Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы действия ультразвука на белки крови и эритроциты

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Механизмы действия ультразвука на белки крови и эритроциты"

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ ИНСТИТУТ ФОТОБИОЛОГИИ

На правах рукописи ИГНАТЕНКО Валерий Андреевич

МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ УЛЬТРАЗВУКА НА БЕЛКИ КРОВИ И ЭРИТРОЦИТЫ

03.00.02 — биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск 1992

Работа выполнена в Институте биохимии АН Республики Беларусь.

Научный руководитель — кандидат биологических наук,

ведущий научный сотрудник И. И. Степуро.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук

С. Н. Черенкевич,

— доктор биологических наук В. Б. Акопян.

Ведущая организация — Институт химической физики

АН России.

Защита состоится « » . . 1992 г. в . .

часов на заседании специализированного совета Д 006.05.01 по защите докторских диссертаций' по специальности «Биофизика» при Институте фотобиологии АН Республики Беларусь, 220733, г. Минск, ул. Академическая, 27.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института фотобиологии АН Республики Беларусь.

Автореферат разослан « . . »....... 1992 г.

Ученый, секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Л. М. Шейко

ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ И АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ

Ультразвук (УЗ)широко применяется в технике,биологии и медицине,а так же как метод исследования строения биол гических обьектов.

Область применения УЗ в медицине постоянно расширяется,и в настоящее и время ->н широко используется в физиотерапии, хирургии, в диагностической практике.

Широкое применение и распространение технических устройств. способных генерировать колебания ультразвуковых частот, постоянный контакт человек с ними требуют исследования механизмов биологического действия УЗ.Влияние УЗ На биологические обьекты многофакторчо и включает механическое,тепловое, и химическое действия.В ¡зависимости . от природы озвучиваемого обьекта преобладающее значение приобретает тот или иной фактор.

Без детального знания молекулярных механизмов действия УЗ практически невозможно определить границы безопасного применения УЗ в терапии;хирургии,диагностике и т.д.

При действии УЗ на водные растворы протекает множество авукохимичеасих реакций, вызванных распадом молекул воды на ОН и Н-радикалы и гидратированный электрон.

Выход свободных радикалов, химических соединений,образующихся в процессе окислительно-восстановительных реакций, зависит от природы растворенного газа, частоты и мощности УЗ . Име-• ется значительное сходство в протекании окислительно-восстановительных реакций органических соединений в разбавленных водных растворах под действием ультразвука и под действием ионизирующего излучения,через образование одинаковых по природе промежуточных продуктов радиолиза и сонолиза воды.

В настоящее время достигнут значительный прогресс в изучении механизма действия УЗ на Клеточные структуры и белки крови.Особенно подробно исследовано действие УЗ на эритроциты и гемоглобин СНв) [Брагинская Ф.И.идр. ,19а";Уегяз1ег А. ,19601

Однако целый ряд вопросов, [касающихся механизма окисли-тельно-восстачовительных превращений Нв,вклада механических, тепловых й свободно-радикальны^ процессов в повреждение макромолекул и клеточных мембран остается открытым.

Цель работы: изучение механизма действия УЗ на ферро- и

(}<?рри- формы Нв , сывороточный альбумии, мембраны эритроцитов и цельные эритроциты.

Основные задачи исследования: - исследовать механизмы протекания в УЗ поле физико-химических превращений ряда форм Нв, отличающихся степенью окисления иона железа, его состояния и природой лиганда,

-изучить роль гема и растворенных в водных растворах Нв газов на изменения гемопротеина при действии УЗ,

-изучить влияние перекисного окисления липидов мембран эритроцитов вызываемого свободными радикалами возникающими в УЗ поле в водных растворах,на гемолиз эритроцитов.

Научная новйана1 Установлена последовательность превращений происходящих с Нв и УЗ поле:

Показано, что тепловая стабильность различных ферро-и ферри- форм Нв коррелирует с их устойчивостью к воздействию гидр<~чсйльных радикалов,генерируемых в УЗ поле.

Ферроформы Нв окисляю' зя в УЗ поле до метНв Без повреждения белковой глобулы.Тепловая стабильность метНв, полученного в УЗ поле или окислением оксиНа химическими агентами, одинаковы.

Установлено,что в УЗ поле из метНв образуется феррипе-роксидная форма Нв, которая восстанавливается в метНв ферро-формами Нв,но не НвСО.а также радикалами алифатических спиртов. Показана защитная роль гема в повышении устойчивости апо-гло-бина к воздействию кислородных свободных радикалов.

Гидроксильные радикалы,генерируемые в УЗ поле и в реакциях ионов переходных металлов с НгРг, вызывают деструкцию белков с появлением флуоресценции в области 440-480 нм.

Показано, что НвОг выступает как антиоксидант в отношении гидроксильных радикалов и аащитдет мембраны зритроцитов от их повреждающего действия. В УЗ поле гемолиз ¡эритроцитов при частоте УЗ 880 Гц вызывается как механическим действием УЗ,так и свободными радикалами.

Практическое значение работы. Показана возможность использования УЗ вместо химических окислителей для подготовки белковых образцов к кислотному гидролизу,проводя окисление

ОН

гемихром П с окислением цисгеина,деструкцией триптофана, гистидина

НвОг-

МетНв

44 гемихром I соответствующий тепловому воздействию

дисульфидных мостиков и сульфгидрильных групп до остатков цис-теиновой кислоты гидроксильными радикалами.

По1юаано, что Fe CED и МетНв катализируют окисление спиртов до альдегидов с учаетвием гидроксильньк радикалов.

Иаготорлена лабораторная установка для удаления Ог иа воды с помощью Нв и быстрой десатурации кислорода из суспензии эритроцитов и растворов НвОгСполучено авторское спидетельство 1632944) .

Результаты исследований ' по изменению антиоксидантных свойств Нв и комплексов Нв с пиридоксапь-Р и другими соединениями могут использоваться в медицинской фармакалогии .экспериментальной биологии для предотвращения повреждающего действия кислородных свободных радикалов.

