Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние ионизирующих излучений на кальцийаккумулирующую способность мембран лимфоцитов (экспериментальное исследование)

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние ионизирующих излучений на кальцийаккумулирующую способность мембран лимфоцитов (экспериментальное исследование)"

На правах рукописи

швыдюк

Олег Николаевич

ВЛИЯНИЕ ИОНИЗИРУЮЩИХ ИЗЛУЧЕНИЙ НА КАЛЬЦИЙ-АККУМУЛИРУЮЩУЮ СПОСОБНОСТЬ МЕМБРАН ЛИМФОЦИТОВ (экспериментальное исследование)

03.00 01 - радиобиология 03 00.13 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

003444667

Санкт-Петербург 2008

Работа выполнена в Научно-исследовательском испытательном центре (медико-биологической защиты) Федерального государственного учреждения «Государственный научно-исследовательский испытательный институт военной медицины МО РФ» и в Институте физиологии им ИП Павлова РАН

Научные руководители доктор медицинских наук, профессор

|Галеев Игорь Шарифович] доктор биологических наук, профессор Бигдай Елена Владимировна

Официальные оппоненты доктор медицинских наук, профессор

Смирнов Николай Алексеевич, доктор медицинских наук профессор Чурина Светлана Константиновна

Ведущая ортнизация ФГУ «Российский научный Центр радиологии и хирургических технологий Федерального агентства по высокотехнологической медицинской помощи»

Защита состоится « ЭМ »_X_2008 года в часов

на заседании диссертационного совета Д 215 002 11 ВМедА «Военно-медицинская академия имени С М Кирова МО РФ» (194044, Санкт-Петербург, ул академика Лебедева, д 6)

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Военно-медицинской академии имени С М Кирова

Автореферат разослан « ^ » VII _2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

И Б Ищенко

ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность: Лнмфопения - одно из наиболее ранних гематологических проявлений лучевого поражения Хотя патогенетическая значимость ранней лимфопении в развитии пучевого поражения менее очевидна в сравнении с миелодепрессией, тем не менее даже само наличие линейнои зависимости между степенью уменьшения количества лимфоцитов и величиной поглощенной дозы позволяет предполагать, что указанный гематологический феномен играет определенную роль в дальнейшем течении патологического процесса, индуцированного воздействием ионизирующей радиации

В последние годы убедительно показано, что некоторые цитомшы и ростовые факторы, препятствующие гибели лимфоцитов после облучения, оказывают отчетливый противолучевой эффект (Пол У 1988)

В отчичие от количественных закономерностей изменений числа лимфоцитов в зависимости от дозы радиационного воздействия, которые изучены довольно подробно, влияние облучения на функциональное состояние этих клеток исследовано явно недостаточно Между тем эют вопрос представляет не юлько теоретический интерес, но и имеет важное прикладное значение для целенаправленной разработки средств ранней пато! енетическои терапии острой лучевой болезни (ОЛБ)

Данные, раннее проведенных исследований, позволяют предполагать, что снижение количества лимфоцитов после облучения связано с нарушением структуры и функции клеточных мембран (Иванов И И , Тарусов Б Н , 1976, Зенков Н К , Менщикова Е Б , Шергин СМ, 2993, Плужников НИ, Чиж СИ, Юзвинкевич Л С и др 2 ООО), причем важную роль в этих процессах играет оксидашвный стресс, проявляющийся в резком усилении продукции активных кислородных метаболитов (АКМ) (супероксидный анион-радикал, гидроксильный радикал, синглетный кислород и др ), оксидов азота (монооксид азота, пероксинитрит), инициации процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) (Алесенко АВ, 1981, Барабой В А, Олейник С А 1999, КудряшовЮБ, Гончаренко ЕН 1970) Действие активных форм кислорода (АФК) оказывает модифицирующий эффект на клеточные мембраны с нарушением синтеза АТФ и транспорта ионов, в частности, ионов кальция Роль ионов кальцця^ в регуляции внутриклеточных процессов показана многими авторами (Самойлов ВО 1983, Самойлов В О , Соловьев В Н, Гурская Н Г и др 1980)

Известно, что повышение концентрации цитозолыюго кальция приводит к образованию комплекса кальций-хлортетрациклин-клеточная мембрана с цитозольной стороны мембраны н увеличению количества связанной с ней флуоресцирующей формы (Самойлов ВО 1983, СамойловВО, Лисовский В А, Щедрунов ВВ, Барский И Я 1984) В качестве депо для ионов кальция, помимо эндоплазматического

ретикулума, выступают и митохондрия Захват митохондриями кальция из цитоплазмы - такая же важная функция, как и окислительное фосфорилирование Если захват ионов кальция митохондриями увеличивается, то уменьшается выход АТФ, а при снижении захвата кальция увеличивается выход АДФ, что свою очередь может быть причиной снижения кальций-аккумулирующей способности мембран лимфоцитов (Евдотиенко Ю В, Зинченко ВП 1979, Лейкин ЮН, Виноградов А Д 1974, Меерсон Ф 3 1981, Агиота Окегиз I 1998) В то же время, данных об изменении кальций-аккумулирующей способности и активности дыхательной цепи митохондрий лимфоцитов прижизненными методами люминесцентного анализа у животных, подвергнутых гамма-облучению, в литературе обнаружить не удалось

Недостаточная изученность этих вопросов и обусловила актуальность настоящей работы, посвященной исследованию механизмов повреждающего действия ионизирующих излучений на клетки лимфоидной ткани, в частности, оценке влияния у-облучения на кальций-аккумулирующую способность мембран и клеточное дыхание лимфоцитов, чго имеет важное теоретическое и практическое значение для радиобиологии и военной медицины

Целью работы явилось экспериментальное изучение ранних пострадиационных изменений кальций-аккумулирующей способности, нарушении митоходриального дыхания лимфоцитов и роли оксидативного стресса в механизмах их возникновения

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи

1. Изучить дозововременные закономерности пострадиационных изменений кальций-аккумулирующей способности мембран лимфоцитов при различных вариантах радиационного воздействия

2. Оценить влияние радиозащигных средств на кальций-аккумулирующую способность мембран лимфоцитов

3. Исследовать влияние радиационного воздействия на митохондриальное дыхание лимфоцитов

4 Изучить состояние процессов свободнорадикального окисления в ранние сроки после гамма-облучения и их возможную роль в механизмах ранних постлучевых нарушений кальций-аккумулирующей способности мембран лимфоцитов

Научная новизна и теоретическая значимость исследования.

Установлено, что в первые минуты после облучения крыс в дозах, вызывающих костномозговую форму острой лучевой болезни, отмечается увеличение кальций-аккумулирующей способности лимфоцитов, сменяющееся ее нормализацией, либо снижением, наиболее выраженным при облучении в дозе, соответствующей СДзд/зо

Впервые покачано, что степень снижения кальций аккумулирующей способности мембран лимфоцитов прямо пропорциональна тяжести лучепого поражения Установлено, что снижение кальций-аккумулирующеи способности мембран лимфоцитов происходит при воздействии на крыс стрессорных факторов нелучевой природы (депривация сна истощающая физическая нагрузка, гипертермия, иммобилизационный стресс), однако эти изменения выражены значительно в меньшей степени, чем при воздействии легальных доз облучения

Получены данные, свидетельствующие, что профилактическое введение крысам радпозащитных средств - цистамина и нафтизина способствует восстановлению кальции-аккумулирующей способности лимфоцитов

Новыми являются данные, указывающие, что облучение животных в дозах, вызывающих костномозговую форму острой лучевой болезни, сопровождается выходом ионов кальция из эндоплазматического ретикулума Это свидетельствует о том, что причиной увеличения кальций-аккулирующей способности лимфоцитов в первые минуты после облучения является повышение концентрации внутриклеточного кальция, связанное с нарушением функции Са 2+ - АТФазы эндоплазматического ретикулума

Впервые получены данные, указывающие на то, что облучение животных в дозах, вызывающих костномозговую форму острой лучевой болезни, сопровождается ранней активацией клеточного дыхания лимфоцитов и проявляется снижением уровня собственной флуоресценции восстановленных пиридиннуклеотидов и окисленных флавопротеидов Это обсюятельство позволяет полагать, что ионизирующее излучение изменяет окислительно-восстановительное состояние переносчиков электронов в дыхательной цепи митохондрий

В работе показано, что уже в первые минуты после облучения в костномозговом диапазоне доз в плазме крови облученных крыс развиваются изменения процессов свободнорадикальпого окисления, характерные для окислительного стресса (возрастает содержание окисленного триптофана, уровень карбонильных производных, снижается количество а-токоферола и битирозина) Совпадение по времени этих изменений и нарушений кальций - аккумулирующая способность мембран лимфоцитов может указывать на один из возможных механизмов ранних пострадиационных изменений кальций-аккумулирующей способности лимфоцитов

Практическая значимость работы.

Разработаны экспериментальные модели для изучения ранних пострадиационных нарушений функции клеточных мембран на основе прижизненного флуоресцентного анализа их кальций-аккумулирующеи

способности Уточнены количественные закономерности изменения этого показателя при различных вариантах радиационного воздействия у мелких лабораторных животных Получены данные, свидетельствующие о цетесообразности дальнейшего изучения указанного показателя для оценки эффективности средств профилактики и лечения лучевых поражений в эксперименте

Положения, выносимые на защиту

1 Облучение животных сопровождается ранним увеличением кальций-аккумулирующей способности мембран лимфоцитов Этот эффект обусловлен выходом ионов кальция из эндоплазматического ретикулума

2 Облучение животных в дозах, вызывающих костномозговую форму острой лучевой болезни, сопровождается ранней активацией клеточного дыхания лимфоцитов

3 Пострадиационное снижение кальций-аккумулирующей способности мембран лимфоцитов может быть связано с активацией процессов свободнорадикального окисления

Апробация и внедрение результатов работы

Исследования выполнялись в соответствии с плановой тематикой научно-исследовательских работ НИЩ (МБЗ) ГНИИИ DM МО РФ с января 2003 г по декабрь 2005 г, его результаты реализованы в отчетах по теме НИР «Экспериментальное обоснование использования маркеров оксидативного стресса для ранней индикации радиационных поражений» Результаты исследований доложены на заседаниях секции № 1 НТС НИИЦ (МБЗ) ГНИИИ ВМ МО РФ (протокол № 2 от 16 февраля 2005 г), на Российской научной конференции «Медико-биологические проблемы противолучевой и противохимической защиты» (Санкт-Петербург, 2004 г.)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 108 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы собственных результатов, обсуждения, выводов и списка литературы В диссертации представлены 12 рисунков и 16 таблиц Список литературы содержит 145 библиографических источников из них 84 отечественных и 61 иностранных публикаций

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Эксперименты выполнены на 630 белых беспородных крысах-самцах, массой 180 - 220 г До начала опытов животные находились в условиях стационарного содержания в виварии не менее 7 сут Для

получения радиационных поражений животных подвергали гамма -облучению в диапазоне доз о г 0,5 до 7,5 Гр

