Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы регуляции внутриклеточной концентрации ионов кальция в нейронах спинальных ганглиев цыпленка и крысы

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Механизмы регуляции внутриклеточной концентрации ионов кальция в нейронах спинальных ганглиев цыпленка и крысы"

А К А Д Е Л\ І Я НАУК УКРАЇНИ ІіДЗуиТУТ ФІЗІОЛОГІЇ імені О. О. БОГОМОЛЬЦЯ

На правах рукопису

УСАЧОВ Юрій Михайлович

МЕХАНІЗМИ РЕГУЛЯЦІЇ ВНУТРІШНЬОКЛІТИННОЇ КОНЦЕНТРАЦІЇ ІОНІВ КАЛЬЦІЮ В НЕЙРОНАХ СПІНАЛЬНИХ ГАНГЛІЇВ КУРЧАТИ ТА ЩУРА

Спеціальність: 03.00.02 — Біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ — 1993

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті фізіології ім. О. О. Богомольця АН Україні

Наукові керівники: академік П. Г. Косткж, д. б. н. С. Л. Л\іронов,

Офіційні опоненти: д. б.н. В. Л. Зима,

д. б. н. К. Малишева.

Ведуча установа: Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна АН України.

Захист відбудеться л1993 р! на засіданні спеціалізованої вч

иої ради Д-01.13.01 при інституті фізіології ім. О. О. Богомольця АН Україн (м. Київ, вул. Богомольця, 4). -

Автореферат розісланий .¿2."1993 р. . •

Вчений секретар спеціалізованої ради доктор біологічних наук

3. О. Сорокіна-Марін

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОКОТИ

Актуальність пгоб.'ісми. Внутрішньоклітинний кальцій вважається одним з найбільш }піверсалміих регуляторів клітинних процесів. 0 нерьових клітинах, зокрема, іони кальцію беруть участь в процесі рнзільмєнш! медіатора, о реіуляції електричного збудження, в регуляції сиііаптнчної пласпічності, в процесах росту та диференціювання нервової клітіїнн і т.д. Дія іонів кальцію перелається різними кальційзалежнимн ферментами, активність яких регулюється внутрішньоклітинною концентрацією іонів кальцію. Тому вивчення механізмів регуляції Енугріїшіьоклітпнної концентрації вільного кальцію (|CaJ+)¡) а нервових клітинах являє собою важливу наухову проблему. D регуляції |CaJ*]¡ можуть брати участь такі системи клітини: кальцієві канали плазматичної мембрани, кальцієвий насос та Na*/CaJt обміниик плазматичної мембрани, кальцііітранспсртугачі системи ендоплазматичного ретнкулуму та мітохошрій. Особливості функціонування, та відносний внесок кожної з цих систем залежать від типу клітини. Для сенсорних нейронів ці питання залишаються відкритими. Усе це'і визначило мету роботи.

Мета роботи полягала в дослідженні процесія регуляції внутрішньоклітинної концентрації Ca2t в ізольованих ".гйронах спіналькнх ганг.чіїп теплокровних та систем клітини, шо сідпозідають за ці пронеси.

Іаішіілашш

1. Розробити методику, їло доззолхс одночасно вимірювати |CiJI¡i і тлійснювати електрофізіологічний к о; прать з нервових клітинах.

2. Дослідити особливості регуляції (Ca3*j¡ з різних 'і::егинол иергого! клітини під час електричної стимуляції клітини.

3. Ілпгпіфіглиатн та вяачитя системи клітини, uso відповідають м регу^-тію ¡Ca!,!¡ в різних умовах.

«5. З'ясугзти роль внутрішньоклітинні« Сз д;ло у кальцієвому roveocraji ¡іервогої клітини.

1. Ппсрше поклзона різниця а швидкості регуляції !C"3r)¡ в сомі та

’іідтг-.-ГлПХ нейронів тіпальних гангліїа. .

і. Визначена швидкість дифузії Сіг' я них клітинах.

3. Иохамио, шл з уси іоній к.тгрі увійшли в клітину під

?стимуляии, лише приблизно !'S іоиіз задишпстьс:’ у низ'я^но:-»;'

стані,

J

4. Ідентифіковані системи нейронів спінольних гангліїв, що беруть

участь в регуляції [Са1*!; (потенціалкеровані Са канали плазматичної мембрани, Са,+-АТФаза плазматичної мембрани, Си-транспортуючі системи мітохондрій та ендоплазматичного ретикулуму). Визначено відносний внесок цих систем до процесів регуляції |Са2+|| за різних зовнішньо- та

внутрішньоклітинних умов.

5. Подано докладний -опис механізму вивільнення Са1* з

внутрішньоклітинних кофеїнчутливих Са депо.

6. Детально вивчена фармакологія процесу вивільнення Са1* і

кофеїнчутливих Са депо. Зокрема, вперше на нервових клітинах показано, що іони Ва2* блокують розвиток цього процесу, і що тапсігаргін викликає

вивільнення Са1* з кофеїнчутливих Са депо. .

Практична цінність даної роботи полягає у виявленні різних способів впливу на Са-залежні процеси в нейронах спінольних гангліїв теплокровних.

Апробація роботи. Основні положення роботи були викладені с доповіді на семінарі Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця АН України (1993 р.), засіданні Вченої ради інституту фізіології ім. 0.0. Богомольця АН України (1993 р.).

Об'см та структура дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, результатів досліджень, обгоьорювання, висновків та списку літератури. Робота викладена на 157 сторінках Машинописного тексту та ілюстрована 28 малюнками. Список літератури нараховує 23$ джерел.

ГІо матеріалах дисертації опубліковано 7 робіт.

. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

В огляді літератури зроблено аналіз сучасних даних щодо систем клітини, котрі беруть участь в регуляції внутрішньоклітинної концентрації Са1*; кальцієвих каналів плазматичної мембрани, кальцієвого насосу та Ыл'/Са1* обмінника плазматичної мембрани, кальційзв'язуючих білків, каль-ційтрансиортуючнх систем мітохондрій та ендоплазматичного ретикулуму. В цьому розділі розглянуто також експериментальні методики, що використовуються для вимірювань внутрішньоклітинної концентрації вільного кальцію.

МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ

Експерименти виконувались в основному на первинній культурі нейронів спінольних гангліїв (ОЯО нейронах) курчати та щура. Клітини

готувались у відповідності з методикою для вирощування DRG нейронів в первинній культурі (Barde et al., 1980; Kirischuk et al., 1992). Клітини використовувались на 2 - 5 день після перебування в культурі. Деякі експерименти були проведені на свіжоізольованих неідентифікованих нейронах виноградного равлика, які готувались згідно з методикою, шо традиційно використовується в нашій лабораторії (Костюк, 1986).

Вимірювання внутрішньоклітинної концентрації Са2+ базувалося на спектральних властивостях флуоресцентних- кальційчутливих зондів фура-2 і індо-1 (Grynkiewicz, 1985). Для завантаження зондів клітини витримувались при кімнатній температурі на протязі 30 хвилин в розчині Хенкса. який містив 5 мкМ фура-2 /АМ чи 10 мкМ індо-1/AM (Molecular Probes чи Calbiochem), а також 0,02 % детергента плюроника Ф-127 (Molecular Probes). Після закінчення фарбування клітини відмивались нормальним розчином Хенкса на протязі 30 - 60 хвилин. Кінцева концентрація барвника в клітині складала приблизно 50 мкМ. ' .

Експерименти проводились на двох експериментальних установках, побудованих на базі інвертованих флуоресцентних мікроскопів Axiovcit 35 (Zeiss) і Люмам Р-1 (ЛОМО). Обидві установки було змонтовано згідно з загальними принципами роботи з флуоресцентними кальційчутлишіми зондами. Флуоресценція збуджувалась за допомогою ртутної чи ксенонової лампи. Розділення потоків збуджуючого світла та флуоресценції здійснювалось дихроїчною пластиною. Флуоресценція зонда фура-2 збуджувалась почергово на довжинах хвиль 340 та 380 нм чи 360 та 3S0 нм, а реєструвалась в широкому діапазоні 480 - 650 нм. Для селективного збудження чи реєстрації флуоресценції використовувались комбінації інтерференційних та відтинаючих фільтрів. Вимірювання флуоресцентного сигналу здійснювалось за допомогою фотопомножувача чи CCD (charge couple device) камери (Photometries Series 200). Яйцо фотопомнегжувач дозволяв аналізувати лише середнє значення |Ca2+]¡, то CCD камера давала можливість вивчати просторовий розподіл ICa2+]¡ в клітині з точністю до 1 мкм. Флуоресценція зонда індо-1 збуджувалась на довжині хбилі 365 нм, а реєструвалась одночасно на двох довжинах хвиль 400 та 500 нм за допомогою двох фотопомножувачів.

Перерахунок флуоресцентного сигналу в [CaJ*|¡ здійснювався згідно з методом, запропонованим Грінкєвічем та співавт. (Grynkiewicz et al., 1985).' Розрахунки [Ca2t]¡ виконувались на персональній ЕОМ типу IBM AT або типу Commodore.

Для електрофізіологічної реєстрації одночасно з реєстрацією [Ca3*)¡ були використані метод перфорованого петчу (Horn and Marty, 1983) та метод

З

пстч-клемлу в умовах цілої клітини (Hamill et al., 1981). Для реєстрацій застосовувався петч-клемп підсилювач ЕРС-7 (List Electronics). Електрофізіологічні вимірювання на нейронах виноградного равлика виконувались за допомогою мікроелектродної техніки, як це описано у працях Косткжа та співакг. (Костюк та інш., 1988; Kostyuk et al., 1989).

Усі зовнішньоклітинні розчини для роботи на DRG нейронах готувались на основі розчину Хенка такого складу (мМ): HEPES, 20 (рН=7,45, NaOH); NaCl, 140; СаСІ2, 2; MgS04, 0,4; MgCI2, 0,5; КС1, 5; Glucose, 5,6. Зовнішньоклітинні розчини для роботи на нейронах виноградного равлика готувались на основі розчину Рінгера такого складу (мМ): Tris-HCl, 20 (рН“7.4); NaCl, 100; КС1,5; СаС12, 10; MgCl2,5. Швидка локальна зміна зовнішньоклітннного розчину здійснювалась за допомогою багатоканальної піпетки з діаметром кінчика близько 400 мкм, розмішеної на відстані 50 - 100 мкм від клітини. Розчини для заповнення кінчика петч-піпетки готувались на базі розчину такого складу 'мМ): HEPES, 10 (рН“7,4, КОН); КС1, 135; MgCI2, 3; MgATP, 3; EGTA, 0,1. Всі експерименти проводились при кімнатній температурі.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Нивчення входу Са!+ в нервову клітину через електрокеровані кальцієві канали.

В умовах фіксації мембранного потенціалу окремий деполяризуючий поштовх протягом 300 мс до 0 мВ від мембранного потенціалу, що підтримувався на рівні -60 мВ, приводив до значного збільшення |CaJ*]¡ в DRG нейронах курчати від рівня 106 + 29 нМ (п“20) для клітини, що перебуває у спокої, до рівня 505 + 202 нМ (п-20) (Мал. 1). Збільшення |Ca5t]¡ у відповідь на деполяризуюче зміщення мембранного потенціалу не спостерігалося, якщо у зовнішньоклітинному розчині був відсутній Ca¡* або знаходились CdCl2 чи LaCl3 в концентрації 100 мкМ - неорганічні блокатори пагенціалкерованих Са каналів (Коспок та інш., 1988; Tsien et al., 1988). Збільшення |Ca2+)¡ починалось у ділянці клітини, шо прилягає до плазматичної мембрани, а потім розповсюджувалося в радіальному напрямі від мембрани до центру клітини (Мал. 1). Виходячи з припущення про тс, що радіальний напрям зростання |CnJ*)¡ обумовлюється головним чином дифузійним процесом, було оцінено значення коефіцієнта дифузії - (7,5 ± 3,9)* Ю 6 см2/с (іі^З). Це значення узгоджується з даними Хернандеца-Круза та

:півавт. (Hemandez-Cruz et al., 1990) і трохи перевищує значении, що наведені і роботі Насі і Тіллотеона (Nasi and Tillotson, 1985).

