Механизмы развития микроэкологических нарушений в кишечнике и новые подходы к их коррекции

Горская, Елена Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизмы развития микроэкологических нарушений в кишечнике и новые подходы к их коррекции
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы развития микроэкологических нарушений в кишечнике и новые подходы к их коррекции"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И-МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МОСКОВСКАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ имени И.М.СЕЧЕНОВА

п\

На лряяях рукописи

- О .,.) •

ГОРСКАЯ Елена Михайловна

УДК 61634 - 008.87 - 036.21

МЕХАНИЗМЫ РАЗВИТИЯ МИКРОЭКОЛОГИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ В КИШЕЧНИКЕ И НОВЫЕ ПОДХОДЫ К ИХ КОРРЕКЦИИ

03.00.07 - микробиология

ДИССЕРТАЦИЯ в форме научного доклада на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва -1994

Работа выполнена в Московском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им.Г.Н.Габричевского Государственного комитета санэпиднадзора РФ и в НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи РАМН

Научные консультанты: профессор, д.м.н. В.М.Бондаренко профессор, д.м.н. Б.А.Шендеров

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор А.С.Быков - доктор биологических наук, профессор И.Б.Куваева доктор медицинских наук, профессор В.М.Мельникова

Ведущая организация - Российская медицинская Академия последипломного образования

Защита состоится " 1995 г. в" " часов

на заседании специализированного совета /Д.074.05.10/ в Московской медицинской Академии им. И.М.Сеченова /г.Москва, Б.Пироговская ул., 2/6/.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской медицинской Академии им: И.М.Сеченова и МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского

Разослана"

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат медицинских наук

А.Ю.Миронов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время желулочно-кишечная жосистема рассматривается как система защиты организма. Нормальная микрофлора, главным образом анаэробные представители шшигешгой микрофлоры, обеспечивают колонизационную резистентность (КР) шщеварительного тракта - устойчивость к колонизации его слизистых нк«т.м.-к услонногтятогетп.ппг таи патогенными бактериями (экзо-ишшш или эцдогешгыми). В обычных условиях поддержание КР микрофлорой осуществляется за счет продукции антибиотических !с1пестп, конкуренции за места адгезии, подавления адгезии гсловнопатогенных бактерий, ингибиции транслокации и ряда тосредованных механизмов.

Различные воздействия на организм хозяина и его микрофлору -огфекционные заболевания, витаминное и белковое голодание, стрессы, »рациональная химиотерапия, поступление с водой, пищей солей тяжелых металлов, пестицидов и других химических соединений приводят с синдрому нарушении микроэкологии пищеварительного факта -шебактериозам. При дисбактериозах меняется количественный и сачественный состав микрофлоры и как следствие этого - состав ^метаболитов, подавляется КР. Это, в свою очередь, может явиться тричиной снижения иммунного статуса, возникновения ауто-днфииирования и других расстройств (Нег^сх 1).]., 1983; Нинепш Б.В. и ф., 1984; Смолянская А.З., 1987; тендеров Б.А., 1990). При этих :остояниях кишечная микрофлора, измененная в составе и локализации, те способна выполнят!, в полном обтлме присущие ей мноючмеленные физиологические функции: антагонистическую, пищеварительную, иммуностимулирующую, витаминообразукмцую, дезшггоксикационную и тр. Кроме того, дисбактериозы кишечника могут становиться возможным источником внутрибольничных инфекций, вызываемых представителями гранзиторной аутомикрофлоры: энтеробактериями, исевдомопада.ми, стафилококками и другими бактериями. Подавляющее число публикаций посвящено детальному описанию количественных и качественных изменений в различных биотопах кишечника при дисбактериозах и незначительное - исследованиям механизмов микроэкологических гарушений и их коррекции. В частности, недостаточно известно, как «меняется адгезивностъ условнонатогенных бактерий - экзогенных и тредставителей аутомикрофлоры, в том числе антибиотикорезистенпшх нтаммов и что в этом процессе играет определяющую роль - факторы

макроорганизма или бактерий. Неясно также, вносят ли вклад в патогене этого синдрома протеолитические свойства микроорганизмов и каков суммарная протеолигическая активность (ИЛ) содержимого толстог отдела кишечника в норме и при микроэкологических нарушениях.

На основе современных представлений о нормальной микрофлор для лечения дисбактериозов кишечника применяются и разрабатываютс препараты из представителей индигенной и транзиторной микрофлоры лактобацилл, бифидобактерий, кишечных палочек, споровых аэробны бактерий; средства, стимулирующие механизмы неспецифической специфической резистентности: лизоцим, иммуноглобулины, ферменты кроме того специфические бактериофаги. Вместе с тем спектр препарате для лечения дисбактериозов крайне недостаточен, так как вариаци микроэкологических нарушений разнообразны, также как фо инфекционных или соматических заболеваний, предшествующий ил сопровождающий их. Особо следует отметить, что даже производственных штаммов эубиотиков слабо изучен механизм и действия, взаимодействие с макроорганизмом, адгезивные и колони зирующие свойства, влияние на фагоцитарную активность. Кроме тог новым подходом к коррекции микроэкологических нарушений мог б] быть подход, направленный на снижение ПА условнонатогенны бактерий, то есть применение ингибитора протеолитических ферментов средств, стимулирующих шщигенную микрофлору.

Общим недостатком эубиотиков из бифидобактерий, лактобащии кишечных палочек и других микробов, а так же комплексны пробиотических препаратов из них является необходимость применять и длительно, до 4-х недель. Стимуляция собственной микрофлоры в это] случае также происходит медленно. Поэтому с учетом патогенетически механизмов формирования дисбактериозов кишечника обоснован разработка совершенно новых способов коррекции микроэкологически нарушений с применением сорбентов и ингибиторов протеолитически ферментов.

Все вышеуказанное, а также увеличение числа больных эндогенным (ауто) инфицированием свидетельствует, что экспери ментальная проверка вышеуказанных положений весьма актуальна.

Цель работа - выяснение механизмов формирован» микроэкологических нарушений в кишечнике при воздействии различнь факторов и обоснование новых подходов к их коррекции.

Задачи исследования;

. Изучить механизм снижения колонизационной резистентности при исбактериозах, вызнанных введением антибиотиков, кратковременного >лодания, кровопотери.

Исследовать в экспертгментах дополнительные эффекты положи-ильного действия эубиотиков из лактобанилл.

Оценить возможность применения некоторых эотепоглрбсхпои «ли эррекции микроэкологичргктг": нарушении в кишечник«

Быксиить механизм лейспзяя и эффективность ингибитора протео-ггических ферментов - пара-(аминометил)бензойной кислоты (Памба) ш лечения экпериментальных и клинических дисбактериозов ■онечника различного происхождения.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

Патогенетические механизмы микроэкологических нарушений в ки-ечнике включают в себя не только традиционное понимание нарушения ионизационной резистентности, но и селекцию штаммов :ловнонатогенных бактерий с повышенной протеолитической актив-зстыо, изменение рецептивных свойств эпителиальных клеток кишеч-лка, способствующее усилению адгезивных свойств услошюпатотенных истерий к слизистой оболочке кишечника.

Эубиотики на основе лактобацилл при их плюральном введении взывают стнмулятшю некоторых факторов неспецифической резис-'нтности, системы мопонуклеарных фагоцитов, модулируют клеточный ■вет. Отдельные штаммы лактобацилл, перспективные для создания эвых эубиотиков, проявляют повышенную адгезивность к мушшу, ибронекггину, эпителиальным клеткам кишечгшка.

Энтеросорбепты эффективно снижают уровень условнопатогенных истерий в кишечнике и частоту их транслокации. Сорбенты обладают □личиями в действии на условнопатогегтую и резидентную кишечную жрофлору.

Ингибитор протеолитических ферментов Памба является новым »рректором микроэкологических нарушений при дисбактериозах пнечника.

Научная новизна. Впервые установлено, что микроэкологические рушения, вызванные различными факторами (введением анти-

биотиков, голоданием, кровонотерей) имеют как общие, так специфические черты в своем проявлении. Общие закономерност заключаются в увеличении количества и спектра условнопатогенны бактерий, снижении числа бифидобактерий, а специфические -увеличении популяции лакгобацилл в толстом отделе кишечник; транслокации бактерий из кишечника в регионарные лимфатически узлы и внутренние органы при дисбактериозе после кровопотери повышении функциональной активности клеток мононуклеарно фагоцитирующей системы при дисбактериозе после голодания.

Выявлены ранее неизвестные механизмы развития микроэколс гических нарушений в кишечнике: селекция условнопатогенных бактери с повышенной ПА, изменение рецеотивности эпителиальных клето кишечника, увеличение адгезивной способности бактерий.

Впервые определена роль протеолитических ферментов условие патогенных бактерий в патогенезе дисбакгериозов кишечника. Н клиническом материале показано, что существует коррелятивная связ между повышенной IIA содержимого толстого отдела кишечника больны с дисбактериозом и высоким уровнем в микрофлоре фекалий тех ж больных бактерий рода Proteus, гемолитических Escherichia col стафилококков, а также ассоциаций стафилококков с клебсиеллаш эшерихиями и другими условнопатогенными микроорганизмами.

Впервые на различных моделях, в том числе с применение: животных - гнотобионтов, экспериментально обоснованы новые подход] к коррекции микроэкологических нарушений в кишечнике. Одним из ни является использование штаммов эубиотиков на основе лактобацши способных стимулировать неспецифическую резистентность, в том числ функциональную активность макрофагов, и обладающих выраженно адгезивной способностью. Установлено, что последняя может бьп обусловлена активным специфическим связыванием лакгобацилл муцином, фибронекгином (ФН) и (или) лектинами. Показано, что разнк вицы и штаммы лакгобацилл обладают достаточно высоким уровне прикрепления к иммобилизированному фибронектину и конканавалину . и низким уровнем адгезии к муцину. В результате того, что ФН являете рецептором не только для грамотрицательных бактерий, но лакгобацилл, создается возможность конкурентных отношений межл ними за рецепторные места на эпителии.

Выявлены межвидовые и межштаммовые различия в адгези лакгобацилл к энтероцитам и колоноцитам и связывание их с Ф1 конканавалином А (Кон А) и муцином, что необходимо учитывать пр отборе штаммов для создания новых препаратов пробиотиков.

Установлено развитие клеточного ответа пол действием лактобапилл о латшм реакции гиперчувствителыгости замедленного типа (РГЗТ). первые выявлено усиление фагоцитарной активности макрофагов при ероралыгом введении лактобапилл в эксперименте. Под действием актобацилл ускоряется дифферешхировка и миграция энтероцитов в истеме крита-ворсинка, что способствует более быстрой элиминации атогенных и условнопатогенных бактерий, попадающих в кишечный эакт.

ТТсказгпо, 'но iiciKioaiibH'H? ряе.четгае эптеросорбштов «'акчи-¡тровашгого уыеродною волокшгетого материала, гидрогеля полиметил-ялоксана, полифепана и энтероката) оказывает коррегируюшее влияние а популяционный уровень энтеробактерий и кокковой микрофлоры в эзличных биотопах кишечника, в несколько раз снижает транслокацию истерий из пищеварительного тракта в лимфоидную ткань, внутренние рганы, кровь. Выявлены определенные различия в действии сорбентов а условнопатогенную и индигенную кишечную микрофлору.

Впервые продемонстрирована роль ингибитора протеолитических ерментов - Памба как средства для коррекции микроэкологических арушений в кишечнике. Применение ингибитора при экегге-иментальном ампиоксовом лисбактериозе способствовало снижению ыражешгости дисбиотических изменений. Фагоцитарная активность акрофагов при этом и активность катенсина Д в них повышалась.

Впервые выявлена ростстимулирующая активность 11амба в шошении бифидобактерий, лактобапилл, кишечных палочек как in vitro, iK и in vivo и подавление этим препаратом протеолитической активности эктерий родов Proteus и Pseudomonas.

В результате проведенной работы сформулирована концепция о л ж н ости применения патогенетически обосновашгых принципиально овых средств коррекции микроэкологических нарушений в кишечнике.

Практическая ценность работы н внедрение результатов в практику.

о лученные данные но комплексному изучению механизма действия жтобацилл - компонентой пробиогиков позволят конструировать бак-зепараты с задагашми свойствами - высокой адгезивной активностью к феделенным типам эпителиальных клеток, муцину, способностью к илению фагоцитарной функции макрофагов, стимулягщи клеточного ■вета.

Получен патент № 2000784 от 15.10.1993 г. на изобретен« "Средство для лечения дисбактериоза кишечника". Применени ингибитора нротеолитических ферментов Памба в детских инфекцион ных клиниках дало положительный эффект и способствовало коррекцш дисбиотических изменений: снижению числа условнопатогашы бактерий, увеличению содержания бифидобактерий, лактобацилл ] кишечных палочек. Получены положительные заключения о клинически испытаниях Памба в детских инфекциошгых болышцах № 5 и № 1 I Москвы (акты о внедрении от 14.05.90 г. и 25.05.92 г.). Подана заявка н; патент "Применение Памба в качестве стимулятора рост, бифидобактерий, лактобацилл, кишечных палочек". Приоритетна) справка № 052877 от 25.11.1993 г.

Получен патент на изобретение "Способ получения биомассь бактерий" № 2007450 от 15.02.1994 г. Изобретение может быть исиоль зовано в лабораториях научно-исследовательских институтов и ] медицинской промышлешюсти.

