Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы генерации кальциевых сигналов в глиальных клетках центральной нервной системы (экспериментальное исследование)

ВАК РФ 03.00.05, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Механизмы генерации кальциевых сигналов в глиальных клетках центральной нервной системы (экспериментальное исследование)"

национальна академ ¡я наук укра1ни

шститутф13Юлоп1 т. о. о. богомольця

г Г 5 О Л

2 2. !\||Р На правах рукопису

КИРИЩУК СЕРИЙ 1ВАНОВИЧ

МЕХАШЗМИ ГЕНЕРАЦ11 КАЛЬЦШВИХ СИГНАЛIВ У ГЛ1АЛЬНИХ КЛ1ТИНАХ ЦЕНТРАЛЬНО! НЕРВ0В01 СИСТЕМИ

(експериментальне дослщження)

03.00.05 - БЮФ13ИКА

автореферат дисертацл на здобуття наукового ступеня доктора бюлопчних наук

Киш - 1996

дисертащею с рукопис

1'о6о|у ипконлно и ¡нсгитуп фиюлогп ¡м.О.О.Ьо!омольця Н;1шиналы11)1 Академи наук УкраТни

Консультанта : академ1к, доктор бюлопчних наук

Костюк Платон Григорович доктор медичних наук, Верхратський Олексш Несторович

Офщшш опоменти: академ1к, доктор медичних наук Шуба Михайло Федорович; доктор бюлопчних наук, Малишева Маргарита Костянтишвна доктор ф13ико-математичних наук Тесленко Висгор 1ванович

Провщна установа: 1нститут ф1зюлоп1 при Кшвському ушверситеи ¡м. Тараса Шевченка

вщбудеться " " 1996 року о

Захист вщбудеться " у " УЧ^^УИ-ЭС- 1996 року о (у годиш на засщанш спещал1зовано! ради Д - 01.13.01 при 1нституп ф1зюлогп ¡м.О.О.Богомольця Нащонально! Академи наук Украши за адресою: 252024, м.КиТв, вул. Богомольця, 4.

3 дисертащею можна ознайомитися у б1блютеш 1нституту ф1зюлогП ¡м.О.О.Богомольця НАН Украши.

Автореферат розюланий " / " ^(п И* 1995 р

Вчений секретар спешал1зовано! ради,

доктор бюлопчних наук Сорокина-Марша 3.0.

злгалъна характеристика роботи

Актуалыметь теми. [Зпутрпппьоклмпмний юмпонаний кальцш i одним з найбшьш уншерсальних регулятор1в функщювання юптин. У ста hi спокою концентращя клопиного юшзованого кальцто [Ca2+]j утримуеться на низькому piBHi (10 "7 моль/л, у позаклггинному середовииц - 10 "3 моль/л). Змжи [Ca2+]j контролюють найважлив1нп цитоплазматичт процеси, MKi с основою збудливостц секреци, пластичности метабол1чних процеав та регуляцп функцповання генетичного апарату. Постшна i точна рсгулящя внутршньоклггинно! концентрацп юшв кальшю як у сташ спокою, так i пщ час loiiTHHHOi' активное^ забезпечуеться функшюванням клггинних структур -внутршньоюптинних (внутршшьокштинш кальщев! депо та мп-охондри) та розташованих на плазматичнш мембраш (кальшев! канали, кальшев1 насоси та система натрш-кальщевого обмшу).

Основн1 параметри цих мехашзм1В ¡нтенсивно дослщжуються протягом останшх десятир1чь. Поява найсучасшших метод1в, як електроф1зюлопчних -ф1ксащя ¡зольованоТ частини юптинно! мембрани (patch-clamp), так i оптичних - флуоресцентш ¡щцкатори та конфокальна техшка, значно прискорила вивчення функщювання структур, яга регулюють [Ca2+]j. Однак, онтогенетична регулящя i взаемозв'язок цих структур потребують подальших дослщжень. Необхщно також пщкреслити, що левова частка експерименйв виконуеться на нервових к_1итинах та м'язах В той же час шформащя про функщювання мехашзм1в , яи вщповщають за регулящю внутрiшньокл¡тинного кальщю у ппальних юптинах, що вважали за пасивний, структуральний елемснт мозку, у свгговш л1тератур1 дуже обмежена.

Мета та завдання дослшження. Мета роботи полягала у дослщженш систем, яш регулюють [Ca2+]j , у трьох основних типах ппальних клггин центрально! нервовоТ системи - ол1годендроцитах, астроцитах та мжроглп.

Для досягнення мети визначет таю завдання:

1. Розробити методики вим1рювання внугр1шньокл1Тинно! конце нтраци

ютв клльцпо пиальних клггин центрально! нервово! системи у культуральних умовах та у тонких зр1зах мозку.

2. Дослшкти особливосп функппоиання кальщ'евих каналш плазматично! мембрани протягом онтогенетичного розвитку пиальних клггин.

3. Дослщити особливост1 функцшвання внутршньоюптинних кальщевих депо пиальних юйтин.

4. Розробити схему взаемодп мехашзм1в, що регулюють внутршньоюптинну концентращю юшзованого кальщю, в основних типах юптин нейропиально! л ¡ни центрально! нервово! системи.

Наукова новизна роботи.

Доведено, що протягом онтогенетичного розвитку кл1тин сшгодендроцитарно! лши вщбуваються змши як репертуару експресованих кальщевих кангшв плазматично! мембрани, так 11х розподшу на мембран!.

Вперше дослщжеш внутршньоюптинш кальщев1 депо у кштинах ол1Годендроиитарно1 л ¡ни та виявлена залежшсть !х функцшвання вщ фази розвитку.

Вперше показано, що розподы активних маохондрш у цих юлтинах залежить вщ фази онтогенетичного розвитку.

Вперше дослщжеш кальщев1 депо клггин астропиально! лши у тонких зр1зах мозку. Доведена залежшсть функцшвання цих депо вщ р1вню внутршньок л ¡тинного кальщю.

Показано юнування та функщональну роль р^анодин-чутливих кальщевих депо у юптинах астроцитарно! лши у тонких зр1зах мозку.

Вперше показано ¿снування та ф1зюлопчну роль системи натрШ-кальщевого обкину та мггохондрш астроцштв у тонких зр1зах мозку.

Доел¡джен 1 кальщев! депо у кляинах мжроглп. Доведено, що звшьнення кальщю з цих кальщевих резервуар1в, призводить до вщкритгя специф1чних кальщевих каналов плазматично! мембрани.

Показано, що основними системами, котр! вщповщають за зниження

pinnK) калымя до базального, е кальщев1 насоси : плазматичнсм мембранм та внутршньоюптинш. При цьому роль насоеш плазматичноУ мембрани, як! пинодять кальцш у позаюптинне ссрсдовище, - домшуюча, що може бути основою нсйрон-шальноУ пзасмодп.

Практична ппппсть роботи. Отримаш noni принципов! результата про функциовання та взаемозв'язок мехашзм1в регуляцп кальцпо у кл ¡тинах I[сiiрогл¡плыIо'Г лiпi'f, то можс маги принциповс значения удоелтженнях роботи мозку та корекцп порушень функцюнального стану центрально') нервовоУ системи.

Апробашя роботи. OcHOBHi положения роботи доповщались та обговорювались на семшарах 1нституту ф1зюлопУ ¡м.О.О.Богомольця HAH УкраУни, бвропейськш конференцй' з ппальних юитин (Гайдельберг, 1993), Всесвгенш конфсренщУ ф1зюлопчних товариств (Глазго, 1993), Конференцй бвропейськоУ асощацП з нейронаук (ВЬцень, 1994), Конфсреншях ф!зюлопчного товариства Велико! Британи (BipvtiurcM, 1994; Бристоль, 1996), Конференцй ф1зюлопчного товариства Шмеччини (Готтинген, 1995), Конференцй нейроф1зюлопчного товариства Шмеччини ( Берлщ, 1996), семшарах у наукових установах Велико! Британи та Шмеччини.

ПублжашУ. За материтлами дисертаци опубл1ковано 23 роботи.

Обсяг та структура роботи. Дисертащя викладена на 253 сторшках, ¡люстрована 4 таблицами та 79 малюнками, складаеться 3i вступу, огляду л1тератури, викладення методик дослщжень, трьох глав результата, обговорення результата, висновюв та списку цитованоУ Л1тератури, який вмщуе 263 джерел.

3MICTРОБОТИ Методи та об'екти дослщжень

Кулътуралът клтини. Для доелдав були використаш культуральш клггини мйсроглй та ол1годендроцит1в. Методики вид1лення та культивування юитин

и

схож1. Фрагмента мозку обробляли 0.1 % розчином трипсину на протяз1 15 мтлин за течпсратури 35 °С. Шсля мого юптини переносили у культуральне '■епскниппе п\1 РМ. ло я ко го додавали Ю % сиропаткн велико? ро| атоТ ху.чоби, га ломшали у СС>2 ¡нкубатор ( газове середовище 5 % СО2 + 95% О2, температура 37 ОС). За 4-5 днш нейрони знищувались ¡муноцитсмшом. Юптини - мшропию чи ол1годендроцити, шо знаходилися на поверхт моношара ^ фоцппв. 'огрушукапням переводили у суспензии. Офимаиа еуепепзш персносилас!. у нов! чашки Пстр1 та пом1щалась у ¡нкубатор. Культуральш ю-птини викеристовувались для дослшв протягом наступних 5-10 д1б. Гопк! зрЬи льчку. Експерименти були проведен! на зр1зах мозочку мишей лшп ММШ в1ком шд 5 до 45 д1б. Шсля декаттаци мозок занурювали у холодний ф1зюлопчнии розчин ( 0-4 °С) та вир1зали мозочок. Отриманий об'ект ирикртлювали пол1акршамщним клеем до пщложки камери в1бротома, також заповнено! чолодним ф1з1олопчним розчином. За допомогою микротома нарЬали сапгальт слайси товщиною 150-200 мкм. ГПсля цього тоню зр1зи переносили у карбонатний ф1зюлопчний розчин кжнатно!' температури, постшно газований карбогеном (5 % С02 + 95% 02). Отримаш зр1зи мозочку ммкористовуиались для дослшв протягом 4-6 годин.