Крыс подвергали общему равномерному однократному тамча-облучению в дозах, вызывающих костно - мозговую форму острой лучевой болезни Исследование периферической крови у животных проводили через 3 мин, 3, 6 и 24 ч после облучения

Неравномерное у - облучение моделировали с коэффициентом неравномерности голова-таз 3,3 в дозе 20,0 Гр с экранированием свинцовыми тастинами туловища животных Под экраном одновременно фиксировали 4 с ланка (один над другим) Туловище крыс экранировали при помощи свинцового кожуха толщиной 8 мм по бокам и с торцов станка, с учетом величины тени Дозиметрическии контроль осуществили с помощью дозиметров Д-500 Исследование периферической крови у животных проводили через 6 ч после неравномерного облучения

Сочетацные лучевые поражения моделировали в варианте сочетания рентгеновского ожога Ш-б степени с общим облучением животных от источника гамма-излучения

Комбинированные радиационно-механические поражения у облученных животных моделировали путем перелома диафиза бедренной кости в средней трети Перелом бедренной кости осуществляли под внутрибрюшиннои анестезией Достоверными признаками перелома являлись патологическая подвижность в зоне перечома, крепитация костных отломков, анатомическое укорочение бедра и нарушение двигательной функции После перелома бедренной кости животным осуществлялся интрамедуллярный остеосинтез спицей Киршнера

Для моделирования воздействия повышенной температуры окружающей среды животных помещали в термокамеру, сконструированную на базе термостата, где обеспечивалась достаточная вентиляция воздуха и доступ животных к воде В камере поддерживалась заданная температура и относительная влажность воздуха на уровне 30 -50 % Визуально контролировалась двигательная активность и поведение животных внутри камеры

Для моделирования психоэмоциональных перегрузок методом депривации сна Крыс помещали по одной в отсеке решетчатой клегки (размером 200x150x150 мм) установленной на поддон с водой комнатной температуры В отсеки клетки были вмонтированы жердочки (диаметром 10 мм), расположенные на 100 мм выше пола клетки Пот заливали водой, высота водяного столба 4 см Животные находились в решетчатой клетке в течение 48 ч Один раз в сутки животных извлекали для кормления

Истощающую физическую нагрузку в опытах на крысах моделировали методом многоскоростного плавания до отказа, при этом относительное приращение продолжительности очередного проплыва

дистанции по сравнению с предыдущим уменьшалась в 3-4 раза в конце теста

Для моделирования иммобилизационного стресса передние и задние конечности крыс фиксировали медицинским бинтом на деревянном станке (размером 430x145 мм) на 2 ч

Для решения поставленных задач применяли прижизненный флуоресцентный анализ мембранносвязанного кальция в лимфоцитах, а также прижизненный флуоресцентный анализ активности дыхательной цепи митохондрий лимфоцитов

Прижизненный анализ кальций-аккумулирующей способности клеточных мембран имеет ряд преимуществ по отношению к другим методам исследования, к которым относится, высокая чувствительность, неинвазивность и малая инерционность (Владимиров Ю А , Коган Э М, Коркина Л Г, и др 1978, Карнаухов В Н 1977)

Зондом для регистрации мембранно-связанного кальция клеток является хлортетрациклин, с помощью которого можно изучать клеточные процессы на целых тканях и в клетках - как изолированных, так и in situ (Владимиров Ю А , Коган Э М, Коркина Л Г , Сороковой В И 1978)

Лимфоциты выделяли из периферической крови животных в градиенте плошости фикол - верографина при инкубации в термостате при t - 37 0 С в течение 40 мин После трех - кратного центрифугирования при 1500 об/мин в течение 3-х мин клетки инкубировали в 25 мкМ растворе хлор тетрациклина, приготовленном на растворе Рингера для теплокровных животных, при t = 37 0 С в течение 30 мин, а затем помещали в камеру Горяева на предметном столике под объективом микроскопа Для выделения возбуждающей флуоресценцию длины волны с максимумом на 390 нм применяли светофильтры (ЛОМО, Россия) Интенсивность флуоресценции регистрировали на длине волны 520 нм от одиночных клеток, что позволяло в одном эксперименте получать большой статистический материал Световой сигнал от каждой из 20 клеток поступал на фотоэлектронный умножитель, а затем через аналого-цифровой преобразователь — в компьютер

Для изучения причины увеличения кальций - аккумулирующей способности мембран лимфоцитов использовали раствор тапсигаргина (100 нМ ) - ингибитора Са2+ - АТФазы эндоплазматического ретикулума, вызывающего пассивную мобилизацию Са2+ из внутриклеточных депо независимо от активации рецепторов и генерации специфических инозитолфосфатов Тапсигаргин применяли для прямого исследования емкостного входа ионов Са21" Возникновение реакции под действием тапсигаргина, сходной с таковой под влиянием действия физических и химических факторов, свидетельствует о том, что вход Са24 в клетку обусловлен опустошением кальциевых депо В экспериментах были использованы реактивы фирмы Sigma (Швейцария)

Посредством анализа собственной флуоресценции можно решать задачи, связанные с изучением внутриклеточной регуляции обмена веществ и энергии (Лукьянова Л Д, Балмуханова Б С , Уголев А Т 1982) В свою очередь, реакции дыхательной цепи - терминального этапа биоло1 ического окисления, являются интегральным показателем динамики обмена веществ Метод прижизненного люминесцентного анализа клеточного дыхания позволяет изучагь изменения клеточного метаболизма Среди реакций существенную роль могут играть изменения активности дыхательной цепи митохондрии, вызванные действием ионизирующего излучения (Moller J V , Anderson J R,, Maire M 1981)

Максимум интенсивности собственной флуоресценции НАД H находится в области спектра от 455 до 480 нм При окислении НАД H теряет способность люминесцировать

Не менее важно оценить вклад гликолитическото и митохондриального НАД H в суммарную флуоресценцию Согласно имеющимся экспериментальным данным, вклад второго пула в общий сигнал почти в 10 раз выше, чем цитоплазматического ( Giacobim Е, Grasso А 1966) Таким образом, в лимфоцитах синюю флуоресценцию в клетках главным образом обеспечивают никотинамидцинуклеотиды митохондрий

Окисленным флавопротеидам свойственна собственная флуоресценция на длине волны 520 - 530 нм, которая обусловлена рибофлавином При восстановлении флавопротеиды теряют способность люминесцировать Активность дыхательной цепи митохондрий в лимфоцитах исследовали методом прижизненной флуоресцентной микроскопии

Интенсивность флуоресценции восстановтенных

пиридиннуклеотидов и окисленных флавопротеинов лимфоцитов оценивали на микроскопе ЛЮМАМ-Р8 (ЛОМО, Россия)

Достоинством микроскопа ЛЮМАМ-Р8 является то, что он позволяет одномоментно измерять собственную флуоресценцию пиридиннуклеотидов и окисленных флавопротеинов в реальном времени Излучение этих компонентов дыхательной цепи, проходя через монохроматор и свой фотоэлектронный умножитель, усиливается и преобразовывается в электрические сигналы, которые регистрируются на мониторе компышера

Таким образом, анализ собственной флуоресценции восстановленных пиридиннуклеотидов и окисленных флавопротеинов лимфоцитов облученных крыс позволяет решать поставленные задачи, связанные с изучением метаболической активности дыхательной цепи митохондрий

Состояние общей антиоксидантной активности системы, опредетение общей оксидантной активности, концентрацию SS- и SH-

групп и а-токоферола, окислительную модификацию белков определяли по содержанию общего белка, карбонильных производных, триптофана, битирозина и нитратов в плазе крови облученных животных определяли по стандартным методикам

В работе использованы радиопротекторы нафтизин и цистамин Раствор нафтизина вводили внутрибрюшинно за 15 мин до воздействия

Раствор цистамина вводили внутрибрюшинно 20 мин до воздействия Исследование периферической крови проводили через 6 ч после воздействия

Статистическую обработку результатов проводили с помощью I -критерия Стьюдента для сравнения средних значений Вероятность Р<0,95 считали достаточной для вывода о существенности выявленных различий РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Оценка кальций - аккумулирующей способности мембран лимфоцитов крыс при различных вариантах у-облучения

Установлено, что равномерное облучение животных в дозах 0,5 - 7,5 Гр (через 3 мин после облучения) вызывает достоверное увеличение суммарной интенсивности флуоресценции комплекса «кальций -хлортетрациклин - клеточная мембрана» с последующим снижением ниже контрольного уровня через 3 ч после обтучения животных в дозах 6,75 и 7,5 Гр Увеличение кальций-аккумулирующей способности мембран лимфоцитов в последующие сроки сменялось нормализацией показателя или постепенным его снижением, наиболее выраженным при облучении крыс в высоких (6,75 и 7,5 Гр) дозах

Важно отметить, что кальций-аккумулирующая способность мембран лимфоцитов огражает функциональное состояние клеток и не зависит от общего количества лимфоцитов в периферической крови животных

Для более точного анализа изменений кальций-аккумулирующей способности лимфоцитов условно введены такие понятия, как лимфоциты с «высокой» (65 - 70 уел ед) «сниженной» (ниже 45 уел ед) и «нормальной» (45 - 50 услед) флуоресценцией Снижение количества «нормальных» лимфоцитов в периферической крови животных регистрировалось в диапазоне доз облучения от 0,5 до 7,5 Гр, причем значимые и статистически достоверные различия в значениях показателя отмечались у лее через 6 ч после облучения

Из рисунка 1 видно, что в первые минуты-часы после облучения в дозах 0,5 - 3,0 Гр и в первые минуты после облучения в дозах 6,75 - 7,5 Гр снижение количества лимфоцитов с «нормальной» флуоресценцией происходит за счет увеличения числа клеток с «высокой» флуоресценцией, тогда как в более поздние сроки в периферической крови животных

преобладают лимфоциты с «низкой» (ниже 45 отн ед) флуоресценцией (рис 2)

Рисунок 1 - Относительное количество лимфоцитов с «высокой» интенсивностью флуоресценции у крыс, облученных в различных дозах

Рисунок 2 - Относительное количество лимфоцитов с «низкои» интенсивностью флуоресценции у крыс, облученных в различных дозах

Как видно из рисунка 3, снижение количества «нормальных» лимфоцитов в периферической крови животных регистрировались в диапазоне доз облучения от1 0,5 до 7,5 Гр, причем значимые и статистически достоверные различия отмечались через 6 ч после облучения

Рисунок 3 - Относительное количество «нормальных» лимфоцитов в периферической крови у крыс, облученных в различных дозах

Таким образом, снижение количества «нормальных» лимфоцитов в периферической крови облученных животных через 6 ч после воздействия было обусловлено количеством клеток со сниженной кальции-аккумулирующей способностью