Составлены "Методические рекомендации по определению адгезш бактерий кишечного происхождения к эпителиальным клеткам тонкого I толстого отделов кишечника". Рекомендации внедрены в практику ' лабораторий 6 научно-исследовательских институтов.

Составлено рацпредложение "Способ получения энгероцитов и: бионтатов кишечника".

Отдельные положения диссертации представлены в монографии О.В. Чахава, Е.М. Горской, С.З. Рубана "Микробиологические и иммунологические основы гнотобиологии", М.: Медицина, 1982.

Различные разделы работы введены в курс лекций и практически} занятий кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Московской Медицинской Академии им. И.М. Сеченова, кафедры микробиологии Акмолинского медицинского института (Казахстан) кафедры микробиологии Тартуского Государственного Университете (Эстония).

Апробация работы. Основные результаты проведенных исследований доложены на: Всесоюзном Съезде по паразитоценологии (Киев,1982), 5 ом Всесоюзном симпозиуме по целенаправленному изыскании физиологически активных веществ (Рига, 1983), Международно» симпозиуме "Состояние и перспективы гастро-шггестинально! микроэкологии" (Погодам, 1984), VIII Межинстшугской научно! конференции "Факторы клеточного и гуморального иммунитета щи различных физиологических и патологических состояниях (Челябинск

1986), 1-ой Всесоюзной конференции "Актуальные проблемы нозокомиалышх инфекций и лекарственной устойчивое™ микроорганизмов (Москва, 1986), Всесоюзном семинаре "Колонизацио1шая резистс! гп гость и химиотсряпсиппсскис антибактериальные препараты (Москва, 1988), ХУ111 съезде Всесоюзного общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов им. И. И. Мечшосова (Москва, 1989), Всесоюзном семинаре "Антибиотики и колонизационная резистентность" (Москва, 1990), Мсжыунапплной конференции по медицинской биптрп.плепш, иммунизации и СПИДу (Ленинград, 15*1), VI Всероссийском съезде микробиолохх>в, эпидемиологов и паразитологов (Н.Новгород, 1991), XXII Национальном конгрессе по микробиологии (Акапулько, 1992), XI Международном симпозиуме по шотобиологии (Белло Горизонто, 1993), секции Ученого Совета МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, 1994 (протокол №3).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе применит современные методы: микроэкологический, шотобиологический, морфологический, в том числе с использованием электронной микроскопии, авторадиографический, иммунологический, радиометрический.

В экспериментальных исследованиях использовано 380 крыс, 90 мышей, изучена анаэробная и аэробная микрофлора фекалий у 323 человек; из них у 246 человек определена иротеолитичсская активность содержимого толстого отдела кишечника. Гпотобиологические исследования проведены на 35 крысах - безмикробных и моноассоциированных с лактобациллами. У 61 обычной крысы микрофлора исследована в одном биотопе, у 20 - в двух биотопах, у 139 -в пяти биотопах кишечника, хфи этом исследовалось 7-9 фупи микроорганизмов. Препарат Памба в ограниченных клинических испытаниях применен у 77 детей. Более подробно детали экспериментов приведены в соответствующих разделах.

Статистическая обработка полученных экспериментальных и клинических дашгых проводилась методами вариационной статистики с использованием критериев Стьюдента, Вилкоксона, коэффициента корреляции.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. ИЗМЕНЕНИЕ МИКРОФЛОРЫ ТОЛСТОЙ КИШКИ КРЫС К АДГЕЗИВНОЙ АКТИВНОСТИ БАКТЕРИЙ КИШЕЧНОГС ПРОИСХОЖДЕНИЯ ПРИ ИНТРАГАСТРАЛЬНОМ ВВЕДЕНИИ ЦЕФАЛЕКСИНА И ЭРИТРОМИЦИНА.

Для разработки новых подходов к коррекции микроэкшюшчески> нарушений при дисбактериозах кишечника необходимо знать различные стороны патогенетического развития этих нарушений.

На первом этапе нашей работы мы смоделировали антибиотиков!^ дисбактериоз, чтобы на этом его варианте исследовать механизмы, включающиеся в формирование микроэкологических нарушений i кишечнике.

Крысам линии Fisher ишрагастрально вводили в течение 17 дне? цефалексин и эритромицин (раздельно) в максимальной суточной дозе Количественные и качественные изменения со стороны кишечной микрофлоры зарегистрированы со 2-го дня введения антибиотикот (рис.1). После введения как цефалексина, так и эритромицина снижало« общее количество аспорогетшых анаэробных бактерий, лактобацилл возрастало содержание клостридий с постепенным восстановлением ю еще в периоде обработки антибиотиками. Наиболее характерным былс повышение числа псевдомонад, условнопатогсшшх энтеробактерий расширение их видового состава. Об изменении КР судили пс длительности сохранения в толстой кишке индикаторных штаммог Staphylococcus aureus 209Р cef и S.aureus 209Р eryf. Индикаторные штаммь выделялись на две недели длительнее у животных, получившю антибиотики, что является несомнешшм доказательством снижения КР Причина могла быть в более высоком уровне адгезии стафилококков v других бактерий к эпителиальным клеткам кишечника, для чего былг изучена их прилипающая активность в системе in vitro на энтероцитш интактных крыс и крыс, получивших цефалексин и эритромицин! Отмечено возрастание адгезивности индикаторных цггаммо: стафилококков к изолированным энитслиоцитам крыс, обработан» ы антибиотиками, по сравнению с адгезивной активностью тех же штаммо к энтсроцитам интакпшх животных. Прилипание индикатор! гы резистентных к цефалексину стафилококков было выше к клетка] животных, получавших антибиотики при сочетании с шпрагастральны! введением S. aureus 209Р cef (табл.1.).

лактобациллы кишечные палочки

*ис.1 Динамика изменений количественного удержания некоторых представителей кишечной 1икрофлоры под влиянием цефалексина и эритромицина

11 — иефалексин,2 — эритромицин 3 — контроль;

— одна неделя после отмены антибиотиков?

— восстановительный период)

Таблица 1.

Адгезивная активность стафилококков к энтероцитам крыс in vitro после интрагастрального введения цефалексина.

Время Среднее

Группы Заражение исследования количество

животных (сутки) после микробов иа 1

отмены антибиот. энтсроцит

- 1 17.8 ±0.81

Опыт р< 0.05

5 23.3 ± 1.82

р< 0.05

Контроль - 1 12.7 ± 1.68

5 14.6 ± 1.17

S.aureus 209Р 1 37.0 ± 1.0

Опыт cef р< 0.05

5 67.1 ± 1.8

р< 0.05

Контроль S.aureus 209Р 1 15.9 ± 0.84

cef 5 18.9 ± 0.9

Кроме того, увеличивалась также адгезивная активность клебсиелл и кишечных палочек, выделенных из фекалий опытных животных, к энтероцитам крыс, обработанных цефалексином (Рис.2). Обнаруженный нами факт возрастания прилипающей способности K.oxytoca cef, E.coli cef и S. aureus 209P cef к энтероцитам кишечника in vitro, сочетающейся с количественным увеличением этих микроорганизмов в фекалиях, свидетельствует, что в патогенезе развития микроэкологических нарушений с увеличением числа условнопатогенных бактерий в кишечнике немаловажное значение принадлежит усилению адгезивного процесса, связанного прежде всего с модификацией рецепторов на эпителии. На нашей модели контакт тест-микробов происходил с эпителиальными клетками, подвергавшимися в организме воздействию антибиотиков. Это значит, что "виновником" изменения адгезивной активности бактерий являются только энтероциты, что подтверждается сравнением индекса прилипания тех же тест-штаммов к энтероцитам интакгаых крыс.

Следовательно, один из механизмов увеличения популяционного уровня условнопатогенной микрофлоры в кишечнике при ангибиотиковом дисбактериозе, вызванном введением цефалексина и эритромицина - повышенная адгезивная и колонизирующая способность резистентных к этим антибиотикам бактерий, попадающих как экзогенным путем, так и уже находящихся там и входящих в состав аугомикрофлоры (стафилококки, клебсиеллы, кишечные палочки).

1 2 3

г-"l - контроль ПИ£ШИ'1 - опыт

1 - К. oxvtoca 2-Е. coli 3 - S. aureus 209 P Рис.& Агезивная активность in vitro цефалекоинустойчивых

клебсиелл, кишечных палочек и стафилококков к энтероцитам крыс,получавших цефалексин

2. ОСОБЕННОСТИ ДИСБАКТЕРИОЗА КИШЕЧНИКА, ВЫЗВАННОГО КРАТКОВРЕМЕННЫМ ГОЛОДАНИЕМ.

Эксперименты проведены на 20 обычных аутбредных крыса* Брга^е-ВахЛеу. 10 крыс из этой группы лишали пищи на 3 суток при свободном доступе к воде.

Основные сдвиги в составе кишечной микрофлоры касались анаэробного компонента и характеризовались уменьшением содержания бифидобактерий, лактобацилл и бактероидов. Наиболее выраженное снижение со стороны указанных групп микроорганизмов отмечено в дистальных отделах тонкой кишки (р< 0.001) (табл.2).

Таблица 2.

Некоторые показатели микрофлоры слепой и дистального отдела тонкой кишки крыс после 3-х суточного голодания (в 1% КОЕ/г; М ± т).

Группы Слепая кишка Тонкая юшка

микроорганизмов

Интактные Животные с Интактные Животные 1

животные голоданием животные голоданием

Bactervides sp. 8.2 ± 0.4 8.0 ± 0.5* 6.7 ± 0.3 6.0

Bifidobacterium sp. 7.8 ± 0.5 7.0 + 0.7* 7.3 ± 0.2 5.9 ± 0.4

Lactobacillus sp. 8.5 ± 0.3 7.4 ± 0.9 8.1 ± 0.2 6.1 ± 0.7

Exoli 6.8 ± 1.0 8.2 ± 0.8* 5.5 ± 1.0 6.1 ± 0.9

Enterococcus sp. 6.6 ± 0.5 7.7 ± 0.5* 5.8 ± 1.0 6.1 ± 0.9

Примечание : *- р<0.05.

В слепой кишке снижение уровня данных бактерий выявлено в меньшей степени (р<0.05), в то же время в данном биотопе обнаружено повышенное количество кишечной палочки и энтерококков. После голодания, хотя и происходило снижение КР, но не такое глубокое, как после воздействия эритромицина и цефалексина. Индикаторный штамм Exoli 083 rif колонизировал кишечник на короткий срок, выделяясь в течение 3-4 суток восстановительного периода из содержимого тонкого кишечника, муцина, фекалий.

При исследовании адгезии 5 штаммов лактобацилл, 2 штаммо! патогенных энтеробактерий установлено повышение прилипания t колоноцитам in vitro почти всех штаммов в 1.5-2 раза по сравнению с адгезией к колоноцитам интактных животных. Адгезия к энтероцитал этих же штаммов имела тенденцию к усилению или досговернс возрастала (рис.3).

Индекс адгезии

контроль

__1

с__j — опыт

1-Е. coli No 18

2 — К. pneumoniae

3 - L. fermentum 1-20

_ „ 4 - В. adolescent is MC-42

Рис.5 Изменение адгезии микроорганизмов

колоноцитам конвекцпонаи:

in vitro после голедания

На длительность сохранения микроэкологических нарушений несомненное влияние оказывает функциональная активность мононуклеарной фагоцитирующей системы. При ангибиотиковом дисбакгериозе она, как правило, угнетается (Пинегин Б.В., 1987). В то же время не известно, как меняется эта активность при дисбакгериозе, вызванном кратковременным голоданием. 10 крыс 8ргаяие-Па\у1еу 6 мес. возраста, самок лишали пшци на 4 суток. До голодания бифидо- и лакгофлора регистрировалась у животных на уровне 7.9 ± 0.25 и 7.51 ± 0.45 КОЕ/г соответственно (табл.3).

Таблица 3.

Количественный и качественный состав микрофлоры фекалий крыс при экспериментальном дисбакгериозе кишечника, вызванного голоданием КОЕ/г; М ± ш).

Группы бактерий До голодания После голодания

Общее количество 8.7 ± 0.08 7.3 + 0.08

анаэробов p< 0.001

Lactobacillus sp. 7.5 ± 0.45 5.8 ± 0.2

p< 0.05

Bifidobacterium sp. 7.9 ± 0.25 6.0 ± 0.02

p< 0.001

Общее количество 5.7 + 0.26 6.8 ± 0.35

аэробов p< 0.05

E.coli 4.66+ 0.25 5.43+ 0.33

p> 0.05

Proteus sp. 4.3 ± 0.34 5.0 ± 0.2

p> 0.05

Pseudomonas 3.9 ± 0.2 4.9 ± 0.5

aeruginosa p< 0.05

Enterococcus sp. 5.5 ± 0.35 5.1 ± 0.3

p> 0.05

Staphylococcus sp. 4.9 ± 0.25 4.3 + 0.1

p> 0.05

Candida sp. 3.0 + 0.1 0

Аэробные микроорганизмы, в том числе условнопатогенные, встречались в меньшем количестве. Соотношение между аэробной и анаэробной микрофлорой составило 1:1000, что соответствует эубиозу. После голодания значительно снижалось количество бифидобактерий и лактобацилл (на 2 ^ КОЕ/г). Вместе с тем повышалось количество

транзиторных представителей аэробной микрофлоры - P.aeruginosa на 1 lg КОЕ/г; имел тенденцию к повышению уровень протеев и эшерихий. Не было статистически значимой разницы в количестве стафилококков и лпсрококков до и после голодания. В результате нарастания аэробной микрофлоры и снижения анаэробной соотношение между ними становилось равным 1:1, что свидетельствовало о развитии дисбактериоза.

