Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы модифицирующего действия пептидогликанов на радиационное поражение лимфоцитов

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы модифицирующего действия пептидогликанов на радиационное поражение лимфоцитов"

‘ НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ, ОНКОЛОГІЇ І РАДІОБІОЛОГІЇ ім. Р. Є. КАВЕЦЬКОГО

На правах рукопису

БЛЮМ ІРИНА ОЛЕКСАНДРІВНА

Механізми модифікуючої д:? пептидогліканів на радіаційне ураження лімфоциті в

03.00.01 - радіобіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук

КИЇВ - 1994

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі біохімії Київського університету ім. Тараса Шевченка

Науковий керівник: доктор біологічних наук,

професор Цудзевич Б. О.

Офіційні опоненти: доктор медичних наук,

Савцова З.Д.

кандидат біологічних наук, ' Лукашова Р.Г.

Провідна установа: Український державний медичний

університет ім. академіка О. О. Богомольця, Київ

Захист^відбудеться " 1994 р.

о /У—годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 016.38.02. в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р. Є. Кавецького НАН України (252022,

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці 1ЕІЮР НАН України, Київ 22, вул. Васильківська, 45

Автореферат розісланий .1994

Р-

Вчений секретар .

спеціалізованої вченої ради, АГ.Й.Лапрснчук канд. біол. наук и.и

АКТУАЛЬНІСТЬ ПРОБЛЕМИ. Незважаючи на велику кількість фактичного матеріалу, радіобіологічна наука ще не отримала однозначну відповідь на питання про ведучі механізми уражаючої дії радіації на окремі типи клітин і тим більше на багатоклітинний організм як єдине ціле. Відомо, що одним із важливих факторів, які визначають закономірності радіаційного ураження організму є радіочутливість тканин, органів та систем, важливих для виживання організму [Бонд та 1н., 1971; Кудряшов 1 Беренфельд, 1982; Ярмоненко, 1984]. За морфологічними змінами найбільш радіочутливими є органи кровотворення. Ураження кісткового мозку, тимусу, селезінки, лімфатичних вузлів є одним Із важливих проявів гострого променевого захворювання [Петров 1 Зарецька, 1970].

Значні морфологічні та функціональні порушення спостерігаються у всіх органах кровотворення, що. в свою чергу, призводить до пору-шнь Імунних функцій організму. При опроміненні пригнічення імунітету в організмі являє собою складний багатоступіньчастий процес. Виходячи з цього, цілком обгрунтованими видаються схеми радіаційної профілактики та терапії, які базуються на хімічній корекції окремих ланцюгів Імунної системи [Гуськова і Байсоголов, 1970; Ільїн та ін., 1975; Суворов 1 Шашков. 1975]. Роботи у цьому напрямку в ряді

випадків пов'язані з пошуком нових ефективних захисних та корегуючих засобів, здатних цілеспрямовано впливати на функції імунокомпе-тованих клітин.

Серед речовин, які потенційно здатні проявляти модифікуючу ДІЮ ■ у відношенні до тих чи інших типів клітин Імунної системи, особливу увагу привертають Імуномодулюючі компоненти природного походження - бактеріальні ліпополісахариди (ЛПС) та пептидоглікани (ПГ). Зуло встановлено, що ЛПС мають виражену протиопромінювальну дію [Mlsustova et al., 1984; Richardson & Elving. 1987]. Аналогічні

зластивості ПГ майже не вивчались, хоча вони проявляють мітогенну га поліклональну дію на лімфоцити [Вершигора і Позур. 1986], що 1 jae підставу передбачати наявність таких властивостей. Однак вив-іення шляхів реалізації протиопромінювальної дії природних Імуномо-іуляторів зустрічає труднощі у зв’язку з тим, що відсутня інформа- . Ця про первинні механізми Ініціювання Імуномодулюючої активності дах речовин.