[мунологшт методи. Роботами професора М. Шахнер було показано, що за допомогою специфнних антитш ( так звано1 О сери) можна щентифшувати р1зн! стада розвитку ол1годендроштв. У вах дослщах, проведених на культур! ол'тэдендроштв, до початку експерименту шитики шкубували протягом 1520 хвилин у фшолопчному розчин!, збагаченному вщповщним антиплом, яке було з'еднанс з люмшофором родамшом. Перед вим1рами у флуоресцентному евгап (родам¡н поглинае зелене свило, а випромшюе - червоне) вщбирали для дослщжень кл1тини на р1зних стад1ях розвитку : 04-негативш - клггини-попередники, 04-позитивш - молод! ол1годендроцити та ОЮ-позитивш - зрш ол1годендроиити. Назви були запропоноваш у роботах М.Шахнер : ми будемо дотримуватися шеЧ номенклатури.

Едс1строф1зшлог1'чт методы. Рсироблена Hammil, Neher & Sackmann (1981) методика електрично! ¡золяцп фрагмента юитинноГ мембрани (patch-clamp) е riponinioio у лослшжешп ioniiifx струмш У лослшах, ииклалепних у uiii робоп, була використана конф1гуращя whole-cell uiei методики. Пипетки, виготовлеж ¡з мол1бденового скла, мали електричний onip 3-5 МОм. Електричний onip шунта м1ж мембраною клггин та пипеткою був не менше 5 ГОм. Реестрацп проводилися за допомогою пщеилкмшча ЕРС-7 чи ЕРС-9 (List Electronic, Шмеччина) та персонального комп'ютера. Для обробки була використана програма TIDA, розроблена групою Кетенмана, Гайдельберг, Шмеччина.

А Б

Мал. 1. Флуоресценттп спектри барвниюв Шга-2 (А) та Пио-З (Б).

Флуоресцентн1 шЫкатори. Синтез х1м1чних з'еднань, що реагуючи з ф1з1олопчними юнами, змшюють сво!" оптичш характеристики, призв!в до значного прогресу у питаниях, пов'язаних з роллю цих юшв у функшюваню клтш. Флуоресцентш зонди можна подшити на дв1 велию категорп : дво- та однохвильовг Останш при з'еднанш з юном м1няють гальки ¡нтенсившсть флуоресценци. 31'х допомогою не можливо проводити гальгасш вим1ри, осюльки оптичний сигнал е функщею як концентрацп ¡ошв, так ¡, наприклад, концентрацп ¡нд!катору.

Дпо;;вильов1 ¡ндкатори, з'еднуючись с ¡оном, змшюють свш спектр збудження (наприклал, Гига-2) чи нинромшсння (наприклад, indo-1). Одночаспс пим'фюпапня сигналт, характсрних для нсзп'язанноТ та зп'язанноУ форми чопду, дае змогу розрахувати дшсну концентращю íohíb.

На малюнку I зображеш спектри збудження кальщевих зощнв fura-2 та fluo-3. При poöoTi з fura-2 були використаш хвил1 360 та 380 нм для Ыщацп флуоресцспшТ, íiHMÍpn проподилися па довжиш XBiiJii 510 им. Концетрацно кальшю розраховували за формулою :

[Ca2+]¡ = K/ß* ( R-Rmin)/(Rmax-R) де R - вщношення флуоресцентних ситал!в, вим1ряних при збуджснт сштлом 360 i 380 нм, Rmin - вщношення у розчиш з високою (10 мкмоль/л) концентрашею кальцш, Rmax - вщношення у середовищ1 с низькою (10 мкмоль/ л EGTA) концентращею кальщю, K<i*ß - константа дисощаци комплексу кальцш-fura У наших умовах щ параметри дор1внювали - 0.2, 1.25 та 2992, в'щповщно.

KanbixieBi си гнали, отримаш за допомогою зонду fluo-3, наведеш у вщношенш вим1рюемого параметру до сигналу у стаж спокою, тобто на початку дослщу. Експериментальш методы. BnMipn проводилися за допомогою двох метод1в: лазерного скануючого конфокального м!кроскопу (Sarastro-2000, Molecular Dynamics, USA) та однодетекторно! двохвильово! кальщево! системи ( мал.2 презентуе принципов! схеми).

Конфокальна техшка. Лазерна конфокальна скануюча мжроскошя (ЛК.СМ) базуеться на використанш лазеру для збудження зонду, що дае можливють ¡ндукувати флуоресценщю в об'ем1 меньшому за 1 мкм3 , i можливост1 фокусувати лазерний npoMinu у довшьнш точщ трим1рного простору. На той же час, сканування вщбувается послщовно, тобто точка заточкою, i отримання TpHMipHoi' структури кдшши потребуе часу (приблизно 1 хвилина). Сканування виключно фокально! площини (256*256 шксел1в) потребуе 5 сек. Надаеться також можливють сканувати одну чи декшька лшш у фокальнш площиш, що забеспечуе бистродш - 128 гпксел1в ( одна лш1я) у 10 мсек.

Б

феп

Мал.2 Принципов! схеми конфокально'1 (А) та двохвильово! кальцШметрично! (Б) установок.

Трикпрна мода була використана тгльки задля реконструкцц трим^рноТ сгрукгури пиальних клгтин у тонких зр1зах мозку. Це значно полегшуе Тх щентифжащю. Основш вим1ри проводились у режим! сканування фокально! площини; сканування л ¡ни було використане для вим1рювань швидких, неоднорщних у простор! процеслв.

Параметри лазеру, наявного у нашому випадку, не дозволяли проводити дослщи з використанням двохвильових кальщевих зощцв, тому вс1 експерименти були проведен! з ¡щцкатором Яио-З. На початку кожного експерименту проводилося сканування у вертикальному напрямку ! знаходилася найкраща позиц!Я для

фокально!' площини. По закшченш дослщу nepmi три цифров! зображення ннкористовунали для нормування калыйевих сигналш.

Олнодетекторна двохвильова калыиева система. Оптичнп частица nie! методики принципово не вщр!зняеться вщ наведено! вище. Вщмшшсть полягае в тому, що у данному випадку за допомогою кальцшметрично!' системи можна зм!нювати довжину хвшп св!тла, що збуджуе флуоресценц!ю зонду fura-2. BLanonlani фшьтри були змоптоваш на колсш, що кругилося з частотою 5 Гц. Кальцшметрична система роздшяла та рееструвала флуоресцентш сигнали, KOTpi вщповщали довжинам хвиль 360 та 380 нм. По закшченш реестрацй' концентрашя кальшю розраховувалась за формулою, наведеною вище. Диафрагма розм1ром у 1 мм обмежувала 40 мкм зону у фокальн!й площиш, сигнал вщ яко! рееструвався детектором.

За допомогою uiei методики ми мали змогу робити KmbKicHi вим1ри змш концентраиГ! кальц!ю, але втрачали можлив!сть вивчати просторов} неоднор'щност!.

Розчини. Пщ час роботи з культурами використовувався стандартний розчин (у ммоль/л) : NaCl - 150, KCl - 5.4, СаС12 - 2.5, MgCl2 - 1, HEPES-NaOH - 10, глюкоза - 10 (рН=7.4). Для тонких 3pi3is (у ммоль/л): NaCl - 125, KCl - 3, СаС12 - 2.5, MgCl2 - 1, NaHC03 - 26, КН2Р04 - 1.8, глюкоза - 10 (рН=7.4). У безкальщевому розчит кальц'ш було замшено на магнш та додано 1 ммоль/л EGTA. У розчинах з пщвищеною концентращею кал1ю - вщповщна частка натрпо зам!нювалась на кал!й.

При диал1з! кл!тин був використаний внутрииньопипеточний розчин (у ммоль/ л): KCl - 130, MgCl2 - 1, АТФ-Mg - 2, HEPES-KOH - 10 (рН=7.2), який кпстив також , якщо не вказано ¡нше, 200 мкмоль/л fura-2 або fluo-3.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛЩЖЕНЬ I. Pißciib концентраци ¡ошв калыцю у тальних клгеинах центрально! нервово! системи

На BittMiny вщ нейрон1в, яи мають досить стабшьний ревень [Ca2+]j у

сташ спокою, р1вень концентрацп юшв кальщю в уах трьох типах пиальних клтш .¡находимся у широкому д1апазош (нщЗОдо 300 нмоль/л, мал. 3). Р1зпиим ришя [Сп2+]! 1 |с ппливпла ил гютсшиал спокою клтш. який занжли чнпхо/шмся

А

ол1годендроцити

50 100 1 50 300 250 100

астроцити

|||||

50 100 150 200 250 300

Мал.З Гистограмм розподыу

ВНуТр1шНЬ0КЛ1ТИНН01 концентрацп юшв кальщю в пиальних титанах ЦНС у сташ спокою.

В

М1КрОГЛ1Я

|||в!_

50 100 150 200 250 300

[Са2+]|

у д1алазош -80 - -60 мВ. Це дае змогу стверджувати, що така варшбсльшсть не е наслщком процедури препарування. Цижом можливо, що ппальш клтши приймають участь у регулюванш позаклп-инно! концентрацп не тшьки калпо, але також 1 кальщю.