На фоне полученного варианта дисбактериоза было изучено функциональное состояние макрофагов перитонеального экссудата и селезенки. При дисбактериозе, вызванным ^ггпрсясьны« голоданием, не мяКл?одалоСй изменения сншезя белка как в перитонеальных макрофпгзх, гак и макрофагах селезенки по сравнению с контролем (рис.4). Активность 5'-нуклеотидазы была резко снижена в перитонеальных макрофагах и практически не менялась в макрофагах селезенки. Как известно, снижение активности 5'-нуклеотидазы наблюдается обычно при активации макрофагов. Способность макрофагов к захвату ЭБ 51сг усиливалась после кратковременного голодания как в перитонеальных макрофагах, так и в макрофагах селезенки. Усилетшй захват сочетался с возрастанием бактерицидной активности макрофагов (НСТ-активности) и выраженности лизосомного аппарата в подопытной группе. Из исследуемых лизосомных ферментов наиболее чувствительной к воздействию кратковремешюго голодания была кислая фосфатаза, активность которой снижалась в перитонеальных макрофагах и увеличивалась в макрофагах селезенки. Активность катепсина Д не изменялась в обоих типах макрофагов.

Таким образом, кратковремешгое голодание вызывает микроэкологические нарушения в кишечнике, связанные прежде всего с отсутствием поступления питательных веществ, но эти изменения не носят необратимого характера и даже вызывают усиление функциональной активности перитонеальных макрофагов, что позволяет, по-видимому, противостоять более глубокому снижению КР.

3. МИКРОЭКОЛОГИЧЕСКИЕ НАРУШЕНИЯ В КИШЕЧНИКЕ ПРИ ОСТРОЙ KPOBOITO ГЕРЕ У КРЫС.

Эксперименты поставлены на 79 крысах обоего пола массой 120-220 г (беспородных и аутбредных Sprague-Dawley). На 3 сутки постреанимационного периода после острой кровопотери в содержимом гонкой кишки достоверно снижалось количество лактобацилл и увеличивалось число вейллонелл. Уровень стафилококков и аэрококков Че менялся (табл.4).

i г

го •

го

i г шЬ:

I г

■¿ка

Х\0'

г VI

I- захват ЭБ-5'Сг в имп/мин/мг белка

п- бактерицидная активность (hct) в ед. оптической плотности/мг белка

ш * степень выраженности лизосомного аппарата в ед.ОП/мг белка

ij - активность катепсина д в мкг тирозина/мг белка хю1

i - активность кислой фосфатазы в мкг pl/ МГ БЕЛКА

и - активность 5-нзклеотцдазы в МКГ Pi/мг белка *|0г

i - контроль

г - опыт

Рис. Влияние кратковременного голодания на функциональное

______СОСТПЯиИЕ ftPPl/ITnUFMlhUhlX МАКРПФЬГПР.

1аолица 4.

Количественная и качественная характеристика микрофлоры различных биотопов кишечника крыс Брга^е-Оа\у1еу после острой кровопотери з постреанимационном периоде (в ^ КОЕ/г).

Биотоп Группа животных щ—17; ПП=19 Энтсро-бакгерии Стафилококки Энтерококки Аэрококки Лакто-бакгерии Бифвдо-бактерии Вейллонеллы

Содержимое 1 3.83 ± 0.31 4.32 ± 0.58 3.58 ± 0.37 4.06 ± 0.36 6.56 ±0.17 6.46 ± 1.00 3.73 ± 0.24

тонкой п~6 п=5 п=7 п=7 п=9 п=9 п=7

кишки п 4.45 ± 0.36 4.3Е ± 0.83 4.17 ± 0.67 4.27 ± 0.59 5.66 ±0.26* 5.88 ± 0.04 5.13 ±0.28*

п—6 п=5 п=6 п=11 п=13 п=12 а=10

Стенка 1 2 4.00 ± 0.50 2 3.48 4.56 ± 0.27 .;,47 - 0.97 3.73 ± 0.58

тонкой п=17 п=2 п=17 п=*1 п=6 п=7 п=3

кишки п 5.15 ± 0.70 2 3.58 ± 0.58 3.77 ± 0.51 3.85+0.28" 4 32 ± 0.78 4.88 ± 1.15

п=3 п=17 11=4 п—3 п=8 п=6 п=4

Содержимое 1 5.76 ± 0.30 5.73 - 0.28 5.54 ± 0.16 5.31 ± 0.25 7.50 ± 0.32 К.<»1 ± 0.16 6.31 ± 0.28

толстой п=8 п=9 п=11 п=11 п=11 п=11 п=11

кишки п 8.15 ±0.30* 7.45 ±0.53* 7.19 ±0.60* 7.40 ±0.54» 8.81 ±0.12* 8 í<5 ± 0.14 8.05 ±0.27*

л=14 п=10 п=14 п=14 п=13 п=14 п=13

Стенка 1 3.50 ± 0.50 4.05 ± 0.13 ЗЛО ± 0.08 3.50 ± 0.50 5.26 ± 1.07 5.5D ± 0.91 3.50 ± 0.50

толстой п=2 п=3 п=3 п=2 п=8 п=9 п=2

кишки п 4.73 ±0.29* 5.02 ± 0.93 4.40 ±0.29* 4.58 ± 0.75 4.96 ± 1.33 5.53 ± 1.06 5.00 ±0.83*

п=8 п=4 п=7 п-6 п=8 л=8 п=П

Примечание. 1- интакшая группа животных; П- подопытная группа животных; *- р<0.05 по г критерию; **- р<0.05 по критерию и.

В стенке тонкой кишки, представляющей суммарно пристеночную и мукозную микрофлору, у интакгаых крыс регистрировались стафилококки, аэрококки, лактобациллы, бифидобактерии в меньших количествах, чем в содержимом кишки. У подопытных животных в этом биотопе наиболее заметно возрастало количество энгеробактерий, энтерококков, вейллонелл; количество лакгобацилл имело тенденцию к снижению. В микрофлоре пейеровых бляшек у 7 из 11 крыс контрольной группы обнаружены лактобациллы и у 8 из 11 - бифидобактерии с популяционными уровнями соответственно 4.65±1.0 и 4.65+1.0 ^ КОЕ/г, т.е. примерно в таком же количестве, как и в стенке тонкой кишки вне зоны пейеровых бляшек. С меньшей частотой высевались энтеробактерии, стафилококки, энтерококки. У подопытных животных в этой зоне был достоверно ниже уровень лакгобацилл и бифидобактерий (на 1.5-2 ^ КОЕ/г). Чаще высевались энтерококки, аэрококки обнаруживались в большем количестве, чем в стенке вне пейеровых бляшек.

В содержимом толстой кишки опытных крыс происходит довольно резкое нарастание (на 2-2.5 Ц;) всех исследованных представителей аэробных бактерий и вейллонелл. Количество бифидобактерий не менялось, а количество лакгобацилл достоверно увеличивалось. В стенке толстой кишки значимо возросло количество основных представителей аэробной кишечной микрофлоры и вейллонелл, число лакгобацилл и бифидобактерий практически не изменилось.

С целью определения транслокации представителей аутомикрофлоры бактериологически исследованы гомогенаты мезентериальных лимфатических узлов, печени, селезенки и крови 35 крыс, перенесших терминальное состояние. При этом у 9 крыс Бргадие Оату1еу выделены 33 транслоцировавшихся штамма и у 14 беспородных -45. В большинстве случаев бактерии высеяны из мезентериальных лимфатических узлов. Транслокация представителей кишечной микрофлоры в печень, селезенку или кровь имелась при положительных результатах посева гомогенатов мезентериальных лимфатических узлов. Среди транслоцировавшихся штаммов доминировали эшерихии и протеи, затем по частоте следовали лактобациллы и бифидобактерии, энтерококки. Микробиологическое исследование гомогенатов внутренних органов и крови животных контрольной группы (интактные) дало отрицательные результаты.

Таким образом, на 3 сутки постреанимационного периода после острой кровопотери у крыс обнаруживаются глубокие дисбиотические изменения, наиболее выраженные в биотопах тонкого кишечника

(содержимое, стенка). Выявлены особенности количественных и качественных сдвигов пристеночной микрофлоры различных уровней кишечника и структурных образований (тонкая кишка, область пейеровых бляшек, толстая кишка). Транслоцировавшиеся штаммы чаще обнаруживались в мезентериальных лимфатических узлах, реже - в печени, селезенке и крови. Первое место занимают эшерихии, с меньшей частотой выявляются другие представители грамотрвдателыгой и грамположительной микрофлоры.

Микроэкологические нарушения. рячвгаингсся в кишечшосс животных после осгрои кровопотсри, имели отлтппы от аншбиотикового дисбактериоза. В этом случае наблюдалось достоверное повышение уровня лактофлоры в толстой кишке при неизмененном количестве бифидобактерий. В то же время биотоп тонкой кишки (содержимое, стенка, пристеночная микрофлора пейеровых бляшек) характеризовался снижением количества лакгобацилл и бифидобактерий и нарастанием уровня энтеробактерий, энтерококков, вейллонелл в содержимом и стенке кишечника. Транслокация бактерий во внутренние органы отразила более глубокое снижение КР, чем при антибиотиковом дисбактсриозе.

4. ПРОТЕОЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ СОДЕРЖИМОГО ТОЛСТОГО КИШЕЧНИКА ПРИ ДИСБЛКТЕРИОЗАХ.

Протсолитические ферменты условнопатогекных бактерий (стафилококков, стрептококков, синегнойных палочек, протеев и др.), рассматриваемых в качестве транзиторных представителей нормальной микрофлоры кишечника, относят к факторам юс потенциальной патогенности. Протеиназы гаяролизуют различные белки, в том числе казеин, фибрин, желатину и др. Показано, что протеолитические ферменты микробного происхождения принимают участие в развитии тяжелых клинических форм кишечных инфекций, эндотоксинового, инфекционно-токсического и травматического шоков (Проценко В.А., 1988).

Исходя из вышеизложенного, можно предположить,- что при дисбиотических состояниях при нарастании в содержимом толстой кишки условнопатогенных бактерий с наличием тех или иных' факторов патогенности, к. которым относятся и протеолитические ферменты, должна увеличиваться суммарная ПА супернатантов фекалий. Однако к моменту начала наших исследований таких данных в литературе не было.

На первом этапе исследований нами была определена ПА содержимого толстого кишечника крыс с дисбактериозом кишечника,

<■

вызванного введением ампиокса. Микроэкологические нарушена выражались в увеличении общего количества аэробных бактерий, в тс» числе значительном повышении уровня протеев и стафилококков I снижении количества бифидобактерий (табл.5).

г Таблица 5

Состав ^микрофлоры толстого кишечника крыс после введения ампиокса.

Группы бактерий Количество в lg КОЕ/г, М ± m Достоверность

До введения После введения различий

Общее количество 7.4 ± 0.6 10.0± 0.8 р< 0.05

аэробов

Rcoli 6.0 ± 1.0 8.0 ± 0.6 р< 0.05

Proteus spp. <2.0 8.4 ± 0.5 р< 0.05

Staphylococcus spp. 5.0 ± 0.8 8.5 ± 0.7 р< 0.05

Lactobacillus spp. 8.7 ± 0.8 8.0 ± 0.9 р> 0.05

Bifidobacterium spp. 8.0 ± 0.5 <0.5 р< 0.05

Если у интактных контрольных крыс протеолитическая (казеинолитическая) активность (КА) не регистрировалась, то после введения ампиокса зоны ПА составляли в среднем 9 мм, свидетельствуя с возможной роли протеиназ условнопатогенных бактерий в патогенезе микроэкологических нарушений.

На 2 этапе исследований изучена ПА супернатанга фекалий у 204 детей в возрасте от 1 мес. до 15 лет с дисфункциями желудочно-кишечного тракта без выделения патогенных микробов и у 42 практически здоровых детей.

Из 204 проб супернатантов фекалий, полученных от больных, IIA выявлена в 113 (55.4%). По анализам микробиоценоза толстого кишечника обследованные больные были подразделены на 2 группы: I группа - со снижением количества лакгобацшш и бифидобактерий на 12.5 Ig КОЕ/г без увеличения количественного содержания условнопатогенных бактерий. II группа - со значительными отклонениями нормального микробиоценоза, обусловленными возрастанием количества эшерихий, в том числе гемолитических, бактерий родов Klebsiella, Proleus, Enterobacter, споровых анаэробных бактерий и их ассоциаций. На рис.5 показана ПА супернатанга фекалий у больных с дисбактериозами кишечника I и II групп и здоровых (контрольная труппа). Она оказалась положительной у 44% больных I группы и у 70% бальных II группы'. Для I группы характерным было значительное число проб со средним и минимальным уровнем ПА (54.3% и 34.8%)

2, группа (ДИ) 1 группа (ДП; контроль (К)

I I - ПА не обнаружена ГШМДI - ПА обнаружена

Рис ,5А. Протеолитичеекая активность (ПА) супернатантов фекалий больных с дисбактериозом кишечника

г-(0.0%)

1 группа (ДI) 2 группа (ДП) контроль Ш)

I I - высокая I / / / / I - средняя | теазавг!I - минимальная

Рис .5В. Выраженность протеолитической актлиности (ПА) супернатантов фекалий больных с дисбактериозом кишечника

соответственно (суммарно 89.1%). Высокий уровень КА отмечен в 10.9% случаев. В то же время во II группе, в которой регистрировалось в содержимом толстой кишки повышенное количество энтеробакгерий, стафилококков и других условнопатогенных микроорганизмов, число проб с высоким уровнем ПА почти в 4 раза превысило их количество в I группе (38.4%). В контрольной группе в 40.5% проб имелась ПА, однако в значительном числе она была минимальной.