Апробация работы. Результаты работы доложены и обсуждены

на :

-международном симпозиуме "УБИ0МЕД-5"( Ультразвук в биологии и медицине) Пущино, 1981:

-республиканской конференции "Биохимия нуклеиновых кислот и метаболизм белка", Шнек, 1981:

-Всесоюзном симпоэиуме"Биохеммлюминесценция в медицине и сельском хозяйстве",Ташкент,1986:

-YI конференция по спектроскопии биополимеров, Харьков,1988: -III Всесоюзной конференции"Биоантиоксидант",Москва,1989: -Международном симпозиуме"Мэлекулйрная организация биологических структур", Москва,19В9:

-Международном сиыпоаиуме"МехаШ',змы акустических биоаффек- . тов", Путано, 1990:

-Всесоюзной конференции"Клиническ&й витаминология",Москва, 1991: -Всесоюзной конференции"Фармакологическая коррекция гипокси-ческих состояний", Гродно,1991:

-YII конференц!1и по спектроскопии биополимеров,Харьков, 1991: -совместном заседании, лабораторий института биохимии АН Республики Беларусь, г. Гродно, 1990.

Публикации.По теме диссертации опубликовно 20 печатных работ,получено авторское свидетельство на изобретение,оформлены 4 рационализаторских предложения.

Структура диссертации.Диссертация состоит иа введения, обзора литературы (часть 1),описания методов исследования (часть 2),изложения экспериментальных результатов и их обсуждения (часть 3-7),заключения,выводив и списка цитируемой лите-

ратуры (136 наименований).Материал диссертации изложен на 124 страницах и включает 38 рисунков и 9 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В работе испольаовали: 1. В-аминонафгалинсульфонат(АНС)--(<НТ), билирубин и сыйороточный альбумин человека (САЧ) производства Reanal (ВНР) ¡отечественные препараты 1.10-фенантро-лин, "ч - д. а."; хлорное желеао, "ч^Т"; сульфат желеэаС П), "ч.д. а."; феррицианид калия,"ч.д.а..";серная кислота,"х.ч.";щавелевая кислота, "х.ч."¡гидросульфат натрия, "ч.";этанол, "ос.ч."; пропа-нол,"х.ч.";ацетальгид,"ч";свемеперегнанный 2-4-динитрофенил-гидраэин, "ч. д. а."; радиактивныэ соединения('''О-ацетальдегид с удельной радиактивностью 1 ыКи/ ш, 1-('" С)-¡этанол и 2 -(|ЧС)--этанол с удельной радиактивностью 104 мКи/мл.

Коммерческий сывороточный альбумин человека пропускали через колонку с еефадексом в-100 для получения мономерной фракции.Элюцию проводили фосфатным буфером (рН-0,В;0,01БМ). Опыты проводили с мономерным белком .

ОксиНв получали иа свежей донорской крови.Отмытые трижды 0,15 М раствором NaGl эритроциты подвергали осмотическому шоку в 0,01 М Na фосфатном буфере рН-7,2 с последующим центрифугированием при 16000 об/мин.Для опытов брали супернатант, концентрация белка изменялась в пределах 10-10 М и определялась спектрофотометричееки по оптическому поглощению на 415нм (экстинкция £=125000 М см ).

МетНа получали добавлением к раствору оксиНв в воде или фосфатном буфере (0,015 М,рН 7,0) избытка феррицианида с последующим отделением ниакомолекулярных соединений гельфильтра-цией на сефадексе Б-ЕД.Пероксидную форму Нв получали добавлением иабьггка НгОг к водному раствору метНв.

КарбоксиНв получали пропусканием череа водный раствор оксиНв СО,которая образовывалась при добавлении серной, кислоты к водному раствору муравьиной кислоты;деэоксиНв-добавле-нием к оксиНв гидросульфата натрия или барботированием раствора окисиНз молекулярным ааотом в течение ¡¿0 мин, а также пони-жнием парциональногс давления растворенного в растворе газа . АпоНв получали по методу CRossi-Faneli А.1969], обрабатывая Нв подкисленным ацетоном при 4 С. Для аащиты окисиНв от окисления кислородными свободными радикалами испольаовали цие-

теин,, цлстин, глутатион окисленный, глутатион восстановленный, сывороточный альбумин. Окисление 5-3 и -5Н группы, до остатков цистеиновой кислоты контролировали на аминокислотном анализаторе.

Б качестве ловушек радикалов ОН и Н испольаовали раствори спиртов, концентрация которых изменялась от 0,01 до 1 М. Эритроциты получали из цельной кропи пятикратный отмыванием 0,15 М Ыа01 с последующим центрифугированием при 3000 об/мин. Для опытов взвесь аритроцитов разводили изотоническим раствором МаС1 в 200 раз.

Тени аритроцитов получали осмотическим гемолизом по методике, описанной в работеСЗенгбуш П. 1981]. Перекисное окисление мембран эритроцитов определяли по ТБК тесту [ Владимирове. А. 1972] . При изучении влияния температуры на гемолиз эритроцитов обьеы аритроцитов перед опытами термостатировапи 10 мин в водяной бане.

В работе использовали УЗ частоты В80 кГц от УЗ терапевтического аппарата УПТ-1 с изменяемой интенсивностью ( 0,2-2 Вт/см1!, получаемые с кварцевого излучателя диаметром 4 см. Растворы исследуемых пещгств,подвергаемые действию УЗ волн, помешдли в стеклянный сосуд, закрывали и ставили на кварцевый излучатель УТЗ головки.УЗ головка помещалась в сосуд, через который циркулирует охлажденная вода, подаваемая насосом термостата 1М0 для охлаждения излучателя и облучаемой пробы.

