Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы регуляции рецептор-зависимого входа ионов кальция в клетки асцитной карциномы Эрлиха

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Механизмы регуляции рецептор-зависимого входа ионов кальция в клетки асцитной карциномы Эрлиха"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИП ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УИИВЕГСИТЕТ

На правах рукописи

Т Ю IIIЕ В Валентин Евгеньевич

Г

МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ РЕЦЕПТОР-ЗАВИСИМОГО ВХОДА ИОНОВ КАЛЬЦИЯ В КЛЕТКИ АСЦНТНОЙ КАРЦИНОМЫ ЭРЛИХА

03.00.02 - биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наух

Санкт-Петербург 1995

Работа"выполнена в лаборатории биофизики клетки физиологичео-ного научно-йсследоБательоного института им. А.А.Ухтомского СПСГУ и на базе Института биофизики клетки РАН

Научный руководитель: доктор биологичесних наун О.Б.Лебедев

Научный консультант: доктор биологических наук В.П.Зинченио

Официальные опаонвкты:доктор биологических наун Ф.Г.Грибэнин

доктор медицинских наук, профессор,

член-корреспондент РАМН В.0.Самойлов

Ведущая организация: Институт физиологии им. И.П.Павлова РАН

Защита .состоится " I (э " А! ^ Р*"]"/! 1995 года в 16 часов на заседании Специализированного Совета Д.063.57.50 по защите диссертаций на соиокание ученой степени доктора биологических наун при Саннт-Петербургоком государственной универоитете. ( 199034, Санкт-Летербург, Университетская наб., 7/9, ауд.90 )

С диссертацией ыокно озна.ноиитьсп в библиотека им..А.М.Горького Саннт-Петербургоного государственного университета.

Автореферат разослан "_"__ 1995 года.

Ученый сенретарь Специализированного совета кандидат биологических неук

З.И.Крутецная

Актуальность проблемы. В настоящее время все большее внимание привлекает изучение молекулярных механизмов запуска и регуляции физиологических процессов в клетках. Активация определенных физиологических процессов в клетках в основном осуществляется благодаря взаимодействию природного стимула (гормоны, факторы роста, медиаторы, митогены и другие факторы) с рецептором на плазматической мембране клеток, в которой находятся функциональные системы, преобразующие внешние сигналы во внутриклеточные. Внутриклеточные сигналы передаются молекулами-посредниками или "вторичными моссэндчмрами".

Ватную роль в трансмембранной передаче сигнала играют изменения в транспорто и внутриклеточной концентрации ионов и в первую очередь ионов Са2+ < Rasmussen,Barret, 1984J Berridre, Irvine, 1989 [ iiw-hes,Putney, IS90; Крутецкая, Лебедев, 1992a), а также H+, Ha+ , К*, роли которых в последнее время уделяется большое внимание (Веренинов, Марахова, IS86; Grinstein е.а. 1989).

В последние годы достигнут значительный прогресс в понимании путей активации клеток, в которых роль основного вторичного посредника ВЫПОЛНЯЮТ ионы ( Наятцязеп,.Sarret ( 1984; iJerridr;e, Irvine, 1989). Изменения в транспорте и внутриклеточной концентрации ионов играют ключевую роль в запуске и регуляции общих и специализированных клеточных функций, таких как пролиферация, рост, секреция, сокр&п^енив, переддча нервного импульса, иммунный ответ и т.д.

Как выяснилось в последнее время, экстраклеточные адени-новые нуклеотиды могут являться одним из регуляторов функционального состояния различных клеток и тканей ( Gordon, 1986). АТФ или действуя снаружи в микромолярных концентрациях, взаимодействуют со специальными рецепторами клеток - "пурино-рецепторами" ( йцгг,stock, 1978) и могут влиять на многие биологические процессы в различных клетках.

Клетки асцитной карциномы Зрлиха (АКЭ) имеют на своей поверхности пуринорецепторы Р2ц~типа> которьго активируются экзогенной АТ4 и приводят к стимуляции, эффекторной молекулы -фосфолипаэн С, которая расщепляет мембранный фосфолипид фосфа-тидилинозитол-4,5-бифосфат на два внутриклеточных мэссенджера-водорастворимый шозитол-1,4,5-трифосфа'Г и липидсрастворимяй диацилглицерол (Dubynlc.üe tounf,. 1985; Dubyak, 1986; Wiener п.п.

