щсгинкя груди,Н -щетинки на ногах, Кр - щетинки на крыльях, Бр -брюппше щетинки. Пять кружков соответствует дикому типу, а отсутствие кружков - ноль-аллслю. (Б) Мутангаые фепотппи по sc гену у самцов. Представлена стандартная номенклатура щетинок (LINDSLEY and ZIMM1992): HU, humerals; ASA, anterior supra-alars; APA, anterior post-alars; PS-pre suturais', AOR, anterior Orbitals; ОС, ocellarsr, PV, postverticals; ANP, anterior notopleurals; SC, scutellars. Ha pneyme показаны только измененные щегипки. Отсутствие, один или два квадрата показывает, что определенная щетинка отсутствует у > 90%, >50% или >10% проанализировавших мух соответственно. Те же символы у SC показывают, что 0-1,2-3 или 3-4 scutellar щетинки присутствуют; как среднее среди ста проанализированных мух Три квадрата означают, что данная щетинка присутствует у всех мух.

GH KHRX ннхн

В

AOR ANP m PV ОС PS AFW ASA SC

/-sc"'; +Л

su(Hw)'/su(Hw)'

/-"sc*"; +/+ su(Hwf/su(Hw)'

y"'sc"; +/+

В1Е1ПППППП П 51ИПППППП П

si snnnnnn n П

□ ППППППП П

ГТГ

X H H X H

эк 3. Структура и фенотип У^'^с;""*1' производных. (А) Структура мутации и ее производной

¡¡той при рентгеновском облучения. Обозначения эндонухлеаз: И - £соК1; Н - Н/жИИ; в - Вд1II; X - ХЬо\\ В -

I; 3 - га/1; Р - РъЯ. Фрагменты геномной ДНК: Шт1\П-ВатН\ (уе1Ь&), ЕсоЯ]-ВдП\ (АЭ-С), Н^Ш-ЕсоШ

)ный элемент), используемые для анализа по Саузерну, обозначены тонкими линиями. Последов

ости Р элементов обозначены прямоугольниками. Ориентация и Р элементов обознэтена стрелками.

руктура у^с"производных линии у2™^*?™1. (В) Фенотипы мутаций у самцов. Все обозначения как на

се 1В.

влияния su(Hw) инсулятора на sc фенотип, мы создали комбинацию мутаций y^'sc""' и транс-гетерозиготы su(Hwf/su(Hwf мутаций, которые полностью инактивируют функции sufflw) гена. Неожиданно su(Hwf/su(Hwf трансгетерозигота привела к сильной супрессии мутантного íc-фенотипа мух: только humeral (HU), частично anterior orbital (AOR) и anterior notopleural (ANP) щетинки отсутствовали. При этом нормальное развитие всех остальных щетинок полностью восстанавливалось (Рис. 1В). Это указывает на то, что su(Hw) инсулятор, который физически не разделяет AS-C энхансеры и промоторы ас и sc генов, может влиять на активность AS-C энхансеров.

Белок Mod(mdg4) непосредственно взаимодействует с белком Su(Hw) и участвует в инсуляции. Мутация mod(mdg4)1'1' приводит к почти полной инактивации связывания этого белка с белком Su(Hw). Для выяснения роли Mod(mdg4) белка в блокировании AS-C энхансеров была создана линия, содержащая y,l"lsc""' и гомозиготу по мутации mod(mdg4)1"1. В гомозиготе мутация mod(mdg4)'"' оказывает на sc фенотип y1"J'scm'!l линии схожий, но менее выраженный эффект, чем мутация su(Hw) Vsufllw)1 (Рис. IB) Комбинация мутаций в генах mod(mdg4) и su(Hw) оказывает такой же эффект на у2"'sc""'пинию, как и su(Hw//su(Hwf трансгетерозигота в отдельности (Рис. 1 В).

Таким образом, можно предположить, что su(Hw) инсулятор нарушает взаимодействие между AS-C энхансерами и промторами генов ас и sc даже в том случае, если не расположен между ними.

U. su(Hw) инсулятор, расположенный в локусе yellow, отвечает за блокирование AS-C энхансеров в у1"" sc"*' лшшн. Инактивация Su(Hw) белка приводит к супрессии мутаитного sc фенотипа в у1"1' sc""' линии, что противоречит предыдущим наблюдениям. Для того чтобы проверить возможность присутствия дополнительного su(Hw) инсулятора в AS-C, мы проверили район 80 т.п.н. с помощью Саузерн блог анализа. При гибридизации с клонами, содержащими область гена yellow и AS-C, не было выявлено изменения паттернов рестриктных фрагментов в линии y^'sc""' относительно контроля. Это подтверждает, что в линии /"V нет.никаких дополнительных инсерций в AS-C район, содержащих su(Hw) инсулятор.

Был также проведен анализ девяти независимых y*"sc* производных линии у2'"'sc""', в которых произошла полная реверсия мутантного sc фенотипа и восстановление уровня пигментации тела и крыльев как у исходной у"" линии (Рис. ЗВ). Структура yellow-ac-sc района этих мух была проанализирована с помощью Саузерн блот анализа и в результате была обнаружена реинверсия участка ДНК между двумя Р элементами (Рис.ЗБ).

При этом в шести y*"'sc* производных два Р элемента (Pi и Р4), находящиеся в AS-C, имели ориентацию голова к голове. В других трех производных в AS-C был обнаружен только один Р элемент (РА). Введение su(Hw)Vsu(Hwf мутаций и гомозиготы по mod(mclg4/' мутации

не имели эффекта на sс фенотип y*"sc* мух (Рис. ЗВ). Таким образом, в AS-C нет дополнительного sii(Hw)-cBi3UBaiomero сайта. Однако, супрессия AS-C энхансеров Su(Hw) белком наблюдается только при наличии инверсии, которая нарушает нормальную структуру AS-C.

Как показано выше, su(Hw) инсулятор расположен в регуляторной части гена yellow и индуцирует мутантный sc фенотип. Для получения прямого подтверждения был проведен эксперимент по индукции делеции su(Hw) инсулятора из гена yellow под воздействием рентгеновского излучения. В общей сложности было проанализировано приблизительно 27000 мух из потомства облученных самцов У"1' sc""' линии. Среди них была найдена одна производная, y2nilJschl, в которой произошла частичная супрессия sc фенотипа. Для выяснения природы производной мутации был проведен сравнительный Саузерн блот анализ исходной у"'ас"' и y>""'4sc1"1 производной линии. В результате было выявлено, что исследуемый район отличается от родительского, у1"'1scотсутствием МДГ4 в регуляторной части теш yellow. Присутствие длинного концевого повтора (ДКП) на месте инсерции МДГ4 предполагает механизм вырезания МДГ4 в результате рекомбинации по ДКП (Рис.3 A). /"'V мутант имел фенотип аналогичный тому, который наблюдался в линии, содержащей комбинацию мутаций su(Hw)"/su(Hwf и у1"3'sc""'. При введении su(Hwf/su(Hwf мутации в y!"s!'lsch' линию не наблюдалось изменение sc фенотипа (Рис. ЗВ). Таким образом, 5и(Н\у)-инсулятор, расположенный в локусе yellow, отвечает за индукцию мутантного ic-фенотипа в У™'sc линии.

