Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизм вызываемого ацетилхолином долговременного восстановления работоспособности френико-диафрагмального препарата крысы

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Механизм вызываемого ацетилхолином долговременного восстановления работоспособности френико-диафрагмального препарата крысы"

рг Б Ой

2 3 ОПТ 1995

САНКТ-ПЕ .'ЕРБУРГСКИИ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ университет

Н* лрыак рукописи

Лопатина Екатерина Валоитихоана

МЕХАНИЗМ ВЫЗЫВАЕМОГО АЦЕТИЛХОЛИНОЯ ДОЛГОВРЕКЕННОГО ВОССТАНОВЛЕНИЯ РАБОТОСПОСОБНОСТИ «РРЕНИКО-СИАРРЛГНАЛЬНПГО ПРЕПАРАТА КРЫСЫ

03.00.13 - физиологи* -»ловок» и хиаоткм;«

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискшш» ученой степени кандидата биологических наук

Сенкт-Петервург 1995

Работа выполнен* а нвучма-иас/ивдаввтвлцоком институте физиологии им,А.Д.Ухтомского Санкт-Петербургского государственного университета

Научнмй руководитель: доктор медицинаких наук, профессор, Д.П.Катвакин

Официальны« оппоненты; доктор медицинских наук, профессор, акад.РАЕН Р.С.Орлоэ

доктор биологически* наук, профессор, Г.А.Наоледов

Воду «ее учреждение - Институт физиологии им, И. П, Пав лова РАН

. \Ь . иа-аЪчхД 1995 г. в__М&

_ _ _______________г лса «п ла__—.

Эацита состоится « \ V » 1995 г. в ЛУЗ час,

на заседании Диссертационного совета К 063.37.09 по защите диосертаций на соискание ученой степени кандидата биологических на/ж при Санкт-Петербургском государственном университете <1ЭУ034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, ауд.90).

С диссертацией можно ознакомиться * библиотеке им.А.И.Горького Саикт-Петврйургккого государственного университета.

Автореферат разослан * * 199В года

Ученый секретарь Диссертационного освета кандидат биологических наук

А.Г.Марков

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследовануя, Одной иэ форм нарушения передачи возбуждения о нерва на скелетную мышцу является частичный блок, развивающийся в процессе длительней активности нервно-кишечного аппарата. Этот процесс прогрессирующего снижения рабстоспособ-ности скелетной мышцы в коде длительной стимуляции известен как феномен утомления.' Изучение мехгшиэмов периферического утомления - актуальная проблема современной нервно-мыюемной физиологии (см. обзоры: Нанукям, 19В4! Vesterblad et al,, 1991; Pitts, 1994). Одной иэ причин утомления является накопление в межклеточном пространстве работающих мыгсц клеточный метаболитов, ионов калия и аце-тилхолина САХ). В настоящее время довольно подробно изучено роль, которую играют в утомлении ионы калия <Clausen et »1., 1993) и некоторые метаболиты. Менее понятна роль естественного медиатопа АХ, который помимо собственно недиотррного действия может модулировать синоптическую передачу, изменяя чувствительность хеморе-цептивной мембраны мышечного волокна (Гиниатуллин и др. , 1ЭЙ61 Магаэаник, 19ВЭ; Hartzell et al,, 1973; Glavinovic, 1991) и освобождение медиатора иэ двигательных нервных окончаний (Никольский, 1990: Зефиров, Шакирьянова, 1992! Неvron st al., 1966; Weeoler, 1989; Wilson, Torneen, 1991). Громе этого,, хорошо известно, что АХ вообще обладает широким спектром действия на самые различные системы клеток СГоликов и др., 19ВЗ).

В лаборатории нервно-мышечной физиологии ФИИИ им.А.А.Ух» томского СПбГУ Сэав.проф. Д.Л.Матшшкии) в течение многих лат детально исследуются механизмы действия иснов калия и АХ на нерв-но-мьгаечнур передачу позвоночных (Шабунова, 1973; Кривой и др., 1987; Иатюшкин, 1900; 1994; Katyushkin e-t al., 1984). Недавно сотрудниками чаборатсрии (Кубасов, Кривой, 1993) был обнаружен новый феномен: было показано, что редкие короткие татаниэации двигательного нерва -приводят к вооетакоаленнию работоспособности непрерывно утомляемых непрямым раздражением изолированных мычц о ингибированной ацетилхолинэстераэой САХЭ). Этот эффект устранялся никотиновым и мусхериновым холинолитиками и воспроизводился поело кратковременного добавления в раствор экзогенного АХ в низкой концентрации. Было высказано предположение, что восстановление работоспособности кыац связано о накоплением в них медипгорного АХ.

- г -

, у радами исследования. Цельп данной работы являлось детальное исследование механизма восстановления работоспособности утомляемых мышц после применения экзогенного АХ. Исходя иэ этого, ставились следующие задачи Г

1. Определить локализацию аффекта АХ Ссинаптичаское звено» механизм генерации мышечных потенциалов действия, электромеханическое сопряжение, сократительный аппарат?.

2. Оценить возможную мишени для АХ в механизме его "последействия" СН-« И-холинорецептор, ионный канал, ферментная система и т.п.5 и вероятные внутриклеточные пути развития эффекта.

3. Исследовать конкретные механизмы реализации Эффекта •последействия* АХ.