Концентрацию гема в растворе после воздействия УЗ на Нв определяли флуориметрическим методом. В 2 М растворе щавелевой кислоты инкубировали 4-10 мКл На (1 мл при 98-100°С в течение 30 мин). Затем раствор охлаждали и измеряли интенсивность флуоресценции протопорфирина IX. Длина волны возбуждающего света 406 нм (максимум флуоресценции при 618 нм).Концентрацию ионов двухвалентного железа Ре(П) определяли па спектру поглощения комплекса катиона железа с фэнантролином для длины волны бЮнм

Ч -1-1

(экстинкция-1,1 10 М.см). Альдегиды, образовавшиеся при озвучивании водных растворов алифатических спиртов,определяли с помощью ",4-динитрофенилгидрпаина.К меченым ('*())-ацетальдигиду или 2- ('"о-этанолу, (1- (С) -этанолу) добавляли немеченный ацеталь-дегид или этансу! для создания соответствующих молярных избытков по'отношению к белку Количество включенного в состав макромолекулы меченного спирта или подуктов его сонолиаа определяли после отдельния белковых фракций методом гельфильтрации на еефа-

дексе й-Ей.

Альдегиды, обратимо связанные с первичными аминогруппами белка с образованием основания Шффа, определяли восстановительным алкилированием ЫаВН^.Длд этого озвученный водно-спирт'о вой раствор 01сисиНв или метНв обрабатывали НаШ*,. затем прово дили гельфильтрацию на сефадексе Б-25.Определяли ашчшность изотопа в белковых фракциях, используя джжсшювий сцинтилля тор,на радиоктивном счетчике ''Магк-2" (США).

Константы равновесия ассоциации алифатических спиртов определяли по уменьшению оптической плотности полосы поглощения' метНв на 360 нм в зависимости от концентрации*спиртов. Кислотный гидролиз проводили в течение 24 часов при 10Б°0 в 6 н. НС1. УФ-спектры поглощения записывали на регистрирующем спектрофотометре "5ресогс)М-40" (ГДР). Регистрацию флуори-сценции осуществляли на спектрофлуориметре"Аггапсо Воутап(СШЛ). Действие УЗ на растворы, ферро- и ферриформ Нв проводили в атмосфере воздуха.

Усредненную по площади интенсивность УЗ с иалучающей по-□ерхностн определяли по радиационному давлению, измеренному прибором ИМУ-СЗ. •

Спектры КД снимались на спектрополяриметре J-29 (Япония).

Лкиюшадлотний состав белка до' и после воздействия излучения определяли с помощью аминокислотного анализатора "Т-ЗШ" (ЧССР) по методике, описанной в работе^Мооге 3.195В1. Число 5Н групп определяли с помощью реагента Эллмана.

Температуру плавления ферро-и ферриформ Нв до и после действия УЗ определяли но измерениям проводимым на Прецизионном дифференциальном сканирующем микрокалориметре ДАСМ-1М при .скорости прогрева С К/мин. и избыточном давлении 4.1 атм.

11<г02ферро и ферриформ На определяли по графику зависимости образования оксиНв от давления. Для «того использовали специальную установку десагуратор.в кювете которого можно повышать или .понижать давление.Кювету помещали в спектрофотометр и определяли спектры поглощения Нв при уменьшении и увеличении давления воздуха.

ДЕЙСТВИЕ И НА ФЕРРОООРМЫ Нв ЧЕЛОВЕКА В АТМЗМЕРЕ ВОЗДУХА.

Воздействие УЗ на водный раствор мссиНв в атмосфере воздуха приводит к окислению до метНв, что проявляется в ив-

менении спеотра поглощения. Кроме коротковолнового сдвига полосы Соре возникают полосы о максимумом на Б00 и 630 им. Форма спектра и количество полученного метНв соответствует мет11в( полученному окислением той те концентрации оксиНв К5Ре(СМ)6.Обра-боткя раствора метНв, полученного окислением К^еССЮб или в УЗ поле, НаВН<,приводит к образованию девоисиНв, который после пропус!сания через раствор атмосферного воздуха превращается в оксиНв.

Рис. 1. Кинетика убили в УЗ поле в атмосфере воздуха ОксиНв(1),образования метНвСР), деструкции гемина (3), образования оксиНв из метНв после восстановления ИаВН,,(4* .дальнейшего превращения метНв (5) (разность между 3 и 4). Концентрация

го я)

оксиНв 10 М,

Т.нин

исходного

водный раствор, рН=7*, О, е-иэмеряемая концентрация Нв и. гемина, аа единицу принята первоначальная концентрация оксиНв. Интенсивность УЗ- яв'т/см4. .

Кривые,характеризующее связывание кислорода с исходным Нв и Нв,полученным после восстановления МетНв,образованного в УЗ поле ИаВНу,практически совпадают(рис.1).Удовлетворительно совпадают и О*исходного Нв и НВ, полученного из МетНв НаВН*. Как следует из рис.1 и табл.1 в Начальный период оавучивания (3-бмин.)структура молекулы Нв по отношению к связыванию кислорода не нарушена и оксигенвция протекает полностью.

Таблица 1. Иаменение коэффициента Хилла(п) Нв, облученного УЗ.

облуч.раств. +МаВН ч с Рго 02. козф.Хилла ъ'с рН

НВ01 0 14 , .2,7 - 18 6.7

НвОг. + УЗ 300 14 2.7 18 6.7

НвО I + УЗ 600 ' И . 2.5 18 6,7

НвОг * УЗ 1В00 0 1.2 18 6.7

М, интенсивность УЗ-спектрофот;ометрическим способом при

Примечание: Концентрация НвОг-1-Ю -1 Вт/см1 Р^» определяли оксигенации Нв.

ДезоксиНв,а также карбоксиНв, полученный из оксиНв проду'

вашем через водный раствор окиси углерода, под действием УЗ быстро окисляются до ферриНв.

Методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии определена температура денатурации оксиНв, карбоксиНв и метНв, а также метНв после окисления этих ферроформ в УЗ поле.Анали-аируя кривые теплопоглощения, можно заключить,что тепловая стабильность метНв,полученного иа оксиНв и карбоксиНв п Уз поле и окислением оксиНв,праетически совпадают (рис.2).

иОж-К'1

т ■

Рис. 8. Кривые теплопоглощения фер-ро и ферри форм гемоглобина до и после действия ультразвука: 1-Нв02; 2-НвСО ; 3-МетНв; 1'-после 5 мин. действия УЗ на НвО^ 1-после 30 мин. действия УЗ на НвОг;2'-после 30 мин. действия УЗ на НвСО.Снь-1.6 loVl

го »0 ВО 80

Приведенные данные свидетельствуют об отсутствии существенных нарушений в четвертичной структуре белка и 'конформационных изменений при окислении ферроформ свободными радикалами, генерируемыми в УЗ поле.