Повышение кальций-аккумулирующей способности лимфоцитов облученных животных в первые часы после облучения обусловлено увеличением содержания ионов кальция в цишзоле, что соответствует данным, полученным другими авторами В частности, в работе (Шевченко А С , Габай В Л , Кобялко В О , Макарова Ю М , Шевченко Т С 1997, Ярилин А А 1996) показано, что через 1,5 - 3,5 ч после облучения тимоцитов мышей в дозе 5 Гр отмечается резкое увеличение проницаемости клеточной мембраны для ионов кальция Избыток ионов кальция в клетках инициирует процесс фрагментации ДИК Выявленное в этот период накопление ионов кальция в облученных тимоцитах мышей является одной из причин активации Са 21" - зависимой эндонуклеазы (Шевченко А С , Габай В Л , Кобялко В О , Макарова 10 М , Шевченко Т С 1997, Ярилин А А 1996) Кроме того, избыточное содержание ионов кальция в клетке может оказывать прямое цитотоксическое действие Установлено, что через 3,5 - 5 ч после облучения тимоцитов в дозе 5 Гр, фрагментация ДНК и перегрузка внутриклеточных пулов ионами кальция

приводит к гибели клеток (Шевченко АС, Габай В Л, Кобялко ВО, Макарова Ю М , Шевченко Т С 1997, Ярилин А А 1996)

Установлено, что интенсивность флуоресценции комплекса «кальций - хлортетрациклин - клеточная мембрагт» лимфоцитов при нсравномермом облучении животных через 6 ч составила 39,5 ± 1,6 отн ед , а количество «нормальных» меток - на уровне 49,2 ± 5,4 % от исходного, в то время как при общем равномерном гамма - облучении в той же дозе (20 Гр) интенсивность флуоресценции комплекса «кальций -хлортетрациклин - клеточная мембрана» лимфоцитов была значительно выше и составила 100,1 ± 8,1 уел ед, а количество «нормальных» клеток снижалась до 10,8 ±1,5 %

Таким образом, степень снижения интенсивности флуоресценции коррелировала с тяжестью течения лучевой болезни (при общем равномерном у - облучении средняя продолжительность жизни крыс составила 7,5 ± 1,5 сут, тогда как средняя продолжительность жизни погибших животных, подвергнутых неравномерному облучению, составила 14 + 1,5 сут )

Изучение кальций-аккумулирующей способности лимфоцитов при других вариантах радиационного воздействия (неравномерном у -облучении, комбинированном и сочетанном лучевых поражениях) показало, что при неравномерном у - облучении (в дозе 20 Гр) количество «нормальных» лимфоцитов в периферической крови облученных животных в 4,5 раза выше, чем при равномерном облучении в той же дозе

Таким образом, можно утверждать, что степень снижения количества «нормальных» клеток является важным показателем тяжести острой лучевой болезни

При сочетании общего равномерного у - облучения в дозе 6,75 Гр и рентгеновского ожога 10 % поверхности тела животных отмечалось более тяжелое течение острого лучевого поражения у крыс, что сопровождалось резким снижением количества «нормальных» лимфоцитов (до 25 % при 100 % гибели животных) В случае изолированного у - облучения животных в дозе 6,75 Гр число «нормальных» лимфоцитов составило 37,6 % относительно исходного уровня, а летальность - 50 %

Комбинированное поражение (перелом бедренной кости и общее облучение в дозе 6,75 Гр) вызывало снижение числа «нормальных» лимфоцитов до 25 % относительно исходного уровня, при этом летальность составила 67 % Как указывалось выше, равномерное у -облучение сопровождалось 50 % гибелью животных и снижением числа клеток с «нормальной» флуоресценцией до 38 % относительно исходного значения

Более легкие поражения (изолированный перелом бедра или локальный рентгеновский ожог 10 % поверхности кожи животных) сопровождались снижением количества «нормальных» лимфоцитов до

уровня, наблюдаемого при общем равномерным у - облучении в дозе 3,0 Гр

Следовательно, полученные данные об изменении кальций-аккумулирующей способности лимфоцитов свидетельствуют о корреляции этого показателя с общей тяжестью лучевого поражения чем выше летальность, тем больше снижается количество «нормальных» 'шмфоцитов в крови облученных животных

Из полученных данных можно заключить, что показатель «количество нормальных клеток» являться ранним прогностическим признаком тяжести ОЛБ при равномерном, неравномерном у - облучении, а также комбинированном и сочетанном лучевых поражениях

Изучение специфичности изменений кальций - аккумулирующей способности мембран лимфоцитов

С целью оценки специфичности пострадиационных изменений капьций-аккумулирующей способности лимфоцитов, было изучено влияние на этот показатель стрессорных факторов нелучевой этиологии (депривация сна, истощающая физическая нагрузка, гипертермия, иммобилизационный стресс) Воздействие различных факторов нерадиационной природы вызывало увеличение интенсивности флуоресценции комплекса «кальций - хлор тетрациклин - клеточная мембрана» лимфоцитов периферической крови крыс на 40 % выше исходного уровня, что свидетельствовало об увеличении кальций-аккумулирующей способности лимфоцитов При этом число «нормальных» лимфоцитов снижалось на 20 - 35 % по сравнению с исходным уровнем Близкие результаты были получены в группах животных, подвергнутых общему равномерному облучению в дозах 0,5 -3,0 Гр

Таким образом, увеличение кальций-аккумулирующей способности лимфоцитов крыс неспецифично и возникает при воздействии различных неблагоприятных факторов, имеющих стрессовый характер Аналогичные данные приведены в работе (Шевченко А С , Габай В Л, Кобялко В О , Макарова Ю М, Шевченко Т С 1997), где показано, что у мышей, подвергнутых длительному стрессовому воздействию в течении 24 ч, отмечалось увеличение части разрывов ДНК в тимоцитах и увеличение МДА в сыворотке крови, сопоставимое с эффектами облучения животных в дозах 50-60 рад

Влияние радиозащитных средств на кальций-аккумулнрующую способность мембран лимфоцитов крыс, подвергнутых равномерному у-облученшо

Применение нафтизина и цистамина в радиозащитных дозах вызывало увеличение количества «нормально» флуоресцирующих клеток в 2 раза по сравнению с облученным контролем При этом у животных, подвергнутых облучению в дозе 7,5 Гр, количество «нормальных»

лимфоцитов периферической крови увеличилось до уровня, наблюдаемого при у - облучении животных в дозе 6,75 Гр Эю позволяет полагать, что одной из возможных мишеней специфического действия радиопротекторов является защита мембран лимфоцитов от атаки свободных радикалов в облученном организме

Полученные данные свидетельствуют, что показатель «количество нормальных лимфоцитов» может быть использован в качестве метода оценки эффективности средств профилактики лучевых поражений

Изменение кальцин - аккумулирующей способности мембран лимфоцитов в облученной суспензии

На фоне действия тапсигаргина интенсивность флуоресценции комплекса «кальций - хлортетрациклин - клеточная мембрана» увеличивалась и достигала значений 72,0 ± 8,4 уел ед (такого же уровня достигает свечение суспензии лимфоцитов, облученных в дозе 7,5 Гр) Равенство реакций на тапсигаргин и облучение свидетельствует, по-видимому, об одинаковом механизме, лежащем в основе увеличения интенсивности флуоресценции комплекса «кальций - хлортетрациклин -клеточная мембрана» Следовательно, увеличение интенсивности флуоресценции комплекса «кальций - хлортетрациклин - клеточная мембрана» в облученной суспензии лимфоцитов происходит за счет выхода ионов кальция из эндоплазматическою ретикутума

Таким образом, увеличение кальций - аккумулирующей способности мембран лимфоцитов периферической крови облученных живошых происходит за счет выхода ионов Са~+ из эндоплазматического ретикулума

Влияние радиационного воздействия на миюхоидриалыше дыхание лимфоцитов крыс

Результаты исследований свидетельствуют (рис 4), чю интенсивность собственной флуоресценции восстановленных пиридиннуклеотидов в лимфоцитах периферической крови крыс, облученных в различных дозах, снижается уже через 3 мин после воздействия Уменьшение светового сигнала в синей области спектра связано со снижением содержания в митохондриях восстановленных пиридиннуклеотидов, что свидетельствует об изменении окислительно-восстановительного состояния начального участка дыхательной цепи митохондрий Следовательно, облучение вызывает снижение пула восстановленных пиридиннуклеотидов в митохондриях лимфоцитов

Следует отметить, что эти изменения были достаточно кратковременными и наиболее выраженными после радиационного воздействия в дозах 6,75 - 7,5 Гр Уровень восстановленных пиридиннуклеотидов восстанавливался и даже несколько увеличивался к исходу 1 сут

Восстановленная форма пиридиннуклеотидов служит основным донором переноса электронов на флавопротеиды в дыхательной цепи митохондрий По дыхательной цепи возбужденные электроны переносятся на кислород, постепенно отдавая свою энергшо для синтеза молекул АТФ, обеспечивающих биоэнергетику клетки

•в* « .3 5

о _ и й й £

а

> <

БК

0,05

24

Время после обтучения, ч

Рисунок А флуоресценции крыс

- Влияние у - облучения на интенсивность собственной восстановленных пиридиннуклеотидов в лимфоцитах

Данные, характеризующие индуцированные радиационным воздействием изменения собственной флуоресценции окисленных флавопротеидов в лимфоцитах периферической крови крыс, представлены на рис 5

Рисунок 5 - Влияние у - облучения на интенсивности собственной флуоресценции окисленных флавопротеидов в лимфоцитах крыс

Как видно из рисунка 5, через 3 мин после облучения животных в высоких дозах интенсивность флуоресценции окисленных флавопротеидов достоверно снижалась и сохранялась ниже контрольного значения в течение 6 ч после облучения Такое изменение собственной флуоресценции указывает на преобладание восстановленных форм флавопротеидов, которые образуются при переносе .электронов с восстановленных пиридиннуклеотидов и при этом теряют способность флуоресцировать

Следовательно, облучение крыс вызывает снижение содержания окисленных форм флавопротеидов в митохондриях лимфоцитов, т е изменяет окислительно-восстановительное состояние переносчиков электронов в дыхательной цепи митохондрий

В этой связи можно предполагать, что полученные данные об изменении активности ферментов начального участь а дыхательной цепи митохондрий могут свидетельствовать о постлучевои активации клеточного дыхания

Таким образом, можно полагать, что увеличение кальций-аккумулирующей способности мембран лимфоцитов и активация ферментов начального участка дыхательной цепи митохондрий

лимфоцитов является результатом усиления окислительных процессов в облученном организме

Состояние процессов свободнорадикальною окисления и системы антиоксидантной защиты плазмы крови при лучевом поражении о I общего равномерного у-облучения

В последние годы возрос интерес исследователей направлен к изучению начальной стадии радиационных поражений свободнорадикальным реакциям, активация которых приводит к развитию "окислительного стресса" (Алесенко А В, 1981, Барабой В А, Олешгак С А 1999, Плужников Н Н , Чиж С И, Юзвинкевич Л С 2000, Зозуля 10 А, Барабой В А , Сучковой Д А 2000)

Известно, что окислительный стресс наблюдается при различных экстремальных воздействиях и патологических состояниях и является неотъемлемой частью патогенеза радиационного поражения Свободные радикалы, образующиеся в результате прямого действия излучения на молекулы-мишени или в результате взаимодействия молекул биосубстрата с продуктами радиолиза воды, инициируют и активируют перекисное окисление липидов, что приводит к повреждению клеточных мембран