II. Калыпсвий гомеосгаз у кл¡тинах (шгодеироцитарноТ Л1Н11

2. / Потешиал-залежи/' калыцет' капали

Деполяризащя мембран юптин оЛ1Годендроцитарно1 лшп ашпкашею розчину з тдвищенною концентращею ¡ошв калт (50 ммоль/л) викликала тдвищспня |Са2+]|. Кальшсвий транз1снт зникап у безкалыисвому розчиш (п=12) та блокувався 100 мкмоль/л верапамшу (п=7). Це дае змогу стверджувати, що пщвищення вщбуваеться внаслщок активаци потенщал-залежних

кальщевих каиал!в. 1нкубування юптин у розчиш, що мютив 100 мкмоль/л р1анодину (п=8) або 0.5 мкмоль/л тапагаргшу (п=5), не впливало на кальшсвий транз1ент, що вказуе на вщсутнють Са^+Чндукованого вившьнення кальцпо ¡з внутршньокчп-инних депо.

Щоб з'ясувати, яьа саме типи кальщевих канашв експресуються, були використаш розчини з р1зною концентращею кальщю (10, 20, 30, 50 ммоль/ л). При цьому слщ виЫтити, що юптини-попередники та зрш олтодендроцити (ОЛЦ) по-р1зному вщповщали на кал1еву деполяризащю.

У клпгинах-попередниках ашпкащя 20 ммоль/л К+ викликала пщвищення

ршня

[Ca2+]i виключно у вщростках, а 50 ммоль/л К - по всШ клптон, хоча амгштуда вщповци у сом1 була приблизно у швтора рази меньша (1.6 ± 0.3, п=27, мал.4). Аплнсащя 50 мкмоль/л №2+, блокатора Т-типу кальщевих канал ¡в, зменьшувала амплитуду кальщевого транз1ента, який був ¡ндукований 20 ммоль/ л К+, у вщростках у 1.6±0.2 рази (п=7), не впливаючи на вщповщь у сом1. Кальщевий сигнал, який був викликаний 50 ммоль/л К+, збшьшувався у розчиш, що М1стив 1 мкмоль/л ВАУ К 8644 (п=4), 4 пригшчувався у присутноеп 10 мкмоль/л нифедшну (п=5). Таким чином, можна стверджувати, що у юптинах-попередниках експресоваш два типи кальщевих канал1в, а саме, Т-та Ь-типи.

У зрших ОЛЦ ашпкащя 50 мкмоль/л №2+ не впливала на кальщев1 транз1енти, як! були ¡ндуковаш кал1евою деполяризащею. Але вони

потенцповались у розчиш, що мютив 1 мкмоль/л ВАУ К 8644 (п=7), \ зменьшуиались у присутньосп 10 мкмоль/л нифедшшу (п=6). Амплпуди були завжди бшыш у вщростках (у 2.0±0.3, п=43). Таким чином, можна стперджувати, що у зришх ОЛЦ експресовано Ь-тип кальщевих канал1в (мал.4). Слщ також

сома вшростки

20 тМ К-*- 30 тМ К+ 50 тМ К+

А

л

Э тМ К* ЗОтМК* 50тМК*

В

Мал.4 Кальщев1 вщповщ, викликаш кал1евою деполяр1защею у юнтинах-попередниках (А) та ол1годендроцитах (Б,В).

завважити, що навпъ деполяризащя 10 ммоль/л К1 викликала пщвищення [Са2+]; у вщростках зрших ОЛЦ (п=3, мал.4).

2.2 Внутртньоклтинш калъщевг депо 2.2.1 1нозпчэлтрифосфат-чутливе кальщеве депо Ашпкащя 100 мкмоль/л АТФ викликала пщвищення внутршньоюптинно!

в

з.о-

t

UL

ЮцМАТР

3.0-1

£

1.0

ЮцМАТР

30s

3.0-1

1.0 J

ЮцМАТР

Мал.5 АТФ-шдуковаш кальщев1 вщповда у юптинах-попередниках (А), молодих (В) та зрших (С) «шгодендроцитах (а-сома, в-вщростки).

концентраци íohíb кальщю у зрших ОЛЦ, але не в клгошах-попередниках (на

мал.5 приведен! морфолопчш та кальцшметричш дат). При цьому, як ! у випадку з калыиеиими каналами, вщповшь у со,\п була значно мсньша за ампл"|тулою у портнянш ч транз1еитом у шлросткпх ( у 2.2+0 5 раш, п = 35). Ашикатею розчишв, яю мштили р1зн1 концснтраци АТФ, було з'исонано, що порогова концентращя агонюта становить 1 мкмоль/л, а нагпвмаксимальна вщповщь ¡нщпоеться 5-7 мкмоль/л АТФ (п=17).

Сурамш (100 мкмоль/л) - мало спсцифгший блокатор Р2-типу пуринорецепторщ - зменьшував амплпуду кальщевого сигналу на 90±9% (п=21). що дае змогу стверджувати, що ОЛЦ експресують якийсь ¡з Р2-рецепторш. Щоб з'ясувати, який саме тип пуринорецептор1в експресовано у ОЛЦ були протестоваш аденозин, аденозинмонофосфат (АМФ), аденозиндифосфат (АДФ) та урдантрифосфат (УТФ). Були отримаш наступи! результати : у юнтинах кори - АДФ>АТФ>>УТФ=АМФ=аденозин (п=12), у ретин! - УТФ >АТФ>> АДФ =АМФ=аденозин (п=14). Тобто, рецептор, експресований у ОЛЦ, належить до метаботропних Р2у Та пуринорецептор!в.

[нкубашя ОЛЦ у розчини, що мютив тапагарпн (10 мкмоль/л) - блокатор внутршньокштинних кальщевих насос!в ендоплазматичного ретикулуму, пригн!чувала кальщеву вщповщь на АТФ на 80±13% (п=15). Бшьш того, диал!з кл!тин ол!годендроцитарно\'лши розчином, до якого було додано 10 мкмоль/ л гепарину - специф!чного шпбпчэра 1п5Рз-чутливого кальц!евого каналу ендоплазматичного ретикулуму, також призводив до блокування кальщевого транз!ента (п=7). Диал1з нормальним внутр!шньокл!тинним розчином не впливав на реакщю (п=7).

Задля перев!рки можливого культурального артефакту ряд дослдав було проведено на тонких зр1зах мозку. Як ! в культур!, ашикац!я АТФ викликала кальщевий транз!ент виключно у зрших ОЛЦ ! не впливала на р1вень [Са2+][ у клггинах-попередниках (п=12).

Наведен! результати вказують на те, що ашпкащя АТФ призводить до активацй метаботропних рецептор!в, синтезу ¡ноз!толтрифосфатута вившьнення кальщю ¡з внутр!шньокл!тинних депо.

2.2.2 Р1анодин-чутлипе кальщеве депо Ж апл1кашя кофеТну (до 40 ммоль/л. м=15), ш р1пнолину (до 100 мкмоль/ л, п=17) не викликали змши р1вня внутр1шньоклп'инно1 концентрацм кальцш. Кальщев! тран'ленти, яю ¡ндукувалиея кал1евою деполяризащею чи АТФ, також не були модульовань Це дае можливкть вважати, що кл1тини о.'пгодендроцптарноТ лшп практично не скспресують р1анодинових рсцептор1в ¡, як результат, р1анодин-чутливе депо не приймае участ1 у регуляцп [Са2+]|.

2.2.3 Мггохондрп

Для дослщження розподшу м1тохондр1й у юптинах олтэдендроцитарно! лшп був використаний специф1чний флуоресцентний маркер родамш 123. 10-хвилинна ¡нкубацгя юитин у розчиш, що мютив 1 мкмоль/л родамшу 123 показала, що у юитинах-попередниках мпчэхондрй концентруютьея майже

Мал.6. Кальщев1 транз1енти, викликаш аплисащею мггохощцяального блокатора СССР у клшшах-попередниках (А) та зрших ол!годендроцитах (Б). Пуст! символи - сома, заповнеш - вщростки.

виключно у В1дростках, а у зрших ОЛЦ - розподшяються однорщно. Ашпкащя 10 мкмоль/л СССР (п=17) - блокатора М1Тохондр1ального транспорту протошв - викликала значне пщвищення ргвня що говорить за те, що мггохондрц

мають значну кшыасть зв'язаного калыдпо. Однак, як I у випадку з родамшом 123, у юитинах-попередниках кальщевий транз1ент виникав лише у вщростках, а в зрших ОЛЦ - по всш клггиш (мал. 6). Базуючись на наведених даних,

можна вважати, що у молодих ОЛЦ мпхзхондрп зосереджеш виключно у шдростках. Однак, спроба перев1рити це тисрдження за допомогою електронно'1 м1кроск<->пГ|" показала, то 1 кшьюсть. 1 чорфолопя м1тохондрж онюрщж по всш клпиш. Таку розб1жшсть результат!» можна пояснитн тим фактом, що I родамш 123, 1 СССР реагують з мшжондрьями, що мають низький потенщал мембрана (-200 мВ) - "активш" мггохондрп. Базуючись на цьому факт1, можна ствсрдж\вати, що у кл1тинах-поперсдниках "активж" М1тохондри розташоваш у вщростках, а у зрших ОЛЦ - 1х розподы однорщний.

2.3. Мехашзми вилучення юшв кальщю Для функшювання кл1тин принциповнм е не тшьки можливють пщвищувати р1вень [Са2+], у вщповщь на стимул, але й вщновлювати р1вень спокою. У наших дослщах кальщев1 транз1енти були викликаш ашикащею розчину. який мктив 50 ммоль/л КС1.

Ь|кубування клггин у розчиж, що \пстив або 10 мкмоль/л СССР (п= 12), або 10 мкмоль/л р1анодину (п=11), не впливала на кшетики кальщевих вщповщей. Ашнкащя безнатр1евого розчину (екв1молярна замша на NN№0) (п=6) не змшювала ш р1вень [Са2+]; , ж юнетику кальщевих транз1ент1в, ям були ¡ндуковаш кашевою деполяризащею. Наведен! дат вказують на те, що роль мпохондрш, р1анодин-чутливого депо та системи натрШ-кальщевого обмшу у вшновленш базального р1вню | незначна.