Обращало на себя внимание то, что преобладающее число отрицательных проб у больных II группы отмечалось при наличии в их микрофлоре повышенного содержания кишечных палочек без гемолитической активности или с низким процентом гемолизин-продуцирующих штаммов (от I до 10%).

Выявлена корреляция ПА с увеличенным количеством в микрофлоре гемолитических форм кишечной палочки, бактерий рода протея, стафилококков, ассоциаций стафилококков с клебсиеллами, E.coli и другими условнопатогенными бактериями. Вместе с тем такая корреляция не обнаружена при повышенном уровне K.pneumoniae. Возможно, что увеличение в содержимом кишечника числа клебсиелл не сопровождалось появлением у них ПА. Во всех случаях, когда в микрофлоре находили Proteus spp. в количестве > 5 lg КОЕ/г, ПА супернатантов была высокой.

Таким образом, при дисбакгериозах кишечника, сопровождающихся микроэкологическими нарушениями, включающими повышение числа эшерихий, продуцирующих гемолизины, других условнопатогенных энтеробакгерий, стафилококков, протеев, Э1 ггеробакгеров, ююстридий, ассоциаций условнопатогенных бактерий, нами найдено повышение суммарной ПА содержимого толстого кишечника. Это связано, в основном, с деятельностью протеаз микроорганизмов, которые могут иметь значение в патогенезе дисбактериозов различного генеза. В связи с этим, по нашему мнению, ингибиторы протеолитических ферментов могут быть использованы в комплексе средств для коррекции микроэкологических нарушений при дисбиотических состояниях кишечника.

5. ПУТИ КОРРЕКЦИИ НАРУШЕННОЙ МИКРОЭКОЛОГИИ КИШЕЧНИКА.

5.1. Механизмы действия лактобактерина.

Использование лактобацилл в пробиотиках для терапии и профилактики заболеваний желудочно-кишечного тракта, микроэкологических нарушений после различных воздействий широко практикуется во странах мира. Истоки научного обоснования ггр!г.:сясиия таких upen?, ратов связаны с именем Ц.Ц. ¡Мечникова, а истоки эмпирического использования с народней медишпюй. Еще совсем недавно наиболее важгаям и разработанным считался принцип антагонистического действия лактобацилл на условнопатогенные и патогенные бактерии. Затем экспериментально были обоснованы вигаминообразующие, ферментативные свойства лактобацилл, адгезивность к эритроцитам. Подбор лактобацилл в соответствующие препараты стал проводиться с учетом этих свойств. Однако еще ряд потенциальных полезных биологических свойств лактобацилл не исследовался, что явилось основанием для изучения дополнительных характеристик L.plantarum 8R-A3 и L.fermentum 90T-S4, входящих в состав отечественного лактобактерина.

5.1.1. Иммуноморфологические изменения в слизистой оболочке кишечника и регионарных лимфатических узлах при введении эубиотиков из лактобацилл.

Используя гнотобиологические модели, было выявлено морфо-гешюе и иммуногегаюе влияние нормальной микрофлоры {Чахава О.В., 1972). Вместе с тем на основании немногочисленных работ сложилось представление о том, что лактобациллы в иммунологическом и морфологическом аспектах инертны, так как введение их безмикробным животным не вызывало каких-либо клеточных изменений в слизистой оболочке кишечника или нарастатшя титров антител. Однако накопилось достаточное количество фактов, свидетельствующих о большом вкладе лактобацилл в КР: защита против колонизации патогенными и услов-нопатогенными микробами, дезинтоксикационный эффект' и др. Одним только антагонистическим действием лактобацилл создаваемую ими резистентность было трудно объяснить. На гнотобиологической модели нами было изучено влияние лактобацилл на слизистую оболочку кишечника и регионарные (мезентериальные) лимфатические узлы.

Безмюсробные крысы линии Фишер получили с питьевой водой 1х109 КОЕ Lactobacillus plantarum 8R-A3 и Lactobacillus fermentum 90T-S4 (1 серия) или только L.plantarum 8R-A3 (2 серия).

Результаты исследования показали, что на 7-14 сутки после ассоциации безмикробных крыс со штаммами 2-х видов лактобацилл, ворсинки подвздошной кишки были незначительно утолщены, кровеносные и лимфатические капилляры расширены и заполнены лимфоцитами. В соединительнотканной строме толстого отдела кишечника имелась лимфоцитар-ная и эозинофильная инфильтрация: число лимфоцитов увеличивалось с 21.8±2.4% у безмикробных до 39.0+9% у подопытных (р<0.05), эозино-фильных гранулоцитов с 2.0+0.4% до 6.5+2.1(р<0.05) соответственно. В паракортюсальной области брыжеечных лимфатических узлов встречались отдельные группы властных форм клеток и фигуры митоза. Увеличивалось число посткапиллярных венул, внутри и вокруг которых имелись скопления лимфоцитов.

При электронномикроскопическом исследовании, проведенном после введения безмикробным крысам L.plantarum, в энтероцитах ворсинок выявлены ультраструктурные признаки интенсификации их функциональной деятельности. Определение антител к лактобациллам в сыворотке крови животных, как в первой, так и во второй серии опытов показало, что во все сроки исследования они если и обнаруживались, то только в низких титрах 1:2 - 1:8 (реакция иммунофлуоресценции), а у некоторых животных полностью отсутствовали.

Таким образом, штаммы лактобацилл, входящие в состав коммерческого лактобактерина (L.plantarum и L.fermentum) вызывают иммуно-морфологические изменения в слизистой оболочке тонкого и толстого отделов кишечника. Они проявляются в лимфоцитарной инфильтрации и инфильтрации эозинофилами с отсутствием морфологических признаков гуморального ответа - незначительное число бластных форм и практически отсутствие плазматических клеток. Однако в мезентериальных лимфатических узлах выявлено образование "муфт" вокруг капилляров, усиление миграции лимфоцитов через эндотелий посткапиллярных венул. Обычно таким путем поступают лимфоциты в тимусзависимые области лимфатическиз узлов, а пролиферация лимфоцитов в паракортикальной области служит доказательством Т-клеточного ответа.

5.1.2. Действие лактобацилл на кинетику энтероцитов тонкого отдела кишечника.

Работами Van der Waaij D., Verhoef J. (1971) установлено, что основные представители нормальной микрофлоры, создавая резистентность

организма к заражению патогешшми и условнопатогенными микробами, осуществляют это через ряд механизмов. Одним из несиецифических факторов резистентности является обновление эпителиальных клеток кишечника, позволяющее при определенной его скорости путем экструзии эпителиоцитов избавляться от прилипших к ним патогенных и условнопатогенных микробов. Поскольку в литературе к моменту наших исследований не было данных о том, как лактобациллы влияют на скорость обновления эпителиальных клеток, нами были предприняты следующие эксперименты.

Мы изучили кгастпху оожтлеппя JHiepoi гитов тонкою отдела ктапгпшка рапиоэтггографическии методом у безмикробных крыс, экс-безмикробных животных, ассоциированных с L.plantarum 8R-A3 и L.fermentum 90T-S4 и обычных крыс линии Fisher.

Если у безмикробных крыс митотический индекс эпителия равен 16.1±0.3 и 15.9±0.2% в тощем и подвздошном отделах кишки соответственно, то у обычных он составил 23.6+1.1 и 26.9±1.3% (р<0.001). Через 1 час после инъекции Н3 -тимидина индекс меченых ядер (ИМЯ) эпителия крипт тощей кишки равен Зб.З ± 2.5 и 34.1 ± 2.3% у обычных и безмикробных крыс соответственно, то есть число эпителиальных клеток, участвующих в синтезе ДНК в единицу времени, одинаково для сравниваемых грунп животных (рис.6). Через 72 часа после введения Н3 -тимидина у обычных живопшх единичные меченые эпителиальные клетки обнаруживались лишь на верхушке ворсинок. У крыс-гного-бионтов с отсутствием микрофлоры в кишечнике через то же самое время в криптах выявлено 38.3 ± 1.9%, а на поверхности ворсинок - 12.4 ± 1.6% меченых эпителиальных клеток.

В подвздошном отделе кишечника через 1 час после шгьекпии Н3 -тимидина ИМЯ эпителиальных клеток крипт у интакптых крыс (обычных и безмикробных) и ассоциированных с лактобациллами составляет 46.3 ± 2.5; 44.1 ± 2.3; 45.3 ± 2.7 % соответственно. Через 72 часа ИМЯ эпителиоцитов в криптах у безмикробных крыс - 38.3 ± 1.9%, у крыс после введения лактобацилл - 17.4 ± 1.8%, у обычных -0%. На ворсинках ИМЯ к этому сроку соответственно составляет 12.4 ± 1.6; 18.4 ± 1.7; 0%.

Таким образом, при отсутствии микробов в просвете кишечника эшероциты перемещаются в системе крипта-ворсинка значительно медленнее, чем у животных с нормальной микрофлорой. Введение лактобацилл безмикробным крысам вызывает ускорение дифференцировки и миграции эпителиальных клеток в системе крипта-ворсинка. Сокращение жизненного цикла эпителиальных клеток после ассоциации безмикробных крыс с лактобациллами, видимо, обусловлено соответствующим изменением других параметров обновления (скорости пролиферации, дифференцировки, экструзии).

Индекс меченых ядер {%)

ворсинка

Индекс меченых ядер (%)

1 час

крипта

72 часа

сл

1 час 72 часа

безмикроб. Г771 - ассоциир. ШШ - конвенциональн. Рис.6 Влияние пероралъного введения

лактобацилл на обновление эпителиальных клеток подвздошной кишки крыс

5.1.3. Влияние лактобацилл на гиперчувствительность замедленного типа.

Собственные данные о том, что введенные перорально безмикробным крысам лактобациллы индуцируют лимфоцитарную инфильтрацию в слизистой оболочке кишечника, расширение тимусзависимых зон в мезентериальных лимфатических узлах, увеличение числа посткапиллярных венул с образованием "муфт" лимфоцитов вокруг них, послужило основанием для изучения возможности развития гиперчутст^иел ьносто замедленного типа (РГЗТ1 тм\ч влиянием молочнокислых бактерий.

РГ5Т оыла исиольлояатга в качестве показателя клеточного ответа (козахая проба). 83% обычных интактных крыс отвечали положительной РГЗТ на растворимый антиген из Ь.рШМагит (лизат дезинтегрированных микробных клеток). Кожная проба была положительной у 24 животных из 29 и ни у одной из 14 безмикробных крыс того же возраста. После сенсибилизации животных взвесью живых лактобацилл в неполном адыованте Фрейнда кожные реакции были выражены сильнее: они наблюдались у всех взятых в опыт животных, причем вдвое возросла площадь инфильтрата. Диаметр инфильтрата у сенсибилизированных животных достигал 18.0 +1.5 см^, в то время как у штгакшых -8,4 ± 0.9 см^ (р<0.05). В первом случае толщина инфильтрата была более значительной, кроме того отмечалась гиперемия. Специфичность РГЗТ подтверждена морфологическим исследованием фрагмента инфильтрата с места инъекции. Через 1 час после внутрикожного введения препарата из Ь.р1ап1агит отмечена инфильтрация с преобладанием нейтрофильных лейкоцитов в сетчатом слое. Через 3 часа инфильтрация нарастала: соотношение поли- и мононуклеаров в сетчатом слое составило 3:1, а в сосочковом - 1:1. Через 6 часов отмечена интенсивная инфильтрация преимущественно нейтрофильного типа. Через 24 часа соотношение нейтрофильных лейкоцитов к мононуклеарам составило 2:1, а через 48 часов преобладающими в инфильтрате оказались мононуклеары. На 3 сутки в коже было много фибробластов, мононуклеаров, имелись плазматические клетки.

Таким образом, Ь.р!аШагит 8Я-А3 индуцируют ГЗТ, которая может оказать защитное действие при инфекционном процессе, что является еще одной, ранее не известной стороной действия этих представителей нормальной микрофлоры.

5.1.4. Усиление фагоцитарной активности клеток мононуклеарной фагоцитирующей системы при пероральном введении лактобацилл.

Известно, что естественная устойчивость организма к патогенным микробам и формирование иммунитета при возникшем заражении во многом определяется деятельностью клеток мононуклеарной фагоцитирующей системы (МФС), в частности, одной из наиболее важных функций- фагоцитозом (Фрейндлин И .С., 1984). Вместе с тем неясно, способны ли лактобациллы при пероральном введении усиливать функцию МФС. С этой целью нами была изучена фагоцитарная функция клеток МФС после перорального и внугрибрюшинного введения лактобацилл.