1.4. Мутантный sc-феиотип не зависит от инсуляции энхансеров гена yellow. Нельзя исключить возможности, при которой энхансеры yellow способны активировать sc ген в у2"1sc"линии. В этом случае su(Hw^ инсулятор находится между энханссрами и активируемым ими промотором, что объясняет его роль в индукции мутантного sc фенотипа. Для проверки этого предположения, был проведен эксперимент по удалению AS-C энхансеров с помощью инверсии. Линии с удаленными в результате инверсии AS-C энхансерами были получены в два этапа. Мы использовали в этом эксперименте три yi"°sc" производные полученные независимо из ytmlsc""'. Эти производные имели пигментацию кутикулы как у исходной у*"' линии, a sc фенотип как у мух дикого типа (Рис 2В). Мобилизовав Р элемент в этих линиях, мы получили 11 производных, имеющих экстремальный sc фенотип. В соответствии с 5с-фенотипом, производные были разделены на два класса: sc"m (менее сильный) и sccl" (более сильный) (Рис. 4В). Мы проанализировали структуру AS-C в sc"" и ,чс"ь" производных. Саузерн-блот анализ показал, что экстремальные фенотипы sc"" и sc'1" производных вызваны большой инверсией между Р элементами расположенными в AS-C и другом районе X хромосомы (Рис. 4А). Границы этих инверсий во всех случаях фланкированы одним или двумя Р элементами. Для индукции инверсии между yellow и AS-C, была проведена

._i 1 т.п.н.для инсерций

y+nslscebsl ^^ -FHFP

SRHXH SRHHX

У y+ns4sceas4

\ yellow ac ícsimkjhíx «Kjfn

80 170 60 50 40 30 Í-------------------------10.......20

ннвсрсня i

•^Химерный аяемемт**^ ■

РГ............. Р2 |

НХ SRHX Н SRHHX

рр 2nsl2 ebsl2 <tj—i " I I f ТГ"

HX > SC XH S R HHX

"=FHR FP v2ns41sceas41 FP "=FR

SRHXHHX } HX SRH

■nm=p v2ns42sceas42 п3" th

X11EQIR S J HX SRH

В

генотипы

PSA PNP PVTBR

sc4; +/+

y'V; +/+ su(Hwf/su(Hw)"

su(Hw)Vsu(Hw)"

su(Hw)2/su(Hw)"

y*™41 sc""4'; +/+ su(Hw)*/su(Hw)'

JELQ

РППН El El

В ilPH

алии

П П П ■

se"""; +/+

П П П

su(Hwf/su(Hw)" П П П

Рисунок 4. Схематическое изображение и фенотипы мутаций вызванных удалением регуляторной части AS-C. (А) Структура y-"sti*' y™V*J и (Б) их производных . (В) Фенотипы SC мутации у самцов и их взаимодействие с мутациями по генам Suflh и mod(mdg4). BR озшнает РРА, posterior oibi ОС, ANP, PV, HU, AOR, PS, APA, ASA и SC щетинки. Все обозначения как на рисунке 1L

еще одна мобилизация Р элемента. В результате мы отобрали девять независимых производных У^с"4' и /"к™. Инверсия между yellow и AS-C была подтверждена с помощью Саузерн-блот анализа. Все мухи имели экстремальный sc фенотип, свидетельствующий о неактивном состоянии ас и sc генов (Рис. 4В).

Вновь полученные инверсии, а также исходные y""'ic"4,/ и yf"'Jsc""' линии были проанализированы на фоне мутаций по su(Hw) и mod(mdg4) генам (Рис. 4В). При введении и mod(mdg4)'" /mod(mdg4)'*' мутаций в линиях с более экстремальным scb фенотипом никаких изменений sc фенотипа не наблюдалось. В то время как введение комбинации su(Hw)2/sv(Hw)v и mod(mdg4)Mfmod(mdg4)M мутаций в линии, имеющие sc"° фенотип, происходило слабое усиление муташного sc фенотипа (Рис. 4В). Таким образом, su(Hw) инсулятор блокирует некоторые негативные регуляторные элементы, находящиеся в захваченном инверсией районе. Полученные результаты подтверждают, что экспрессия sc гена зависит от AS-C знхансеров и не зависит от энхансеров гена yellow.

1.5. Промотор гепа yellow отвечает за частичное блокирование HU, ANP и AOR эпхансеро» AS-C. Как было показано ранее, инактивация Su(Hw) белка в su(Hwf/su(Hw)" трансгетерозиготс не приводит к полной супрессии мутантного sc фенотипа scлинии: щетинки Ни и частично ANP и AOR щетинки отсутствовали (Рис. 1В). Наиболее часто встречаемой производной y^'sc"1"' линии были yhsc"\ Зги производные имели полностью инакгивированый ген yellow (jMiojib мутация) и менее выраженный, чем в исходной ,

мутантный sc фенотип. (Рис. 2Б). В отличие от y2nslscmal линии, введение su(Hw)2/su(Hw)' и mod(mdg4)'"l/mod(mdg4)'"1 мутаций в yhsc"" полностью супрессировало мутантный scute фенотип (Рис. 5Б). Для выяснения разницы между yhsc°" и у2"'scлиниями, мы проанализировали пять независимых y'ssc°" производных, используя Саузерн-блот анализ и клонирование места изменения с помощью ПЦР. Было обнаружено, что все y''sd"' мутации индуцированы дслецией РА элемента, примыкающего к промотору гена yellow. Делеция захватывает практически весь Р элемент, кроме инвертированных концевых повторов (Рис. 5А). Эти данные предполагают, что последовательности РА элемента ответственны за супрессию образования Ни, ANP и AOR щетинках. Одновременно последовательности РА элемента необходимы для активации экспрессии тень yellow.

Для более детального анализа роли РА элемента, мы проанализировали 31 yhsc"" мутацию. Среди них 30 линий не имели РА элемента, а одна у1'16scш16 содержала РА элемент с делецией прилегающих 637 п.н., включавших в себя yellow промотор (Рис. 5А). При введении su(Hw)2/su(Hwf

и mod(mdg4)'"'/mod(mdg4)'u! мутаций в y'''ssc""'6 линию, наблюдалась полная супрессия мутантного sc фенотипа (Рис. 5Б). Это означает, что yellow промотор отвечает за остаточный мутантный sc фенотип в у1"'1 sd""'\su(Hw)2/su(Hw)" линии.

