Механизмы ганглиозид-индуцированной иммуносупрессии Т-лимфоцитов

Молотковская, Ирина Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизмы ганглиозид-индуцированной иммуносупрессии Т-лимфоцитов
ВАК РФ 03.03.03, Иммунология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы ганглиозид-индуцированной иммуносупрессии Т-лимфоцитов"

На правах рукописи

Молотковская Ирина Михайловна

МЕХАНИЗМЫ ГАНГЛИОЗИД-ИНДУЦИРОВАННОЙ ИММУНОСУПРЕССИИ Т-ЛИМФОЦИТОВ

«03.03.03 - иммунология»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

1 О МДР 2911

Москва, 2011

4840268

Диссертация выполнена в Учреждении Российской академии наук Институ биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Научный консультант:

академик РАН и РАМН, доктор медицинских на профессор Р.В. Петров

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, Доктор медицинских наук, Доктор медицинских наук,

профессор А.А.Ярилин; профессор З.Г.Кадагидзе; профессор М.А.Стенина.

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН

Защита диссертации состоится <4^3 » ¡„¿/¿с^Г¿1 2011 г. в /часов на заседай Совета по защитам докторских и кандидатских диссертаций Д 208.017.01 в ФГ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, дом 24, корпус 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ГНЦ Инстит иммунологии» ФМБА России.

Автореферат разослан «/¿? 11 г.

Ученый секретарь

Совета по защите докторских и ^

кандидатских диссертаций

доктор медицинских наук / Сеславина Л.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Изучение молекулярных механизмов пролиферации, дифференцировки и гибели клеток иммунной системы является одной из центральных проблем современной иммунологии, клеточной физиологии и биохимии. Среди важнейших участников этих процессов - ганглиозиды, изменяющие свою функцию при развитии таких патологических процессов, как, например опухолевый.

Ганглиозиды, сиалированпые гликосфинголипиды (ГСЛ), известны как активные участники функционирования клеток. Пролиферация, дифференцировка клеток, межклеточный контакт, адгезия, лигаид-рецепторное взаимодействие - далеко не полный перечень процессов, в которых ганглиозиды принимают активное участие (Degroote S, 2004). Биосинтез и мембранный состав ганглиозидов, их доменная локализация и контакт с рецепторными белками специфичны для клеток разного типа и на разных стадиях созревания. Роль ганглиозидов в созревании и функционировании клеток иммунной системы особенно важна, о чем свидетельствует появление ганглиозидов в близком липидном окружении таких рецепторов как CD3, CD4, CD95 и ряда других на определенной стадии созревания Т- и В-лимфоцитов.

Развитие опухолевого процесса приводит к резкому изменению биосинтеза и катаболизма ГСЛ. Меняется уровень экспрессии ряда генов, кодирующих ферменты, важные для их биосинтеза, в результате чего изменяется соотношение между ганглиозидами, экспрессированными на поверхности опухолевых клеток; появляются новые ганглиозиды, отсутствовавшие ранее. Так, клиническими маркерами ряда опухолей являются ганглиозиды GM2 и GD2. Такие изменения приводят к изменению адгезионных способностей опухолевых клеток, к стимуляции васкуляризации солидных опухолей, что влияет на их способность к метастазированию. Эти изменения приводят также к устойчивости опухолевых клеток к сигналам на апоптоз. Ганглиозиды способны супрессировать цитотоксичность NK-клеток, тем самым ослабляя противоопухолевый иммунитет, подавлять пролиферацию Т-лимфоцитов (Grayson G., Ladisch S., 1998).

мкМ, т.е. превышает норму в десятки раз. Ганглиозиды участвуют в подавлении иммунного ответа на клетки опухоли; в частности, смесь экзогенно добавленных ганглиозидов подавляет пролиферацию IL-2-зависимых клеток, являющихся моделью активированных цитотоксических Т-лимфоцитов. Поскольку супрессированная ганглиозидами пролиферация Т-лимфоцитов частично восстанавливается rIL-2, было предположено, что супрессия происходит в том числе за счет образования комплексов ганглиозида с иитерлейкином-2, т.е. происходит перехват ганглиозидом цитокина, за который ганглиозид конкурирует с рецептором интерлейкина-2 (IL-2R). Для борьбы с иммуносупрессией этого типа в настоящее время используют rIL-2. Однако такая цитокинотерапия сопровождается серьезными побочными явлениями. К ним относятся интоксикация, лихорадка и др. Причиной ряда из них является нарушение процессинга молекулы, обычно получаемой в прокариотической клетке. Кроме того, внутривенное введение терапевтического средства приводит к его значительному протеолизу; эффективными оказываются лишь высокие, токсичные дозы интерлейкина, вызывающие у больных тяжелые осложнения. В то же время, супердозы цитокина, имеющего рецепторы на клетках самого разного типа, активируют их на пролиферацию и дифференцировку, тем самым усугубляя патологическое состояние больного (Rosenberg S.A., 2000; Davis C.B., 2003).

Связывание ганглиозида происходит определенным участком молекулы интерлейкина-2 или -4. Определение локализации и первичной последовательности ганглиозид-связывающих фрагментов цитокина позволит создать новые препараты пептидной природы, эффективно перехватывающие сброшенные ганглиозиды, но лишенные прочих активностей IL-2 или IL-4. Ранее для определения сайтов связывания лиганда на рецепторе применяли фотоаффинное мечение. Так, в работе (Shapiro R.E., 1997) с помощью фотоаффинномеченого ганглиозида GTlb был установлен сайт связывания ганглиозидов в молекуле токсина столбняка.

Иммуносупрессирующее действие ганглиозидов может быть связано также с ГСЛ-индукцией апоптоза лимфоцитов. Если ганглиозиды способны облегчать вступление иммунокомпетентных клеток в апоптоз или сами являются индукторами программируемой клеточной смерти, это может привести к развитию/усилению иммунодепрессии или к появлению более специфического иммунодефицита в случае элиминирования лишь части клеток Т-клеточного репертуара.

В последнее время особое внимание уделяется функциям ГСЛ и их метаболитов как вторичных мессенджеров в клетках (Tahaha Т.А., Mullen T.D, Obeid L.M., 2006). Известна роль таких метаболитов как церамид (Сег) в проведении сигнала на апоптоз в клетке (Pandey S., Murphy R.F., and Agrawal D.K., 2007). Кроме того, известно, что Сег образуется при катаболизме ганглиозидов в клетке. Имеются данные об участии ганглиозидов в развитии апоптоза, причем особое внимание уделяется ганглиозиду GD3, индуцирующему апоптоз клеток по митохондриальному пути (De Maria, R. et al., 1997, 1998). При активации клеток FasL концентрация GD3 в клетках возрастает. Особое значение в проведении сигнала на апоптоз уделяется митохондриям (Kroemer, G., Galluzzi, L., and Brenner, С., 2007); вторичные мессенджеры, действующие на эти органеллы, приводят к образовании транзиторных пор в мембранах митохондрий и к высвобождению таких факторов как bcl-2, AIF и цитохром с. Показано, что одним из таких вторичных мессенджеров — ганглиозид GD3 (De Maria, R. et al., 1997; Rippo, M.R. et al., 2000). Тем самым пути проведения сигнала на апоптоз и метаболические пути ганглиозидов пересекаются.

В настоящее время не выявлены закономерности между способностью ганглиозидов индуцировать апоптоз клеток и структурой молекул; не изучено пересечение специфических биохимических путей ГСЛ, связанных с их метаболизмом в клетках, и классических путей апоптоза, например, при действии на клетку FasL или TNFa.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

Целью настоящей работы является характеристика механизмов конкурентного и

неконкурентного типов ингибирования пролиферации активированных цитотоксических лимфоцитов, определение зависимости между структурой ганглиозидов и механизмом их действия, супрессирующего пролиферацию Т-лимфоцитов. Важной частью работы является также анализ перестроек клеточной мембраны, происходящих при встраивании в мембрану ганглиозидов и приводящих к модуляции сигнала.

Другой важной задачей было определение первичной последовательности фрагментов молекулы интерлейкина-4, взаимодействующих с ганглиозидами, характеристика способности пептидов - фрагментов молекулы интерлейкина-4

связывать ганглиозиды, а также анализ структуры сайта связывания ганглиозидов молекуле 1Ь-4.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ

Впервые обнаружена связь между типом ингибирования \L-2- и 1Ь-4-зависимо пролиферации Т-лимфоцитов, индуцируемым ганглиозидами разного строения, характеристиками комплексов ганглиозид/цитокин. Показано, что ди-трисиалоганглиозиды (СПЬ, СЭЗ) и моносиалированный ганглиозид ОМЗ проявля1 близкий к конкурентному тип ингибирования пролиферации. Эти ганглиозид образуют с г!Ь-2 и гГЬ-4 комплексы с низкой константой диссоциации (Кл составляющей 5-10 нМ. Ганглиозиды СМ 1 и вМ2 ингибируют пролиферацию клето линий СТЬЬ-2 и СТ.4Я по конкурентному и неконкурентному типам одновременн Определены значения Кл комплексов, ганглиозидом ОМ1 с г1Ь-2 и г1Ь-взаимодействие вМ2 с интерлейкином-2 и -4 неспецифично.

Впервые определены фрагменты в молекуле 1Ь-4, взаимодействующие ганглиозидами; для этой цели охарактеризован и использован фотоаффинный зонд 125 Оср-СМ1, несущий фотофор в олигосахаридной части молекулы. Фрагмент молекулы 1Ь-4, взаимодействующие с ганглиозидом СМ1, — участки молекулы аминокислотными остатками 19-25 ((ЗКТЬСТЕ) и 103-113 (АМС)8ТЬЕ№ЬЕ). Впервы установлены пространственно сближенные фрагменты молекулы 1Ь-4, формирующи копформационный сайт связывания ганглиозидов. Охарактеризована способное синтетических пептидов связывать опухолеассоциироваиный ганглиозид.

Впервые выявлено, что экзогенный ганглиозид вМ1 эффективно взаимодейству с а-субъединицей 1Ь-2К, что приводит к сильному маскированию этой субъединиц рецептора, в то время как доступность других субъединиц 1Ь-2Я или 1Ь-4Я поел инкубации с ганглиозидом меняется недостоверно; результаты получены с помощы цитометрического анализа клеток. В то же время, с помощью встроенного в мембран клеток фотоаффинного ганглиозида 1251-Оср-ОМ1, несущего фотофор Эср в ацильно цепи, установлено, что при индукции апоптоза клеток линии СТ1Х-2 ганглиозидо вМ 1 ганглиозид взаимодействует с р-субъединицей 1Ь-2Я; взаимодействие с другим субъединицами рецепторов интерлейкинов-2 и -4 не зарегистрировано.

Впервые определена способность ганглиозидов индуцировать апоптоз активированных цитотоксических лимфоцитов (клеток линии СТЬЬ-2 и активированных С08+-Т-лимфоцитов человека). Максимальной способностью вызывать апоптоз этих клеток обладают моносиалнровашше ганглиозиды; эффективность убывает с увеличением числа сиалильных групп в молекуле гапглиозида. Показано, что индуцированный ганглиозидами апоптоз клеток линии СТЬЬ-2 является каспазозависимым. Ганглиозиды разного строения индуцируют апоптоз, но пути его проведения различаются; отличия показаны как для инициирующего участка каскада каспаз, так и для эффекторного. Лишь для процесса, индуцированного ОМ1, найдено полное совпадение механизма проведения сигнала с механизмом, описанным для рецепторного пути апоптоза; в переносе через мембрану сигнала на апоптоз, индуцированного этим ганглиозидом, участвуют упорядоченные микродомены плазматической мембраны, рафты. Установлено регулирующее влияние каспазы 3 на каналы митохондрий.

Форма представления ганглиозидов клеткам влияет как на эффективность развиваемого апоптоза Т-лимфоцитов: ганглиозиды, добавленные клеткам в составе липосом, индуцируют апоптоз Т-лимфоцитов более эффективно по сравнению с добавленными в составе мицелл. Они попадают в лизосомы, и их катаболиты участвуют в развитии сигнала на апоптоз. Добавление ганглиозидов в виде мицелл приводит к использованию клетками классических путей трафика ГСЛ и его катаболизма.

Результаты данной работы показывают, что супрессия цитотоксического звена иммунитета при развитии опухолевого процесса может развиваться как в результате перехвата опухолевыми гаиглиозидами цитокииов (и, тем самым, уменьшения эффективной их концентрации), так и путем прямой индукции смерти цитотоксических Т-лимфоцитов.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Результаты исследования формируют новое представление о механизмах иммуиосупрессин, вызываемой ганглиозидами, сбрасываемыми с поверхности опухолевых клеток при развитии опухолевого процесса. Синтетические пептиды, связывающие ганглиозиды, а также конструкции, полученные на их основе, могут

быть использованы для развития нового подхода к цитокинотерапии. Указанны пептиды перспективны также для создания новых онкодиагностикумов.

• Результаты исследования интерференции апоптотического пути сфинголипидного метаболизма позволяют понять причины устойчивости опухолевы клеток к апоптотическим сигналам, а также выработать подходы для повышени чувствительности этих клеток к химио- и радиотерапии.

Методические рекомендации, сформулированные по результата фотоаффинного зондирования клеток и белков, важны для расширения применени этого информативного подхода к изучению сайтов связывания лигандов рецепторами, участников проведения сигнала, а также для изучения други структурных образований, требующих присутствия нативных белков.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Ганглиозиды ингибируют пролиферацию \L-2- и 1Ь-4-зависимых клеточных лини по конкурентному типу; супрессирующая Т-лимфоциты эффективность ганглиозидо возрастает с ростом числа сиалильных группировок. В то же время, ганглиозид формируют комплексы с 1Ь-2 и 1Ь-4, причем специфичность комплексов коррелирует типом ингибирования, проявляемым конкретным ганглиозидом, и со структуро молекулы. Так, с максимальной специфичностью взаимодействуют с 1Ь-2 и 1Ь-ганглиозиды, несущие дисиалильную группировку. Ганглиозиды конкурируют рецепторами 1Ь-2 и 1Ь-4 за молекулы соответствующих интерлейкинов.

2. Ганглиозид СМ1 препятствует взаимодействию 11.-2 с клеткой за счет экран рования а-субъедииицы 1Ь-2Я. Экзогенный ганглиозид вМ 1 воздействует 1 функционирование лимфоцитов не только в результате сорбции на поверхносп встраиваясь в клеточную мембрану, он попадает в ближайшее липидное окружение субъединицы рецептора, влияя на сборку 1Ь-211.

3. Ганглиозид вМ1 взаимодействует с фрагментами молекулы 1Ь-4, расположенным на антипараллельных петлевых участках. Это фрагменты с аминокислотным остатками 19-25 (0>КТЬСТЕ) и 103-113 (АЫС^ТЬЕОТЬЕ); они пространствен сближены и, таким образом, формируют конформационный сайт связывания.

4. Экзогенные ганглиозиды супрессируют пролиферацию Т-лимфоцитов не толь путем перехвата интерлейкина-2 и -4; они также индуцируют апоптоз клеток. Апопт

CD8f T-лимфоцитов способны вызывать ганглиозиды разного строения, в проведении сигнала на апоптоз участвуют каспазы; однако пути его проведения для ГСЛ разного строения различаются, отличия показаны как для инициирующего участка каскада каспаз, так и для эффекторного. Эффективность процесса максимальна при обработке клеток моносиалированными ганглиозидами. Перенос сигнала от ганглиозида на апоптоз через мембрану происходит с участием рафтов.

5. Экзогенные ганглиозиды попадают в разные органеллы клетки при их добавлении в виде мицелл или в составе липосом. Во втором случае они попадают в лизосомы, образующиеся активные метаболиты ГСЛ участвуют в развитии сигнала на апоптоз; в результате достигается более высокая интенсивность процесса. Трафик ганглиозидов, добавленных клеткам в виде мицелл, является классическим для ГСЛ: ганглиозиды попадают в эндоплазматический ретикулум, а затем в аппарат Гольджи.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы диссертации доложены на III Советско-швейцарском симпозиуме «Биологические мембраны. Структура и функции» (Ташкент, 1983), на I съезде иммунологов России (Новосибирск, 1992), на 4-ом конгрессе Российской ассоциации аллергологов и клинических иммунологов (РААКИ) «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2001), на V и VII Всероссийских научных Форумах с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2001, 2003), на II-ом съезде биофизиков России (Москва, 1999), на V и VII чтениях, посвященные памяти акад. Ю.А. Овчинникова «Биоорганика 2000» и «Биоорганика 2004» (Москва, 2000 и 2004), на XIII, XIV, XV, XVII и XVIII Зимних международных молодежных научных школах «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2001, 2002, 2003, 2005 и 2006), а также на: 8th International Congress of Immunology (Budapest, Hungary, 1992), 13th European Immunology Meeting (Amsterdam, 1997), 10th International Congress of Immunology (New Delhi, 1998), Frontiers of Cellular Microbiology and Cell Biology (San Feliu de Guixols, Spain, 2004), XVIII International Symposium on Glycoconjugates (Florence, Italy, 2005), ISAC XXIII International Congress (Quebec, 2006), 53st Annual Meeting of Biophysical Society of USA (Boston, Massachusetts, USA, 2009), 2nd European congress of immunology (Berlin, Germany, 2009).

По материалам диссертации опубликовано 43 печатных работ, в том числе: главы в книгах; 15 статей в научных изданиях, рекомендованных ВАК РФ дл публикации материалов докторских и кандидатских диссертаций; 25 публикаций материалах отечественных и международных конференций и конгрессов.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 244 страницах машинописного текста, содержит 6 рисунков, 16 таблиц и 1 диаграмму. Диссертация состоит из следующих разделов введение, обзор литературы (главы 1-9), экспериментальная часть (материалы \ методы, результаты исследований и их обсуждение), выводы, список литературы Список литературы включает 390 источника, из них 5 на русском языке и 38 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В экспериментах использовали тимоциты мышей линии Fl(CBAxBALB/c) и

питомника ФИБХ РАН (г. Пущино, МО) в возрасте 8-12 недель с исходной массой 16 18 г; мононуклеарные клетки (МНК) периферической крови человека, выделенные и лейкоцитарной массы здоровых доноров по стандартному протоколу, а такж клеточные линии CTLL-2 и CT.4R. Клетки IL-4-зависимой Т-клеточной мышино" линии CT.4R получены по методу Hu-Li J. (1989).

Культивирование теток. Клетки культивировали в 24-луночных планшетах питательной среде RPMI-1640 («ICN Biomedicals», США) с добавлением 5% или 10°/ FCS («Bioclot», Германия), 2 мМ L-глутамина и 50 мкг/мл гентамицина (ПС). Д культивирования клеток линии CTLL-2 ПС дополняли rIL-2 (100 ед. акт./мл) и 50 мкМ 2-меркаптоэтанола; для клеток линии CT.4R - rlL-4 (500 ед. акт./мл) и 2 меркаптоэтанол (50 мкМ).

Для оценки ингибирования IL-2- или IL-4-зависимой пролиферации клето ганглиозидами клетки линии CTLL-2 или CT.4R инкубировали в ПС, содержащей последовательные разведения rIL-2 или rIL-4 соответственно; пролиферацию клето определяли колориметрическим методом (Mossmau Т., 1983).

Тип ингибирования ганглиозидами IL-2- и IL-4-зависимой пролиферации оценивали с помощью модели (Webb 1963) в рамках формализма теории Михаэлиса-Ментен. Рассматривали rIL-2(4) как аналог субстрата, локализованный в

плазматической мембране клетки рецептор к IL-2(4) - как аналог фермента, а ганглиозид - аналог ингибитора. Для построения модели тестировали действие ганглиозидов на 1Ь-2(4)-зависимую пролиферацию клеток с серийными разведениями rIL-2(4) в широком диапазоне концентраций. Анализ данных проводили с помощью графиков Лайнуивера-Берка и с использованием программы Inhibit, написанной для решения данной задачи (Svirshchevskaya et al. 1993). По экспериментальным данным вычисляли Kei - константу образования двойного комплекса фермент-ингибитор (либо субстрат-ингибитор) и Kes¡ - константу образования тройного комплекса фермеит-субстрат-ингибитор. Вводили параметр W, описывающий совокупное образование комплексов: W = К„ / Kcsi. Если W = 0, иигибирование является строго конкурентным. При 0<W<1 иигибирование происходит по конкурентному и по неконкурентному типам. Бесконкуренткое (необратимое) иигибирование характеризует W> 1.

Ганглиозиды добавляли клеткам в виде мицелл или липосом. Мицеллы получали, подвергая суспензию липида в PBS, содержащем 10% МеОН, обработке ультразвуком в водяной бане. Липосомы формировали методом экструзии суспензии липидов через поликарбонатную мембрану («Nucleopore», США) с порами диаметром 0.1 мкм. Конечная концентрация липосом по липиду составляла 0.25 мг/мл.

Для определения констант диссоциации комплексов ганглиозида с IL-2 или IL-4 антрилвинилмеченые флуоресцентные ганглиозидные зонды добавляли к раствору фосфатидилхолина так, чтобы концентрация зонда составляла 0.5 мол%. Липосомы получали методом экструзии. К суспензии липосом добавляли rIL-2 или rIL-4. Анизотропию флуоресценции регистрировали на спектрофлуориметре Сагу Eclipse (Varían, Австрия) в кюветах с термостатированием и перемешиванием.

Проведение фотореактивной пришивки зонда mI-Dcp-GMl к rIL-4 и определение места сшивки зонда. 10 нмоль rIL-4 инкубировали с 10 нмоль шЮср-GM1 в PBS, в темноте (60 мин, 37°С), при легком потряхивании. Фотолиз суспензии проводили (5 мин, комн. t, перемешивание) ртутной лампой среднего давления (Хисп 365 нм), отсекая фильтром излучение <320 нм. Белок осаждали ультрацентрифугированием, осадок обрабатывали селективной эндопротеиназой Glu-C (соотношение фермент/субстрат, 1:100 М/М, 18 ч, 37"С). Реакцию останавливали быстрым замораживанием смеси до -196°С. Реакционную массу подвергали офВЭЖХ; для масс-спектрометрического анализа выбраны образцы с высоким уровнем как

поглощения в области амидных связей, так и радиоактивного счета. MALDI-TOF-масс-спектрометрический анализ проводили на времяпролетном масс-спектрометре «UltraFlex» (Bruker Daltonics, Германия) с ионным источником MALDI в линейном или отраженном режиме.