Научна^ ^овиэнр. В опьггак на изолированных нервно-мышечных препаратах диафрагмы крысы с иыгибираванной АХЭ впервые детальна исследован феномен длительного повышения работоспособности утомляемых раздражением нерва мышц после кратковременного действия АХ . в низкой концентрации. Установлено, что в ходе этого повышения работоспособноети мышц параллельно с усилением сокращений увеличивалась и .амплитуда суммарных мьюечных потенциалов действия; амплитуда и длительность внутриклеточных потенциалов действия мы-«ечных волокон и сила сокращений в ответ на прямую стимуляцию мыши при этом не изменялись, что свидетельствует о синаптической природе эффекта 'последействия* ЛХ. В ходе усиления работоспособности мышц после применения АХ амплитуда и длительность спонтанных адноквантовьм ответов на изменялись, но наблюдалось увеличение амплитуды » квантового состава вызванных потенциалов концевой пластинки, что, видимо, лежит в основе повышения гарантийного фактора синоптической передачи. Такое повышение квантового состава передачи обнаружено и описано впервые. Усиление работоспособ-кости наблюдалось также поело применения карбахолина, но не И-агониета окоотреморина; отсутствовало на фоне Блокаторсв и Н- и К-холинорецепторйв тубокурарина и скополамина, иэ чего следует, что клеточной мивеныо » этом'эффекте служат не обычные пре- или поетсинзлтичеаки» холинорецепторы. Впервые показана, -что гиперпо-ляриэация внесинаптичеокой мембраны мышечных волокон на 2-Э мВ, наблюдаемая в ходе кратковременного добавления АХ в раствор, сохранялась в течение длительного времени пооле удаления АХ. Эта следовая гиперполяриаация отсутствовала на фоне оуабзина, что указывает ня ее связь о активацией Ма/К-АТРизы. Ив фоне действия

- Э -

блокаторов и Н- и М-холинорвцепторо» описанная слелстаа гиперпо-ляриэация (как и повывение работоспособности мы«ц) на наблвда-лась. Долговременное повышение работоспособности мышц и "следовая" гилерполяриэация пышечных во юяон полностью воспроизводились на (рона блокирования цАМФ-эависимоО протеинкинаэм А толбутвнидом, но отсутствовали а условия« блокирования освобождения кальция иэ внутриклеточных депо гепарином, что позволяет предположит* участие в этих Эффектах внутриклеточного кальция и регулирующих его уровень мессснджеров■ Таким образом, работоспособность «ищи повышалась АХ только тогда, когда в таких же условиях наблюдалась и следовая гиперполяриэация ньгаечных волокон. Это позволило эак1-лпчить, что в основе "последействия" АХ лежит длительное повышение активности Иа/К-АТФаэи, которая, возможно, и является иивенью для АХ. Предполагается, что кратковременное добавление АХ в рос-вор вызывает долговременное, опосредуемое уровнем внутриклеточного кальция повышение активности Иа/)С-АТФазу, которое чер-зэ уменьшение концентрации калия в межклеточном пространстве работавших мыщц и увеличение электрогенного компонента приводит к гиперполяризации нервных окончаний, увеличению кг-чнтового состава потенциалов концевой пластинки и восстановлению нормального проведения в синапсах.

1. Эффект долговременного повышения работоспособности утомляемой нервной стимуляцией мыацы крысы о ингибироавнной АХЭ после кратковременного приложения АХ имеет синаптическую природу и обусловлен повывени«»!« гарантийного фактора нерано-яыввчной передачи, :

2. Никотиновые и иускариновые колинорицепторы не является мишеньо АХ в описанном Эффекте повышения работоспособности мышц.

3. В основе усиления работоспособности нышц лежит долговременное увеличение активности Ыа/К-АТФазы.

4. Повышение гарантийного фактора нервно-мывочной передачи происходит вследствие увеличения квантового состава потенциалов концевой пластинки.

Научно-практическая ценность. Получены новые данные, существенно расширявшие представления о механизмах, противодействующий периферическому утомлении, и о той роли, которую может играть ме-диаторный АХ в синаптической пластичности. Эти данные должны учитываться при проседании физиологических и фармакологических

исследовний на нервно-мышечных и других хслинергических синапсах.

Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены на XVII съезде Физиологического общества при РАН СПущино, 1993)1 на заседании квфедры физиологии человека и животных биолого-почвенного факультета СП6ГУ ССанкт-Легербург, 19945! Международной симпозиуме "Биологическая подвижность*, посвященном памяти академика Г.М.Франка СПущино, 1994); на заседании Санкт-Петербургского общества физиологов, биохимиков и фармакологов им.И.К.Сеченова ССанкт-Петербург, 1994).

