Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы регуляции рецепторно-зависимого входа ионов кальция в клетки асцитной карциномы Эрлиха

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Механизмы регуляции рецепторно-зависимого входа ионов кальция в клетки асцитной карциномы Эрлиха"

^. ^4

г44

г САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ

V.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Т Ю Ш Е В Валентин Евгеньевич

На правах рукописи (

/

МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ РЕЦЕПТОР-ЗАВИСИМОГО ВХОДА ИОНОВ КАЛЬЦИЯ В КЛЕТКИ АСЦИТНОЙ КАРЦИНОМЫ ЭРЛИХА

03.00.02 - биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Сянкт-Пегербург 1995

Работа"выполнена .в лаборатории биофизики клетки физиологического научно-исследовательского института им. А.¿.Ухтомского СПбГУ и на базе Института биофизики клетки РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук 0.Б Лебедев

Научный консультант: доктор биологических наук В.П.Зинченко

Официальные оплоненты:доктор биологических наук Ф.Г.Грибэнвн

доктор медицинсних наук, профессор,

член-корреспондент РАМН В. 0.Самойлов

Ведущая организация! Институт физиологии им. И.П.Пэвлова РАН

Защите состоится " \Ь 11 Акь^Ух 1995 года в 16 чесов на заседании Специализированного Совета Д.063.57.50 по защите диссертаций на соискание учено» степени доктора биологических наук при Саннт-Петербургсаом государственном университете. ( 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, ауд.90 )

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им..А.М.Горького Санат-Пезербургокого государственного университета.

Автореферат разослан " У " (ДД-^-Я 1995 года.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологичеоких наун

В.И.Крутецная

Актуальность проблемы. В настоящее время все большее внимание привлекает изучение молекулярных механизмов запуска и регуляции физиологических процессов в клетках. Активация определенных физиологических процессов в клетках в основном осуществляется благодаря взаимодействию природного стимула (гормоны, факторы роста, медиаторы, митогены и другие факторы) с рецептором на плазматической мембране клеток, в которой находятся функциональные системы, преобразующие внешние сигналы во внутриклеточные. Внутриклеточные сигналы передаются молекулами-посредниками или "вторичными мессендтсерами".

Важную роль в трансмембранной передаче сигнала играют изменения в транспорто и внутриклеточной концентрации ионов и в первую очередь ионов Са2+ ( Rasmussen,j3arret, IS84; Berridpe, Irvine, 1989( Hughes,Putney, 1990; Крутецкая, Лебедев, 1992a), а таете H+, Na+ , IT1", роли которых в последнее время удаляется большое внимание (Веренинов, Марахова, 1986; Grinstein е а 1989).

В последние годы достигнут значительный прогресс в понимании путей активации клеток, в которых роль основного вторичного Посредника выполняют ионы ( Rasmussen.iJarret > 1984; jierridp;e, Irvine, 1989). Изменения в транспорте и внутриклеточной концентрации ионов Са^+ играют ключевую роль в запуске и регуляции o6qnx и специализированных клеточных функций, таких как пролиферация, рост, секреция, сокращение, передача нервного импульса, иммунный ответ и т.д.

Как выяснилось в последнее время, зкстраклеточные адени-новые нуклвотиды могут являться одним из регуляторов функционального состояния различных клеток и тканей ( Gordon, 1986). AM или АДФ, действуя снаружи в микромолярных концентрациях, взаимодействуют со специальными рецепторами клеток - "пурино-рецепторами" ( Burnstock,1978) и могут влиять на многие биологические процессы в различных клетках.

Клетки асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ) имеют на своей поверхности пуринорецепторы Р^-пта., к°*°рыо активируются экзогенной ATS и приводят к стимуляции эффекторной молекулы -фосфолипазы С, которая расщепляет мембранный фосфолилид фосфа-тидилинозитол-4,5-бифосфат на два внутриклеточных мессенджера-водорастворимый инозитол-1,4,5-трифосфат и липидорастворимнй диацилглицерол (Dub.ynk.De Tounp, 1985; Dub.yak, 1986; Wlen«r ".а.