Зовжшньоюптинна ашнкащя 3 ммоль/л Ьа3+ - антагошсту кальщевих насос1в плазматично! мембрани - уповшьнювала процес вщновлення базового Р1ВНЯ [Са2+]| у 5-7 раз1в (п=12). Тапагаргш (10 мкмоль/л) також викликав зниження швидкостс цього процесу (1.5±0.2, п=8). Таким чином, основне значения у вщновленш базального р1вню [Са2+]^ у юитинах ол1годендроцитарно! лши вдаграють кальщев1 насоси плазматично! мембрани та ендоплазматичного ретикулуму.

Ш. Калынсвий гомеостаз у шитиках Бергмашвсько! глГ| мозочка

3. / Плачмалсмалыи калыцсв! качали Юптини Бергмашвськсн глп (БГ), яю належать до астроципв, мають иисокий р1вснь пасивно! кал1ево! провщнос™ I не експресують нотешиал-залежних, у тому числ1 калыпевих, канагив (мал.7).

На той же час, агшкашя ка'шату (100 мкмоль/л) викликае зпачне

+30 тУ

-160 тУ

20 гш

Мал. 7 Клггини БергмашвськоТ г л и не експресують потешпал-залежних канал 1В.

пщвищення р1вня [Са2+]; (до 500 нмоль/л). Ефект кашату блокувався у безкальщевому зовншньокл ¡тинному розчиш та додаванням 10 мкмоль/л СЫСЗХ - специф1чного ¡нпб1тора АМРА/КА типу глютаматних юнотропних рецептор1в. Таким чином, можна сказати, що БГ експресуе юнотропний глютаматний рецепор, який являе собою неспециф1чний канал, кр1зь який проходять ¡они Ыа+, Са2+ та К+. Фракшональна провщнють цього каналу для ¡ошв калыдю становить 2-3 %.

3.2 Внутршньоклтинш кальщев1 депо 3.2.1 1нозгголтрифосфат-чутливе калылеве депо. Як показано у табл.1, кр!М вищезгаданного кашату, АТФ, гистамш

та адреналж пикликали гндвищеннл |Ca2+]j у юптинах БГ. Приклали калыисвих тр;иi3ÍtHTÍB, як1 були ¡ндукопаш цими рсчопинами, приведен! на м а л. 8

Таблиця 1.

Концентрац!я [Ca2+]¡ Число КЛ1ГИН

Аспартат 10 - 1000 - 9

АТФ 10 - 1000 + 37

Брадик!н!н 0.1 - 10 - 11

Допамш 10 - 1000 - 9

Адренал!н 0.1 - 10 + 44

ГАМК 10 - 1000 - 12

Гл!цин 10 - 1000 - 14

Гистам^н 1 - 1000 + 4!

Гомоцистеат 10 - 1000 - S

KaiHaT 10 - 1000 + 51

Норадренал!н 0.1 - 10 + 15

Okcítoühh 1 - 10 - 18

CepoTOHÏH 10 - 1000 - 12

Соматостатш 1 - 10 - 10

Субстанц1я Р 1 - 10 - 11

TaypÍH 10 - 1000 - 7

Вазопрес1Н 1 - 10 - 15

Щоб з'ясувати мехашзм, за рахунок якого вищезгадан! агошети шицюють кальщевий сигнал, були проведен! наступи! тестов! дослщи. Шдвищення внугршньокл1тинно1 концентраци, викликаш ашикащею АТФ, адреналша чи гистамша, не змшювалося при замш зовн!шньокл!тинного розчину на розчин, що М1стив 1 мкмоль/л ТТХ, 10 мкмоль/л б!кукул!на - блокатора ГАМК-

рецепторш та 10 мкмоль/л СЫ(}Х - шпптора кашатних рецепторш. Базуючись Н1 них данпх, можна вважати, що АТФ-, адреналш- та гиетамш-шдукований чр|ст [Са2+^ виникають пнаслшок яктивапп рецептор1в, скспресованих титанами БГ.

Агшкацп зростаючих концснтратй вщповщних агошспв дали можливють побудувати крив1 доза-вщповщь. Для адреналшу порогова концентращя

А

400 -I

60

В

250 1

100 мкМ кашат

30-'

220 л

40

100 мкМ АТФ

200 1

50

3 мкМ адреналш

10 мкМ гистамш

Мал. В Кашат-, АТФ-, адреналш- та гистамш-шдуковаш кальщев1 вщповцц у юптинах Бергмашвсько! гли у тонких зр1зах мозку.

дор1внювала 0.3 мкмоль/л, а 3 мкмоль/л викликала кальщевий транз1ент нашвмаксимально! амгштуди. Для гистамшу щ параметри дор1внювали 1 мкмоль/л та 30 мкмоль/л, вщповщно. Для АТФ - 1 мкмоль/л та 50 мкмоль/л.

Для визначення типу пурино-, адрено- та гистамшо-рецептор1в були нсрсшрсш спсциф1'[Н1 агошсти та антагошсти вишоищних рецепторов.

Аил1каши феншефршу (I мкмоль/л, п=7) - спсциф1чного активатора «1-типу адренорецептор1в викликала кальшевий транз1ент, схожий па адренапш-¡ндукований, а клонццн (до 10 мкмоль/л, п= 10) - активатор а2-типу рецептор1в та ¡зопротеренол (до 10 мкмоль/л, п=11) - агошет (3-типу не змшювали ршню (Са2+]| Також нсефективт були блокагори а2- та |3-гипу рецелторш, шдповщно йохимбш 1 пропранолол (п=6), а празозн) (1 мкмоль/л, п=12) пригшчував адреналш-1ндукований кальщевий транз1ент на 85110% (п=11). Таким чином, можна стверджувати, що юнтини БГ експресують сх|-тип адренорсцептор1в.

У випадку з гистамшом ш димапрн (100 мкмоль/л, п=4), ш альфа-метил-гистамш (100 мкмоль/л, п=6) , вщповщно активатори Н2- I Нз-рецептор1в, не викликали кальщевих вщповщей. Також антагон1сти Н2- 1 Н3-рсцептор1в, рантдш (1 мкмоль/л, п=5) та тгоперамш (1 мкмоль/л, п=5) не змшювали гистамш-шдукований кальшевий транз1ент. Антагошст Н|- типу -хлорфетрамш (1 мкмоль/л, п=7) майже повжетю блокував гистамж-¡ндукований кальц1евий транз1ент (до 9515%, п=8). Таким чином, можна стверджувати, що клггини БГ експресують Н,-тип адренорецептор1в.

Сурамш (100 мкмоль/л) - не дуже специф1чний блокатор Р2-типу пуринорецептор1в - зменьшував амтнтуду кальщевого сигналу на 75120% (п=8). Ашпкаци аденозину, аденозинмонофосфату (АМФ), аденозиндифосфату (АДФ) та уршнтрифосфату (УТФ) дали наступш результати : АДФ=АТФ>>УТФ=АМФ=аденозин (п=9). Тобто, рецептор, експресований у юитинах БГ, належить до метаботропних Р2У пуринорецепторт.

Як вщомо ¡з лп-ератури, вс1 три типи рецептор1в, що експресуються клтшами БГ, належать до метаботропних рецептор1в, тобто IX активащя супроводжуеться синтезом [пбРз та вив1льненням кальцш ¡з внутршшьокл1тинних депо. Дшсно, кальщев1 в1дповш, ¡ндуковаш вищезгаданими речовинами, не залежали вщ зовжшньоюнтинного кальщю (п=12 для кожного агошету).

1 1

¡нкубацш у розчиш, що М1стив тапагарпи (1 мкмоль/л) - блокатор внутршньоюптинних кальщевих насоав ендоплазматичного рстикулуму, нсоборотньо пригшчувала калмпеш шлпопш (п=15). Бш.ш того. липлгз о ¡тин БГ розчином, до якого було додано 10 мкмоль/л гепарину - спсциф1чного ¡нпбггора ¡пзРз-чутливого кальщевого каналу ендоплазматичного рстикулуму, також призводив до пригшчення кальшевого транз1енту на 80±П% (п=6). Дпал13 нормальним внутршньоюнтинним розчином не впливав на реакцп (п=5). Наведет даш показують, що клпини Бергмашвсько! глп експресують три типи метаботропних рецептор!в, а саме а(-адрено-, Н|-гистамшо - та Рг-

А

200

|

100

о

о

О 50 100 150 200

гезИпд [Са3']л (пМ)

Мал.9 Кальщев1 вщповш, ¡ндуковаш aктивaц¡eю метаботропних рецептор ¡в, залежать в'щ р1вню ¡Са^+];

пурино-рецептори.

Сл1д також вщмггити, що амплпуди кальщевих вщповщей, як1 було

викликано агипкащею активатор1в метабогропних рецептор1в, були у зпоротнш залежност1 вщ р1вню внутршньоюнтинноТ концентраци ¡слив калышо. Якщо ж р1вснь [Са2+]| перепитував 150-2П0 нмои,/л, пплжацт агонютт не шдукуваля кальшевих транз1ент1в (мал.9).

3.2.2 Р1анодин-чутливе кальщеве депо Агипкацш кофешу (до 40 ммоль/л, п = 12) ни кликала шдви щопня [Са2+]; на 30-50 нмоль/л. ¡нкубащя тонких зркнв мозочку у розчиш, який мюгив р1анодин (10 мкмоль/л, п=8), також транз1ентно шдвищувала внутршньоюптинну концентращю кальшю на 30-50 нмоль/л I пригжчувала

А

И 00 -1

У. 50 -1

В

гуапосПпе 1 цМ

25 в

250

50 -I

АТР ЮОцМ

АТРЮОцМ

25 б

гуагух!те 1цМ

Мал. 10 Р1анодин викликае пщвищення [Са2+]; та модулюе АТФ-¡ндуковану кальщеву вщповщь.