- г -

1986). Инозитолтрнфэсфат мобилизует ионы из эндоплазма-тического ретикулума, увеличивая концентрацию свободных ионов

в цитозола, а диацилглицерол, оставаясь в мембране, активирует Са^+-чувствигельную, фоа^олипидзависимую протеинки-наэу С. Обнаружено, что многие другие типы клеток также активируются АТФ по фосфоинозитидному пути, поэтому клетки АКЭ являются удобным объектом для изучения механизмов трансмембранной передачи сигнала от АТй-рецептора.

Поддержание кальциевого гоыеостаза - тонкий, сложный и хорошо отрегулированный процесс, в котором приникают участие многочисленные Са^+-транспортирую(цие системы, расположенные в различных мембранах клетки ( СагзГои, 1967). Стимуляция многих рецепторов приводит к двухфазному увеличению внутриклеточной концентрации ионов Са + вследствие мобилизации из

л 2+

внутриклеточных репо и входа Са по градиенту концентрации из наружной среды. Учитывая большой градиент концентрации ионов Са^* меж^у внаашей средой и цитозолем и то, что массированный вход Са + в клетки может представлять опасность для их функционирования, можно было предположить, что системы входа ионов Са^ должны очень жестко регулироваться.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в дальнейшем изучении механизмов формирования кальциевого сигнала при активации клеток АКЭ экстраклеточной АТй и путей регуляции рецептор-зависимого входа в ети клетки. Аля достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Рассмотреть роль различных С&*"+-транспортирух>щих систем клетки в формировании кальциевого сигнала.

2. Определить возможную взаимосвязь изменений транспорта кальция и других ионов (Н+, Иа+ , при рецептор-зависимой активации клеток.

3. Исследовать зависимость кальциевого сигнала от температуры и активности систем окислительного метаболизма.

4. Определить зависимость кальциевого сигнала от уровня содержания циклических нуклеогидов и активности протеинкинаэы С.

5. Изучить роль арахидоновой кислоты и ее продуктов в регуляции механизмов формирования кальциевого сигнала.

Научная новизна. Впервые показано, что в формировании

кальциевого сигнала при рецептор-зависимой активации клеток, кроме процессов мобилизации ионов из внутриклеточных депо и входа их снаружи, участвует механизм активного выброса Са^+ во внеклеточное пространство с помощью АТОаэы плазматической мембраны, что является причиной быстрого снижения в первые минута после активации клеток.

Доказана Езаимосвяэь входа ионов в клетки и активности Па+/н+-обмена клеток АгИ при их рецептор-зависимой активации.

Показана сложная множественная регуляция рецептор-зависимого входа ионов в клетки AiO, состоящая в зависимости этого процесса от тешературы, энергетического метаболизма клетки, концентрации цА1«5, активности протеиикиназы С, а также продуктов липоксигеназного пути окисления арахидоновой кислоты.

Научно-практическое значение работа. Полученные результаты расширяет представления о механизмах формирования кальциевого сигнала в клетках при их рецептор-зависимой активации, о взаимосвязи а этом процесса транспорта различных ионов и могут быть использованы в исследованиях механизмов управления различными функциональными процессами, в которых роль основного вторичного посредника выполняют ионы Использованное сочетание методов изучения ионтранспортных систем может быть применено для выяснения механизмов действия и побочных эффектов различных фармакологических препаратов.

Апробация работа. Результата диссэртационной работы были доложены на 5 Советско-швейцарском симпозиуме "Биологические мембраны: структура и функции" (Рига, 1968), на Всесоюзной конференции "Механизмы действия медиаторов и гормонов на эф-фехторные клетки" (Суздаль, 1989), на Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы клеточной биологии" (Ленинград, 1969), на конференции СШИ им.A.A.Ухтомского "доминантные механизмы поведенческих адаптация" (Ленинград, 1990), на Всесоюзном совещании "Ионный транспорт и регуляция функций клеток" (Ленинград, 1990), на Всесоюзном совещании "Внутриклеточная сигнализация" (Москва, 1991), на Международной школе "Механизмы гомеостаза в возбудимых клетках" (Киев, 1993).