Реализация результатов исследования. Материалы проведенные исследований в клочены 8 лекционный спецкурс 'Современные представления а физиологии нервных проводников и синапсов* для студентов кафедры физиологии человека и животных СПбГУ. По материалам диссертации опубликованы 4 печатные рабсти.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания методики исследования, результатов работы, обсуждения результатов, выводов, списка литературы. Перечень цитируемой литературы включает источника, иэ них - иностранных ввтсров. Работа иллюстрирована 16 рисунками и 5 таблицами.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Опыты проводили на изолированных френико-диафрагмальных препаратам белых беспородных крыс. Полоску л*?вой полудиафрагмы крысы о входящим в нее нервом помещали в плексигласовую камеру с про. точны» раствором следующего состава <в ммоль/лЭ*. - 137; КС1 - з; СаС1^ - г; НдСГ^ - г; ЫаИС03 - 24; МаН^РС^ - 1; глюкояа -11; рН всех растворов составлял 7,4 - 7,6. Раствор постоянно аэрировали кврбогеном С93Х * 5Х СО^) . Для угнетения активности АХЭ применяли фосфороргвнический ингибитор армии <0,4 нкмоль/л), который находился в экспериментальной камере на протяжении всего

опыта* Опыты проводили при температуре раствора в эксперименталь-о

ной камера +28 С. Нерв раздражали о помочью всасиоаюшегп электрода прямоугольными импульсами длительности 0,1 мсек. Мышцы утомляли, непрерывно раздражая нерв а частотой 1 имп/с. Утомление начинали через 43-60 минут после добавления в раствор армина.

АХ или его агониети добввляли в раствор на 30-й минуте утомления на 15 минут, после чего мышцы отмывали исходным растоорсм. В опытах, а который действие АХ исслсдааали на громе с!-тубакурари-

на, скополамина, гепарина или толбутамида, эти вещества добавляли одновременно с армином и они присутствовали в растворе до конца опыта. Применяли армин, АХ и карбахолин отечественного производства; d-туйокурарин (Orion)! оксотрекорин, скополамин, толпу-тамид и оуабаин С все Sigma); гепарин CSigna или СПОФА, Прага).

Напряжение, развиваемое мышцей, регистрировали с помощью ме-ханотрона в изометрическом режиме. В ряде опытов, наряду с непряным, применяли прямое раздражение мышц через проволочные хлорсе-ребряные электроды, расположены^ перпендикулярно направлению мышечных волокон в районе, максимально удаленном от места вхождения нерва. Этими же электродами регистрировали суммарные мьшечные потенциалы действия СПД) . Запись вели с помощью самописца, осциллографа и фоторегистратора.

Для внутриклеточной регистрации применяли стеклянные микро-лектроды. Мембранный потенциал покоя СМПП) и ГШ регистрировали во внесинаптическом районе мышечных волок он ча расстоянии олала 2 мм от нест нервных разветвлений. Толи концевой пластинки CTKfl) регистрировали методом двухмикроэлектродной фиксации потенциала постсинаптической мембраны. Для фокаль.па внеклеточной регистрации потенциалов концевой пластинки <ПКП) применяли стеклянные микроэлектроды о диаметром кончика 2-4 мхм.

Регистрируемые в микроэлектродкых опытах сигналы оцифровывали аналого-цифровым преобразователем с интервалом 35-30 икс и анализировали on line о помощью ЭВМ ДВК-2. Измеряли величину КПП. а у мьгаечкых Пй и постсинаптических ответов - их амплитуду, длительность восходящей фазы С20 г 80* от пиковой амплитуды) и время полуспада. Квантовый состав оценивали по отношению амплитуд вызванных и спонтанных ПКП СТКП) и по коэффициенту вариации амплитуд вызванных ответов. Результаты экспериментов обрабатывали статистически. Достоверность различий оценивали по критерии Стьюден-та Сt-тест). В тексте приведены средние значения с их ошибками.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИМ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Исследование действия экзогенного ацетчлхолиня на динамику утомления, диафрагмы крысы.

1.1. Действие ацетилхолина и его агонистсв.

Мышцы утомляли а течение 3-х часов, непрерывно стимулируя нерв с частотой t имп/с. Силу первого сокращения принимали за контрольную. Уже через 10 минут утомления сила одиночных сократи-

ний уменьшалась в 4-5 раз, после чего практически не изменялась вплоть до 30-й минуты С20,8х2,£Х к контролю, п=10), когда в раствор добавляли АХ. Через 15 минут действия АХ сила сокращений уменьшалась до 3,4£1,5Х к контролю. Затем АХ удаляли из раствора и сила сокращений не только восстанавливалась до значения, предшествовавшего добавлению АХ, но продолжала увеличиваться, достигая через 2 часа отмываний 56,6£9,5Х к контролю. В опытах без .применения АХ восстановления силы сокращений не было.

Для количественной оценки усиления работоспособности мышц мы , использовали понятие эффект ■последействия". Этот эффект мы оценивали как отношение максимальной силы сокращений в ходе отмывания мьпац в процентах к силе сокращений на ЭО-й минуте утомления (перед добавлением АХ или его агонистов). Таким образом, эффект •последействия* АХ составил 279+.37Х, р>0,99.

При использовании вместо АХ его аналога карбахолина (атомиста Н- и М-холинорецепторов) в концентрации 5-10 мкмольУл Сп»5> через 15 минут его действия сила сокращений уменьшалась в 3-4 раза. В коде отмывания карбахолина также наблюдалось увеличение работоспособности ныац, однако эффект 'последействия" карбахолина составил лить 19ЭД24Х, р>0,95. Если же вместо АХ использовали огонист М-холимарецвпторов оксотреморин в концентрации 1-20 миюль <п»4), не наблюдалось ни оалабления сокращений в его присутствии, ни усиления сокращений в ходе отмывания.