кофе'шчндуковану кальщеву вщповщь. Незважаючи на досить незначш калыдев! вщловш на кофе'ш та р1анодин, прешкубацш слайспв у розчиш, до

я кого додавали р1анодин (10 мкмоль/л, п=25), пригшчувала кащат ¡цдукопаний кальщевий траьЫент на 30±13% (п=7) \ хоча 1 не впливала на амгшгуди кальшевих шлпопщей, ¡ндукопаних актипащею метаботропних рст'птор1в чате значно '¡X скорочувала у чаа (мал. 10). Наведет даш вказують на те, то в клтшах БГ присутне р1анодин-чутливе кальщеве депо, яке приймае участь у шдвищенш р!вню [Са2+], за механизмом кальцш-^ндукованого »ивишк.ння кальцпо (С1СК).

3.2.3 Мпохондрп

Дослщження рол1 мгтохондрш у кальщевш сигналшцп у кл¡тинах БГ оуло ускладнене тим, що навпъ коротка (10 сек.) ашпкац1я незначно! концентраци (1 мкмоль/л) м1тохондр1ального блокатору СССР ¡ндукувала пщвиид ння \Са^+][ до мифомолярного р1вня. Таю концентраци не можливо вим1рунати барвинком Гига-2. Висновком цих дослццв може бути твердження, що у китохондр1ях присутня значка юлыасть кальщю, який може бути звшьне шй.

3.2.4. Глютаматчндуковане пщвищення [Сз?+][

Глютамаг-шдуковане пщвищення внутршшьоклтшно! концентраци кальщю складаеться ¡з багатьох компонент. Як було згадано вище, клп ини Б Г експресують юнотропш глютаматш рецептори АМРА/КА - типу. 3 шшого боку, агоикащя гдютамату (1 ммоль/л) у розчиш, який мютив 10 мкмоль/л СИС>Х - блокатору шнотропних рецептортв, пригшчувала кальщевий тран лент тшьки на 20+9% (п=19). Кашатчндукована кальщева вщповщь у такому роз ! ин1 була вщсутня, вказуючи на вщсутнють активацп юнотропних глютаматпих-рецептор1в. Лплкацш транс-АСРБ (до 100 мкмоль/л) викликала калыпеву вщповщь титьки у 30% клггин, при цьому у вс1х випадках ця вщповщь повнютю пригшчувалась у безкальщевому розчиш. Таким чином, транс-АС'РБ и;рогщшше ппцшэе пщвищення [Са2+]^ за рахунок активацп юнотрог них рецептор1в. Квисквалат (10-30 мкмоль/л) викликав пщвищення [Са2+^ (п= 15), яке не припнчувалося видаленням юшв кальщю ¡з зовншньоклп'иниого

розчину (п=11) 1 не було чутливе до блокатору юнотропних глютамагних рецептор!в CNQX (п=5)(мал. 11). Таким чином, наведет результата вказують на ¡снування метаботропного глютаматного рецептору типу С1чК5 та/чи С1иШ.

Але при цьому шкубування тонких зр1з1В мозочка у розчиш, що М1стив тап<лгарпн (1 мкмоль/л), хоча 1 пригшчувала кальщев1 вщповщ1 (п= 13), але тшьки на 50-60 вдоотив. Бшьш того, диашз клпин БГ розчином, до якого було додано И) мкмоль/л гепарину, також не призводив до повного пригшчення

А

2505

с

"(В О

70-

в

2002 с

J

О

70-

Са2+-&ее

Мал. 11 Глютамат та квисквалат активують метаботропш рецептори у титанах Бергмашвсько! гли мозочка.

кальщевого транз1енту (амплпуда зменьшувалаеь на 40±11% (п=8)). Навпъ у титанах, яю шляхом диаизу були заповнеш розчином з гепаршом, та знаходилися у безкальщевому зовшшньоклггинному розчиш, який мостив тапепарпн та СЫС^Х, глютамат викликав кальщев1 транз1енти. Це показуе, що ¡снуе якийсь шший компонент.

1000 цМ glutamftte

1000 цМ gluuunal«

C*2t-free

30 s

30 s

00 цМ quisqualate

100 цМ quisqualate

Оскшьки пшальш юитинп приймають активну участь в усуненш мсд1атора-глютамату з синаптичних щшин за рахунок натрш-залежного транспорту глютамату, можна припустити наявшсть активно!' рол1 систсми натрш-кальщевого обмшу. Дшсно, аплшащя глютамату у розчиш, який не мютив натр1ю, пригшчувала кальщевий сигнал на 24±7% (п=25). Кашат-шдукований кальщевий транз!ент модулювався безнатр1евим розчином ще сильнше - на 56±13%. Таким чином, система натрШ-кальщевого обм'шу здатна значно пщвищувати [Са2+]; у клтшах БГ, пщ час активади глютаматних рсцептор1в.

За допомогою барвника 5ВР1, який е чутливим до юшв натрш, ми визначили внугршньоюптинш концентрацй юшв натрпо п1д час апл1кацш кашату та глютамату. Глютамат викликав пщвищення натр1ево'1 концентрацй до 20-30 ммоль/л, а кашат - до 40-60 ммоль/л. При цьому глютаматчндуковане пщвищення [Ыа+] [ майже не пригшчувалось ашпкащею СЫ(ЗХ, що свщчить за те, що цей рют вщбуваеться за рахунок функциовання системи транспорту глютамату, а не активування юнотропних рецептор1в.

Таким чином, глютамат може активувати три р1зних мехашзми пщвищення [Са2+];; 1. активация юнотропних рецептор!в та вхщ юшв кальцш ззовш; 2. активащя метаботропних рецептор1в та вив1льнення кальцда з внутршньоклшшних 1шРз-чутливих кальщевих депо; 3. активацгя юнотропних рецептор1в та системи натрШ-залежного транспорту, пщвищення внутршньокттинноТ концентрацй юшв натрио, пщвищення [Са2+], за рахунок роботи системи натрш-кальщевого обмшу у реверсивнш модь

2.3. Мехашзми вилучення юшв кальцт

Для функцповання кл1тин принциповим е не тыьки можлив1сть пщвищувати р1вень [Са2+]| у вщповщь на стимул, але й вщновлювати р1вень спокою. Для оцшки систем, яга вщповщають за вщновлення базового р1вня [Са2+]( , пщвищення його р1вня викликали ашпкащею АТФ чи кашату.

¡нкубащя клгган у розчиш, що не мютив натрш (екв!Молярна замша на

N М ЭО) (п= 15) нщвищувала р1вень [Са2+]; на 55110 нмоль/л, але не змшювала кшетик кальцюшх транз1енпв, як1 були ¡ндуковаш ашпкашею 100 мкмоль/л АТФ. Навелеш лан1 пказують на те, шо система натр1й-калыпевого обмшу приймае участь у стабшзацп базового р1вня [Са2+]; , але у вщновленш базального р1вню [Са2+]; и внесок незначний.

Зовшшньоюнтинна аплжашя 3 ммоль/л 1_л3+ - антагошсту кальщевих насосав плазмашчно'/ мсмбрани - уповшьнювала процес вщновлсння базового р1вня [Са2+]| у 1.5-2 рази (п= 17). При цьому характер спаду залишався двоекспоненцшним, але швидкий спад [Са2+], становив лише 10-15%. Попередня ашпкащя розчину, який мютив р1анодин (100 мкмоль/л) (п= 12), практично не змшювала двоекспоненцшний характер спаду кальшевих сигналов до базового ртня. Тапс1гарпн (1 мкмоль/л) пригшчував швидкий компонент процесу вщновлення [Са2+], (п=11). Таким чином, основне значения у вщновленш базального р1вню [Са2+][ у юптинах олихэдендроцитарно! лшп вцпграють калыпев! насоси плазматичноТ мембрани та ендоплазматичного рстикулуму.

IV. Кальщевий гомеостаз у шитиках мжроглп

4.1 Плазмалемапьм кальщевг капали

Мал. 12. Елекрофь зюлопчт характеристики кл1тин м1кроглп.

20 ГПБ

Клггини М1крогли, яю належать до макрофапв, не експресують потенщал-

залежних кальщевих канал1в (мал. 12). бдиннй вщомий юнотропний рецептор наложить до пуринорецепторш, який активуеться як АТФ, так 1 АДФ 1 можс бути заблокований сурамшом (100 мкмоль/л), тобто - до Р^-типу юнотропних пуринорецептор1в.

На той же час майже вщеутш даш про наявшеть внутршньоюитинних калыиевих депо та функцповання механ1зм1в регуляцн [Са2+]; .

4.2 Внутртиъоклтинш кальщевI депо 4.2.1 1ноз1толтрифосфат-чутливе кальщеве депо Методом флуоресцентно! кальщево! М1кроскопн були протестоваш так1 мед1атори:

Таблиця 2.

Концентраци [Са2+]■, Число юитин

Аспартат 10 - 1000 - 7

АТФ 10 - 1000 + 41

Брадикшш 0.1 - 10 - 6

Допам1н 10 - 1000 - 8

Адреналш 0.1 - 10 - 11

ГАМ К 10 - 1000 - 5

С5а 1 - 10 + 25

Гистам1н 1 - 1000 - 7

Гомоцистеат 10 - 1000 - 7

Кашат 10 - 1000 - 6

Норадренал1н 0.1 - 10 - 5

Окс'иоцин 1 - 10 - 12

Серотон1н 10 - 1000 - 3

Соматостайн 1 - 10 - 6

Субстанц1я Р 1 - 10 - 11

Вазопрес1н 1 - 10 - 15

2 9

Як показано у табл.2 окр1м вищезгаданного АТФ жодна речовина, окрш комплемент-фактору С5а, не викликала шдвищення [Са2+]^ у кл ¡тинах' мжрогли. С5а- та АТФ-шдуковаж калылеш тршЫенти були дозо-залежш : порогова концентращя дор1внювала 1 мкмоль/л для АТФ 1 0.5 нмоль/л для С5а , а 10 мкмоль/л АТФ 1 1.5 нмоль/л С5а викликали кальщев1 транзгёнти нашвмаксимальноТ амплпуди.