Первоначально были испытаны 2 схемы введения молочнокислых бактерий:

1. Мышам линии С57В1 вводили по 1x10** смеси лактобацилл {L.plontarum 8Р-АЗ и L.fermentum 90T-S4) внутрибрюшинно однократно. Через 4 дня этим же животным инъецировали внутрибрюшинно брюшнотифозную вакцину и через 30 мин., 7 сут., 14 сут. определяли уровень радиоактивной метки в КПЭ.

2. Мышам одновременно вводили лактобациллы и брюшнотифозную вакцину в тех же дозах, что и по первой схеме и определяли уровень метки в КПЭ в те же сроки.

Результаты этих двух опытов оказались неоднозначными. Предварительное введение животным смеси лактобацилл усиливало способность КПЭ к захвату меченой ^С- вакцины - уровень метки в 2 раза выше контрольного. Была усилена также и переваривающая функция клеток. Так, индекс переваривания - соотношение количества меченого антигена, обнаруживаемого в КПЭ через 30 мин., к количеству его, выявляемому через 14 суток после введения меченого антигена, то есть 30мин/14 суток был намного выше в опытной группе, чем в контрольной, т.е. большее количество антигена переработано клетками под влиянием активации лактобациллами. Если же лактобациллы вводили одновременно с меченым антигеном, то происходило снижение уровня захвата меченого антигена; угнеталась и переваривающая способность КПЭ.

Поскольку при терапии лактобациллы применяются перорально, представляло интерес изучить их воздействие на клетки МФС именно при таком способе их аппликации. Были исследованы 3 схемы введения per os лактобацилл:

1. В течение 6 дней непрерывно.

2. Прерывистый 6-дневный цикл: 3-х-дневное введение, перерыв 7 дней, 3-х-дневное введение.

3. В течение 18 дней непрерывно. Через 4 дня после последнего введения животным лактобацилл им инъецировали внутрибрюшинно меченую брюшнотифозную вакцину и через 30 мин., 7 сут., 14 сут. определяли уровень радиоактивной метки в КПЭ.

Как видно из рис. 7, в опытной группе мышей, получавших иероралыю в течение 6 дней (непрерывный или прерывистый циклы) смесь из 2-х видов лактобанилл - L.plantarum 8R-A3 и L.fermeníum 90T-S4 и 3-х видов лактобанилл L.caset subs, casei 37, L.plantarum 38 и L.fermentum 39 фагоцитарная активность - КПЭ по отношению к брюшнотифозной пакпине 14С усилилась в 1.5 раза по сравнению с таковой в контрольной грутше. Усиленный захват меченого антигена сопровождался ускоренной ею переработкой (в 3 раза) и выведением. Аналогичные результаты получены нами на крысах после neponaiTM»r.r~ приема ими « течетше 13

лной коммерческою лактолактерина.

! {сророльное введение мышам смеси L.plantarum 8R-A3 и L.fermentum 90T-S4 при 6-дневных циклах привело к 4-х-кратному увеличению титров aimrran на 7 сут. в опытной группе по сравнению с контрольной. На 14 сут. в результате снижения антителообразования к брюшнотифозным антигенам в опытной грутше и повышения его в контрольной, титры антител стали одинаковыми.

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что лакгобациллы при пероральном введении воздействуют на фагоцитарную функцию МФС, усиливая захват и катаболизм меченого антигена. Их можно отнести к иммуномодуляторам, одной из точек приложения которых являются клетки МФС, другой- В-клеточная система иммунитета. Стимулирующее влияние лактобанилл на активность макрофагов было известно, но только при парентеральном введении препаратов. Возможность такого воздействия лактобанилл на макрофаги при пероральном введении не исследовалась. Результаты наших экспериментов позволяют полагать, что- и при пероральной аппликации лактобацилл продукты их метаболизма и компоненты клеточных стенок, всасываясь в кишечнике, стимулируют клетки мононуклеарной фагоцитирующей системы. Аналогичные с нашими данными результаты, опубликованные в это же время, получили Perdigón G. et al. (1986), которые наблюдали повышение фагоцитарной функции макрофагов после перорального введения мышам L.casei.

5.1.5. Адгезивные свойства лактобанилл' как критерий отбора их в препараты пробиотики.

Бактериальное прилипание необходимо как для персистенции j представителей нормальной микрофлоры, так и для запуска инфекционного процесса патогенными микробами. Еще недавно при

I П Ж I I ш

рмс. 7 Захват и выведение -ТВ при пероральном введении

ЛАКТОБАЦИЛЛ

изучении физиологических свойств лактобацилл для отбора в оубиотики их адгезивная активность не учитывалась. Однако в последние годы этому признаку стали уделять пристальное вгашание (Брилис В.И., 1983; Silva М. eta!., 1987).

Нами была исследована адгезия различных штаммов лактобацилл, а также некоторых патогенных бактерий к различного типа изолированным эпителиальным клеткам кишечника крыс, а также к фибронектину, конканавалину Л, муцину, иммобилизированным на пластике.

Прослеживаются межштаммовые колебания одгсзяйнги-т как лактобацилл. тяу » nüTöieHHwx бактерий кишечного происхождения. Так, уровень алгезитшой активности L.fermentum 1-20 к энтероцитам превосходил таковой L.fermentum 3-1 почти в 5 раз. Такая же закономерность в отношении межштаммовых различий выявилась при оценке их адгезии к колоноцитам. Следует подчеркнуть, что адгезивность большинства штаммов была выше к колоноцитам, чем к энтероцитам, несмотря на межштаммовые колебания. Из 17 штаммов лактобацилл средняя степень прилипания к энтероцитам зарегистрирована у 5 штаммов, к колоноцитам - у 4, высокая к энтероцитам у одного и колоноцитам - у 5. Подобные же результаты дало исследование среднего показателя адгезии штаммов патогешшх кишечных палочек, кампилобактеров (клинические изоляты) и шшелл: межштаммовые колебания прилипающей способности, более выраженная адгезия к колоноцитам (рис.8).

Особыми образованиями тонкой кишки являются пейеровы бляшки. Нами была оценена энтероадгезивноегь 27 производственных штаммов лактобацилл к эпителию пейеровых бляшек. В качестве контроля изучена энтероадгезивность 30 штаммов клинических изолятоп C.jcjuni, выделенных при кампилобактериозе у детей, 2 штаммов •лперотокеш енных E.coli, по одному штамму S.typhimurium и Y.enterocolitica. Результаты показали, что для всех штаммов лактобацилл средний показатель адгезии к энтероцитам пейеровых бляшек не отличался от уровня адгезивной активности к энтероцитам вне этих зон. В то же время у 96.8% из 30 исследованных клинических изолятов кампилобактеров средний показатель адгезии к энтероцитам пейеровых бляшек был в 1.5 раза и более выше, чем к эпителию тонкой кишки вне пейеровой бляшки. Такая же закономерность нами отмечена для E.coli К99 Ent+, Y.enterocolitica 09 и тенденция к этому у S.typhimurium и E.coli G7 К88 Еп&.

непатогенные эшерихии и лактобациллы

Индекс адгезии 10

-Р< 0 . 01-

'Л 'J4*)

патогенные эн-теробактерии.и кампилобактеры

-Р< 0 . 01-.

СО fo

L р<0.01 J И - энтероциты

L р< 0.05 J

а - КОАОНОЦИТЫ

Рис.8 Адгезивная ' активность микроорганизмов in к эпителиоцитам конвенциональных крыс

vitro

Индигенные лактобациллы обычно находят в слизистом слое, где они принимают участие в КР, конкурентно ингибируя прилипание и колоштацию патогашыми бактериями, и выполняя другие важные функции. Вместе с тем ассоциация различных штаммов лактобацилл с муцином, лиганд-рецепторные связи с эпителиальными клетками кишечника практически не исследованы. Между тем эти знания необходимы для направленного воздействия на кишечную микроэкологию, для отбора штаммов лактобацилл в эубиотигги

Нами была охарактсризопяч:-! стсиож. прилипания к мунииу, ФН и КонЛ 33 апаммоп дакгоб.шидл - представителей инд иге! гной и транзиторной микрофлоры, взятых из коллекции произподстветгых штаммов Нижегородского НИИЭМ и кафедры микробиологии Тартуского университета. Исследование осуществляли в реакции бактериосорбции по методике Николаева В.Л.

Среди 1..р!ап(агит высокой адгезией к муцину обладали 3 из 14, средней - 4 и низкой - 7 штаммов. Все культуры ¿.соде/ (6) и Ь.ЬгемЬ (4) имели низкую степень прилипания к этому субстрату; из 4 штаммов Ь./егтеШит 2 имели среднюю активность и 2 - низкую. Почти все штаммы лактобацилл обладали высокой и средней способностью связывания с ФН. С КонА лучше всего связывались штаммы ¿.р/ашагит и Ь./егтеШит: высокую и среднюю степень адгезии имели 11 из 14 штаммов Ь.р1ап1агит и 3 из 4 Ь./егтеп1ит. Для Ь.Ьгеуя и С.сазе! зарегистрированы другие соотношения этих уровней активное™ - 2 из 4 и 2 из 6. В целом из исследованных 33 штаммов лактобацилл с муцином активно связывались 10 (30.3%), с ФН - 29 (88%) и КонА - 18 (54%) (рис.9). Контрольные опыты по блокированию адгезии после предварительной обработки микробных клеток соответствующими растворимыми белками показали, что там, где уровень связывания был достаточно высок (высокий и средний), оно блокировалось у 80% штаммов. Рецепторы для лактобацилл на эпителиальных клетках точно не установлены, хотя чаще всего для грамположительных бактерий таким рецептором является ФН. С ФН связывается 98% штаммов Б.аигеи (Лызлопа Л.В., и др., 1990). По нашим данным с ФН связывалось 88% штаммов лактобацилл 8 видов, из них все исследованные штаммы Ь.рктШгит, Ь.сазе'1 и Ь./егтепШт.

Это позволяет полагать, что ФН является рецептором на эпителиальных клетках для лактобацилл. Видимо, он не единственный рецептор, т.к. с лектином - КонА связывалось 54% штаммов лактобацилл. Хотя муцин не содержит лектины, прямой коррелятивной связи между

Опт.

плотность

0.25

со Л

Р < 0.01 (по критерию Вилкоксона)

I / / /1 - к мидинн ШШ - к Фибронектину Рис.9 Бактериосорбция различных видов лактобацилл мбгцинн и фибронектинн

суммарной адгезией штаммов лактобацилл к муцину и КонА не найдено. Випимо, применешшй в нашем исследовании муцин желудка свиньи, структурно сходный с мушпгом человека, не имеет обпгих углеводных остатков с КонА. Вместе с тем, у L.plantarum, и L.fermentum имеются адгезины к этому углеводу, о чем свидетельствует достаточно авилное связывание с ними. Не исключено, что части популяции лактобацилл не требуется адгезии к ФН, покрывающему эпителиальные клетки. Они могут связываться с муцином, успешно там переживать, находя здесь источник питания. Однако этот пркзгтг,:: - ^¿шзьтяние с .муцином не такой частый {}{)% шгаммои*, по он представляется важным для характеристики их биологических свойств и может быть использован, наряду с другими, как критерий отбора в эубиотики.

Таким образом, экспериментальная оценка бактерий-"кандидатов" в эубиотики, по нашему мнению, должна включать изучение различных сторон их действия как на другие микробы, так и на организм хозяина. На примере лактобацилл, входящих в состав отечественного лактобактерина - L.plantamm 8R-A3 и L.fermentum 90T-S4, нами показаны догошштельные эффекты эубиотиков из лактобацилл. Они заключаются в способности индуцировать клеточный ответ - (РГЗТ), стимулировать факторы неспецифической резистентности (ускорение обновления эпителиальных клеток кишечника - их дифферешшровки и миграции с крипты на ворсинку), усиливать фагоцитарную активность макрофагов -(способности к захвату и выведению антигена, способности к адгезии с эпителиальными клетками кишечника различных типов, муцином, ФН. Все эти эффекты следует целенаправленно использовать при отборе и конструировании эубиотиков на основе лактобацилл.

5.2. Обоснование применения энтсросорбентов для коррекции микроэкологических нарушений в кишечнике

В п.З дано описание микроэкологических нарушений, развивающихся после острой кровопотери у крыс. Нами была испытана возможность коррекции этих нарушений и снижения уровня транслокации с помощью энтеросорбснтов - полиметилсидоксана (ПМС), полифепана (ПФ), активированного угольного волокнистого материала (АУВМ), АУВМ с полимиксином (АУВМп), энтероката (ЭК).

Как показали данные микробиологического исследования, в контрольной группе животных, перенесших клиническую смерть от острой венозной кровопотери и не получавших лечения, в стенхе тонкой и толстой кишки уровень энтеробактерий нарастал на 1 Ig к 3-м суткам

иостреанимационного периода. Почти такие же изменения регистрировали и в отношении энтерококков. Количество стафилококков также заметно увеличивалось в содержимом и стенке толстой кишки. Количество лактобацилл возросло в содержимом толстого отдела кишечника, в то же время в содержимом тонкого достоверно снизилось и не изменилось в стенках как тонкого, так и толстого отделов. Уровень бифидобактерий не изменился ни в одном из исследованных биотопов (табл.6, 7).