Вивчення змін |Ca2+|¡ та Са струму (1са)> викликаних ¡ : "ммн іміщеннями мембранного потенціалу від -60 мВ в бік деполяризації, виявило ¡обру відповідність між потенціалзалежністю амплітуди змінень |Са2*!, та юльт-амперною характеристикою Іса (Мал. 2, А). В цих експериментах :піввідношення між повним припливом Са2+ до (сгіітіїни за період іеполяризації, розрахованим як інтеграл Iq, по часу, та амплітудою зміненім ¡Ca2+)¡ описувалось лінійною функцією (Мал. 2, Б; експериментальні крапки іозначені незафарбованими колами, а розраховані шляхом лінійної шроксімації - зафарбованими). Знаючи, скільки Саг* потрапляє до клітини, ножна розрахувати, наскільки повинна змінитися lCaJ*')¡ за період іеполяризації. Виявилось, що обчислена таким чином амплітуда змін |Ca2,]¡ у 101 + 25 (н=5) разів перевищує те значення, яке обчислюється по зміні {шуоресценції Ca-чутливого зонда. Це значить, що з усіх іонів Са2+, що зотрапляють до клітини через плазматичну мембрану під час електричної лтімуляції, в незв'язаному стані в цитоплазмі залишається дише біля 1%, що згоджується з оцінками, наведеними в інших роботах (McBurney and Necring, 1985; Thayer and Millqr, 1990).

На підставі усіх цих результатів можна зробити висновок, що під час короткої деполяризації в умовах нормального зовнішньоклітинного розчину збільшення |Ca2+|¡ вибувається головним чином за рахунок роботи уіектрокерованих Са каналів. '

Особливості змінень [Са2*]| в різних частинах нейроса при електричній стимуляції.

Для вивчення особливостей регуляції ICa2+|¡ в різних частинах нейрона клітина піддавалась електричній стимуляції в умовах фіксації мембранного потенціалу чи струму. Як можна бачити на Мал. З, тривала електрична стимуляція клітини (параметри стимуляції в цьому випадку: зміщення потенціалу мембрани від -60 мВ до 0 мВ; тривалість імпульса - 50 мс; частота стимуляції - 5 Гц) приводила до зростання |Ca2+|¡ в усіх ділянках нейрона, але це зростання відбувалось у відростку клітини помітно шеидшє, ніж у сомі. Через кілька секунд, не дивлячись па продовження стимуляції, збільшення [Ca2+]¡ у відростку практично припинялось, тобто досягалась рівновага між входом Са2* у відросток та його виведенням з цитоплазми відростку. В цей же час у сомі клітини ще мало місце зростанн і |Ca2f]¡. Після виключення стимуляції і у сомі клітини, і у відростку починалось відновлення

[Са1*], (нМ) 2 [Са!+], (нМ)

20 мкм

час (с)

10,5 нА

л

-60 мВ

оі. 1. Одночасна реєстрація }Са2*]1 в трьох точках, позначених на схемі клітини, та трансмембранного струму.

0 50 100 150 г

приплив Са1' (пКл)

Мал.2. Графіки залежності максимального значення середньої (Са1* і величини припливу Са1* до клітини від величини деполяризації мембрани (А) та амплітуди

800-

600

400

200

30 мкм

71

зміни |Са2*], від величини приплива Са!* до клітини (Б).

'ч,

-йМ&йязі '

0,5 нА

Мал.З,

Одночасна реєстрація [Са1*], в п'яти точках, позначених на схемі клітини, під час електричної стимуляції в умовах фіксації мембранного потенціалу..

10 , , 20 час (с)

(Oa1'*']j до базального рівня. Різниця у кінетиці змін [Ca2*]j у сомі та відростку нейрона, яка спостерігається під час електричної стимуляції клітини (Мал. 3), певно, може бути обумовлена більшою ефективністю Са2+ буферних систем у відростку, ніж у сомі. Дійсно, відновлення |Ca2+]j в сомі після виключення стимуляції відбувалось відносно повільно і добре описувалось однією експонентою з постійною часу 12,3 + 3,7 с (п=”8) для центральної частнші соми та 10,5 ± 2,2 с (u=8) для примембранної ділянки соми. Для відростка поряд з повільним компонентом процесу релаксації [Са14]] (постійна часу дорівнює 16,8 + 3,5 с; іг=8) з'являвся швидкий (постійна часу дорівнює 1,1 +

0,6 с; п=8), відображаючий наявність у відростку окрім систем, характерних і для соми, більш швидкого Са2+-зв'язуючого механізму.

Варіювання параметрів стимуляції (тривалість імпульса від 10 до 50 мс; частоти стимуляції від 5 до 50 Гц) або умов стимуляції (фіксація мембранного потенціалу чи струму) не справляло принципового впливу на описані вище ефекти. ' .

Таким чином, на підставі поданих в цьому розділі результатів можна дійти висновку, що процеси' регуляції |Са3+1, відбуваються швидше у відростках нейронів спінальних гангліїв, ніж у сомі.

У попередньому розділі було показано, що при електричній стимуляції збільшення (Са2+]| в нейроні відбувається головним чином завдяки роботі потенціалкерованих Са каналів. Тому і розподіл Са2+ відповіді у різних частішах клітини повинен залежати від розподілу Са провідності плазматичної мембрани. Для більшості вивчених систем був виявлений нерівномірний розподіл потенціалкерованих Са каналів в мембрані нервових клітин (див. огляди Llinas, 1988; Slier et al., 1991). Вивчення просторового розподілу |С'а2,1і в DRO нейронах у відповідь на електричну стимуляцію також свідчить на користь такої нерівномірності. З Мал. З, наприклад, виплипас, що і в сомі, і у відростку DRG нейрона є потенціалзхпежні Са канали. Але, якщо для соми не виявлялись помітні неоднорідності, то для відростків більшості клітин спостерігалось зменшення входу Са2* при віддаленні від соми (Мал. 3). У деяких випадках (3 клітшіи з 14) зростання |Са24]( було локалізовано в окремих частинах відростку незалежно від відстані до тіла нейрона.

Роль NaVCa1*’ обмінника в регуляції [Са1*];.