А

1 цМ Шарода^ш

Б

ЮОцМАТР ЮОцМАТР ЮОцМАТР

1 цМ Ллр^аг^ш

Мал.13 Тапс1гарпн викликае пщвищення [Са2+]; та пригшчуе АТФ-¡ндуковану кальшеву вщповщь у клггинах м1кроглй.

Щоб вщокремити юкотрапний та метаботропний кальщев'1 компоненти АТФ-шдукованого кальщевого п1двищення [Са2+](, вс1 дослщи по ¡дснтифкацв типу мстаботропного рецептора були проведет у безкалымевому розчиж. Сурамш (100 мкмоль/л) зменьшував амплггуду кальщевого сигналу на 82± 15% (п=9). Ашпкаци аденозину, адснозинмонофосфату (АМФ), аденозиндифосфату (АДФ) та урдантрифосфату (УТФ) дали наступи! результати : АДФ=АТФ»УТФ=АМФ=аденозин (п=5). Тобто, рецептор, експрссований у кл¡тинах м1крогли, належить до метаботропних Р2у пуринорецептор1вЛнкубащя у розчиж, що мютив тапс1гарпн (1 мкмоль/л) - блокатор внутр\шньоклп-инних кальщевих насоив ендоплазматичного ретикулуму, повшстю пригшчувала кальщев1 вщповш (п=13, мал. 13). Бшьш того, диализ юнтин мисрогли розчином, до якого було додано 10 мкмоль/л гепарину - специф1чного шпб1тора ¡пвР^-чутливого кальщевого каналу ендоплазматичного ретикулуму, також призводив до пригшчення кальщевого транз1енту на 95±12% (п=9). Диал1з нормальним внутршньоюнтинним розчином не впливав на реакцп (п=4). Наведеш даш показують, що кл1тини м1кроглн експресують метаботропш Р2у -пуринорецептори.

Кальщева вщповщь, шдукована комшпмент-фактором С5а також не залежала вщ наявносп кальщю у зовшшньоклггинному розчиш (п=21), пригтчувалась тапагарпном (п=15) та гепаршом (п=4), що говорить за те, що 1 у випадку комплемент-фактору вона викликана акгиващею метаботропних рецептор1В.

Слщ вщмггити, що метаботропш кальщев! вщповцц у клггинах м1крогли були двофазними. Перший компонент - швидка кальщева вщповщь, яка не залежала вщ зовшшньоюптинного кальцпо, та повшьний спад, який пригшчувався у безкальщевому розчиш. Короткочасна аплкащя розчину, який не мютив юшв кальщю, викликала вщновлення базового р1вня [Са2+],, але замша розчину на нормальний пщукувала додаткове транз1ентне пщвищення кальщево! концентрацй (мал. 14). Базуючись на цих даних, можна припустити, що вившьнення кальщю ¡з внутршньоклтшних депо шдукуе вщкриття

A

E

100 piM ATP

Ca2+-free

Man. 14 AT<$ iHayicye bwkphtth cneuHcjjiHHHx KaitbuieBHX KaHaniB, mo Bia6yBaeTbCH nuacjiuiOK BHBijjbHeHHfl Kajimiio ¡3 BHyTpiiiiHbojuiiTHHHiix

aeno.

n.ia3MajieMaj[bnnx KajibuieBHX KaHajiiB, aid BinoMi nifl Ha3Boio - CRAC (calcium release activated channels).

4.2.2 Р1анодин-чутливе кальшеве депо № апл1кашя кофеТну (до 40 ммоль/л, п=6), ж р1анолину (ло 100 мкмоль/ л, п=4) не викликали змши р1вня внутршньоклггинно1 концентрацн кальщю. Кальщев1 транз1енти, яш ¡ндукували АТФ, також не були модульоваш. Це дае можливкть вважати, що юптини мкрогли практично не експресують р1анодинових рецептор1в ¡, як результат, р1анодин-чутливе депо не приймае участи у регуляцн [Са2+]|.

4.2.3 М1тохондри

Ашпкащя 10 мкмоль/л СССР (п=11) - блокатора м1тохондр1ального транспорту протошв - викликала значне, транз1ентне гадвищення р1вня [Са2+][, що говорить за те, що мггохондри мають значну кшыасть зв'язаного кальцпо. Кальщева вщповщь не залежала в)Д наявност! зовшшньоклггинного кальцпо, вказуючи на внутршньоклгшнне походження кальцпо, який був вившьнений. Тобто, у мггохондр1ях клггин м1крогли присутня значна кшьйсть кальцпо, який може бути звшьнений.

4.3. Мехатзми вилучення юшв кальцт 1нкубування кл1тин у розчиш, що мютив або 10 мкмоль/л СССР (п=7), або 10 мкмоль/л р1анодину (п=5), не впливало на кшетики кальщевих вщповщей. Ашпкац1я безнатр1евого розчину (екгймолярна замша на ЫМБО) (п=8) не змшювала ш р1вню [Са2+]^, ш мистику кальщевих транз1ент1в, якл були ¡ндуковаш атипкащею АТФ. Наведеш даш вказують на те, що роль мггохондрШ, р1анодин-чутливого депо та системи натрШ-калыцевого обмшу у вщновлеши базального р!вню [Са2+]; незначна.

Зовшшньоклггинна агоикащя 3 ммоль/л Ьа3+ - антагонюту кальщевих насоЫв плазматично! мембрани - значно уповшьиювала процес вщновлення базового р1вня [Са2+]; (п=8). Тапагаргш (10 мкмоль/л) також викликав зниження швидкосп цього процесу (1.3±0.2, п=5). Таким чином, основне

значения у ¡пдновленш базального р1пню [Са2+]; у клтшах о/пгодендроцитарно! лшм вццграють кальщев1 насоси плазматично! мембрани га гилоплтмтпчпого рстикулуму.

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТ! В

Незважаючл на той факт, що у ЦНС стввщношення кЬчькост! пиальних юптин до кшькосп нейрошв становить 10 : 1, мехашзми регуляцл [Са2+]| у г л! 1 майже не охарактеризован!. У данш робот1 було виконано пряме дослщження основних мехашзм1в кальщевого гомеостазу у трьох основних типах пиальних кл1тин центрально! нервово! системи : астроцитах, ол1годендроцитах та м1кроглп. За результатами перегляду лкератури можна стверджувати, що дана робота являе собою перше детальне дослщження мехашзм1в внутршньоклтшно! кальщево! сигнал1зацп у пиальних клтшах.

Оскшьки робота була виконана на трьох р1зних типах клггин, як1 виконують у ЦНС абсолютно р1зш функцп, обговорення результата буде також подшене на три пщроздиш.

Олиодендроцити

На мал. 15 узагальнеш результати наших досл1джень кл1тин олцодендроцитарно! л ¡на. Результати дослщв свщчать за те, що у юптинах ще! лшп мехашзми кальщево! сигнал1заци знаходяться у прямш залежносп вщ фази онтогенетичного розвитку.

Юйтини-попередники експресують два типи потенщал-залежних кальщевих кашшв, а саме, канали з низьким порогом активацп - очевидно Т-тип, та з високим порогом активацп - Ь-тип. При цьому, Т-тип концентруеться майже виключно у вцаростках шитин. У зрших олцодендроцитах якщо I експресоваш канали Т-типу, то !х густина дуже мала, а канали, що мають високий порц активацп, знову ж таки концентруються у вщростках. Такий розподш канал ¡в може бути вшдзеркаленням функцюнально! рол! юптин ще!

клйтина-попередник

Т Т т

о р

г

р в

р

о Я

Я

р

43 р

Я

я

ё

-е-

о £

о

р

X X м

я

Я О

Зр1лий ол!годеидроцит

Мал. 15 Мехашзми генерацц кальшевих сигналов у клггинах олнтщендроцитарно1 лшп. У ход1 онтогенетичного розвитку змшюеться репертуар та розподш кальшевих канал1в (Ь- та Т- тили.), проходить експресш метаботропних ?2У/и рецепщмв, зникають юнотропш глютаматш рецептори та змшюеться розподш мтэхондрш.

зовшшньоклтпшого простору Слльше. Базуючись на тому, що вщростки юптин о;мгодендроцитарно1 лжи "шукагать" аксони, детектуючи Тх активнють, а це можуть бути змши зовнн1ип>окл1тинноТ концентраци калт. можна стверджувати, то на раншх стадиях щ юитини мусять детектувати значно меныш змши концентраци кал1я, шж у сформовашй ЦНС. Таким чином, експреая у вщростках кальщевих канал1в з низьким порогом активацн може бути воображениям псобхшност1 деюктувати незначш змши концентраци калпо, а для зрших олп'одендроципв це вже не так принципово.

По тому, як аксон був знайдений, починаеться процес М1ел1шзацп. Ь лггератури вщомо, що вс1 необхщш для М1ел1шзацп компонента виробляються на мющ, а не транспортуються з соми. Неоднорщний розподи М1тохондрш, який був показаний у щй робот>, вказуе на те, що ¡оптини-попередники мають значну кыьк1сть м^тохондрш у вшростках, а зрш ОЛЦ демонструють однорщний розподш цих органел.