Структура и объем диссертации, диссертация состоит из

следующих разделов: введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на страницах, вклочая 23 рисунков и библиографию, содержащую 11 отечественных и 251 зарубежных источников.

матьишы и ыщца ИССЛВДВАШЯ

Клетки асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ) поддерживали в белых беспородных мышах с помощь» внутрибришинного введения асцитной жидкости от спухоленесущих животных - доноров. В экспериментах использовали клетки через 7-8 дней после прививки. Уровень концентрации ионов Са в цигозоле измеряли

с помощью флуоресцентного зонда йура-2,РН определяли с использованием зонда кзаср . Коцентрацио во внутриклеточных структурах измеряли по флуоресценции хлортетрациклина (ХТ). Концентраций Са2+, К+, Н+ в среде инкубации определяли с помо'дыз ионселективных электродов, для регистрации указанных параметров клетки помещали в терыостатируемую ячейку флуориметра в концентрации 1-2 х 10 клеток/мл при постоянном перемешивании.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЩОВШМ И ИХ ОБСУлЩВНИЕ

I. Характеристика кальциевого сигнала, возникающего в клетках асцитной карциномы Эрлиха при активации их экстраклеточной АТФ.

Активация клеток АКЭ экзогенной АТ» происходит благодаря наличию на их мембране пуринорецепторов Р2ц -типа, относящихся к семейству рецепторов, передача сигнала с которых идет с участием я-белков и фосфолипазы С {.пчъу&к, 1986; шьуак, 1993).

Добавление АТЬ к клеткам АКЭ вызывает двухфазный Са -от»ет: быстрый пик и промежуточное плато, вше исходного уровня в покое (рис.1а). Измерение содержания Са2+ во внутриклеточных структурах по флуоресценции XI (рисЛб) показало, что А15 приводит к быстрому уменьшению интенсивности флуоресценции, отражающему освобождение ионов Са2+ из внутренних источников, т.о., первый всялео1:£Са2+^ происходит за счет мобилизации этих ионов из внутриклеточных структур. Вторая медленная Фаза Са2+~сигнала, очевидно, связана со стимуляцией входа Са^

Рис Л. Изменения концентрации кальция в цитозоле,

, измеренной по флуоресценции Фура-2 (А), содержания Са''"1" во внутриклеточных структурах, измеренного по флуоресценции хлортетрациклина (Б), выход ионов ■из клеток асцитной карциномы Эрлиха, зарегистрированный по изменению концентрации в среда инкубации ([Саг+]о) с помощью Са ^"-селективного электрода (В),и изменения рН;, измеренные по флуоресценции воеср (Г) При действии 2 мкИ

т.

снаружи, т.к. она отсутствует при инкубации клеток в бескальциевой среде. Активация входа ионов из среды инкубации в клетку и возвращения во внутриклеточные депо продолжается в течение 10 и более минут в зависимости от концентрации вдбав-ленной АТй.

В чем причина быстрого понижения (Са^ в первые минуты после воздействия АТФ? Скорость обратного заполнения внутриклеточных депо кальцием, судя по восстановлению флуоресценции ХТ (рис.16), оказалась слитком медленной, чтобы объяснить фазу быстрого понижения

. их реаккумуляцией. Измерения концентрации Са^+ во внешней среде с помощью Са^+-селективно-го электрода показали, что через 2тЗ с после начала мобилизации происходит выброс ионов Са^+ из клеток, что и обеспечивает быстрое понижение

(рисЛв).

Рецептор-зависимый вход Са?> в клетки АКЭ обеспечивает

развитие фазы стационарного длительного повышения (Са*""М} и заполнение кальцием внутриклеточных пулов.