Здатність екзогенних імуномодуляторів Індукувати імунну відпо-

відь визначається їх фізико-хімічними властивостями, які дають можливість активувати імунокомпетовані клітини, що 1 проявляється у стимулюванні проліферації В- 1 T-лімфоцитів [Morrison & Ulevlch, 1978]. Критичним етапом активації клітин. Імунної системи ЛПС 1 ПГ є їх дія на плазматичні мембрани. ПГ 1 ЛПС специфічно зв’язуються з одним 1 тим зке білком на поверхні В-лІмфоцитІв [Dzlarskl, 1991]. Ряд досліджень демонструє принципову роль .циклічних нуклеотидів [Vazgerz et al., 1991] та іонів Са2+ [Trotter & Quitana, 1981] як внутрішньоклітинних посередників сигналів. ЩО Індукують Імунні ВІД7

ПОВІДІ. '

Показано, що ЛПС індукує накопичення Інозитольних фосфатів у моноцитах, тромбоцитах 1 лімфоцитах крові [Вікторов та 1н., 1988;

Kozak et al., 1989]. Як наслідок. ЛПС промотують транслокацію про-теїнкінази С із розчинної в нерозчинну фракцію В-лімфоцит1в та активують її [Bosca & Dlaz-Guerra, 1988], що 1 призводить до проліферації клітин даного типу [Xu et al., 1990]. Все ж механізм дії ПГ на імунокомпетовані клітини поки-що не встановлений. Відомо лише, що мурамілдипептид, синтетичний аналог ПГ, може індукувати обмін фосфоінозитидів у лімфоцитах [Kozak et al., 1989]. Тому випробування ПГ на наявність у них модифікуючих дію опромінення властивостей, так як і вивчення біохімічних механізмів реалізації їх дії на Т- 1 В-лімфоцити у нормі та при опроміненні, становить суттєвий інтерес. Це дає підставу сформулювати основну мету і задачі досліджень.

Мета 1 задачі дослідження. Метою роботи було з’ясування механізмів протиопромінювальної дії пептидогліканів на основі аналізу взаємозв’язків між особливостями їх структури та імуномодулюючою активністю.

У конкретні задачі роботи входило: .

1. Для вивчення модифікуючої дії та особливостей складу одержати ПГ із клітинних стінок Staphylococcus aureus 1 Brevibacterium flavvm.

2. ■ Оцінити вплив ПГ на особливості Імуномодулюючої активності, по-

ліклональних властивостей та активацію макрофагів.

3. Вивчити закономірності впливу ПГ різного складу на інтенсивність

синтезу ДНК in vivo у кістковому мозку, тимусі та селезінці ми-

• шей. .

4. З'ясувати відмінності мітогенних відповідей на клітинах тимусу

та селезінки у опромінених мишей та при дії ПГ.

5. Вивчити особливості впливу опромінення 1 ПГ на транслокацію' про-

- з -

теїнкінази Су спленоцитах мишей.

6. Дослідити рівні циклічних нуклєотидів в селезінці опромінених

мишей та на фоні використання ПГ. -

7. Визначити вплив ПГ на фрагментацію ДНК спленоцитів у нормі та при опроміненні.

Наукова новизна роботи. Вперше одержаний ПГ із Br. flavwn 1 вперше продемонстрована наявність модифікуючих властивостей у ПГ із S. aureus 1 Br. flavum за променевого ураження. Показано, що в основі вказаних властивостей ПГ лежить їх здатність ефективно впливати на різні ланки імунної системи мишей. Визначені закономірності впливу ПГ на Інтенсивність синтезу ДНК in vivo у кістковому мозку, тимусі та селезінці мишей. Вперше встановлено, що реалізація проти-опромінювальної дії ПГ здійснюється за участю цАМФ-залежної системи фосфорилювання та протеїнкінази С. Вперше показано взаємозв’язок мін особливостями'.структури ПГ і особливостями впливу цих полімерів на ефекторні системи імунокомпетованих клітин.

Запропоновано можливий механізм реалізації модифікуючої дії ПГ шляхом специфічної регуляції функціональної активності різних типів клітин імунної системи за участю систем вторинних посередників 1 регуляції в такий спосіб активності Саг+, Mg2*-залежної ендонуклеази.