Т1льки на етат зршого ол1годендроцита у юитинах щ€1 лшп вщбуваеться експреая метаботропних рецептор1в. Функшональне значения тако1 гпзньо1 активаци не дуже зрозумше, але у тонких зргзах мозку було показано, що активнють аксона викликае пщвищення [Са2+]; у вщростках зршого ОЛЦ за мехашзмом, чутливим до блокатор1в кальщевих насос!в внутршньоюитинних депо. Таким чином, можна припустити, що вившьнення юшв кальцта ¡з внутрпиньоклтшних депо являе собою один ¡з шлях!в взаемодп аксон-ол1годендроцит, що може бути принципово важливим для процесу дем1елш1зацп.

Астроцити

Астроцити утворюють найбшыи поширену популящю юптин у ЦНС. Деяга принципов! функцй астроцит1в було показано : активна роль у регуляцп зовн1шньокл1тинно1 концентраци юшв калпо; постачання глюкози нейронам; вилучення нейротрансм1тер1в ¡з зовтшньоклггинного середовища. Основш мехашзми, яю приймають участь у регуляцп ртня [Са2+]; у юнтагах БГ мозочку, та 1х взаемод1я зображеш на мал. 16.

Мал. 16 Мехашзми генерацп кальшевих сигнал1в у юитинах Бергмашвсько! глп мозочка.

на Taxi категорн:

1. Формупання та вивиншення у зовшшньоюптинне середовище бюлопчноактивних речовин, наприклад, apaxwonoRoi кислоти, NO. глютамату

Нейрон Пурш'е

250

100 цМ ATP

200 п 5

О

60 J

40 s

.^Уугьян.

100 цМ histamine

200

60 J

U

TF

........

Бергмашвська шя 220 -

40 J

200 -1

Hull

"WW......

100 (iM ATP

40 s

50

250

100 цМ histamine

30 ->■

10 цМ epinephrine

3 цМ epinephrine

Мал. 17 Нейрони Пурин 'e та Бергмашвсько1 гли експресують щентичш рецептори. В uempi - зображення нейрона Пуркш'е i клггини БГ, яга були заповнеш барвинком Лющфером жовтим, у тонкому 3pi3i мозку.

3 8

та ¡нших.

2. Перетворення ппкогену на глюкозу.

3. Рсгуляшя об'гму ппальних кл'|тнн. к як наслшок. рогупюппнпн об'гму синаптично! щишни.

4. Змша буферних властивостей шального синцитш.

5. Регулящя концентраца ¡ошв у зовшшньоюптинному середовищь

У данш робот! було показано, що юптини Бергман¡всько) глн мозочку, яю належать до астроцит1в, експресують рецептори до всих основних нейромед1атор1в мозочку, а саме, глютамату, гистамшу, адреналшу та АТФ, який може бути вившьнений як котрансм1тер. Ф1зюлопчним значениям експреси циюго набору рецептор1в, активащя яких ¡нщдае синтез 1пзРз та вивгльнення кальщю ¡з внутршньоклтшнних депо, може:

1. полягати у тонкш регуляци р1вня [Са2+]; у астроцитах. Це припущення базуеться на наших даних, яи показують, що активащя р!зних рецептор1в призводитьдо кальщевих реакцш рЬно! амплпуди. Бшьштого, активащя одного з рецептор1в може пригшчувати вщповш на шип. За нашими даними можна побудувати ряд : глютамат = адреналш > АТФ > гистамш, значения якого полягае у тому, що ашпкащя мадаторщ, що вказаш лшше, пригшчуе вщповщ на мед1атори, що у цьому ряду стоять правше.

2. бути основою нейрон-пиально! взаемодп. Дослщжуючи мехашзми кальшево! сигнал1зацн у клтшах БГ мозочка у тонких зриах мозку, ми також перев1рили щ мехашзми у нейронах, що знаходяться поруч, а саме, Пурин'е та гранулярних нейронах мозочка. Принциповим результатом можна вважати те, що репертуар рецептор1в нейрошв Пуркш'е та юитин БГ абсолютно щентичш (мал. 17). Приймаючи до уваги, що юптини БГ шкапсулюють синапси нейрошв Пуркш'е 1 те, що передача сигнал1в у цих синапсах опосередована глютаматом, норадреналшом або гистамшом, можна стверджувати, що юптини БГ здатш "вщчувати" вЫ синаптичш входи нейрошв Пуркш'е 1 нав1ть регулювати процеси передач! шляхом захвату нейромед!атор1в та змши об'ему

синаптичного контакту.

М1крпгл1я

Мжроппя являе собою один з найзагадковпних титв клггин ЦНС, навггь походження цих клшш все ще становить тему дискусн. Але найбшыиу увагу

науковщв привертае питання активацй м'жрогли, тобто переходу и у макрофаг. 1з л1тератури вщомо тшьки, що bcí активатори мкроглп викликають також пшвишсння piRHto fCa2+]¡ . п це. у споючергу. iiniiiior псробулопу нитосксютл На мал. 18 зображеш мехашзми регуляцн [Ca2+j¡ у кл¡тинах м^кроглп. 1снуе два основних мехашзми, як! викликають тдвищення внутраиньокл ¡тинного pÍBHx кальщево! концентрацп :

1. Вхщ ionio кальщю кр1зь хемо-чутлив1 кальшев1 канал и, у нашому випадку АТФ-чутлив1, та CRAC канали;

2. Вивмьнення кальщю Í3 внутр1шньокл1тинних ¡пвРз-чутливих кальщевих депо.

При цьому, наявна Ч1тка послщовнють запуску цих MexaHÍ3MÍB. Активащя ¡онотропного або метабогропного рецептору призводить до швидко! десенситизацп та вшкривання CRAC канал1В. Приймаючи до уваги, що i АТФ, i комплемент-фактор можугь бути вивыьнеш при пошкодженш мозку, а акгивована М1кроглш може та повинна М1грувати, то активашя цих канашв може бути принциповою для перебудови цитоскелету..

висновки

1. У стаж спокою концентращя íohíb кальщю у ппальних кланах цетрально! нервово! системи може знаходитися у широкому д1апазош 30-300 нмоль/л, що вказуе на високу лабшьшсть мехашзм1В кальциевого гомеостазу у гли.

2. У кл ¿тинах ол1Годендроцитарно! лши генеращя кальциевого сигналу забезпечуеться входом кальщю кр!зь потенщал-залежш канали плазматично! мембрани та вившьненням ¡з внутршшьоклггинних ¡нозпплтрифосфат-чутливих депо. На р1зних стадиях розвитку юнтини uiei лши змшюють репертуар експресованих каналов, але незалежно В1д стади кальшев! канали концентруються у вщростках юнтин.

3. Вишльнепнн кальцпо ¡з виугр1шньокл1тинних депо вщбуваеться внаслщок активаци Pi пуринорсцептор111, я к i контролюють ртень внутр1шньокл'п"инного ¡ноз^олтрифосфату. Пуринорепептори скспрссуються тшьки на бшыи nbnix стагпях розвитку ол1годендроцит1в i вщсутж у юнтинах-попередниках.

4. Блокування транспорту протонш у юптинах ол1годендроцитарно! лшн призводить до вивоьнення кальцпо ¡з м1тохондрш, вказуючи на високу концснтранпо калымю у цич органслах. Розгтодш «¡тохондрж з низьким потсншалом спокою ("актпвних") заложить вщ сищп розвитку : у юптинах-попередниках вони концентруються у вщростках, а у зрших олiгодеiщроцитах розподшяються однорщно.

5. Зниження концентраци кальщю до р1вня спокою теля його росту внаслщок активносп у шптинах ол1годендроцитарно"1 лinii забеспечуеться кальщевими насосами : плазматично'1 мембрани, тобто виведенням кальщю у позаюптинне середовище, та ендоплазматичного ретикулуму.

6. Астроцити, клпини Бергмашвсько1 гли мозочка, не експресують потенщал-залежних кальшевих канал1в. Bei основш нейромед1атори мозочка - глютамат, адреналш, пстамин та аденозинтрифосфат - ¡шшюють кальщев1 транз1енти у Бергмашвськш гли.

7. АТФ, пстам1н та адреналш активують вщповшш метаботропш рецептори, що призводить до пщвищення внугршньоклтшного р1вня ¡нозп'олгрифосфату та вившьнення кальщю ¡з 1Рз-чутливих кальщевих депо. Глютамат-1ндуковане пщвищення р(вня [Ca2+]j складаеться з входу кальцпо по юнотропним АМРА/ КА каналам та вившьнення його ¡3 юитинних 1Рз-чутливих депо, а також активаци системи Na+/Ca2+- обмшу, що в данному випадку фунцюнуе у реверсивнш модь

8. Вперше показано ¡снування в астроцитах р1анодин-чутливих кальщевих депо. Активация Bcix вище названих шляхт пщвищення [Са?+][ також додатково викликае вившьнення Са2+ цих депо.

9. Зниження концентраци кальщю до piBHio спокою теля його росту внаслщок

активноеп у титанах Бергман ¡вськоТ глй забеспечуеться кальщевими насосами плазматичноТ мембрани , тобто ви ведениям кальшю у позакл¡тинне середовище, та сплоплпзматичним рстикулумом.

10. М1крогл1я не експресуе потенщал-залежних кальшевих капали). АТФ та комнл¡мент-фактор С5а активують вщповщш метаботропш рецептори, що призводить до пщвищення внутршньокл ¡тинного piBHH ¡ноз!толтрифосфату га нивпьнення кальшю з 1Р3-чугливнх кальшевих депо. АТФ також актииуе ¡онотропн) кальшев1 канали.

11. Вившьнення Са2+ ¡з внутршньоклггиних депо викликае активашю специф1чних кальшевих канашв плазматично! мембрани - СЯАС-канал1в.

12. ЕкспреЫя чисельних peuerrropiB до Bcix основних нейромед!атор1в у кл¡тинах глй може складати основу нейрон-шально! взаемодй. АТФ, який активуе кальщев1 сигнали у Bcix типах макро- та мкроглй, е одним з найв1рогщшших претенденпв на посередника uiei взаемодй.