А

ТГТТ г

it них ннхы к

/Л pj делеаид Р4 элемента

\

Is* ms У SC

штш&шют

? 1 т

2ns2J mes21

у SC

f

ls2I2 ms212 £

"Г"

H R

=F "L

1 s21 7 ms211 у sc

G С

AOR A MP HU PV ОС PS АРА ASA SC

su(Hw)*/su(Hw)' mod'"'/mod

$u(Hw)'/su(Hw)' mod"'/mod'"

y""sc™"; +/+ su(Hw)*/su(Hw)' mod^'/mod'*

sc™*!* /""'sc™2"; +/+ su(Hw)7su(Hw)•

И И lm* □□ ПП П П ¡¡пи ьаппир □ □

ц□□ариы ы д пппппппп п ппгшпппп п

цааааааии

■ ПППППППП п

П П ПРППП п п

□ □□□□нуыа аапвацууа

пппппппп п

Рисунок 5 Роль промотора гена yellow и последовательной элемента в sc мутациях при наличии инверсии. (А) структу] y"s<f мутации. Рисунок показывает количество нуклиотши месте внутренней делеции Р элемента согласно его карге и делеции в гене yellow согласно его к арге. Положение и направление праймеров в yellow ¡ыт (у) (sc) и /' элемента (Р), использовавшихся для ПЦР показаны стрелками. Последовательности оставшиеся после вырезан] элемента в пяти y''s(f" производных линии y^'sc"1"1, представлены в скобках. Последовательность ДНК на стык: представлена таким образом, что пробел разделяет концы разрывов. Заглавные буквы обозначают известную последовательность Р элемента, а маленькие - филлерпую последовательность, находящуюся в точке разрыва. Все обозначения как «а рисунке 7А. (Б) Фенотипы sc мутаций у самцов и их взаимодействие с мутациями по генам Su(llw) i inod(indg4). Всс обозначения как на рисунке 1В.

Необходимо отметить, что все супернестабилыше yellow аллели имеют промотор с дслецией от -70п.н. до - 146 п.н. Эта деления сильно снижает уровень экспрессии гена yellow. Регуляторная часть встроившегося Р элемента компенсирует делецию и восстанавливает нормальную экспрессию yellow. Это объясняет почему удаление либо оставшейся части yellow промотора, либо Р4 элемента имеет схожий эффект. Такие же результаты были получены при анализе y'*sc"K производных линии, не содержащей химерного элемента (Рис. 5А).

Среди y'"scm° производных мы обнаружили вариабельность по структуре РА элемента.

Производная yhl2scm''2 имела дупликацию Р4 элемента с делецией 5'-коица у каждой копии. Производная ylsl7scmelT имела маленькую далецига (с Нп.н. по 201 п.н.) с 5'-конца Р4 элемента. Не смотря на присутствие почти всей последовательности РА элемента, введение su(Hw)2/sv(Hw)' и mod(mdg4)'"'/mod(mdg4)'"1 мутаций приводило к полной супрессии мутантного se фенотипа (Рис. 5Б). Это указывает на то, что 5'-конец регуляторпой части РА элемента отвечает за активацию yellow и репрессию транскрипции se гена.

Для выяснения роли Р элемента и yellow промотора в случае отсутствия инверсии AS-C, мы использовали y?Ji4scL'4 производные у2's с' линии (Рис 6Л). Производная у2'31 se'4 имела дупликацию последовательности гена yellow от позиции -69 п.н. до +4700 п.н. Ген yellow в дупликации имел ориентацию от Pi к Р4 элементу (Рис. 6А). Введение su(Hw)2/su(Hwf мутации не влияло на se фенотип. Это позволяет сделать вывод, что su(IIw) инсулятор не ответственен за мутантный se фенотип в линиях, не имеющих AS-C ипвсрсии.

Для подтверждения участия yellow промотора в образовании мутантного se фенотипа в уъи5сы производной, мы проанализировали se1 ревертантов, полученных после мобилизации Р элемента в y2sl4scls'1 линии. С помощью Саузерн-блот анализа и ПЦР клонирования места изменения было показано, что одни ревертанты утратили дупликацию yellow гена между РЗ и РА элементами (Рис. 6А). Так одна производная, ylsl'sc*'\ была индуцирована делецией Pi элемента, расположенного около промотора гена yellow.

Для проверки возможности влияния РА элемента на se фенотип, "мы также проанализировали потомство y^W с неизмененным .sc. В результате анализа была обнаружена линия yf^'sc1'42, в которой РА элемент отсутствовал, однако se фенотип не изменился (Рис.бА). Все полученные результаты позволяют сделать вывод, что yellow промотор и 5'-конец регуляторпой части Р4 элемента, расположенный около промотора гена yellow, отвечают за блокирование HU, ANP и AOR энхансеров AS-C.

2. Механизмы образования химерных мобильных элементов

2.1 Молекулярный анализ дупликации последовательностей гена yellow между последовательностями Р элементов. В качестве модели для изучения механизма образования химерных мобильных элементов была использована у?™'sc""' линия (Рис 1Б и ЗА). Эта модельная система удобна, так как Р элементы в yellow-ac-sc районе имеют различную рестрнкгную карту, что позволяет их идентифицировать. Так, Лий элементы длинной 1,2т.п.н. состоят из 829п.н. с 5'-конца и 347п.н. с З'-конца (с 2560 до 2907п.н.) полноразмерного Р элемента, с последовательностью TAGCTACAAA между ними, не принадлежащей Р элементу. Эти Г элементы несут Hind\\\ и Xhol сайты, по не содержат Sail, Psi 1, ЕсоЮ и Крп\ сайты рестрикции, которые находятся в центральной и З'-коицевой частях полноразмерного Р элемента. Pi элемент является полноразмерным 2.9. т.п.н копией. Р2 элемент и Pi элемент расположены в ориентации голова-к-голове и между ними находится

А

,2s34r, + s4 1

,2s34,Js42g

yellow

К H К

y-t-a 'is

,.2s 3 + s 4 3

AORANP HU PV ОС PS АРА Ai

*/* - - El ПИПППП Г su(Hw)'/su(Hw)"; И ПИПППП Г /""sc*™ П П П ПП П П Г

с" /"'sc*41

Рисунок 6. Роль промотора iciia yellow i последовательностей P4 элемента в sc мутациях при отсутствии инверсии. (А) Структура y*sc* мутации и ее пропзвош Положение и направление праймерсв в yellow гене (у) ,AS-C (sc) и Р элемента i использовавшихсдля ПЦР показаны стрелками. Все обозначения как на рису: ЗА и 6А (Б) Фенотипы sc мутаций у самцов и их взаимодействие с мутациям по генам Su(fJw) и mod(mdg4). Все обозначения как на рисунке 1 В.

ОТССАОТС последовательность. Та же 8-ми нуклеотидная последовательность, но в инвертированном варианте (йТССАОТС), была обнаружена на стыке между последовательностями А8-С и 3'-концами РЗ и Р4 элементов. Можно предположить, что при инсерции первого Р элемента в А8-С произошла дупликация СТССАСТС последовательности. Второй Р элемент встроился на расстоянии 8 п.к. от первого, что привело к дупликации тех же 8 п.н. Элемент Р\ имеет сайт рестрикции НМIII на 5'-концс и Бай, Л/1 и £'ссК.1 на З'-конце. Однако центральная часть элемента, содержащая НтЛП и ХЬо1 сайты, делегирована, что отличает РА элемент от 1'\ чР2 элементов и от полноразмерного РЗ элемента (Рис.7А).