Теоретичне 1 практичне значення роботи. Продемонстрована перспективність використання ПГ бактерій як засобів, що модифікують дію опромінення. Розроблені способи посилення та пролонгування протиоп-ромінювального ефекту ПГ шляхом їх комбінованого використання із відомим радіопротектором - серотоніном. Отримані дані сприяють більш глибокому розумінню механізмів регуляції функціональної активності лімфоцитів за участю ПГ в Інтактному організмі та при дії опромінення, що дає практичний внесок у розробку стратегії підвищення радіорезистентності клітин за допомогою хімічних засобів.

Запропонований підхід до використання Вг. flavum як джерела ПГ, що може знайти широке практичне застосування. Це може бути покладене в основу промислових способів одержання ПГ в умовах розширення їх використання в якості мітогенів, Імуноад’ювантів і т.д.

Апробація роботи. Матеріали дисертації були представлені 1 повідомлені на X Всесоюзному симпозіумі "Структура та функції клітинного ядра" (Гродно, 1990), на І з’їзді імунологів Білорусі (Мінськ. 1990).

Публікації. По темі дисертації опубліковано 6 робіт.

Об'єм 1 структура..дисертації. Дисертаційна робота складається

з вступу, огляду літератури, матеріалів 1 методів дослідження, результатів роботи та їх обговорення, заключення, висновків, списку літератури, що складається з 189 робіт. Дисертація викладена на 133 сторінках, має у своєму складі 22 рисунки, 13 таблиць.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ . В дослідах використовували безпорідних білих мишей-самців ма-

сою 20 - 22 г, мишей лінії СВА, C57BL та гібридів (CBAxC57BL) Fj. Тварин опромінювали на установці РУМ-17 в дозі 0,236 Кл/кг за умов: фільтри - 0,3 мм Си. 0,1 мм А1, напруга -190 кВ. сила струму 15 мА, потужність дози у повітрі 2x1О4 А/кг, відстань до поверхні шкіри тварин 50 см.

. У роботі для отримання ПГ використовували культуру S. aureus

(иітамм 3272) 1 Br. f lavum (штам sp22). ПГ одержували за методом Рашба (1976). Токсичність полімерів оцінювали за методом Біленького (1963). Радіопротекторні властивості речовин визначали за методом стимуляції ендогенного утворення колоній у селезінці [Чертков і Гуревич, 1984]. Для оцінки протиопромінювальної дії ПГ (1000 мкг/тва-рину) і серотоніну (15 мг/кг) використовували мишей лінії СВА, котрих опромінювали за вищеназваних умов. Пептидоглікани у цій серії досліджень вводили в дозі 1000 мкг/тварину за 24 год до . опромінення, серотонін - за 15 хв до опромінення. Величину протиопроміню-вального ефекту визначали за виживанням тварин на протязі ЗО днів після опромінення. '

Імунологічну реактивність тестували за методом [Jerne et al., 1963]. Вплив ПГ Із S. aureus I Br. flavum на бактерицидну активність макрофагів вивчали за допомогою НСТ-тесту [Грачева, 1984]. Для вивчення впливу ПГ на інтенсивність синтезу ДНК in vivo їх вводили внутрішньоочеревино в дозах 100 1 10000 мкг/тварину. Дослідження мітогенної дії здійснювали за допомогою реакції бласттранс-формації. .

Активність протеїнкінази С досліджували за методом Кіккави [Kikkava et al., 1986]. Фрагментацію ДНК вивчали за методом Газієва [Газиев, 1976]. Вивчення вмісту циклічних нуклеотидів проводили на рідинно-сцинтиляційному лічильнику SL-4000 "Intertechique". Статистичну обробку результатів проводили загальноприйнятими методами варіаційної статистики [Кокунін, 19753.