Аля того, чтобы определить возможную локализацию эффекта ■последействия* АХ, в части экспериментов, регистрировали амплитуду суммарных кыаечкьк ПД и силу сокращений в ответ на прямой раздражение мыщц. Оказалось, что амплитуда суммарных мышечных ПД в опытах а применением АХ качественна изменялась так же, как и сил» сокращений в ответ на стимуляцию нерпа: снижалась до 9,0*1,ЗХ к контролю на 30-й минуте утомления и через 2 часа отмывания АХ возрастала до 19,,3* к контролю <п»3) .

- Однократное прямое раздражение мышцы осуществляли через каждые 5-10 кинут прямоугольными импульсами длительностью 10 мс оверхмаксимальной силы на фоне непрекращающейся стимуляции нерва (в паузах между стимулами, наносимыми на нерв). Таким способом мы тестировали 'мышечную* долю а утомлении, развивающемся в ходе стимуляции нерва. Сила сокращений в ответ на такое прямое раздражение мыщц уже к 3-й минуте утомлрния снижалась до 69,0_16,ОХ к контроле Сп°Я). В данном случае за контроль била принята сила

сокращений в ответ на пряную стимуляции до начала утомления. Далее сила сокращений достоверна не изменялась ни при действии АХ, ни после его удаления иэ раствора.

Сила сокращений, тестируемая прямым раздражением мышц. снижалась намного меньше, нежели в ходе непрямой стимуляции. Иэ этого следует, что утомление, наблюдаемое нами при -такой редкой стимуляции нерва, имело отчасти и "мышечкуя" природу» «о в большей степени было связано с нарушениями а нервко-угыоечной передаче, что хорошо согласуется с литературными данными (Никольский, 1974! Никольский, Полетаев, 1977).

Полученные нами результаты позволили предположить, что усиление работоспособности утомляемых мьглц * холе отмывания АХ не связано о какими-либо изменениями о контрактильнон аппарате и электромеханическом сопряжении. . Скорее всего происходило воет -ноаление нормального проведения в части синапсов и, как следствие, увеличение числа мышечных волокон, отвечающих генерацией ПД и сокращением на нервный импульс. То есть в ходе отмива-ния АХ повышался гарантийный фактор оинаптичеокой передачи.

1.2." Действие ацетилхолина на фоне ¿локаторов Н- или И-холинорецептороа.

В следующей части работы мы попытались охарактеризовать возможную мишень АХ в наблюдаемом эффекте восстановления работоспособности утомляемых мышц. Такой молекулярной мишень» могут служить Н- и/или М-холинорецепторы. В диафрагме крысы Н-холиноре-цепторы расположены не только ка мышечкой мембране, но и на пресинаптических нервных терминалях, где наряду о И-холинорецеп-торамц играют роль ауторецепторов (Никольский, 1990; Ш.1аол, 1982; ИеэзЬгг, 1939).

Оказалась | что и на фоне с!-тубокурарина (блокатор Н-холино-рецепторов) в концентрации 13 нмоль/л (п> 3), и на фоне окополаки-иа (блокатор М-холинорецепторов) в концентрации 0,1 мкмоль/л (п»3), эффект «последействия« АХ полностью отсутствовал. При этом к 13-0 минуте действия АХ наблюдалось примерна такое же уменьшение силы сокращений, как и в опытах без применения блокаторов хо-линорецепторов. Это означает, что эффект "последействия* АХ не саяэан с тем влиянием АХ, которое приводит к ослаблению сокращений в его присутствии.

Таким образом, лффект "последействия" АХ, с одной стороны, не имитироэллггя ПГ^Ч'г'М-холинорецепторов, но, с другой сторо-

ны, отсутствовал на фон© и Н- и М-антагомиста. Это позволяет предположить, что мишенью для АХ в Эффекте ыосстановления работоспособности служат нг типичные? Н- и/или М-холинорецепторы» а какие-то другие структуры клеткие обладающие способностью связываться с АХ. Такой миаеньв может быть, например, Кь/К-АТФаза, каталитическая субьединица которой сходна с Н-холинорецептором СБ1тао е! а!.в 1982). Этот фермент активируется ЛХ в низких концентрациях, что вызывает слабую гиперполяриэацию мышечных вола-кон» причен активирующее дейотвие АХ устраняется и Н- и М-блоко-торами (Платонова и др«, 1906; ОХоиЬа еЪ &1., 1979).

1.3. Аэйствие ацетилхолина на фоне толбутакида и гепарина. Обнаруженный нами эффект •последействия" АХ являлся долговременным и развивался в течение 120 кинут после удаления АХ из раствора. Это позволило предположить, что кратковременная аппликация АХ запускает какие-то механизмы на уровне внутриклеточных мессенджеров. Мы попытались оценить доз иэ возможных путей внутриклеточной передачи сигналов, Для оценки роли цАМФ ны использовали блокатор цАМЯ>-зависимой протеинкинаэы А - толйутамид. В других опытах использовали гепарин, препятствующий освобождению кальция иэ внутриклеточных депо,

В присутствии толбутамида С2-200 мкмоль/л; п=5) эффект •последействия" АХ полностью воспроизводился и составлял 309,6+35,4* к 120-й минуте отмывания, В то же время в опытах а использованием гепарина <1 мкмоль/л, п*5) никакого усиления работоспособности мииц ка наблпдалось.