Среди производных линии у2"*'хс!""', вызванных мобилизацией Р элемента, частота мух с более темной пигментацией кутикулы тела и крыльев, а также несущих неизмененный зс"'"1-подобный фенотип, составила 0,7 х 10'3. Они были обозначены как (16 независимых

событий), у'"*лс"" (3 событий), и у'ю1с"(2 события ) (Рис.2 и 7Б)Линии у""яс""" и с"" имели пигментацию кутикулы тела и крыльев такую же как у линии у*. Пигментация тела и крыльев у мух была промежуточной между у"" и у. ¡с фенотип у производных л ибо

оставался таким же как у исходной линии либо был слегка супрессирован как в

случае $с". Это подтверждает наличие инверсии в производных линиях, так как в случае реинверсии ¡с фенотип полностью восстанавливается до дикого типа.

Для дальнейшего исследования с помощью Саузерн блот анализа были выбраны 15 независимых у""зст°" производных, которые были обозначены от1 до 15, две у"*1ст производные (16 и 17), и две у'1т1ст" производные (18 и 19) (Рис.7Б и Табл.1). ДНК каждой производной была обработана двумя эндонуклеазами ВатШ и В&Ш, перенесенная на

у

з

yellow

—П-Mill

x н н х н р RP

Ms» p'.pi ^ 1)»р4 -Hpi.pl

М ¡>4

т-п—Г

Н RP S ■«< р4 -44 Цр«

Р'-Р2 ^р5

y^scm" (1-4, 6,7, 10) y+Vs (16)

y+Vs (8)

Р2

РЗ

y+nsscws

(17)

/V" (5, 9)

v+^scT" (18)

Alnsnrnes

у sc '" (19)

y+nss(fnes (Ц-15)

^т- X ~г н —-—г 1 1 1 RP S

Р4 РЗ

—ь! —► 1

1 1 1 S PR 1 н 1 1 Р S

Р4 РЗ

1 -ч— Ы I —►

S P2

P3

1— —Н= —]

1 1 X н т н 1 1 1 XII Р 1 1 RP 1 S

Р2 РЗ

1 1 X Н г 11 1 Г 1 X Н Р 1 1 RP 1 S

Р2 РЗ

1 — 14- —1

Г X

P2

XH P RP Pi

cn G-R (AS-Q tew* H-B (yellow)

1—1 H-R (химешшй элемент)

-*■ Дупликация yellow

(не в масштабе)

1 1 т.п.н.

м I II

X II Р RP

Н

. 7. Схематическое изображение дупликации yellow 11 у "'sc™1' производной. (А) Схематическое изображение 1 и sd""' мутаций в ym'sc?"' производной. (Б) Схематическое изображение y*"scT", y*"sc" н yib"scm" tiводных с дуплицированной последовательностью yellow. Полые вертикальные стрелки обозначают места юсомшхх разрывов, связанные с инверсией. В масштабе подставлены Р элементы в виде прямоугольников, стадия Р элсменгоз показана стрелками. Положение и направление праймеров, используемых при ПЦР, ано черными маленькими стрелками. Аббревиатура эвдонуклеаз: R - £ruRl; В - Я/лШП; G - Bg/ll. X - ХЬо\\ В -HI; S - Sail, Р - А/1; А - Xbal. Фрагменты геномной ДНК, используемые для гибридизации Лшс1111-ДагаН1 env); EcoRl-BglII (AS-C); NintHU-Ecoitl (химерный элсмеш) отмечены выполненными прямоугольниками, сие линии со стрелками указывают направление дупликации.

Таблица 1. Схема анализа структуры мутаций в локусе yellow и AS-C с помощью метода Саузер

блот гибридизации

Цель Комбинация эндонуклеаз Зонды, использовавшиеся да гибридизации

Продемонстрировать наличие yellow дупликации и определение количества Р элементов в местах разрыва инверсии и дупликации BamHVBgm НтШ-ВатШ {yellow), ЕсоК Bglll (AS-C), Hindlll-EcoRl (химерный элемент), смотри Рис. 7А

Выяснение инверсии между yellow и AS-C. BgRI, Xbal или BgWXbal НтШ-ВатШ {yellow), ЕсоК Bglll (AS-C), Hmd\\\-EcaR\ (химерный элемент), смотри Рис. 7А

Определение размера дупликации гена, yellow Предварительное определение

ВатШ ВатШ-EcoRl (кодурующая часть гена yellow).

Картирование границ дупликации BamHVBgUl, ЕсоШ, BgllVEcoRi, BgWPsll, Bgll\/Xba\, ЕсоШ Xbal Фрагменты из области yellow ас

Структура Р элементов в местах разрыва инверсии/реилверсии:

на границе транскрибируемой части гена yellow BamWHinilll, EcdSlJChol, Pstl, Sail или Kpnl ШпШ-Ватт (yellow)

на границе с геном sc BgllVHindlll, EcuRl, Xhol, Pstl, Sail или Kpnl EcoKl-BglW (AS-C)

на границе с химерным элементом BghVXhol, Pstl, Sail или Kpnl ffi/;dIII-£coRI (химерный элемент

Примечание: В скобках указаны районы, откуда были взяты фрагменты для гибридизации.

нейлоновый фильтр, сгибридизована с HindiII - ВапА II фрагментом из промоторной облает! yellow. В результате, кроме контрольного фрагмента в производных линиях выявлялись одн; (дупликация последовательностей гена yellow) или две (трипликация последовательностей ген; yellow) дополнительные полосы. Такой картины не наблюдалось при гибридизации с HindiII Hindll! фрагментом из дисталыюй регуляторной части гена yellow. На основании результате! Саузерн блот анализа н активации гена yellow в производных линиях можно предположить что в дупликацию входит вся кодирующая область генаyeUow.

Приблизительные размеры дупликаций гена yellow были определены с помощьк Саузерн блот анализа ДНК, обработанной эндонуклеазой ВатШ. Для гибридизации бьи использован меченый фрагмент ДНК ВатШ - ЕсоШ из кодирующей части гена yellow. Есл! дупликация reHa_ye//ow была менее 13,3т.п.н. (расстояние между ВатШ в первом экзоне ген; yellow и ближайшим ВатШ сайтом, который находится с 3' стороны от гена yellow), Tt появлялась дополнительная полоса. Размер этой полосы соответствовал приблизительно длин дупликации. Если дупликация гена yellow была более 13,3т.п.н., то контрольная полоса имел более интенсивную гибридизацию. Для более точного определения границы дупликаци

yellow был проведен детальный Саузерн блот анализ каждой из производных (Табл.1 и 2). Десять y*"sscm"', характеризующиеся нормальным уровнем экспрессии гена yellow в теле и крыльях (1-10), содержали дупликации mm yellow размером от 5 до Ют.п.н., ориентированные urns, yellow ген дикого типа. ДНК пяти других y""scma производных (11-15) была обработана одновременно двумя рестрикгазами Ват\\\ и BglR. При гибридизации фильтра с зондом, полученным на основе IlindlU - ВатШ фрагмента гена yellow были выявлены две дополнительные полосы, одна из которых также гибрндизовалась с BglH - ieoRI зондом (AS-С), а другая с IlindlП - EcoRl зондом (химерный элемент). Эти результаты показывают, что y'V производные (11-15) содержат две копии гена yellow (трипликация), ориентированные хвост-к-хвосту и расположенные между Р2иРЗ элементами (Рис. 7Б, Табл. 1 и 2.).