йроведевд исследования некоторых характеристик каналов, через которые Са*"+ поступает в клетки. Цоказано, что вход ионов Са^+ не подавляется такими известными ¿локаторами каналов, как верапамил, А-600, ионами . Обнаружено, что Са^+~каналы в этих клетках блокируются ионами ^ . деполяризация мембран клетки при увеличении концентрации в среде не вызывала входа в клетки и не влияла на развитие к'£<2-индуцированного Са^+-сигнала. Показано, что рецептор-зависимый вход Са^' в клетки АКЭ происходит через Са -каналы, которые не проницаемы для ионов Ып'"+ или Зг^* .

2. Зависимость изменений при рецептор-зависимой

активации клеток АКЭ от активности ка+/л+-обмена.

ири стимуляции АФа-рецепгоров клеток АКЭ экзогенной АГ4 происходят и заметные изменения рН^, которые можно рассматривать в качестве еще одного важного ионного сигнала в процессе активации клеток. В связи с этим была исследована возможная взаимосвязь между изменениями

[Са2^ и 1фи добавлении А14 к суспензии клеток АЮ происходит увеличение интенсивности флуоресценции красителя воиср , цто свидетельствует о за- • щелачивании цитозоля 'рисЛг). Изменения рй^ начинаются на 30-40 с позже начала развития Са^+-сигнала и развиваются более медленно. Эти изменения рН^ отсутствуют в безнатриевой среде и устраняются этилизопропиламилоридом (ЭЖ1А) - ингибитором йа+/н+-обмена. йри этом обнаружено, что ингибирование Ка+/н+ -обмена приводит к устранению второй фазы Са^-сигнала, связанной с входом ионов Са^+ в метки, и подавлению возвращения его в ретикулум. Оба эти процесса - вход ионов Са"^ в клетки и реаккумуляция их в ретикулума - восстанавливаются при добавлении моненсина - искусственного ка+/н+ -ионофора. В бескальциевой среда, в которой отсутствует вход ионов Са2+ в клетки, рН^атвет сохраняется. Таким образом, существует односторонняя зависимость рецептор-активируемого входа в клетки АКЭ от На+/н -обменника.

3. Влияние температуры на изменения рН . и в клетках асцитной карциномы Орлята.

Учитывая, что в процессе эксперимента окрашенные Фура-2 и dOiGF клетки хранили в холодильнике при -t-4°C перед помещением в термостатируемую ячейку с +37°С, нами исследован процесс адаптации клеток к смене температуры. Сравнение Са*"+- и рН -ответов в клетках, инкубированных разное время при +37°С, свидетельствует о том, что для развития рН -ответа и полноценного Са^-сигнала необходим предварительный 8-10 минутный период инкубации клеток при температуре 37°С. Если АТФ добавляли раньше этого срока, то не наблю,иали повышения рН а в Сас+~сигнал& отсутствовала вторая медленная фаза, связанная с входом ионов из внеклеточной среды. Такая заьисимость от температуры рН - и Са^+-отеетсв на АТ2, по-ви,шмому, объясняется температурной чувствительность» механизмов, генерирующих эти ионные сигналы. В данных экспериментах также подтверждается взаимосвязь процессов входа ионов Са^+и активации Ka+/n'f -обмена.

4. Зависимость и рЯ -ответов клетки АКЭ от активности систем окислительного метаболизма.

Исследовано влияние различных ингибиторов дыхательной цепи митохондрий на развитие и pti -ответов при актива-

ции клеток АКЭ. Появление энергетического обмена митохондрий за счет разобщения окислительного фосфорилирования t IGCP ), ингибирования переноса электронов в дюсательной цепи ( iiafij) или ингибирования дыхательной цепи и одновременного подавления Н+-АТФсинтетаэы (ротенон-олигомицин) во всех случаях полностью ингибировало вход Са?'+ в клетки и возвращение их во внутриклеточные депо. О^овременно с входом в клетки подавлялся и рН -ответ. Механизм действия ингибиторов дахатель-ной цепи митохондрий на процессы рецептор-зависимого транспорта и Н+ остается неясным. Кратковременность воздействия ингибиторов вряд ли могла привести к залетному снижению концентрации AT} за этот период, поэтому можно сказать только то, что нормальное функционирование систем окислительного метаболизма митохондрий важно для нормального развития ионных сигналов при рецептор-зависимой активации клеток АКЭ,