На основании результатов этих оггытоэ можно предположить, что усиление работоспособности утомляемых мышц обусловлено тем, что за время присутствия АХ а растворе запускаются какие-то долговременные внутриклеточные процессы. По-видимому, эти процессы не имеют отношения к цАМФ-зависимой протеинкинаэе А, а связаны, скорее всего« о изменением уровня внутриклеточного кальция. 2. Исследование действия экзогенного ацетилхолина на мембранный потенциал покоя и параметры внутриклеточных потенциалов

действия мышечных волокон. 2.1, Действие? ацетилхолина в утомляемых и неутомляемых мышцах.

МПП регистрировали в ходе утомления мышц на фоне непрерывной стимуляции нерва с частотой 1 имп/с. Перед введением микроэле»кт~ рода в мышечное волокно раздражение нерва на несколько секунд от-

ключали. Сразу после регистрации МПП и ПД раздражение возобновляли о прежней частотой, а микрозлектрод выводили иэ волокно, то есть утомление практически было непрерывны*;. За 30 минут утомления величина МПП снижалась с исходного значения -74,0.10,!? мВ t ( 136 волокон» 6 мышц), до -73,11.0,4 мВ (158 волокон, 6 мышц), то есть всего на 0,9 мВ. Добавление АХ в раствор на ЭО-û минуте утопления вызывало котя и небольшое, но достоверное <р>0,99) увеличение МПП до -75,410,4 мВ il47 волокон, 6 мыиц) через 13 минут действия АХ. Таким образом, гиперполяризация а присутствии АХ составила в среднем 2,3 мВ. Через 60 минут после удаления АХ иэ растиора ги-перполяриэаиия увеличивалась до 3,1 мВ (МПП * -76,21.0,4 мВ; 156 волокон, 6 мышц). 1С 120-й минута отмывания НПП несколько уменьшался (-74,7,10,3 мВ; 156 волокон, 6 мышц), но, тем н» мене«», это значение МПП также достоверно <р> 0,93) превышало исходное (до добавления АХ). Таким образом гиперполяризация кмдочнык волокон сохранялась 2 часа после удаления АХ иэ раствора.

Амплитуда, длительность восходящей фазы и время полуспада ПД отдельных мышечных волокон на 30-6 минуте утомления составляли, соответственно, 92,311,3 нВ: 0,2241.0,007 мс и 0,710.10,022 мс (73 волокна, 6 мышц). Зти параметры существенно не отличались от параметров ПД перед началом утомления и далее не изменялись ни после добавления в раствор АХ, но в ходе его атниаания. Это подтвердило наше? предположение о том, что увеличение амплитуды суммарных мышочныч ПД в ходе восстановления работоспособности мышц происходило из-за роста числе "включающихся* в работу мытпечных волокон, а не из-за увеличения амплитуды им индивидуальных ПД»

В опытах без применения АХ ло утомления МПП мышечных волокгн составлял -72,5*10,3 нЭ (114 волокон, 3 мы«ц>, л на 30*0 минут* утончения -72,2+0,S мВ (124 волокнаt 5 мышц). То есть, так а» как и в опытах с применением АХ, в течение 30 минут утомления МПП снижался менее, чем на 1 мВ. Далее наблюдалась только постепенная медленная деполяризация мьнпечных волокон вплоть до -69,£¿.0,4 С139 волокон, 3 мыфц) чьгроэ 3 часа утомления. Параметры ПД мышеч**. ных волокон и ô этик опытам существенно не изменялись*

В опытах на неутомляегмын мышцах АХ добавляли в раотаор на 90-й минуте действия ермина, что по времени соответствовало 30-0 минуте утомления в предыдуших экспериментах* И в этих опытах че-* реэ 15 минут действия АХ наблюдалось достовернее увеличение МПП с -71,8+0,5 мВ CIS1 волокно, 7 мычц) до -73,9,10,4 м0 С153 волокна,

7 миац). Гиперполяриэация составила 2,0 мВ, та есть примерно столько же, как и а опытах с утомлением. Эта гиперполяриэация не только сохранялась а течение 2-х чесов после удаления АХ, но продолжала постепенно увеличиваться. Так, к 120-й минуте отмывания величина ИПП достигала значения -75,ОАО,1 мВ С149 волокон, 7 мыац> и гиперполяриэация! следовательно, составляла уже 3,2 мВ.

Данные опиты показали, что обнаруженный нами эффект устойчивой гипврполяризоции мышечных волокон после кратковременного воздействия АХ сам по себе не связан с утомлениям (или процессами, которые протекают в мышце на фоне развития утомления). Поэтому дальнеОяее исследование этого эффекта мы проводили только на неу-томляемых нервно-мышечных препаратах.

2,2. Изменение мембранного потенциала покоя мышечных волокон под влиянием ацетилхолина в присутствии оуабаина.

Для выяснения природы вызываемой АХ гиперполяризации мышечных волокон мы исследовали влияние АХ на ИПП на фоне блокатора Na/K-АТФазы оуабаина С20-50 мкмоль/л). Оуабаин добавляли в раствор через 1 час действия армина и он присутствовал в раотворе до окончания эксперимента.