Дуплицированная последовательность yellow фланкирующая Р2 элемент, т.е. yellow-дистальный, варьировала по длине от 5 т.н.н. до 10 т.п.н. и содержала всю кодирующую часть гена yellow. Размер дупликации yellow, примыхающей к Pi элементу, т.е. yellow-проксимальный, варьировала от 3 до 10 т.п.н. В четырех y™scma производных (12-15) дистальный и проксимальный гены yellow были одинакового размера. Общая длина дупликации (трипликации) yellow в 11-15 аллелях была выше, чем в 1-10 аллелях с одной дупликацией yellow.

Две y*l"'sc"'" производные (18 и 19) несут дупликации гена yellow от 6 до 7 т.п.н., но в ориентации противоположной y*msd"" производных (Рис. 7Б). Снижение уровня экспрессии гена yellow может зависеть от расстояния между энхансерами химерного элемента и промотора yellow. Две y*"*scw' линии (16 и 17) имеют дупликацию более 14т.п.н. в ориентации сходной с y""scma производными (Рис. 7Б). Неполную супрессию sc фенотипа можно объяснить дупликацией последовательности гена ас, который может частично функционально компенсировать ген sc.

2.2 Выяснение структуры Р элементов фланкирующих дупликации гепа yellow и анализ мест стыка дупликаций тепл yellow и Р элементов. Дупликации гена yellow с обеих сторон были ограничены Р элементами. Структура Р элементов была проанализирована с помощью Саузерн-блот анализа как показано в Таблице 1. Элемент Р2, имеющий Hindi] I и Xho\ сайты присутствовал в одной из двух y""scw\ а также в 9 и 10 y^"'sc""s производных, где дуплицировалась одна копия гена yellow (Рис. 7Б). Согласно результатам Саузерн блот анализа, стык между 5' концом Р2 элемента и геном yellow во всех y""sc":" и у'"sc"" производных был идентичен стыку между 5' концом РА элемента и гена yellow в yJr"'sc""' линии. Это было подтверждено клонированием с помощью ПЦР и секвенированием места стыка между 5' концом дупликации и 5' концом Р2 элемента в семи y^'sc""* и в одной y*"'sc"

Таблица 2. Последовательности па стыке между Р элементом и дупликацией тепаyellow в производных полученныху2"/1с"!°'

Аллели V* У-Р Р* Р- Р последовательности на стыке yellow/P элеме

(1) 7548 4744 1997 910 AAGCAAAAAA / ТА / TAATTGTTTA

(2) 7770 4966 2362 545 СААТТССААТ / AAA / TTGAGAATCA

/"sc™ (3) 7546 4742 2231 676 GTTAAGCAA/АААА/TAAAAGTAAA

yV" (4) 7740 4936 1345 1562 GCACTTTTTT / ААААА / ТТААСААААА

y"scm" (5) 7716 4912 1 2907 CACAAGATCT / gtcatatggatgggtttggatggatg GACTGGAC / CATGATGAAA

у-Д* у-Р у-П* у-Р последовательности на стыке между у-дистальным и у-проксимальным

у Vs (И) 7617 4813 5990 3096 AGCGGAAAA/АА/AATAGGAGAA

Примечание: у-Д (у-дисталъный) • дупликация гена yellow около Р2 элемента; у-П ( у-проксимальный) - дупликация гена yellow около РЗ элемента. у-Д (у-дисталъный) и у-П (у-проксимальный) противоположны по ориентации. . ■

Ориентация дуплицированного гена yellow противоположна Р2 элементу и сонаправлена РЗ элементу. Все последовательности представлены с кодирующей цепи ДНК. Точки разрывов в Р элементе и гене yellow (у* , Р*, у-Д * , у-П ' колонки) представлены в соответствии с опубликованными картами (О 'HARE и RUBIN 1983; GEYER et al. 1986). Цифры в колонках у -Р (размер yellow) и Р -Р (размер Р элемента) означают размер дупликации, место разрыва в yellow с каждой стороны и размер оставшейся части Р элемента. Цифры в скобках после разрыва с 3' конца обозначает количество пар нуклеотидов Р элемента оставшихся с этой стороны. Последовательность ДНК в месте стыка представлена таким образом, что выделенная разделяющая последовательность относится к обеим сторонам разрыва. Заглавными буквами представлена известная последовательность Р элемента и гена yellow. Прописными буквами обозначена новая последовательность, которая не гомологична известным последовательностям. Заглавными выделенными буквами обозначена последовательность GACTGGAC, находящаяся между Р2 и РЗ элементами в исходной у21"'sc""' линии. Участки гомологии подчеркнуты.

линиях. В двух случаях, у'"'хс"'"(&) и y*mscw' (17), элемент PI заменился на Р элемент длиной 2,2т.п.н., похожий по рестриктной карге и размеру на Р4 элемент.

По результатам Саузерн блот анализа, в большей части дупликаций, 5' конец РЗ элемента отсутствовал. В восьми y^st?" и двух у*"'sc" производных HindiII и ft/I рестрикционные сайты, характерные для 5' концевой части РЗ элемента, и иногда £eoRI и Pstl, характеризующие центральную часть РЗ элемента, отсутствовали, и только 3' часть Г элемента, содержащая рестриктный сайт для Sali, присутствовал во всех производных (Рис.7Б). Для определения структуры стыка между геном yellow и Р элементом, этот район был амплифицирован с помощью ГЩР, клонирован в плазмиду и секвенирован в четырех у '"sc"" (1-4) производных, которые по результатам Саузерн блот анализа имели небольшой размер дупликации (Табл. 2). Во всех четырех аллелях дупликация включала в себя всю кодирующую часть гена yellnw. Последовательности гена yellow и Р элемента в месте стыка были А/Г богатые и имели от 2 до 5п.н. гомологии.

В двух у "sc""1 производных (5 и 9) элемент имел не измененный 5' конец. Место стыка между РЗ элементом и дуплицированным геном yellow было клонировано с помощью ПЦР в случае y""scm" (5) линии (Табл. 2). Было обнаружено, что на стыке

последовательностей гена yellow и GACTGGAC, фланкирующей 5' конец РЗ элемента, находится дополнительная последовательность длиной 26п.н. (Табл. 2). Эта последовательность имела короткие участки гомологии (такие как TGGA) с GACTGGAC последовательностью.

Полноценный РЗ элемент так же был обнаружен в обеих y*'"'scm" производных (РисЛБ). Место стыка между дуплицированными yellow последовательностями и РЗ элементом было амгишфвдировано с помощью ПЦР и прямое секвенирование подтвердило, что место стыка между 5' концом РЗ элемента и yellow геном было идентично стыку между РА элементом и yellow геном. По Саузерн анализу, Р2 элемент имел делецию 5' конца у ytlnsscm" (19) производной и не полноценный Р2 элемент в y>lnssc'" (18) производной (Рис. 7Б). Как и в случае с y^^sc™" аллелями, yrl"'scm" дупликации включали в себя всю последовательность гена yellow.