Результаты исследований, представленные в работе, позволяют утверждать, что в первые минугы - часы после радиационного воздействия у животных, облученных в костномозговом диапазоне доз, происходит снижение общей антиоксидантной активности, что проявляется в увеличении концентрации БЗ-групп, снижении БН-групп и эндогенного а-гокоферола (табл 1)

Таблица 1

Показатели общей антиоксидантной системы плазмы крови крыс через 3 мин после у - облучения в различных дозах (М ± т, п=12)

Показатель До облучения (контроль) После облучения в дозах, Гр

0,5 3,0 6,75

ОАА, уел ед 55,2±2,3 94,8±9,20* 125,7±6,60* 160,2±5,10*

Концентрация Э Б-групп, мкмоль/л 0,06±0,01 0,07±0,02 0,08±0,02 0,12±0,02*

Концентрация БН-групп, мкмоль/л 0,33±0,03 0,28±0,02* 0,34±0,02 0,32±0,02

Содержание а токоферола, мкмоль/л 13,0±0,3 9,3±0,3* 8,8±0,2* 7,5*0,3*

различия достоверны (р<0,05) по сравнением с контролем

На этом фоне общая оксидантная активное ги плазмы крови облученных животных увеличивается (табл 2)

Таблица 2

Показатель общей оксидантной активности плазмы крови крыс через 3 ч после у - облучения в различных дозах ((М ± м, п=12)

Показатель До облучения (контроль) После облучения в дозах, Гр

0,5 3,0 6,75

Общая оксидантная активность, % 57±6 72±4* 75±3* 79±4*

*-различия достоверны (р<0,05) по сравнению с уровнем до облучения

Как видно из табл 2, через 3 ч после радиационного воздействия у животных отмечается достоверное увеличение общей оксидантной активности плазмы крови (на 20-25 % от исходного уровня) на всем регистрируемом диапазоне доз

В этот же срок в плазме крови облученных животных изменяется окислительная модификация белков, что сопровождайся увеличением количества окисленного триптофана, карбонильных производных и снижением количества окисленного тирозина В последующем отмечается увеличение антиокислительной активности плазмы крови, что регистрируется в реакции ингибирования окисления твина-80, в реакции с рибофлавином, ДФПГ

Можно предположить, что процессы свободнорадикального окисления в облученном организме животных, протекают не только в плазме крови, но и в клетках лимфоидной ткани с последующей модификацией мембран лимфоцитов

Таким образом, результаты проведенных исследований позволяют заключить, что под влиянием ИИ изменяется концентрация ионов кальция в цитозоле лимфоцитов Это приводит, с одной стороны, к активации дыхательных ферментов, связанных с синтезом АТФ, с другой - усилению процессов ПОЛ и дальнейшим нарушениям структуры внутриклеточных мембран, в частности митохондрий Изменение кальций аккумулирующей способности мембран лимфоцитов как в сторону увеличения, так в сторону снижения может быть пусковым сигналом к инициации апоптоза лимфоцитов, что имеет важное значение в патогенезе лучевого поражения организма

ВЫВОДЫ

1 В первые минуты после у - облучения крыс в дозах 0,5 - 7,5 Гр отмечается увеличение кальдий-аккумулирующей способности мембран лимфоцитов (на 20 - 40 % по сравнению с контролем), что свидетельствует об увеличении концентрации ионов кальция в лимфоцитах В последующие сроки наблюдения, отмечается либо нормализация (0,5 -3,0 Гр), либо значительное снижение кальций-аккумулирующей способности мембран лимфоцитов, достигающее минимального значения при облучении в дозе 7,5 Гр (6 - 24 ч после радиационного воздействия)

2 При неравномерном кранио-каудальном у - облучении крыс в дозе 20 Гр в первые часы после воздействия отмечается увеличение концентрации ионов кальция в лимфоцитах в 2 раза и снижение количества лимфоцитов с «нормальной» флуоресценцией в 5 раз по сравнению с необлученным контролем

3 В первые часы после сочетанного лучевого поражении, включающего рентгеновский ожог 10 % поверхности тела крыс и общее облучение в дозе 6 75 Гр, отмечается снижение количества лимфоцитов с «нормальной» флуоресценцией в 4 раза по сравнению с необлученным контролем ив 1,8 раза по сравнению с изолированным облучением в аналогичной дозе

4 Комбинированное лучевое поражение крыс, включагохцее перелом бедренной кости и общее облучение в дозе 6,75 Гр, сопровождается уменьшением количества лимфоцитов с «нормальной» флуоресценцией в 4 раза по сравнению с необлученным контролем

5 При воздействии на крыс факторов нелучевой природы (депривация сна, истощающая физическая нагрузка, гипертермия и иммобилизационныи стресс) наблюдается снижение количества лимфоцитов с «нормальной» флуоресценцией на 20 - 35 % по сравнению с контролем Эти сдвиги значительно менее выражены по сравнению с воздействием у - облучения в летальных дозах

6 Профилактическое введение крысам радиозащитных средств цистамина и нафтизина способствует снижению повреждающего действия облучения в отношении кальций-аккумулирующей способности мембран лимфоцитов

7 Облучение животных в дозах, вызывающих костно-мозговую форму острой лучевой болезни, сопровождается увеличением выхода ионов кальция из эндоплазматического ретикулума, что является, по-видимому, основной причиной увеличения содержания ионов кальция в лимфоцитах

8 Облучение животных в дозах, вызывающих костно-мозговую форму острой лучевой болезни, сопровождается ранней активацией клеточного дыхания лимфоцитов, что проявляется снижением уровня собственной люминесценции восстановленных пиридиннуклеотидов на 40 - 60 % и окисленных флавопротеидов на 40 - 50 % по отношению к контролю

9 В первые минуты после облучения крыс в дозах от 0,5 Гр до 6,75 наблюдаются сдвиги процессов свободнорадикального окисления в плазме крови, которые характерны для окислительного стресса (возрастает содержание окисленного триптофана в 1,3 раза, уровень карбонильных производных в 2 раза, снижается количество а-токоферола на 30 % ) Эги нарушения могут явиться одним из возможных механизмов постлучевого снижения кальции - аккумулирующей способности мембран лимфоцитов ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Показатель кальций-аккумулирующей способности лимфоцитов может быть использован в качестве метода оценки тяжести лучевых поражений в дозах, вызывающих костномозговую форму острой лучевой болезни и эффективности средств их профилактики и лечения

2. Определение собственной флуоресценции восстановленных пиридиннуклеогидов и окисленных флавопротеидов в лимфоцитах может быть использовано в качестве метода оценки функциональною состояния лимфоидной ткани при воздействии на организм различных экстремальных факторов внешней среды

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1 Тихомиров П В , Швыдюк О Н Модификация лучевых поражений истощающей физической нагрузкой // Актуальные проблемы и перспективы развития военной медицины / под общ ред Н Н Плужникова - СПб ,2003 - 282 с - ( Науч тр НИИЦ (МБЗ) ГосНИИИ военной медицины, Т 4)

2 Антонишкис Ю А, Швыдюк О Н Дииамика показателей лейкоцитограммы и ретикулоцитов периферической крови крыс в ранние сроки после облучения // Актуальные проблемы и перспективы развития военной медицины / Под общ ред Н Н Плужникова - СПб , 2004 - 315 с

- ( Науч тр /НИИЦ (МБЗ) ГосНИИИ военной медицины, Т 5)

3 Драчев И С , Галеев И Ш , Родионов Г Г , Швыдюк О Н Экспериментальная оценка возможности использования маркеров оксидативного стресса в целях биологической дозиметрии // Там же.

4 Швыдюк О Н, Галеев И Ш , Бигдай Е В , Тихомиров Г1В Возможность использования кальций - аккумулирующей способности нейтрофилов и лимфоцитов периферической крови крыс в качестве показателя для ранней индикации радиационных поражений // Там же

5. Галеев И Ш , Легеза В И , Магира В Ф , Швыдюк О Н, Драчев И С. Роль оксидативного стресса в радиационном поражении организма ГосНИИИ ВМ МО РФ, Москва / под ред член - кор РАН и РАМН И Б Ушакова / Механизмы стресса в экстремальных условиях М 2004 165 с

6 Швыдюк О Н, Галеев И Ш , Тихомиров П В , Бигдай Е В Кальций

- аккумулирующая способность нейтрофилов и лимфоцитов

периферической крови крыс как ранний биоиндикатор радиационных поражений // Медико - биологические проблемы противолучевой и противохимической защиты - СПб ООО «Издательство Фолиант» 2004 -528 с

7 Швыдюк ОН, Галеев ИШ, Легеза В И, Тихомиров ПВ, Бигдай Е В, Ладанова Т В Изменения активности дыхательных ферментов митохондрий лимфоцитов периферической крови крыс, подвергнутых радиационному воздействию // Актуальные проблемы и перспективы развития военной медицины /под общ ред AB Иванченко -СПб, 2006 - 328 с - ( Науч тр / НИИЦ (МБЗ) ГосНИИИ военной медицины, Т 6)

8 Швыдюк О Н , Галеев И Ш, Легеза В И, Тихомиров П В, Бигдай Е В , Ладанова Т В Изменения активности восстановленных пиридиннуклеотидов и окисленных флавопротеидов митохондрий тимфоцитов периферической крови крыс, подвергнутых радиационному воздействию Вестник Российской Военно - Медицинской Академии Приложение № 2005 1 (14) с 178

9 Василевич С В , Швыдюк О Н , Галеев И Ш , Комлев А Е Влияние поля электрета на кальций - аккумулирующую способность нейтрофилов у животных, подвергнутых острому лучевому воздействию Там же

10 The experimental evaluation ot the state of reduced pyridmenycleotides (NAD H) and oxidated flavoproteides (FP) in rats subjected to radiation exposure

Shvydyk О N , Galeev I Sh , Legeza V I, Tichomirov P V, Bigdai E V, Ladanova TV// XXXVI World Congress on Military Medicine International Cooperation m the Field of Military Medicine PRESENT AND FUTURE // SCIENTIFIC ABSTRACT 5-11 June 2005 St Petersburg, Russia 227-228 p

11 Швыдюк О И , Тихомиров П В , Антонишкис Ю А , Бигдай Е В , Ладанова Т В Кальций - аккумулирующая способность мембран лимфоцитов как критерий оценки тяжести радиационного поражения организма Проблемы диагностики и коррекции состояния здоровья в напряженной экологической среде обитания // Материалы второй международной научной конференции, посвященной 80 - летию со дня рождения академика АМН СССР (РАМН) профессора Г И Сидоренко // под ред профессора Захарченко М П СПб Крисмас+ 2006-485 с

Формат 60x84 '/16 Заказ № 479

Подписано в печать 20,06,08

Объем i п л_Тираж 100 экз

Типография ВМедА, 194044, СПб , ул Академика Лебедева, 6

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Швыдюк, Олег Николаевич

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННОЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ О НАРУШЕНИИ ОБМЕНА ИОНОВ КАЛЬЦИЯ В МЕХАНИЗМАХ ЛИМФОПЕНИИ ПРИ РАДИАЦИОННОМ ПОРАЖЕНИИ ОРГАНИЗМА (обзор литературы).