- 5 -

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ Хоча структура стафілококового ПГ досить добре вивчена, при роботі з новим штамом бактерій необхідна ідентифікація його амінокислотного складу. Це зумовлено значною внутрішньовидовою варіа-більністю містків, що зшивають цукропептидні одиниці [Вершигора і Позур, 1986]. В результаті наших досліджень було встановлено, що одержаний нами ПГ із стафілококу містив аланін, глютамінову кислоту, гліцин, лізин 1 серин, а із аміновуглеводнів - М-ацетилглюкоза-мін та Н-ацетилмурамову кислоту в еквімолярних кількостях. У кислотному гідролізаті були виявлені два аміновуглеводні - Н-ацетилг-люкозамін та М-ацетилмурамова кислота, - а також диамінопімелінова

■ Таблиця 1

Протиопромінювальна активність комбінації пептидогліканів Із серотоніном при опроміненні мишей лінії СВА

1 ' -■ і Умови введення 1 радіопротекторів 1 . г Кіль-тьі тварин І Середня тривалість життя тварин і - 1 Виживання, І % 1

І Контроль 20 1 7,4 0 1

І Серотонін, водний І розчин (за 15 хв і до опромінення) 20 1 10.7 28 1

і ПГ Із S. aureus І (1000 мкг/мишу за і 24 год до опромін.) І + серотонін (за 15 1 хв до опромінення) 15 1 12,6 60 І

І ЛГ Із Br. flavum 1 (1000 мкг/мишу за t 24 год до опромін.) І + серотонін (за 15 І хв до' опромінення) і ■ 15 1 » 12,7 73.3 1 і

кислота.

Раніше була продемонстрована здатність ПГ стимулювати утворення КОУ у кістковому мозку і селезінці мишей при опроміненні в суб-летальних дозах Шозур, 1983]. У наших дослідах спостерігалась ко-лонієстимулююча дія як ПГ із S. aureus так 1 у ПГ із Br. flauum. Більш виражений стимулюючий ефект спостерігався у разі використання ПГ Із Br. flauum у дозі 1000 мкг/тварину (40.6+2.1) у порівнянні з ПГ Із S. aureus у тій же дозі (35,3±2.3) (р<0.05).

Отримані дані по вивченню протиопромінювальн'их властивостей ПГ демонструють, що введення їх за 24 год до опромінення дає ефект більший у два рази в порівнянні із введенням за 15 хв до опромінення. Крім того, комбіноване використання серотоніну 1 ПГ збільшують протиопромінювальну дію останніх.

Враховуючи, що ПГ притаманні мітогєнні властивості 1 як наслідок вони можуть стимулювати синтез ДНК у різних тканинах, ми дослі-

Імп • хе .ІШ «р-даг*1000

Рис. 1. Зміна інтенсивності синтезу ДНК у селезінці мишей після введення ПГ Із Вг. /Іапап у дозах 100 мкг (крива а) і 1000 мкг (крива б) на тварину

Рис. 2. Зміна інтенсивності синтезу ДНК у селезінці мишей після введення ПГ Із S. aureus у дозах 100 мкг (крива а)

1 1000 мкг (крива б) на тварину

дали їх вплив на синтез ДНК In vivo. Із рисунків 1 та 2 видно, що ПГ можуть стимулювати Інтенсивність синтезу ДНК in vivo у селезінці мишей. Тому далі нам було цікаво дослідити здатність ПГ проявляти мітогенну дію на культурах клітин селезінки 1 тимусу інтактних та опромінених мишей. При концентрації 200 мкг/мл Індекс стимулювання для ПГ Із S. aureus дорівнює 22,8 а для ПГ Із Br. flavum 17,8. Різницю у стимулюванні, можливо, можна пояснити різною структурою стовбурних пептидів. .

. Наступні експерименти для уточнення їх мітогенної дії на лімфоцити були проведені на Ізольованих В- 1 7-клітинах селезінки. Показано. що культури В- 1 T-клітин відповідали збільшенням інтенсивності синтезу ДНК на дію ЛПС 1 ФГА.

Для потенціювання дії цихмітогенів ми використали форболми-

ристатацетат (ФМА), відомий як сильний мітоген Т- 1 В-лімфоцитів. ефекти якого можна Інгібувати поліміксином В - неспецифічним інгібітором протеїнкінази С. У наших дослідах ФМА не стимулював міто-генну відповідь ні Т- ні В-лімфоцитів, бо для індукції мітогенної відповіді лімфоцитів ФМА нербхідна підвищена концентрація Саг* у клітині. Але ж з іншого боку, комбінації ФГА+ФМА (Т-клітини) і ЛПС+ФМА (В-клітини) стимулювали Інтенсивність синтезу ДНК значніше ніж окремо взяті ФГА 1 ЛПС. Підсилення мітогенної відповіді лімфоцитів ми спостерігали і в разі комбінації ПГ та ФМА (рис.З 1 рис.4)