Из тканевых гомогенатов и крови, начиная с первых часов и на протяжении всего периода исследования, высевались энтеробактерии. Чаще всего микрофлора кишечника транслоцировала в мезентериальные лимфузлы, реже - в печень, селезенку и кровь. Среди транслоцировавшихся штаммов доминировали E.coli, в единичных случаях встречались Klebsiella spp., Enterobacter spp., Serratia spp., Staphylococcus spp., Enterococcus spp.

В опытных группах все 5 исследованных энтеросорбентов вызывали снижение популяционного уровня энтеробактерии. Однако имелись особенности для каждого кишечного биотопа. В содержимом тонкой кишки уровень энтеробаюгерий уменьшился на 1 порядок только на фоне применения ПФ; остальные сорбенты не вызывали изменений в количественном содержании бактерий этого семейства по сравнению с животными контрольной группы. В стенке тонкой кишки уровень энтеробактерий на фоне всех сорбентов понизился достоверно для ПМС и ЭК (р<0.05), хотя и не достигал среднего уровня интактных животных. В содержимом толстой кишки количество бактерий при применении всех сорбентов достоверно уменьшилось на 1-2 lg. В стенке толстой кишки энтеробактерии оставались примерно на таком же уровне, как у животных контрольной группы без введения сорбентов.

Анализ влияния сорбентов на уровень стафилококков показал, что только энтеросорбент ПМС активно элиминировал (абсорбировал) эти бактерии из содержимого тонкой кишки животных и уменьшал их количество до уровня у интактных. В стенке тонкой кишки аналогичное действие, помимо МПС, оказывали ПФ и АУВМп. В содержимом толстой кишки уровень стафилококков на 1.5-2.5 lg снижали все примененные сорбента, за исключением АУВМп, приближая его к уровню у интактных крыс. К достоверному уменьшению количественного содержания стафилококков в стенке толстой кишки привело использование всех сорбентов, за исключением ЭК. Что касается A.viridans, то в проксимальном отделе (содержимое и стенка тонкой кишки) их количество значительно уменьшал энтеросорбент АУВМп

Таблица 6.

Влияние энтеросорбентов на микрофлору тонкой кишки в постреанимационном периоде

(в & КОЕ/г) (М ± т).

Группа Enterobac- Staphylococcus ; Aerococcus Enterococcus Lactobacillus j Bifidobacterium

животных teriaceae _ ! . _______VP- ; viridans spp. _____WP-_____ I spp.

Содержимое тонкой кишки

1-я 3.86+0.2 4.07r0.3 4.14+0.2 3.63±0.2 6 4310.2 6.11±0.4

2-я 4.96±0.4 4.33±0.5 4.53+0.3 4.90±0.5* 5 56 t0.3* 5.79±0.3

3-я 4.52±0.2 4.58+0.5 2.0 4.86±0.8 4 83 :0.4 5.51±0.4

4-я 4.20±0.3 4.17+0.2 4.90±0.2 3.95±0.2 5. }5:::0.9 5.22±0.4

. 5-я 3.88±0.3 3.66=0.3 4.14±0.4 4.32±0.1 6.19" 0.5 6.29+0.4

6-я 4.23±0.6 3.00-0.0 4.38±0.2 4.96±0.6* 5.J9:*0.6 4.18+0.2*

7-я 4.26+0.3 5.23±0.3* 4.80=0.4 5.30+0.0 6.i4 + 0.2 5.77±0.3

Стенка тонкой кишки

1-я 3.00+0.0 3.66±0.3 3.48+0.0 2.0 4.4 r-:0.2 4.42±0.3

2-я 4.89±0.4* 4.10+0.5 4.13 ±0.4 3.87+0.3 4.50-0.3 4.52+0.3

3-я 3.96+0.5 2.0 2.0 2.0 3.97r(.2 4.80±0.5

4-я 3.53+0.9 3.56+0.6 3.59-0.6 3.37+0.5 4.87 ±0.7 4.64x0.4

5-я 4.10+0.0 2.0 3.90=0.0 4.24+0.2 5.17+0 5 4.42±0.3

6-я 3.30-0.0 2.0 3.26±0.6 3.00+0.0 4.22+0 5 4.13±0.3

7-я 3.82+0.3* 3.22±0.1 4.36±0.4 4.54±1.0 4.54 tO 3 4.36±0.2

Примечание. 1-я группа - иятакгная, 2-я - животные, перенесшие клиническую смерть, 3-7 я животные, перенесите клиническую смерть и получавшие сорбенты (3-я - АУВМп, 4-я - АУВМ, 5-я - ПФ, 6-я - ПМС, 7-я - ЭК); * -р<0.05.

Таблица 7.

Влияние энтеросорбентов на микрофлору толстой кишки в постреанимационном периоде

(в КОЕ/г) (М + ш).

Группа Enterobac- Staphylococcus Aerococcus Enterococcus Lactobacillus 1 Bifidobacterium

животных teriaceae spp. viridans spp. spp. 1 spp.

Содержимое толстой кишки

1-я 5.58±0.3 5.28+0.2 5.37+0.2 5.62±0.1 7.26+0.3 8.61+0.3

2-я 8.08±0.1 7.08±0.5* 7.21+0.3* 7.51+0.3* 8.75+0.1* 8.85+0.2

3-я 7.02±0.4* 6.22+0.8 6.30+0.6 6.58x0.6 8.28+0.6 7.57+0.6

4-я 6.26±0.4 5.05+0.3 5.25±0.3 5.95+0.3 7.46+0.6 7.06±0.5

5-я 7.35±0.4* 5.30±0.1 5.60+0.4 7.06±0.2* 8.55±0.5* 8.75±0.2

6-я 7.14±0.5* 4.31±0.5 5.11±0.5 6.58±0.3* 7.88±0.8 7.05+0.5*

7-я 6.51 ±0.6 4.97±0.5 5.23+0.2 6.87+1.1 8.36+1.4 7.40±0.5

Стенка толстой кишки

1-я 3.88+0.5 3.76+0.4 3.502:0.5 3.10+0.1 4.91+0.4 5.37±0.4

2-я 4.95+0.3 5.23+0.4* 4.77+0.4 4.63±0.3* 4.98*0.4 5.48 ±0.4

3-я 4.97 ±0.4* 2.0 3.59+0.2 4.37±0.7 4.64+0.4 4.59±0.3

4-я 5.07±0.7 3.83+0.4 3.62±0.3 3.59+0.4 4.41+0.4 3.27+0.6

5-я 4.78+0.5 3.78+0.4 3.00±0.0 4.51+0.2* 5.28+0.5 5.34±0.6

6-я 4.98+0.7 2.0 2.0 3.00±0.0 4.76+0.6 4.75+0.4

7-я 5.38+0.7 4.30+1.0 3.84+0.5 6.00+1.0 4.42+0.6 4.62+0.4

Примечание. 1-я группа - интакгная, 2-я - животные, перенесшие клиническую смерть, 3-7-я - животные, перенесшие клиническую смерть и получавшие сорбенты (3-я - АУВМп, 4-я - АУВМ, 5-я - ПФ, 6-я - ПМС, 7-я - ЭК); * -р<0.05.

(на 2-2.5 Ы КОЕ/г), в содержимом толстой - все сорбенты, за исключением ЭК. В результате у опытных крыс их уровень соответствовал таковому интакпгых животных. Повышенное количество энтерококков в содержимом тонкой кишки опытных животных снижал энтеросорбент АУВМ, в стенке тонкой кишки - ПМС, АУВМп, в содержимом и стенке толстой кишки два сорбента - АУВМ и ПМС.

Очень важно было проследить влияние сорбентов на лакто- и бифидофлору кишечника. Необходимо отметить, что в 3 из 4 исследованных биотопов все примененные •»ктерссорСентм не зызьшали изменений п уровне лактоопшхлл. Только з содержимом толстого гапдечникя аУВМ снизил количество лактобацилл у опытных животных до уровня интактных. Что касается бифидобактерий, то ПМС уменьшил их количество в содержимом тонкой кишки, а в содержимом толстой такое же действие, помимо этого сорбента, оказали ЭК, АУВМ, АУВМп. В стенке толстой кишки снизил количество этих бактерий АУВМ.

Транслокация энтеробакгерий во внутренние органы и кровь расценивается как тяжелое проявление дисбактериоза. При применении энтеросорбентов транслокация кишечной микрофлоры отмечена у метшего числа животных. У всех животных отсутствовало проникновение во внутренние органы грамположительных кокков -стафилококков, аэрококков, энтерококков; в 2-4 раза уменьшалась транслокапия грамотрицателъных бактерий.

Таким образом, детальное исследование микрофлоры биотопов кишечника крыс в горизонтальном и вертикальном направлениях позволило выявить определенные различия в действии энтеросорбентов. Наиболее эффективнее действие сорбентов наблюдалось в содержимом толстой кишки. Из них АУВМ сказался наиболее неселективным, так как "связывал" и неотрицательные, и грамположтелышс бактерии. По таким же характеристикам приближается к нему ЭК. ПМС и ПФ сорбировали только грамположительную микрофлору, ПМС снижал к тому же количество бифидобактерий. АУВМп проявил селективность в отношении грамотрицателъных бактерий, по снижал уровень бифидобактерий. Для сорбции энтеробакгерий из тонкого кишечника (стенка и содержимое) наилучшими сорбентами явились ПМС, ЭК, ПФ, а для грамположительных бактерий - ПМС, АУВМ, АУВМп.

Хотя для определения возможности коррекции микроэкологических нарушений с помощью энтеросорбентов была использована модель с субтотальной кровопотерей и последующими реанимационными мероприятиями, данные, полученные с ее помощью, можно применить для различных вариантов и моделей дисбиотических состояний.

5.3. Коррекция микроэкологических нарушений с помощью пара(аминометал)бензойиой кислоты

5.3.1. Регуляция Памба кишечной микрофлоры и функциональной активности макрофагов в эксперименте.

Подавляющее большинство исследований свидетельствует о несомненной лечебной и профилактической эффективности препаратов из лактобацшш и содержащих их кисломолочных продуктов при дисбиозах желудочно-кишечного тракта. Вместе с тем в ряде случаев применение таких препаратов не дает положительного результата или он наступает через значительный промежуток времени (до 4-х недель). В связи с этим ведется поиск и других средств патогенетического лечения дисбактериозов кишечника, повышения KP. В качестве одного из таких средств нами была испытана нара(аминометил)бензойная кислота -ингибитор протеолигических ферментов. Ингибиторы протеаз являются протекторами клеточных повреждений, оказывают противовоспалительное действие, угнетают образование плазмина, ингибируют протеолитическую активность трипсина и хемотрипсина. Памба (синоним амбен) - препарат, разрешенный к применешпо в нашей стране для лечения панкреатитов и повышения свертываемости крови.

В экспериментах использовали 60 белых беспородных крыс, самцов, массой 250 г. Животные были разделены на 4 группы: I - крысы, получившие ампиокс в течение 3-х дней; И- животные, которым вводили ампиокс совместно с амбеном 3 дня и 2 дня только амбен; III - крысы, получавшие амбен 5 дней; IY- интактные животные. Во всех группах животных определяли количество основных представителей микрофлоры толстого кишечника до введения препаратов, на 4 и 12 день после начала эксперимента. Параллельно от животных этих же групп получали макрофаги перигонеального экссудата (ПМ) и определяли их функциональную активность по нескольким тестам.

Как видно из табл.8, в группе животных, получавших ампиокс (1а) через 4 дня после начала эксперимента (на следующий день после окончания введения препарата) регистрировали дисбиотические изменения: достоверно увеличивалось общее число аэробных бактерий (р<0.05), среди которых 40% были гемолитическими. Возрос уровень энтеробактерий за счет Proteus spp. Число стафилококков увеличилось больше, чем на 2 порядка (р<0.05). Что касается таких представителей

Таблица 8.

Состав микрофлоры толстого кишечника крыс при комбинированном введении ампиокса и амбена (М ± т, КОЕ/г).

Группы Группы животных

бактерий la 16 IIa 116 lila Ulli IYa JY6

Общее количество 9.7 ± 1.0* 9.7 ± 0.4* 6.8 ± 0.5 8.8 + 0.8 7.8 ± 0.2 7.6 ± 0.6 7.2 ± 0.6 8.6 ± 0.4

бактерий E.coli 9.0 ± 0.3* 5.5 i 0.5 6.6 ± 0.3 5.5 ± 0.4 7.0 ± 0.3 7.3 ± 0.1 6.8 ± 0.8 6.5 ± 0.4

Proteus spp. 8.9 ± 0.6* 5.0 ± 0.6 - 4.0 ± 0.6 - - - 5.5 ± 0.6

Staphylococcus spp. 8.9 ± 0.2* 4.0 ± 0.3 3.0 6.3 ± 0.35 7.0 ± 0.4 6.7 t 0.2 6.0 ± 0.5 7.5 ± 0.8

Lactobadüus spp. 8.6 ± 0.7 10.7 ± 0.9 6.7 ± 0.7 8.5 ± 1.0 10.0±0.9* 8.0-O.S* 8.3 ± 0.6 8.3 ± 0.3

Bifldobaäerium spp. < 5.0* < 5.0* < 5.0 6.8 ± 0.3 11.6±0.3* 7.0-0.-* 8.0 ± 1.0 7.2 ± 0.6

Примечание: I - ipynna животных, получавших ампиокс

II - группа животных, получавших ампиокс + амбен

III - группа животных, получавших амбен IY - интактная группа животных

а - исследование выполнено на 4 сутки после введения препаратов

б - исследование выполнено на 12 сутки после введения препаратоз

* - р < 0.05

индигенной микрофлоры, как лактобациллы, то их количество не изменилось, зато содержание бифидобактерий значительно снизилось. В восстановительный период (через 9 дней после окончания применения ампиокса) у крыс этой группы (16) общее число аэробов продолжало оставаться повышенным (р<0.05), еще встречались колонии, продуцирующие гемолизины (10-15%). Среди условнопатогенных бактерий обнаруживали Proteus spp. в количестве 5.0 ± 0.6 lg КОЕ/г. Количество бифидобактерий все еще было снижено - <5.0 lg КОЕ/г (р<0.05).