1986). Инозитолтрифосфат мобилизует ионы из эндоплазма-тического ретикулума, увеличивая концентрацию свобо/лых ионов Са^+ в цитозоле, а диацилглицерол, оставаясь в мембране, активирует Са2+-чувствительную, фосфолипидзависимую протеинки-назу С. Обнаружено, что многие другие типы клеток также активируются АТФ по фосфоинозитидному пути, поэтому клетки АКЭ являются удобным объектом для изучения механизмов трансмембранной передачи сигнала от АТй-рецептора.

Поддержание

кальциевого гомеостаза — тонкий, сложный и хорошо отрегулированный процесс, в котором принимают участие многочисленные Са^-транспортирующие системы, расположенные в различных мембранах клетки ( СагаГоИ, 1967). Стимуляция многих рецепторов приводит к двухфазному увеличению внутриклеточной концентрации ионов Са вследствие мобилизации Са2+ из внутриклеточных депо и входа по градиенту концентрации из наружной среды. Учитывая большой градиент концентрации ионов Са^+ между внешней средой и цитозолем и то, что массированный вход Са + в клетки может представлять опасность для их функционирования, можно было предположить, что системы входа ионов должны очень жестко регулироваться.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в дальнейшем изучении механизмов фррмирования кальциевого сигнала при активации клеток АКЭ зкстраклеточной АТФ и путей регуляции рецептор-зависимого входа в эти клетки. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Рассмотреть роль различных Са^+-транспортирующих систем клетки в формировании кальциевого сигнала.

2. Определить возможную взаимосвязь изменений транспорта кальция и других ионов <Н+, , при рецептор-зависимой активации клеток.

3. Исследовать зависимость кальциевого сигнала от температуры и активности систем окислительного метаболизма.

4. Определить зависимость кальциевого сигнала от уровня содержания циклических нуклаотидов и активности протеинкииаэы С.

5. Изучить роль арахидоновой кислоты и ее продуктов в регуляции механизмов формирования кальциевого сигнала.

Научная новизна. Впервые показано, что в формировании

кальциевого сигнала при рецептор-зависимой активации клеток, кроме процессов мобилизации ионов Са'*+ из внутриклеточных депо и входа их снаружи, участвует механизм активного выброса Са^+ во внеклеточное пространство с помощью АИазы плазматической мембраны, что является причиной быстрого снижения в первые минуты после активации клеток.

Доказана взаимосвязь входа ионов в клетки и активности Па+/н+-обмена клеток АКЭ при их рецептор-зависимой активации.

Показана сложная множественная регуляция рецептор-зависимого входа ионов в клетки А1О, состоящая в зависимости этого процесса от температура, энергетического метаболизма клетки, концентрации ц&МЗ, активности протеинкиназы С, а также продуктов липоксигеназного пути окисления арахидоновой кислоты.

Научно-практическое значение работы. Полученные результаты расширяют представления о механизмах форшрования кальциевого сигнала в мотках при их рецептор-зависимой активации, о взаимосвязи в этом процессе транспорта различных ионов и могут быть использованы в исследованиях механизмов управления различными функциональными процессами, в которых роль основного вторичного посредника выполняют ионы Использованное сочетание методов изучения ионтранспоргных систем может быть применено для выяснения механизмов действия и побочных эффектов различных фармакологических препаратов.

Апробация работы. Результаты диссзртационной работы были доложены на 5 Советско-швейцарском симпозиуме "Биологические мембраны: структура и функции" (Рига, 1988), на Всесоюзной конференции "Механизмы действия медиаторов и гормонов на эф-фекторные клетки" (Суздаль, Х989), на Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы клеточной биологии" (Ленинград, 1969), на конференции СИМ им.А.А.Ухтомского "доминантные механизмы поведенческих адаптация" (Ленинград, 1990), на Всесоюзном совещании "Ионный транспорт и регуляция функций клеток" (Ленинград, 1990), на Всесоюзном совещании "Внутриклеточная сигнализация" (Москва, 1991), на Международной шкоде "Механизмы гомеостаэа в возбудимых клетках" (Киев, 1993).