1.1 Ранние пострадиационные изменения функционального состояния лимфоцитов.

1.2 Влияние ионизирующего излучения на структуру и функцию клеточных мембран.

1.3 Значение оксидативного стресса в пострадиационной клеточной гибели.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Общая характеристика экспериментального материала.

2.2 Экспериментальные модели.

2.2.1 Моделирование радиационных поражений от равномерного и неравномерного облучения.

2.2.2 Моделирование радиационных поражений от сочетанного и комбинированного облучения.

2.2.3 Моделирование воздействия факторов нерадиационной природы.

2.3 Методы прижизненной люминесцентной микроскопии.

2.3.1 Метод прижизненного анализа индуцированной флуоресценции лимфоцитов.

2.3.2 Метод прижизненного анализа активности дыхательной цепи митохондрий лимфоцитов, определяемой по собственной люминесценции.

2.4 Биохимические методы исследования.

2.5 Фармакологические средства, использованные в работе-—

2.6 Статистические методы обработки и анализа данных.

ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ ИОНИЗИРУЮЩИХ ИЗЛУЧЕНИЙ НА

ВНУТРИКЛЕТОЧНОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ИОНОВ КАЛЬЦИЯ МЕМБРАН ЛИМФОЦИТОВ (результаты собственных исследований). . >>

3.1 Кальций - аккумулирующая способность мембран лимфоцитов при равномерном у - облучении.

3.2 Кальций - аккумулирующая способность мембран лимфоцитов при неравномерном у - облучении.,

3.3 Кальций - аккумулирующей способности мембран лимфоцитов при сочетанном радиационном поражении.

3.4 Кальций - аккумулирующая способность мембран лимфоцитов крыс при комбинированном радиационном поражении

3.5 Изучение радиационной специфичности изменений кальций - аккумулирующей способности мембран лимфоцитов.

3.6 Изменение кальций - аккумулирующей способности мембран лимфоцитов в облученной суспензии.

3.7 Влияние радиозащитных средств на кальций - аккумулирующую способность мембран лимфоцитов периферической крови крыс, подвергнутых равномерному у - облучению.

3.8 Влияние радиационного воздействия на митохондриальное дыхание лимфоцитов.

3.9 Состояние процессов свободнорадикального окисления и системы антиоксидантной защиты плазмы крови при лучевом поражении от общего равномерного у - облучения.

ГЛАВА 4. ИЗМЕНЕНИЕ КАЛЬЦИЙ АККУМУЛИРУЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ МЕМБРАН

ЛИМФОЦИТОВ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ВАРИАНТАХ у

ОБЛУЧЕНИЯ (обсуждение полученных результатов).

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние ионизирующих излучений на кальцийаккумулирующую способность мембран лимфоцитов (экспериментальное исследование)"

Актуальность проблемы. Лимфопения - одно из наиболее ранних гематологических проявлений лучевого поражения. Хотя патогенетическая значимость ранней лимфопении в развитии лучевого поражения менее очевидна в сравнении с миелодепрессией, тем не менее даже само наличие линейной зависимости между степенью уменьшения количества лимфоцитов и величиной поглощенной дозы в определенном диапазоне позволяет предполагать, что указанный гематологический феномен играет важную роль в дальнейшем течении патологического процесса, индуцированного воздействием ионизирующей радиации.

В последние годы убедительно показано, что некоторые цитокины, препятствующие гибели лимфоцитов после облучения, оказывают отчетливый противолучевой эффект [27].

В отличие от количественных закономерностей изменений числа лимфоцитов в зависимости от дозы радиационного воздействия, которые изучены довольно подробно, молекулярные механизмы, вызывающие гибель этих клеток, исследованы недостаточно. Между тем этот вопрос представляет не только теоретический интерес, но и имеет важное прикладное значение для целенаправленной разработки средств ранней патогенетической терапии острой лучевой болезни (ОЛБ).

Данные, раннее проведенных исследований, позволяют предполагать, что снижение количества лимфоцитов после облучения связано с нарушением структуры и функции клеточных мембран [26, 59, 63], причем важную роль в этих процессах играет оксидативный стресс, проявляющийся в резком усилении продукции активных кислородных метаболитов (АКМ) (супероксидный анион-радикал, гидроксильный радикал, синглетный кислород и др.), оксидов азота (монооксид азота, пероксинитрил), инициации процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) [1, 4, 26, 37, 59, 63,]. Действие активных форм кислорода (АФК) оказывает модифицирующий эффект на клеточные мембраны с нарушением синтеза АТФ и транспорта ионов, в частности, ионов кальция. Роль ионов кальция в регуляции внутриклеточных процессов показана многими авторами [44, 70].

Известно, что повышение концентрации цитозольного кальция приводит к образованию комплекса: кальций-хлортетрациклин-клеточная мембрана (Са -ХТЦ-КМ) с цитозольной стороны мембраны и увеличению количества связанной с ней флуоресцирующей формы [19, 31, 95]. В качестве депо для ионов кальция, помимо эндоплазматического ретикулума, выступают и митохондрии. Захват митохондриями кальция из цитоплазмы -такая же важная функция, как и окислительное фосфорилирование. Если захват ионов кальция митохондриями увеличивается, то уменьшается выход АТФ, а при снижении захвата кальция увеличивается выход АДФ, что свою очередь может быть причиной снижения кальций-аккумулирующей способности (КАС) мембран лимфоцитов [33, 43, 48, 86]. В то же время, данных об изменении кальций-аккумулирующей способности и активности дыхательной цепи митохондрий лимфоцитов прижизненными методами люминесцентного анализа у животных, подвергнутых гамма-облучению, в литературе обнаружить не удалось.

Недостаточная изученность этих вопросов и обусловила актуальность настоящей работы, посвященной исследованию механизмов повреждающего действия ионизирующих излучений на клетки лимфоидной ткани, в частности оценке влияния у-облучения на кальций-аккумулирующую способность мембран и клеточное дыхание лимфоцитов, что имеет важное теоретическое и практическое значение для радиобиологии и военной медицины.

Целью работы явилось экспериментальное изучение ранних пострадиационных изменений кальций-аккумулирующей способности, нарушений митоходриального дыхания лимфоцитов и роли оксидативного стресса в механизмах их возникновения.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить дозововременные закономерности пострадиационных изменений кальций-аккумулирующей способности мембран лимфоцитов при различных вариантах радиационного воздействия.

2. Оценить влияние радиозащитных средств на кальций-аккумулирующую способность мембран лимфоцитов.

3. Исследовать влияние радиационного воздействия на митохондриальное дыхание лимфоцитов.

4. Изучить состояние процессов свободнорадикального окисления в ранние сроки после гамма-облучения и их возможную роль в механизмах ранних постлучевых нарушений кальций-аккумулирующей способности мембран лимфоцитов.

Научная новизна и теоретическая значимость исследования.

Установлено, что в первые минуты после облучения крыс в дозах, вызывающих костномозговую форму ОЛБ, отмечается увеличение кальций-аккумулирующей способности лимфоцитов, сменяющееся ее нормализацией, либо снижением, наиболее выраженным при облучении в дозе, соответствующей СД90/30.

Впервые показано, что степень снижения кальций - аккумулирующей способности мембран лимфоцитов прямо пропорциональна тяжести лучевого поражения. В частности, при неравномерном облучении тяжесть лучевого поражения проявляется в меньшей степени, чем при равномерном облучении в той же дозе, а при комбинированном и сочетанном облучении - выше, чем при изолированном.

Показано, что снижение КАС мембран лимфоцитов происходит при воздействии на крыс стрессорных факторов нелучевой природы (депривация сна, истощающая физическая нагрузка, гипертермия, иммобилизационный стресс), однако эти изменения выражены значительно в меньшей степени, чем при воздействии летальных доз облучения.

Получены данные, свидетельствующие, что профилактическое введение крысам радиозащитных средств - цистамина и нафтизина способствует восстановлению КАС мембран лимфоцитов.

Новыми являются данные, указывающие, что облучение животных в дозах, вызывающих костномозговую форму острой лучевой болезни, сопровождается выходом ионов кальция из эндоплазматического ретикулума. Это свидетельствует о том, что причиной увеличения кальций-аккулирующей способности мембран лимфоцитов в первые минуты после облучения является повышение концентрации внутриклеточного кальция, связанное с нарушением функции Са - АТФазы эндоплазматического ретикулума.

Впервые получены данные, указывающие на то, что облучение животных в дозах, вызывающих костномозговую форму острой лучевой болезни, сопровождается ранней активацией клеточного дыхания лимфоцитов и проявляется снижением уровня собственной флуоресценции восстановленных пиридиннуклеотидов и окисленных флавопротеидов. Это обстоятельство позволяет полагать, что ионизирующее излучение изменяет окислительно-восстановительное состояние переносчиков электронов в дыхательной цепи митохондрий.

В работе показано, что уже в первые минуты после облучения в костномозговом диапазоне доз в плазме крови облученных крыс развиваются изменения процессов свободнорадикального окисления, характерные для окислительного стресса (возрастает содержание окисленного триптофана, уровень карбонильных производных, снижается количество а-токоферола и битирозина). Совпадение по времени этих изменений и нарушений КАС мембран лимфоцитов может указывать на один из возможных механизмов ранних пострадиационных изменений кальций-аккумулирующей способности мембран лимфоцитов.

Практическая значимость работы.

Разработаны экспериментальные модели для изучения ранних пострадиационных нарушений функции клеточных мембран на основе прижизненного флуоресцентного анализа их кальций-аккумулирующей способности. Уточнены количественные закономерности изменения этого показателя при различных вариантах радиационного воздействия у мелких лабораторных животных. Получены данные, свидетельствующие о целесообразности дальнейшего изучения указанного показателя для оценки эффективности средств профилактики и лечения лучевых поражений в эксперименте.

Положения, выносимые на защиту.

1. Облучение животных сопровождается ранним увеличением кальций-аккумулирующей способности мембран лимфоцитов. Этот эффект обусловлен выходом ионов кальция из эндоплазматического ретикулума.

2. Облучение животных в дозах, вызывающих костномозговую форму ОЛБ, сопровождается ранней активацией клеточного дыхания лимфоцитов.

3. Пострадиационное снижение кальций-аккумулирующей способности мембран лимфоцитов может быть связано с активацией процессов свободнорадикального окисления.

Апробация и внедрение результатов работы.

Исследования выполнены в соответствии с плановой тематикой научно-исследовательских работ НИИЦ (МБЗ) ГНИИИ ВМ МО РФ с января

2003 г. по декабрь 2005 г., их результаты реализованы в отчетах по теме НИР «Экспериментальное обоснование использования маркеров оксидативного стресса для ранней индикации радиационных поражений». Результаты исследований доложены на заседаниях секции № 1 НТС НИИЦ (МБЗ) ГНИИИ ВМ МО РФ (протокол № 2 от 16 февраля 2005 г.), на Российской научной конференции «Медико-биологические проблемы противолучевой и противохимической защиты» (Санкт-Петербург, 2004 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 108 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы собственных результатов, обсуждения, выводов и списка литературы. В диссертации представлены 12 рисунков и 16 таблиц. Список литературы содержит 145 библиографических источников, из них 84 отечественных и 61 иностранных публикаций.