Фотолиз (l2SI)-Dcp-GMl-l в плазматических мембранах (клетках линии CTLL-2). Мицеллярную суспензию гапглиозида GM1 и зонда или

(125I)-Dcp-GMl-s (10/1, 0.2 мл) добавляли к лиофильно высушенной суспензии плазматических мембран (0.1 мг по белку) либо к суспензии клеток линии CTLL-2 в PBS с NaN3 (0.02%). Суспензию ганглиозидов инкубировали с мембранной фракцией 3 ч при 37°С или с суспензией клеток 40 мин при комн. t и мягком покачивании. Фотолиз фрагментов плазматических мембран (0.1 мг по белку в 200 мкл PBS) и суспензии клеток (2.5'10б/мл в 10 мл буфера) проводили как описано выше. В отдельных случаях фрагменты плазматических мембран делипидизировали тремя объемами смеси СНС13-МеОН, 1:3, получали белковый преципитат (центрифугирование при 2000g). Его лиофилизовали, затем готовили для SDS-PAGE. Отдельно собирали супернатант, его так же готовили для электрофореза. Иммунопреципитацией выделяли a-, ß- и у-субьединицы рецептора IL-2 (IL-2R) и рецептор IL-4. Использовали антитела к IL-2Ra, ß, Y и IL-4Ra для иммунопреципитации (rabbit anti-mouse CD25, CD122, CD132, CD124) («Santa Cruz Biotechnology Inc.» США). Фотореактивные пришивки анализировали PAG-электрофорезом (по Laemmli 1970) с последующей авторадиографией.

Оценку количества клеток, вступивших в апоптоз проводили на проточном цитофлуориметре Epics XL («Coulter», США) Обсчет полученных результатов проводили в программе WinMDI. Окрашивание клеток FlTC-аннексином V. После четырехчасовой инкубации с индуктором апоптоза, клетки дважды отмывали холодным PBS, ресуспендировали однократным PBS, содержащий 150 мМ СаС1:, и добавляли растворы FITC-аннексина V и PI. Окрашивание фиксированных клеток PI проводили по общепринятой методике (Telford, King, and Fraker 1994). Прямой метод окрашивания открытых концов цепей ДНК (TUNEL-метод). Окрашивание клеток проводили с применением набора фирмы «PharMingen» по инструкции изготовителя.

Для изучения участия каспаз в проведении сигнала на апоптоз использовали их ингибиторы: Z-VAD-FMK, Z-DEVD-FMK, Z-LEVD-FMK, Z-WEHD-FMK, Z-IETD-FMK, Z-LEHD-FMK («Oncolmmun Inc.», США). Клетки инкубировали с

гапглиозидами (40 мкг/мл) в присутствии ингибиторов каспаз (10 мкМ) в течение суток.

Трансмембранный потенциал митохондрий регистрировали цитометрически, используя потенциал-чувствительный зонд DiOC6(3) (50 нМ).

Для конфокальной микроскопии образцы готовили на чашках Петри, обработанных 0.01% раствором полилизипа («Sigma») для просмотра в микроскопе Carl Zeiss 510 (Германия) с UV-лазером, под объективом Plan-Neofluar 100х/1.3 oil Ph 3 (3).

Статистическая обработка данных. Число повторов для каждой экспериментальной точки - от 2 до 4. Все опыты были повторены не менее трех раз. Определяли среднее арифметическое и стандартную ошибку среднего арифметического. Достоверность оценивали по t-критерию Стыодента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ I. КОНКУРЕНТНЫЙ ТИП ВЫЗЫВАЕМОГО ГАНГЛИОЗИДАМИ ИНГИБИРО-ВАНИЯ IL-2- И IL-4-ЗАВИСИМОЙ ПРОЛИФЕРАЦИИ Т-ЛИМФОЦИТОВ 1. Определение параметров ннгнбнрования пролиферации клеток линии CTLL-2 н CT.4R под действием ганглиозидов

В конце 80-х годов было высказано предположение (Chu W.K., Sharom F.J., 1990), что одним из механизмов подавления пролиферации Т-лимфоцитов гапглиозидами является их непосредственное взаимодействие с IL-2. Однако прямых свидетельств такого взаимодействия установлено не было; не была также определена зависимость между структурой ганглиозида и его сродством к IL-2. Сходство в строении IL-2R и IL-4R, а также гомология в строении IL-2 и IL-4 позволили нам выдвинуть предположение о способности ганглиозидов влиять и на IL-4-зависимую пролиферацию клеток. Для проведения такого анализа была получена клеточная линия CT.4R (по методу Hu-Li J. et al, 1989), которая отличается способностью к пролиферации в присутствии IL-4.

Индивидуальные ганглиозиды сравнили по супрессирующему воздействию на пролиферацию клеток IL-2-зависимой клеточной линии. Они располагаются в следующий ряд: GTlb > GDla > GM1 > GD3 > GM2.

Для определения механизма ингибирования IL-2- и IL-4-зависимой пролиферации гапглиозидами различных классов изучали зависимость восстановления пролиферации

клеток линии СТ1Х-2 или СТ.4Я, ингибированной ганглиозидами, при добавлении 1Ь-2- или 1Ь-4 соответственно. Кинетический анализ результатов позволил определить тип ингибирования пролиферации 1Ь-2- и 1Ь-4-зависимых клеток индивидуальными ганглиозидами. Для характеристики типа ингибирования цитокин-зависимых клеток применили параметр ингибирования IV (Табл. 1). Ингибитор, для которого значения \У близки 0, проявляет близкий к конкурентному тип ингибирования пролиферации клеток, т.е. вТ1Ь и СЭЗ ингибируют 11,-2- и 1Ь-4-зависимую пролиферацию клеток по близкому к конкурентному типу ингибирования, а ОМ 1 и ОМ2 проявляют конкурентный и неконкурентный типы ингибирования одновременно. вМЗ занимает в промежуточное положение, причем в случае 1Ь-2-зависимой пролиферации ингибитор по своему действию приближается к конкурентному (Ж = 0.08), а при 1Ь-4-зависимой пролиферации возрастает вклад неконкурентного типа ингибирования = 0.14).

При проведении тестирования ганглиозидов СМ1, йМЗ, СЭ1Ь на клетках, инкубируемых на полной среде (ПС), дополненной 5% РС5, значения параметра оказались ниже, чем при добавлении 10% сыворотки. То есть введение в среду культивирования дополнительных сывороточных факторов приводит к увеличению вклада конкурентного ингибирования и к уменьшению - неконкурентного.

Таблица 1. Зависимость параметра ингибирования (IV) ганглиозидами. пролиферации клеток линии CTLL-2 и CT.4R от концентрации FCS.

Ганглиозид W

Клетки линии CTLL-2 Клетки линии CT.4R

10% FCS 5% FCS 10% FCS 5% FCS

GM1 0.32+0.06 0.33±0.07 0.32±0.07 0.51±0.08

GM2 0.49+0.10 0.26±0.09 0.26±0.08 0.38+0.09

GM3 0.08±0.03 0.18+0.04 0.14±0.04 0.22+0.09

GD3 0.04+0.01 0.11+0.02 0.11+0.02 0.09±0.01

GTlb 0.06+0.02 0.08+0.03 0.08±0.02 0.09+0.03

Ранее было показано, что в присутствии FCS резко усиливается взаимодействие ганглиозидов с 1L-2 (Chu W.K., Sharom F.J., 1990). Мы предположили, что факторы сыворотки способны связываться с поверхностью мембраны клеток, блокируя тем самым потенциальные места связывания с ганглиозидами и уменьшая степень их

действия по неконкурентному пути. Подтверждением этому служат результаты, полученные для трисиалоганглиозида GTlb, который проявляет ярко выраженный конкурентный тип ингибирования клеток линии CTLL-2 независимо от содержания сывороточных факторов в среде (Табл. 1). Аналогичные результаты получены для ганглиозидов GTlb и GD3 на клетках линии CT.4R.

Ганглиозид GM2, ассоциированный с опухолевыми заболеваниями, ингибирует пролиферацию клеток IL-2- и IL-4-зависимой клеточных линий как по конкурентному, так и по неконкурентному типам одновременно, однако на клетках линии CTLL-2 увеличение количества сывороточных факторов приводит к уменьшению вклада конкурентного ингибирования (при 5% FCS, W = 0.26 и при 10% FCS W = 0.38). Этот результат резко отличается от закономерностей, наблюдаемых для остальных ганглиозидов. Характерно, что способность данного ганглиозида индуцировать апоптоз (один из вероятных механизмов ингибирования по неконкурентному пути) усиливается в присутствии rIL-2, в то время как для GM1, например, добавление rIL-2 приводит к резкому ослаблению его способности индуцировать апоптоз (см. Раздел 3), возможно, за счет образования неактивного комплекса GM1/IL-2, уменьшающего эффективную концентрацию ганглиозида.

Таким образом, на основании результатов кинетического анализа активности индивидуальных ганглиозидов, проведенных на IL-2- и IL-4-зависимых клеточных линиях, можно предположить, что существенный вклад в ингибирование активированных цитотоксических лимфоцитов привносит прямое взаимодействие между молекулами ганглиозида и цитокина, что проявляется в ингибировании пролиферации клеток по конкурентному механизму. Различия во вкладах конкурентного и неконкурентного ингибирования, наблюдаемое при увеличении концентрации FCS, подтверждают это предположение. Увеличение количества сиалильных остатков в молекуле ганглиозида приводит к увеличению вклада конкурентного ингибирования Т-лимфоцитов, что свидетельствует об их роли в образовании комплексов гапглиозид/интерлейкин-2 и ганглиозид/интерлейкин-4.

2. Характеристика комплексов ганглиозидов с IL-2 и IL-4

Чтобы проверить предположение о непосредственном взаимодействии

ганглиозидов с IL-2 и IL-4, мы сравнили сродство к IL-2 и к IL-4 ганглиозида GM3,

ингибирующего пролиферацию клеток по типу, близкому к конкурентному, и ганглиозида ОМ1, для функционирования которого характерен значительный вклад неконкурентного типа ингибирования. Кроме того, исследовали способность ганглиозидов вМ2 и вОЗ, ассоциированных с опухолевым процессом, образовывать комплекс с цитокинами 1Ь-2 и 1Ь-4. В качестве отрицательного контроля был использован неактивный в клеточных экспериментах лактозилцерамид (ЬасСег), который не содержит сиалильных остатков. Для этой цели анализировали зависимость изменения анизотропии флуоресценции (Дг) антрилвинил- (АУ)-меченных ганглиозидов АУ-СМ1, АУ-СШ, А\'-СОЗ, АУ-СМ2 и меченого гликолипида АУ-ЬасСег, встроенных в липосомы, от концентрации добавленного цитокина г1Ь-2 или г1Ь-4; анизотропия флуоресценции увеличивается при уменьшении подвижности флуорофора, т.е. при связывании молекулы зонда с молекулой цитокина. Применены флуоресцентномеченые аналоги этих ганглиозидов; их поведение в плазматической мембране близко к таковому природных липидов.

Определяли зависимость Дг от концентрации соответствующего цитокина. Для ганглиозидов были получены простые изотермы связывания: с повышением концентрации лиганда наблюдается монотонное возрастание значений Дг, которое выходит на плато в области высоких концентраций цитокина (Рис. 1, вставка); зонды АУ-ОМ2 и АУ-ЬасСег не дают достоверного отклика (данные не приведены). Представление полученных данных в логарифмических координатах в координатах Хилла приводит к линейным зависимостям (Рис. 1). Были получены значения Кй для комплексов ганглиозидов (кроме СМ2) с 1Ь-2 и 1Ь-4 — см. Табл. 2.

Для выявления специфичности взаимодействия ганглиозидов ОМ1, вМЗ и СОЗ с т!Ь-2 и г1Ь-4 исследовали возможное опосредование действия цитокинов на липосомы липидами матрицы. Для ответа на этот вопрос мы добавляли цитокины к липосомам, не содержащим ганглиозиды или к липосомам, содержащим лишь немеченые ганглиозиды, а в качестве флуоресцентного зонда использовали антрил-винилмеченый фосфатидилхолин (АУ-РС).

А В

Рис. 1. Зависимость анизотропии флуоресценции Лг|ШХ/Лг - 1 зондов от концентрации г1Ь-2 (А, С) или г1Ь-4 (В, О) (в логарифмических координатах) в липосомах, состоящих из РОРС (99.5 мол%) и флуоресцентномеченого ганглиозида (0.5 мол%): АУ-ОМ1 (1А, В), АУ-СМЗ (2А, В) или АУ-ООЗ (С, О). Вставки: соответствующие зависимости, представленные в прямых координатах.

Таблица 2. Значения Кл комплексов ганглиозидов с цитокинами г1Ь-2 и г1Ь-4.

Ганглиозид кл

1Ь-2 1Ь-4

0.38 мкМ 0.28 мкМ

вмз 12 нМ 5 нМ

ОЭЗ 110 нМ 45 нМ

В обоих случаях мы не наблюдали изменения г (данные не приведены), т.е. теоретически возможная сорбция цитокина на липосомах не приводит к изменению значений этого параметра.

Результаты экспериментов двух типов, на клетках и на модельных мембранны системах, хорошо согласуются: низкие значения константы диссоциации комплексо ганглиозидов ОБЗ и ОМЗ с цитокинами хорошо соответствуют параметр ингибирования IV, близкому нулю и, следовательно, реализуемому ганглиозидам! конкурентному типу ингибирования пролиферации интрелейкин-зависимых клеток.

Для ОМ1, ингибитора с ярко выраженным вкладом неконкурентного тип ингибирования (значения IV =0.31 и 0.32 для СТЪЬ-2 и СТ.4Я соответственно) определены низкие константы связывания. СМ2 ингибирует пролиферацию клеток п выраженному неконкурентному типу (IV = 0.49 для 1Ь-2-зависимых клеток), изменени анизотропии зонда АУ-СМ2 при добавлении цитокинов находятся в пределах ошибки т.е. взаимодействия между вМ2 и г!Ь-2 или г1Ь-4 неспецифичны.

Для АУ-ЬасСег, зонда на основе неактивного в кинетических тестах гликоли-пида, добавление ГЬ-2 и 11.-4 не изменяло величину г, что подтверждает роль сиалильного остатка во взаимодействии 1Ь-2 и 1Ь-4 с ганглиозидами.

3. Влияние синтетических пептидов 1Ь-4 на ингибироваиие индуцированного ганглиозидом СОЗ ингибирования пролиферации лимфоцитов

Перед проведением фотореактивной пришивки были проведены предварительные исследования для анализа наиболее вероятных участков взаимодействия 1Ь-4 с ганглиозидом. Целью такого исследования был выбор селективной протеазы. Анализ пространственной структуры молекулы 1Ь-4 основывался на предположениях, что участки молекулы цитокина, связывающие ганглиозид, должны располагаться на гибких структурах молекулы, а также содержать заряженные положительно аминокислотные остатки. Поэтому для функционального анализа были синтезированы пептиды следующего состава: фрагмент 1: 1Ь-4 БР 22-37: ТЬСТЕЬТУТОШААЗК; фрагмент 2: 1Ь-4 БР 55-68: РУЗНИЕКОТЯСЬСА; фрагмент 3: 11-4 БР 95-109: ОЬ^СРУКЕАНОБТЬ, а также 1Ь-482 - рекомбинантная форма 1Ь-4, лишенная последовательности 22-37. Синтез пептидов, а также получение 1Ь-4§2, были проведены в Институте инженерной

иммунологии, РАО «Биопрепарат». Пептиды были охарактеризованы по способности стимулировать рост клеток линии СТ.4Я.

Рис. 2. Влияние пептидов - фрагментов 11,-4 (1500 нг/мл) на пролиферацию клеток линии СТ.4Я, супрессированную ганглиозидом вОЗ. Контроль •- к клеткам добавлен г1Ь-4 в разных концентрациях, 3 - клетки инкубировали в присутствии СИЗ (40 мкг/мл); А - клетки инкубировали в присутствии 003 (40 мкг/мл) и синтетических пептидов (1.5 мкг/мл) одновременно. А, добавлен пептид 11.-4 БР 22-37; В, добавлен пептид 11-4 5Р 55-68; С, 11.-4 вР 95-109, Д \L-Ao2.

Показано, что ни один из пептидов не оказывает стимулирующего влияния на пролиферацию клеток (данные не представлены).

Все полученные соединения были исследованы по их способности восстанавливать пролиферацию клеток линии CT.4R, обработанных онкоассоциированным ганглиозидом GD3 (Рис. 2). Восстановление пептидами пролиферации клеток, подвергнутых такой обработкой, означало бы их способность взаимодействовать с ганглиозидом. Выбранный для исследования ганглиозид GD3 взаимодействует с IL-4 с высокой специфичностью.

Показано, что пептид IL-4 SP 22-37 (TLCTELTVTDIFAASK) и рекомбинантная форма IL-452 способны значительно, на 23-30% восстанавливать пролиферацию клеток. Способность пептидов IL-4 SP 95-108 (GLNSCPVKEANQSTL) и IL-4 SP 55-68 (FYSHHEKDTRCLGA) восстанавливать супрессированную ганглиозидом GD3 пролиферацию клеток недостоверна (Рис. 2).

По результатам клеточного теста фрагмент 22-37 способен связываться с ганглиозидом GD3. IL-4S2, полноразмерный IL-4, лишенный фрагмента 22-37, сохраняет способность связывать ганглиозид, что свидетельствует о наличии на молекуле IL-4 второго участка с ганглиозид-связывающими функциями.

Т.о., результаты предварительного исследования показали, что фрагменты, связывающие ганглиозид, располагаются на петлевых участках молекулы IL-4. На основании этих результатов была выбрана селективная протеаза, сохраняющая петлевые участки. Кроме того, по-видимому, молекула содержит 2 участка, связывающих ганглиозид. Это предположение будет использовано при анализе фрагментов, с которыми произошла фотореакгивная сшивка.

4. Определение фрагментов молекулы IL-4, участвующих во взаимодействии с ганглиозидом, методом фотореактивной пришивки

Поскольку нами было показано, что ганглиозиды образуют комплексы с IL-2 и 1L-4, мы использовали метод фотоареактивного (фотоаффинного) мечения (Photoafilnity Labeling, PAL) для определения участков молекулы 1L-4, непосредственно взаимодействующих с ганглиозидом. Для установления сайтов связывания ганглиозида GM1 на молекуле IL-4 был выбран зонд i:sI-Dcp-GMl на основе GM1, несущий фотоактивируемую 2-диазоциклопентадиенкарбонилънуга (Dcp)

группу, а также радиоактивный иод-125 в олигосахаридной части молекулы. Зонд 1251-Dcp-GMl был синтезирован Е.Л. Водовозовой в лаборатории химии липидов ИБХРАН.

Синтез зонда потребовал замены ацетила нейраминовой кислоты Dcp-группой в молекуле природного GM1. Поскольку известно, что во взаимодействие между ганглиозидом и белковой молекулой важный вклад вносят сиалильные остатки (Sia), необходимо было проверить, насколько сильно влияет такая замена на сродство липида к IL-4. Прямая проверка этой характеристики возможна в функциональных тестах на клетках линии CTLL-2 с помощью кинетического анализа, однако применение такого подхода требует больших количеств зонда. Поскольку во взаимодействии СМ1 с В-субъединицей холерного токсина (СТВ) также принимает участие Sia, в качестве модельных исследований была проведена фотоаффинная пришивка 125I-Dcp-GMl к СТВ. В MS-MALDI продукта реакции наряду с молекулярным (m/z 11622.4) и двухзарядным (m/z 5812.3) ионом исходной субъединицы появляются пики однозарядных (m/z 11724.85; 11775.3; 11965.9; 12002.95) и двухзарядных (m/z 5862.3; 5888.6; 5930.75; 5984.9) ионов производных СТВ, несущих фрагменты зонда, что доказывает взаимодействие последнего с СТВ и тем самым свидетельствует о возможности использования зонда для изучения взаимодействий IL-4 с GM1. Мы предположили, что вероятным местом связывания ганглиозида с молекулой IL-4 являются петлевые участки белка, и для последующего анализа продуктов пришивки выбрали протеазу Glu-C, максимально сохраняющую эти участки, а также пептиды, синтезированные на основе которых обладают функциональной активностью (ингибируют супрессированную ганглиозидом GD3 пролиферацию клеток IL-4-завимой линии, см. выше). Выбор протеазы обосновали также, проведя полный MS-анализ rIL-4, подвергнутого протеолизу этим ферментом. Анализ подтвердил наличие фрагментов rIL-4, соответствующих петлевым участкам.

После 1-ч инкубации rIL-4 с 125I-Dcp-GMl (IM/IM в PBS), фотолиза и ультрацептрифугирования белок, ковалентно сшитый с производным GM1, подвергали протеолизу эндопротеиназой Glu-C. Полученные пептиды разделяли и анализировали методом ВЖХ, регистрируя два параметра, поглощение пептидной связи и радиоактивность. Фракции, несущие максимальную радиоактивность и эффективно поглощающие в области пептидных связей одновременно, анализировали с помощью MS-MALDI.

Фрагмент Масса, Да

ср + Н+ 92

ср + Na+ 114

ср + К+ 130

Sia + Н+ 341

Sia + Na+ 363

Sia + К+ 379

Sia-0 + Н+ 357

Sia-O + Na+ 379

Sia-0 + K+ 395

Таблица 3. Массы фрагментов При фотореактивной пришивке зонда к белковой

Dcp-GMl, ожидаемых в составе ,

молекуле образуется производное, содержащее

комплексов пептид/фрагмент

зонда (фрагментация в ходе MS- циклопентадиенкарбонильный остаток (ср). Анализ

MALDI)-- MS-MALDI-спектров 125I-Dcp-GMl показал, что в

процессе десорбции-ионизации молекула зонда фрагментируется, расщепляясь по амидной связи ср - сиалильная группа или по гликозидной связи сиалил—>галактозил, аналогично расщеплению немеченого GM1. Предполагается, что в результирующих масс-спектрах могут присутствовать пики ионов состава [М + Na]+ и [М + К]+. С учетом данных MS-MALDI-спектров протеолитических фрагментов rIL-4 были рассчитаны массы ожидаемых пиков меченых пептидов. Отсутствие в MS фрагментов церамидной части подтверждается отсутствием парных пиков, отличающихся на ДМ = 28 Да (в состав церамидного остатка входят сфингозиновые основания С18 и С20 в соотношении ~ 9:1.

В результате PAL выявлены 2 концевых фрагмента 1-8 (KCDITLQE) и 122-128 (KYSKCSS), а также фрагменты 19-25 (QKTLCTE), 41-42 (КЕ), 103-109 (ANQSTLE) и 110-113 (NFLE). Анализ локализации фрагментов 19-25 (QKTLCTE) и 103-113 (ANQSTLE) на пространственной структуре молекулы IL-4 показал, что эти фрагменты располагаются на двух антипараллельных петлях, сближенных в пространстве.