Структура и объем диссертации, диссертация состоит из

следующих разделов: введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 128 страницах, включая 26 рисунков и библиографию, содержащую 15 отечественных и 240 зарубежных источников.

ШКРИАЛЫ И МЕТОДУ ИССЩОВАНИЯ

Клетки асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ) поддерживали в белых беспородных мышах с помощью внутрибрюшинного введения асцитной жидкости от опухоленесущих животных - доноров. В экспериментах использовали клетки через 7-8 дней после прививки. Уровень концентрации ионов Са в цитозоле измеряли

с помощью флуоресцентного зонда 4>ура-2,РН определяли с использованием зонда веют . Коцентрацию Са^+ во внутриклеточных структурах измеряли по флуоресценции хлортетрациклина (ХТ). Концентрацию Са^+, К+, Н+ в сре^е инкубации определяли с помощью ионселективных электродов, для регистрации указанных параметров клетки помещали в терыостатируемуи ячейку флуориметра в концентрации 1-2 х 10 клеток/мл при постоянном перемешивании.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЩОВШШ И ИХ ОБСУВДгШЕ

I. Характеристика кальциевого сигнала, возникающего в клетках асцитной карциномы Эрлиха при активации их экстраклеточной АХ®.

Активация клеток АКЭ экзогенной АГа происходит благодаря наличию на их мембране пуринорецепторов Р2и -типа, относящихся к семейству рецепторов, передача сигнала с которых идет с участием О -белков и фосфолипазы С (ВчЪуак, 1986; СиЬуак, 1993).

Добавление АТ® к клеткам АКЭ вызывает двухфазный Са*-+-ответ: быстрый пик и промежуточное плато, выше исходного уровня в покое (рис.1а). Измерение содержания во внутриклеточных структурах по флуоресценции ХТ (рис.16) показало, что АТ$ приводит к быстрому уменьшению интенсивности флуоресценции, отражающему освобождение ионов из внутренних источников, т.о., первый всплеск ¡Са^З^ происходит за счет мобилизации этих ионов из внутриклеточных структур. Вторая медленная фаза Саг+~сигнала, очевидно, связана со стимуляцией входа

Рис Л. Изменения концентрации кальция в цитозоле, [Са^ , измеренной по флуоресценции Фура-2 (А), содержания Са?+ во внутриклеточных структурах, измеренного по флуоресценции хлортетрациклина (Б), выход ионов Са2+ из клеток асцитной карциномы Эрлиха, зарегистрированный по изменению концентрации Са2+ в среде инкубации (fCa?,+)o) с помощью Са^+-селективного электрода (В),и изменения piij, измеренные по флуоресценции Й(ЗЕСК (¡') При действии 2 мкМ A Ti.

снаружи, т.к. она отсутствует при инкубации клеток в бескальциевой среде. Активация входа ионов из среды инкубации в клетку и возвращения во внутриклеточные депо продолжается в течение 10 и более минут в зависимости от концентрации добавленной АТ<31.

В чем причина быстрого понижения [Са^ в первые минуты после воздействия АМ? Скорость обратного заполнения внутриклеточных депо кальцием, судя по восстановлению флуоресценции ХТ (рис.16), оказалась слишком медленной, чтобы объяснить фазу быстрого понижения . их реаккумуляцией, Измерения концентрации Са^+ во внешней среде с помощью Са^+-селективно-го электрода показали, что через 2г-3 с после начала мобилизации происходит выброс ионов

иэ клеток, что и обеспечивает быстрое понижение ГСа2^ (рисДв).

Рецептор-зависимый вход в клетки АКЭ обеспечирнет

]

развитие фгзы стационарного длительного повышения и

заполнение кальцием внутриклеточных пулов.

Проведены исследования некоторых характеристик каналов, через которые Са2+ поступает в клетки. Показано, что вход ионов не подавляется такими известными блокаторами каналов, как верап&мил, А-600, ионами , Обнаружено, что Са^+-каналы в этих клетках блокируются ионами . Деполяризация мембран клетки при увеличении концентрации К+ в среде не вызывала входа в клетки и не влияла на развитие АТ®-индуцированного Са^-сигнала. Показано, что рецептор-зависимый вход Са£( в клетки АКЗ происходит через Са -каналы, которые не проницаемы для ионов Нп' + или зг^1" .