Заключение Диссертация по теме "Радиобиология", Швыдюк, Олег Николаевич

ВЫВОДЫ

1. В первые минуты после облучения крыс в дозах 0,5 - 7,5 Гр отмечается увеличение кальций-аккумулирующей способности мембран лимфоцитов (на 20-40 % по сравнению с контролем), что свидетельствует об увеличении концентрации ионов кальция в лимфоцитах. В последующие сроки наблюдения, отмечается либо нормализация (0,5 — 3,0 Гр), либо значительное снижение кальций-аккумулирующей способности мембран лимфоцитов, достигающее минимального значения при облучении в дозе 7,5 Гр (6 - 24 ч после радиационного воздействия).

2. При неравномерном кранио-каудальном гамма-облучении крыс в дозе 20 Гр в первые часы после воздействия отмечается увеличение концентрации ионов кальция в лимфоцитах в 2 раза и снижение количества лимфоцитов с «нормальной» флуоресценцией в 5 раз по сравнению с необлученным контролем.

3. В первые часы после сочетанного лучевого поражении, включающего рентгеновский ожог 10 % поверхности тела крыс и общее облучение в дозе 6,75 Гр, отмечается снижение количества лимфоцитов с «нормальной» флуоресценцией в 4 раза по сравнению с необлученным контролем и в 1,8 раза по сравнению с изолированным облучением в аналогичной дозе.

4. Комбинированное лучевое поражение крыс, включающее перелом бедренной кости и общее облучение в дозе 6,75 Гр, сопровождается уменьшением количества лимфоцитов с «нормальной» флуоресценцией в 4 раза по сравнению с необлученным контролем.

5. При воздействии на крыс факторов нелучевой природы (депривация сна, истощающая физическая нагрузка, гипертермия и иммобилизационный стресс) наблюдается снижение количества лимфоцитов с «нормальной» флуоресценцией на 20-35 % по сравнению с контролем. Эти сдвиги значительно менее выражены по сравнению с воздействием гамма-облучения в летальных дозах.

6. Профилактическое введение крысам радиозащитных средств цистамина и нафтизина способствует снижению повреждающего действия облучения в отношении кальций-аккумулирующей способности мембран лимфоцитов.

7. Облучение животных в дозах, вызывающих костно-мозговую форму острой лучевой болезни, сопровождается увеличением выхода ионов кальция из эндоплазматического ретикулума, что является, по-видимому, основной причиной увеличения содержания ионов кальция в лимфоцитах.

8. Облучение животных в дозах, вызывающих костно-мозговую форму острой лучевой болезни, сопровождается ранней активацией клетлчного дыхания лимфоцитов, что проявляется снижением уровня собственной люминесценции восстановленных пиридиннуклеотидов на 40 - 60 % и окисленных флавопротеидов на 40 - 50 % по отношению к контролю.

9. В первые минуты после облучения крыс в дозах от 0,5 Гр до 6,75 наблюдаются сдвиги процессов свободнорадикального окисления в плазме крови, которые характерны для окислительного стресса (возрастает содержание окисленного триптофана в 1,3 раза, уровень карбонильных производных в 2 раза, снижается количество а-токоферола на 30 % ). Эти нарушения могут явиться одним из возможных механизмов постлучевого снижения кальций — аккумулирующей способности мембран лимфоцитов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Показатель кальций-аккумулирующей способности мембран лимфоцитов может быть использован для оценки тяжести лучевых поражений в дозах, вызывающих костномозговую форму ОЛБ и эффективности средств их профилактики и лечения.

2. Определение собственной люминесценции восстановленных пиридиннуклеотидов и окисленных флавопротеидов в лимфоцитах можно применить для оценки функционального состояния лимфоидной ткани, при воздействии на организм различных экстремальных факторов внешней среды.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Швыдюк, Олег Николаевич, Санкт-Петербург

1. Алесенко, А.В. Роль липидов и продуктов перекисного окисления в биосинтезе и функциональной активности ДНК /

2. A.В. Алесенко // Биохимия липидов и их роль в обмене веществ. М.: Наука, 1981.-С. 3-16.

3. Арутюнян, А.В., Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма/ А.В. Арутюнян, Е.Е. Дубинина, Н.Н. Зыбина // Методические рекомендации. — СПб .: ИКФ «Фолиант», 2000. 104 с.

4. Африканова, Л. А. Острая лучевая травма кожи / Л.А. Африканова//М.: Медицина, 1975. 193 с.

5. Барабой В.А. Стресс в развитии радиационного поражения. Роль регуляторных механизмов / В.А. Барабой, С.А. Олейник // Радиац. биология. Радиоэкология. 1999. - Т. 39, № 4. - С. 438 - 443.

6. Барабой, В.А. Перекисное окисление и радиация / В.А Барабой,

7. B.Э Орёл, И.М. Карнаух // Киев, 1991. - 256 с.

8. Блекмишев, И.Б. Радиационое повреждение эритроцитов и пути их репарации./ И.Б. Блекмишев, В.П. Шабаев, В.М. Инюшин. // Радиационно стимул, процессы. Алма-Ата, 1980. - С. 134 - 143.

9. Болдырев, А.А. Парадоксы окислительного метаболизма мозга / А.А. Болдырев // Биохимия. 1995. - Т. 60, № 9. - С. 1536 - 1542.

10. Бурмистров, С.О. Антиоксидантная активность сыворотки крови беременных и небеременных женщин: сравнение разных методовопределения / С.О. Бурмистров, Т.И. Опарина, В.М. Прокопенко // Клин, лаб. Диагностика. 1997, № 11. - С. 14 - 17.

11. Владимиров, Ю.А. Применение флуоресцентного зонда тетрациклина как метод оценки жизнеспособности органов / Ю.А. Владимиров, Э.М Коган, Л.Г Коркина, В.И. Сороковой // Актуальные проблемы пересадки органов. М. : Медицина, 1978.-С. 150-165.

12. Владимиров, Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков // М.: Наука, 1972.-252 с.

13. Владимиров, Ю.А. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран / Ю.А. Владимиров, Г.Е. Добрецов // М.: Наука, 1980.-320 с.

14. Галактионова, А.В. Состояние перекисного окисления у больных с язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки / А.В. Галактионова, А.В. Молчанов, С.А. Ельчанинова // Клин. лаб. Диагностика. 1998. - № 6. - С. 10 - 14.

15. Говорова, Л.М. Механизмы метаболической адаптации и окислительный стресс при вирусных и бактериальных инфекциях у детей: Автореф. дис. . д-ра биол. наук. / Л.М. Говорова СПб., 2002. - 48 с.

16. Голдобенко, Г.В. Рак предстательной железы. Лучевая терапия злокачественных опухолей / Г.В. Голдобенко, С.И. Ткачев // М.: Медицина, 1996. - С. 319 - 329.

17. Граевская, Б.М. О механизмах, определяющих течение и исход воздействия ионизирующей радиации на организм / Б.М. Граевская, Н.Н. Золотарева // Радиобиология. 1991. - № 5. - С. 747 - 753.

18. Граевский, Э.Я. Сульфгидрильные группы и радиочувствительность. / Э.Я. Граевский -М.: Атомиздат, 1968. 245 С.

19. Дубинина Е. Е., Бурмистров С.О., Ходов Д.А. // Вопросы мед. химии. 1995. - Т. 41, № 1. С. 24 - 26.

20. Закарян, А.Е., Кочур Н.А., Тарусов Б.Н. О сверхслабой хемилюминесценции сыворотки крови онкологических больных /

21. A.Е Закарян, Н.А. Кочур, Б.Н. Тарусов // Физико-химические механизмы злокачественного роста М.: Наука, 1970. - Т. 32. - С. 99 - 103.

22. Заярна, С.П. Возможности фармакологической регуляции ферментативного торможения перекисного окисления липидов в условиях лучевого поражения / С.П. Заярна, О.А. Ульянцева, В.К. Напханюк // Лжи. 1998, № 1.-С. 64-66.

23. Зенков, Н.К. Активированные кислородные метаболиты в биологических системах / Н.К. Зенков, Е.Б. Меныцикова // Успехи соврем, биологии. 1993. - Т. 113, вып. 3. - С. 286 - 296.

24. Зинченко, В.П. Изменение люминесценцииспиридиннуклеотидов мышечной клетки в ответ на кратковременную стимуляцию / Зинченко, В.П. // Биофизика живой клетки. Пущино, 1972. -Т.З.-С. 76-80.

25. Зозуля, Ю.А. Свободнорадикальное окисление и антиоксидантная защита при патологии головного мозга / Ю.А. Зозуля,

26. B.А. Барабой, Д.А. Сутковой и др. // М.: Знание - М, 2000. - 344 с.

27. Иванов, И.И. Молекулярные механизмы действия токоферолов в биологических мембранах / И.И. Иванов, Б.Н. Тарусов // Свободнорадикальное окисление липидов в норме и патологии М.: Наука, 1976. - С. 105 - 108.

28. Иммунология /под ред. У. Пола. М: Мир, Т. 1. 1987 - 1988.476 с.

29. Каган, Е.В. Кальций и перекисное окисление липидов в мембранах митохондрий и микросом сердца / Е.В Каган, В.И. Савов, В.В. Диденко, Ю.В. Архипенко, Ф.З. Меерсон // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1983. - Т. 95, № 4. - С. 46 - 48.

30. Карнаухов, В.Н. Действие функциональной нагрузки на энергоаппарат клетки / В.Н. Карнаухов // Проблемы дефицита возбуждения. Петрозаводск, 1971.-С. 34-35.

31. Карнаухов, В.Н. Люминесцентные исследования мышечных клеток / В.Н. Карнаухов // Молекулярная и клеточная биофизика. М.: Наука, 1977. - С. 247 - 258.

32. Кения, М.В. Роль низкомолекулярных антиоксидантов при окислительном стрессе / М.В. Кения, А.И. Лукаш, Е.Н. Гуськов // Успехи соврем, биологии. 1993. - Т. 113, № 4. - С. 456 - 469.

33. Кинетические и термодинамические характеристики транспорта кальция в митохондриях // Евдотиенко Ю.В., Зинченко В.П., Кудзина Ю.Д. и др. / 1 Сов.- Швейц. симпоз. Биологическая мембрана: структура и функции. - М., 1979. - 90 с.

34. Крутецкая, З.И., Лебедев О.В. Роль тирозинового фосфорилирования в регуляции активности ионных каналов клеточных мембран / З.И. Крутецкая, О.В. Лебедев. СПб: «Айю», 1998. - 245 с.

35. Кудряшов, Ю.Б. Лучевое поражение "критических систем" / Лучевое поражение (острое лучевое поражение, полученное в эксперименте) // под ред. Ю.Б. Кудряшова. М.: МГУ, 1987. - С. 5-72.

36. Кудряшов, Ю.Б. Роль биологически активных веществ (радиотоксинов) в лучевом поражении /Ю.Б. Кудряшов, Е.Н. Гончаренко // Радиобиология. 1970. - Т. 10, вып. 2. - С. 212 - 229.