СПИСОК РОБ1Т, ЯК1 ОПУБЛ1КОВАН1 ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЩ?

1. S.Kirischuk, H.Kettenmann & A.Verkhratsky (1994): Calcium signalling in oligodendrocytes. Neurophysiology/Neirophiziologia, v. 26, No. 2, p. 26 - 31.

2. S.Kirischuk, J.Sherer, H.Kettenmann & A.Verkhratsky (1994) ATP-induced cytoplasmic Ca2+ release via activation of InsP3-sensitive channels in oligodendrocytes. Proceedings of the First European Meeting on glial cells Junction in health and disease. Heidelberg, March 24 - 27, p. 113

3. S.Kirischuk, J.Sherer, H.Kettenmann & A.Verkhratsky (1994) ATP-triggers Ca2+ mobilization in Bergmann glail cells via activation of P2 purinoreceptors. Proceedings of the First European Meeting on glial cells function in health and disease. Heidelberg, March 24 - 27, p. 113

4. S.Kirischuk, J.Sherer, H.Kettenmann & A.Verkhratsky (1994) Subcellular heterogeneity of voltage-gated Ca2+ channels in cells of the oligodendrocyte lineage. Proceedings of the First European Meeting on glial cells function in health and disease.

•) :>

Heidelberg, March 24 - 27, p. I 14

5. S. Kirischuk, H.Kcitcnmann & A.Verkhratsky (1994) ATP-triggcrcd Ca2+ release from InsP vsensitive stores in oligodendrocyte1;. Journal of Physiology (Loudon), 477P, 9P

6. S. Kirischuk, H. Kettenmann & A. Verkhratsky (1994) ATP triggers Ca2+ release from InsPj-sensitive stores in oligodendrocytes. European Journal of Nvurosciencc, .suppl. 7, Proceeding^ of the I6ih Animal liNA Meeting p. IS7.

7. S. Kinscliuk & A. Verkluaisky (1995) Mechanisms of Ca2+ mobilization in cerebellar Bergmann glial cells. Journal of Physiology, London, v. 483P, 35P.

8. A.Veikhratsky, S. Kirischuk & H. Kettenmann (1995): Metabotropic purinoreceptors and calcium signalling in glial cells. Proceedings of 23rd Gottinger Neurobiologentagung, March 24 - 26, 123P.

9. P.Kostvuk, P.Belan, A.SIimigol, S.Kirischuk. A.Verkhratsky (1993) Basic mechanisms of calcium sygnal generation in nerve cells. Proceedings of the IUPS Congress, Glasgow, P.51.

10. S.Kirischuk, N.Voitenko. H.Kettenmann & A.Verkhratsky (1994) Mechanisms of cytoplasmic calcium signalling in cerebellar Bergmann glial cells. Neurophysiology (Kiev), v. 26, p. 417 - 419.

11. S.Kirischuk, J.Sherer, A.Verkhratsky & H.Kettenmann (1995) Subcellular heterogeneity of voltage-gated Ca2+ channels in cells of the oligodendrocyte lineage. Clia, v. 13, p.l 12

12. S.Kirischuk, J. Sherer, II.Kettenmann and A.Verkhratsky (1995) Activation of P2 purinoreceptors triggers Ca2+ release from InsP3-sensitive internal stores in mammalian oligodendrocytes. J.Physiol. (London), v. 483.1, pp.41-57

13. S.Kirischuk, J.Neuhaus, A.Verkhratsky and H.Kettenmann (1995) Preferential localization of active mitochondria in process tips of immature retinal oligodendrocytes. Neuroreport, v.6, p. 737-741.

14. S. Kirischuk, T. Mollcr, N. Voitenko, H. Kettenmann, & A.Verkhratsky (1995): ATP-triggered calcium mobilization in cerebellar Bergmann glial cells. Journal

of Neurohcience , v. 15 , pp. 7861-7871.

15. Kiriscluik S., Voitenko N., Kostyuk P., Verkhratsky A. (1996) Calcium signalling in granule neurones studied in cerebellar slices. Proceedings offirst meeting of Neurowissenschaflichen Gesellschaft, Berlin, 1996, p.59.

16. Kirischuk S., Tuschick S., Verkhratsky A., Kettenmann H. (1996) Monoamines and histamine induced calcium mobilization in Bergmann glia. Proceedings of fust meeting of Neurowissenschaflichen Gesellschaft, Berlin, 1996, [5.59.

17. Verkhratsky A., Kirischuk S., Moller T., Kettenmann H. (1996) Purinoreceptors and calcium signalling in glia. Proceedings of first meeting of Neurowissenschaflichen Gesellschaft, Berlin, 1996, p.68.

18. Kirischuk S., Matiash V., Kulic A., Kostyuk P., Verkhratsky A. ATP, epinephrine and histamine induced calcium mobilization in cerebellar Purkinje cells. Proceedings of first meeting of Neurowissenschaflichen Gesellschaft, Berlin, 1996, p.69.

19. Kirischuk S., Voitenko N., Kostyuk P., Verkhratsky A. (1996) Calcium signalling in granule neurones studied in cerebellar slices. Cell Calcium, v. 19, 59-71.

20. S.Kirischuk, H. Kettenmann, A.Verkhratsky (1996) Metabotropic receptors involeved in calcium signalling in Bergmann glial cells. Proceedings of the meeting of the Physiological Society of The UK, Bristol, p. 77.

21. S.Kirischuk, V.Matiash , A.Kulic, A.Verkhratsky ATP, epinephrine and histamine induced calcium mobilization in mouse cerebellar Purkinje cells. Proceedings of the meeting of the Physiological Society of The UK, Bristol, p.78.

22. S. Tuschick, S. Kirischuk, A. Verkhratsky, H. Kettenmann (1996) Mouse cerebellar Bergmann glial cells express ETb endothelin receptors linked to the intracellular Ca2+ release from intracellular stores. Proceedings of the meeting of the Physiological Society of The UK, Manchester, 25P.

23. S. Kirischuk, N. Voitenko, P. Kostyuk, A Verkhratsky (1996) Calcium signalling in granule neurones studied in cerebellar slices : developmental changes. Proceedings of the meeting of the Physiological Society of The UK, Manchester, 67 P.

24. S. Kirischuk & A.Verkhratsky (1996): [Ca2+]j recordings from neural cells

in acutely isolated cerebellar slices employing differential loading of membrane pcrmeant form of calcium indicator fura-2. Pflugers Archiv , in press.

25. S. Kirischuk, S. Tuchick, A. Verkhratsky & H. Kettenmann (1996) Epinephrine and histamine-induced Ca2+ signalling in Bergmann glia. Eur. J. Neurosci., in press.

26. S. Kirischuk, V. Matiash, A. Kulik, N. Voitenko, P. Kostyuk, A. Verkhratsky (1996) Activation of P2-purino-, ai-adreno- and ll|-histamine receptors triggers cytoplasmic calcium signalling in cerebellar Purkinje neurons. Neurosci., (in press).

4 О

Kirischuk S.I. Mechanisms of calcium signalling in glial cells from ccntral nervous system. The dissertation ( manuscript) is presented in accordancc with requirements for the degree of doctor of biological sciences in the speciality 03.00.05. - Biophysics, A.A.BogomoIei/. Institute of Physiology. National Academy of Scicnccs of Ukraine, Kiev, 1996.

Mechanisms of calcium signalling were investigated in experiment on different types of glial cells of central nervous system (namely, oligodendrocytes, astrocytes and microglial cell) both in culture and in thin slices. It was shown than in spite of nonexcitability these cells express full spectrum of receptors, which were for long time supposed to be characteristic for neurones. Oligodendrocytes - the cells which are responsible for myelination - during development showed dramatic differences in both receptoi expression pattern and their spatial distribution. Higher density of the receptors in processes could be suggested to be a sensor system for the beginning of either myelination process or demyelination if an axon was broken. Cerebellar astrocytes showed absolutely the same repertoire of receptors as neighbouring neurones. Such a similarity of receptor expressed allows to suppose that these cells are not only the element engulfing synapses; but an active partisipator of synaptic transmission processes. Microglia express receptors which are activated if there is a damage of a brain. Activation of them induces opening of CRAC channels what could be a system for the support of cytosceleton transformation. Numbers of glial receptors and complexity of glial reactions are strongly in favour of denying the definition of glial cells as a passive element of brain. Neuron-glial interaction seems to be extremely important for brain functioning.

Кирищук С. И. Механизмы генерации кальциевых сигналов в глиальных клетках центральной нервной системы млекопитающихся. Диссертация (рукопись) на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.05 - Биофизика, Институт физиологии им.АА.Богомольца НАН Украины, Киев, 1996.

Исследования проводились на трех основных типах глиальных клеток центральной нервной системы - олигодендроцитах, астроцитах и микроглии. В качестве объекта использовались как культуральные клетки, так и клетки в тонких срезах мозга. Показано, что в клетках олигодендроцитарной линии и репертуар экспрессированных рецепторов, и их пространственное распределение зависят от стадии развития. При этом плотность рецепторов значительно выше в отростках, что может являтся основой для начала как процесса миелинизации, так и демиелинизации, в случае если аксон был поврежден. Астроцитарные клетки, Бергманновские клетки мозжечка, експрессируют тот же набор рецепторов, что и нейроны Пуркинье, расположенные в том же слое. Такая идентичность рецепторов позволяет предположить, что глиальные клетки не только инкапсулируют синапсы, но и являюся активными учасниками в процессе синаптической передачи. Микроглиальные рецепторы могут быть активированы веществами, образующимися при повреждении. Высвобождение кальция из депо приводит к активации специфических CRAC-каналов. Нейрон-глиальные взаимодействия, по-видимому, являюся жизненно важными для функционирования ЦНС.

Ключов1 слова: олщодендроцити, астроцити, мжроппя, кальщевий гомеостаз, нейрон-пйальна взаемод1я.