Поскольку PAL было проведено зондом, добавленным в мономерном виде (т.е. при концентрациях ниже константы мицеллообразования), K,i комплекса цитокин/зонд существенно возрастала по сравнению с величинами, определенными при презентации зонда в составе липосом; условия проведения пришивки могли привести к неспецифическим взаимодействиям. Это означает, что среди выявленных фрагментов молекулы rIL-4, к которым произошла пришивка зонда, могли оказаться фрагменты, взаимодействие которых с ганглиозидом является неспецифическим. В частности, концевые фрагменты молекулы цитокина обладают повышенной подвижностью. На этом основании мы предположили, что концевые фрагменты 1-8 и 122-128 взаимодействуют с зондом неспецифически; для этих фрагментов функциональный

Таблица 4. Сравнение расчетных и экспериментальных масс в МБ-спекграх сшивок пептидный фрагмент 1Ь-4-фрагмент 1251-Оср-ОМ1

Расчет, Да Мв, т/2, Да Отнесение

1040.48 - (1-8) + (ср + Н4)

1062.46 1066.05 + (ср + Иа4)

1078.44 1082.03 + (ср + К")

3049.34 3050.43 (19-42) +(ср + 81а-0+Ыа4)

913.41 - (19-25) + (ср + Н4)

935.39 937.17 + (ср + Ыа4)

951.37 953.24 + (ср + К")

616.17 617.29 (41-42) + (ср + 81а + Н^

638.15 639.20 + (ср + 35а + Ыа4)

654.13 655.20 + (ср + 81а + К1)

632.17 632.08' (41-42) + (ср + 51а-0 + Н4)

654.15 654.01 + (ср + Б^а-О + Иа4)

670.13 671.00 + (ср + К4)

2414.15 2411.18 (41-59) + (ср + Н4)

2436.13 2433.30 + (ср +

2452.11 2449.17 + (ср + К4)

853.38 854.93 (103-109) + (ср + Н4)

875.36 876.87 + (ср + Ыа4)

891.34 892.86 + (ср + К4)

862.27 - (110-113) + (ср +Б1а+Н4)

884.25 887.17 + (ср + + Иа4)

901.23 903.27 + (ср + + К4)

878.27 881.06 + (ср + £¡3-0 + Н4)

900.25 903.27 + (ср + 51а-0 + Иа4)

916.23 919.28 + (ср + Бга-О + К4)

2424.22 - (110-128) +(ср + Н^

2446.20 2450.16 + (ср + На4)

2462.18 2466.18 + (ср + К4)

2135.99 2187.98 (113-128)+ср+51а-0+Н+)

2207.97 2209.97 + (ср + 81а-0 + Ыа4)

2223.95 2226.02 + (ср + 81а-0 + К4)

893.39 - (122-128) +(К4 +Н4)

915.37 919.26 + (ср + Ыа4)

931.35 935.11 + (ср + К4)

анализ связывания с ганглиозидами проведен не был. Поэтому интерес для дальнейшего анализа представляли фрагменты 19-25,41-42, 103-109 и 110-113.

Расположение фрагментов молекулы 1Ь-4, выявленных при фотоафинной пришивке, представлено на Рис. 3.

А В

Рис. 3. Структура IL-4 с выделенными | фрагментами, связывающими ганглиозид GM1. А -фрагмент 110-113, В - фрагмент 19-25, С - 103-109 1 (по пространственной структуре, данной в работе Muller Т., Oechlenschlager F., BueherM., 1995).

Наиболее вероятным сайтом связывания являются последовательности двух петель (между спиралями а и b и спиралями с и d, Рис. 4), которые сближены в пространстве и обладают достаточной гибкостью и полярностью, чтобы взаимодействовать с олигосахаридной частью ганглиозида, а именно: первая последовательность 19-25 (Gln-Lys-Thr-Leu-Cys-Thr-Glu), которая находится в петле между спиралями а и 6; и вторая последовательность 103-113 (Ala-Asn-Gln-Ser-Thr-Leu-Glu-Asn-Phe-Leu-Glu), являющаяся участком петли между спиралями с и d и захватывающая спираль d. В молекуле IL-4 эти фрагменты располагаются на двух антипараллельных петлях, сближенных в пространстве (Рис. 4), причем обе последовательности состоят преимущественно из гидрофильных аминокислот, формируя полость для полярной олигосахаридной части ганглиозида.

Рис. 4. Пространственная организация ганглиозид-связывающего центра в молекуле 1Ь-4 (найденные фрагменты молекулы интерлейкина, связывающие ганглиозид, выделены зеленым и желтым цветом).

Поскольку известно, что в связывании ганглиозида с белками участвует не только полярная головка ГСЛ, но и гидрофобная часть молекулы, возникает вопрос о том, с каким участком молекулы цитокина она может взаимодействовать. Наиболее вероятным местом взаимодействия гидрофобных цепей ганглиозида являются спирали а и с молекулы 1Ь-4, поскольку они пространственно сближены и доля гидрофобных остатков в них велика, т.е. они могут формировать гидрофобную полость для неполярных цепей ганглиозида. Кроме того, конкуренция ганглиозида с рецептором за цитокин предполагает полное или частичное перекрывание связывающего его сайта на молекуле цитокина с сайтом, ответственным за связывание с рецептором. Основными аминокислотами 1Ь-4, формирующими сайт связывания с высокоаффинной 1Ь-4Ка-цепью, являются гидрофильные аминокислоты Е9 и Я88, которые располагаются в спиралях а и с соответственно. По-видимому, гидрофобный участок молекулы ганглиозида способен экранировать гидрофобные каркасы 11,-4, предотвращая взаимодействие молекулы цитокина с его рецепторной субъединицей.

II. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ГАНГЛИОЗИДА С 1Ь-2- И П^-РЕЦЕПТОРАМИ В КЛЕТКАХ ЛИНИИ СТЬЬ-2

В ингибирование пролиферации клеток может приносить свой вклад блокирование проведения сигнала за счет образования комплекса ганглиозид/рецепгор ингерлейкина. К настоящему времени эта проблема изучена слабо. Известно, однако, что в ряде случаев ганглиозиды могут образовывать комплекс с антигенами поверхности клеток. Так, показано, что инкубация С04+лимфоцитов с ганглиозидом СМЗ приводит к образованию комплекса ганглиозида с СВ4-антигеном и быстрой его интернализации (ОагоГа1о Т., Бойсе М., 1998).

Поскольку экзогенные ганглиозиды могут влиять на индукцию и проведение Независимого сигнала, меняя доступность либо его отдельных субъедиыиц для цитокина, был проведен эксперимент, в котором окрашивание клеток антителами к субъединицам 1Ь-2К. проводили после их инкубации с ганглиозидами. Условия эксперимента препятствовали как активному сбросу, так и интернализации комплексов рецептор/ганглиозид.

CTIL-2

3IL-2RC! alL2-R|i

0 ®М1 ■ 6М2 s SD3

Рис. 5. Влияние ганглиозидов на относительные значения флуоресценции (mean) клеток' линии CTLL-2, инкубированных 10 мин в PBS, дополненном 1% FCS и NaN3. Клетки окрашены антителами к IL-2Ra (левые столбцы) или к IL-2R(3 (правые столбцы). Желтые столбцы - инкубация с GM1; синие - с GM2, красные - с GD3. Концентрация ганглиозидов 40 мкг/мл. I

Ганглиозиды маскируют а- и fi-субъединицы IL-2R, причем особенно ярко этот эффект проявляется для ганглиозида GM1 и а-субъединицы рецептора, в то время как регистрируемое маскирование [3-субъедшшцы этим ганглиозидом находится в пределах разброса (Рис. 5).

Однако регистрируемое цитометрически уменьшение окрашивания антителами к субъединицам IL-2R клеток, обработанных ганглиозидами, недостаточно для понимания локализации ганглиозидов; информация недостаточна также для понимания возможных механизмов воздействия ганглиозидов на проведение IL-2-зависимого сигнала.

Применение метода PAL позволяет получить однозначную информацию о локализации зонда и целевой молекулы. Нами был использован 1251-Оср-меченый GM1, причем в данном случае метка расположена в области гидрофобных остатков, на разной глубине (123I-Dcp-GMl-s, метка находится на ацильном остатке С2, 125I-Dcp-GMl-l, остаток СП). В соответствии с условиями эксперимента, пришивка происходила лишь после встраивания ганглиозидного зонда в плазматическую мембрану.

Поскольку результаты по маскированию рецепторных белков получены при физиологических условиях после инкубации ганглиозидов с клетками линии CTLL-2, оба зонда в смеси с природным GM1 (1:100) также инкубировали (40 мин) с живыми клетками в физиологических условиях, после чего облучали.

Субъединицы IL-2R и IL-4R выделяли преципитацией с соответствующими антителами и проводили 10% SDS-PAG электрофорез в мягких восстанавливающих условиях. После мечения клеток зондом U3I-Dcp-GMl-s, кроме того, проводили электрофорез фракции плазматических мембран. На радиоавтограмме отчетливо определяется полоса белка с массой -75 кДа, соответствующая р-субъединице IL-2R (Рис. 6Ь, 3-я дорожка). Эта полоса обнаруживается электрофорезом иммунопреципитата с антителами к Р-субъединице IL-2R после проведения фотореактивной сшивки 1251-Dcp-GMl-1. В то же время, иммунопреципитаты, полученные после фотореактивной сшивки Dcp-GMl-s, не выявили на радиоавтограмме полосы ни для одного из использованных антител (данные не представлены).

1 2 3 4 5

2 3 4 5

Рис. 6. а, 10% SDS-PAGE белков мембран клеток линии CTLL-2 после зондирования фотореактивным ганглиозидом nsI-Dcp-GMl-l и иммунопреципитации. (/) стандарты Bio-Rad; (2) Белки клеток после мечения и иммунопреципитации с антителами к а-субъединице EL-2R; (5) То же, но с антителами к ß-субъединице IL-2R; (4) То же, но с антителами к у-субъединице IL-2R; (5) То же, но с антителами к 1L-4R. На все дорожки нанесено 60 мкг по белку, окрашивание серебром. Ъ, Те же дорожки, результаты авторадиографии (экспозиция 2 мес).

Иммунопреципитация проводится антителами, специфичными к определенному участку белковой молекулы. Зоня '2;,I-Dcp-GMl-s мог сшиться либо непосредственно с участком связывания с антителом, либо пришитый ганглиозид мог маскировать это место связывания, делая невозможным извлечение продуктов сшивки со специфическими белками иммунопреципитацией. Поэтому для выделения белков плазматической мембраны клеток использован альтернативный метод.

При таком способе выделения белков не происходит обогащения фракции по тестируемым субъединицам рецептора, однако не происходит также их потери за счет недоступности этих субъединиц для антител, используемых при иммунопреципитации.

I После фотореактивной сшивки |251-Оср-ОМ1-8 были выделены фрагменты ' плазматических мембран, далее анализированные электрофорезом и

радиоавтографией. В этом случае удалось зарегистрировать полосу, по молекулярной массе соответствующую (З-субъединице 1Ь-2Л, (Рис. 7Ь, дорожка 2).

1 2 3 4 2 3 4

Рис. 7. а, 10% SDS-PAGE белков клеток линии CTLL-2 после зондирования фотореактивным ганглиозидом Dcp-GMl-s. (/) стандарты, Bio-Rad; (2) Белки плазматических мембран клеток после фотомечения; (5) То же, но после фотомечения проведена делипидизация (хлороформ/метанол, 1:3; (4) Фракция веществ, извлеченных при делипидизации белков для дорожки 3. Нанесено по 60 мкг белка/дорожка, окрашивание серебром. Ь, Те же дорожки, результаты авторадиографии (экспозиция 2 мес).

Выделение субъединиц IL-2R и IL-4R после фотореактивной сшивки обоих зондов позволило зарегистрировать на радиоавтограмме полосу, соответствующую IL-2Rß, лишь для зонда lbI-Dcp-GMl-l (Рис. 6Ь, 3). Однако нам удалось выявить полосу, соответствующую lL-2Rß, после пришивки l25I-Dcp-GMl-s, когда для электрофореза использовали фрагменты плазматических мембран зондированных клеток (Рис. 7Ь, 2).

Иммунопреципитацию проводили с использованием антител к определенным белкам (в нашем случае - к субъединицам IL-2R и IL-4R), полученным к определенному эпитопу белковой/полипептидной молекулы. В случае если сшивка находится либо непосредственно в специфическом для антитела участке белковой молекулы, либо продукт сшивки экранирует участок связывания антитела, антитела не свяжутся с субъединицами, содержащими пришитые молекулы ганглиозида. Выделение плазматических мембран клеток не позволяет сконцентрировать тестируемые белки, однако этот метод выделения позволяет проанализировать все белки, расположенные на клеточной поверхности. Именно такой метод выделения белков мембраны позволил зарегистрировать полосу, соответствующую IL-2RP по молекулярной массе (Рис. 7Ь, 2). Т.о. сшивка с использованием 125I-Dcp-GMl-s произошла именно в области места связывания антитела с IL-2R(i, т.е. с пептидом, расположенным на С-конце IL-2Rp.

В настоящее время широко обсуждается проблема сборки IL-2R; имеются разные данные относительно локализации а- и Р-субъединиц рецептора до и после получения клетками сигнала от лиганда (IL-2). Так, в работах группы Pao при использовании для выделения рафтов относительно жесткого неионного детергента Тритон-Х 100 показано их обогащение р-субъединицей IL-2R (Rao R. et al., 2004); частичная транслокация этой субъединицы в растворимую детергентами фракцию плазматических мембран клеток наблюдалась после активации клеток цитокином (Goebel J. et al., 2002). Мы проводили фотоаффинную пришивку зонда в условиях активации ганглиозидом апоптоза клеток, и в этих условиях фотореактивный зонд сшивается с р-субъединицей IL-2R, что свидетельствует как о локализации ганглиозида в ближайшем липидном окружении IL-2RP, так и о расположении этой субъединицы в доменах мембраны, обогащенных GMI (рафтах). Увеличенная концентрация ганглиозида, приводящая к увеличению размера рафта, не позволяет р-субъединице перейти в неупорядоченную мембранную фазу, что препятствует активации цитотоксических клеток даже при наличии цитокина.

Сравнение результатов двух подходов: цитометрического, проведенного после инкубации ганглиозидов с клетками, а также фотореактивного зондирования, обращает внимание то, что экзогенный GM1 резко уменьшает уровень экспрессии а-субъединицы 1L-2R, практически не изменяя характеристики Р-субъединицы, хотя пришивка зонда происходит именно к р-субъединице. Т.е. ганглиозид локализован в ближайшем липидном окружении именно этой субъединицы рецептора, но он не зарегистрирован

вблизи а-субъединицы. Это можно объяснить лишь двумя различными типами воздействий ганглиозида на рецепторы клетки, происходящими одновременно.

Первое из них, регистрируемое цитометрически, определяется электростатическим взаимодействием (олигосахарид/олигосахаридное взаимодействие). Такое взаимодействие не требует встраивания молекул ГСЛ в плазматическую мембрану, в то же время оно может препятствовать взаимодействию молекулы рецептора с лигандом за счет стерических факторов. Анализ, проведенный методом PAL, однозначно свидетельствует о локализации пула ганглиозида, встроившегося в мембрану. Основной механизм воздействия ганглиозидов на цитокин-зависимые процессы определяется их действием на латеральное передвижение субъединиц рецептора, следовательно, и на сборку рецептора.

III. НЕКОНКУРЕНТНЫЙ ТИП ГАНГЛИОЗИД-ИНДУЦИРОВАННОГО ИНГИ-БИРОВАНИЯ ПРОЛИФЕРАЦИИ Т-ЛИМФОЦИТОВ

1. Механизмы ганглиозид-индуцированного апоптоза клеток линии CTLL-2

Как было показано выше, ганглиозиды супрессируют IL-2-зависимую пролиферацию клеток линии CTLL-2. Частично это подавление связано с конкуренцией между рецептором к цитокину и ганглиозидами за молекулу IL-2. Однако одна эта конкуренция не может полностью объяснить супрессию, особенно для тех типов ганглиозидов, у которых вклад конкурентного типа ингибирования невелик (моносиалоганглиозиды GM1 и GM2 например). Мы предположили, что одним из механизмов неконкурентного ингибирования является апоптоз клеток.

Анализ способности ганглиозидов индуцировать апоптоз был проведен на клетках линии CTLL-2; регистрировали изменение доли аннексии V-положительных клеток. Положительным (по индукции апоптоза) контролем был проникающий через мембрану аналог церамида С2-Сег (4-ч инкубация). Инкубация клеток с ганглиозидом GM1 привела к появлению аннексии V-положительных клеток (Рис. 8).

Рис. 8. Двухпараметрическяе гистограммы распределения FlTC-аннексин V-позитив-ных (апоптозных) (квадрант 3) и FITC-аннексин V- и PI-позитивных (некрозных) (квадрант 4) клеток линии CTLL-2. А - добавлен PBS, В - инкубация с GM1 (40 мкг/мл).

Способность ганглиозидов индуцировать апоптоз различается (Табл. 5), она максимальна для моносиалированных ГСЛ (GM2, GM1, GM3) и минимальна для ди- и трисиалоганглиозидов ¿-серии (GDlb и GTlb). Способность ганглиозидов к индуцированию апоптоза клеток падает в ряду GM2 > GM3 > GMI > GDI а > GDlb > GTlb. В первой части работы показано, что ди- и трисиалоганглиозиды ингибируют пролиферацию клеток линии CTLL-2 по типу, максимально приближенному к j конкурентному. Моносиалированные же ганглиозиды, проявляющие неконкурентный j конкурентный тип ингибирования с небольшим вкладом конкурентного, активно J индуцируют их апоптоз. Эти результаты показывают, что индуцируемый !

ганглиозидами апоптоз - один из механизмов неконкурентного типа ингибирования I пролиферации Т-лимфоцитов. J

Таблица 5. Влияние ганглиозидов на долго клеток линии СТ1Х-2, вступивших в апоптоз (% от

Ганглиозид

йМ1 235 + 10

вМ2 680 ±3

вмз 670 + 30

001а 181 ±9

С01Ь 55 + 5

ОТ1Ь -30 + 3

Хорошо известен факт активации апоптоза клеток при дефиците ростовых факторов. Поскольку ганглиозиды способны связываться с цитокином, а используемая линия клеток является 11,-2-зависимой, был проведен анализ влияния г11_-2 на индукцию апоптоза, активированного ганглиозидами. Регистрировали активацию клеток ганглиозидами в присутствии и в отсутствие т1Ь-2 (Табл. 6).

Таблица 6. Влияние г1Ь-2 (100 ед/мл) на индукцию апоптоза клеток линии СПХ-2 ганглиозидами (40 мкг/мл) и С8-Сег (увеличение доли апоптотических

Эффект вМ1 в отсутствие г!Ь-2 сравним с эффектом, оказываемым природным

церамидом С8-Сег. Более того, ганглиозид вМ2 в присутствии г1Ь-2 сильнее индуцирует апоптоз, чем без факторов роста (Табл. 5). Это доказывает, что, по крайней мере, ганглиозид вМ2 индуцирует апоптоз по пути, отличному от инициируемого депривацией цитокина.

Цитокин Индуктор

С8-Сег ОМ1 вМ2

+ 11,-2 61 ± 5 % 61 ± 4 % 109 ± 7 %

-11,-2 58 ± 3 % 256 ± 19% 51 ± 3 %

2. Сравнение способности ганглиозидов разного строения индуцировать апоптоз различных субпопуляций Т-лнмфоцитов человека

Ганглиозиды, сброшенные с поверхности опухолевых клеток, попадают в кровоток в виде мицелл либо в составе липосом и в таком виде они воздействуют на циркулирующие в крови лимфоциты. Поскольку в противоопухолевом иммунитете особое значение принимают активированные СИ8+ Т-лимфоциты, нами было изучено влияние ганглиозидов на ФГА-стимулированные СОЗ+СП8+-лимфоциты человека (Табл. 7). Наибольшей способностью индуцировать апоптоз активированных С03+С08+

-лимфоцитов обладают моносиалированные, а наименьшей - три- и тетрасиалоганглиозиды, т.е. получены закономерности, аналогичные таковым для активированных цитотоксических Т-лимфоцитов мышей (для клеток линии CTLL-2, см. Табл. 7).

Поскольку показана общность эффектов ганглиозидов на клетках линии CTLL-2 и на активированных СВЗ+СБ8+-лимфоцитах периферической крови человека, пути проведения сигнала на апоптоз мы изучали на клетках линии CTLL-2.

3. Участие каспаз в апоптозе, индуцированном гаиглиозидами

Общий ингибитор каспаз Z-VAD-FMK практически полностью восстанавливает пролиферацию клеток, супрессия которых была вызвана гаиглиозидами GM1, GM2 и GD3. Апоптоз, индуцированный ганглиозидом GM3, при действии этого ингибитора ослабевает в 3.9 ±0.1 раза (Рис. 9а). Каспаза 8 передает сигнал на апоптоз от мембранных рецепторов и активирует включение каскада каспаз. Участие каспазы 8 в апоптозе, вызванном гаиглиозидами, мы изучали, используя ингибитор этой каспазы Ac-IETD-CHO. Апоптоз, вызванный гаиглиозидами GM1 и GD3, зависим от каспазы 8 (Рис. 9), т.е. ингибитор каспазы 8 восстанавливает пролиферацию, сниженную под действием GM1 и GD3. Добавление ингибитора к клеткам, инкубированным с ганглиозидом GM2, не приводит к уменьшению доли клеток, вступивших в апоптоз.

Наиболее значимой эффекторной каспазой является каспаза 3 (Liu X. et al. 1997). Анализ участия каспазы 3 в апоптозе, запускаемом гаиглиозидами, анализировали, используя ингибитор каспазы Ac-DEVD-FMK (Рис. 9с). Добавление ингибитора каспазы 3 восстанавливает супрессированную GM1 или GD3 пролиферацию клеток лишь незначительно (см. Рис. 9с); при индукции апоптоза ганглиозидом GM2 (Рис. 9с) и другими гаиглиозидами (данные не представлены) этот ингибитор не влияет на уровень пролиферации клеток.

Таблица 7. Влияние ганглиозидов на долю вступивших в апоптоз ФГА-активированных CD3+CD8+ лимфоцитов, % от контроля, за 72 ч.