. Для вивчення можливих причин синергічної дії ПГ та ФМА на В- 1 Т-лІмфоцити селезінки на рівні субклітинних механізмів ми провели досліди, які вивчали дію поліміксину В на їх мітогенний ефект. Але ні в випадку В-клітин, ні в випадку Т-клітин поліміксин В не знімав

хГО

.-з

зо

24

18

12

гН

&

rh

4МА - ♦ . . + * + +

IirS.a.- • + • ф т + ^ .

ПГБгХ. - - * . + 4

Поліміксин В- - - - - - + .

Рис. з. Вплив поліміксину В (10 мкМ) на включення [3Н]-тим1ди-

ну у В-лімфоцити селезінки, стимульованих ПГ Із S.

aureus 1 Вг. flavwn (200 мкг/мл) і 1/чи 10 hr/мл ФМА

повністю синергічних ефектів ФМА 1 досліджуваних ПГ. Отримані результати вказують на деякі спільні механізми реалізації мітогенної дії ПГ 1 ЛПС за участю протеїнкінази С. ,

Приймаючи до уваги результати., що отримані при вивченні особливостей впливу ПГ на Інтенсивність синтезу in vivo і in vitro, а також особливостях прояву модифікуючих властивостей, ми вважали за необхідне дослідити ці особливості при дії опромінення, виявилось;

xl0"3vJ

90

Zi

18

К

■-*— |~Ь

rh

н-

rh

ФМА- ♦ - - ♦ ■ ♦ ♦ ♦

. ПГ S.a.- - 4 - ♦ - » •

ПГ Br.f.- - - 4 • - 4 - 4

Лолімікснн В-- - - - *4 4

Рис. 4. Вплив поліміксину В (10 мкМ) на включення [3Н] -тим 1 дії -ну у T-лімфоцити селезінки, стимульованих ПГ la S. aureus 1 Br. flavum (200 мкг/мл) 1/чи 10 нг/мл ФМА.

х 10’ 3

10

Т Г+1 t

і 2 3

ЛПС 4 4 4 4 4

ФМА - - - 4 4

Поп і М ІКСИН В * ~ * • 4

Рис. 5. Вплив ФМА 1 поліміксину В на мітогенну відповідь спле-ноцитів, виділених через 6 год після опромінення мишей: 1 - контроль; 2 - спленоцити. виділені через б

год після опромінення: з. 4, 5 - спленоцити. виділені через 6 год після опромінення.

6

що опромінення пригнічує мітогенну відповідь спленоцитів на ЛПС 1 КонА у всі строки після опромінення, а особливо, спленоцитів, виділених через 6 год після опромінення. Аналогічна закономірність зберігається 1 при введенні ПГ та їх комбінацій з серотоніном.. Комбінації ПГ з серотоніном забезпечують більш високі рівні мітогенних відповідей спленоцитів. У кожному із вище названих випадків введення ПГ in vivo забезпечує підвищення стійкості Т- 1 В-клітин до 1н-терфазної загибелі внаслідок їх мітогенної стимуляції.

Кон А 4 4 4 4 4

ФМА - . ш ' ш 4 4

Лолініксин В - - ...

Рис. 6. Вплив ФМА 1 по.ліміксину В на мітогенну відповідь спленоцитів, виділених через 6 год після опромінення мишей: 1 - контроль; 2 - спленоцити, виділені через 6 год після опромінення; 3, 4, 5 - спленоцити, виділені через 6 год після опромінення.