37. Кудряшов, Ю.Б. Современные проблемы противолучевой химической защиты организмов / Ю.Б Кудряшов, Е.Н. Гончаренко // Радиац. биология. Радиоэкология. 1999. Т. 39, № 2 - 3. - С. 197 - 211.

38. Кудряшов, Ю.Б. Радиорезистентность и регуляция метаболизма нервной ткани / Ю.Б. Кудряшов, Н.Е. Кучеренко, А.Н. Васильев и др. Киев: Либщь, 1992. - 234 с.

39. Кузин, A.M. Структурно-метаболическая теория в радиобиологии / под ред. Кузина A.M. М., 1986. - 283 с.

40. Левицкий Д.О. Количественная оценка кальций транспортирующей способности саркоплазматического ретикулума сердца / Д.О. Левицкий, Д.С. Беневоленский, Т.С. Левченко // Метаболизм миокарда. М.: Медгиз, 1981. - с. 35 - 47.

41. Лейкин, Ю.Н. Влияние аккумуляции кальция на окислительное фосфорилирование в митохондриях печени / Ю.Н Лейкин,

42. А.Д. Виноградов // Митохондрии. Молекулярные механизмы ферментативных реакций. М.: Наука, 1972. - С. 131 - 137.

43. Лейкин, Ю.Н. Окисление НАД-Н в митохондриях печени крыс / Ю.Н. Лейкин, А.Д. Виноградов // Митохондрии. Регуляция процессов окисления и сопряжения. М.: Наука, 1974. - С. 55-66.

44. Лисовский, В.А. Люминесцентный анализ в гастроэнтерологии./ В.А. Лисовский Л.: Наука, 1984. - 236 с.

45. Лукьянова, Л.Д. Кислородзависимые процессы в клетке и ее функциональное состояние / Л.Д Лукьянова, Б.С. Балмуханова, А.Т. Уголев М.: Наука, 1982. - 301с.

46. Мазурик, В.К. Лучевое поражение / под ред. Ю.Б. Кудряшова -М.: Изд-во МГУ, 1987. С. 100 - 113.

47. Маянский, А.Н. Апоптоз нейтрофилов / А.Н. Маянский, Н.А Маянский, М.И. Заславская и др. // Иммунология.- 1999. № 6. - С. 11 -24.

48. Мелихов, О.Г. Состояние антиокислительной системы эритроцитов при у-облучении на фоне предшествующего длительного перегревания / О.Г. Мелихов, Н.Б. Козлов // Радиобиология. 1991. - Т. 31, вып. 6-С. 838-841.

49. Меныцикова, Е.Б. Антиоксиданты и ингибиторы радикальных окислительных процессов / Е.Б. Меныцикова, Н.К. Зенков // Успехи соврем, биологии. 1993. - Т. 113, вып. 4. - С. 442 - 455.

50. Меныцикова, Е.Б. Окислительный стресс при воспалении / Е.Б. Меныцикова., Н.К. Зенков // Успехи соврем, биологии. 1997. - Т. 117, №2.-С. 155-171.

51. Михаевич, О.Д. Егорова Н.И. Регуляция а-токоферолом активности каталазы у больных раком легкого / О.Д. Михаевич, Н.И. Егорова // Биохимия опухолевой клетки. Минск, 1990. - С. 68 - 69.

52. Морозкина, Т.С. Способны ли биоантиоксиданты эффективно увеличивать радиорезистентность организма? / Т.С. Морозкина, В.Н. Суколинский, И.Б. Сокольчик и др // Матер. IV конф. "Биоантиоксидант," 2-4 июня 1992 г. М. Т. 1. - С. 89 - 90.

53. Москалев, Ю.И. Отдаленные последствия воздействия ионизирующих излучений. / Ю.И. Москалев М.: Медицина, 1991. - 464 с.

54. Наумова, Г.М., Влияние комплексных препаратов витаминов С и Р на энергетический обмен в митохондриях печени облученных крыс / Наумова Г.М., Рудаков Н.П. // Радиобиология. 1974. - Т. 14, вып. 4. - С. 586 - 589.

55. Новечно, А. Промышленные аварии с серьезными последствиями / А. Новечно, Аскулай Э. // Бюлл. МАГАТЭ, 1987. Т. 29, № 2. - С. 39 - 45.

56. Новоженов, В.Г. Изменения перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы у больных острой лучевой болезнью / В.Г. Новоженов, А.Е. Лысенко, А.В. Подвигин и др. // Воен.-мед. журн. -1993.-№4.-С. 38-40.

57. Окислительный стресс: Диагностика, терапия, профилактика / Н.К. Зенков, Е.Б. Менщикова, С.М. Шергин; РАМН, Сибирское отделение. -Новосибирск, 1993. 181 с.

58. Орлов, С.Н. Кальций аккумулирующая способность клеточных мембран миокарда и гладкой мускулатуры крыс со спонтанной генетической гипертензии / С.Н. Орлов, Н.И. Покудин, Ю.В. Постнов // Кардиология. - 1980. - Т. 20, № 2. - С. 94 - 99.

59. Пермяков, Е.А. Кальцийсвязывающие белки / под ред. Е.А. Пермякова-М.: Наука, 1993. -192 с.

60. Пескин, А.И. Взаимодействие активного кислорода с ДНК / А.И. Пескин // Биохимия. 1997. - Т. 62, вып. 12. - С. 1571 - 1578.

61. Поглазов, А.Ф. Флуориметрическое изучение вывода Са из липосом, индуцированного воздействием фосфолипазы / А.Ф. Поглазов, М.В. Шубин, Ю.Г. Скоцеляс и др. // Биофизика. 1975. - Т. 20, № 1. - С. 69-72.

62. Поляков, JI.E. Основы военно-медицинской статистики / JI.E. Поляков., Б.И. Игнатович, К.В. Ласиков. Л.: ВМедА, 1977. - 336 с.

63. Преображенский, С.Н. Изучение влияния эстрогенов на взаимодействие кальция с мембранами митохондрий / С.Н. Преображенский, Ю.П. Денисов // Биофизика. 1977. - Т. 22, вып. 3. -с. 452 - 455.

64. Программированная клеточная гибель / под ред. проф. B.C. Новикова. СПб.: Наука, 1996,- 276 с.

65. Пяткин, Е. К. Зависимость выхода аберраций хромосом от дозы при облучении лимфоцитов человека in vivo / Пяткин Е. К. // Мед. радиология. 1986 - Т. 31, № 9. - С. 30 - 35.

66. Ритов, В.Б. Транспорт кальция через мембраны саркоплазматического ретикулума / В.Б. Ритов // Биохимия животных и человека. — Киев: Наукова думка, 1977. Т 1. — 53 - 83.

67. Самойлов, В.О. Гетерогенность хемосенсорных систем / под ред. В.О. Самойлова. Л.: Наука, 1983. - 224 с.

68. Самойлов, В.О. О значении метаболических реакций вкусовых рецепторов в восприятии химических стимулов / В.О. Самойлов, В.Н Соловьев, Н.Г Гурская, А.С. Гурченок // Сенсорные системы. Обоняние и вкус. Л. : Наука, 1980. - С. 107 - 109.

69. Тарусов, Б.Н. Первичные процессы лучевого поражения /под ред. Б.Н. Тарусова. М.: Под. ред. Госатомиздат, 1962. - 96 с.

70. Фаршатов, М.Н., Бритун А.И. Комбинированные радиационные поражения: патогенез, клиника, лечение / М.Н. Фаршатов, А.И. Бритун. М.: Медицина, 1993 - С. 87 - 184.

71. Федотова, Т.А. Нуклеиновые кислоты и белки в организме при лучевом поражении / Т.А. Федотова, О.Л. Терещенко, В.К. Мазурик. М.: Медицина, 1972.-408 с.

72. Форсеберг, А.В. Ионизирующее излучение и клеточный метаболизм / под ред. А.В. Форсеберга М.: Изд - во иностр. лит., 1958. — 261 С.

73. Хансон, К.П. Молекулярные механизмы радиационной гибели клеток / К.П. Хансон, В.Е. Комар. М., 1985. - 152 с.

74. Ходоров, Б.И. Роль медленных натрий-кальциевых каналов, саркоплазматического ретикулума и системы натрий-кальциевого обмена в регуляции сократительной активности миокардиальных клеток теплокровных (фармакологический анализ) / Б.И. Ходоров,

75. Е.Г. Ворновицкий, В.Б. Игнатьева // Проблемы общей и клинический физиологии сердечно — сосудистой системы. — Киев: Наукова думка, 1976. -С.180- 195.

76. Штреффер, К. Радиационная биохимия / К. Штреффер; перевод с нем.; под. ред. Е.Ф. Романцева. М., Атомиздат, 1972 - 200 с.

77. Шубин, М.В. Изучение влияния перекисного окисления липидов на проницаемость мембран липосом для ионов кальция / М.В. Шубин, А.Ф. Поглазов, Ю.Г. Скоцеляс, Ю.А. Владимиров // Биофизика. 1975. - Т. 20 - С. 161 - 163.

78. Эйдус, JI.X. Физико-химические основы радиобиологических процессов и защиты от излучений / JI.X. Эйдус М.: Атомиздат, 1972. -240 с.

79. Ярилин, А.А. / Апоптоз и его место в иммунных процессах / А.А. Ярилин // Иммунология. 1996. № 6. С. 10 - 22.

80. Ярмоненко, С.П. Радиобиология человека и животных: учеб. пособие / под ред. С.П. Ярмоненко, А.А. Вайнсон // М.: Высш. шк., 2004. — 549 с.

81. Aruoma Okezie, I. Free radicals, oxidative stress and antioxidants in human health and didease / I. Aruoma Okezie // J. Amer. Oil Chem. Soc. -1998. Vol. 75, № 2. - P. 199 - 212.

82. Azuma, Y. Molecular mechanisms of apoptosis in the immune system / Y. Azuma, H. Kizaki // Nippon. Rinsho. 1995. - Vol. 53, - № 3. P. 753 - 760.

83. Avi-Dor, J., Olson J.M., Dohersy M.D. Fluorescence of pyridine nucleotides in mitochondria / J. Avi-Dor, J.M. Olson, M.D. Dohersy. // J. Biol. Chem. 1962. - Vol. 237, N 7. - P. 2377 - 2383.

84. Besch Henry, R. Jr.,. Ca " uptake by cardiac Ca - uptvesicles: modulation by monovalent cations / R. Jr. Besch Henry, R. Jones Larry, M. Watanable August // Circulation. - 1976. - Vol. 54. - № 4. - suppl. № 2. - P. 163.

85. Blakely, W.F. Overview of low-level radiation exposure assessment: biodosimetry / W.F., Blakely, A.L. Brooks, R.S. Lofts // Ibid. -2003.-P. 20-24.

86. Carvalho, C.A.M. Chlorotetracyclic as an indicator of the interaction of calcium with brain membrane fractions / Carvalho, C.A.M. // J. Neurochem. 1978. - Vol. 30, N 5. - P. 1149 - 1155.

87. Cavaggiony, A. Some aspects of calcium regulation in cell biology / A. Cavaggiony // Biocsience, Reports. 1989. - Vol. 9, N 4. - P. 421 - 436.