2. Зависимость изменений при рецептор-зависимой

активации клеток АКЭ от активности ь'а+/к+-обмена.

При стимуляции АТй-рецепторов клеток АКЭ экзогенной АТС происходят и заметные изменения р%, которые можно рассматривать в качестве еще одного важного ионного сигнала в процессе активации клеток. В связи с этим была исследована возможная взаимосвязь между изменениями [Са^+1^ и рг^. При добавлении АТФ к суспензии клеток АКЭ происходит увеличение интенсивности флуоресценции красителя вопор , что свидетельствует о за- • щелачивании цитозоля (рисДг). Изменения начинаются на 30-40 с позже начала развития Са^+-сигнала и развиваются более медленно. Эти изменения рН^ отсутствуют в безнатриевой среде и устраняются этилизопропиламилоридом (ЭШ1А) - ингибитором 1<п+/Н+-обмена. При этом обнаружено, что ингибирование !1а+/н+ -обмена приводит к устранению второй фазы Са^+-сигнала, связанном с входом ионов Са^+ в метки, и подавлению возвращения его в ретикулум. Оба эти процесса - вход ионов СеР'+ в клетки и реаккумуляция их в ретикулуме - восстанавливаются при добавлений моненсина - искусственного на+/н+ -ионофора. В бескальциевой среде, в которой отсутствует вход ионов Са^+ в клетки, рН-рОтеет сохраняется. Таким образом, существует односторонняя зависимость рецептор-гвктивируемого входа в клетки АКЭ от на+/н*" -обменника.

3. Влияние температуры на изменения рН . и в клетках асцитной карциномы Ьрлиха.

Учитывая, что в процессе эксперимента окрашенные Фура-2 и Liji'ji клетки хранили в холодильнике при +4°С перед помещением в термостатируемую ячейку с +37°С, нами исследован процесс адаптации клеток к сменз температуры. Сравнение и рН -ответов в клетках, инкубированных разное время при +37°С, свидетельствует о том, что для развития рН -ответа и полноценного Са^+-сигнала необходим предварительный 8-10 минутный период инкубации клеток при температуре 37°С. Если АТФ добавляли раньше этого срока, то не наблюдали повышения рН^ а в Са^+-сигнале отсутствовала вторая медленная фаза, связанная с входом ионов из внеклеточной среды. Такая зависимость от температуры рН - и Са2+-стветов на АТ5, по-видимому, объясняется температурной чувствительность» механизмов, генерирующих эти ионные сигналы. В ¿данных экспериментах также подтверждается взаимосвязь процессов входа ионов Са^+и активации Ка+/й+ -обмена.

4. Зависимость и ph -ответов клетки АКЭ от активности систем окислительного метаболизма.

Исследовано влияние различных ингибиторов дыхательной цепи митохондрий на развитие и ph -ответов при актива-

ции клеток АКЭ. Подавление энергетического обмена митохондрий за счет разобщения окислительного фосфорилирования ( гг.ср ), ингибирования переноса электронов в дыхательной цепи ( iJaii^) или ингибирования дыхательной цепи и одновременного подавления Н+-АТФсинтетазы (ротенон-олигомиции) во всех случаях полностью ингибировало вход в клетки и возвращение их во внутриклеточные депо. Одновременно с входом

Са2+ в клетки подавлялся и рН -ответ. Механизм действия ингибиторов дыхательной цепи митохондрий на процессы рецептор-зависимого транспорта и Н+ остается неясным. Кратковременность воздействия ингибиторов вряд ли могла привести к заметному снижению концентрации ATS за этот период, поэтому можно сказать только то, что нормальное функционирование систем окислительного метаболизма митохондрий ватшо для нормального развития ионных сигналов при рецептор-зависимой активации клеток АКЭ.