Враховуючі дані, що наведенвище, ми дослідили можливу роль протеїнкінази С в опосередкуванні протиопромінювальної дії ПГ на спленоцити. Нами вивчався вплив ФМА 1 поліміксину В на стимуляцію ЛПС мітогенної відповіді спленоцитів. що виділялись через 6 год

після опромінення 1 24 год після введення ПГ Із S. aureus (рис. 5) 1 стимуляцію КонА мітогенної відповіді спленоцитів. виділених через 6 год після опромінення 1 24 год після введення ПГ із Br. flavum (рис. 6). В обох експериментальних випадках можлива синергічна дія ФМА з ЛПС 1 КонА, відповідно, яка пригнічується одночасним внесенням у середовище Інкубації поліміксину В, ніж це мало місце в аналогічних дослідах при вивченні мітогенного ефекту даних ПГ на Т- 1 В-л1мфоцити селезінки мишей. ЦІ результати вказують на побічну участь протеїнкінази С в реалізації модифікуючої дії ПГ.

-G дослід -С контроль

Рис. 7. Залежність перерозподілу активності протеїнкінази С між*цитозольною (о) 1 мембранною (+) фракціями після внесення у середовище інкубації ЛПС до спленоцитів, виділених через б год після опромінення мишей, у часі.

Далі ми вивчали вплив ПГ на функціонування протеїнкінази С в лімфоїдних клітинах. При активації лімфоцитів форболовими ефірами 1 мітогенами відбувається транслокація протеїнкінази С Із цитозолю у мембрани. Оскільки для повної активації цього ферменту необхідні фосфоліпіди. така транслокація може являтися механізмом, що забезпечує екзогенну активацію протеїнкінази С. При вивченні перерозподілу активності протеїнкінази С між цитозолем 1 мембранною фракцією спленоцитів, стимульованих до мітогенної відповіді ПГ, нами було

відмічено збільшення активності протеїнкінази С у цитозолі через ЗС хв після внесення кожного Із них у середовище Інкубації. Через 150 хв спостерігалось збільшення активності протеїнкінази С у мембранній фракції.

Нами також вивчались закономірності перерозподілу активності протеїнкінази С мін цитозольною 1 мембранною фракціями спленоцитів мишей, виділених через 6 год після опромінення 1 стимуляції ЛПС (рис. 7) та впливу ПГ із S. aureus у часі (рис. 8). Як свідчать на-

рис. 8. Залежність перерозподілу активності протеїнкінази С мін Цитозольною w і мембранною фракціями після внесення у середовище інкубації ЛПС до спленоцитів. виділених через 6 год після опромінення мишей, в умовах модифікуючої дії ПГ із S. aureus у часі.

ведені дані, опромінення не змінює загального характеру залежності перерозподілу активності протеїнкінази С між двома фракціями у часі. Використання ПГ Із S. aureus забезпечує два ефекти на трансло-кацію ферменту. По-перше, у всі строки досліду із спленоцитами. отриманими через 6 год після опромінення, використання ПГ дозволяє одержати більш високий рівень активності протеїнкінази С в обох Фракціях в порівнянні з дослідами, проведеними на опромінених тва-

2,0

0,5

1.0

1.5

< і

-----.------.------.-----•——> ■ ■■ --------------►-#-+•

10 ЗО 60 90 120 150-хв 12 24 48 год

~ 13 ' . ; ринах. По-друге, використання ПГ Із S. aureus забезпечує більш високий рівень транслокації протеїнкінази С у мембранну фракцію.

Встановлено, що активація протеїнкінази С призводить до модуляції аденілатциклазної системи В-лІмфоцитІв, зміні вмісту циклічних нуклеотидів у лімфоїдних клітинах. При цьому відомо, що апоіі-тична загибель лімфоцитів може викликатись глюкокортикоїдами або агентами, що підвищують рівень внутрішньоклітинного цАМФ і. відповідно, цАМФ-залежної протеїнкіназної активності. Тому нами були

вивчені зміни вмісту цАМФ у клітинах селезінки мишей 1 вплив опромінення на цей процес (табл. 2). Встановлено, що обидва ПГ стимулю-

.. Таблиця 2

Концентрація цАМФ у лімфоїдних клітинах селезінки мишей після -опромінення та введення пептидогліканів (пмоль/107 клітин).