Как было сказано выше, пять y*"sc'"c" производных (11-15) имели две дупликации района IfindiU-ВатШ из. гена yellow. С помощью Саузерн блот анализа было показано, что обе дупликации расположены между Р2 и РЗ элементами в инвертированном хвост-к-хвосту положении (Рис 7Б). Во всех пяти y^'sc"" производных Р2 и РЗ элементы имели ту же структуру, что и в /"'sc""1 линии. ПЦР клонирование и прямое секвенирование показали, что 5' концы обоих Р2 и РЗ элементов фланкированы той же последовательностью гена yellow (начиная от -69п.н.) и в той же ориентации как в случае РА элемента. Место стыка между двумя дупликациями гена yellow было секвенировано в / V (И) производной (Табл. 1). Было обнаружено, что последовательности yellow в месте стыка имели 2 п.н. гомологии.

2-5 Двух копий Р элемента ориентированных голова-к-голове достаточно для эффективной дупликации последовательности гена yellow. Для выяснения влияния химерного мобильного элемента и инверсии на частоту дупликации гена yellow между Р элементами, мы использовали y2'sc'' линию (Рис. 8А). Р элементы в sc локусе этой линии расположены в ориентации голова-к-голове и имеют между 5' концами восьминуклеотидную последовательность GTCCAGTC. Фенотип yf'sc* мух: желтые тело и крылья, нормально окрашенные щетинки (^-фенотип), все щетинки присутствуют (sc* фенотип) (Рис. 2).

После мобилизации транспозиций Р элемента в y'sc"* линии семь независимых yv самцов было проанализировано с помощью Саузерн благ анализа (Табл. 1). Все эти мутации связаны с дупликацией последовательности гена yellow между РЗ и РА элементами в AS-C. Ориентация дупликации гена yellow была одинаковой и совпадала по направлению е исходной копией гена (Рис. 8А). Структура РЗ и РА элементов не изменилась. Стык между 5' концом РЗ элемента и последовательностью гена yellow в дупликации был идентичен стыку между Р2 и геном yellow. Для четырех y:'sc!s аллелей это было подтверждено ПЦР клонированием и прямым ссквенированием области между 5' концом РЗ элемента и последовательностью гена

yellow

<< ас

5С»

н

Ja

-ч у

G-R (AS-C) H-B (yellow)

1 Т.П.Н.

GTCCAGTCC

1-П—I-ГГ

S PR P H X H

►p/. p2

< pl.p2

I

/Vs (1-7)

P3

1-П—I—П-г

S PR P HX H

-»•1 GTCCAGTC t

P4

"T~l-г

RP S

Последовательность на месте стыка yellow и РА элемента y2s SC?* (1) - 3895 (1091) CAACAAATGTAAGAGTGGftaagaalgGTCCAGTQCATGATGAAA У2" SC& (2) - 6708 (3904) CTTCACGTGTGATGAGCGAT(GTCCAGTC)CATGATGAAA

y2s SCU (3) - 7582 (4778) TTTTGAAGGTTAAGAGT(g®jatGICCAGTC)CATGATGAAA

V2s SC^ (4) - 6694 (3890) CCATACCACTTCACG(tcacg£lCICCAGTC)CATGATGAAA

Рисунок 8. Схематическое изображение дупликации yellow в производных y^sc*' линии.(А) Схематическое изображение у1'sc" мутации и у2^'3 производных с дупликацией гена yellow. Все обозначения как ш Рис. 7. (Б) Сиквенс стыков 3' коша yellow дупликации и 5' коти Р элемента. Элемент Р4 и yellow дупликация ориентированы одпнакою Все последовательности представлены с кодирующей цепи ДИК. Места разрывов пронумерованы в соответствии с опубликованным ранее полным екквепсом гена yellow (GEYER et al. 1986). Числа в скобках означают размер дупликации гена yellow. Большими буквами обозначены извеепте последовательности гена yellow и Р элемента, а маленькими - филлерная последовательность, находящаяся в точках разрыва. Большими выделенными буквами обозначена GTCCAGTC последовательность, расположенная между 5' концами Р элемента вУ'ю+,линии. Гомологичные последовательности подчеркнуты.

yellow. Стык между 3' концом дупликации yellow и Р4 элементом был клонирован ПЦР-ом и ееквенирован для четырех /'se1' аллелей (Ркс. 8Б). Во всех случаях сохранялась GTCCAGTC последовательность, фланкирующая Р4 элемент. В трех производных дополнительная последовательность была обнаружена между yellow и GTCCAGTC последовательностью. Эта новая последовательность имела некоторую гомологию с соседними yellow и GTCCAGTC последовательностями.

ОБСУЖДЕНИЕ

1. Способность su(Hw) инсулятора блокировать не изолированные энхансеры.

1.1. Особеппости энхансер-промоторных взаимодействий вyeltow-ac-sc районе. Гены ас и se контролируются набором цис-регуляторных элементов, которые распределены в районе генома примерно на 90т.п.н. (Gomez-Skarmeta Í.K. et al, 1995). Интересно, что ген yellow, находящийся в 10 т.п.н. от ас гена, имеет абсолютно другой паттерн экспрессии и активируется другими энхансерами (Campuzano S. et al. 1985, Geyer P.K. et al. 1986, Geyer P.K. and Corees V.G. 1987). Таким образом, эти гены могут быть использованы как интересная модель для анализа специфичности взаимодействий между энхансерами и промотором, находящихся на больших расстояниях друг от друга. Специфичность взаимодействия может определяться наличием доменной границы между AS-C и локусом yellow, или зависеть от специфичности белковых комплексов, которые собираются на соответствующих друг другу энхансере и промоторе.

В данном исследовании была описана инверсия, которая помещает ген yellow между генами ас и se с одной стороны и всеми AS-C цис-регуляторными элементами с другой стороны. Эта инверсия приводит к частичной репрессии транскрипции se гена. При введении su(Hw) мутации или удалении su(Hw) связывающего сайта МДГ4, нормальная экспрессия гена se восстанавливается. Таким образом, наличие промотора rem yellow между промотерами ас и se генов и всеми AS-C цис-регуляторными элементами не нарушает нормальную экспрессию se гена. Ген yellow, расположенный непосредственно около AS-C энхансеров, ими не активируется. Одним из возможных объяснений этого результата может быть то, что точка разрыва при инверсии, вызывающая мутантный фенотип yellow, находится близко к TATA промотору гена yellow, что нарушает функционирование промотора. Однако мы обнаружили, что инсерция Р элемента в регуляторную область гена полностью компенсирует удаленные регуляторные последовательности (от-146 п.н. до-69п.н.) и поддерживает нормальный уровень экспрессии гена yellow (Belenkaya et al. 1998). Полученные результаты, в случае энхансер-промоторного взаимодействия в yellow-ac-sc районе, соответствуют модели специфичности взаимодействия между энхансером и промотором.