Ранее было показано, uto протонирование Са^-каяалов l-типа приводит к снижении их проводимости ( Prod • h о г:, е.а. , 1287). Учитывая, что и F сор и Каи^ приводят к закислению цитозоля, можно предположить, что и в данном случае снижение рН i может привести к уменьшению проводимости Са^+-каналов и ингибировонию входа в клетки АКЭ. Реаккумуляция в ретикулум также может иметь зависимость от phj, т.к. в ряде клеток в инозитолтрифосфат-чувствительных депо обнаружены üa2V'.lf -об1генник и ¡1+-А.Т4аза, создающая градиент Н+ на мембране вндоплазматического ретикулуыа для транспорта ионов Са2+ внутрь депо ( üohuiz е. а. , 198^). йри этом нужно учитывать, что F oui-- может действовать как протонофор не только на митохондрии, но и на ретикулум.

5, Зависимость и pli -ответов клеток АКЭ от уровня

концентрации циклических нуклеотидов.

Повышение концентрации внутриклеточной цДМФ различными путями - активацией аденилатциклазы (форсколин), ингибирова-нием фосфомэстеразы цЫй (тзофиллин) или добавлением проникавшего аналога цАйЬ (дибутирил цА^й) приводило к подавлению обеих фаз Са^+-сигнала при действии малых (0,5-5 мкМ) доз АТФ. Ври воздействии же больших концентраций AT£ (50-100 мкМ) повышение концентрации цАШ ингибировало только процесс входа ионов Са^+ в клетки. Йри этом рН -ответ подавлялся во всем исследованном диапазоне концентраций. ATS. Ингибировянке мобилизации ионов Са2+ иа ретикулума при действии малых концентраций АТЛ позволяет предположить, что сто может быть связано с фосфорилироваяиеы цАМФ-зависимой протеинкиназой А либо рецептора, либо G белка, либо фосфолипазы С, что, по-видимому, приводит к уменьшению образования инозитолтрифосфага. he исключено такке снижение за счет фосфорилирования сродства рецептора к иноаитолтрифосфату в ретикулуме, что может привести к такому же аффекту. Подавление входа ионов Са2+ в клетки коррелирует с подавлением рН -ответа и в данном случае, при этом

вход Са^1" может быть восстановлен добавлением моненсина. Тар.

ким образом, можно предположить, ото подавление входа Са и изменения рН^ обусловлено цАМ4-зависимнм фосфорилированием ' Ыа+/11<-об1,1енника. Б отличие от цАМФ повышение вчутриклет^ч-

ной концентрации цГИй с помощью нитропруссида не влияло на вызываемый АТ'5 рост pHi и параметры Са^-сигнала.

б. Ингибиторный анализ роли протеинкиназы С в формировании и рН -ответов клетки АКЭ при активации их ATîi,

Активатор протеинкиназы С форболовый эАнр ТЙ (12-0-тетрадеканоил форбол-13-ацетат) в концентрации 50 иг/ил полностью устранял Caf>- и рН -ответы клеток при низких концентрациях А'Гзг (рис.2). добавление блокатора протеинкиназы С Н? до Т&А. устраняло ингибирующее действие форболового эфира. Следовательно, его ингибируюций эффект действительно обусловлен активацией протеинкиназы С. Использование более низких концентраций ТФА (20 мг/мл! приводило к подавлении только процесса входа ионов в клетки и рН-ответа, не затрагивая мобилизацию из ретикулума. Т.о., протеинки-наза С, по-видимому, осуществляет отрицательную обратную связь в трансмембранной пере,чаче сигнала в клетках АКЭ и имеет мишени фосфорилирования на начальном (до фосфолипазы С) участке. Ингибированиэ с помощью ïfiA в более низких концентрациях входа ионов в клетки и изменений pHt свидетельствует о тон, что протемнкиназа С имеет мишени действия и на уровне систем регуляции этих процессов.

При высоких концентрациях АТФ форболовый эсЬгр никак не влиял на развитие Са и рН-ответов клеток, что отличается от действия повышения концентрации цАЬЙ.

