Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизм ингибирования фторидом алюминия и вакадатом Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Механизм ингибирования фторидом алюминия и вакадатом Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума"

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ

На правах рукописи

УТл'ГАЛИЕВА Раиса Сакгагановна

МЕХАНИЗМ ШГИЕИВДВАНИЯ ШТОРВДОМ МИШ И ВАНАДАТОМ Са-А1М315 САМ0Ш1АЗЖГИЧЕСК0Г0 . " РШПШША

03.00.13 - физиология человека и животных 03.00.04 - биохимия

Автореферат,' диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Алма-Ата 1993

• . .! ГОСУД* 1' ' !

- Работа-выполнена в ^щщррщ^кзиологии мембран Инстпс физиологии АН Республики Казахстан

Научный руководитель - доктор биологических наук,

профессор Есырев 0„В„

Официальные оппонента: доктор биологических наук,

профессор Септов З.С.

доктор биологических наук, профессор Булек >аева Л.Э.

Вздудае учреждение Институт молекулярной биологии

и биохимии имоАйтхокина М.А. АН Республики Казахстан

Защита состоится ' / ■ , 1993 г. б_часов

на заседании специализированного совета К.008.21»01 при Институте физиологии АН Республики Казахстан по адресу: 480032, г.Алма-Ата, Акадеигородок, Институт физиологии.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии АН Республики Казахстан.

1В9:

Автореферат разослан 'г . ^гС^/Сь) х993 г

Ученый секретарь Специализированного совета л ^ п

лихи ^.и-и*./ ха л у—>

ичзских наук

шшшда биологических наук /^¡аЧ/у ) Базаралдана II

обшая ШШШСТШк работы

Актуальноеть проблемы. Са-аки;впруе;лая, Mg-завксимая аза (Са-АТз ¿оо^огйдролаза K.J>. 3.6.1.33)(Са-АКаза) является интегральным компонентом Са-пасоса, транспортирует Саг+ из цитоплазмы в лкпеп мембранной системы сарколлаз'дгатического ретшу-лума (CP), используя энергию гидролиза АТ5,и способствует пони-ивяшз внутриклеточной концентрация и расслаблению тшечйою волокла, ¿¡iioroe уае известно о кинетике гидролиза А'йазы дашшм рерментом, а также о его структуре л лершчноЗ аминокислотной последовательности, что.делает Са-АИазу идеальной моделью для исследования механизмов катпонного транспорта, сопряженного с гидролиз о;,i ATi, и влияния на nee различных зкзо- и эндогенных агентов. 3 настоящее время механизмы активного ионного транспорта и агентов на него ьанадата п фторида алюминия, как аналогов фосфата, являзтея предметом пристального внимания исследователей, однако остаются во многом неясными. Ванадат и фторид алюминия представляют самостоятельный интерес как хорошие инструменты для исследования каталитического и транспортного циклов ферментов, образующих при работе росфорилировшшый интермедиат. Лвл..лсь агентам загрязняквдкли окружающую среду, а такае будучи представленными в ;кивотно;л организме, они могут представлять интерес и с физиологической точки зрения как модуляторы Са-на-соса, обеспечивающего лщшечное расслабление, шеханизщ влияния' этих агентов па Са-насос в настоящее вреди недостаточно изучены. Для решения этих вопросов целесообразно использование изолированных 1'ле«;браинцк препаратов CP, который в'условиях in vitro лрэдетапляе? собо^ физиологическую модель процессов регуляции сокращения и расслабления' мыаечного волокна, путем регуляция ъхо;;:-. и выхода ионов Са^ из мембранн. х образований.

Цель и задачи исследования. Целью работа была исследовать роль АТФ-, Фосфат- и Са-с2язывавдих центров Сэ-ДТФазы CP в

в иягибировании ферментативной активности фторидом олзишля и ванадатом.

Анализ состояния исследуемо:: проблыи позволил с;.юр..<:ул;:ро-вать следующие задачи:

I.. Последовать ялияняе ваяадата на кинетические лаушетра Сa-Aüi азы и д-Ы^азы фрагментов СР.

2. Провести кинетический анализ гидролиза Ш я n-í;.¿>j в ирпеутет вии фторида натрия и комплекса фторида аяшангд б препаратах C?.

3. Выяснять влшше фгоряда алшшщя й вападата иа транспорт Са* везикулаж СР.