Также мы наблюдали слабое ингибирование экспрессии ас и se генов при наличии инверсии или при наличии промотора гена yellow между ас и se генами и всеми AS-C цис-

регуляторными элементами. Ингибирование экспрессии гена sc наблюдалась при наличии активного промотора гена yellow, который, может взаимодействовать с некоторыми энхансерами AS-C и тем самым блокировать их взаимодействие с промоторами ас и sc генов. Сравнительно слабый эффект промотора гена yellow можно объяснить тем, что большинство энханссров AS-C могут отличать свои промоторы от промотора yellow, в то время как HU энхансеры и, в некоторой степени AOR и ANP энхансеры, способны взаимодействовать с промотором yellow. Таким образом, промоторная специфичность в yellow-ac-sc районе имеет некоторое ограничение.

1.2. Новые свойства su(Hw) инсулятора. В этой работе мы описали новые свойства su(Hw) инсулятора, способного блокировать энхансеры не отделенные им от соответствующего промотора. Этот результат противоречит предшествующим наблюдениям других авторов (Geyer Р.К. and Corees V.G. 1992, Scott K.S. and Geyer P.K.. 1995, Roseman R.R. et al. 1993), указывавших на строго направленное действие инсулятора.

Способность su(Hw) связывающего района непосредственно блокировать не изолированные им энхансеры от соответствующего промотора сложно объяснить в свете представления об инсуляторе как о границе домена. Во-первых, в данном случае su(Hw) инсулятор не образует границу между энхансером и промотором, поскольку их не разделяет. Во-вторых, он отделен от энхансеров и промоторов, на которые действует, рядом других энхансероп, которые находятся в химерном элементе и в гене yellow. К тому же, ANP энхансер способен активировать AS-C промоторы, находясь в гене ye//ow(Gause М. et al. 1998), что указывает на отсутствие инсуляторов между yellow и sc локусами.

Модель, рассматривающая инсулятор как ловушку для энхансера, не противоречит полученным в данном исследовании результатам. С помощью этой модели можно объяснить отсутствие направленности в действии инсулятора, т.к. в результате инверсии происходит образование инсулятор-промоторного или инсулятор-энхансерного динамического комплекса. Ранее было показано, что su(Hw) связывающий район в мутациях sc0' и sc', вызванных инсерцией МДГ4, полностью блокирует только энхансеры отделенные su(Hw) инсулятором от ас н sc промоторов (Campuzano et al. 1985).

Механизм непосредственного взаимодействия между AS-C энхансерами и su(Hw) инсулятором не ясен. Можно предположить, что инверсия обеспечивает тесный контакт su(Hw) связывающего района с AS-C энхансерами за счет изменений в хроматиновой структуре, которые приводят к новым дальним взаимодействиям между соответствующими регуляторными участками. В результате, su(Hw)-mod(mdg4) комплекс, образовавшийся на su(Hw) инсуляторе, приобретает возможность непосредственно взаимодействовать с транскрипционными активаторами или белками облегчающими энхансер-промоторные взаимодействия. Тот факт, что при инверсии происходит только частичная инактивация AS-C

регуляторных элементов su(Hw) ннсулятором, можно объяснить динамическим взаимодействием между инсулятором и энхансерами, как в случае динамического взаимодействия, наблюдаемого между энхансером и промотором (Wijgerde М, et al. 1995).

2. Механизм образования химерных мобильных элементов.

2.1. Специфическое положение Р элемсптов вызывает частые дупликации уникальных геномных последовательностей. Второй целью данного исследования было понять механизм возникновения дупликаций геномных последовательностей, приводящих к образованию химерных мобильных элементов. Ранее было показано, что такие мобильные элементы являются причиной супернестабильных мутаций (Georgiev and Yelagin 1992; Georgiev et al. 1997).

Описанные в данном исследовании химерные элементы имеют структуру, при которой дупликация происходила между двумя Р элементами. Частота дупликаций, или даже трипликаций, значительно выше, чем в случае дупликаций около одиночного Р элемента. Эти свойства Р элементов не были описаны в литературе. Это можно объяснить отсутствием соответствующей генетической системы в предыдущих работах. Необходимо отметить, что генетическая структура необходимая для частых дупликаций, описанных выше, представляет собой два расположенных рядом Р элемента, ориентированных голова-к-голове.

2.2. Механизмы дупликаций гепа yellow между инвертированными Р элементам»

Можно выделить три различных варианта дупликации последовательностей гена yellow. 1) душшцированная последовательность гена yellow ограничена с 5' конца Р элементом, и 3' конца - концом Р элемента; последовательности yellow и Р элементов в месте стыка часто А/Т богатые и имеют гомологию в несколько пар нукпеотидов; 2) две копии гена yellow встроились в инвертированном друг к другу положении между двумя Р элементами; последовательности yellow в месте стыка А/Т богатые и имеют гомологию в несколько пар нуклеотидов; 3) оба Р элемента имеют не измененные концы, последовательность GTCCAGTC(GACTGGAC) присутствует во всех пяти независимых секвенированных случаях дупликации, часто присутствует дополнительная последовательность в месте стыка Р элемента и гена yellow.

Все три варианта дупликаций могут быть объяснены в рамках ранее описанной SDSA модели (Nassif et al. 1994; Keeler and Gloor 1997)

К первому варианту дупликации гена yellow относятся исследованные производные: -4.6,7,Ю) и y4"V"(16) (Рис 7Б). На первом этапе происходило вырезание РЗ элемента, которое было индуцировано ассоциацией 3' конца РЗ элемента с 5' концом Р2 элемента (Рис 9А) (Svoboda et al. 1995; Gray et al. 1996). В результате образуются 3'-одноцепочечные хвосты из Р2 и РЗ элементов. Одноцепочечный 3' конец РЗ элемента

Выреьшне П jj'lCMcirrd

Р2 Г а

-a

Двуцепочечньш разрыв между И элементами

FZ ^у N

~ С

I ПиИ1.К гомологии

t, 't

1

Ы

п PJ

¿C1

4 Синтез,

замещение, отжиг

- II I -

/у

Поиск гомологии

л t 1

Синтез, огжиг и литров«шне |

Дауцспочечиый разрыв между F элементами

Последовательность yellow

элементы

СТССЛСТС (САСТССЛС)

Направление синтеза ДНК

Рисунок 9. SDSA модель для дупликаций reiia yellow, опосредованных Р элементом. (А) Дупликация последовательности гена yellow, ограниченного с одной стороны поврежденным Р элементом. (Б) Две копии гена yellow, дуплицировавшиеся между двух не нарушенных Р элементов. (В) Последовательность yellow, дугшщировавшаяся между двух не нарушенных Р элементов. Черные прямоугольники со стрелками обозначают Р элементы с инвертированными повторами, которые обеспечивают дупликацию yellow. Серые прямоугольники со стрелками .означают Р элементы, используемые как матрица. Ген yellow представлен не в масшгабс в виде заштрихованного прямоугольника. Стрелки с пунктирной линией показывают направление синтеза ДНК. Белые прямоугольники обозначают GTCCAGTC(GACTGGAC) последовательность. Двуцспочечные разрывы образуются за счет вырезания Р элемента или разрывов между 5' концами Р элементов. Концы разрывов не деградируют. Обрагювавшиеся свободные инвертированные повгоры длиной 31 п.н. шцуг гомологию. Повторы, находящиеся близко к гену yellow отжигаются. Один, отжегшлсь, служит ираймером для синтеза ДНК с 3' конца в кодирующей части гена yellow, а другой - с Р элемента (А), или оба оджегшихся конца служат пранмерами для синтеза ДНК с 3' конца в кодирующей части reia yellow (Б), или одни ш концов не способен шйгн гомологичную последоватсльноспДВ).