Ингибитор протеинкиназы С Н7 подавлял рН -ответ лишь на 20S, т.о., а отличие от классической схемы акч'ивация №+/Н+ обмена в клетках АКЭ не определяется полностью этим ферментом. Можно предположить, что активация На^/Н4" -обмонника происходит вследствие активации тирозиновой протеинкиназы, о возможности участия которой в этом процессе свидетельствуют данные, полученные на таких клетках, как тимоциты мыши ( m-rata е.а., 1984) и Т-лим^зциты человека ( Mira е.а., 1966).

Обнаруженная различная чувствительность ионных сигналов, генерируемых при действии малых и больших концентраций АТ5, дает возможность предположить либо наличие дополнительного механизма передачи сигнала с рецептора при высоких дозах АТ4,

ССм"\*П tcí

fe»

ш но

V г

I лтгг

Рис.2. Влияние форболового эфира ТОЛ (50 мг/мл) на изменение концентрации Са^+ в цитоэоле (А) и рЙ1 (В) при действии АТй в концентрациях б и ЬО мкМ (I). В экспериментах, представленных кривыми 2, клетки предварительно инкубировали с ингибитором протеинкиназы С 117 (50 мкМ).

'т

ГТ4

либо существование различных популяций рецепторов к ATO - с низким и высоким сродством к агонисту. При этом последняя не регулируется протеиикиназами А и С. Подобный вывод о существовании двух типов пуринорецепторов был сделан при исследовании клеток линии HL60 ( Dubyak е.а., 1988). доказано существование двух типов пуринорецепторов ( i'2z и P2u ) у макрофагов ( Alonso-Torre,Trautfflann , 1993).

Проведенные нами предварительные исследования показали, что стауроспорин, ингибирующий в отличие от Н7 не только протеинкиназу С, но и тирозиновую киназу, приводил к подавлению и рЯ-ответов клеток АКЗ даже при действии больших концентраций АМ. Т.о., можно предположить, что активация тирозинкиназы необходима для стимуляции фосфолипазы С и обмена фосфоинозитидов. Необходимость фосфорилирования тиро-

- U -

зииа цитоплазматического С-конца рецептора к эпидерыальнсму фактору роста для активации фосфолипазы С действительно была доказана ( Veeu е.а. , I9S2).

Выше уже обсуждался вопрос о том, что у данного типа клеток рецептор-зависимая активация ма+/11+-обыена не определяется полностью протеинкиназсй С и что, возможно, в этом процессе участвует тироэинкинаэа. Это предположение подтверждается данными о том, что стауроспорин подавляет ph-ответ даже при действии больших концентраций ATO.

7. Роль арахидоновой кислоты и ее продуктов в формировании и рН-ответов клеток АКЭ.

Во многих рецептор-зависимых процессах, сопровождающихся увеличением ГСаИ , наблюдается стимуляция освобождения арахидоновой кислоты (АЯ) и образование продуктов ее окисления. Имеется много данных о влиянии этих продуктов на другие системы вторичных посредников, транспорт различных ионов (Кру-тецкая, Лебедев, 1S93).

Нами показано, что добавление к суспензии клеток At© свободной АК (5 мкМ) приводит к мобилизации ионов из тех же пулов, что и при действии AW. Обнаруженное при этом ингибирование вчода ионов и реаккумуляции их в ратикулум восстанавливается при действии моненсина, что свидетельствует о подавляющем действии экзогенной АК на активность Ка+/н+ -обменника.

При исследовании действия ингибитора фосфолипазы Ag бромфенацилбромида (БЙ>) и ингибиторов лилоксигеназы - норди-гидрогуар&тиковой кислоты (ЦЩ'К) и 15-НЕТБ показало, что в клетках At© они не влияет на рецептор-зависимую мобилизацию

из внутриклеточных структур, но блокируют вход в клетки и накопление его в ретикулума (рис.3). В то же время индометацин - ингибитор циклооксигеназного пути окисления АК-не оказывал никакого действия на Са^-сигнал. Т.о., какой-то продукт липоксигеназного пути окисления АК включен в передачу .сигнала от АП-рецептора в этих клетках. По-видимому, в клетках АКЭ взаимодействие ATS-рецептора с ATO преждо всего приводит к активации фосфолипазы С и инозитолтрифосфат-эависи-мой мобилизации Увеличение может приводить К

Рис.3. Влияние 6 мкМ бромфенацилбромида и 10 мкМ нордагидрогуаретико-вой кислоты на изменение концентрации Са2+ в цито-золе (А),во внутриклеточных депо (Б) и рН цитояо-ля (Б) при действии АТй (2 мкМ) на клетки асцит-ной карциномы Эрлиха.