Ганглиозид |

GM1 21.4±0.3

GM3 29.5±0.3

GDlb 22.6±0.4

GD3 12.2±0.1

GTlb 8,6±0.2

Рис. 9. Участие каспаз в индуцированном ганглиозидами ОМ1, йМ2, йМЗ и СЭЗ (20 мкг/мл) апоптозе клеток линии СТЬЬ-2. Цитофлуорометрическая регистрация клеток, окрашенных Р1. Добавлены: а, общий ингибитор каспаз, Ас-У АО-ПУПС; Ь, ингибитор каспазы-8 Ас-1ЕТО-СНО; с, ингибитор каспазы-3, Ас-ОЕУО-СНО. ■ - без ингибитора; □ - с ингибитором. Время инкубации 24 ч.

Каспаза 3 активирует расщепление ДНК клеток на фрагменты, кратные 180 н.п., определяемые на электрофо-реграмме ДНК в виде «лесенки» (Рис. 10). Электрофорез ДНК мы проводили после инкубации клеток с ганглиозидами в течение суток. Депривация ростового фактора IL-2 и добавление ганглиозидов GM1, GM3, GDla, GDlb, GD3, GTlb или GQlb привели к появлению характерной «лесенки» ДНК (Рис. 10); такие фрагменты нами не были выявлены при инкубации клеток с ганглиозидом GM2 и для ДНК клеток, инкубированных без ганглиозидов (в контроле) (Рис. 10).

rIL-2 -rIL-2 GM1 GM2 ОЮ GDla GD3 GTlb GQlb

Я Щ iSffiiil

iwtili

'тттшшт

SlliiiilSlllSpl IliliSiSSii

Рис. 10. Гель-электрофорез геномной ДНК, выделенной из клеток, инкубированных с ганглиозидами в течение суток; г!Ь-2, клетки инкубировали с г1Ь-2 (отрицательный контроль на апоптоз), -г1Ь-2, в отсутствие г1Ь-2 (положительный контроль на апоптоз).

Рис. 11. Влияние ганглиозидов GM2 (20 мкг/мл) и GM3 (20 мкг/мл) на связывание { флуоресцентномеченых нуклеотидов с клетками линии CTLL-2, окрашенными по

методу TUNEL; инкубация 24 ч. а. Микрофотографии клеток: 1, контроль (добавлен PBS); 2, добавлен ганглиозид GM2; 3, добавлен GM3. 6, Изменение ДЫ числа 1 флуоресцентномеченых клеток, индуцированных ганглиозидами GM2 и GM3, 1 выраженное в процентах относительно значений, полученных для не активированных клеток; регистрация цитометрическим методом. 1

Поскольку апоптоз, вызванный ганглиозидом GM2, не приводит к активации

каспазы 3, мы проверили наличие эндонуклеазной активности в процессе развития ! !

апоптоза, используя метод TUNEL, позволяющий регистрировать накапливающиеся L

разрывы ДНК. Флуоресценцию фиксированных клеток измеряли на флуоресцентном 1 ! микроскопе (Рис. 11а) и на цитофлуориметре (Рис. 115). Выявили, что инкубация

клеток с ганглиозидами GM2 и GM3 приводит к отчетливо заметному в первом

случае усилению флуоресценции клеток (Рис. 11а), а во втором - к увеличению

процента окрашенных клеток (Рис. 11 б) (относительно значений, полученных для

контрольных неактивированных клеток).

При инкубации клеток с ганглиозидом GM2 происходит изменение 1

морфологии, характерное для программируемой клеточной смерти, появляются также

аннексии V-позитивные клетки и разрывы в ДНК, выявляемые методом TUNEL. В то

я I

же время каспаза 3 и ее некоторые

субстраты не участвуют в развитии апоптоза, индуцированного ОМ2. Мы предполагаем, что для клеток данного типа программируемая клеточная смерть клеток, индуцированных ОМ2, реализуется через эффекторную систему, не зависящую от классических апоптосом.

4. Участие каспаз и митохондрий в проведение ганглиозид-игдуцированного сигнала на апоптоз клеток

Митохондрии являются ключевыми участниками апоптотического пути; они важны также и в проведении сигнала на апоптоз лимфоцитов, активированных ганглиозидами. Задачей данной работы является изучение роли каспаз в передаче сигнала на апоптоз, активированный ганглиозидами в тимоцитах, а также изучение вовлеченности каспаз в деполяризацию митохондрий; использован потенциал-зависимый краситель ОЮС6(3).

Все использованные ганглиозиды индуцируют апоптоз тимоцитов. Мы проверили участие в этом процессе каспаз, используя их общий ингибитор Е-УАО-РМК. Данный ингибитор полностью отменяет апоптоз клеток, индуцированный ганглиозидами ОМ1, йМ2 и ОБ1а, ООЗ, и 0(21Ь (Рис. 12А).

5 40]

6М1 смз воз сачь

6М1 бмз воз гсць

6М2 й01а 6Т1Ь

Рис. 12. Влияние общего ингибитора каспаз 2-УАО-РМК (А) и ингибитора каспазы 3 2-ВЕУГ)-РМК (В) на апоптоз тимоцитов, индуцированный ганглиозидами ОМ1, вМ2, йМЗ, ОБ 1а, ОБЗ, СТ1Ь и ОС>1Ь (40 мкг/мл). ■ - без ингибитора; а - с ингибитором. Время инкубации 24 ч.

То есть все тестируемые ганглиозиды индуцируют апоптоз тимоцитов, в проведении сигнала на который участвуют каспазы. Ингибитор каспазы 3 приводит к отмене клеточного апоптоза, индуцированного добавлением ганглиозидов GM1, GM2, GD3, GDIa, GTlb (Рис. 12В), а при добавлении ганглиозидов GM3, GQlb - к снижению доли апоптотических клеток в 2.6 и в 2.0 раза соответственно.

Для изучения вовлеченности каспаз в передачу сигнала на митохондрии активированных ганглиозидами тимоцитов были выбраны ганглиозиды, проявившие максимальную способность индуцировать апоптоз тимоцитов, - GM1, GD3 и GTlb. Инкубация тимоцитов с ганглиозидами приводит к деполяризации мембран митохондрий (падению мембранного потенциала); максимальные изменения наблюдаются для трисиалоганглиозида GTlb (33% от изменения, вызываемого добавлением клеткам антител к Fas) и минимальные - для моносиалированного GM 1 (17%, Рис. 13А). Для всех выбранных агентов воздействие на митохондрии приводит к развитию пути, в котором принимают участие каспазы, так как при их добавлении общий ингибитор каспаз Z-VAD-FMK практически полностью отменяет деполяризацию мембран митохондрий (Рис. 13В). Анализ воздействия общего ингибитора каспаз на ганглиозид-индуцированный апоптоз, регистрируемый по изменению числа гиподиплоидных клеток, выявил аналогичные закономерности: при добавлении Z-VAD-FMK происходит практически полное ингибирование процесса (Рис. 12А). Эти результаты свидетельствуют, что деполяризация мембран митохондрий в тимоцитах, активированных ганглиозидами GM1, GD3 и GTlb, -каспазозависимый процесс.

GM1 GD3 GT1b a-Fas

-100^

GM1 GD3 GT1b a-Fas

Рис. 13. (А) Влияние ганглиозидов GM1, GD3 и GTlb (40 мкг/мл) и антител к Fas (2 мкг/мл) на долю окрашенных DiOC6(3) тимоцитов с низкой интенсивностью флуоресценции (% от контроля). Инкубация 24 ч. (В) То же, но клетки обработаны общим ингибитором каспаз Z-VAD-FMK.

GM1 GD3 GT1b a-Fas

GM1 GD3 GT1b a-Fa$

Рис, 14. Влияние ингибиторов каспазы 8 Z-IETD-FMK (А) и каспазы 3 Z-DEVD-FMK (В) на долю окрашенных DiOC6(3) тимоцитов с низкой интенсивностью флуоресценции (% от контроля). Клетки инкубировали с гаиглиозидами GM1, GD3, GTlb (40 мкг/мл) и антителами к Fas (2 мкг/мл) в течение 24 ч.

Инициирующая каспаза 8 активируется на внутреннем монослое плазматической мембраны и активирует каскад каспаз (Kauímann S.H., Hengartner М.О., 2001). Это звено оказалось важнейшим при проведении сигнала на митохондрии в апоптозе тимоцитов, индуцированном антителами к Fas (Рис. 14А): ингибирование каспазы 8 приводит к отмене деполяризации мембран митохондрий тимоцитов, индуцированных

антителами к Fas, на 85%. При действии ганглиозидов на тимоциты деполяризация мембран митохондрий происходит либо вообще без участия инициирующих каспаз (при СИЗ-индуцировании апоптоза клеток добавление Z-1ETD-FMK не повлияло на потенциал митохондрий), либо с существенным вкладом других, альтернативных путей. Так, для процесса, индуцированного ганглиозидом GM1, на долю процесса, зависящего от каспазы 8, приходится 37%, а индуцированного GTlb - 21.7% (Рис. 12А). Каспаза 3 участвует в эффекторных стадиях развития апоптоза, однако ингибирование каспазы 3 отменяет деполяризацию мембран митохондрий тимоцитов, активированных антителами к Fas (на 74 ± 4 %), а также GMI и GTlb (на 58 ± 7% и 57.5 ± 4% соответственно). В то же время для GD3, индуцирующего проведение сигнала на апоптоз по пути, независимому от рецепторов смерти, Z-DEVD-FMK меньше влияет на мембранный потенциал митохондрий: этот ингибитор отменяет деполяризацию мембран ООЗ-активированных тимоцитов на 30 - 35% (Рис. 14В).

Таким образом, тестированные ганглиозиды индуцируют апоптоз с участием митохондрий в сигнальном процессе; более того, деполяризация мембран митохондрий является процессом, зависящим от активации каспаз, т.е. предварительная инкубация клеток с общим ингибитором каспаз отменяет проведение сигнала на митохондрии (Рис. 13В). Лишь индукция клеток антителами к Fas приводит к развитию процесса, протекающему только по рецептор-опосредованному пути, т.е. ингибитор каспазы 8 отменяет падение мембранного потенциала митохондрий на 85%. Этот ингибитор не влияет на деполяризацию мембран митохондрий клеток, активированных GD3 (Рис. 13В), т.е. в клетках, активированных этим ганглиозидом, проведение сигнала на апоптоз не зависит от каспазы 8 и происходит по митохондриальному (внутреннему) апоптотическому пути. Для ганглиозидов GM1 и GTlb проявляются оба пути проведения сигнала.

Ключевой эффекторной каспазой программируемой смерти клеток является каспаза 3. Добавление к тимоцитам ингибитора каспазы 3 приводит к отмене деполяризации мембран митохондрий в том случае, если клетки были активированы агентами, запускающими апоптотический процесс по рецептор-опосредованному пути либо полностью (антитела к Fas), либо частично (GM1 или GTlb) (Рис. 14В), но для ОШ-индуцированных клеток, стимулирующих митохондриальный апоптотический путь, этому ингибитору не удается отменить участие митохондрий.

5. Участие метаболитов гликосфинголипидов в проведении сигнала на апоптоз, индуцированного ганглиозидами

Индукция апоптоза ганглиозидами приводит как к активации общих апоптотических сигнальных путей, так и к появлению специфических вторичных мессенджеров - метаболитов ГСЛ, усиливающих либо ослабляющих проведение сигнала. Для понимания механизмов проведения сигнала на апоптоз, индуцированного ганглиозидами, важным является понимание интерференции различных сигнальных путей. Для этой цели использованы ингибиторы, влияющие на синтез или удаление из реакции соединений - метаболитов ГСЛ, которые служат вторичными мессенджерами апоптотического пути. Показано, что GD3- и GQlb-индуцированный апоптоз тимоцитов для проведения сигнала не требует синтеза церамида de novo (Рис. 15, ингибитор фумонизян 2, FB2). В то же время, церамид-зависимые процессы участвуют в апоптотическом пути, индуцированном ганглиозидами а-серии (GM1, GM2, GM3, GDla).

Рис. 15. Влияние ганглиозидов (40 мкг/мл) на развитие апоптоза тимоцитов мышей в присутствии РБМР (25 мкМ), верхний рисунок, либо РВ2 (50 нМ), нижний рисунок Для верхнего рисунка: 1, йМ!; 2, йМ2; 3, С01а; 4, СТ1Ь; 5, вС^Ь. Инкубация 24 ч.

РБМР ингибирует фермент глюкозилцерамид синтазу и, следовательно, обработка клеток этим соединением приводит к инги-бированию в ней синтеза сложных ГСЛ. Нами показано, что сложные

к 1 Ц

о Ч

4,6-

-4,9

"0,6"

GM1 фМ2..(>МЗ GD" a_GD3_GTlb.G_Q1b

L-J -5,6

-572"

-8 J—6f9-

-6,4_

ганглиозиды участвуют в проведении сигнала на апоптоз, индуцированный всеми ганглиозидами, кроме ОМ1.

6. Зависимость трафика ганглнозидов в лимфоцитах от способа их презентации клеткам.

Сравнение ганглнозидов, презентированных тимоцитам мышей в разной форме, выявило, что, за некоторым исключением, ганглиозиды, включенные в состав липосом индуцируют апоптоз клеток более эффективно, в среднем на 70%. Исключение составляют ганглиозиды ОМ2 и ЭМЗ, липосомная форма которых презентации вызывает лишь слабую апоптогенную активность.

Методом конфокальной микроскопии было показано, что добавление ганглиозида вМ1 клеткам в составе липосом существенно усиливает интернализацию ганглиозида. Презентация ганглиозида в форме мицелл приводит к трафику ГСЛ и продуктов его катаболизма по классическим путям (ранние эндосомы, аппарат Гольджи). Для клеток, инкубированных с этим ганглиозидом в течение 30 мин, выявлена колокализация ОМ1 и мембран аппарата Гольджи. В то же время, при I липосомной презентации ганглиозида клеткам ярко выражена колокализация флуоресцентного ганглиозидного зонда и мембран лизосом, т.е. липосомы со встроенным ганглиозидом, видимо, попадают в лизосомы в результате их эндоцитоза.

По изменению уровня апоптоза под действием хлороквина, ингибитора | функционирования лизосом, ганглиозиды разделяются на три группы. Для ( ганглнозидов, входящих в первую, - вМ2, вМЗ или 0(31Ь - при проведении сигнала \ на апоптоз требуются ферменты лизосом лишь при добавлении ганглнозидов в форме | мицелл, а при их презентации в составе липосом эти ферменты не участвуют в | апоптотическом сигнальном пути. Т.е. в первом случае добавление хлороквина блокирует проведение индуцированного ганглиозидами сигнала, а во втором - нет. \ Во второй группе, представленной ганглиозидом 001Ь, наоборот, лишь его | презентация в составе липосом приводит к трафику ГСЛ в лизосомы с образованием I катаболитов, являющихся активными переносчиками сигнала на апоптоз, а в форме | мицелл - не влияет на проведение сигнала. В случае ОВ1а и ОТ1Ь форма презентации ганглиозида не меняла роли ферментов лизосом и, соответственно, роли катаболитов I ГСЛ для проведения сигнала: для первого из упомянутых ганглнозидов хлороквин не |

влияет на развитие апоптотического процесса, а для второго - полностью блокирует сигнал, вне зависимости от способа презентации ганглиозида.

7. Рафты в проведении индуцированного ганглиозидами сигнала на апоптоз

Индукция апоптоза клеток линии СТЬЬ-2 при их обработке ганглиозидами происходит с участием инициирующей каспазы-8. Поскольку РавЬ-индуцируемый апоптотический путь лимфоцитов, инициируемый каспазой-8, происходит с участием рафтов, мы проверили, как зависит от жидко-упорядоченных микродоменов плазматической мембраны активация ганглиозидами запрограммированной смерти 1Ь-2- зависимых клеток; в качестве индуктора был выбран ганглиозид вМ!.

у о

а ю

70 60 -50 -40 -30 20 10 -

15,1

59,6 58,5

38,1

17,7

19,7

к к М,ЗСО с1ех с!ех вМ1 вМ1 МЦСО М0СО

Рис. 17. Влияние М/ЗСЭ (50 мкг/мл, инкубация 4 ч) на развитие апоптоза клеток линии СТЬЬ-2, индуцированного ОМ1 (40 мкг/мл) или дексаметазоном (10"5 М).

Для изучения участия рафтов в проведении сигнала на апоптоз были проведены опыты с разрушением рафтов метил-/3-циклодекстрином (М/ЗСВ). М/ЗСБ не связывается с клеткой и не проникает в мембрану; он извлекает из нее холестерин. Апоптоз клеток регистрировали цитофлуометрически (клетки окрашивали Р1). Клетки обрабатывали ОМ1 или дексаметазоном с добавлением и без добавления М/ЗСО в течение 4 час.

Предынкубация клеток с М/ЗСИ уменьшает долю апоптотических клеток, активированных ганглиозидом вМ1, до уровня, близкого к значениям спонтанного апоптоза, но не влияет на уровень апоптоза клеток, обработанных дексаметазоном (Рис. 17). В проведении сигнала на апоптоз клеток линии СТЬЬ-2, активированных ганглиозидом ОМ1, принимают участие упорядоченные микродомены - рафты.

выводы

1. Впервые детально исследована способность ганглиозидов разного строения подавлять пролиферацию цитотоксических лимфоцитов путем связывания интерлейкинов. Определены константы диссоциации комплексов ганглиозидов ОМ1, СМ2, СМЗ и СЭЗ с интерлейкином-2 и -4. Специфичность формируемого комплекса коррелирует с проявляемым конкретным ганглиозидом типом ингибирования пролиферации 1Ь-2 и 1Ь-4-зависимых лимфоцитов, т.е. с их функциональной активностью. Как для проявления гликолипидами функциональной активности, так и для формирования ими комплекса с молекулами 1Ь-2 и 1Ь-4 требуется наличие сиалильной группировки. Ганглиозиды, несущие дисиалильную группировку, взаимодействуют с 1Ь-2 и 1Ь-4 с наибольшей специфичностью. Результаты работы свидетельствуют о перехвате цитокинов молекулами ганглиозидов, ассоциированных с опухолями; при этом конкурентный тип ингибирования означает конкуренцию между ганглиозидом и рецепторами к интерлейкину-2 или -4 за 1Ь-2 или 1Ь-4.

2. Выявлен сайт связывания ганглиозида ОМ1 в молекуле 11,-4. Ганглиозид взаимодействует с пространственно сближенными фрагментами молекулы 1Ь-4 — аминокислотными остатками 19-25 (С}КТ1_СТЕ) и 103-113 (ANQSTLENFLE). Эти участки молекулы 1Ь-4 формируют конформационный сайт связывания ганглиозидов. Синтетический пептид ТЬСТЕЫУТО1РАА5К (фрагмент молекулы 11,-4, включающий в себя а.о. 19-25) взаимодействует с опухолевым ганглиозидом 003, восстанавливая ингибированную им пролиферацию активированных Т-лимфоцитов.

3. Экзогенные ганглиозиды действуют на лимфоциты двумя способами: как сорбируясь на поверхности клеток, так и встраиваясь в клеточную мембрану. Экзогенный ганглиозид влияет на проведение 1Ь-2-зависимого сигнала в клетку либо экранируя молекулы рецептора, либо встраиваясь в клетку, где попадает в ближайшее липидное окружение (5-субьединицы 1Ь-2Я, тем самым препятствуя сборке молекулы.

сиаловых кислот приводит к уменьшению доли клеток, ушедших в апоптоз. В переносе активированного ганглиозидами сигнала на апоптоз, участвуют рафты.

5. Интенсивность развиваемого апоптоза Т-лимфоцитов, трафик добавленных ганглиозидов, а также участие активных метаболитов в развитии апоптоза клеток зависят от способа презентации ганглиозидов: гапглиозиды, добавленные клеткам в составе липосом, индуцируют апоптоз Т-лимфоцитов более эффективно по сравнению с мицеллами. Они попадают в лизосомы, и их катаболиты участвуют в развитии сигнала на апоптоз. Добавление ганглиозидов в виде мицелл приводит к использованию классических путей трафика ГСЛ и его катаболизма.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Молотковский Ю.Г., Дмитриев П.И., Молотковская И.М., Бергельсон Л.Д. Маневич Е.М. Синтез новых флуоресцентномеченых липидов и изучение их поведения в модельных мембранных мембранах. Биоорган, химия, 1981, Т. 7, N 4, С. 586-571.

2. Molotkovsky Jul.G., Manevich Е.М., Gerasimova E.N., Molotkovskaya I.M., Polessky V.A., Bergelson L.D. Differential study of phosphatidylcholine and sphyngomyelin in human high-density lipoproteins with lipid-specific fluorescent probes. Eur. J. Biochem. 1982, V. 122, N3, P. 573 -580.

3. Молотковская И.М., Гудима Т.О., Ляшенко В.А., Молотковский Юл.Г., Бергельсон Л.Д. Реорганизация липидов мембран лимфоцитов при их активации конканавалином А. Биол. мембраны 1985, Т. 2, N 5, С. 499 - 507.

4. Молотковская И.М., С вирщевская Е.В., Литвинов И.С., Михалев И.И., Дятловицкая Э.В., Молотковский Юл.Г., Бергельсон Л.Д. Исследование иммуносупрессорных свойств гликосфииголипидов. Изучение взаимодействия интерлейкина-2 с ганглиозидами на клетках и в модельных системах. Биол. мембраны 1992, Т. 9, N2, С. 143-151.

5. Молотковская И.М., Зеленова Н.А., Луценко Г.В., Сапожников А.М., Михалев И.И., Молотковский Юл.Г. Исследование иммуносупрессорных свойств гликосфииголипидов. Влияние сывороточных факторов на ингибирование ганглиозидами интерлейкин-4-зависимой пролиферации клеток. Биол. мембраны 1998, Т. 15, N6, С. 623-629.

6. Молотковская И.М., Холоденко Р.В., Зеленова Н.А., Сапожников А.М., Михалев И.И., Молотковский Юл.Г. Ганглиозиды индуцируют апоптоз клеток цитотоксической линии CTLL-2, но не промиелоцитарной лейкемической линии HL-60. Биол. мембраны 1999, Т. 16, N 6, С. 657 - 666.

7. Холоденко Р.В., Сапожников A.M., Михалев И.И., Молотковский Юл.Г., Молотковская И.М. Участие каспаз в апоптозе, индуцированном ганглиозидами, на клетках линии CTLL-2. Биол. мембраны 2002, Т. 19, N 3, С. 209 - 215.

8. Molotkovskaya I.M., Kholodenko R.V., Molotkovsky J.G. Influence of gangliosides on the IL-2- and IL-4-dependent cell proliferation. Neurochem. Res. 2002, V. 27, P. 761 -770.

9. Холоденко И.В., Яшунская Я.Ю., Якухина H.A., Холоденко Р.В., Молотковская И.М. Молекулярные механизмы иммуносупрессии Т- лимфоцитов, вызываемой опухолевыми ганглиозидами GM3 и GD3. Иммунология 2004, Т. 25, N 3, С. 132 - 135.