Однією з систем нервової клітини, яка може приймати участь у поверненні [Са2*]! до базального рівня пісчя періоду активності нейрона, с Na+/Ca2+ обмінник плазматичної мембрани (Костюк, 1986; Rlaustein, 1983; Miller, 1991). Якщо вилучити з зовнішньоклітішиого середовища іони Na*. ач

система починає працювати у протилежному напрямі, забезпечуючи вхід Са3* в клітину та виведення Na* назовні (Lagnado and McNaughton, 1990). Ця властивість й використовуватась для вивчення ролі Na*/Ca3* обміну в регуляції iCa2+|j. Експерименти проводились на інтактних нейронах спінальннх гангліїв щура. Поміщення клітини в розчин, в якому весь NaCl було замішено на еквівалентну кількість N-nietliyl-d-glucamineCl, викликало збільшення ICa2*]j від 80 ± 16 нМ у контролі до 151 + 28 нМ (п"5). Після відмивання безнатрієвого розчину (Са2* Jj поверталась до рівня, який відповідає перебуваючій у спокою в нормальних умовах клітині. Ці результати доводять наявність Na*/CaJ* обмінника в DRG нейронах, який може працювати в безнатрієвому розчині у зворотньому напрямі. Але ж не було виявлено статистично достовірної різниці (п“5) між умовами безнатрієвого та контрольного розчину в швидкості відновлення базального рівня [Са2*]; після її підвищення, викликаного короткочасною аплікацією гіперкалієвого розчину (40 мМ КСІ). Тобто, в фізіологічних умовах Na*/Ca3* обмінник не відіграє істотньої ролі в регуляції |Ca2*]j в DRG нейронах.

Роль СаІ+-АТФазк плазматично? мембрани в регуляції [СаІ+]|.

Ще однією системою плазматичної мембрани, яка здатна транспортувати Са2* з клітини назовні, є Са2*-АТФаза (або Са насос) (Carafoli, 1991; Wang et а!., 1992). Відомо, що іони La5* блокують роботу цієї системи (Kwan et al.. 1990; Carafoli, 1991). Тому La3* використовувався для вивчення ролі Са2*-АТФази в регуляції |Ca2*]j в DRG нейронах. Через те, що La3* являє собою також блокатор Са електрокерованих каналів мембрани, він додавався до зовнішньоклітннного розчину лише після закінчення стимуляції клітини за допомогою гіперкалієвого розчину. Аплікація в таких умовах LaCl3 в концентрації З мМ приводила до помітного зменшення швидкості відновлення базального рівня |Ca2*]j: постійна часу експоненти, що описує процес відновлення, збільшувалась з 11,2 + 3,7 с в контрольних умовах до 34,5 + 9,4 с (п*=6) в присутності лаитана. З цього випливає, що Са3*-А’ГФаза плазматичної мембрани відіграє важливу роль в регуляції |Ca3*)j в нейронах спінальннх гангліїв.

Участь Са транспортних систем мітохондрій в Са гомеостазі.

Електрохімічний протонний градієїгт на внутрішній мембрані мітохондрій може забезпечувати транспорт Са2* з цитоплазми у мітохонлріальний матрікс проти градієнта концентрації (Ленінджер, 1974; Костюк, 1986). Огже мітохондрії можуть брати участь в регуляції (Ca3*]j. Для

того, щоб це перевірити, вивчався вплив сильного роз'єднувача окислювального фосфорилірування карбоніл ціанід р-трнфлуометоксі-фенілгідразона (FCCP) (Duchen, 1990) на процеси регуляції |Ca2*]¡. Додавання до зовнішньоклітинного розчину FCCP в концентрації З мкМ виклш ало повільне зростання |CaItJ¡ від рівня 78 + 15 нМ в контролі до 156 + 25 нМ (пв7). Це відбувалось, мабуть, через те, що транспорт Са2* в мітохондрії зупинявся, в той час як інша система мітохондрій, транспортуюча Са2* в протилежному напрямі в обмін на Na* - Na*/Ca2* обмінник мітохондрій (Miller, 1991). продовжувала виводити Са3* в цитоплазму по градієнту концентрації. Отруєння мітохондрій FCCP також в деякій мірі впливало на процес відновлення |Ca2*]¡ після її збільшення за допомогою гіперскалієвої деполяризації: постійна часу експоненти, що описує цей процес, зростала з 8,8 ± 2,7 с в контролі до 12,0 + 2,4 с (п=4), тобто у присутності FCCP релаксація [Ca2*)¡ відбувалась трохи повільніше.

Вивільнення Са1+ з внутрішньоклітинних кофеїнчутливих Са депо.

Мембрана ендоплазматичного ретикулуму, так само, як і поверхнева мембрана клітини, мас Са2+-АТФазу (Са насос), яка здатна транспортувати Са2* з цитоплазми, в ретикулум проти градієнта концентрації і, отже, зменшувати |Ca2*]¡ (Martonosi, 1984; Костюк, 1986; Blaiistein, 1988). З іншого боку, мембрана Са депо ретикулуму містить Са канали, які можуть

відкриватися при певних умовах і

забезпечувати вивільнення накопиченого в депо Са до цитоплазми (Tsien and Tsien, 1990; Henzi and MacDermolt, 1992).

Наявність цих антагоністичних механізмів забезпечує важливу роль ретикулуму в

регуляції |Ca2*]¡.

Кофеїн в мілімолярних

концентраціях може викликати мобілізацію Са3* з внутрішньоклітинних депо в різних типах клітин (Henzi und MacDermott, 1992; Berridge, 1993). В DRG нейронах прикладання кофеїна в концентрації 10 мМ приводило до зростання |Ca2*]¡ від 74 + 19 нМ в спокої до 342 + 97 нМ (п-=44). Максимальне значення |Ca2*]¡ досягалось за 5,4 ± 1,1 с (п=24). Потім, не зважаючи на

400 —і £

£

Ъ.

70-

ЯЛ

паашвваашві*

' 50с___

Мал.4.

Порівняння змін середньої |Са2+]р що викликаються аплікацією кофеїна різної тривалості. Періоди аплікації кофеїна в концентрації 10 мМ позначені чорними прямокутниками під реєстраціями.