. При исследовании фагоцитарной способности макрофагов найдено, что начальная стадия фагоцитоза (функция захвата) при введении ампиокса подавлена, т.к. через 30 мин после внугрибрюшшшого введения крысам меченых эритроцитов, ПМ животных I группы содержали значительно меньшее - в 28 раз количество метки (р<0.05), чем ПМ IY группы (интакгных). При исследовании активности катепсина Д выявлено значительное ее усиление под влиянием ампиокса (р<0.05). Достоверных изменений других исследованных функций ПМ (интенсивности синтеза белка, бактерицидной активности, активности кислой фосфатазы) при этом не наблюдали. У крыс II группы, получавших, наряду с ампиоксом амбен, на 4 день наблюдения не имелось такого нарастания общего количества аэробов, как в группе животных, которым вводили только ампиокс. Условнопатогенные энтеробактерии, за исключением кишечной палочки, не были найдены. В подгруппе, которая получила к моменту исследования в течение 4 дней амбен, было сниженным число лакгобацилл и бифидобактерий, однако оно практически возвращалось к норме в восстановительном периоде (группа 116). Этого не наблюдалось у животных, получавших ампиокс, в отношении бифидофлоры.

Применение амбена у животных, которым вводили ампиокс, доводило до нормы (уровень интакгных крыс) все исследованные показатели функциональной активности макрофагов.

В III группе крыс, получавших амбен, на 4 день его введения *не обнаружено роста числа условнопатогенных микроорганизмов. Достоверно возросли уровни лакгобацилл и бифидобактерий. На второй срок наблюдения (группа Шб) количественные и качественные показатели исследованных представителей кишечной микрофлоры не отличались от таковых у интакгных животных.

Из параллельно исследованных при этом показателей функциональной активности макрофагов выявлено значительное усиление начальной стадии фагоцитоза - количество метки составляло

18527 ± 987 имя/мин (р<0.05), в то время как в ГТМ интактных крыс, получивших амбеи, зарегистрировано снижение активности кислой ^юсфатазы (р<0.05).

Таким образом, применение амбена коррегировало чикроэкологические нарушения в кишечнике, вызванные введением ампиокса. При анализе механизма действия амбена было обнаружено его многофакторное действие:

1. Стимуляция бифидо- и лактофлоры.

2. Ингибиторное действие амбена на протес;штическун? акт;износи» УСЛОВНПТТЯГОГСШШХ микрооргшшзмов, что впоследствии было под гиерждсно прямыми экспериментами in vitro.

3. Снижение в макрофагах активности лизосомного фермента -кислой фосфатазы.

4. Усиление функции захвата антигена, сниженной под влиянием ампиокса.

5. Количественное содержание кате псина Д в фаголизосомах перитонеальных макрофагов от животных с ампиоксовым дисбактериозом доходит до уровня интактшлх.

5.3.2. Экспериментальное исследование ростстимулиругощей активности бифидобактерий, лактобацилл и эшерихий РНК-азой и Памба.

Наиболее распространенными способами лечения нарушений кишечной микроэкологии, возникающих после тех или иных воздействий или применешы химиотерапевтических препаратов являются использование эубиотиков, селективная деконтаминащм. В первом случае необходимый эффект достигается за счет бактериальных препаратов из представителей индигенной или транзиторной микрофлоры, обладающих антагонистическим действием в о ( ношении условнопатогенных бактерий, и стимулирующих неспецифическую резистентность и иммунитет макроорганизма (Гончарова Г.И. и др., 1988, Поспелова В.В. и др., 1988). При селективной деконтаминации повышение колонизационной резистентности происходит в результате использования антибиотиков, подавляющих развитие аэробной части микрофлоры, среди которой наибольшее число составляют условнопатогенные бактерии (Van der Waaij D., 1984).

Наряду с этим в настоящее время получает развитие одно из оригинальных направлений в коррекции нарушений микробной экологии кишечника - селективная стимуляция представителей нормальной

микрофлоры (Mitsuoka Т. et al, 1987; Tanaka R. et al, 1983; Terada et al, 1992).

Мы изучили действие препаратов биназа (РНК-аза Bacillus intermedius) и Памба на рост бифидобактерий, лактобапилл, кишечных палочек и возможность коррекции микроэкологических нарушений кишечника у детей одним из них (Памба).

Прирост культуры бифидобактерий после 20 час. роста увеличивался под влиянием РНК-азы на 20-43% и зависел от дозы препарата и штамма бифидобактерий. Субминимальная концентрация биназы - 0,0001 мкг/мл не давала эффекта. Доза 0.001 мкг/мл оказывала небольшую стимуляцию

- на 5-10%. При увеличении концентрации биназы от 0.001 до 0.1 мкг/мл наблюдался прирост разной степени (по оптической плотности) всех трех штаммов бифидобактерий, который при повышении дозы до 1 мкг/мл начинал снижаться.

Оптимум стимуляции РНК-азой B.intermedius 3-х тест-штаммов L.fermentum после 5 час. роста составлял 15-35%, при этом эффект зависел как от штамма, так и от дозы. Так, биназа больше всего стимулировала рост L.fermentum ГИСК 39 - на 35%, меньше всего L.fermentum АТСС 9338

- на 15%. Для штамма АТСС 2953 увеличение прироста культуры было строго дозозависимым и повышалось с увеличением концентрации препарата. Для двух других штаммов четкой корреляции не выявлено. В целом стимуляцию вызывали очень низкие дозы биназы. Через 5 час. оптимальная стимуляция биназой роста E.coli М17 (штамм препарата -эубиотика колибакгерина) отмечена на 32% (дозы 0.1 мкг/мл - 0.01 мкг/мл), а Е coli 083 №19 - на 54% в дозе 0.001 мкг/мл.

Препарат Памба также оказывает стимулирующее влияние на рост штаммов бифидобактерий, лактобацилл, кишечных палочек в системе in vitro.

Через 18 час. культивирования отмечено увеличение культуральной массы штамма B.bifldum JIBA-3 на 40.3% при концентрации препарата 1 мг/мл (рис.10).

Памба в той же дозе - 1 мг/мл стимулировал рост L.casei ГИСК 37 на 42.9% через 10.5 час. и L.fermentum - на 28.6%.

Из двух испытанных доз препарата - 0.02 мг/мл и 0.2 мг/мл оптимальная ростстимулирующая активность в отношении E.coli выявлена на дозу 0.02 мг/мл через 5 час. - штамма М17 - на 22.2% и штамма К12 Нв101 - на 34.2% (табл.9). Кроме тохх> эта концентрация Памба способствовала более быстрому выходу E.coli Ml 7 на стационарную фазу роста по сравнению с контролем.

0,8 бд

опыт

КОНТРОЛЬ

18 ЧМ

РисЛО Влияние памбд нарост в.ышит лба-3 после {в часов культивирования

ШКАЛА: 0,8 БД ОПТИЧЕСКОЙ ПЛОТНОСТИ

Таблица 9

Влияние Памба на рост различных штаммов E.coli.

Доза Памба _ в мг/мл

E.coli Ml7

Стимуляция, %

£соЛК12НЬ101

34.2

33.3

0.02 0.2

22.2

8.3

5.3.3. Клиническое применение Памба для лечения детей с дисбактериозом кишечника.

Как показано в главах 5.3.1. и 5.3.2. в эксперименте на животных и in vitro показаны несколько точек приложения действия Памба: стимуляция роста бифидобактерий, лактобациял, эшерихий, активация функциональной активности макрофагов, снижение ПА условно-патогенных бактерий. Все это способствовало коррекции микроэкологических нарушений в кишечнике после применения ампиокса, Кроме того, в опытах in vitro с использованием в качестве субстрата щелочного гемоглобина на модели известных микроорганизмов-продуцентов протеолитических ферментов {Proteus vulgaris 382 и Pseudomonas aeruginosa АТСС 10145) установлена способность Памба ингибировать синтез этих энзимов. Ингибиция носила дозозависимый характер и была максимальной при концентрации 4 мг/мл. Все это послужило основанием для испытания Памба для коррекции микроэкологических нарушений в педиатрической практике.

Памба, разрешенный к применению для лечения панкреатитов и как антифибринолитическое средство, был испытан в детских инфекционных больницах №1 и №5 г. Москвы. Под наблюдением находилось 77 детей в возрасте от I мес. до 2-х лет. У всех детей на основании микробиологического исследования найдены дисбиотические изменения в микрофлоре толстого кишечника. Сдвиги в микрофлоре сопутствовали острым или затяжным диареям, по поводу которых дети получали антибактериальные препараты (полимиксин, генгамицин, левомицетин, канамицин).

Применение Памба в возрастных дозировках в течение 5-7 дней приводило к клиническому улучшению, что сопровождалось положительной динамикой в изменении количественного и качественного состава микрофлоры:

Как видно из табл.10, среднее число бифидобактерий в фекалиях детей до лечения Памбой составило 3.26 ± 0.32 lg КОЕ/г. После курса лечения уровень бифидобактерий увеличился на 1.32 lg КОЕ/г. Хотя г

катамнезе исследование проведено у 11 детей, оно выявило дальнейшее повышение количества бифилобактерий до 5.7 ± 0.48 lg КОЕ/г (р<0.001). Число лактобапилл за срок лечения также выросло на 1 lg (р<0.05) и увеличилось до lg 8.0 в катамнезе (р<0.05). Что касается E.coli, то Памба заметно стимулировала in vivo рост и злого микроорганизма (на 1.6 lg КОЕ/г). 1аким образом, в результате приема Памба возрастало число бифилобактерий, лактобапилл и кишечных палочек в толстом отделе кишечника детей (р< 0.05 для каждой ipymibi микроорганизмов). Более детальный анализ выявил что гтркмспсшшй препарат стимулировал нифидобактерии у »юимнего числа Сольных, чем лактобациллы и кишечные палочки (у 74.6; 57.4; и 50% детей соответственно). В то же время в контрольной группе детей, где для лечения применяли сорбенты, колострол, стимуляция указанных групп микроорганизмов наблюдалась у 30, 26 и 30% детей соотвественно (рис.11). В опытной группе увеличение количества Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp., E coli на 1-1.5 lg KOE/r отмечено примерно у одинакового числа детей, в то время как стимуляция на 2 и более lg КОЕ/г бифилобактерий произошла у 53% детей, а эшерихий и лактобацилл - только у 30 и 34% соответственно.

Таблица 10.

Состав микрофлоры фекалий детей после применения Памба

Группы Количественное содержание в lg КОЕ/г

бактерий до лечения 1 после лечения | в катамнезе

Bifidobacterium spp. 3.26 ± 0.32 4.58 ± 0.35 5.70 ± 0.48

п=49 п=50 п=11

Lactobacillus spp. 6.38 ± 0.27 7.34 + 0.18 8.00 ± 0.24

п=43 п=46 ггЧО

Escherichia coli 6.70 ± 0.41 S.30 i 0.22 7.9 ± 0.42

п=46 п=47 п=11

Enterobacteriaceae, 6.55 ± 0.31 4.87 ± 0.46 4.10 ± 1.34

Staphylococcus spp. ___ п=48 п=48 п=11

Однократный курс применения Памба вызвал снижение общего уровня условнопатогенных бактерий, среди которых регистрировались энтеробактер, цитробактер, протеи, клебсиеллы и другие микроорганизмы и их ассоциации, на 1.9 № (р<0.05). В тех случаях, где в микрофлоре фекалий регистрировались гемолитические кишечные палочки в 100%, после лечения у этих же больных их процент заметно

E. coli

Bifidobacterium spp. опытная группа

Lactobacillus spp.

контрольная группа

3 — увеличение

|////1 - снижение

- без изменений

I .л J

Рис.11 Изменения в содержании представителей резидентной микрофлоры толстого кишечника при лечении памба

снижался. В подавляющем большинстве случаев происходило снижение количества основных представителей родов I'.nterobacteriaccae п Staphylococcus spp. (у 90% детей), в то время как п контрольной группе - в 44.4%.

Таким образом, РНКаза и Памба in vitro стимулируют рост бифилобактерий, лактобаиилл и кишечных палочек. Подобный эффект Памба оказал in vivo п организме лете» с дисбикгериозом кишечника.