10. Коваленко Е.И., Хирова Е.В., Молотковская И.М., Овчинникова Т.Н., Саблина М.А., Сапожников A.M., Хайдуков С.В., Бовин Н.В. Модификация поверхности клеток с помощью липофильных гликоконъюгатов и взаимодействие модифицированных клеток с натуральными клетками. Биоорган, химия 2004, Т. 30, N 3, С. 281 -292.

11. Холоденко И.В., Водовозова Е.Л., Молотковский Юл.Г., Холоденко Р.В., Василенко Р.Н., Михалев И.И., Молотковская И.М. Взаимодействие различных субъединиц рецептора интерлейкинов-2 и -4 с ганглиозидом GM1 в активированных Т-лимфоцитах. Биол. мембраны 2006, Т. 23, N 1, С. 27 - 33.

12. Холоденко Р.В., Холоденко И.В., Вискова Н.Ю., Луцан Н.И., Молотковская И.М. Участие каспаз в деполяризации мембран митохондрий тимоцитов при индукции апоптоза ганглиозидами. Биол. мембраны 2007, Т. 24, N 2, С. 142 - 149.

13. Kovalenko E.I., Abakushina Е., Telford W., Kapoor V., Korchagina E., Khaidukov S., Molotkovskaya I., Sapozhnikov A., Vlaskin P., Bovin N. Clustered carbohydrates as a target for natural killer cells: a model system. Histochem. Cell. Biol. 2007, V. 127, N 3, P. 313 -326.

14. Холоденко И.В., Холоденко P.B., Водовозова Е.Л., Олейников В.А., Поляков Н.Б., Молотковская И.М., Петров Р.В. Участки молекулы интерлейкин-4, связывающиеся с ганглиозидом GM1: изучение методом фотоаффинной пришивки. ДАН 2008, Т. 418, N 4, С. 557 - 561.

15. Akimov S.A., Hlaponin Е.А., Bashkirov P.V., Boldyrev I.A., Mikhalyov 1.1., Telford W.G., Molotkovskaya I.M. Ganglioside GMl increases line tension at raft boundary in model membranes. Биол. мембраны 2009, Т. 26, N 3, С. 80 - 85.

16. Молотковская И.М. Липиды клеточной мембраны в активации лимфоцитов. Глава 2 в кн. Ляшенко В.А., Дрожешшков В.А., Молотковская И.М. Механизмы активации иммунокомпетептных клеток. Москва, Медицина, 1988, С. 78 - 126.

17. Ляшенко В.А., Молотковская И.М. Липиды клеточных мембран лимфоцитов и их перестройка в процессе иммунологической активации. В: Итоги науки и техники, серия «Иммунология», Т. 22, ВИНИТИ, Москва, 1988, С. 22 - 42.

18. Водовозова Е.Л., Холоденко И.В., Холоденко Р.В., Поляков Н.Б., Олейников В.А., Молотковская И.М. Метод фотоаффинного мечения. Глава 7. В кн.: Руководство к

практическим занятиям по нормальной физиологии, под ред. А.Г. Камкина И.С. Киселевой И.С.: Геотар-Медиа, 2011, С. 206 -239,

19. Молотковская И.М., Ляшенко В.А. Перераспределение липидов мембран лимфоцитов при активации клеток конканавалином А. Материалы III Советско-швейцарского симпозиума «Биологические мембраны. Структура и функции», Ташкент, 1983, С. 159.

20. Молотковская И.М., Свирщевская Е.В., Литвинов И.С., Михалев И.И., Дятловицкая Э.В., Молотковский Юл.Г., Бергельсон Л.Д. Исследование иммуносупрессорных свойств гликосфинголипидов. Изучение взаимодействия интерлейкина-2 с ганглиозидами на клетках и в модельных системах. Материалы I съезда иммунологов России. 23-25 июня 1992. Новосибирск, 1992, С. 309.

21. Svirschevskaya E.V., Molotkovskaya I.M., Chelkin A, Sapozhnikov А.М. Serum IL-2 inhibitor binds IL-2 molecule. 8th International Congress of Immunology, Budapest, Hungary, August 23-28, 1992, P. 232.

22. Molotkovskaya I.M., Svirschevskaya E.V., Mikhalyov I.I. Disialyl residue in ganglioside structure increases specificity of glycosphingolipids to IL-2. 8-th International Congress of Immunology, Budapest, Hungary, August 23-28, 1992, P. 502.

23. Molotkovskaya I.M., Lutsenko G.V., Zelenova N.A. Immunosupressive activity of glycosphingolipids. Influence of serum factors on ganglioside inhibition of IL-4-dependent cell proliferation. 10th International Congress of Immunology. New Delhi, 1-6 November, 1998. The Immunologist 1998. N SI, P. 521.

24. Левизарович C.A., Луценко Г.В., Зеленова H.A., Молотковская И.М. Исследование иммуносупрессорных свойств гликосфинголипидов. Изучение взаимодействия интерлейкина-4 с ганглиозидами на клетках и в модельных липидных системах. Материалы 2 Национального Конгресса Российской Ассоциации Аллергологов и Клинических Иммунологов «Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармакологии». Москва, 1998, С. 390.

25. Асташкин Е.И., Молотковская И.М., Беспалова Ю.Б., Грачев С.В., Твердислов В.А. Влияние сфингозина на [Ca2+]i в клетках крови человека. Материалы II съезда биофизиков России, 23-27 августа 1999, Т. I, С. 479-450.

26. Молотковская И.М., Холоденко Р.В., Зеленова Н.А., Михалев И.И., Молотковский Юл.Г. Ганглиозиды - индукторы апоптоза CDs-позитивных лимфоцитов. Материалы V чтений, посвященных памяти акад. Ю.А. Овчинникова «Биоорганика-2000». 13-20 ноября. Тезисы докладов, Москва, 2000, С. 42.

27. Холоденко Р.В., Беспалова Ю.Б., Асташкин Е.И., Молотковская И.М. Участие апоптоза, индуцированного ганглиозидами, и путей проведения сигнала на апоптоз в клетках линии CTLL-2 и других лимфоцитах. Сборник трудов 4 конгресса Российской Ассоциации Аллергологов и Клинических Иммунологов (РААКИ) «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии». Тезисы докладов, 2001, Т. 2, С. 234.

28. Холоденко Р.В., Михалев И.И., Молотковский Юл.Г., Сапожников A.M., Молотковская И.М. Различия между молекулярными механизмами проведения сигнала, индуцируемого опухолевым ганглиозидом GM2 и ганглиозидами -нормальными компонентами клеточных мембран. Материалы V Всероссийского научного Форума с международным участием имени акад. В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», Мед. иммунология, 2001, Т. 3, №2, С. 133 - 134.

29. Холоденко Р.В., Зеленова H.A., Молотковская И.М. Молекулярные механизмы проведения индуцированного ганглиозидами сигнала на апоптоз в клетках линии CTLL-2. Материалы XIII зимней международной молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Тезисы докладов, Москва, 7-9 февраля 2001, С. 92.

30. Molotkovskaya I.M., Kholodenko R.V., Zelenova N.A., Sapozhnikov A.M., Molotkovsky Jul.G. Gangliosides induce apoptosis of cytotoxic cells but not the promyelocyte HL-60 cells. 11-th International Congress of Immunology, Stockholm, Sweden. 22-27 July. Scandinavian J. Immunol., 2001, V. 54, N 1, P. 378.

31. Холоденко P.B., Молотковская И.М. Участие каспаз в апоптозе, индуцированном ганглиозидами, на клетках линии CTLL-2. Материалы XIV зимней международной молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Тезисы докладов, Москва, 12-15 февраля 2002, С. 106.

32. Молотковская И., Холоденко Р., Якухина Н., Холоденко И. Механизмы иммуносупрессии, вызываемой ганглиозидами - маркерами опухолевого процесса. Материалы VII Всероссийского научного Форума с международным участием имени акад. В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» 23-26 июня 2003. Мед. иммунология, 2003, Т. 5, №3-4, С. 208.

33. Холоденко И.В., Водовозова E.JI., Холоденко Р.В., Молотковская И.М. Взаимодействие ганглиозида GM 1 с субъединицами рецептора IL-2. Материалы VII чтений, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова. Москва, 4-7 октября

2004, С. 50-51.

34. Kholodenko I.V., Vodovozova E.L., Kholodenko R.V., Molotkovskaya I.M. Interaction of ganglioside GM1 with IL-2 receptor subunits. Frontiers of Cellular Microbiology and Cell Biology. San Feliu de Guixols, Spain, 16-21 October 2004.

35. Романова H.A, Холоденко И.В, Молотковская И.М. Исследование ганглиозид-связывающей активности пептидов - фрагментов интерлейкина-4. Материалы XVII зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Тезисы докладов, Москва, 7-10 февраля

2005, С. 78.

36. Яшунская Я.Ю., Холоденко Р.В., Молотковская И.М. Изучение механизмов апоптоза, индуцированного ганглиозидами, в различных популяциях Т-лимфоцитов крови человека. Материалы XVII зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии».

Тезисы докладов, Москва, 7-10 февраля 2005, С. 83.

37. Vodovozova Е., Molotkovskaya I., Molotkovsky J. Photoaffme glycolipid analogues' bearing diazocyclopentadien-2-ylcarbonyl group, and their application in biological application in biological studies. XVIII International Symposium on Glycoconjugates. Florence, Italy, September 4th-9th, 2005. Glycoconj. J., 2005, V. 22, N 4-6, P. 178.

38. Molotkovskaya I., Oleynikov V., Kholodenko I., Vodovozova E. Ganglioside binding sites in interIeukin-4 molecule: a photoaffinity study. XVIII International Symposium on Glycoconjugates. Florence, Italy, September 4th-9th, 2005. Glycoconj. J, 2005, V. 22, N 4-6, P. 582-583.

39. Романова H.A, Биктимирова C.3., Молотковская И.М. Влияние экзогенного ганглиозида GM1 на реорганизацию рафтов в модельных мембранных системах и проведение сигнала на апоптоз. Материалы XVIII зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Тезисы докладов, Москва, 7-11 февраля, 2006, С. 68.

40. Kovalenko E.I., Abakushina E.V., Kapoor V., Korchagina E.Yu., Khaidukov S.V., Molotkovskaya I.M., Sapozhnikov A.M., Vlaskin P.A., Bovin N.V., Telford W.G. Clustered carbohydrates as a target for natural killer cells: A model system. "ISAC XXIII International Congress", Quebec, May 20-26, 2006, P. 197.

41. Pavlov K., Akimov S., Bashkirov P., Boldyrev I., Tellford W., Molotkovskaya I. Influence of ganglioside GM1 on formation and properties of rafts in lipid membranes. 53st Annual Meeting of Biophysical Society of USA, February 28 - March 4, 2009, Boston, Massachusetts, USA, Biophys. J., 2009, V. 96, N 3, P. 448.

42. Kholodenko R., Vodovozova E., Kholodenko I., Molotkovskaya I. Interaction of exogenous gangliosides with IL-2R subunits. 2nd European congress of immunology. September 13-16, 2009. Berlin, Germany. Eur. J. Immunol., 2009, V. 39, N SI, P. SI 19.

43. Холоденко P.B., Водовозова E.JI., Холоденко И.В., Молотковская И.М.. Взаимодействие экзогенных ганглиозидов с различными субъедииицами IL-2 рецептора. Материалы международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова, 28 сентября - 1 октября. Тезисы докладов, Москва, 2009, С. 254-255.

Подписано в печать 17.02. и Формат 60X84/16 Бумага офисная «Бу^оСору». Тираж 100 экз. Заказ №186 Отпечатано на УМТ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Молотковская, Ирина Михайловна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Структура ганглиозидов

2. Биосинтез ганглиозидов

3. Функциональное значение липидных микродоменов

4. Влияние ганглиозидов на функционирование мембранных 30 белков

5. Ганглиозиды при опухолевой трансформации

6. Ганглиозиды и апоптоз

7. Ганглиозиды и их метаболиты в противоопухолевой терапии

8. Ганглиозиды как рецепторы вирусных и бактериальных 69 токсинов

9. Подходы к изучению структурно-биологических и лиганд-рецепторных взаимодействий. Фотоаффинное мечение

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Конкурентный тип ингибирования IL-2 и IL-4-зависимой пролиферации Т-лимфоцитов, вызываемого ганглиозидами

• Определение параметров ингибирования пролиферации клеток линии CTLL-2 и CT.4R под действием ганглиозидов

• Характеристика комплексов ганглиозидов с интерлейкиноми интерлейкином

• Влияние синтетических пептидов IL-4 на ингибирование индуцированной ганглиозидом GD3 пролиферации 116 лимфоцитов

• Определение фрагментов молекулы IL-4, участвующих во взаимодействии с ганглиозидом, методом фотореактивной пришивки

• Обсуждение результатов

2. Взаимодействие ганглиозида GM1 с IL-2- и IL-4-рецептором в 141 клетках линии CTLL

• Влияние ганглиозидов на уровень экспрессии субъединиц

IL-2- и IL-4-рецепторов

• Фотореактивная пришивка: локализация ганглиозида GM1 и субъединиц рецепторов IL-2 и IL

• Обсуждение результатов

3. Неконкурентный тип ганглиозид-индуцированного 155 ингибирования пролиферации Т-лимфоцитов

• Механизмы ганглиозид-индуцированного апоптоза клеток 155 линии CTLL-2. Зависимость апоптотического пути от способа презентации ганглиозидов

• Сравнение способности индивидуальных ганглиозидов 161 индуцировать апоптоз различных субпопуляций Т-лимфоцитов человека

• Участие каспаз в проведении индуцированного ганглиозидами 163 сигнала на апоптоз

• Каспазы и митохондрии

• Участиерафтов в проведении индуцированного 182 ганглиозидами сигнала на апоптоз

• Участие метаболитов гликосфинголипидов в проведении 184 ганглиозид-индуцированного сигнала на апоптоз

• Влияние способа презентации ганглиозидов на проведение 188 сигнала на апаптоз

• Зависимость трафика ганглиозидов в лимфоцитах 195 от способа их презентации клеткам.

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы ганглиозид-индуцированной иммуносупрессии Т-лимфоцитов"

Изучение молекулярных механизмов пролиферации, дифференцировки и гибели клеток иммунной системы является одной из важнейших проблем современной иммунологии, клеточной физиологии и биохимии. Одним из важнейших участников этих процессов являются ганглиозиды, меняющие свою функцию при развитии таких патологических процессов, как, например, опухолевый.

Ганглиозиды, сиалированные гликосфинголипиды (ГСЛ), являются активными участниками функционирования клеток. Пролиферация, дифференцировка клеток, межклеточный контакт, адгезия, лиганд-рецепторное взаимодействие - это далеко не полный перечень процессов, в которых ганглиозиды принимают активное участие (Degroote 8, 2004). Биосинтез и мембранный состав ганглиозидов, их доменная локализация и контакт с рецепторными белками специфичны для клеток разного типа и на разных стадиях созревания. Роль ганглиозидов в созревании и функционировании клеток иммунной системы особенно важна, что ярко выявляется появлением ганглиозидов в близком липидном окружении таких рецепторов, как СОЗ, СБ4, С095 и ряда других на определенной стадии созревания Т- и В-лимфоцитов.

Развитие опухолевого процесса приводит к резкому изменению биосинтеза и катаболизма ГСЛ. Меняется уровень экспрессии ряда генов, кодирующих ферменты, важные для их биосинтеза, в результате чего меняется соотношение между ганглиозидами, экспрессированными на поверхности опухолевых клеток, появляются новые ганглиозиды, отсутствовавшие ранее. Так, клиническими маркерами ряда опухолей служат ганглиозиды вМ2 и ОБ2. Такие изменения приводят к изменению адгезионных способностей опухолевых клеток, к стимуляции г васкуляризации солидных опухолей, влияют на их способность к метастазированию. Эти изменения приводят также к устойчивости опухолевых клеток к сигналам на апоптоз. Ганглиозиды способны супрессировать цитотоксичность NK-клеток, тем самым ослабляя противоопухолевый иммунитет, подавлять пролиферацию Т-лимфоцитов (Grayson G., Ladisch S., 1998).

Известен феномен сброса («шеддинга») ганглиозидов опухолевыми клетками. Сброшенные ганглиозиды обнаружены в плазме крови опухолевых больных в виде мицелл и липосом (Ladisch S., 1998), причем концентрация ганглиозидов достигает 10-100 мкМ, т.е. превышает норму на 2-3 порядка. Ганглиозиды участвуют в подавлении иммунного ответа на клетки опухоли; в частности, смесь экзогенно добавленных ганглиозидов подавляет пролиферацию IL-2-зависимых клеток, являющихся моделью активированных цитотоксических Т-лимфоцитов. Поскольку супрессированная ганглиозидами пролиферация Т-лимфоцитов частично восстанавливается rIL-2, было предположено, что супрессия частично происходит за счет образования комплексов ганглиозида с интерлейкином-2. Т.е. происходит перехват ганглиозидом цитокина, за который ганглиозид конкурирует с рецептором интерлейкина-2 (IL-2R). Для борьбы с иммуносупрессией этого типа в настоящее время используют rIL-2. Однако такая цитокинотерапия обладает ярко выраженными побочными действиями. К ним относятся интоксикация, лихорадка и др. Причиной ряда из них является нарушение процессинга молекулы, обычно получаемой в прокариотической клетке. Кроме того, внутривенное введение терапевтического средства приводит к его мощному протеолизу, поэтому эффективными оказываются лишь высокие (токсичные) дозы интерлейкина, вызывающие у больных тяжелые осложнения. В то же время, супердозы цитокина, имеющего рецепторы на клетках самого разного типа, активируют их на пролиферацию и дифференцировку, тем самым усугубляя состояние больного (Davis C.B., 2003).

Связывание ганглиозида происходит со специфическим участком молекулы интерлейкина. Определение локализации и первичной

10 последовательности ганглиозид-связывающих фрагментов цитокина позволит создать новые препараты пептидной природы, эффективно перехватывающие сброшенные ганглиозиды, но лишенные побочных активностей IL-2 или IL-4. Ранее для решения аналогичных задач применяли фотоаффинное мечение. Так, в работе (Shapiro R.E., 1997) с помощью фотоаффинномеченого ганглиозида GTlb был установлен сайт связывания ганглиозидов в молекуле токсина столбняка.

Неконкурентный тип ингибирования может включать в себя в том числе и индукцию в клетках апоптоза. Если ганглиозиды способны облегчать вступление иммунокомпетентных клеток в апоптоз или сами являются индукторами программируемой клеточной смерти, это может привести к развитию/усилению иммунодепрессии или к появлению более специфического иммунодефицита в случае элиминирования лишь части клеток Т-клеточного репертуара.

В последнее время особое внимание уделяется функциям ГСЛ и их метаболитов как вторичных мессенджеров в клетках (Ohanian, J. et al„ 2001). Известна роль таких метаболитов, как церамид (Сег) в проведении сигнала на апоптоз в клетке (Venkataraman К. et al. 2000). Известно кроме того, что Сег образуется при катаболизме ганглиозидов в клетке. Появились также отдельные публикации об участии ганглиозидов в развитии апоптоза, причем особое внимание уделяется GD3, индуцирующему апоптоз клеток по митохондриальному пути (De Maria, R. et al., 1997, 1998). При активации клеток FasL концентрация GD3 в клетках возрастает. Особое значение в проведении сигнала на апоптоз уделяется митохондриям (Desagher, S. et al., 2000; Joza, N. et al. 2001); вторичные мессенджеры, действующие на эти органеллы, приводят к образованию транзиторных пор и высвобождению таких факторов, как Bcl-2, AIF, цитохром с. Показано, что одним из таких вторичных мессенджеров является GD3 (Rippo, M.R. et al., 2000; Garsia-Ruiz, С. et al, 2000). Тем самым происходит перекрест путей проведения сигнала на апоптоз и метаболизма ганглиозидов.

В настоящее время не выявлены закономерности между способностью ганглиозидов индуцировать апоптоз клеток и структурой молекул; не изучено пересечение специфических биохимических путей ГСЛ, связанных с их метаболизмом в клетках, и традиционных путей, проводящих апоптоз, например, при действии СБ95 или ТШчх.

Цель исследования. Цель настоящей работы - характеристика механизмов конкурентного и неконкурентного типов ингибирования пролиферации активированных цитотоксических лимфоцитов, определение зависимости между структурой ганглиозидов и механизмом их действия, супрессирующего пролиферацию Т-лимфоцитов. Важной частью работы является также анализ перестроек клеточной мембраны, происходящих при встраивании ганглиозидов и приводящих к модуляции проведения сигнала.

Другая важная задача исследования — определение первичной последовательности фрагментов молекулы интерлейкина-4, взаимодействующих с ганглиозидами, характеристика способности пептидов-фрагментов молекулы интерлейкина связывать ганглиозиды, а также анализ структуры сайта связывания ганглиозидов в молекуле 1Ь-4.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Гликосфинголипиды (ГСЛ) - универсальные составляющие мембран эукариотических клеток, они участвуют в процессах клеточного узнавания, рецепции вирусов, во взаимодействиях типа лиганд - рецептор, в клеточной адгезии и контроле клеточного роста (Degroote, Wolthoorn, and Meer, 2004; Lopez and Schnaar, 2009; Tettamanti, 2004). Они супрессируют цитотоксичность NK-клеток, тем самым, ослабляя противоопухолевый иммунитет (Bergelson et al., 1989), участвуют в запуске апоптоза (Bektas and Spiegel, 2003). Роль гликосфинголипидов в развитии организма ярко проявляется в исследованиях на нокаутных мышах. Так, нокаут по ферменту, ответственному за синтез глюкозилцерамида (GlcCer), приводящий к появлению мышей без ганглиозидов, синтезируемых на основе глюкозилцерамида, погибают на этапе эмбриогенеза (Yamashita et al., 1999). Для жизнедеятельности клетки важно также поддержание баланса между синтезом и деградацией ГСЛ; при недостаточной деградации этих липидов развивается ряд серьезных патологических процессов (Futerman and van Meer, 2004). Специфические изменения в составе и метаболизме гликосфинголипидов происходят во время клеточной пролиферации (Hakomori, 1970; Robbins and Macpherson, 1971), при смене фаз клеточного цикла (Yamashita et al., 1999), при развитии мозга в эмбриогенезе (Abad-Rodriguez and Robotti, 2007; Yu et al., 2004), в процессе созревания и дифференцировки клеток (Fishman et al., 1974; Xia et al., 1989), а также при злокачественной трансформации различных типов клеток (Cheresh et al., 1984b). Можно предположить, что состав и соотношение тех или иных внутриклеточных ганглиозидов определяют морфологию и функционирование клеток.