присутність зовні кофеїна, IC.v' ]i починала зменьшуватись і поверталась до початкового рівня протягом 87,3 + 33,8 с (і»=24). Відповідь на кофеїн зберігалась і у безкальцієиому розчині, шо доьоднть активацію кофеїном

вивільнення Са2* з

внутрішньоклітинних депо. Кофеїн викликав збільшення [Ca2+]j як в ■ сомі нейрона, так і в його відростках. Прн тривалій аплікації кофеїна в концентрації 10 мМ відбувалось виснаження внутрішньоклітинних Са депо, і повторна аплікація не викликала маііже ніякої реакції. При прикладанні кофеїна на короткий час спустошення було істотно меншим. Відновлення |Ca2*]j до базального рівня відбувалось набагато повільніше в присутності кофеїна, ніж у випадку, кати одразу після досягнення піка (Са2+]| кофеїн відмивався (Мхі. 4).

Перезаповнювання депо Са та відновлення здатності клітини відповідати на кофеїн в межах 5-10 хвилин відбувалось майже лінійно з часом (Мал. 5). Процес иерезаповнення проходив досить повільно: половинний час відновлення амплітуди | Са2 * jj відповіді складав 2-5 хвилин. Але, якщо створювався додатковий приплив Са2* до цитоплазми, наприклад, за рахунок гіперкаліевої деполяризації, тоді амплітуда І Са2"* ] j відповіді дуже швидко досягала попереднього значення або паліть перевищувала його. _

Кофеїн спроможний взасмодіити з флуоресцентним зондом інао-1, викликаючи гасіння флуоресценції. Ефект гасіння не залежить від довжини хвилі флуоресценції і збільшується лінійно зі збільшенням концентрації кофеїна в межах 0,5 - 50 мМ (O'Neill et al., 1990). Тому, з одного боку, ефект гасіння не заважає вимірювати |Са2+]; за допомогою дьохвильового методу (Grynldewicz et al., 1935), • а, з іншого боку, дозволяє вимірювати внутрішньоклітинну концентрацію кофеїна (O'Neill et al.,. 1990). Остання властивість була використана дія вивчення дозозалежності впливу кофеїна на ІСа2*];. Як можна бачити з Мал. 6, прикладання зовні кофеїна приводило до

час (с) ■

Мал.З.

Нормовані залежності для шоста клітин амплітуди викликаної

кофеїном Са2+ відповіді від часу між двома послідовними тривалими

аплікаціями кофеїну в концентрації 10 мМ. Кожній клітині відповідає певний символ на графіку.

швидкого зростання концентрації кофеїна в клітині, яка потім утримувалась на постійному рівні, поки кофеїн був присутній в зовнішньоклітинному розчині. Кофеїна в концентрації 2 мМ часто було досить для того, щоб викликати вивільнення Са2* із депо. Але цей процес помітно відставай віл зміни внутрішньоклітинної концентрації кофеїна і був істогньо повільнішим,

ніж при аплікації кофеїна в концентрації 10 мМ (Мал. 6). Максимальна швидкість

зростання ICa^lj у відповідь на 7 мМ кофеїна складала 35 + 8 нМ/с (11=8). тоді як у випадку 10 мМ кофеїна максимальна швидкість була 172 ± 23 нМ/с (н=22). Аналогічним чином, амплітуда змін |Са2*|, залежала від концентрації кофеїна: дгщ 2 мМ кофеїна амплітуда складала 106 + 28 нМ (п^З), а дія 10 мМ кофеїна - 268 + 48 нМ (н“44). Цікаво відмігити, що хоч відповідь на кофеїн в низькій концентрації (2 мМ в ньому випадку) могла бути виснаженою, більш високі концентрації кофеїна все ще були спроможні викликати мобілізацію великої кількісті Са2+ з яено. Таким чином, сгупінь спустошення внутрішньоклітинних Са1+ депо також залежить від концентрації кофеїна.

Крім кофеїна, вивільнення Са2+ j внутрішньоклітинних кофеїнчугливнх Са депо викликалось також теофіліном та З-ізобугіл-1-метилкеантіном (1ВМХ) в мілімолярних концентраціях. Аденін та гіпоксантін

- ІНШІ речовинії, що мають схожу 3 кофеїном хімічну PTpjKiypy, ■ в ™х самих концентраціях не мали ніякої дії на (Са2'],.'

Іншим класом речовин, які можуть викликані вивільнення Са2+ з внутрішньоклітинних депо, є специфічні блокатори Са’*-АТФазн мембрани ендоплазматичного регикулуму (Rink and Mcrrit, 1990; Demaurex et al., 19^2>. До цього класу речовин належить тапсігаргін. На клітинах нейробласюмн б\ло

2 мМ

0-*

^ 51) г.

Мал.6.

Одночасна реєстрація внутріїшн.оклі-тинної концентрації кофеїна (верхній запис), ¡Ca2+jj (середній запис) та швидкості зміненім [Са2*], (нижній запис).

показано, наприклад, що тапсігаргін мобілізує Са2* з тих самих депо, що й вгоністи, які активують формування інозітол 1,4,5-трифосфата (Jackson et al., 19S8). Виявилось, що в DRO нейронах тапсігаргін в концентрації 2 мкМ може звільняти Са2* з кофеїнчутливих Са депо.

Популярні блокатори процеса вивільнення Са2* з кофеїнчутливих депо ріанодін та даитролен натрію (Thayer et al., 1988; Henzi and MacDennott, 1992) в концентрації 10 мкМ викликали незворотнє блокування мобілізації кофеїном Са2* з Са депо DRG нейронів, іони Ва2*, блокуюча дія яких на цей процес була досліджена на м'язових клітинах (Paladc, 1987), на DRG нейронах приводили до зменшення амплітуди ICa2*]¡ відповіді на кофеїн до 20,7 + 5,7 % (п*=7) від амплітуди в контрольних умовах. На відміну від ріанодіна та дантролена натрію, блокуючий ефект барію був частково зворотним. .

Участь кофеїнчутливих внутрішньоклітинних Садепо в контролюванні низького рівня [Ca2*]¡.