■ (М ± m, п = 3)

Умови прове- Час після опромінення (900 р), год

дення досліду

1 . 6 24 48 72

Контроль 24, 8 ± 3,1

Опромінення 24,8 ±3,4 20,3 +2; 9 10,6 ±1,2 13,8 ±1,8 5, 6 ±1.1*

ПГ S. aureus (1000 МКГ за 24 год до опромінення) 26,4 +1,9 37,9 ±3.6* 35.1 +5. 2 23,4 ±4.1 22,7+2.7

ПГ вг. fla-vum (1000 мкг за 24 год до опроменення) 27,1 ±2,8 33,4 ±3,9* 34,7 ±4,8 26,8 ±3,8 1.3 ±0,4*

Р<0,05

ють накопичення цАМФ в клітинах селезінки максимально через 24 і'48 год після введення. При використанні ПГ концентрації цАМФ у клітинах селезінки перевищують величини, отримані при опроміненні тварин без використання ПГ. Таким чином, при стимуляції синтезу ДНК ПГ

і?

'Г 80 І 70

S3

1 60

З

і 50 g.

f 40

І зо 20 10

ifi

+М-

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 II 12

+ ФМА + ПМВ

Рис. 9. Вплив ПГ на рівні фрагментації ДНК спленоцитів мишей:

1 - контроль; 2 - контроль після інкубації з ФМА; 3 -контроль з поліміксинсм В; 4, 7, 10 - клітини, виділені через 6 год після опромінення; 5, 8, 11 - клітини, виділені через 6 год після опромінення з попереднім . введенням ПГ Із S. aureus; 6, 9. 12 - клітини, виділе-

ні через 6 год після опромінення з попереднім введенням ПГ Із Br. /lavum;

відмічене підвищення рівнів цАМФ може відігравати важливу роль, а також приймати участь у опосередкуванні модифікуючої дії ПГ. що вивчались.

Враховуючи модифікуючі властивості ПГ і механізми опосередкування їх дії на лімфоцити, ми вивчили їх здатність виливати на фрагментацію ДНК у спленоцитах мишей (рис. 9). Са2*.Mg2"-залежна

ендонуклеаза - фермент, що опосередковує радіаційну загибель лімфоцитів - регулюється при участі системи вторинних посередників. Отримані результати свідчать про те, що рівень фрагментації ДНК у контролі становить Ш. Внесення ФМА достовірно не змінює цей показник. поліміксин В значно збільшує його. '

■ Спленоцити, виділені через 6 год після опромінення мишей, характеризуються 6655-ним рівнем фрагментаці ї ДНК. При введенні ПГ за 24 год до опромінення рівень фрагментації ДНК знижується у два рази. Це може пояснюватись активацією протеїнкінази С і пов’язані з

цим процесом змінами концентрації цАМФ, що логічно співпадає з отриманими результатами у нашій роботі.

Внесення у середовище Інкубації ФМА знижує рівень фрагментації ДНК на 57%. Звідси випливає, що протеїнкіназі с може належати тригерна роль у регуляції ендонуклеазної активності. -Ще більший ефект на зменшення фрагментації ДНК проявляється після його внесення у середовище інкубації спленоцитів. виділених через 6 год після опромінення в умовах використання ПГ. Поліміксин В вірогідно збільшує рівень фрагментації ДНК в спленовдтах опромінених тварин, а також спленоцитах опромінених тварин 1 введення досліджуваних ПГ.

Таким чином, отримані результати наглядно демонструють той факт, що протеїнкіназа С відіграє суттєву роль в опосередкуванні модифікуючої дії ПГ на спленоцити. у тому числі через регуляцію Саг*, Mg2*-залежної ендонуклеази. Це не виключає того, що пострадіаційна загибель лімфоцитів може регулювалися за допомогою 1 Інших сигнальних систем, у тому числі 1 цАМФ. Очевидно ці шляхи також можуть бути задіяні в реалізації модифікуючих ефектів ПГ на дію опромінення. .

ВИСНОВКИ '

• • 1. Встановлені модифікуючі дію опромінення властивості виділе-

них і вперше охарактеризованих за хімічним складом пептидоглікани Із клітинних стінок S. aureus 1 Br. flavwn. При цьому показано залежність модифікуючої дії від структурних відмінностей пептидних компонентів ПГ.