Заключение Диссертация по теме "Иммунология", Молотковская, Ирина Михайловна

выводы

1. Впервые детально исследована способность ганглиозидов разного строения подавлять пролиферацию цитотоксических лимфоцитов путем связывания интерлейкинов. Определены константы диссоциации комплексов ганглиозидов ОМ1, ОМ2, вМЗ и вОЗ с интерлейкином-2 и -4. Специфичность формируемого комплекса коррелирует с проявляемым конкретным ганглиозидом типом ингибирования пролиферации 1Ь-2 и ГБ-4-зависимых лимфоцитов, т.е. с их функциональной активностью. Как для проявления гликолипидами функциональной активности, так и для формирования ими комплекса с молекулами 1Ь-2 и 1Ь-4 требуется наличие сиалильной группировки. Ганглиозиды, несущие дисиалильную группировку, взаимодействуют с ГЬ-2 и 1Ь-4 с наибольшей специфичностью. Результаты работы свидетельствуют о перехвате цитокинов молекулами ганглиозидов, ассоциированных с опухолями; при этом конкурентный тип ингибирования означает конкуренцию между ганглиозидом и рецепторами к интерлейкину-2 или -4 за 1Ь-2 или П.-4.

2. Выявлен сайт связывания ганглиозида ОМ1 в молекуле 1Ь-4. Ганглиозид взаимодействует с пространственно сближенными фрагментами молекулы 1Ъ-4 — аминокислотными остатками 19-25 (С>КТЬСТЕ) и 103113 (АМРЗТЬЕКГЬЕ). Эти участки молекулы 1Ь-4 формируют конформационный сайт связывания ганглиозидов. Синтетический пептид ТЬСТЕЬТУТОГРААЗК (фрагмент молекулы 1Ь-4, включающий в себя а.о. 19-25) взаимодействует с опухолевым ганглиозидом ОБЗ, восстанавливая ингибированную им пролиферацию активированных Т-лимфоцитов.

207 сигнала в клетку либо экранируя молекулы рецептора, либо встраиваясь в клетку, где попадает в ближайшее липидное окружение р-субъединицы 1Ь-211, тем самым препятствуя сборке молекулы.

4. Формирование опухоли приводит к супрессии периферических Т-лимфоцитов. Экзогенные ганглиозиды индуцируют апоптоз активированных цитотоксических Т-лимфоцитов каспазозависимым способом. Эффективность развиваемого процесса зависит от структуры добавленных ганглиозидов: увеличение числа остатков сиаловых кислот приводит к уменьшению доли клеток, ушедших в апоптоз. В переносе активированного ганглиозидами сигнала на апоптоз, участвуют рафты.

5. Интенсивность развиваемого апоптоза Т-лимфоцитов, трафик добавленных ганглиозидов, а также участие активных метаболитов в развитии апоптоза клеток зависят от способа презентации ганглиозидов: ганглиозиды, добавленные клеткам в составе липосом, индуцируют апоптоз Т-лимфоцитов более эффективно по сравнению с мицеллами. Они попадают в лизосомы, и их катаболиты участвуют в развитии сигнала на апоптоз. Добавление ганглиозидов в виде мицелл приводит к использованию классических путей трафика ГСЛ и его катаболизма.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Молотковская, Ирина Михайловна, Москва

1. Abad-Rodriguez, J., and Robotti, A. (2007). Regulation of axonal development by plasma membrane gangliosides. J. Neurochem. 103(Supl. 1), 47-55.

2. Ahmed, N. N., Grimes, H. L., Bellacosa, A., Chan, T. O., and Tsichlis, P. N. (1997). Transduction of interleukin-2 antiapoptotic and proliferative signals via Akt protein kinase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(8), 3627-3632.

3. Alderson, N. L., Maldonado, E. N., Kern, M. J., Bhat, N. R., and Hama, H. (2006). FA2H-dependent fatty acid 2-hydroxylation in postnatal mouse brain. J. Lipid Res. 47, 2772-2780.

4. Algericas-Shimnich, A., Shen, L., Barnhart, B. C., Murmann, A. E., Burkhardt, J. K., and Peter, M. E. (2002). Molecular Ordering of the Initial Signaling Events of CD95. Mol. Cell. Biol 22(1), 207-220.

5. Baeuerle, P. A., and Baichwal, V. R. (1997). NF-kappa B as a frequent target for immunosuppressive and anti-inflammatory molecules. Adv. Immunol. 65, 111-137.

6. Baldwin, A. S., Jr. (1996). The NF-kappa B and I kappa B proteins: new discoveries and insights. Annu. Rev. Immunol. 14, 649-683.

7. Bektas, M., Jolly, P. S., Muller, C., Eberle, J., Spiegel, S., and Geilen, C. C. (2005). Sphingosine kinase activity counteracts ceramide-mediated cell death in human melanoma cells: role of Bcl-2 expression. Oncogene 24(1), 178-187.

8. Bektas, M., and Spiegel, S. (2003). Glycosphingolipids and cell death. Glycoconj. J. 20(1), 39-47.

9. Bergelson, L. D., Dyatlovitskaya, E. V., Torkhovskaya, T. I., Sorokina, I. B., and Gorkova, N. P. (1968). Dedifferentiation of phospholipid composition in subcellular particles of cancer cells. FEBS Lett. 2(2), 87-90.

10. Bharti, A. C., and Singh, S. M. (2000). Induction of apoptosis in bone marrow cells by gangliosides produced by a T cell lymphoma. Immunol Lett. 72(1), 39-48.

11. Bharti, A. C., and Singh, S. M. (2001). Gangliosides derived from a T cell lymphoma inhibit bone marrow cell proliferation and differentiation. Int. Immunopharmacol. 1 (1), 155—165.

12. Bieberich, E. (2004). Integration of glycosphingolipid metabolism and cell-fate decisions in cancer and stem cells: Review and Hypothesis. Glycoconj. J. 21(6), 315-327.

13. Birkle, S., Zeng, G., Gao, L., Yu, R. K., and Aubry, J. (2003). Role of tumor-associated gangliosides in cancer progression. Biochimie 85, 455-463.

14. Bitton, R. J., Guthmann, M. D., Gabri, M. R., Carnero, A. J. L., Alonso, D. F., Fainboim, L., and Gomez, D. E. (2002). Cancer vaccines: an update with special focus on ganglioside antigens. Oncol. Rep. 9(2), 267-276.

15. Bleicher, R. J., and Cabot, M. C. (2002). Glucosylceramide synthase and apoptosis. Biochim. Biophys. Acta 1585(2-3), 172-8.

16. Bonizzi, G., and Karin, M. (2004). The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity. Trends Immunol/ 25(6), 280288. .

17. Borden, W. T., Gritsan, N. P., Hadad, C. M., Karney, W. L., Kemnitz, C. R., and Platz, M. S. (2000). The interplay of theory and experiment in the study of phenylnitrene. Acc. Chem. Res. 33(11), 765-771.

18. Bose, R., Verheij, M., Haimovitz-Friedman, A., Scotto, K., Fuks, Z., and Kolesnick, R. (1995). Ceramide synthase mediates daunorubicin-induced apoptosis: an alternative mechanism for generating death signals. Cell 82(3), 405-414.

19. Bremer, E. G., Hakomori, S., Bowen-Pope, D. F., Raines, E., and Ross, R. (1984). Ganglioside-mediated modulation of cell growth, growth factor binding, and receptor phosphorylation. J. Biol Chem. 259(11), 6818-6825.

20. Bremer, E. G., Schlessinger, J., and Hakomori, S. (1986). Ganglioside-mediated modulation of cell growth. Specific effects of GM3 on tyrosine phosphorylation of the epidermal growth factor receptor. J. Biol. Chem. 261(5), 2434-2440.

21. Bromley, S. K., Burack, W. R., Johnson, K. G., Somersalo, K., Sims, T. N., Sumen, C., Davis, M. M., Shaw, A. S., Allen, P. M., and Dustin, M. L. (2001). The immunological synapse. Annn. Rev. Immunol. 19, 375-396.

22. Brown, D. A., and London, E. (1998). Functions of lipid rafts in biological membranes. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14, 111-136.

23. Brown, D. A., and London, E. (2000). Structure and function of sphingolipid-and cholesterol-rich membrane rafts. J. Biol. Chem. 275(23), 17221-17224.

24. Brunette, D. M., and Till, J. E. (1971). A rapid method for the isolation of L-cell surface membranes using an aqueous two phase polymer system. J. Membr. Biol. 5(2), 215-224.

25. Brunner, J. (1981). Labelling the hydrophobic core of membranes. Trends Biochem. Sci. 6,44-46.

26. Brunner, J. (1989). Photochemical labeling of apolar phase of membranes. Meth. Enzymol. 172, 628-687.

27. Brunner, J. (1993). New photolabeling and crosslinking methods. Annu. Rev. Biochem. 62, 483-514.

28. Burchill, M. A., Yang, J., Vang, K. B., and Farrar, M. A. (2007). Interleukin-2 receptor signaling in regulatory T cell development and homeostasis. Immunol. Lett. 114, 1—8.

29. Carubia, J. M., Yu, R. K., Macala, L. J., Kirkwood, J. M., and Varga, J. M. (1984). Gangliosides of normal and neoplastic human melanocytes. Biochem. Biophys. Res. Com. 120(2), 500-504.

30. Chalfant, C. E., and Spiegel, S. (2005). Sphingosine 1-phosphate and ceramide 1-phosphate: expanding roles in cell signaling. J. Cell. Sci. 118(Pt 20), 4605-46012.

31. Chan, K. F. (1988). Ganglioside-modulated protein phosphorylation. Partial purification and characterization of a ganglioside-inhibited protein kinase in brain. J. Biol. Chem. 263(1), 568-574.

32. Chang, F., Li, R., Noon, K., Gage, D., and Ladisch, S. (1997). Human medulloblastoma gangliosides. Glycobiology 7(4), 523-530.

33. Chang, H. R., Cordon-Cardo, C., Houghton, A. N., Cheung, N. K., and Brennan, M. F. (1992). Expression of disialogangliosides GD2 and GD3 on human soft tissue sarcomas. Cancer (Phila.) 70, 633-638.

34. Chapman, P. B. (2003). Vaccinating against GD3 ganglioside using BEC2 antiidiotype monoclonal antibody. Curr. Opin. Invest. Drugs 4, 710-715.

35. Chapman, P. B. (2007). Melanoma vaccines. Semin. Oncol. 34(6), 516-523.

36. Cheng, P. C., Brown, B. K., Song, W., and Pierce, S. K. (2001). Translocation of the B cell antigen receptor into lipid rafts reveals a novel step in signaling. J. Immunol. 166(6), 3693-3701.

37. Cheresh, D. A., Harper, J. R., Schulz, G., and Reisfeld, R. A. (1984a). Localization of the gangliosides GD2 and GD3 in adhesion plaques and on the surface of human melanoma cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81(8), 5767-5771.

38. Cheresh, D. A., Varki, A. P., Varki, N. M., Stallcup, W. B., Levine, J., and Reisfeld, R. A. (1984b). A monoclonal antibody recognizes an O-acylated sialic acid in a human melanoma-associated ganglioside. J. Biol. Chem. 259(12), 7453-7459.

39. Cherukuri, A., Carter, R. H., Brooks, S., Bornmann, W., Finn, R., Dowd, C. S., and Pierce, S. K. (2004). B cell signaling is regulated by induced palmitoylation of CD81. J. Biol Chem. 279(30), 31973-31982.

40. Cheung, N. K., Saarinen, U. M., Neely, J. E., Landmeier, B., Donovan, D., and Coccia, P. F. (1985). Monoclonal antibodies to a glycolipid antigen on human neuroblastoma cells. Cancer Res. 45(6), 2642-2649.

41. Chu, J. W., and Sharom, F. J. (1990). Interleukin-2 binds to gangliosides in micelles and lipid bilayers. Biochim. Biophys. Acta. 1028(3), 205-214.

42. Chung, J. B., Baumeister, M. A., and Monroe, J. G. (2001). Differential sequestration of plasma membrane-associated B-cell antigen receptor in mature and immature B cells into glycosphingolipid-enriched domains. J. Immunol. 166, 736-740.

43. Colell, A., Fernandez, A., and Fernandez-Checa, J. C. (2009). Mitochondria, cholesterol and amyloid beta peptide: a dangerous trio in Alzheimer disease. J. Bioenerg. Biomembr. 41(5), 417-423.

44. Colell, A., Garcia-Ruiz, C., Roman, J., Ballesta, A., and Fernandez-Checa, J. C. (2001). Ganglioside GD3 enhances apoptosis by suppressing the nuclearfactor-kappa B-dependent survival pathway. FASEB J. 15(6), 1068-1070.

45. Conzelmann, E., Burg, J., Stephan, G., and Sandhoff, G. (1982). Complexing of glycolipids and their transfer between membranes by the activator proteinfor degradation of lysosomal ganglioside GM2. Eur. J. Biochem. 123(2), 455464.

46. Correa, M. R., Ochoa, A. C., Ghosh, P., Mizoguchi, H., Harvey, L., and Longo, D. L. (1997). Sequential development of structural and functional alterations in T cells from tumor-bearing mice. J. Immunol. 158(11), 52925296.

47. Cuvillier, O. (2002). Sphingosine in apoptosis signaling. Biochim. Biophys. Acta 1585(2-3), 153-162.

48. Cuvillier, O., Pirianov, G., Kleuser, B., Vanek, P. G., Coso, O. A., Gutkind, J. S., and Spiegel, S. (1996). Suppression of ceramide-mediated programmed cell death by sphingosine-1-phosphate. Nature 381(6585), 800-803.

49. De Maria, R., Lenti, L., Malisan, F., dAgostino, F., Tomassini, B., Zeuner, A., Rippo, M. R., and Testi, R. (1997). Requirement for GD3 ganglioside in CD95- and ceramide-induced apoptosis. Science 277(5332), 1652-1655.

50. De Maria, R., Rippo, M. R., Schuchman, E. H., and Testi, R. (1998). Acidic sphingomyelinase (ASM) is necessary for fas-induced GD3 ganglioside accumulation and efficient apoptosis of lymphoid cells.«/. Exp. Med. 187(6), 897-902.

51. De Rosa, M. F., Sillence, D., Ackerley, C., and Lingwood, C. (2004). Role of multiple drug resistance protein 1 in neutral but not acidic glycosphingolipid biosynthesis. J. Biol Chem. 279(9), 7867-7876.

52. Degroote, S., Wolthoorn, J., and Meer, G. (2004). The cell biology of glycosphingolipids. Semin. Cell & Develop. Biol. 15, 375-387.

53. Dejean, L. M., Martinez-Caballero, S., Manon, S., and Kinnally, K. W. (2006). Regulation of the mitochondrial apoptosis-induced channel, MAC, by BCL-2 family proteins. Biochim. Biophys. Acta 1762(2), 191-201.

54. Deng, W., Li, R., Guerrera, M., Liu, Y., and Ladisch, S. (2002). Transfection of glucosylceramide synthase antisense inhibits mouse melanoma formation. Glycobiology 12(3), 145-152.

55. Deng, W., Li, R., and Ladisch, S. (2000). Influence of cellular ganglioside depletion on tumor formation. J. Natl. Cancer Inst. 92(11), 912-917.

56. Dickson, R. C., Sumanasekera, C., and Lester, R. L. (2006). Functions and metabolism of sphingolipids in Saccharomyces cerevisiae. Prog. Lipid Res. 45(6), 447-465.

57. DiDonato, J. A., Hayakawa, M., Rothwarf, D. M., Zandi, E., and Karin, M. (1997). A cytokine-responsive IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB. Nature 388(6642), 548-554.

58. Dorman, G., and Prestwich, G. D. (1994). Benzophenone photophores in biochemistry. Biochemistry 33, 5661-5673.

59. Dorman, G., and Prestwich, G. D. (2000). Using photolabile ligands in drug discovery and development. Trends Biotechnol. 18, 64-77.

60. Dustin, M. L. (2008). T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunol. Rev. 221, 77-89.

61. Dyatlovitskaya, E. V., and Bergelson, L. D. (1987). Glycosphingolipids and antitumor immunity. Biochim. Biophys. Acta 907(2), 125-143.

62. Dyatlovitskaya, E. V., Sinitsyna, E. V., Jung, K., Azizov, Y. M., and Bergelson, L. D. (1983). Shedding of gangliosides from calf thymocytes. Eur. J. Biochem. 131(3), 601-605.

63. Ebert, J. R., Baker, J. F., and Punt, J. A. (2000). Immature CD4+CD8+thymocytes do not polarize lipid rafts in response to TCR-mediated signals. J. Immunol. 165(10), 5436-5442.

64. Edidin, M. (2003). The state of lipid rafts: from model membranes to cells. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Structure 32, 257-283.

65. Fantini, J., Garmy, N., Mahfoud, R., and Yahi, N. (2002). Lipid rafts: structure, function and role in HIV, Alzheimer's and prion diseases. Expert Rev. Mol. Med. 4(27), 1-22.

66. Farrelli, I. S., Toroney, R., Hazen, J. L., Mehl, R. A., and Chin, J. W. (2005). Photo-cross-linking inte-racting proteins with a genetically encoded benzophenone. Nature Methods 2, 377-384.

67. Fishman, P. H., and Atikkan, E. E. (1980). Mechanism of action of cholera toxin: effect of receptor density and multivalent binding on activation of adenylate cyclase. J. Membr. Biol. 54(1), 51-60.

68. Fishman, P. H., Simmons, J. L., Brady, R. O., and Freese, E. (1974). Induction of glycolipid biosynthesis by sodium butyrate in HeLa cells. Biochem. Biophys. Res. Com. 59(1), 292-299.

69. Foster, L. J., Hoog, C. L., and Mann, M. (2003). Unbiased quantitative proteomics of lipid rafts reveals high specificity for signaling factors. Proc. Natl Acad. Sci. USA 100(10), 5813-5818.

70. Fra, A. M., Masserini, M., Palestini, P., Sonnino, S., and Simons, K. (1995). A photo-reactive derivative of ganglioside GM1 specifically cross-links VEP21-caveolin on the cell surface. FEBSLetters 375(1-2), 11-14.

71. Fredman, P. (1994). Gangliosides associated with primary brain tumors and their expression in cell lines established from these tumors. Prog. Brain Res. 101, 225-240.

72. Fredman, P., Brezicka, T., Holmgren, J., Lindholm, L., Nilsson, O., and Svennerholm, L. (1986). Binding specificity of monoclonal antibodies to ganglioside, Fuc-GMl. Biochim. Biophys. Acta 875, 316-323.

73. Fredman, P., von Hoist, H., Collins, V. P., Dellheden, B., and Svennerholm, L. (1993). Expression of gangliosides GD3 and 3-isoLMl in autopsy brains from patients with malignant tumors. J. Neurochem. 60(1), 99-105.

74. French, K. J., Schrecengost, R. S., Lee, B. D., Zhuang, Y., Smith, S. N., Eberly, J. L., Yun, J. K., and Smith, C. D. (2003). Discovery and evaluation of inhibitors of human sphingosine kinase. Cancer Res. 63(18), 5962-5969.

75. Fuentes, R., Allman, R., and Mason, M. D. (1997). Ganglioside expression in lung cancer cell lines. Lung Cancer 18, 21-33.

76. Furukawa, K., Hamamura, K., Aixinjueluo, W., and Furukawa, K. (2006). Biosignals modulated by tumor-associated carbohydrate antigens: novel targets for cancer therapy. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1086, 185-198.

77. Furukawa, K., and Lloyd, K. O. (1990). Gangliosides in melanoma In "Human melanoma: from basic research to clinical application" (S. Ferrone, Ed.). Springer. Heidelberg.

78. Futerman, A. H., and van Meer, G. (2004). The cell biology of lysosomal storage disorders. Natl. Rev. Mol. Cell. Biol. 5(7), 554-565.

79. Gable, K., Slife, H., Bacikova, D., Monaghan, E., and Dunn, T. M. (2000). Tsc3p is an 80-amino acid protein associated with serine palmitoyltransferase and required for optimal enzyme activity. J. Biol. Chem. 275(11), 759775603.

80. Galardy, R. E., Craig, L. C., and Printz, M. P. (1973). Benzophenone triplet: a new photochemical probe of biological ligand-receptor interactions. Nature New Biol. 242, 127-128.

81. Garcia-Ruiz, C., Colell, A., Morales, A., Calvo, M., Enrich, C., and Fernandez-Checa, J. C. (2002). Trafficking of ganglioside GD3 to mitochondria by tumor necrosis factor-alpha. J. Biol. Chem. 277(39), 36443-36448.

82. Gastman, B. R., Johnson, D. E., Whiteside, T. L., and Rabinowich, H. (2000). Tumor-induced apoptosis of T lymphocytes: elucidation of intracellular apoptotic events. Blood 95(6), 2015-2023.

83. Gimpl, G., and Gehrig-Burger, K. (2007). Cholesterol reporter molecules. Biosci. Rep. 27(6), 335-358.

84. Giraldo, A. M. V., Castello, P. R., Flecha, F. L. G., Moeller, J. V., Delfino, J. M., and Rossi, J. P. F. C. (2006). Stoichiometry of lipid-protein interaction assessed by hydrophobic photolabeling. FEBS Lett. 580(2), 607-612.

85. Goebel, J., Forrest, K., Morford, L., and Roszman, T. L. (2002). Differential localization of IL-2- and -15 receptor chains in membrane rafts of human T cells. J. Leukoc. Biol 72(1), 199-206.

86. Greenberg, G. R., Chakrabarti, P., and Khorana, H. G. (1976). Incorporation of fatty acids containing photosensitive groups into phospholipids of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 86-90.

87. Gruber, M. Y., Cheng, K.-H., Lepock, J. R., and Thompson, J. E. (1984). Improved yield of plasma membrane from mammalian cells through modifications of the two-phase polymer isolation procedure. Analyt. Biochem. 138(1), 112-118.

88. Gubbens, J., Vader, P., Damen, J. M. A., Oflaherty, M. C., Slijper, M., Dekruijff, B., and Dekroon, A. I. P. M. (2007). Probing the membrane interface-interacting proteome using photoactivatable lipid cross-linkers. J. ProteomeRes. 6(5), 1951-1962.

89. Gupta, C. M., Costello, C. E., and Khorana, H. G. (1979). Sites of intermolecular crosslinking of fatty acyl chains in phospholipids carrying a photoactivable carbene precursor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 3139-3143.

90. Hahn, W. C., Counter, C. M., Lundberg, A. S., Beijersbergen, R. L., Brooks, M. W., and Weinberg, R. A. (1999). Creation of human tumour cells with defined genetic elements. Nature 400(6743), 464-468.