Як вже відзначалося вище, мембрана ендоплазматичного ретикулуму містить Са2*-АТФазу, яка має спорідненість до Са2* приблизно 3* 10-7 М і адатна транспортувати Са2* з цитоплазми до ретикулуму (Martonosi, 1984; Костюк, 1986; Blaustein, 1988). Тому ця система може брати участь в процесах відновлення ICa2*]¡ до низького базального рівня після періоду клітинної *

активності. Для перевірки цього припущення було досліджено, як вплив на транспортні системи ретикулуму відображається на швидкості відновлення [Ca2+]¡. Для того, щоб заблокувати участь кофеїнчутливих депо ретикулуму у виведенні Са2+ з цитоплазми, використався, по-перше, специфічний блокатор Са2*-АТФази ретикулуму тапсігаргін (Rink and Merritt, 1990) і, по-друге, ріанодін, який, як відомо (Fill and Coronado, 1988), при зв'язуванні з Са каналом мембрани кофеїнчутливих депо переводить його у постійно відкритий субпровідний стан і, отже, робить мембрану депо нездатною до підтримання градієнту концентрації Са2*. Обидві ні речовини значно зменшували швидкість повернення {Ca2*]¡ до базального рівня після того, як [Ca2*]¡ підвищувалась за допомогою електричної стимуляції клітини; тапсігаргін в концентрації 2 мкМ приводив до збільшення постійної часу експоненти, що описувала .процес ' відновлення |Ca2*]¡, з 10,3 + 2,2 с (п=6) у контролі до 17,9 + 4,5 с (п**6), а ріанодін в концентрації 10 мкМ відповідно - з 12,3 + 3,5 с (п=6) у контролі до 27,6 + 6,7 с (п“6). «

Ефективність зворотного захоплення Са2*. кофеїнчугливими депо ретикулуму зменшується з накопиченням Са в цих депо (Martonosi, 1984; Hciui and MacDcnnott, 1992). Тому впливати на участь систем

ендоплазматичного ретикулуму у виведенні надлишкового Са з цитоплазми також можна, змінюючи завантаженість кофеїнчутливлх депо. Ця особливість була використана ще в одній серії експериментів по перевірці ролі кофеїнчутливих Са депо в контролюванні низького рівня (Са2*],. В цих експериментах порівнювалась швидкість відновлення внутрішньоклітинної концентрації Са2*, збільшення якої досягалось або прикладанням гіперкалієвого розчину, або короткою аплікацією кофеїна в концентрації 10 мМ. У випадку кофеїна, коли зростання |Ca2+]j відбувалось за рахунок спустошення Са депо, постійна часу експоненти,' яка апроксимує процес відновлення |Са2+];, була помітно менше (7,7 ± 2,2 с, п=8), ніж при застосуванні гіперкалієвої деполяризації (11,2 + 3,7 с, п=8).

Ці результати дозволяють зробити висновок, що механізм активного транспорту Са2*- у кофеїнчутливі Са депо ретикулуму відіграє важливу роль у підтриманні низького рівня |Ca2*]j. Ще одним непрямим підтвердженням цього висновку с спостереження про те, що лантан, блокатор Са2*-АТФази плазматичної мембрани (див. вище), мав значно менший ефект на швидкість відновлення [CaJ+]j, якщо [Ca2+]j збільшувалась не деполяризацією мембрани, а прикладанням зовні кофеїна. Тобто підвищення зворотного захоплення Са1+ у спустошені кофеїнчутливі депо компенсувало виведення з ладу Са2*-АТФаз поверхневої мембрани.

Деякі властивості внутрішньоклітинних кофеїнчутливих Са депо нервових клітин молюска Helix pomatia.

Для того, щоб перевірити, наскільки наведені вище властивості кофеїнчутливих Са депо є універсальними для нервових клітин, були проведені дослідження на іншому експериментальному об'єкті -свіжовиділених ізольованих неідентифікованих нейронах навкологлоткового ганглію молюска Helix -pomatia. Для цих нейронів, також як і для сенсорних нейронів теплокровних, прикладання кофеїна в мілімолярннх концентраціях викликало зростання (Ca2*lj, яке потім, не зважаючи на присутність зовні кофеїна, змінювалось поверненням |CaJ+]j до базального рівня. Відповідь на хофеїн майже не залежала від присутності Са2* у зовнішньому розчині, тобто кофеїн і у цих нейронах викликав вивільнення Са2* з внутрішньоклітинних Са депо. Ці депо досить швидко спустошувались, і повторні відповіді на кофеїн були значно слабкішими, або зовсім не спостерігались. Перезаповнення депо кальцієм відбувалось трохи швидше, ніж для DRG нейронів, і помітно прискорювалось, якщо створювався додатковий приплив Са2* до цитоплазми шляхом деполяризації плазматичної мембрани. Тобто, основні властивості

кофсїнчутливмх Ся депо нейронів виноградного равлика практично не відрізняються від властивостей тих же депо DRG нейронів. Таке ж саме можна сказати і про фармакологію процеса вивільнення Са2* з кофеїнчутливих депо нейронів Helix ротаїіа: теофілін та ІВМХ викликали мобілізацію Са2* з цих депо, а ріаиодін та іони Ва2* блокували цей процес.

ОБГОВОРЕННЯ

Спільне використання мікрофлуорометричного та

електрофізіологічного підходів дозволило проаналізувати особливості регуляції |CaJ*J¡ о нейронах спінальних гангліїв курчати та" щура. Результати експериментів вказують на.те, що е, як мінімум, дві системи, що забезпечують приплив Са2* до цитоплазми сенсорних нейронів: І) потенціхікеровані Са канали плазматичної мембрани, які можуть активізуватися при деполяризації мембрани; 2) внутрішньоклітинні Са депо, що здатні звільняти Са2* під впливом кофеїна та інших ксантінподібних речовин, а також й тапсігаргіна. На ьідміну від спостережень одних вчених (Lipscombe et al., 1988; Friel and Tsien, 1992), але у відповідності з результатами інших (Tliaycr and Miller, 1990; Blumenfcld et al., 1992) дія DRG нейронів у фізіологічних умовах не було виявлено помітного внеску внутрішньоклітинних Са депо у розвиток Са2* відповіді під час електричної стимуляції клітини. На користь того, що при деполяризації мембрани вхід Са2* до цитоплазми визначається в основно^ роботою потсішіалкерованих Са каналів, свідчать такі результати: 1) зростання |Ca2+]j не спотерігалося, якщо у зовнішньоклітинному розчині був відсутній Са2*, ибо знаходились іони Cd2* чи La3* - неорганічних блокаторів Са каналів;

2) зростання |CaJ*]¡ починалося біля поверхневої мембрани та розповсюджувалось з часом радіально від мембрани до центру соми (Мал. 1);

3) залежність амплітуди змінень середньої |Ca2*]¡ від величини потоку Са2*.до клітини добре описувалась лінійною функцією (Мал. 2).