Добавление в водные р лтворы ряда веществ приводит к защитному эффекту,усиливающемуся с увеличением концентрации спиртов, серосодержащих соединений, а также белков,например,сывороточного альбумина,причем в последнем деструкции,в основном, подвервергаются S-S связи. При достаточно высокой концентрации спирта оксиНв не окисляется в УЗ.поле аа промежутки времени, в течение которых в отсутствии спирта наблюдали полное превращение ферроНв в ферриНв. Добавление одинаковых молярных концентраций указанных выше соединений ловушек вызывало повышение устойчивости НвОгк окислению в УЗ поле.

Вследствие образования из спиртов СО происходит быстрое превращение оксиНв в карбоксиНв. Количество образовавшейся СО мало, но гемоглобин обладает в 200 раз более высоким сродством к СО, чем к 0¡t .

ДЕЙСТВИЕ УБ НА ВОДНЫЕ И ВОДНО-СПИРТОВЫЕ РАСТВОРЫ МетНв.,

Сввучиеание метНв в атмосфере воздуха приводит к образованию новой формы Нв,имеющей характерный спектр поглоще-

нил, идентичный спектру перокеидной' формы миопюбина:

Эта пероксиднаа гемферрильная форма Нв устойчива к воздействию ферр.'цианида калия и не изменяется в атмосфере ааота как оксиНв.имеющий схожий с ней,но более смещенный в длинноволновую область спектр поглощения.Наряду с окислением иона трехвалентного железа в пероксидную форму также происходит окисление сульфгидрильных групп остатков цисгеина до цистеи-новой кислоты,что легко фиксируется методом аминокислотного ,'анализа кислотных, гидролизатов белка. Происходит также разрушение остатков триптофана белка и гема,фиксируемое флуоресцентным методом (рис.3).

Рис.3.Зависимости содержания продуктов деструкции и окисления в УЗ поле от времени облучения: 1-гемина, й-триптофана, З-ци ^теина и образования цистеиновой кисло-ты(4). Методы определения: 1, 2-флу-оресцентный,3,4-аминокислотный анализ. Исходная интенсивность флуоресценции(1,2), а также исходная концентрация(3), принята за

оя

ОН

-Т.ИИН

1,0.Концентрация белка 2 10 М, инаенсивность УЗ-2 Вт/см2

Окисление остатков аминокислот в УЗ поле приводит к изменению структуры белка и образованию необратимого гемихрома. Об этом свидетельствуют как данные абсорбционной спектроскопии, та)« и термодинамические параметры белка. После воздействия УЗ на метНв максимум теплопоглощения сдвигается до 45-Б0 С и близок к максимуму теплопоглощения гемихрома,полученного воздействием на метНв спиртов и длинноцепочечных жирных кислот. При добавлении Н^Ог к ферриНв также образуется феррипе-рокеидная форма Fe(IY), имеющая спектральные характеристики, близкие к спектрам озвученного ферриНв.Следует отметить, что феррипероксидная форма Нв в отличие от миоглобина неустойчива и медленно (в течение 1-2 часов) переходит в метНв,вероятно, вследствие окисления боковых остатков аминокислот белка.Поэтому' спектральные характеристики пероксидных форм определяли непосредственно после воздействия УЗ или Н^на ферриНв рис-. 4.

Рис.4.Спектры поглощений растворов метНв: 1-исходный метНв; es 2-метнв в присутствии H2Ü2B начальный момент времени; 3-то же а5 после 3-хчасов инкубации; 4,5-

после воздействий уз (4) q?s

и в присутсвии 10 спирта(5). Концентрация белка й-10 М, интенсивность УЗ 2 Вт/см?время озвучивания Н202-0.01Б М.

500

20 мин.

£00 Ш

.концентрация

i

.Ют, Л

Если воздействовать Уз на водный раствор метНа в атмосфере азота,то наблюдается восстановление трехвалентного железа в составе гемина до двухвалентного.Следовательно,происходит переход метНв в ферроформу-деаоксиНв,и равновесное соотношение м&аду количеством ^.-рро- и ферриформ составляет 0.25-0.3.В прмсутсаии спиртов наблюдается полное восстановление ферриНв в фйррофориу (табл.2).

Таблица 2. Образование карбоксиНв в водно-спиртовых растворах метНв под действием УЗ в атмосфере азота.

с,,м

0.024 0.122 0.244

метанал

02,%

12.5 19.5 24

О „И Сг,Х

этанол 0.017 32

0.086 70

0.172 72

1.7

100

Примечание: В последнем опыте время воздействия УЗ интенсивности 1.6 Вт/смгпа раствор метНв со спиртом составляло 30 мин,в остальных случаях 10 мин. Концентрация исходного метНо принята аа 100%;С,- концентрация, спирта в растворе метНв,Сг-- количество карбоксиНв.образовавшегося из метНв.

Однако вследствие образования из спиртов в УЗ поле СО происходит быстрое превращение дезоксиНв в карбоксиНв.Так как сродство СО к Нв более чем в 200 раз превышает сродство кисло-.рода,то почти вся образовавшаяся СО количественно связывается с деаоксиНв ..который практически не регистрируется как промежу-

точный продукт.

Сонолиа водных растворов трехвалентного железа н кислой среде хйрастегюу«чтся теш же закономерностями, что и озвучивание растворов метНв (рис.5). В атмосфере азота радикалы спиртов полностью восстанавливают трехвалентное желево в фер~ ро форму.В отсутствии спиртов в атмосфере ааота наблюдается

лишь частичное восстановление ферриформы в фзрроформу вследствие наличия конкурентных процессов, о первую очередь со стороны ОН-радикапов .¡эффективно окисляющих ионы двухвалентного жилеаа;

Рис. б. Восстановление F'e(III) в Feill) при озвучивании водных растворов FeCIj:1-в атмосфере кислорода; 2-в атмосфере азота; 3-в атмосфере азота в -.рисутевии спиртов.