Ранее было показано, что протонироваше Са^-каналов l-типа приводит к снижению их проводимости С Prod^o» е.а. , 1287). Учитывая, что и fûcp и каН-^приводят к закислению цитозоля, можно предположить, что и в данном случае снижений рН сможет привести к уменьшении проводимости Са^+-каналов и ингибированию входа в клетки АКЭ, Реаккуыуляцид в ретикулум также мотет иметь зависимость от pHj, т.к. в ряде клеток в инозитолтрифосфл-чувствительнцх депо обнаружены са2+/'.(|" -обмвнник и Н+-АТ&аэа, создающая градиент Н+ на мембране эндоплазматического ретикулума для транспорта ионое Са^4" внутрь депо ( ¡ichulz е.п. , 1969). При этом нужно учитывать, что Fooi- может действовать как протонсфор не только на митохондрии, но и на ретикулум.

5. Зависимость Са2+- и pli -ответов клеток АКЭ от уровня концентрации циклических нуклеотидов.

Повышение концентрации внутриклеточной разливдыми путями - активацией аденилатциклаэи (форсколин), ингибирова-ниеы фосфодиэстеразы цШВ (тзофиллин) или добавлением проникавшего аналога цААй (дибутирил приводило к подавлению обеих фаз Са2+-сигнала при действии малых (0,5-5 мкМ) доз ATsii. При воздействии же больших концентраций А.Ъ2 (50-100 мкШ повышение концентрации цАМЬ ингибировало только процесс входа ионов Са*^ в клетки. При атом рН -ответ подавлялся во всем исследованном диапазоне концентраций AT Si. Ингибированке мобилизации иоиов Саг+ из ретикулума при действии малых концентраций А.М позволяет предположить, что сто может быть связано с фэс^рилированием цАМФ-зависимоЙ протеинкиназой А либо рецептора, либо g белка, либо фефэлипазы С, что, по-видимому, приводит к уменьшению образования иноэитолтрифосфата. Не исключено такяа снижение за счет фосфорияирования сродства рецептора к иноаитолтрифосфату в ретикулуме, что может привести к такому же эффекту. Подавление входа ионов Са2+ в клетки коррелирует с подавлением рН -ответа и в данном случае, при этом вход Семожет быть восстановлен добавлением моненсина. Таким образом, мокно предположить, что подавление входа Са2+ и ияманения рНд обусловлено цАМФ-зависимнм фосфорилированием ' Ыа+/и1-обменника. Б отличие от цАМФ повышение внутриклеточ-

ной концентрации цГЛФ о помощью нигропруссидд не влияла на вызываемый ATii рост püi и параметры Са^+-сигнала.

6. йнгибиторний анализ роли протеинкиназы С в формировании Са**+- и рН -ответов клетки АКЭ при активации их АТв.

Активатор протеинкиназы С форболовый эйир TÍA (12-0-тетрадеканоил форбол-13-ацэтат) в концентрации 50 кг/мл полностью устранял Саи рН -ответа клеток при низких концентрациях AT® (рис.2), добавление блокатора протеинкиназы С h? до Т£А устраняло ингибируящее действие форболового э^ира. Следовательно, его ингнбируюций зф|ект действительно обусловлен активацией протеинкиназы С. Использование более низких концентраций 1ФА (20 мг/мл) приводило к подавлении только процесса входа ионов Са^" в клетки и рН-ответа, на затрагивая мобилизаций Са2+ из ретикулуыа. Т.о., протеинки-наза С, по-видимому, осуществляет отрицательную обратную связь в трансмембранной передаче сигнала в клетках АКЭ и имеет мишени $ос£орилироаания ¡ra начальном (до фосфолипаэа С) участке. Ингибированив с помоцыо TîA в более низких концентрациях входа ионов Са®+ в клетки и изменений свидетельствует о том, что протеннкиназа С имеет милени действия и на уровне систем регуляции этих процессов.

При высоких концентрациях АТЗ> форболовый Oitwp никак не влиял на развитие Са - и рН-ответов клетск, что отличается от действия повышения концентрации цАЬ®.