Збільшеній !CaJ*]¡ за рачунок вивільнення Са2* з внутрішньоклітинних депо могло бути викликано кофеїном, теофіліном, 3-ізобугіл-І-метилксантіном і тапсігаргіном. Як випливає з порівняння |Ca2*]¡ відповідей на аплікації кофеїна різної тривалості, вивільнення Са2* з внутрішньоклітинних Са дедо відбувається на протязі усього періоду аплікації. Якщо прийняти до уваги результати спостережень на рівні поодиноких каналів саркоплазматичпого ретикулуму серцевих м'язів (Sitsapesan and Williams, 1990) та ендоплазматичного ретикулуму нейронів Пуркін'є (Bezprozvanny et пі,, 1991), то можна вважати, що вивільнення Са2* з депо відбувається при

активації Са каналів депо, яка триває, доки а цитоплазмі є кофеїн. Але ж через спустошення Са депо і, отже, зменшення кальцієвого градієнта між депо та цитоплазмою, потік Са2* з депо повинен падати. Оскільки усе це відбувається на фоні активного зв'язування Са2* буферами клітини, то не зважаючи на постійну присутність кофеїна, фаза зростання внутрішньоклітинної концентрації Са2* змінюється на її зменшення. Швидкість зростання (Са2*|| при мобілізації Са кофеїном повинна залежати від того, яка кількість Са каналів депо одночасно відчиняється. Імовірність відчиненого стану збільшується з підвищенням концентрації кофеїна (Sitsapesan and Williams, 1990). З цієї точки Sopy можна пояснити, чому швидкість зростання |Са2*]; була помітно меншою при використанні низьких концентрацій кофеїна (Мал. 6). Окрім того, імовірно, що при використанні низьких концентрації кофеїна менша кількість потенційно здатних до мобілізації Са депо залучалась у розвиток реакції: дійсно, кофеїн в концентрації 10 мМ був здатний спричинити значний ефект, в той час як концентрації кофеїна 2 мМ було вже недостатньо (Мхі. 6). імуноцнтохімічні, морфологічні та біофізичні дослідження показують, що порожнина ендоплазматичного ретикулуму не є одним великим безперервним резервуаром для Са, ч складається з просторово та функціонально окремих депо (Henzi and MacDermott, 1992). Тому можна припустити, що Са канали різних депо мають різну чутливість до кофеїна, ' наприклад, за рахунок цАМФ-залсжного фосфорилірування одних, шо підвищує імовірність активації вивільнення Са2* (Yoshida et аі., 1592), і/чи казмодулінзалежної інактивації інших (Smith et til., 1989). Тоді дії низьких концентрації кофеїна будуїь підкладні тільки сенситизовані Са депо, в той час як решта збереже свій Са вміст, який потім може бути мобілізований білі-ш високими дозами кофеїна (Мал. б).

Фармакологічні характеристики процесу вивільнення Са2* з внутрішньоклітинних хофеїнчутлпвих Са депо DRG нейронів повністю відповідають загальновідомим властивостям цього процесу і для інших клітин (Martonosi, 19S4; РаЫе, 19S7; Henzi and MacDermott, 1992). Вивільнення Са2*, порад з кофеїном, викликалося іншими блокаторами фосфодіестерази -теофіліном та З-ізобутіл-1-метилксантіном (Северін та Кочетова, 1985). Тому можна припустити, що дія цих речовин опосередкована циклічним АМФ. Здатність тапсігаргіна мобілізувати Са2* з кофеїнчутливих депо пояснюється, певно, блокуючею дією цієї речовини на Са2*-АТФазу ретикулуму (Rink and Merritt, 1990; Wictome et al., 1992).

Базуючись на результатах експериментів по вивченню кофеїн-чугливих Са депо отриманих на зовсім іншому гіорявняно з DRG нейронами

іенлокрошшх експериментальному об'єкті - нейронах молюска ¡Mix pomatrn -можна тірппустнти, іцо досліджені біофізичні та фармакологічні особливості процесу вивільнення Са2* з цих депо е універсальними для нервових клітин.

|Са2*]; d DRG нейронах, що перебувають у спокої, підтримується на рівні меншому, ніж 100 нМ (див. результати). Збільшеній |Са2*]; в клітині за рахунок входу Са2* через електрокеровані Са канали мембрани або вивільнення з внутрішньоклітинній Са' депо активує різноманітні клітинні системи, які виводять Са2* з цитоплазми. Це призводить до відновлення попереднього рівня |Са2*|;. Вивчаючи процеси, які відбуваються при електричній стимул її ції нейрона, вдалось виявити дві стадії процесу відновлення ¡Са2*.];: 1) швидка стадія, яка починається одночасно з початком стимуляції і триває мілісекунди або менше; 2) повільна стадія, яка триває десятки секунд. Під час швидкої стадії відбувається зв’язування близько 99% усіх іонів Са2т, що утішили до клітини (див. результати). Найбільш імовірним учасником процесу швидкого зв'язування Са2* під час першої стадії уявляються Са-зв'язуючі білки (Miller, 1991; Baimbridge et al., 1992).

Повільна стадія відновлення [Са2*]; до базального рівня добре апроксимувалась для соми клітини однією експонентою з постійною часу близько десяти секунд. На підставі аналізу постійної часу експоненти при різних діях на клітину були досліджені системи, що забезпечують повільну стадію зв'язування цитоплазматичного Са2*. З'ясувалось, що основну роль у відновленні [Са2*]; в нейронах спінальних гангліїв у фізіологічному діапазоні змін ІСа2*]і відіграють Са2*-АЇФази плазматичної мембрани та ендогиіазматичного ретикулуму. При цьому відносний внесок Са насоса ретикулуму в цьому процесі залежить від заповнення депо, ретикулуму кальцієм. Деякий вплив на швидкість повернення |Са2*]; до базального рівня справляють також Са транспортні системи мігохондрій.