Изменение спектров поглощения МетНв при восстановлении ферриформы ¡3 ферроформу в атмосфере ааота в УЗ- 4-исходный МетНв;5-после воздействия УЗ, смесь ферро и ферриформ; п-№тНв в присутсвии спиртов после воздействия УЗ,форма спектра соответствует карбокснНв. Концентрация белка 2-10 М,-Fed, 2. 6-10 М,

1 3 интенсивность УЗ 2 Вт/см.Спектры а;б записаны после йО мин

действия УЗ. .

Кап известно,координация спиртов происходит с теневым железом по шестому аксиальному положению и равновесная константа сродства возрастает с удлинением углеводородной цепочки . Равновесные константы связывания алифатических спиртов с метНв,определенные спектрофотометричс-ски с точностью до 10%, равны соответственно 0.3:0.6 и 2.0 М для метанола,этанола и пропанола.

При озвучивании метНв в смеси со спиртами как в атмо&^е-ре азота, так и в воадухе наблюдается включение спиртов и их продуктов сонолмэа в состав макромолекулы.При радиолизе и со-нолиэе спиртов наряду с другими продуктами деструкции образуются альдегиды, количество которых , намеряемое с помощью фе-нилгидразина,пропорционально времени озвучивания.Образовавшиеся альдегиды могут взаимодействовать с первичными амино- и SH-группоми остатков цистеина,образуя основание Шиффа и полу-

ыеркаптали.Количество включенных в состав Нв продуктов соноли-аа зависит от времени инкубации озвученной смеси спирт-белок, Добавление в эту озвученную смесь МаВНуПриводит к ковалентному связыванию альдегида с белком (рис.Б).

Рис.6.Хроматографическое разде- Я,стн.еЭ ление на колонке с сефадексом

й-БО раствора содержащего Нв

и

и С -¡этанол; 1 -поглощение на 280 им белковой фракции исходного На; 2-радиоактивность в белковых фракциях оавученного НВ в смеси со спиртом;3-радиоактивность в Нв, полученном из озвученного Нв в смеси со спиртом;4-радиоактивность в белковых фракциях Нв после озвучивания водно-спиртовых растворов и последующей обработки НаВН^;5-радиоактивность в белковых фракциях глобина,полученного из Нв с последующей обработкой N.=¿<¡1,, .

Продукты алкилирования первичьых аминогрупп белка устойчивы к кислотному-гидролизу и выходят в виде отдельного тт между пиками выхода гистидина и аргинина в спектре аминокислотного аналиаа. Добызление'^с -ацетальдегида к.Не с последующим восстановительным алкилированием МаВН^и кислотным гидролизом дает такой же пик по времени удержания в спектре аминокислотного анализа. Отделение гемина от белковой глобулы в кислой среде позволяет исключить вклад радиактивности,связанной с включением в состав гемина меченой СО.

ДЕЙСТВИЕ УЗ НА СЫВОРОТОЧНЫЙ АЛЬБУМИН ЧЕЛОВЕКА.

Спектры кругового дихроизма сывороточного альбумина человека до и после сонолиза показаны на рис.7. Вторичная с^рук-' тура белка, как видно из спектров КД,в дальней ультрафиолетовой области симбатно разрушается с увеличением числа претерпевших деструкцию под действием УЗ дисульфидных мостиков.Вращательная дисперсия й спектре КД в области200-350 нм,соответствующая ароматическим остаткам белка,также уменьшается при, сонолизе белка,что указывает на изменение третичной структуры макромолекулы.Анологичные иаменения в спектрах КД белка выаы-

ваются восстановлением дисульфидных свавей НаВН^или 2-n-wsp-каптоатанолом(рис.7).

V 2

сэ

0

'S Е

-г

'о

■ч

Ш

' ■i

1 JO г

1/; if -i /У tili ' -ICO

A v^j

2Я ! м

МО Я, 10я

Рис.7.Спектр КД . сывороточного альбумина человек (САЧ) (200-250 нм), концентрация белка 1 -10 М, в области поглощения ароматических аминокислот (250-300 нм), концентрация белка 2-10 М и в области поглощения билирубина и AUG (350-500 нм), концентрация белка 2 10 М.связанных с белком; до-1 и после воздействия УЗ -2.Интенсивность УЗ 1 Вт/см*время облучения 30 мин,рН растворов для спектральной области 200-300 нм -6,0 и для 350-500 нм -7,5.

Деструкция относительно небольшого числа S-S мостиков в УЗ поле или их восстановление NaBRyприводит к разрушению центров связывания ряда лигандов и исчезновению индуцированной оптической активности в полосе поглощения связанного с белком хромофора. Например,в спектре КД комплекса билирубина с облученным белком происходит уменьшение величины эффекта Коттона в полосе поглощения билирубина при практическом совпадении положения максимумов полос в спектре КД.

Максимальное число определяемых тиольных групп в белке после сонолиаа с помощью реагента Эллмана было во Есех случаях меньше,чем соответствующее число разрушенных дисульфидных мостиков..Количество разрушенных дисульфидных связей в белке,а также аминокислотный состав белка после сонолиза определяли с помощью аминокислотного анализатора. Реаультаты представлены в табл.3.В УЗ поле" в белке наблюдается наиболее быстрое разрушение дисульфидных мостиков и, в меньшей степени,разрушение ряда других аминокислот,в первую очередь ароматических, таких как триптофан,тирозин.В УЗ поле очень эффективно образуется цисте-иновая ки лота-продукт окисления дисульфидных. связей.

таблица 3.Аминокислотный состав САЧ после действия УЗ и кислотного гидролиза.

II Аминоки-ты САЧ САЧ+УЗ N Аыиноки-ты САЧ CA4t-y3

I Асп 53 53. 6 11 иЛей 8 8.1

п к Тре 28 27. 3 12 Лей 61 57.6

3 Сер 24 24. 3 13 Тир 18 15.0

4 Гли 82 83. 0 14 <Ген 31 30.0

5 Про 24 23. 3 15 Ли а 59 58.0

6 Глу 12 12. О 16 Рис 16 13.6

7 Ала 62 . 65. 6 17 Арг 24 26.1

в Вал . 41 40. 1 18 Цк - 10.6

а Цис 35 20. 9 1В Трп 1 0.6

10 Мэт 6 4. 8

САЧ-исходный.САЧнУЗ-время действия УЗ 15 мин.Цк.-цистеиноьая кислота.Трп-содергкание триптофана определено методом флуоресценции в 6 М гуанидинхлориде. Концентрация САЧ -1 10 М.