91. Hait, N. C., Bellamy, A., Milstien, S., Kordula, T., and Spiegel, S. (2007). Sphingosine kinase type 2 activation by ERK-mediated phosphorylation. J. Biol Chem. 282(16), 12058-12065.

92. Hakomori, S. (1970). Cell density-dependent changes of glycolipid concentrations in fibroblasts, and loss of this response in virus-transformed cells. Proc. Natl Acad. Sci. USA 67(4), 1741-1747.

93. Hakomori, S. (2002). The glycosynapse. Proc. Natl Acad. Sci. USA 99(1), 225-232.

94. Hakomori, S. (2004a). Carbohydrate-to-carbohydrate interaction in basic cell biology: a brief overview. Arch. Biochem. Biophys. 426(2), 173—181.

95. Hakomori, S. (2004b). Glycosynapses: microdomains controlling carbohydrate-dependent cell adhesion and signaling. Ann. Acad. Bras. Sci. 76(3), 553-572.

96. Hamilton, W. B., Helling, F., Lloyd, K. O., and Livingston, P. O. (1993). Ganglioside expression on human malignant melanoma assessed by quantitative immune thin-layer chromatography. Int. J. Cancer 53(4), 566573.

97. Han, X., and Cheng, H. (2005). Characterization and direct quantitation of cerebroside molecular species from lipid extracts by shotgun lipidomics. J. Lipid Res. 46(1), 163-175.

98. Hanada, K., Hara, T., Nishijima, M. (2000). Purification of the serine palmitoyltransferase complex responsible for sphingoid base synthesis by using affinity peptide chromatography techniques. J. Biol. Chem. 275(12), 8409-8415.

99. Hanada, K., Kumagai, K., Yasuda, S., Miura, Y., Kawano, M., Fukasawa, M., and Nishijima, M. (2003). Molecular machinery for non-vesicular trafficking of ceramide. Nature 426(6968), 803-809.

100. Hatanaka, Y., Hashimoto, M., Kurihara, H., Nakayama, H., and Kanaoka, Y. (1994). Novel family of aromatic diazirines for photoaffinity labeling. J. Org. Chem. 59(2), 383-387.

101. Heiner, J. P., Miraldi, F., Kallick, S., Makley, J., Neely, J., Smith-Mensah, W. H., and Cheung, N. K. (1987). Localization of GD2-specific monoclonal antibody 3F8 in human osteosarcoma. Cancer Res. 47(20), 537753-81.

102. Heukeshoven, J., and Dernick, R. (1988). Improved silver staining procedure for fast staining in PhastSystem Development Unit. I. Staining of sodium dodecyl sulfate gels. Electrophoresis 9(1), 28-32.

103. Hildenbrand, J., Stryckmans, P. A., and Vanhouche, J. (1971). Gangliosides in leukemic and non-leukemic human leucocytes. Biochim. Biophys. Acta 260(2), 272-278.

104. Hino, N., Okazaki, Y., Kobayashi, T., Hayashi, A., Sakamoto, K., and Yokoyama, S. (2005). Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid. Nature Methods 2, 201-206.

105. Hinrichs, J. W., Klappe, K., and Kok, J. W. (2005). Rafts as missing link between multidrug resistance and sphingolipid metabolism. J. Memhr. Biol. 203(2), 57-64.

106. Hirschberg, K., Rodger, J., and Futerman, A. H. (1993). The long-chain sphingoid base of sphingolipids is acylated at the cytosolic surface of the endoplasmic reticulum in rat liver. Biochem. J. 290(Pt 3), 751-757.

107. Holmgren, J., Lonnroth, I., Mansson, J., and Svennerholm, L. (1975). Interaction of cholera toxin and membrane GM1 ganglioside of small intestine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72(7), 2520-2524.

108. Holthuis, J. C. M., Vanmeer, G., and Huitema, K. (2003). Lipid microdomains, lipid translocation and the organization of intracellular membrane transport (Review). Mol. Membr. Biol. 20(3), 231-241.

109. Hornemann, T., Richard, S., Rutti, M. F., Wei, Y., and von Eckardstein, A. (2006). Cloning and initial characterization of a new subunit for mammalian serine-palmitoyltransferase. J. Biol. Chem. 281(49), 37275-37281.

110. Hsueh, E. C., and Morton, D. L. (2003). Antigen-based immunotherapy of melanoma: Canavaxin therapeutic polyvalent cancer vaccine. Semin. Cancer Biol. 13(6), 401-407.

111. Hu-Li, J., Ohara, J., Watson, C., Tsang, W., and Paul, W. E. (1989). Derivation of a T cell line that is highly responsive to IL-4 and IL-2 (CT.4R) and of an IL-2 hyporesponsive mutant of that line (CT.4S). J. Immunol 142(3), 800-807.

112. Hummel, I., Klappe, K., and Kok, J. W. (2005). Up-regulation of lactosylceramide synthase in MDR1 overexpressing human liver tumour cells. FEBSLett. 579,3381-3384.

113. Huwiler, A., Kolter, T., Pfeilschifter, J., and Sandhoff, K. (2000). Physiology and pathophysiology of sphingolipid metabolism and signaling. Biochim. Biophys. Acta 1485(2-3), 63-99.

114. Huwiler, A., and Zangemeister-Wittke, U. (2007). Targeting the conversion of ceramide to sphingosine 1-phosphate as a novel strategy for cancer therapy. Crit. Rev. Oncol Hematol. 63(2), 150-159.

115. Ilangumaran, S., and Hoessli, D. C. (1998). Effects of cholesterol depletion by cyclodextrin on the sphingolipid microdomains of the plasma membrane. Biochem. J. 335(Part 2), 433-440.

116. Infante, R. E., Abi-Mosleh, L., Radhakrishnan, A., Dale, J. D., Brown, M. S., and Goldstein, J. L. (2008a). Purified NPC1 protein. I. Binding of cholesterol and oxysterols to a 1278-amino acid membrane protein. J. Biol Chem. 283(2), 1052-1063.

117. Jmoudiak, M., and Futerman, A. H. (2005). Gaucher disease: pathological mechanisms and modern management. Brit. J. Haematol 129(2), 178-188.

118. Johnson, K. R., Johnson, K. Y., Crellin, H. G., Ogretmen, B., Boylan, A. M., Harley, R. A., and Obeid, L. M. (2005). Immunohistochemical distribution of sphingosine kinase 1 in normal and tumor lung tissue. J. Histochem. Cytochem. 53(9), 1159-1166.

119. Jury, E. C., Flores-Boija, F., and Kabouridis, P. S. (2007). Lipid rafts in T cell signalling and disease. Semin. Cell Dev. Biol. 18(5), 608-615.

120. Karin, M. (2006). Nuclear factor-kappaB in cancer development and progression. Nature 441(7092), 431-436.

121. Karin, M., and Greten, F. R. (2005). NF-kappaB: linking inflammation and immunity to cancer development and progression. Nat. Rev. Immunol. 5(10), 749-59.

122. Kaucic, K., Etue, N., Lafleur, B., Woods, W., and Ladisch, S. (2001). Neuroblastomata of infancy exhibit a characteristic ganglioside pattern. Cancer 91(4), 785-793.

123. Kaufmann, S. H., and Hengartner, M. O. (2001). Programmed cell death: alive and well in the new millennium. Trends Cell. Biol. 11(12), 526-534.

124. Kawabuchi, M., Satomi, Y., Takao, T., Shimonishi, Y., Nada, S., Nagai, K., Tarakhovsky, A., and Okada, M. (2000). Transmembrane phosphoprotein Cbp regulates the activities of Src family tyrosine kinases. Nature 404, 9991003.

125. Kawamori, T., Osta, W., Johnson, K. R., Pettus, B. J., Bielawski, J., Tanaka, T., Wargovich, M. J., Reddy, B. S., Hannun, Y. A., Obeid, L. M., and Zhou, D. (2006). Sphingosine kinase 1 is up-regulated in colon carcinogenesis. FASEBJ. 20(2), 386-388.

126. Kawasaki, Y., Ito, A., Withers, D. A., Taima, T., Kakoi, N., Saito, S., and Arai, Y. (2010). Ganglioside DSGb5, preferred ligand for Siglec-7, inhibits NK cell cytotoxicity against renal cell carcinoma cells. Glycobiology Epub ahead of print.

127. Khorana, H. G. (1980). Chemical studies of biological membranes. Bioorgan. Chem. 9, 363-405.

128. Kihara, A., and Igarashi, Y. (2004). FVT-1 is a mammalian 3-ketodihydrosphingosine reductase with an active site that faces the cytosolic side of the endoplasmic reticulum membrane. J. Biol. Chem. 279(47), 4924349250.

129. Kihara, A., Mitsutake, S., Mizutani, Y., and Igarashi, Y. (2007). Metabolism and biological functions of two phosphorylated sphingolipids, sphingosine 1-phosphate and ceramide 1- phosphate. Prog. Lipid Res. 46(2), 126-144.

130. Kleinman, H. K., Martin, G. R., and Fishman, P. H. (1979). Ganglioside inhibition of fibronectin-mediated cell adhesion to collagen. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76(7), 3367-3371.

131. Ko, K., Furukawa, K., Takahashi, T., Urano, T., Sanai, Y., Nagino, M., and Nimura, Y. (2006). Fundamental study of small interfering RNAs forganglioside GD3 synthase gene as a therapeutic target of lung cancers. Oncogene 25(52), 6924-6935.

132. Kohama, T., Olivera, A., Edsall, L., Nagiec, M. M., Dickson, R., and Spiegel, S. (1998). Molecular cloning and functional characterization of murine sphingosine kinase. J. Biol. Chem. 273(37), 23722-23728.

133. Kojima, N., and Hakomori, S. (1991). Cell adhesion, spreading, and motility of GM3-expressing cells based on glycolipid-glycolipid interaction. J. Biol. Chem. 266(26), 17552-17558.

134. Kong, Y., Li, R. X., and Ladisch, S. (1998). Natural forms of shed tumor gangliosides. Biochim. Biophys. Acta 1394(1), 43-56.

135. Kroemer, G., Galluzzi, L., and Brenner, C. (2007). Mitochondrial membrane permeabilization in cell death. Physiol. Rev. 87, 99-163.

136. Ladisch, S., Gillard, B., Wong, C., and Ulsh, L. (1983). Shedding and immunoregulatory activity of YAC-1 lymphoma cell gangliosides. Cancer Res. 43, 3808-3813.

137. Ladisch, S., Li, R. X., and Olson, E. (1994). Ceramide structure predicts tumor ganglioside immunosuppressive activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(5), 1974-1978.

138. Laemmli, U. K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bac-teriophage T4. Nature 227(5259), 680-685.

139. Lamos, S. M., Krusemark, C. J., McGee, C. J., Scalf, M., Smith, L. M., and Belshaw, P. J. (2006). Mixed isotope photoaffinity reagents for identificationof small-molecule targets by mass spectrometry. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 45(26), 4329-4333.

140. Langlet, C., Bernard, A. M., Drevot, P., and He, H. T. (2000). Membrane rafts and signaling by the multichain immune recognition receptors. Curr. Opin. Immunol. 12, 250—255.

141. Lavie, Y., Fiucci, G., Czarny, M., and Liscovitch, M. (1999). Changes in membrane microdomains and caveolae constituents in multidrug-resistant cancer cells. Lipids 34(Suppl.), S57-S63.

142. Le Scolan, E., Pchejetski, D., Banno, Y., Denis, N., Mayeux, P., Vainchenker, W., Levade, T., and Moreau-Gachelin, F. (2005). Overexpression of sphingosine kinase 1 is an oncogenic event in erythroleukemic progression. Blood 106(5), 1808-1116.

143. Lee, J. Y., Bielawska, A. E., and Obeid, L. M. (2000). Regulation of cyclin-dependent kinase 2 activity by ceramide. Exp. Cell Res. 261(2), 303-311.

144. Legembre, P., Daburon, S., Moreau, P., Moreau, J. F., and Taupin, J. L. (2006). Modulation of Fas-mediated apoptosis by lipid rafts in T lymphocytes. J. Immunol. 176(2), 716-20.

145. Levade, T., and Jaffrezou, J. P. (1999). Signalling sphingomyelinases: which, where, how and why? Biochim. Biophys. Acta 1438(1), 1-17.

146. Li, Q., and Verma, I. M. (2002). NF-kappaB regulation in the immune system. Nat. Rev. Immunol. 2(10), 725-734.

147. Li, R., Gage, D., and Ladisch, S. (1993). Biosynthesis and shedding of murine lymphoma gangliosides. Biochim. Biophys. Acta 1170(3), 283-290.

148. Lingwood, C. A. (1993). Verotoxins and their glycolipid receptors. Adv. LipidRes. 25(1), 189-211.

149. Lingwood, D., and Simons, K. (2010). Lipid rafts as a membrane-organizing principle. Science 327(5961), 46-50.

150. Linn, S. C., Kim, H. S., Keane, E. M., Andrai, L. M., Wang, E., and Merrill, A. H. J. (2001). Regulation of de novo sphingolipid biosynthesis and the toxic consequences of its disruption. Biochem. Soc. Trans. 29(Pt 6), 831-835. .

151. Liu, X., Zou, H., Slaughter, C., and Wang, X. (1997). DFF, a heterodimeric protein that functions downstream of caspase-3 to trigger DNA fragmentation during apoptosis. Cell 89(2), 175-184.

152. Liu, Y. Y., Han, T. Y., Giuliano, A. E., and Cabot, M. C. (1999). Expression of glucosylceramide synthase, converting ceramide to glucosylceramide, confers adriamycin resistance in human breast cancer cells. J. Biol. Chem. 274,1140-1146.

153. Liu, Y. Y., Han, T. Y., Yu, J. Y., Bitterman, A., Le, A., Giuliano, A. E., and Cabot, M. C. (2004). Oligonucleotides blocking glucosylceramide synthase expression selectively reverse drug resistance in cancer cells. J. Lipid Res. 45, 933-940.

154. Lloyd, K. O., and Furukawa, K. (1998). Biosynthesis and functions of gangliosides: recent advances. Glycoconj. J. 15(7), 627-636.

155. London, E., and Brown, D. A. (2000). Insolubility of lipids in Triton X-100: physical origin and relationship to sphingolipid/cholesterol membrane domains (Rafts). Biochim. Biophys. Acta 1508(1-2), 182-195.

156. Lopez, P. H., and Schnaar, R. L. (2009). Gangliosides in cell recognition and membrane protein regulation. Curr. Opin. Struct. Biol. 19(5), 549-557.

157. Lu, P., and Sharom, F. J. (1995). Gangliosides are potent immunosuppressors of IL-2-mediated T-cell proliferation in a low protein environment. Immunology 86(3), 356-63.

158. Lu, P., and Sharom, F. J. (1996). Immunosuppression by YAC-1 lymphoma: role of shed gangliosides. Cell. Immunol. 173(1), 22-32.

159. Luo, C., Wang, K., Liu, D., Li, Y., and Zhao, Q. S. (2008). The functional roles of lipid rafts in T cell activation, immune diseases and HTV infection and prevention. Cell. Mol. Immunol. 5(1), 1-7.

160. Maceyka, M., Payne, S. G., Milstien, S., and Spiegel, S. (2002). Sphingosine kinase, sphingosine-1-phosphate, and apoptosis. Biochim. Biophys. Acta 1585(2-3), 193-201.

161. Marmor, M. D., and Julius, M. (2001). Role for lipid rafts in regulating interleukin-2 receptor signaling. Blood 98(5), 1489-1497.

162. Marquina, G., Waki, H., Fernandez, L. E., Kon, K., Carr, A., Valiente, O., Perez, R., and Ando, S. (1996). Gangliosides expressed in human breast cancer. Cancer Res. 56(22), 5165-5171.

163. Mathias, S., Pena, L. A., and Kolesnick, R. N. (1998). Signal transduction of stress via ceramide. Biochem. J. 335(3), 465-^480.

164. Mauri, L., Prioni, S., Loberto, N., Chigorno, V., Prinetti, A., and Sonnino, S. (2004). Synthesis of radioactive and photoactivable ganglioside derivatives» for the study of ganglioside-protein interactions. Glycoconj. J. 20(1), 11-23.

165. Mayor, S., and Rao, M. (2004). Rafts: Scale-dependent, active lipid organization at the cell surface. Traffic 5(4), 231-240.

166. Merritt, W. D., Casper, J. T., Lauer, S. J., and Reaman, G. H. (1987). Expression of GD3 ganglioside in childhood T-cell lymphoblastic malignancies. Cancer Res. 47(6), 1724-1730.

167. Mizutani, Y., Kihara, A., and Igarashi, Y. (2005). Mammalian Lass6 and its related family members regulate synthesis of specific ceramides. Biochem. J. 390(Pt 1), 263-271.

168. Mizutani, Y., Kihara, A., and Igarashi, Y. (2006). LASS3 (longevity assurance homologue 3) is a mainly testis-specific (dihydro)ceramide synthase with relatively broad substrate specificity. Biochem. J. 398(3), 531-358.

169. Montecucco, C., and Rossetto, O. (2000). How do presynaptic PLA2 neurotoxins block nerve terminals? Trends Biochem. Sci. 25(6), 266-270.

170. Montecucco, C., Schiavo, G., Gao, Z., Bauerlein, E., Boquet, P., and DasGupta, B. R. (1988). Interaction of botulinum and tetanus toxins with the lipid bilayer surface. Biochem. J. 251(2), 379-383.

171. Mora, P. T., Bradyt, R. O., RoY MI. Bradley, R. M., and McFarland, V. W. (1969). Gangliosides in DNA virus-transformed and spontaneously transformed tumorigenic mouse cell lines. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63(4), 1290-1296.

172. Morales, A., Colell, A., Mari, M., Garcia-Ruiz, C., and Fernandez-Checa, J. C. (2004). Glycosphingolipids and mitochondria: role in apoptosis and disease. Glycoconj. J. 20(9), 579-88.

173. Mosmann, T. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Meth. 65(1), 55-63.

174. Mourey, R. J., Estevez, V.A., Marecek, J.F., Barrow, R.K., Prestwich, G.D., Snyder, S.H. (1993). Inositol 1,4,5-triphosphate receptors: mapping the inositol 1,4,5-triphosphate binding site with photoaffinity ligands. Biochemistry llil), 1719-1726.

175. Mouritsen, O. G. (2005). "Life As a Matter of Fat." The frontiers collection (D. Dragoman, M. Dragoman, A. C. Elitzur, M. P. Silverman, J. Tuszynski, and H. D. Zeh, Eds.) Springer-Verlag Berlin Heidelberg.

176. Mui, B., Chow, L., and Hope, M. J. (2003). Extrusion technique to generate liposomes of defined size. Methods Enzymol. 367, 3-14.

177. Muller, T., Oehlenschlager, F., andBuehner, M. (1995). Human interleukin-4 and variant R88Q: phasing X-ray diffraction data by molecular replacement using X-ray and nuclear magnetic resonance models. J. Mol. Biol. 247(2), 360-372.

178. Musselli, C., Livingston, P. O., and Ragupathi, G. (2001). Keyhole limpet haemocyanin conjugate vaccines against cancer: the Memorial Sloan Kettering experience. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 127(1), 20-26.

179. Navid, F., Santana, V. M., and Barfield, R. C. (2009). Anti-GD2 antibody therapy for GD2-expressing tumors. Curr. Cancer Drug Targets 10(2), 200209.

180. Ng, C. S., Novick, A. C., Tannenbaum, C. S., Bukowski, R. M., and Finke, J. H. (2002). Mechanisms of immune evasion by renal cell carcinoma: tumor-induced T-lymphocyte apoptosis and NF-kB suppression. Urology> 59, 9-14.

181. Nicoll, G., Avril, T., Lock, K., Furukawa, K., Bovin, N., and Crocker, P. R. (2003). Ganglioside GD3 expression on target cells can modulate NK cell cytotoxicity via siglec-7-dependent and -independent mechanisms. Eur. J. Immunol. 33(6), 1642-1648.

182. Offiier, H., Thieme, T., and Vandenbark, A. A. (1987). Gangliosides induce selective modulation of CD4 from helper T lymphocytes. J. Immunol. 139(10), 3295-3305.

183. Ogretmen, B. (2006). Sphingolipids in cancer: Regulation of pathogenesis and therapy. FEBS Lett. 580(23), 5467-5476.

184. Ogretmen, B., and Hannun, Y. A. (2004). Biologically active sphingolipids in cancer pathogenesis and treatment. Natl. Rev. Cancer 4(8), 604-616.

185. Ogretmen, B., Kraveka, J. M., Schady, D., Usta, J., Hannun, Y. A., and Obeid, L. M. (2001). Molecular mechanisms of ceramide-mediatedtelomerase inhibition in the A549 human lung adenocarcinoma cell line. J. Biol Chem. 276(35), 32506-32514.

186. Pagano, R. E. (2003). Endocytic trafficking of glycosphingolipids in sphingolipid storage diseases. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol Sci. 358(1433), 885-891.

187. Palestini, P., Pitto, M., Tedeschi, G., Ferraretto, A., Parenti, M., Brunner, J., and Masserini, M. (2000). Tubulin anchoring to glycolipid-enriched, detergent-resistant domains of the neuronal plasma membrane. J. Biol Chem. 275(14), 9978-9985.

188. Pandit, S. A., Khelashvili, G., Jakobsson, E., Grama, A., and Scott, H. L. (2007). Lateral organization in lipid-cholesterol mixed bilayers. Biophys. J. 92(2), 440-447.

189. Parton, R. G. (1994). Ultrastructural localization of gangliosides: GM1 is concentrated in caveolae. J. Histochem. Cytochem. 42(2), 155-166.

190. Peguet-Navarro, J., Sportouch, M., Popa, I., Berthier, O., Schmitt, D., and Portoukalian, J. (2003). Gangliosides from human melanoma tumors impairdendritic cell differentiation from monocytes and induce their apoptosis. J. Immunol. 170(7), 3488-3494.

191. Perez, F., Pernet-Gallay, K., Nizak, C., Goodson, H. V., Kreis, T. E., and Goud, B. (2002). CLIPR-59, a new trans-Golgi/TGN cytoplasmic linker protein belonging to the CLIP-170 family. J. Cell. Biol. 156(4), 631-642.

192. Pettus, B. J., Chalfant, C. E., and Hannun, Y. A. (2002). Ceramide in apoptosis: an overview and current perspectives. Biochim. Biophys. Acta 1585(2-3), 114-125.

193. Pewzner-Jung, Y., Ben-Dor, S., and Futerman, A. H. (2006). When do Lasses (longevity assurance genes) become CerS (ceramide synthases)?: Insights into the regulation of ceramide synthesis. J. Biol. Chem. 28(35), 2500125005.