До введения в раствор армина величина КПП составляла -74,8^.0,3 мР С117 волоком, 3 мышц) и далее в коде действия армина но изменялась. На SO-й минуте действия армина КПП составлял -74,0^0,4 мВ С119 волокон, S мышц) и через 30 минут после добавления оуабаина снижался до -66,3x0,6 мВ С127 волокон, S мышц). Такое резкое падение КПП после блокирования Ыа/К-АТФазы связано, по всей вероятности, в основном с устранением электрогенной надбавки КПП и лишь отчасти со снижением ионных градиентов. Далее КПП изменялся в сторону деполяризации более плавно. Так, через 1 чао действия оуабаина КПП составлял -64,2£0,6 мВ (112 волокон, 3 мышц) и в течение последующих 90 минут снижался менее, чем на 2 мВ: до -62,310,0 мВ (123 волокон, 5 мышц). Плавное изменение МПП в этот период происходило, видимо, уже только из-за уменьшения ионных градиентов (в основном, градиента ионов калия). Поэтому в последующих опытах АХ добавляли на 60-й минуте действия оуабаина, когда МПП можно было считать относительно стабильным. Оказалось, что кратковременная добавка АХ (13-20 минут) на фоне оуабаина никак не отражалась на ИПП, величина и динамика которого не отличались от данных контрольных опытов без применения АХ.

Г?ти эксперименты подтвердили предположение о том, что гипер-

поляризация мышечных подокон происходит вследствие повышения активности Na/K-АТФаэы.

2.3. Действие ацетилхолина на фоне влокаторов холинорецепторое. толбутамида и гепарина.

Обнаруженная нами слабая гиперполяриэация мышечных волокон в результате действия АХ может быть следствием активации На/К-АТФа-эы и увеличения электрогенного компонента МПП. Долговременное восстановление работоспособности мыац отсутствовало в наших опытах на фоне Н- иди И-антагониста. Из литературы известит, что активирующее Ne/IC-АТФаэу действие АХ также может быть устранено блохаторами Н- или М-холинорецепторов (Платонова и др.* 1966! Dlouha et al., 1979). Поэтому в последующих опытах мы исиледовали влияние АХ на МПП на фоне d-тубокурарина <13 нмоль/л) или скопа-ламина (0,1 мкмоль/л). Для оценки возможной роли некоторых вторичных мессенджеров в развитии следовой гиперполяриэации так же, как и в опытах с механографией, исследовали влияние АХ не ИПП я присутствии толбутамида <100 мкмоль/л) или гвпшрина <1 мкмоль/л).

Как в присутствии d-тубокурарина (4 мышцы), так и скополами-на (4 мышцы), КПП существенна не изменялся ни при действии АХ, ни при его отмывании. В то же время, в присутствии толбутамида <4 мышцы) наблюдалась точно такая же гиперполяризация мищечной немб-раны через 15 минут после добавления АХ и, более того, точно та-, кое же постепенное увеличение этой гиперполиризации после устранения АХ из раствора, как и я опытах без толбутамида. В с итах с использованием гепарина (4 мышцы) МПП как при действии АХ, так и при его отмывании изменялся только в сторону деполяризации. Результаты этих опытов согласуются с данными, полученными я опытах с механографией, когда Эффект 'последействия' АХ воспроизводился на фоне толбутамида полностью, а при использовании d-тубокурарина, скопаламина и гепарина отсутствовал.

Таким образом, наблюдался четкий параллелизм между Эффектами АХ и их временным течением в присутствии влокаторов холинарецеп-торов, толбутпнидв и гепарина как при регистрации силы сокращений, не целом нервно-мыщечном препарате, так и при внутриклеточной р*1-гистрации МПП отдельным мышечных волоком. Полученные данные позволяют предположить, что длительное "следовое' повышение активности Na/K-ATV&sn ужа я отсутствие АХ, по-видимому, и является тем фактором, который лежит в основе усиления работе-способности утомляемых мышц пойле применения АХ.

Возможно, Ма/К-АТФаээ сама является мишенью для ЛХ в механизме повышения гарантийного фактора синаптической передачи. Поскольку следовая гиперполяриэация отсутствовала на фоне гепарина, она каким-то образом может быть связана с выходом кальция из внутриклеточных депо.

Э. Исследование действия экзогенного ацетилхолина на спонтанные и вызванные потенциалы и токи концевой пластинки.

3.1. Внутриклоточная регистрация.

Опыты с внутриклеточной регистрацией МТКП проводили на неу-тонляеммх мышцах. Мембранный потенциал фиксировали на уровне -70 мВ. До аппликации АХ амплитуда* длительность восходящей фазы, время полуспада и коэффициент корреляции между амплитудой и временем полуспада *гв составляли, соответственно! 3,87^.0,61 нА; 0,38740 .,03 не; 1,29^0,07 на\ 0,511.0,07 (п»Ю). В присутствии АХ и в ходе его отмывания в течение 2-х часов параметры МТКП достоверно не изменялись. Влияние АХ на амплитуду и временные параметры одноквантевых ответов не наблюдалось и в опыте с длительной внеклеточной регистрацией ИПК'П. По-видимому, АХ в концентрации 0,1 мкмоль/л за 19 минут действия не оказывал заметного влияния на состояние пзстсинаптических Н-холинорецепторов. Важно, что после кратковременного приложения АХ отсутствопали *следсвые* изменения в виде десеноитизации или постсинаптической потенциации, наблюдаемы*?, например, в мыгаце лягушки после 15 минутной аппликации АХ в концентрации 2 мкмоль/л (Гиниатуллин, 1992).