Суммируя полученные результаты, можно ааключить, что под действием гидроксильных радикалов,образующихся в водных раст-.порах под действием УЗ,окисляется одна наиболее мобильная ди-сульфидная свяаь,вероятно та же, что восстанавливается NaBH^.

При дальнейшей воздействии УЗ наряду с окислением и деструкцией боковых аминокислотных остатков происходит расщепление полипептидной цепи макромолекулы.

В профиле элюции озвученного белка на TSK-HW5 геле наблюдается появление продуктов меньшей молекулярной массы вследствие деструкции Белка, а так*,е агрегатов большего молекулярного веса,чем мономерный альбумин.

'Аналогичные продукты деструкции САЧ образуются после воздействия гидроксильных радикалов, генерируемыми в - реакциях переходных металлов FetIIII,Cu(II) с Н^О^.

При возбуждении УФ светом (290 ни) белковых фракций,собранных после олюции на геле облученного САЧ, наблюдаем появление кроме полосы флуоресценции триптофана,дополнительного максимума, который не наблюдается в исходном белке.Можно предположить, что данное свечение появляется в белке вследствие окисления свободными радикалами аминокислотных остатков белка. Максимум флуоресценции совпадает с молекулярным свечением, возникающем

при действии УЗ на гистидин

АШ'ЮКСИДАНТНЫЕ СВОЙСТВА ГЖИПв.

При действии УЗ на раствор оксиНв г нейтральной среде образование метНв происходит в основном за счет окисления катионов железа Fe(II) гидрокеильными радикалами.Соединения, яв-ляющиееся эффективными ловушками ОН-радикалов, ош^аывали выраженное защитное действие.Добавление одинаковых молярных концентраций соединений-ловушек вызывало повышение стабильности НвО^ к окислению,что хорошо коррелировало со значениями констант скоростей взаимодействия гидроксильных радикалов с у!сазалнымн выше соединениями.

Повышение температуры озвучиваемого раствора Нв в интер-

О о

вале от 20 С до ад С незначительно влияет на скорость окисления оксиНв в метНв в УЗ поле.

Окисление остатков цистеина в молекуле Нв в основном происходит после превращения оксиНв в метНв (табл.4).Образование цистеиновой кислоты приводит к понижению температуры плавления, а изменения спектра поглошэния свидетельствуют об образовании гемихрома.

Таблица 4.Данные аминокислотного анализа по окислению цистина и цистеиновых остатков Нв до цистеиновой кислоты.

L t,y3 мин. С, с г 0, Сг

без этанола с етанолом

• нгог - 70 30 90 10

H,0/CuS0v - 64.6 35.4 97.8 п о А. . А.

- .10 93.5 5 98.5 1.5

- 20 86.5 13. В 98.5 1

- 30 84 15.9 99 1

ньо2 5 94 4.5 98 5 1.6

НЬОг 15 92.7 4.7 98.4 1.6

Ilb02 45 91.2 8.6 98.4,, 1.6

Примечание:Ь-соединения,добавленные к раствору цистина;С, ,Сг -содержание цистина и цистеиновой кислоты соответственно в %. Исходные концентрации: цистина-2-10 М.втанола 1.29 М,Н202-

-2 -3 -V

1.1-10 М,Си50у-г-10 М,Нв02-Б-10 М.Нв02-через 16 мин. действия УЗ превращается в метНв, с этанолом-в НвСО.

Под действием УЗ,как и при образовании гидроксильных радикалов ионами переходных металлов в реакциях с H20j,micT«H окисляется до цистеиновой кислоты,в присутствии же этанола ато. не происходит (табл.4).

Полученные реаультаты повеоляют предложить использовать оксиНв для определения числа свободных радикалов, возникающих в озвучиваемом растворе,если учитывать,что для перевода одной молекулы НвОгв метНв необходимо четыре ОН-радикапа.

Строя кинетические кривые образования метНв иа оксиНв в УЗ поле при наличии различных веществ, можно оценить роль этих веществ как перехватчиков радикалов.

Эффективность взаимодействия лигандов с радикалом ОН оценивается по отношению констант взаимодействия

К _ [ X ] [ МетНв ]_

Кх ~ С Нв02 1 ( С МетНв0] - [ ^МатНв 3) где К-константа скорости реакции Нв02 с ОН - радикалом, К*константа скорости реакции лиганда с ОН-радикалом, СЮ -концентрация лиганда, С HbOJ-концентрация исходного Нв,[МетНв*1-кон-центрация метНв,образованного под действием УЗ из раствора НвОг, [МэтНв]-концентрация метНв, образованного из раствора НвОгс ли-гандом за одинаковое время действия УЗ.

Полученные результаты позволяют разработать методику оценки эффективности взаимодействия лиганда с. ОН радикалом.

ГЕМОЛИЗ ЭРИТРОЦИТОВ В УЗ ПОЛЕ.

Действие УЗ на взвесь эритроцитов в изотоническом растворе NaCl приводит к гемолизу.Можно предположить,что основной причиной гемолиза является механическое действие УЗ на мембрану эритроцита.В то же время известно,что гидроксильные радикалы, возникающие в УЗ поле,индуцируют перекисное окисление липидов(ПОЛ) ,что тазике вносит вклад в повреждение мембран. На рис.8 представлены кривые УЗ гемолиза.- „д См»се,М Рис.В.Кривые УЗ гемолиза вритро-цитов в зависимости от времени действия УЗ и от концентрации NaCl(5):l-B 0.15М NaCl,2-B 0.30М NaGl,3-B 0.45М NaCl,4-B D.60M KaCl, время действия У3-4с. Взвесь эритроцитов разведена в 200 раз,интенсивность УЗ 0.8 Вт/см.г

С; 5 Ц50 О,« 060

Тс

С увеличенном мощности УЗ, действующего на водные взвеси эритроцитов в 0.15М NaCJ,увеличивается число гидроксилышх радикалов, которые подвергают мембраны эритроцитов дополнительному воздействию.На рис.Ч представлены кривые УЗ гемолиза

при наличии в озвучива-V

/о

.7, От/см*

в зависимости от мощюсти УЗ волн емой среде спирта,цистеина.