Ингибитор протеинкииазы С Н7 подавлял рН -ответ лишь на 20/о, т.о., в отличие от классической схемы активация í¡a+/H+ обмена в клетках АКЭ не определяется полностьо этим ферментом. Можно предположить, что активация иа^/Н* -обмэнника происходит вследствие активации тирозиновой протеинкиназы, о возможности участия которой в этом процессе свидетельствуют данные, полученные на таких клетках, как тимоциты мыши ( m-rnta е.a., 1984) и Т-Л1.М+ 5ЦИТН человека ( Mire е.а., 1966).

Обнаруженная различная чувствительность иошмх сигналов, генерируемые при действии малых и больших концентраций AES, дает возможность предположить либо наличие дополнительного механизма передачи сигнала о рецептора при высоких дозах АТФ,

л. "л «л

еа)

ш кос

V/

I

L

Urrs

Рис.2. Влияние форболового эфира ИЛ (50 мг/мл) на изменение концентрации Са^+ в цитоэоле (А) и (Б) при действии ЛТЬ в концентрациях 5 и 50 мкМ (1). В экспериментах, представленных кривыми 2, клетки предварительно инкубировали с ингибитором протеинкиназы С 117 (50 мкМ).

либо существование различных популяций рецепторов и АИ> - с низким и высокие сродством к агониоту. При этом последняя не регулируется протеинкинаэами А и С. Подобный вывод о существовании двух типов пуринорецепторов был сделан при исследовании клеток линии HL60 ( Dubyak е.а., 1988). доказано существование двух типов пуринорецепторов ( Угг и Pgu ) у макрофагов ( Aloneo-Torre,Trautmann , 1993).

Проведенные нами предварительные исследования показали, что стауроспорш, ингибирущий в отличие от Н7 не только прстеинкиназу С, но и тироэиновую киназу, приводил к подавлению и pH-ответов клеток АКЭ даже при действии больших концентраций АТ£. Т.о., можно предположить, что активация тирозинкиназы необходима для стимуляции фосфолипазы С и обмена фосфоинозитидов. Необходимость фосфорилирования тиро-

зина цитоплазматического С-конца рецептора к епидерыальнсму фактору роста для активации фосфолипазы С действительно была доказана ( Veg-a е.а. , 1992).

Выше уже обсухдалсл вопрос о том, что у данного типа клеток рецептор-зависимая активация Ma+/H'to6MeHa не определяется полностью протеинкиназой С и что, возможно, в этом процессе участвует гироэинкиназа. Это предложение подтверждается данными о том, что стауроспорин подавляет рН-отвег даже при действии больших концентраций ATO.

7. Роль арахидоновой кислоты и ее продуктов в формировании и рН-ответов клеток АКЭ.

Во многих рецептор-зависимых процессах, сопровождающихся увеличением , наблюдается стимуляция освобождения ара-

хидсновой кислоты (АК) и образование продуктов ее окисления. Имеется много данных о влиянии этих продуктов на другие системы вторичных посредников, транспорт различных ионов (Кру-тецкая, Лебедев, IS93).

Нами показано, что добавление к суспензии клеток АКЭ свободной А А (5 mk.i1) приводит к мобилизации ионов из тех же пулов, что и при действии AM. Обнаруженное при этом ингибирование входа ионов Са2+ и реаккумуляцки их в рэтикулум восстанавливается при действии моненсина, что свидетельствует о подавляющем действии экзогенной АК на активность Иа+/н+ -обменника.

11ри исследовании действия ингибитора фосфолипаэы Ag бромфенацилбромида (БФБ) и ингибиторов липоксигеназы - нордм-гидрогуаретиковоГ» кислоты (ВД'К) и I5-HETE показало, что в клетках АКЭ они не влияют на рецептор-зависимую мобилизацию

из внутриклеточных структур, но блокируют вход в клетки и накопление его в ретикулуме (рис.3). В то же время индометацин - ингибитор циклооксигеназного пути окисления A line оказывал никакого действия на Са*^"-сигнал. Т.о., какой-то продукт липоксигеназного пути окисления АК включен в передачу.сигнала от АТФ-рецептора в этих клетках. По-видимому, в клетках Ai© взаимодействие АТЗ-рецептора с ATO прелдэ всего приводит к активации фосфолипазы С и инозитолтрифосфат-эависи-мой мобилизации Cat+, Увеличение

может приводить К

Рис.3. Влияние б мк!.1 бромфенацилбромида и 10 мкМ нордигидрогуаретико-вой кислота на изменение концентрации Саг+ в цито-золе (А),во внутриклеточных депо (Б) и рН цитозо-ля (В) при действии АТй (2 мкМ) на клетки асцит-ной карциномы Эрлиха.