88. Chance, В. A method for the estimation of the increase in concentration of adenosine diphosphate in muscle sarcosomes following a contraction / B. Chance, C.M. Conndly // Nature. 1957. - Vol. 179. - P. 1235 - 1237.

89. Chance, B. Fluorometric studies of flavin component of the respiratory chain. Flavins and flavoproteins. E.C. Slator (Editor). Elsevier Publishing Company. Amsterdam, 1966. Printed in the Neherlands, 1966. - P. 510-528.

90. Chance, B. Kinetics of fluoroscence and metabolite changes in rat liver during a cycle of ischemia / B. Chance, B. Schoener, R. Krejci // Biochem. Ztschr.-1965.-Vol 341.-P. 325-333.

91. Chance, B. Fluorometric studies of flavin component of the respiratory chain / B. Chance, M. Schoener // Flavins and flavoproteins. -Amsterdam, 1966.-P. 510-528.

92. Couldwel, W. T. Proteinkinase С inhibitors induce apoptosis in human malignant glioma cell lines / W. T. Couldwel, D. R. Hinton, S. He // FEBS Lett. 1994. Vol. 345, N 1. - P. 67 - 68.

93. Drummond, R.M. Mitochondrial Ca homeostasis during Ca influx and Ca release in gastric myocytes from Bufo marinus / R.M. Drummond, T.C.H. Mix, R.A. Tuft, et al. // J. Physiol. 2000. - Vol. 522, N 3. - P. 375 -390.

94. Epperlein, M.M. Nitric oxide in cigarette smoke as a mediator of oxidative damage / M.M. Epperlein, J. Nourooz-Zadeh, A.A. Noronha-Dutra et al. // Int. J. Exp. Pathol. 1996. - Vol. 77, № 5. - P. 197 - 200.

95. Fatome, M. Biological dozimetry after a criticality accident / M. Fatome Agey D, S. Martyn et al. / Radiat. prot. dosim. 1997. - Vol. 70. № 1 -4. - C. 455-459.

96. Frank George, B. Roles of extracellular and trigger calcium ions in excitation contraction coupling in sceletal vuscle / Frank George, B. // Can. J. Physiol, and Pharmacol. - 1982. - Vol. 60, N 10. - P. 505 - 512.

97. Giacobini, E. Varuiation of glucolitic intrmediates phosphate compounds and puridine of an isolated crustacean neurons / E. Giacobini, A. Grasso // Acta Physiol. Scand. 1966. - Vol. 66, N 1 - 2. - P. 49 - 57.

98. Giacobini, E., Handelman E., Terzulo C.A. Isolated neurone preparation for studies of metabolic events at rest and during impuls activity / E. Giacobini, E. Handelman, C.A. Terzulo // Science. 1963. - Vol. 140, N 3562.-P. 74-75.

99. Goodman, D.B.R. Rapid assay for cellular deocsiribonuclec acid. / D.B.R. Goodman, J.F. Puzaz // Analyt. Bichem. 1978. - Vol. 86. № 1. - P. 50 -56.

100. Grace, M.B. Real-time quantitative RT-PCR assay of GADD45 gene expression changes as a biomarker for radiation biodosimetry / M.B. Grace, C.B. McLeland, W.F. Blakely // Intern. J. Radiat. Biol. 2002. -Vol.78,№ 11.-P.1011 - 1021.

101. Green D. R. Mitochondria and apoptosis / D. R. Green, J. C. Reed // Science 1998.-Vol. 281. P. 1305-1312.

102. Hajnoczky, G. Decoding of cytosolic calcium oacillations in the mitochondria // G. Hajnoczky, L.D., M.B. Robb-Gaspers Seitz, et al. // Cell. -1995. Vol. 82. - P. 415 - 424.

103. Hall, A. G. The role of glutathione in the regulation of apoptosis / A. G. Hall // Eur. J. Clin. Invest. 1999 Vol. 29, P. 238 - 245.

104. Halestarp, A P. Translocation of Bax to mitochondria during apoptosis measured by laser scanning cytometry / A P. Halestarp, E. Bedner, Li. Xun, J. Kunicki et al. // Cytometry. 2000. - Vol. 41, N 1. - P. 83 - 88.

105. Halliwell, B.O. Antioxidants and human disease: A general introduction / B.O. Halliwell // Nutr. Rews. 1997. - Vol. 55, № 1 (p. II). - P. S44 - S45.

106. Hug, H. Rhodamine 110-linked amino acid and peptides as substrates to measure caspase activity upon apoptosis induction in intact cell / H. Hug, M. Los, W. Hirt, K.M. Debatin // J. Biochemistry 1999. Vol. 38. P. 13906 - 1399.

107. Ioshida, H. Apaf 1 is required for mitochondrial pathway of apoptosis and Brain development / H. Ioshida, Y — Y. Kong, R. Yoshida et al. // Cell. 1998. - Vol. 94. - P. 739 - 750.1. O.i.

108. Javors, M.A. Kinetic characterization of Ca transport in synaptic membranes / M.A. Javors, C.L. Bowden, D.H. Ross // J. Neurochem.- 1981. — Vol. 37, №2.-P. 381-387.

109. Jayadev, S. Role for ceramide in cell cycle arrest / S. Jayadev, B. Liu, A. E Bielawsca // J. Biol. Chem. 1995. - Vol. 270, N 5. - P. 2047 -2052.

110. Jobsis, F.F. Oxidative and glycolitic recovery metabolism in muscle. Fluorimetric observations on their relative contributions / F.F. Jobsis, J.C. Duffield // J. Gen. Physiol. 1967. - Vol. 50. - P. 1009 - 1047.

111. Katz, A.M. Control of calcium permeability in the sarcoplasmic reticulum / A.M. Katz, J. Dunnett, D.I. Repke, W. Hasselbach // FEBS Let. -1976. Vol. № 2. - P. 207-208.

112. Klouwen, H.M. In The Cell Nucleus Metabolism and Radiosensitivity / Klouwen H. M. et. al. 1966. - P. 295.

113. Kroemer, G. The protoocoge Bel 2 and its role in regulating apoptosis / G. Kroemer // Nature Med. - 1997. - Vol. 3. - P. 614 - 620.

114. Kuida, K. Caspase 9 Inter. J. / K. Kuida // Biochem. - 2000. - Vol. 32,N2.-P. 121-124.

115. Maisin, J.R. Influence of mixture of chemical protectors on the lymphopoietic fiand hematopoietic system of mice irradiated with a dose 2000 rad of X-rays / J.R. Maisin // Experientia. 1968. - Vol. 24, № 3. - P. 230 - 231.

116. Marnett, L.J. Oxyradicals and DNA damage / L.J. Marnett // Carcinogenesis: Oxford, 2000. Vol. XXI, № 3. - P. 361 - 370.

117. McGroww, C. F. Localization of calcium in presyneptic nerve terminals: an ultrastructural and electron microprobe analisis / C. F. McGroww, A.V. Somlyo, M.P. Blaumstein // J. Cell. Biol. 1980. - Vol. 85, № 2. - P. 228 -241.

118. Menini, A. Calcium signalling and regulation in olfactory neurons / Menini A. // Curr. Opin. Neurobiol. 1999. - Vol. 9. - P. 419 - 426.

119. Mignotte, B. Mitochondria and apoptosis / B. Mignotte, J.-L. Vayssiere //EuropJ. Biochem. 1998. Vol. 252. - P. 1 - 15.

120. Molday, R.S. Calmodulin regulation of cyclic-nucleotide-gated channels / Molday R.S. // Curr. Opin. Neurobiol. 1996. - Vol. 6. - P. 445 -452.

121. Moller, J.V. The sarcoplasmic reticulum Ca 2+ ATPase / J.V. Moller, J.R. Anderson, M. Maire // Mol. and Cell. Biochem. - 1981. - Vol. 43, №2.-P. 83 -107

122. Muller, W.U. Biological indicators for radiation damage / W.U. Muller, C. Stranfer // Intern. J. Radiat. boil. 1991. - Vol.59, № 4. - p. 863-873.

123. Orrenius, S., McCabe M.S., Nicotera P. Ca (2+)-depended mechanisms of citotoxicity and programmed cell death / S. Orrenius, M.S. McCabe, P. Nicotera // Toxicol. Lett. 1992. Vol. 64. - P 357 - 364.

124. Pellmar, T.C. Priority list of research areas for radiological nuclear threat countermeasures / T.C. Pellmar, S. Rockwell et al. // Radiat. Res. 2005. -Vol. 163, № l.-P. 115-123.

125. Qin, Z. H. Pro caspase - 8 is pre - dominantly localized in mitochondria and released into cytoplasm upon apoptotic stimulation / Z.H. Qin, Y. Wang, К. K. Kikly et al. // J. Biol. Chem. - 2001 - Vol. 276, № 11. - P. 8079 - 8086.

126. Racker, E. (Рэкер) Биоэнергетические механизмы: новые взгяды: пер. с англ. Е. Racker (Рэкер) М.: Мир, 1979. - 21 с.

127. Rizutto, R. Microdomains with high Ca close to IP3-sensitive channels that are sensed by neighboring mitochondria / Rizutto R., Brini M., Murgia M.et al. // Science. 1993. - Vol. 262. - P. 744 - 747.

128. Roads, D.E. Ca-ATP-ase activity of ciliary membranes from olfactory receptor cells / Roads D.E., Lo Y.H., Li W. et al. // J. Cell Biol. -1989. Vol. 109, N 4. - (Part 2). - P. 254a.

129. Scholz, P. Flavin and pyridine nucleotide oxidation-reduction changes in perfused rat liver / P. Scholz, R.G. Thurman, J.T Williamson // J. Biol. Chem. 1969. - Vol. 244. - P. 2317-2324.

130. Sham, J.S.K. Ca-release-induced inactivation of Ca current in rat ventricular myocytes : evidence for local Ca signalling / J.S.K. Sham // J. Physiol. 1997. - Vol. 500, N 2. - P. 285 - 295.

131. Shepherd, G.M. Information flow in the olfactory sensory neuron / G.M. Shepherd // J. Physiol. 1991. - Vol. 98, N 6. - P. 2a.

132. Skulachev, V. P. Cytochrome in the apoptotic and antioxidant cascades / Skulachev V. P. // FEBS Lett. 1998. Vol. 423, N. 3. P. 275 - 280.

133. Thorell, B. Absorbancy measurements on lever and kidney cells / B. Thorell, B. Chance // J. Biol. Chem. 1959. - Vol. 184. - P. 934 - 935,

134. Van Winkle, W. Ions and inotropy / W. Van Winkle., Arnold. Barry Schwtz // Anny. Rev. Physiol. Palo Alto, Calif. - 1976. - Vol. 38. - 247-272.

135. Vintermyr, О. K. Microinjected catalic subunit of cAMP -dependent protein kinase induces apoptosis in myeloid leukemia (IPC 81) cell / О. K. Vintermyr, В. T. Gjertsen, M. Lanotte et al. // Exp. Cell Res. 1993. - Vol. 206, N1.-P. 157-161.