образует гетеродуплекс с последовательностями РЗ элемента, который расположен на гомологичной хромосоме, или хроматиде. Одноцепочечный 3' конец Р1 элемента образует гетеродуплекс с гомологичными последовательностями Р4 элемента, который находится рядом с промотором гена yellow. 3' концы Р1 и РЗ элементов могут служить как праймеры для инициации синтеза ДНК для репарации бреши (Рис 9А). В результате, 3' конец РЗ элемента копирует последовательность РЗ элемента, в то время как 3' конец Р2 элеме1гта копирует последовательность гена yellow. Вновь синтезированные одноцепочечные цепи могут так же образовать гетеродуплекс между собой, для которого достаточно наличие 2-4 п.н. После отжига двух одноцепочечных ДНК друг на друга, каждый конец использует противоположную цепь ДНК в качестве матрицы для синтеза. (Рис 9А). В результате возникает дупликация гена yellow и появление на стыке 2-4 п.н., которые могут принадлежать последовательностям как гена yellow, так и РЗ элемента.

С помощью этого же механизма можно объяснить структуру y*mscmes (8) и у""sc"" (17) аллелей (Рис. 7Б), где дупликация yellow была ассоциирован™ с замещением Р2 элемента на /*4. Это можно представить как деградацию 5'части Р элемента, с последующей репарацией, где как матрица используется последовательность Р4 элемента. В случае у >:'"sc"" (19) аллеля (Рис. 7Б), дупликация yellow имеет другую ориентацию. Это можно объяснить ассоциацией 3' инвертированного повтора Р2 элемента с 5' инвертированным повтором РЗ элемента. Последующее вырезание Р2 элемента образует одноцепочечные концы 5'части РЗ элемента и 3' концы Р2 элемента. Таким образом, в отличие от описанного выше варианта дупликации, здесь З'конец, гомологичный РЗ элементу, отжигается на Р; элементе, прилежащем к гену yellow, и последующий синтез приводит к инвертированной дупликации гена yellow.

Следующий класс дупликаций характерезуется двумя копиями гена yellow, расположенными в инвертированной ориентации относительно друг к другу, y*ln"sc""' (11-15) (Рис. 7Б), и не измененными копиями Р элементов с обоих концов дупликации. Для образования такого класса дупликаций необходимо наличие одноцепочечных 3' концов со стороны каждого из двух Р элементов. Здесь происходят двуцепочечные разрывы на 5'концах обоих Р элементов с одновременным объединением 5' концов Р2нРЗ элементов с 3' концами этих же Р элементов, которые находятся на сестринской хроматиде (Рис.9Б) (Svoboda el al. 1995; Gray et al. 1996; Preston el al. 1996). После индукции разрывов, комплекс диассоциируег и освобождает два одинаковых одноцепочечных выступающих 3' конца с 5' концов обоих Р элементов. После этого, свободные одноцепочечные 3' концы образуют гетеродуплекс с гомологичными последовательностями Р4 элемента, расположенного на той же или гомологичной хроматиде. Таким образом, оба свободных конца Р элементов используют последовательности гена yellow как матрицу и, в результате образуется две дупликации последовательностей гена yellow находящихся в ориентации хвост-к-хвосту (Рис.9Б).

Третий класс дупликаций, характеризующийся присутствием GTCCAGTC (GACTGGAC) между Р элементом и дупликацией yellow в y**scl! и y*"stf" (5) производных, предполагает два внутренних двуцепочечных разрыва на 5'-концах обоих Р элементов. Наличие последовательности GTCCAGTC(GACTGGAC) можно объяснить тем, что 3'место разрыва на конце Р4( или Р2) элемента находился между РЪ( или Р4) элементом и GTCCAGTC (или GACTGGAC) последовательностью. В результате двух тахих разрывов индуцированных транспозазой, одна точка разрыва может иметь 17 п.н. одноцепочечную последовательность Р элемента, а другая в дополнение к этому последовательность GTCCAGTC (GACTGGAC). Дополнительные последовательности, возникающие на стыке GTCCAGTC (GACTGGAC) и yellow дупликации, сходна с дополнительными последовательностями, которые часто образуются при внутренних делециях в Р элемента и между концами Р элемента, которые остаются после его вырезания. (Takasu-Ishikawa et al. 1992; Staveley et al. 1995).

Таким образом, возникновение третьего класса дупликаций можно объяснить тем, что сначала транспозаза наносит два двуцепочечных разрыва в 5' концах инвертированных повторов Р элементов (Рис. 9В). Белок IRBP (Rio и Rubin 1988; Beall et Ы. 1994; Beall и Rio 1997) защищает одноцепочечный 3' выступ на конце Р4 элемента от экзонуклеазной деградации, в то время как 3' конец РЗ элемента находит гомологию на 5' конце Р2 элемента. 3' конец РА .элемента, содержащий дополнительную GTCCAGTC (GACTGGAC) последовательность не может образовать гетеродуплекс с гомологичными последовательностями Р элемента и, следовательно, не может служить праймером дня дальнейшего синтеза ДНК. Этим объясняется почему все дупликации yellow ограниченные не поврежденными Р элементами и несущие GTCCAGTC (GACTGGAC) последовательность принадлежат к третьему классу дупликаций.

Выводы:

1. Получена генетическая система на основе супернестабильных мутаций в соседних локусах: гене yellow и achaete(ac)-scute(sc) генном комплексе (AS-C). Эта система может быть использована для изучения взаимодействия между регуляторными элементами, расположенными на больших расстояниях.

2. Продемонстрировано, что правильные взаимодействия между энхансерами и промоторами генов yellow и AS-C определяется специфичностью промоторов, а не существованием границы» которая разделяет два домена транскрипции.

3. Показано, что su(Hw) инсулятор может блокировать взаимодействия между AS-C энхансерами и промоторами ас и sc генов, находясь на большом расстоянии от этих регуляторных элементов.

4. Определены три варианта механизма образования химерных мобильных элементов, которые получаются в результате дупликации уникальных последовательностей

генома между двумя рядом расположенными копиями Р элемента в ориентации «голова-к-голове».

Список работ опубликованных по теме диссертации

1. GolOvnin A., Gause М., Georgieva S., Gracheva Е., and Georgiev P. The su(IIw) Insulator Can Disrupt Enhancer-Promoter Interactions When Locatede More Than 20 Kilobases Away from the Drosophila achaete-scute Complex. Mol. Cel. Biol. May 1999; 19: 34433456.

2. A.K. Головпин, С.Г. Георгиева, М.Г. Гаузе, П.Г. Георгиев В определенных условиях инсулятор может подовлять активность неизолированных энхансеров. ДАН 1999 т.366, № 3, с.420-424.

3. А.К. Головнин, С.Г. Георгиева, П.Г. Георгиев Механизм возникновения химерных мобильных элементов, вызывающих супернестабильные мутации у Drosophila melanogaster. ДАН 2000 г.370, № 3 с. 420-424.