Вызванные ТКП регистрировали в ходе непрерывного утомления в обездвиженных поперечной перерезкой мышцах (через 2-3 часа после перерезки). Мембранный потенциал фиксировали на уровне «-20 ! -40 мВ. В этих опытах не всегда удавалось достичь полного обездвиживания кыац. Это приводило к постепенному повреждению мы-дечного волокна, увеличению поддерживающего тока, ухудшению ус ювий . фиксации потенциала и искажению параметров ТКП в ходе 2-3 часов регистрации в одном волокне. Поэтому результаты этих опытов об иэненении амплитуды и квантового состава ТКП однозначно интерпретировать затруднительно.

По-видимому, поперечная перерезка является неудачным для данных опытое методическим приемом. Мы полагаем, что калий, накапливающийся в ходе утомления в околаклеточном грсстранстве поврежденного иикроэлектредами и деполяризованного перерезкой мышечного волокна, может активировать Иа/К-помпу и делать ее не-

чувствительной к АХ. Калий также может оказывать сложное двуфаэ-ное (в зависимости от концентрации) действие на квантовый состав ПКП (Шабунова, 1973; Матюшкин, 1980; Ка1уиьЫс1п et а1., 197В). Кроме того, активность Иа/К-помпы зависит от мембранного потенциала (Бадаг, Евкоипк!, 1994) и в деполяризованных нервных и мышечных волокнах дейптвие АХ может иметь непредсказуемые особенности. Поэтому далее мы использовали неиноаэивную методику внеклеточной регистрации в меперерезэнных мышцах.

3.2. Внеклеточная регистрация.

В этих опытах для обеэдвиживпмия мышц повыпали концентрацию ионов магния в растворе до 13 умоль/л (концентрации других ионов не изменяли). ПКП регистрировали в ходе непрерывной стимуляции нерва с частотой 1 имп/с, а МПКП - непосредственно перед началом стимуляции нерва и сразу же после его окончания. АХ добавляли через 30-60 минут стимуляции нерва.

Амплитуда ПКП через 15 минут действия АХ снижалась с 363^63 мкВ до 25'^+£0 мкВ <п«7>. Сразу же посла начала отмывания АХ амплитуда ПКП во всех опытах начинала увеличиваться и уже к 30-й минуте отмывания возрастала до 47(3+89 мкВ (на 30,417,7 X, р>0,99) и далее практически не изменялась. К 1 часу отмывания, а иногда доже раньше, появлялись мышечные ПД, которые "маскировали" ПКП и делали затруднительной автоматическую обработку их параметров. До начала стимуляции черва амплитуда, длителытость зосходяшей фазы, время полуслова и величина "г* МПКП составляли, соответственно " 143 + 41 мкВ; 0,299.4.0,032 мо; 1,04.2.0,11 но; 0,51+0,03, и не изменялись после прекращения стимуляции! 137£Д9 мкВ; 0,3031Р, 033 Но; 1,0910,13 мс; 0,6710,03.

Из сопоставления амплитуд вызванных и спонтанных ПКП оледу-ет, что в основе увеличения амплитуды ПКП после действия АХ лежит увеличение их каантового состава. Этот писал подтвердился при рассчете квантового состава по коэффициенту вариации амплитуд ПКП. По-видимому, усиление работоспособности мышц, наблюдаемое в период отмывания АХ и связанное, как мы установили, с повышением гарантийного грзкторп синаптическоС» передачи, имеет пресииапти-1 ческую природу и обусловлено увеличением квантового состава ПКП.

- 14 -ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные нами исследования показали, что восстановление работоспособности утомляемых мыши с ингибированной АХЭ после кратковременной аппликации АХ обусловлено долговременным "следовым* повышением активности Na/K-АТТпэы и увеличением гарантийного фактора нервно-мышечной передачи. Последнее не связано с изменением чувствительности лостсскаптическсй мечбраны, а определяется увеличениегм квантового состава ПКП. вероятной причиной которого является гиперполяриэация нервных терминалей вследствие активации Na/K-ЛТФезш. Такая гиперполяриэация электрогенной природы в относительно гонких нервных терниналях может значительно превышать 2-Э "В, регистрируемые оо внеоинаптичесаом районе мышечных волокон. В результате гиперполяризации может увеличиваться амплитуда пресинаптических ПД, вход кальция в нервные терминвли и, следовательно, расти хванговый состав ПКП. К гиперполяризаиии при активации Na/K-АТФоэы привадит и снижение наружной концентрации калия, накопление которого является одной из причин утомления (Ма-Тиикин, 1980: SJogaard, 1990; Sejerotcd, 1992), Как недавно было установлено, активация Яа/К-АТФаэы инсулином и катехоламинами, приводящая к нормализации ионных градиентов в утомлязмых мышцвх, может быть аюсным механизмом восстановления их работоспособности (СЛаииеп et аХ., 1993! Clausen, Nielsen, 1994). Судя по изменению КПП и параметром мышечных ПД, накопление калия в межклеточной irpivx* поверхностных волокон а ходе утомления в наших условиях невелико. Сднахо в глубине мышц накопление калия может быть существенном. В этом олуча» при снижении концентрации наружного калия его негативное влияние на квантовый состав ПКП меняется на положительное "специфическое* {ШаЙукова, 19735 Матпшкин, 1980; Дойре-цаы и др., 1987; CcoIce, Ouestsl, 1973). Вероятной мишенью АХ является Ма/К-ЛТФаэ.т, но конкретный механизм долговременного повы-аени* ев активности остается не ясным. Можно лишь полагать, что в этом механизме участвуют вторичные мессенджеры, сопряженные с внутриклеточным кальцием,. Полученные данные согласуется с современными представлениями о роли АХ в саморегуляции нервно-кышечной передачи. Применяемая нами концентрация АХ близка к уровню АХ в синаптичеокоС цели при илтактной АХЭ СЗоронин, 1990; Vysleocil et al., 1983; Nltcoleky et al., 1994), что позволяет считать обнаруженный механизм 'последействия" АХ реальным и в естественных условиях.