I - контроль, 2 - на фоне действия бромфенацилбро-■ мида или нордигидрогуаре-тиковой кислоты.

стимуляции фосфолипази Ag и липоксигеназы, которые являются Са2+-зависимыми ферментами (Крутецкая, Лебедев, 1993). Это, в свою очередь, будет способствовать освобождению АК и образованию ее продуктов, которые, по-видимому, и стимулируют вход ионов в клетки.

Хотя Б® и НДГК вызывают заметное закисление цитозоля, это не влияет на повышение рН i при активации АТФ-рецепторов (рис.Зв). Следовательно, метаболиты АК не участвуют в регуляции и не препятствуют рецептор-зависимой активации 1)а /Н -обмена. В то жа время повышение рН^, происходящее при дейст--рии AW, может дополнительно стимулировать ферменты, участвующие В обмене АК ( Shibafca е.е. , 1988; Wang е.а. , 1938; Hezavta е.а. , I99L).

Таким образом, мобилизация стимуляция Ла+/И+ -

обмена и образование продуктов липоксигеназного пути окисления Ali могут стоять в одюй цепи событий, приводящих к усиле-

р.

нию входа ионов Са в клетки.

* к *

Е целом, на основании проведенных исследований можно выделить целый ряд важных и необходимых условий, имеющих значение для регуляции входа ионов Са^1" в клетки АКЭ: опустошенна внутриклеточных депо - эндоплазматического ретикулума, активация г;а+/и+ -обмена, уровень концентрации цАМФ, уровень активности протекнкиназы С, уровень энергкзации клетки, температура окружающей среды, образованна какого-то продукта липо-ксигеназного пути окисления АК. Полученные данные подтверждает высказанное предположение о необходимости жесткой регуляции именно процесса входа ионов Са2+ в клетки,

выводи

1. Изменение концентрации ионов Са'~+ в цитозоле клеток асцитной карциномы Эрлиха при их рецептор-зависимой активации экстраклеточной АМ обусловлено тремя процессами: мобилизацией Са2+ из эндоплазматического ретикулума, выбросом ионов Са2+ из клеток и обратным входом их в клетки с реаккумуляцией в ' ретикулуме.

2. Вход ионов Са'"*" в клетки асцитной карциномы Эрлиха при их активации происходит чере» рецептор-зависимые каналы, которые не ингибирумся кл&ссичэскими блокатораш Са2+-кана-лов( верапамил, Д-600, ионы 1а ) и на проницаемы для ионов аг'г+ , Мп2+. Вход ионов Са2+ и реаккумуляция их в эндоплаз-матическом ретикулуме продолжается длительное время и после освобождения рецептора от АТ55.

3. Рецептор-зависимый вход ионов Са*-1" в клетки асцитной карциномы Эрлиха зависит от активности Ка*/^-обмена и инги-бируется этшшзопропиламилоридом - блокатором этого обменника. В то же врем мобилизация внутриклеточного на зависит от

На+/н+-обмеиа.

4. Индуцируемый экстраклвточиой АИ вход ионов

клетки и рост рЙ цитозоля подавляются при снижении температуры, ингибировании систем энергетического метаболизма и повышении концентрации цАМФ в клетках.

5. Действие факторов, приводящих к активации протеинкина-

эы С или ц/Ш5-эависимой протеинкнназы, на генерация Са2+- и рН-ответов клеток асцитной карцинош Эрлиха зависит от используемой концентрации АТв. Активация указанных протеинкиназ практически полностью подавляет Са2+- и рН-сигналы при применении малых концентрация АТй (0,5-5 мяМ). Цри использовании высоких концентраций ЛТО (50-100 клМ) активация протеинкинаэы С не влияет на параметры обоих ионных сигналов, а активация цАМ£ -зависимой прстеинкиназы кнгибирует рН-сигнал и вход ионов Са^1" в клетки.