194. Pierce, S. K. (2002). Lipid rafts and B-cell activation. Natl. Rev. Immunol. 2(2), 96-105.

195. Pike, L. J. (2005). Growth factor receptors, lipid rafts and caveolae: an evolving story. Biochim. Biophys. Acta 1746(3), 260-273.

196. Pike, L. J. (2006). Rafts defined: a report on the Keystone Symposium on Lipid Rafts and Cell Function. J. Lipid Res. 47(7), 1597-1598.

197. Pitto, M., Brunner, J., Ferraretto, A., Ravasi, D., Palestini, P., and Masserini, M. (2000). Use of a photoactivable GM1 ganglioside analogue to assess lipid distribution in caveolae bilayer. Glycoconj. J. 17(3 -4), 215-222.

198. Pizzo, P., Giurisato, E., Bigsten, A., Tassi, M., Tavano, R., Shawd, A., and Viola, A. (2004). Physiological T cell activation starts and propagates in lipid rafts. Immun. Lett. 91 (1), 3-9.

199. Prestwich, G. D. (1996). Touching all the bases: inositol polyphosphate and phosphoinisitide affinity probes from glucose. Acc. Chem. Res. 29(3), 503513.

200. Prinetti, A., Iwabuchi, K., and Hakomori, S. (1999). Glycosphingolipid-enriched signaling domain in mouse neuroblastoma Neuro2a cells -Mechanism of ganglioside-dependent neuritogenesis. J. Biol. Chem. 274(30), 20916-20924.

201. Prinetti, A., Loberto, N., Chigorno, V., and Sonnino, S. (2009). Glycosphingolipid behaviour in complex membranes. Biochim. Biophys. Acta 1788, 184-193.

202. Pukel, C. S., Lloyd, K. O., Travassos, L. R., Dippold, W. G., Oettgen, H. F., and Old, L. J. (1982). GD3, a prominent ganglioside of human melanoma. Detection and characterisation by mouse monoclonal antibody. J. Exp. Med. 155(4), 1133-1147.

203. Pyne, S., and Pyne, N. J. (2000). Sphingosine 1-phosphate signalling in mammalian cells. Biochem. J. 349(Pt. 2), 385-402.

204. Qian, D., and Weiss, A. (1997). T cell antigen receptor signal transduction. Curr. Opin. Cell. Biol. 9(2), 205-212.

205. Rao, R., Logan, B., Forrest, K., Roszman, T. L., and Goebel, J. (2004). Lipid rafts in cytokine signaling. Cytokine & Growth Factor Rev. 15(2-3), 103-110.

206. Ravindranath, M. H., Tsuchida, T., Morton, D. L., and Irie, R. F. (1991). Ganglioside GM3:GD3 ratio as an index for the management of melanoma. Cancer 67(12), 3029-3035.

207. Redding, P., and Juliano, R. (2005). Clinging to life: cell to matrix adhesion and cell servival. Cancer Metastasis Rev. 24, 425-439.

208. Riboni, L., Viani, P., Bassi, R., Prinetti, A., and Tettamanti, G. (1997). The role of sphingolipids in the process of signal transduction Prog. Lipid Res. 36(2/3), 153-195.

209. Rickard, J. E., and Kreis, T. E. (1996). CLIPs for organelle-microtubule interactions. Trends Cell. Biol. 6(5), 178-183.

210. Riedl, S. J., and Salvesen, G. S. (2007). The apoptosome: signalling platform of cell death. Nature Rev. Mol. Cell Biol 8(5), 405-413.

211. Ringerike, T., Blystad, F. D., Levy, F. O., Madshus, I. H., and Stang, E. (2002). Cholesterol is important in control of EGF receptor kinase activity but EGF receptors are not concentrated in caveolae. J. Cell Sci. 115(Pt 6), 1331-1340.

212. Robbins, P. W., and Macpherson, I. (1971). Control of glycolipid synthesis in cultured hamster cell line. Nature 229(5286), 569-570.

213. Rodgers, W., Crise, B., and Rose, J. K. (1994). Signals determining protein tyrosine kinase and glycosyl-phosphatidylinositol-anchored protein targeting to a glycolipid-enriched membrane fraction. Mol Cell Biol 14, 5384-5391.

214. Rosenthal, M. D. (1987). Fatty acid metabolism of isolated mammalian cells. Prog. Lipid. Res. 26(2), 87-124.

215. Rother, J., van Echten, G., Schwarzmann, G., Sandhoff, K. (1992). Biosynthesis of sphingolipids: dihydroceramide and not sphinganine is desaturated by cultured cells. Biochem. Biophys. Res. Com. 189(1), 14-20.

216. Sa, G., Das, T., Moon, C., Hilston, C. M., Rayman, P. A., Rini, B., Tannenbaum, C. S., and Finke, J. H. (2009). GD3, an overexpressed tumor-derived ganglioside, mediates the apoptosis of activated but not resting T cells. Cancer Res. 69(7), 3095-3104.

217. Saha, S., and Mohanty, K. C. (2003). Correlation of gangliosides GM2 and GM3 with metastatic potential to lungs of mouse В16 melanoma. J. Exp. Clin. Cancer Res. 22, 125-134.

218. Sandhoff, K., and van Echten, G. (1993). Ganglioside metabolism — topology and regulation. Adv. Lipid Res. 26,119-141.

219. Scheel-Toellner, D., Wang, K., Assi, L. K., Webb, P. R., Craddock, R. M., Salmon, M., and Lord, J. M. (2004). Clustering of death receptors in lipid rafts initiates neutrophil spontaneous apoptosis. Biochem. Soc. Trans. 32(Pt 5), 679-681.

220. Scheeltoellner, D., Wang, K., Singh, R., Majeed, S., Raza, K., Curnow, S. J., Salmon, M., and Lord, J. M. (2002). The death-inducing signalling complex is recruited to lipid rafts in Fas-induced apoptosis. Biochem. Biophys. Res. Com. 297(4), 876-879.

221. Schulte, S., and Stoffel, W. (1993). Ceramide UDPgalactosyltransferase from myelinating rat brain: purification, cloning, and expression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(21), 10265-10269.

222. Scorrano, L., Oakes, S. A., Opferman, J. T., Cheng, E. H., Sorcinelli, M. D., Pozzan, T., and Korsmeyer, S. J. (2003). BAX and BAK regulation of endoplasmic reticulum Ca2+: a control point for apoptosis. Science 300(5616), 135-139.

223. Sen, R., and Baltimore, D. (1986). Inducibility of kappa immunoglobulin enhancer-binding protein Nf-kappa В by a posttranslational mechanism. Cell 47(6), 921-928.

224. Senchenkov, A., Litvak, D. A., and Cabot, M. C. (2001). Targeting ceramide metabolism—a strategy for overcoming drug resistance. J. Natl. Cancer Inst. 93(5), 347-357.

225. Shen, W., Falahati, R., Stark, R., Leitenberg, D., and Ladisch, S. (2005). Modulation of CD4 Th cell differentiation by ganglioside GDI a in vitro. J. Immunol. 175(8), 4927-4934.

226. Shevchuk, N. A., Hathout, Y., Epifano, O., Su, Y., Liu, Y., Sutherland, M., and Ladisch, S. (2007). Alteration of ganglioside synthesis by GM3 synthase knockout in murine embryonic fibroblasts. Biochim. Biophys. Acta 1771(9), 1226-1234.

227. Shinoura, N., Dohi, T., Kondo, T., Yoshioka, M., Takakura, K., and Oshima, M. (1992). Ganglioside composition and its relation to clinical data in brain tumors. Neurosurgery 31, 541—549.

228. Simons, K., and Dconen, E. (1997). Functional rafts in cell membranes. Nature 387(6633), 569-572.

229. Simons, K., and Toomre, D. (2000). Lipid rafts and signal transduction. Natl. Rev. Mol. Cell. Biol. 1, 31-40.

230. Simons, K., and van Meer, G. (1988). Lipid sorting in epithelial cells. Biochemistry 27(17), 6197-6202.

231. Simons, K., and Vaz, W. L. C. (2004). Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Ann. Rev. Biophys. Biomolec. Struct. 33,269-295.

232. Singer, S. J., and Nicolson, G. L. (1972). The fluid mosaic model of the structure of cell membrane. Science 175(23), 720-731

233. Singh, A., Thornton, E. R., and Westheimer, F. H. (1962). The photolysis of diazo-acetylchymotrypsin. J. Biol. Chem. 237(5), 3006-3008.

234. Smith, R. A. G., and Knowles, J. R. (1973). Letter: Aryldiazirines. Potential reagents for photolabeling of biological receptor sites. J. Am. Chem. Soc. 95, 5072-5073.

235. Sonenshein, G. E. (1997). Rel/NF-kappa B transcription factors and the control of apoptosis. Semin. Cancer Biol. 8(2), 113-119.

236. Song, W. X., Vacca, M. F., Welti, R., and Rintoul, D. A. (1991). Effects of gangliosides GM3 and De-N-acetyl GM3 on epidermal growth factor receptor kinase activity and cell growth. J. Biol. Chem. 266(16), 1017410181.

237. Sorice, M., Matarrese, P., Manganelli, V., Tinari, A., Giammarioli, A. M., Mattei, V., Misasi, R., Garofalo, T., and Malorni, W. (2010). Role of GD3-CLIPR-59 association in lymphoblastoid T cell apoptosis triggered by CD95/Fas. PLoS One 5(1), e8567.

238. Spiegel, S., and Milstien, S. (2003a). Exogenous and intracellularly generated sphingosine 1-phosphate can regulate cellular processes by divergent pathways. Biochem. Soc. Trans. 31(Pt6), 1216-1219.

239. Spiegel, S., and Milstien, S. (2003b). Sphingosine-1-phosphate: an enigmatic signalling lipid. Natl. Rev. Мої. Cell. Biol. 4(5), 397-407.

240. Sproul, T. W., Kim, S., and Pierce, S. K. (2000). В cell antigen receptor signaling occurs outside lipid rafts in immature В cells. J. Immunol. 165, 6020-6023.

241. Steinman, R. M., Mellman, I. S., Muller, W. A., and Cohn, Z. A. (1983). Endocytosis and the recycling of plasma membrane. J. Cell. Biol. 96(1), 1-27.

242. Susin, S. A., Zamzami, N., Castedo, M., Hirsch, T., Marchetti, P., Macho, A., Daugas, E., Geuskens, M., and Kroemer, G. (1996). Bcl-2 inhibits the mitochondrial release of an apoptogenic protease. J. Exp. Med. 184(4), 13311341.

243. Suzuki, A. (2006). Sphingolipid biology (I. Y. Hirabayashi Y, Merrill Jr AH, Ed.), pp. 519-528. Springer-Verlag, Tokyo.

244. Svennerholm, L. (1972). Meth. Carbohydrate Chem. 6(2), 464-474.

245. Svirshchevskaya, E. V., Sidorov, I. A., Viskova, N. Y., and Dozmorov, I. M. (1993). Quantitative analysis of interleukin-2-induced proliferation in the presence of inhibitors using a mathematical model. J. Immunol. Meth. 159(1), 17-27.

246. Swaminathan, S., and Eswaramoorthy, S. (2000). Structural analysis of the catalytic and binding sites of Clostridium botulinum neurotoxin B. Nat. Struct. Biol. 7(8), 693-699.

247. Takeda, Y., Tashima, M., Takahashi, A., Uchiyama, T., and Okazaki, T. (1999). Ceramide generation in nitric oxide-induced apoptosis. Activation of magnesium-dependent neutral sphingomyelinase via caspase-3. J. Biol. Chem. 274(15), 10654-10660.

248. Telford, W. G., King, L. E., and Fraker, P. J. (1994). Rapid quantitation of apoptosis in pure and heterogeneous cell populations using flow cytometry. J. Immunol. Meth. 172(1), 1-16.

249. Ternes, P., Franke, S., Zahringer, U., Sperling, P., and Heinz, E. (2002). Identification and characterization of a sphingolipid delta 4-desaturase family. J. Biol. Chem. 277(28), 25512-25518.

250. Tettamanti, G. (2004). Ganglioside/glycosphingolipid turnover: New concepts Glycoconj. J. 20(5), 301-317.

251. Thiele, C., Hannah, M. J., Fahrenholz, F., and Huttner, W. B. (2000). Cholesterol binds to synaptophysin and is required for biogenesis of synaptic vesicles. Natl. Cell Biol 2(1), 42-49.

252. Thon, L., Mohlig, H., Mathieu, S., Lange, A., Bulanova, E., Winoto-Morbach, S., Schutze, S., Bulfone-Paus, S., and Adam, D. (2005). Ceramide mediates caspase-independent programmed cell death. FASEB J. 19(14), 1945-1956.

253. Thornberry, N. A., and Lazebnik, Y. (1998). Caspases: enemies within. Science 281(5381), 1312-1316.

254. Tolar, P., Sohn, H. W., and Pierce, S. K. (2008). Viewing the antigen-induced initiation of B-cell activation in living cells. Immunol. Rev. 221, 64-76.

255. Tsibizova, E. V., Vodovozova, E. L., Mikhalyov, I. I., and Molotkovsky, J. G. (2002). Synthesis of new photoaffine probes on the basis of ganglioside GM1 .Russian J. Bioorg.Chem. 28(2), 152-157.

256. Tsuchida, T., E., S. R., Morton, D. L., and and Irie, R. F. (1987). Gangliosides of human melanoma J.Natl. Cancer Inst. 78,45-54.

257. Turro, N. J. (1980). Structure and dynamics of important reactive intermediates involved in photobiological systems. Ann. N. Y. Acad. Sci. 346, 1-17.

258. Valentino, L., Moss, T., Olson, E., Wang, H. J., Elashoff, R., and Ladisch, S. (1990). Shed tumor gangliosides and progression of human neuroblastoma. Blood 75(7), 1564-1567.

259. Vanier, M. T. (2002). Prenatal diagnosis of Niemann-Pick diseases types A, B and C. Prenat. Diagn. 22(7), 630-632.

260. Vos, J. P., Lopescardozo, M., and Gadella, B. M. (1994). Metabolic and functional aspects of sulfogalactolipids. Biochim. Biophys. Acta 1211(2), 125-149.

261. Vyas, A. A., and Schnaar, R. L. (2001). Brain gangliosides: Functional ligands for myelin stability and the control of nerve regeneration Biochimie 83, 677-682.

262. Wang, X., Sun, P., Al-Qamari, A., Tai, T., Kawashima, I., and Paller, A. S. (2001). Carbohydrate-carbohydrate binding of ganglioside to integrin alpha(5) modulates alpha(5)beta(l) function. J. Biol. Chem. 276(11), 8436-8444.

263. Wang, X. Q., Sun, P., and Paller, A. S. (2002). Ganglioside induces caveolin-1 redistribution and interaction with the epidermal growth factor receptor. J. Biol Chem. 277(49), 47028-47034.

264. Wang, Y., Shen, B. J., and Sebald, W. (1997). A mixed-charge pair in human interleukin 4 dominates high-affinity interaction with the receptor alpha chain. Proc. Natl Acad. Sci. USA 94(5), 1657-1662.

265. Warren, L., Fuhrer, J. P., and Buck, C. A. (1972). Surface glycoproteins of normal and transformed cells: a difference determined by sialic acid and a growth-dependent sialyl transferase. Proc. Natl Acad. Sci. USA 69(7), 18381842.

266. Webb, J. L. (1963). Enzyme and Metabolic Inhibitors. Acad. Press. N.Y.

267. Weiner, G. J. (2007). Monoclonal antibody mechanisms of action in cancer. Immunol Res. 39(1-3), 271-278.

268. Wendeler, M., Hoernschemeyer, J., Hoffmann, D., Kolter, T., Schwarzmann, G., and Sandhoff, K. (2004). Photoaffinity labeling of the human GM2-activator protein. Mechanistic insight into ganglioside GM2 degradation. Eur. J. Biochem. 271(3), 614-627.

269. Wenger, D. A., Rafi, M. A., Luzi, P., Datto, J., and Costantino-Ceccarini, E. (2000). Krabbe disease: genetic aspects and progress toward therapy. Mol. Genet. Metab. 70(1), 1-9.

270. Werlen, G., and Palmer, E. (2002). The T-cell receptor signalosome: a dynamic structure with expanding complexity. Curr. Opin. Immunol. 14(3), 299-305.

271. Whiteside, S. T., and Israel, A. (1997). I kappa B proteins: structure, function and regulation. Semin. Cancer Biol 8(2), 75-82.

272. Williams, R. D., Wang, E., and Merrill, A. H. J. (1984). Enzymology of long-chain base synthesis by liver: characterization of serine palmitoyltransferasein rat liver microsomes. Arch. Biochem. Biophys. 228(1), 282-291.

273. Wooten, L. G., and Ogretmen, B. (2005). Spl/Sp3-dependent regulation of human telomerase reverse transcriptase promoter activity by the bioactive sphingolipid ceramide. J. Biol. Chem. 280(32), 28867-28876.

274. Wright, C. S., Mi, L. Z., and Rastinejad, F. (2004). Evidence for lipid packaging in the crystal structure of the GM2-activator complex with platelet activating factor J. Mol. Biol 342, 585-592.

275. Xia, P., Gamble, J. R., Wang, L., Pitson, S. M., Moretti, P. A., Wattenberg, B. W., D'Andrea, R. J., and Vadas, M. A. (2000). An oncogenic role of sphingosine kinase. Curr. Biol 10(23), 1527-1530.

276. Yamamura, S., Handa, K., and Hakomori, S. (1997). A close association of GM3 with c-Src and Rho in GM3-enriched microdomains at the B16 melanoma cell surface membrane: a preliminary note. Biochem. Biophys. Res. Com. 236(1), 218-222.

277. Yamashita, T., Wada, R, Sasaki, T., Deng, C., Bierfreund, U., Sandhoff, K., and Proia, R. L. (1999). A vital role for glycosphingolipid synthesis during development and differentiation. Proc. Natl Acad. Sci. USA 96(16), 9142-9147.

278. Yoon, S. J., Nakayama, K., Takahashi, N., Yagi, H., Utkina, N., Wang, H. Y., Kato, K., Sadilek, M., and Hakomori, S. I. (2006b). Interaction of N-linked glycans, having multivalent GlcNAc termini, with GM3 ganglioside. Glycoconj. J. 23(9), 639-649.

279. Yoshida, S., Fukumoto, S., Kawaguchi, H., Sato, S., Ueda, R., and Furukawa, K. (2001). Ganglioside G(D2) in small cell lung cancer cell lines: enhancement of cell proliferation and mediation of apoptosis. Cancer Res. 61(10), 4244-4252.

280. Yowler, B. C., and Schengrund, C. L. (2004). Glycosphingolipids-sweets for botulinum neurotoxin. Glycoconj. J. 21(6), 287-293.

281. Yu, J., and Langridge, W. H. (2001). A plant-based multicomponent vaccine protects mice from enteric diseases. Nat. Biotechnol. 19(6), 548-552.

282. Yu, R. K., Bieberich, E., Xia, T., and Zeng, G. (2004). Regulation of ganglioside biosynthesis in the nervous system. J. Lipid Res. 45(5), 783-793.

283. Zafir-Lavie, I., Michaeli, Y., and Reiter, Y. (2007). Novel antibodies as anticancer agents. Oncogene 26(25), 3714-3733.

284. Zeng, G., Gao, L., Birkle, S., and Yu, R. K. (2000). Suppression of Ganglioside GD3 Expression in a Rat F-ll Tumor Cell Line Reduces Tumor Growth, Angiogenesis, and Vascular Endothelial Growth Factor Production. Cancer Res. 60, 6670-6676.

285. Zeng, G., Li, D. D., Gao, L., Birkle, S., Bieberich, E., Tokuda, A., and Yu, R. K. (1999). Alteration of ganglioside composition by stable transfection with antisense vectors against GD3-synthase gene expression. Biochemistiy 38, 8762-8769.

286. Zhang, H., Zhang, S., Cheung, N. K., Ragupathi, G., and Livingston, P. O. (1998). Antibodies against GD2 ganglioside can eradicate syngeneic cancer micrometastases. Cancer Res. 58,2844-2849.

287. Zhang, J. L., Simeonowa, I., Wang, Y., and Sebald, W. (2002). The high-affinity interaction of human IL-4 and the receptor alpha chain is constituted by two independent binding clusters. J. Mol. Biol. 315(3), 399-407.

288. Zhu, X. F., Liu, Z. C., Xie, B. F., Feng, G. K., and Zeng, Y. X. (2003). Ceramide induces cell cycle arrest and upregulates p27kip in nasopharyngeal carcinoma cells. Cancer Lett. 193(2), 149-154.

289. Zipfel, P. A., Grove, M., Blackburn, K., Fujimoto, M., Tedder, T. F., and Pendergast, A. M. (2000). The c-Abl tyrosine kinase is regulated downstream of the В cell receptor and interacts with CD19. J. Immunol. 165, 6872-6879.

290. Zou, H., Li, Y., Liu, X., and Wang, X. (1999). An APAF-1.cytochrome с multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9. J. Biol Chem. 274(17), 11549-11556.

291. Бергельсон, JI. Д., Дятловитская, Э. В., Молотковский, Ю. Г., Батраков, С. Г., Барсуков, Л. И., Проказова, Н. В. (1981). Препаративная биохимия липидов. Наука, С. 205-210, Москва. •

292. Водовозова, Е. Л. (2007). Метод фотоаффинного мечения и его применение в структурно-биологических исследованиях. Биохимия

293. Дятловицкая Э.В., А.-З. А. (1983). Препаративный метод выделения гликосфинголипидов из тимуса. Прикл. биохимия и микробиология 19,

294. Дятловицкая, Э. В., Кандыба А. Г. (2006). Сфинголипиды в метастазировании и ангиогенезе. Биохимия 71(4), 347-353.

Информация о работе

Молотковская, Ирина Михайловна
доктора биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.03.03

Диссертация

Механизмы ганглиозид-индуцированной иммуносупрессии Т-лимфоцитов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Механизмы ганглиозид-индуцированной иммуносупрессии Т-лимфоцитов ВАК РФ 03.03.03, Иммунология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы ганглиозид-индуцированной иммуносупрессии Т-лимфоцитов"

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Молотковская, Ирина Михайловна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы ганглиозид-индуцированной иммуносупрессии Т-лимфоцитов"

Заключение Диссертация по теме "Иммунология", Молотковская, Ирина Михайловна

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Молотковская, Ирина Михайловна, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизмы ганглиозид-индуцированной иммуносупрессии Т-лимфоцитов
ВАК РФ 03.03.03, Иммунология