• Рис.9.Зависимости УЗ гемолиза

эритроцитов от мощности УЗ: 1-исходные эритроциты, ^-эритроциты при наличии 1М этано- ^ ла,3-эритроциты при наличии Е-10 М цистеина.Взвесь эритроцитов разведена в £00 раз .интенсивность УЗ 2.

0.8 Вт/см,время действия УЗ 4с.

4 получено вычитанием (3) иэП). • М 1.г ie го

После воздействия УЗ на отмытые тени эритроцитов наблюдается образование продуктов ПОЛ.Причем, количество образовавшихся продуктов ПОЛ, определяемое с помошью ТБК теста, возрастало с увеличением времени сонолияа.Цнстин,цистеин, спирты и малых концентрациях оказывали выраженный ингибиторный аффект на ПОЛ.

При длительном действии УЗ на мембраны эритроцитов(до часа) выраженной избирательности в повреждении!*! белков мембраны эритроцитов не наблюдали.С увеличением времени воздействия УЗ на белки мембран эритроцитов наблюдали образование продуктов деградации белков, флуоресцирующие в области излучения 410-450 нм (при возбуждения ЭБО'нм).

В приведенных опытах время гемолиза разбавленных эритроцитов имеет длительность нескольких секунд,в течение которых уровень образования продуктов ПОЛ незначителен.Поэтому можно предположить,что вклад продуктов ПОЛ в гемолиз эритроцитов минимальный и.защитный эффект ловушек свободных радикалов связан с влиянием их на механические свойства мембран эритроцитов.

В этом случае главный вклад в гемолиз эритроцитов вносит механическая составляющая' УЗ волны. ■

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Суммируя полученные экспериментальные результаты,можно пред

положить следующую схему путей превращения ферроформ Нв в УЗ поле п водных растворах. В присутствии спиртов окисление Г-'е(Ш в Fe(Ili) уменьшается вследствие-перехвата ОН радшииюв спиртами и восстанспления метНв в Нв радикалами спиртов.

Н,Н0?ОНч /'НЬ(Н)х х11Д

ВДН мшл, чощ)н

'0г,1УЗ

нго/ Nit#o чнд

Рис. 10.Схема возможных путей превращения ферроформ Нв в водном растворе в УЗ поле.

Наряду с етим оксиНв при действии Уа взаимодействует с продуктами сонолиза воды по схеме:

ОН.НгРг . Н101 пероксидная

Нв -;—»-МетНв а--1 ■■■■■■ ■•■■■■ форма Нв

■ . / \

необратимый гемихром I с 'гемихром!I(окисленные функциона-нарушенной третичной льные группы белка)

структурой ■ ■

Рис.11.Схема взаимодействия Нв02при озучиваши с продуктами сонолиаа воды.

В необратимый гемихром Нв переходит при тепловой денатурации. ,

Гемолиз еритроцитов в УЗ поле происходит за счет действия механического фактора,хотя при длительном воздействии УЗ возможен радикальный процесс повреждения мембран клетки, что наблюдали для теней эритроцитов.

.ВЫВОДЫ

1.В ультразвуковом поле .ферроформы Нв:оксиНв,деэоксиНв, карбоксиНв окисляются до кётНв без повреждения белковой глобулы. После восстановления МетНв,полученного в УЗ поле, НаВН^

или гидросульфатом натрия в деаоксиНв значение параметров связывания О2.С ремой ( ^„Оц, константа Хилла ) и температура денатурации Т^- совпадают со значениями тех же параметров для ипходнсго оксиНн.

".При воздействии гидрофильных радшъгпов и других кислородных радикалов МетНв окисляется до пероксидной фермы, про исходит деструкция триптофанильных остатков и окисление цис-теина, освобождение геминя, а такж; разрушение гема с образованием свободных катионов железа.

3.МйтНн в спиртовых растворах при действии УЗ в атмосфере азота восстанавливается в ферраформу-карбоксиНв.а радикалы спиртов окисляются до альдегидов.

4. В УЗ поле в бел!сах происходит быстрое разрушение ди-сульфидных мостиков и образование циетеиновой кислоты,в меньшей степени-разрушение других аминокислот,в первую очередь ароматических-триптоф.Ана, тирозина.

Б. Показано,что температура денатурации различных ферро-и ферриформ гемоглобина коррелирует с их устойчивостью к воздействию гидроксилышх радикалов,генерируемых в УЗ поле.

6.Предложена схема возможных путей превращения ферро^орм" гемоглобина в водном растворе с образованием МетНв,перокемд-ных форм Нв.гемихрома с окислением остатков циетеина и триптофана, учитывающая участие кислородных радикалов,возникающих при действии УЗ.

7. По^ действием ультразвука в мембранных белках образуются продукты флуоресценции с излучением и длиноволновой области (400-450 нм) при воабувдении Я=350 им и инициируется ПОЛ

о мембранах эритроцитов.

СПИСОК РАЮТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1.Иг'натенко В.А.,Степуро И. И. , Куанецоь. В. К. Действие ультразвуковых колебаний на сульфгидрильные группы белков. //Тезисы 1 Гродненской обл.конф молодых ученых"Молодежь и научный прогресс" .-Гродно, 1979.-ч.2.-С. 1Й-1.3.

Й.Степуро И И ,Игнатенко В. А.Исследование конформацион-ных перестроек^ сывороточном альбумине,вызываемых ультразву-ко§ыми колебаниями.//Ультразвук в биолог.и мед. (УБИЗМЕД-5): Тез. докл. симпоз.-Пу щино, 19В1. - С. 31-32.