6. Введение в наружную среду ингибитора фосфолипазы ¿2 бром{енацилбромида или ингибитора липоксигеказы нордигидро-гуеретиковой кислоты приводит к блокировали» входа, ионов Са2+ в клетки асцитной карциномы Эрлиха., но не оказывает действия на рН-ответ. Таким образом, в регуляции рецептор-зависимого входа, ионов Са2+ в клетки АКЭ, по-видимому, участвует продукт ляпоксигеназного пути окисления арахидоновой кислоты, который не влияет на активность Na+/ii+ -обмена.

7. Проведенные исследования свидетельствуют о том, что регуляция рецептор-зависимого входа ионов Са2+ в клетки асцитной карциномы Эрлиха является многофакторной и значительно более сложной по сравнений с регуляцией процесса их мобилизации из внутриклеточных депо.

СПИСОК РАБОТ, ОДОШКОВАНШХ ДО ТЕМЕ дассшадм

1. Рецептор-зависимая активация фосфоинозитидного пути трансмеыбранной передачи информации генерирует однотипные ионные сигналы в тимоцитах и клетках асцитной карциномы Эрлиха // Геаисы У Советско-швейцарского симпозиума "Биологические мембраны: структура и функций".- Рига, 1988.- С.97 /совместно с В.И.Зинченко, А.С.ГуковскоЯ, О.В.дегтяревой/.

2. Изменение внутреннего рН к Са2+ в клетках асцитной карциномы Эрлиха при действии ATS /внутриклеточная регуляция.-М.: Наука, 1988.- C.I59-X65 /совместно с В.Ц.Зинченко, А.С. Г'уковской, О.В.Дегтярввой, O.S.Лебедевым/.

3. Действие экзогенной AÏS на. концентрацию ионов Са2+ и рй в цигазолв клеток асцитной карциномы Эрлиха // Биологические мембраны в норма и патологии.- Тбилиси: ТГУ, 1989,- С.102-104 /совместно с О,В.Лебедевым, В.П.Зинченко /.

4. О механизмах рецептор-зависимой активации клеток асцитной карциномы Эрлиха экзогенной AW // Тез. конф. "Актуальные вопросы клеточной биологии.- Цитология.- 198У,- Т.31, №9.- С.III /совместно с О.Е.Лебедевым, В,11.3инченко/.

5. Активация транспорта ионов калия при генерации внутриклеточных сигналов АТФ-рецептором опухолевых клеток Эрлиха // Механизмы действия медиаторов и гормонов на о^фекторные клетки.- Суздаль, 1989,- С.69 /совместно с В.Ц.Зинченко,

B.В.Иетрунякой, O.E.Лебедевым/.

6. Взаимосвязь изменений транспорта различных ионов при активации клеток асцитной карциномы Эрлиха экстраклеточной АТ55 // Тез.конф."Доминантные механизмы поведенческих адаптации (клеточный и системный уровни физиологических адаптаций).-Л.: ЛГУ, 1990.- Вып.2.- С.3-4 /совместно с О.Е.Лебедевым/.

7. Генерация ионных сигналов пурпнорецептором асцитных опухолевых клеток Эрлиха // Цитология.- 1990,- Т.32, №3.-

C.930-93I /совместно о В.Ц.Зинченко, O.E.Лебедевым/.

8. Hole of different protein kinases in the Ca2+ and pH-siGnals feneration upon purinoceptor activation of Ehrlich ascites calls // Hearophy9ioloCT.-199^.-V.2,N1.-p.61-65

/Coauthors:Zinchenko '/.P. .Krutetskaya 2.1, ,lebedev O.K./

9. Механизмы регуляции рецептор-зависимого входа ионов

кальция в клетки асцитной карциномы Эрлиха // Физиол.журнал.-1994.- Т.80, »9,- С.144-154 /совместно с О.Е.Лебедевым, З.И. Крутецкой/.