2. Особливості імуномодулюючої. активності 1 здатність активу- ■

вати макрофаги перитонеального ексудату мишей залежать від різниці в структурі ПГ. '

3. Активація пептидогліканами синтезу ДНК в Імунокомпетованих тканинах є важливою ланкою в реалізації їх модифікуючих властивостей. Максимальний вплив на Інтенсивність синтезу ДНК In vivo у мишей має місце через 12 - 36 год (селезінка), 24 - 36 год (тимус), 24 - 36 год (кістковий мозок) після введення ПГ.

4. Пептидоглікани в концентрації 200 мкг/мл найбільш ефективно стимулюють мітогенний ефект тимоцитів 1 спленоцитів, а також В- 1 Т-лімфоцит1в мишей, форболмиристатацетат здійснює синергічну дію на мітогенну відповідь лімфоцитів, котра індукується пептидогліканами. а поліміксин В (неспецифічний інгібітор протеїнкінази С)Інгібує цю Дію.

5. Спленоцити, виділені через 1. 6 1 24 год після опромінення мишей з попереднім використанням ПГ чи ПГ в комбінації з серотоніном, зберігають більш виражену здатність мітогенної відповіді на ЛПС 1 КонА, в порівнянні зі спленоцитами, виділеними Із опромінених тварин.

6. Пептидоглікани Із S. aureus 1 Вг. ftavum Індукують перероз-

поділ активності протеінкінази С між цитозольною і мембранною фракціями при їх внесенні в середовище інкубації (через ЗО і 150 хв після внесення). '

• 7. При умові використання ПГ за 24 год до опромінення, сплено-

цити. виділені через 6 год після опромінення, характеризуються менш вираженою транслокацією протеінкінази С в цитозольну фракцію 1 більш вираженою транслокацією у мембранну фракцію, порівнянно з транслокацією в спленоцитах, виділених через 6 год після опромінення без застосування ПГ.

Список робіт, опублікованих по темі дисертації

1. Блюми. А., ПозурВ. К., Цудзевич Б. А., Кучеренко Н.Е. Активация генома В- и 7-лтфощітов мышей пептндогликанаж бактериального происхождения // X Всесоюзн. симпозиум "Структура и функции клеточного ядра" (Гродно, 10-14 октября 1990 г.): Сб. тез. - Гродно. -1990. - с. 37.

2. Блюм И. А.. ПозурВ. К., Цудзевич Б. А. Бактериальные пепти-догликаны: механизмы активации .генома В- и Т-лимфоцитов мышей // I Иммунологический съезд Белоруси "Экологические проблемы иммунологии и аллергологии" (Минск, 19-20 ноября‘1990 г.): Тез. докл. - Минск.

- 1990. - с. 5-6.

3. Блюм И. А., ПозурВ. К., Цудзевич Б. А.. Кучеренко Н.Е. Активация пептидогликанами клеточных стенок Staphylococcus aureus и Brevlbacterium flavum интенсивности синтеза ДНК в иммунокомпететных органах мышей.// Докл. АН УССР. Сер.. В. - 1990. - N 7. - С. 68-71.

4. Позур В.К., Блюм І.0.,Фуртат I.M.. Згонник В.В. Вплив пеп~

тидогліканів грампозитивних бактерій на бактерицидну активність клітин перитонеального ексудату мишей // Вісник Київського університету. Хіміко-біол. науки та науки про Землю. - 1991. - N 4. - С. 40-43. .

5. Позур В.К., Блюм И.А. Особенности поликлонального действия и иммуномодулирующей активности бактериальных пептидогликанов у оп-

позитнореагирующих линий мышей // Журнал, микробиол. эпидемиол. и иммунологий. 1992. - N 1. - С. 57-61.

6. Блюм І.О., Позур В.К., Цудзевич Б. 0.. Кучеренко М.Є. Зміни Інтенсивності синтезу ДНК у Імунокомпетентних тканинах мишей пептидогліканами бактеріального походження // Укр. біохім. журнал. -1992, - Т. 64. N 3. - С. 39-45.

Підписано до друку 25.04-.94p формат 60x84/16 . Папір ярук. Умов, дріук. л. І.О. Тирах 100 примірник-. Зяказ К*722

Надруковано ЦУОП ДНПП "Плодвинконсерв" и. Киії , Саксаганського , І