- 15 -ВЫВОДЫ

1. Кратковременное добавление экэогеннсго АХ СО,I мкмоль/л) ■ раствор вызывает длительное усиление одиночных сокращений непрерывно утомляемой редким раэдражсниам нерва диафрагмы крысы с ингибированной оцетилколинэсторазай,

2. Параллельно с: усилением сокращении увеличиваете« амплитуда суммарный мышечным потенциалов действия, тогда как амплитуда внутриклеточных потенциалов действия мычидчных волокпц и силл сокращений в ответ на прямую стимуляцию мышц ни изменяйте»:. Это свидетельствует о синаптической природе 'поалвдейогвия* АХ <о повышении гарантийного фактора синаптичоской передачи).

3. Амплитуда и длительность спонтанных адноквлнтош^х ответов в коде отмывания АХ не изменяются* В основе покьлпмшя гараитайного фактора синаптической передачи лежит увеличение гоантовог-о состава и амплитуды ПКП.

4. Долгопрг?меннгх» повышение работоспособности мышц полностью воспроизводится нл фане блокирования цАКФ-эависиной притоинкима^ы А толбутамидсм, но отсутствует в условиях блокирования гепарином системы освобождения кальция иэ внутриклеточных депо, что указывает на связь этого эффекта о повышением урсьмй внутриклеточного кальция.

5. Эффект повышения работоспособности наблюдаемся также пооле применения карйаяолина, не воспроизводится Я-агонистом оксотрскорином и отсутствует на фоне и Н- и М- антагганист'-ч <ту-бокурарин, скополвмин>, и» чего следует, что оба типа холиноре-цепторо*» не? ягляются мишгныо ЛХ в ^тон гнрфчкто»

6. Кратковременное добавления АХ оызнэзет гиперп^лярумии,!) внесинаптической мвнбрэны мышечных иолокон 'на 2-Э мВ. которая сохраняется и даже возрастает а течение длительного првиищ после удаления АХ. но атаугствавувг на фоне оуайаина, что указывает на ■ электрогенную природу этой гипегрппляриэаиии валедствие активации Ма/К-АТЧ>апы. ' '

7. Следовая гиперполяризация, ток же как и повышения рабэ-;, тоопособности мышц, наблюдается не (рана толбутамида, но' отсутствует на фоне тубокурарина.. схополамина- и гепарина. Это подтверждает, что в основе жрфчкт« "последействия* АХ лежит увеличение активности На/К-АТФяэы, а сам этот фермент является еоз--ножной мище?ныо АХ.

О. Кратковременное добавление: АХ а раетвор рьомвае? долгов-

ременчоа, опосредуемо» через уровень внутриклеточного кальция, повымение активности Na/k-АТФаэы, которое за счет увеличения электрогенного компонента и уменьшения концентрации калия в межклеточном пространстве работающих мышц приводит к гиперполяризации нервных окончаний) усилении) квантового освобождения медиатора и восстановлению нормального проведения а синапсам.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кривой И.И., Кубасов И.В.. Лопатина Е.В. , Сей Т.П. Восстановление работоспособности утомляемой диафрагмы крысы после действия экзогенного вцетилхолина. Тез,докл. 17 съезд Фиэиол.общества при РАН, Пувино, ноябрь 1993// У спеки фиэиол.наук. 1994, T.2S, вип.Э, С.60.

2. Кубасов И.В., Кривой И.И.» Лопатина Е.В. Исследование влияния экзогенного ацетилхолина на эффективность нервно-мышечной передачи в утомляемой диафрагме крысы // Бюлл.экспер.биол. и мед. 1994, т. 113, N 11, с.457-459.

3. Кривой И.И., Кубасов И.В., Лопатима Е.В. Исследование восстановления работоспособности утомляемой диафрагмы крысы после применения экзогенного ацетилхолина // Фиэиол.журн. им.И.И.Сеченова. 1994, 1.80, N 9, U.61-6S.

4. Matyushkin D.P., Drabkina Т.К., Krivoi I.I., Kubasov I.V., Lopatina E.V., RadaJutcevAch V.K., Romanovsky D.Yu. , Sel T.P. Rcgula-tlon at efficiency of fatigued muscles medlated by eubstnnces of nervoue and muscular origi-n. '! Biological Motility Int.eymp,, Pushchi.no, 23 sept.-l oot. 1994- Abstráete. • Pushchj.no. 1994. p.126-127.