I - контроль, 2 - на фоне действия бромфенацилбромида или нордигидрогуаро-тиковой кислоты.

стимуляции фосфолипазы и липоксигеназы, которые являются Са2+ -зависимыми ферментами (Крутецкая, Лебедев, 1993). Это, в свою очередь, будет способствовать освобождению АК и образованию ее продуктов, которые, по-видимому, и стимулируют вход ионов Са^+ в клетки.

Хотя Б$Б и НД'К вызывают заметное закисление цитозоля, это не влияет на повышение рН 1 при активации АТй-рецепторов (рис.Зв). Следовательно, метаболиты АК не участвуют в регуляции и не препятствуют рецептор-зависимой активации Иа /н -обмена. В то же время повышение рН^, происходящее при дейст-• вии АТФ, может дополнительно стимулировать ферменты, участву-йщиэ В обмене АК ( вМЬаЪа е.а. , 1988; Иапр е.а. , 1988; Иогдаа е.а. , 1991).

Таким образом, мобилизация стимуляция Иа /Н

обмена и образование продуктов липоксигеназного пути окисления АН могут стоять в одной цепи событий, приводящих к усиле-

нию входа ионов Са?'* в клетки.

* „ *

В целом, на основании проведенных исследований можно выделить целый ряд важных и необходимых условий, имеющих значение для регуляции входа ионов Са2+ в клетки АКЭ: опустошение внутриклеточных депо - эндоплазматического ратикулума, активация на+/и+ -обмена, уровень концентрации цАМФ, уровень активности протеинкиназы С, уровень энергизации клетки, температура окружающей среды, образование какого-то продукта липо-ксигеназного пути окисления АН. Полученные данные подтверждают высказанное предположение о необходимости жесткой регуляции именно процесса входа, ионов Са^+ в клетки.

ВЫВОДЫ

1. Изменение концентрации ионов в цитозоле клеток асцитной карциномы Зрлиха при их рецептор-зависимой активации экстраклеточной АТФ обусловлено тремя процессами: мобилизацией Са^+ из эндоплазматического ретинулума, выбросом ионов Са^+ из клеток и обратным входом их в клетки с реаккумуляцией в ретикулуме.

2. Вход ионов Са'-*" в клетки асцитной карциномы Эрлиха при их активации происходит черва рецептор-зависимые каиалы, которые не ингибирувтся классическими блокаторами Са^-кана-лов( верапамил, Д-600, ионы La ) и не проницаемы для ионов sr*"4 , (чп2+ . Вход ионов Ca2t" и реаккумуляция их в эндоплаз-матическом ретикулуме продолжается длительное время и после освобождения рецептора от А2Ф.

3. Рецептор-зависимый вход ионов в клетки асцитной карциномы Эрлиха зависит от активности NaVd* -обмена и инги-бируется этилизопропиламилорядом - ¿локатором этого обменника. В то же время мобилизация внутриклеточного Са2+ не зависит от

На+/н+-обмена.

4. Индуцируемый экстраклеточной AT® вход ионов Са2+ в клетки и рост рН цитозоля подавляются при снижении температуры, ингибировании систем энергетического метаболизма и повышении концентрации цАМФ в клетках.

5. Действие факторов, приводящих к активации протеиккина-

эы С или цДЖ-эависиксй протеинкиназы, на генерацию Са2+- и рН-ответов клеток асцитной карцинома Эрлиха зависит от используемой концентрации ATS. Активация указанных протеинкиназ практически полностью подавляет и рН-сигналы при при-

менении малых концентраций АТй (0,5-6 мкМ). Цри использовании высоких концентраций АТ5 (50-100 мкМ) активация протеинкиназы С ие влияет на параметры обоих ионных сигналов, а активация цАМй-зависимой протеинкиназы ингибирует рН-сигнал и вход ионов Са2+ в клетки.