У детей бифидофлора занимает доминирующее иоло~1>иш> '-ре.'!:; ДРУПЕ IIpCUt-iiumiejieh нормялыгой МЖрОфлорЫ. полому понятно, что сс снижение значительно угнетает КР. Известно, что применение эубиотиков из бифидобактерий играет положительную роль, т.к. подавляет условнопатогенную микрофлору, способствует улучшению пищеварения, повышению общей резистентности организма. Собственная бифидофлора в этих случаях стимулируется, по-видимому, вторично, после создания благоприятных экологических условий в кишечнике. Памба, являясь метаболическим субстратом для некоторых бактерий стимулирует рост индигенных бифидобактерий, лактобаиилл, кишечных палочек, способствуя более быстрому восстановлению собственной резидентной микрофлоры.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что микроэкологические нарушения, вызванные различными факторами - антибиотиками, кратковременным юлодапием, кровопотерей, имеют как общие закономерности в своем проявлении -увеличение количества и спектра условно! iaioiенных бактерий, снижение числа бифидобактерий, отклонение от нормального содержания лактобаиилл, так и специфические особенности - увеличение популяции лактобацилл в толстой кишке, транслокация бактерий из кишечника в мезентериальные лимфатические узлы и внутренние органы при лисбактсриозе после кровопотери, длительное пребывание и кишечнике индикаторных штаммов стафилококков при антибиотиковом дисбактериозе.

2. На степень снижения колонизационной резистентности оказывает влияние состояние клеток мононуклеарной фагоцитирующей системы: при активации функций макрофагов колонизационная резистентность подавляется меньше, как это наблюдается при дисбактериозе после кратковременного голодания.

3. Показано, что к патогенетическим механизмам развития микроэкологических нарушений относятся селекция штаммов

условнопатогенных бактерий с высокой адгезивной и протеолитической способностью, изменения рецептивных свойств эпителиальных клеток кишечника.

4. Впервые установлена взаимосвязь между увеличением в толстой кишке представителей условнопатогенных бактерий различных таксономических групп и высоким уровнем протеолитической активности супернатанта фекалий, свидетельствующая о нарушении микробной экологии кишечного тракта.

5. Фибронектин является рецептором для лакгобацилл на эпителиальных клетках: к нему прикрепляется 88% исследованных штаммов. Помимо этого, связывание возможно за счет лектинов: к конканавалину А прикрепляется 54% штаммов.

Ь. Выявлены межвидовые и межштаммовыс различия в прилипании лакгобацилл к энтерошггам и колоноиитам крыс в системе in vitro. Установлена большая адгезивносгь лакгобацилл к колоноцитам по сравнению с эктероцитами, независимая от видовой принадлежности штаммов.

7. Лакгобацнллы, входящие в состав эубиотиков, стимулируют неспецифическую и специфическую резистентность организма хозяина: ускоряют дифферениировку и миграцию энтероцитов в системе крипта-ворсинка, усиливают клеточный ответ, стимулируют функциональную активность макрофагов.

8. Экспериментально обосновано применение пара(аминометил)бензой-ной кислоты (Памба) для коррекции микроэкологических нарушений, в основе которой лежит подавление протеолитической активности условнопатогенных бактерий и стимуляция фагоцитарной функции макрофагов с повышением уровня катепсина Д в них. Выявлено ростстимулирузощее действие Памба в отношении бифидобактерий, лакгобацилл, эшерихий.

9. В ограниченных клинических испытаниях показана эффективность применения Памба в детской клинике для лечения дисбакгериоза кишечника.

10. Экспериментально обосновано использование различных энтеросор-бентов для коррекции микроэкологических нарушений в кишечнике в зависимости от спектра преобладающих в биоценозе условнопатогенных бактерий.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1.1 орская ü.M., |Ча\апа O.ß.l Шусчрова Н.М. и .i;\ Ьстестиешиш клеточная реактивность к лактобапиллам у шпактныч животных // ЯС.микробиол.г 1981.-№5.-С. 18-21.

2j4axana О. HL 1 орская ü.M., Рубан С.З. Микробиологические и иммунологические основы гнотобиологии. М. Мединина, 1982. ЧОлташев Л.Ю.. {Чачава О.B.t,Горская Н.М. и лр. Слизистая оболочка кишки крыс-шоюоионтов при введении лактобанилл // Архив анат., гистологии, эмбриологии,-1982.-№7.-С.5-9.

4iChakhavr-i O.V{, Gorskaya ü.M. G notubiulufeical ic.seaiui of ihc iiucidciion between intestinal microflora and host organism // Abs. Syin. "Stand, und Perspektiven der Gastrointestinalen Microekologia." Potsdam,DDR. 1984.-P.34. 5.Горская ü.M., 1Чахава О-В), Jlciiuep X.II, и др. Лактобаниллы как источник биологически активных вешеств, влияющих на резистентность организма к микробам // Сб. Химия и биология иммунорегуляторов.-Рига, 1985.-С.122-129.

б.Зайцева Л.Г., Хасман Э.Л., Горская ü.M., Особенности фагоцитарной активности клеток перитонеального экссудата при нероралыюм и внутрибрюшинном нвелении лактобанилл. // Тезисы юкл. YII1 Межи петит. науч. конф. "Факторы кле точного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях.' Челябинск, 1986.-С. ¿5-56.

7.Лапчинская A.B., Шендеров Ь.А., Горская ü.M. Количественные и качественные изменения микрофлоры кишечника крыс под влиянием эритромицина и цефалекеина. /'/ Тезисы докл. 1-ой Всесоюзи. конф. "Актуальные проблемы нозокомиалышх инфекций и лекарственной устойчивости микроорганизмов. М.1986.-С.31-32.

8.Горская ü.M., Юлдашев Л.Ю. Сравнительное исследование нерсистешши лактобанилл и холерных вибрионов па гното-биологической модели. // Сб. "Тсорстсгчсские и практические проблемы гнотобиологии". 198b.-С. I(i2-I6d.

9.Зайцева Л.Г., Горская ü.M. Усиление фаюцшлрпои активноеiи клеюк мононуклеарной фагоцитирующей системы при пероральном введении лактобанилл. // Антибиотики и мед. биотехнология. -198Ь.-№ .-С. 091694.

Ю.Ланчинская A.B., Шендеров Ь.А..|Чахапа Р.в1, Горская ü.M. и тр. Изменение микрофлоры толстой кишки при оральном ивечении цефалекеина и эритромицина. // Антиб. и мед. биотехнология. -1987. №3,- С. 206-210.

П.Горская ü.M., Латинская A.B., |Чахава О.В.( и др. Лщезннная способность представителей кишечной микрофлоры при непрерывном и дробном оральном введении цефалекеина и эритромицина. //. Антиб. и мед. биотехнология. -1987.-№3. -С. 210-213.

12.Манохина И.М., Горская ü.M. Сравнительная оценка адгезии некоторых энтеробактерий к различным зонам тонкой кишки крыс. //

Матер. Всес. семинара "Колонизационная резистентность и химиотсра иевтические антибактериальные препараты. М. 1988, ч. II, С. 56-57. 13.Лизько Н.Н., Наумов А.А., Горская Е.М. Влияние голодания ш микрофлору тонкой и толстой кишки крыс и ее адгезивные свойства.// Там же., ч.1. -С.107-108.

И.Горская Е.М. Адгезия микробов к эпителиальным клеткам кишечника // Антибиотики и микроэкология человека и животных. Труды ВНШ1А М. 1988. -С. 79-82.

15.Горская Е.М., Манохина И.М., Ланчинская А.В. и др. Адгезивные v колонизирующие свойства бактерий при экспериментальном дисбакте-риозе кишечника. // Тезисы XYTII стлзла Всесоюзн. общества энид. микроб, и паразитологов им. И.И. Мечникова. М. -1989. -С. 21-22.

16.Горская Е.М. Гнотобиологические исследования в определена колонизационной резистентности кишечника. // Антиб. и мел биотехнология. -1989, т. 34.-№8.-С. 601-606.

17.Горская Е.М. Повышение неснецифической резистентности макроорганизма при пероральном применении эубиотиков и: лактобанилл. // Иммунологические препараты. Сб. науч. трудо! МНИИЭМ. 1989. -С. 181-185.

IS.Bondarcnko V.M., Gorskaya Е.М. The initiation of the development ol bacterial focus of infection in digestive tract. // Abstr. X Intern. Symp. or Gnotobiology, Leiden, 1990,- P.18.

í9.Naumov A.A., Gorskaya E.M., Lizko N.N. Changes of the rats intestina microflora after food deprivation. // Abs. Intern. Symp. "Current Problems oi Medical Gnotobiology and Orogastrointestinal Microflora". Rostok, Germany 1990,- P. 56.

20.Gorskaya E.M. Adhesive and colonization activity of intestinal microflora. // Abst. Intern. Symp. "Current Problems of Gnotobiology and Orogastrointestina Microflora". Rostok, Germany. 1990.- P. 14.

21.Горская E.M., Наумов A.A., Лизько H.H. Изменение кишечной микрофлоры при воздействии голодания. // Антибиотики и колонизационная резистентность. Груды ВНИИА. выи. XIX, 1990,- С. 112-117.

22.Gorskaya Ь'.М., Lizko N.N., Lentznier А.А. et al. Perspectivas en к utilización de nuevas cepas de Lactobacillus en la practica medica. Acapulco. Guerrero, Mexica, 1991.- P.35

23.Gorskaya E.M., Lenzner A.A., Lizko. N.N. et al. Efficiency of new Lactobacillus strains in medical practice. // Idem. 1991.- P.5-4.

24.Горская Е.М. Теоретические и прикладные аспекты изучения адгезии бактерий к слизистой оболочке пищеварительного тракта. // Сб МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского "Медицинские аспекты микробной экологии".М.-1991.-С.41-47.

>5.Ликачеиа А.Ю., Горская Е.М., Соколова К.Я. Адгезия лакгобацилл к различным типам эпителиальных клеток слизистой оболочки кишечникг // Сб. МНИИЭМ им.Г.Н.Габричевского "Мел аспекты микробной экологии". 1991.-С.47-52.

б.Зайцева Л.Г., Васильева Е.И., Горская Е.М. и др. Функциональная ктивность макрофагов при экспериментальных дисбактериозах ишечника крыс. // Ж. микробиол. -1991.- №8.- С. 68-71. 7.Горская Е.М., Алматамбетов К.Х. Аугомикрофлора кишечника в остреашшационном периоде после острой кровопотери у крыс. // Смикробиол. -1991.- №5.- С. 21-24.

5.Горская Е.М., Ленцнер Х.П., Ленцнер A.A. и др. Адгезивные свойства актерий кишечного происхождения. //Ж.микробиол.-1991.- №10,- С. 5-

Р.Алмагамбетов К.Х., Горская Е.М. Транслокация кишечной ихрофлоры и ti /К. микрооиол. -1>>iJvriu.- w. 7у.

3.Бондаренко В.М., Горская U.M., Новые подходы к модслтгрсЕашпо, иагностике и коррекции дисбактериозов кишечника. // Тезисы докл. Y1 серос. съезда эпид., микроб, и паразитологов.М.-1991,т.И. С. 89-90. I.Алматамбетов К.Х., Горская Е.М., Бондаренко В.М., Профилактика эанслокации кишечной микрофлоры после выведения организма из ¡рминального состояния. //Ж. микробиол. -1992.- №5-6.- С. 11-14. ¿.Горская Е.М., Бондаренко В.М. и др. "Применение Памба в качеотве эмулятора роста бифидобактерий, лактобацилл, кишечных яало-ж".//3аявка на изобретение. Приоритетная справка №052877, 1993. !.Мазанкова Л.Н., Горская Е.М., Воротынцсва Н.В. и др. "Срсдстао для гчения дисбактериозов кишечника". // Патент №2000784, 1993. (.Мазанкова Л.Н., Воротынцева Н.В., Горская Е.М. и др. Влияние 1ра(амшю-метил)бензойной кислоты на микрофлору кишечника у детей острыми кишечными инфекциями. // Педиатрия.- 1993.- №2. -С.65-67, ¡.Горская Е.М., Мазанкова Л.Н., Шогенова Ю.С. и др. азеинолитическая активность фекалий как показатель нарушения икроэкологии толстой кишки при гастроэнтерологической патологии. //

6. "Заболевания органов пищеварения у детей. Матер, научно-практич. >нф. Саратов. 1993. -С.139.

¡.Мазанкова Л.Н., Горская Е.М. Селективная стимуляцш! пред-•авителей нормальной микрофлоры при микроэкологических рушениях у детей. // Сб. "Заболевания органов пищеварения у детей, [атер. научно-практич. конф. Саратов. 1993. -С. 153-154. '.Горелов A.B., Горская Е.М., Воротынцева Н.В. и др. Адгезивная ливность некоторых энтеробакгерий и лактобацилл к муцину. // Сб. 1учных трудов ЦНИИЭ "Кишечные инфекции". М. -1993. -С. 17-23. ¡.Горская Е.М., Лихачева А.Ю., Горелов A.B. и др. Связывание истобацилл с некоторыми растворимыми белками и лектинами // :.микробиол. -1994,- №1 ~ С. 5-8.

».Колпаков А.И., Горская Е.М., Куприянова Ф.Г. и др. "Способ изучения биомассы бактерий". // Патент на изобретение №2007450, 94.

1.Горская Е.М., Зайцева Л.Г., Волосникова И.В. Экспериментальные следования некоторых механизмов действия ингибитора протеоли-ческих ферментов - амбена. // Медицинские аспекты микробной олопш. М. -1993/94, вып. 7/8, ч.1. С. 121-125.

Тодписано к печати 30.11.94 Заказ 201 Объем 3,25 п.л. Формат 60x84 1/16 Тираж 150 ТОО "Нерей". ВНИРО. 107140, Москва, В. Красносельская, 17

Информация о работе

Горская, Елена Михайловна
доктора медицинских наук
Москва, 1994
ВАК 03.00.07

Автореферат

Похожие работы