Виявити участь^ Na*/Ca2* обмінника плазматичної мембрани у ' підтриманні низького рівня ]Са2*]; в сенсорних нейронах не вдалося. Ці дані відрізняються від результатів досліджень на нервових закінченнях (Baker nud DiPolo, 19S4; Blaustein, 1988), але узгоджуються зі спостереженнями для соми нервової клітини (Nohmi and Kuba, 1984; Kostyuk et al., 1989; Thayer and Miller, 1990; Benham.et al., 1992).

Мікрофлуорометуична техніка, яка використовувалась в дослідженнях, дозволяла порівнювати динаміку змінень [Са2*]; у сомі та відростках. Основні відмінності зводяться до наступного: регуляція ¡Са2*]; у відростках відбувається швидше, ніж у сомі, тобто ІСа2*]; зростає з випередженням у відростках під час електричної стимуляції та швидше спадає

до початкового рівня після закінчення стимуляції (Мал. 3). Якщо зважити на те, що як зростання , так і відношіення | Са2 * ]; в значній мірі визначаються роботою систем плазматичної мембрани - електрокерованими Са каналами та Са2*-АТФазамн, то стає зрозумілим, шо ці процеси будуть відбуватися швидше в тих частинах нейрона, для яких вище співвідношення поверхня/об'єм. Неважко оцінити, шо для відростка це співвідношення значно вище, що, мабуть, і пояснює виявлену різницю у швидкості регуляції ¡Са2*);.

ВИСНОВКИ

1. За допомогою флуоресцентних Са2**чутливих зондів фура-2 і ікао-1 та методики петч-клемп були вивчені механізмі! регуляції внутрішньоклітинної концентрації Са2* (5Са1*] ¡) в нейронах спінальних гангліїв курчати та шура. ■

2. Показано, шо в цих нейронах існують, як мінімум, два механізми, що забезпечують збільшення [Са2*];: 1) вхід Са2* через потенціалкеровані Са канали плазматичної мембрани, які активуються при її деполяризації; 2) вивільнення Са2* з внутрішньоклітинних Са депо, яке може викликатись кофеїном та іншими метилкеантінами, а також специфічним блока юром Са2*-АТФази ретикулуму тапсігаргіном. Не було виявлено активації Сі2*-залежтюго вивільнення Са2* з внутрішньоклітинних депо при деполяризації плазматичної мембрани.

3. Було вивчено механізм вивільнення Са2* з внутрішньоклітиннім кофеїнчутливих Са депо. Цей процес має такі особливості:

- вивільнення відбувається на протязі всього часу присутності кофеїна в цитоплазмі, доки не будуть спустошені депо;

- амплітуда досягнутих при цьому змін |Са2*]; залежить від кількості • запасеного в депо Са;

- швидкість розвитку процесу вивільнення Са2* з депо та ступінь спустошенім депо збільшуються з підпищенням концентрації кофеїна;

- відновлення вмісту Са депо в межах 5-10 хвилин відбувається майже лінійно з часом;

- додатковий приплив Са2* до цитоплазми сприяє відновленню вмісту

Са депо. 1

4. Процес відновлення |Са2*]; до базального рівня в сомі нейрона апроксимується у більшості випадків олнією експонентою з постійною часу у десятисскундному діапазоні. Цей процес контролюється, як мінімум, трьома системами клітини: Са2*-АТФа30ю плазматичної мембрани, Са2,-АТФаюю

мембрани ендоплазматичного ретикулуму та Са транспортними системами мітохоїщрій. Відносний внесок Са2+-АТФази ретикулуму в цей процес збільшується після спустошеі.ня кофеїнчутливих Са депо.

5. Порівняння амплітуд змін [Са1*]; в сомі, які реєструються за допомогою флуоресцентнім Са2‘-чутливих зондів при деполяризації плазматичної мембрани, з амплітудами, розрахованими на підставі аналізу Са струмів, виявляє поруч з тривалим, моно:кспоненційним компонентом процесу відновлення |Ca2*Ij наявність швидкого компонента. Швидкі Са буфери, що забезпечують цей компонент, зв'язують близько 99% усіх іонів Са2*, шо увійшли до клітини.

6. Просторовий аналіз динаміки |Ca3+]j в різних частинах нервової клітини виявив, шо процеси регуляції |Ca2t|j відбуваються швидше у відростках, ніж у сомі. Найбільш імовірне пояснення цього факту - більш високе співвідношення поперхнм/об'см для відростка, ніж для соми нервової клітини.

І

Матсрікашікртації .рдубдішши.в.дашуярб0т; '

1. Усачев Ю.М, Миронов С.Л. Действие ионов стронция и бария на системы связывания и транспорта кальция в нервных клетках // Нейрофизиология. -1989. - 21, N6. - С. 820-825.

2. Усачев Ю.М., Миронов С.Л. Влияние кофеина на процессы регуляции внутриклеточной концентрации Са2* в изолированных нейронах виноградной улитки // Нейрофизиология. - 1991. - 23, N1. - С. 66-73.

3. Усачев Ю.М., Шмиголь А.В., Прончук Н.Ф., Всрхратский А.Н. Роль кофеин-чувствительных кальциевых депо в модуляция кальциевых сигналов в сенсорных нейронах крыс // Доклады Академии наук. - 1993 (в печати).

4. Mironov S.L, Usachev Yu.M. Sr and Ba transients in isolated snail neurones studied with fura-2. The recovery from depolarization induced load and modulation of Ca release from intracellular stores //Neuroscience Letters.-1990.-112.-P.184-189.

5. Mironov S.L., Usachev Yu.M. Caffeine affects Ca uptake and Ca release from intracellular stores: fura-2 measurements in isolated snail neurones // Neuroscience Utters. - 1991. - 123. - P. 200-20І

6. Mironov S.L., Usachev Yu.M., Lux H.D. Spatial and temporal control of intra-

ccllular free CaJ+ in chick sensory neurons // Pflugers Archiv. - 1993. - 424. - P. 183-191. .

7. Usachev Y., Slimigol A., Pronchuk N., Kostyuk P., Verkhratsky A. Caffeine-induced calcium release from internal stores in cultured rat sensory neurons // Neuroscience. - 1993 (in press).