6. Введение в наружную среду ингибитора фосфолилазы Ag бромфеиацилбромида или ингибитора липоксигеназы нордигидро-гуаретиковой кислоты приводит к блокированию входа ионов Се?'* в клетки асцитной карциномы Эрлиха, но не оказывает действия на ph-ответ. Таким образом, в регуляции рецептор-зависимого входа ионов в клетки АКЭ, по-видимому, участвует продукт липоксигеназного пути окисления арахидоновой кислоты, который не влияет на активность Na+/п+ -обмена.

7. Проведенные исследования свидетельствуют о том, что регуляция рецептор-зависимого входа ионов Са2+ в клетки асцитной карциномы Эрлиха является многофакторной к значительно более сложной по сравнению с регуляцией процесса их мобилизации из внутриклеточных дегю.

СШСОК РШЭТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ дассврадм

1. Рецептор-зависимая активация фосфоиноэитидного пути трансмембранной передачи информации генерирует однотипные ионные сигналы в тимоцитах и клетках асцитной карциномы Эрлиха // Тезисы У Советско-швейцарского симпозиума "Биологические мембраны: структура и функции"— Рига, I98B.- С.97 /совместно о Б.й.Зинченко, А.С.Гуковской, О.Б.дегтяревой/.

2. Ивменение внутреннего рН и Са^+ в клетках асцитной карциномы Эрлиха при действии ATS //Внутриклеточная регуляция.-М.: Наука, 1988,- C.I59-X65 /совместно с В.И.Зинченко, А.С. Чуковской, О.В.Дегтяревой, O.K.Лебедевым/.

3. Действие экзогенной АТ2 на концентрацию ионов и рН ь цитозолэ клеток асцитной карциномы Эрлиха // Биологические мембраны в норме и патологии.» Тбилиси: ТГУ, 1989.- C.I02-104 /совместно с О.Е.Лебедевым, В.П.Зинченко /.

4. О механизмах рецептор-зависимой активации клеток ас-цитной карциномы Эрлиха экзогенной ЛИ // Тез. конф. "Актуальные вопросы клеточной биологии.- Цитология,- 198У.- Т.31, 1г9.- C.IH /совместно с О.Е.Лебедевым, В.И.Зинченко/.

5. Активация транспорта ионов калия при генерации внутриклеточных сигналов АТФ-рецептором опухолевых клеток Эрлиха // Механизмы действия медиаторов и гормонов на эффекторные клетки.- Суздаль, 1989,- С.69 /совместно с В.И.Зинченко,

B.В.Петрунякой, О.Е.Лебедевым/.

6. Взаимосвязь изменений транспорта различных ионов при активации клеток асцитной карциномы Эрлиха экстраклеточной ATO // Тез.конф."Доминантные механизмы поведенческих адаптация (клеточный и системный уровни физиологических адаптации).-Л.: ЛГУ, 1990.- Вып.2,- С.3-4 /совместно с О.Е.Лебедевым/.

7. Генерация ионных сигналов пурмнорецептором асцитных опухолевых клеток Эрлиха // Цитология.- 1990.- Т.32, №3.-

C.930-931 /совместно о В.И.Зинченко, О.В.Лебедевым/.

8. Hole of different protein kinases in the Ca2+ and cH-signals Koneration upon purinoceptor activation of Ghrlich ascites cells // HeurophyaioloBy.-199^.-V.2,N1.-p.61-b5

/Coauthors¡Zinchenko '/.P.,Krutetskaya Z.I.,Lebedev O.K./

9. Механизмы регуляции рецептор-зависимого входа ионов

кальция в клетки асцитной карциномы Эрлиха // Физиол.журнал.-1994,- Т.80, S9.- С Л44-154 /совместно с О.Е.Лебедевым, З.И. Крутецкой/.