3 ¡1гнатенко В. А. .Кузнецов В.К.. ,Степуро И.И.Сравнительная

Aü.pílrwtipi'ÍOTt'l^ii ^GifiCTSHii уЛЬТроЗБуКа И Vi ИЗJiyЧспМп ¡1S СE<aOpCу точный альбумин. //Ультразвук в биолог, и мед. (УБИОМЕД-5) ■. Тез.г докл.симпоа.- Пушино.1981.-С.30-31.

4. Гайко Т. П., Игнатенко В: А. .Степуро И. И. Внутримолекулярные ошивки пиридоксаль-Р с белками.//Биохимия нуклеировых кислот и метоболизм белка.Тез.респ.науч.конф.-Минск,19В1.-П. Hj

Б.Арцукевич А. 11., Заводник И. Б. .Игнатенко В.А.,Степуро И. И. Сравнение действия ионизирующего излучения, рентгеновских лучей и ультразвука на сывороточный альбумин.//Первый Eíeeco-юзный биофизический сьезд.Tea.докл.стенд.сообщ. Т. 2. -Москва, 1982.-0.313.

б.Степуро И,И. .Игнатенко В.А.,Арцукевич А.Н.,Кукреы М.И. Изучение действия УФ-излучения и ультразвука на сывороточный альбумин.Журнал фиаической кимии.1986.Том LX.-N10. -С.2535-2539.

7.0str-ovsky Y.M., Ignatenko V.A. ,Stepvro I. I. Methemoqlobin--catalysed foi'mation of aliphyatic aldehydes in the presence of hydrogen peroxide.J.Alcohol and Alcohol ism.-1987.-vol. 22. -N3.-P.A9.

8.Митянок H. В., Игнатенко Б.Д.,Степуро И. И.Исследование адуктов пиродоксаль-Б-фосфата с гемоглобином человек флуоресцентным методом.//Биохемилюминесценция в медицине и сельском хозяйстве.Материалы Всесоюзного симпозиума.Ташкент,23-25 апреля, 1986г.-Ташкент.-Издательство "Фан"Узбекской •

ССР.-1987.-С.149-151.

9.Степуро И.И..Игнатенко В.А. .Коновалова Р.В.Действие ультраавука на водные и водно-спиртовые растворы метгемогло-бина. Журнал физической химии.-Том LXXII.-N2.-1988.-C.441-449.

10. ЗаводникИ.Б..Игнатенко В.А.,Кашко М.С., Коновалова Н.В. . Опарин Д.А.,Степуро И.И.Влияние альдегидов на конформа-

цию и функциональные свойства гемоглобина человека.//6 конференция по спектроскопии биополимеров.Tea.докл.11-13 октебря 1988р.-Харьков.-1988.-С.

11.Игнатенко В.А.,Коновалова Н.В.,Степуро И.И. ,Ба-ринов В. А. ,Арабей С. М. .Егорова Г. Д.,Соловьев К. Н. Действие, ультразвука на ферроформы гемоглобина человека.КурНал физической химии .-TomLXII.-N9.-1 9.80 .-С. 2468-247в.

12.Степуро И.И.,Игнатенко В.А.,Янчуревич А.С,ИНги-бирование реакций перекисного окисления липидов мембран эритроцитов в ультразвуковом- поле ионами железа. Ультразвук в

сельском хозяйстве.-М.-19ВВ.-С. 47-48.

13. Игнатенко В. А,, Лапшина Е. А. „Янчуревич А.С. ,Сте-пуро И.И.Перекисное окисление липидов мембран эритроцитов при воздействии ультразвука.//3 Всесоюзная конференция Биоантиок-сидант.Теэ.докл.,том 1,27-28 июля 1089г.-Москва.-С.101-102.

14.Ignatenko V.A. ,Stepuro 1.1. ,Konovalova N.B .Borisyuk M.V. The dependence of stability of erythrocyte membranes on the hemoglobin ferri-ferraforms ratio under oxidation hemolysis оГ erythrocytes.//Int rnational symposium Obstract book."Molecular organisation of biological structures" Moscow,June 19-24.-1989. -A-4-16.-p.69.

15.Ignatenko V.A..Zavodvnik I.B..Stepuro I.I.,Kuznetsov B.K ,Lapshina E.A.The role of free radicals in Erythrocyte Homolysis induced by ultrasound.//International symposium MechanisnK of acoustical bioeffects Abstracts 14-18 Мзу 1990, Pushchino VS3R. -P.26.

16. Игнатенко В. А.,Кукреш M. И. .Варинов В. А., Ворисюк

М.В.,Степуро И.И.Гемоглобин как антиоксидант в отношении кислородных свободных радикалов.Система транспорта кислорода. -Гродно.-1989.-С.38-45.

17.Степуро И.И.,Игнатенко В. А. ,Опарин Д.А.Образование альдегидов из спиртов под действием пероксидной формы гемоглобина

2+ „ 2+

и гидроксильных радикалов, генерируемых ионами Си и Fe в присутствии HjP^Журнал физической химии.-Т.LXIV.-1990.N7.-С.1774-1782.

18.Степуро И.И. .Игнатенко В. А. .Опарин Д. А.Восстановление метгемоглобина в ультрааг уковом поле метеленовым синим и спиртами.Биофизика.-Т.36.-199^ -N2.-С.373-374.

19.-СтеПуро И. И.,Игнатенко В. А. ,Сушко Л. И., Чайковская Н. А. Роль гемоглобина в стабилизации эритроцитов при воздействии свободных радикалов кислорода и легкоокислякшщхсй соединений. //Фармакологическая коррекция гипоксических состояний.Мат. 2-ой Всесоюзной конференции.-Гродно,1991.-С. 480-481.

20.Птепуро И. И., Игнатенко В. А., Катко М.Ф.,Тиунов Л. А., Варинов В. А. Авторское свидетельство N1632944 "Устройство для очистки жидких и газовых ' сред от кислорода"Бюл. по H3o6peT.CCCP-N9.-1991.-С.б. - -

Подписано в печать 20.05.92г. Формат бумаги 5üx84 I/I6. Бумага типЛ'1. Печ.л.1. Тираж 100. Зак.1785. Бесплатно.

Ротапринт типографии БелИИКТа,246022,г.Гомель,ул.Кирова, 34.