Научная новизна. В результате впервые проведенного системного исследования механизмов шгибЕроьанйя Са-АТ^азы С? .¿торидо;,. натрия и комплексом пар + AICI3 установлено, что сам фторид натрия вызывает Енгибированке Са-А'йазы, конкурентное по отношению к АТ$. При совместно.« действии ílaP a aici3 ингибктортШ эффект лотепциируется, а само ингибпрование становится сдгеишшыл Данные указывают на то, что ИаР взаимодействует.с ATi-связываю-щш центром, а кошлекс ЯаГ + AlCIg й Pi -связывающим центром Cao Ет формы Са-АТ-йази. Результаты проведенного исследования шикЗировашш ванадатом активности Са-АГ^азы с использованием АТ5 u л-КБй в качестве субстратов указывают на то, что вакадат взаимодействует с Pi -связывающим центром аелвтавдарованиоН ¿ формы Са-АТЗази, появляющейся в транспортном цикле ме;;щу к Ej фортш, с образованием • Va:n комплекса.

Насыщение кальцием высоко- к низкоаяфгшных центров Са-АТ£-азц предотвращает ингибирующий эффект ванадата. Насыщение низ-коарфинных Са-центров углубляет ингибпруюгдий эффект фторида и фторида ашо;.шшя, насыщение высокоаффишшх центров не изменяет аффектов этих агентов.

Теоретическое и практическое значение работы. I) Данные, указывающие на то, что комплекс взаимодействует с РА

связывающим участком Са-АТ&азн, подтверждаю! предположение о подобии, модулирующего механизма действия А1£4~ на ГТВазную активность регуляторных ГТ1?-свяэывавдих белков и на активность транспортных АТ$аз. Эти данные подтверждают представление о возмогеном участии А ТЗ аз в проведении сигнала через мембрану наряду с а-белками и утверждают необходимость изыскания химк-ческих и фармакологических агентов * специфически действующих на проведение сигнала через модификацию ГТБазной и АТЗазноЗ активностей. Эти агенты должны быть одинаково полезны и в качестве терапевтических .средств в клинике определенных заболеваний. 2) Результаты, указывающие на то,' что ванадат взаимодействует с нелигандированной Е формойрасширяют представление о многообразии интермедиагов, появляющихся в транспортном цикле Са-АТ5азы СР, и убевдают в необходимости систематического исследования их физико-химических свойств; Понимание того, что иона ванадата и фторида действуют'на различные интермедиа тные формы Са-АТ£азы прщает уверенность в том, что дальнейшие исследования приведут к разработке мер по реактивации ферментов после ингибированйя их данными нонами. Эти мера могут оказаться терапевтическими средствами в случаях отравления ванадатом и фторидом.

Выявленные механизмы действия ионов фторида, алюминия и ванадата на кальциевый насос саркоплазматического ретикулума долшш рассматриваться как Основа их повревдающих эффектов на мышечнуг систему.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на ХУ съезде физиологов Узбекистана (Ташкент, 133;), I съезде

■физиологов Казахстана (Алма-Ата, I98S), Международном симпозиуме "Транспорт ионов и механизмы его регуляции" (Тбилиси, 1989), на конференциях молодых учешх АН КазСОР (Алма-Ата, 1989).

Структура и объем работы.Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Список литературы включает 230 источников. Работа изложена на 135 страницах, содержит 5 таблиц п 32 рисунка.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для выделения фрагментов СР из скелетных мышц лягушки использовали метод, разработанный О.В.Есыревым и соавт. (1980) Разделение белков мембранных препаратов ретикулума в присутствии додецплсульфата натрия (ДСП) проводили по методу и.к. leommiy (1370). Измерение АТ^азной и Са-транспорткрувдей активностей проводили методом рН-метрии с записью на потенциометре КСП-4 в термостатированной ячейке (Ритов, 1971; Ава-кян и соавт., 1981) объемом 4 мл в среде,' содержащей 100 мМ HaCi (или 100 Щ KCl), 4 ¡/äü MßCIg, 5 Ш оксалат натрия, 2 Ш АТФ, 2,5 мМ имидазол, pH и температуру среды варьировали (pH изменяли добавлением ггаонили HCl). CaCIg вносили в среду в количестве 100 нмаль, белок СР скелетных мышц 30-50 мкг. ATS-азную активность регистрировали также и в той же среде без оксалата натрия, но содержащей твин-20 (0,02/0, KHgPO^j (0-5 М Mg-ATS (0,25-2Ш) и свободный магний (2 м\0. Концентрацию свободного кальция контролировали с помощью Са-ЭГТА-буфера. Активность Са-АТ$азы выражали в мкмоль Фн/мг белка в I мин. Величину Са/АТ£ определяли по отношению количества аккумулированного Са^+ на молекулу гидролизованного ATi>. Концентрацию

б.

Са2* внутри везикул рассчитывали исходя из концентрации окса-лата калия произведения растворимости для оксалата кальция, равного г-Ю-3 М2 (Ilaaaclbacli, Uakinoae, 19бЗ) •

Гидролиз п-нитрифенилфосфата определяли спвктрсфотомет-рически (Bocknan du-6 ) при длине волны 405 шл по накоплению п-нитро$енола в среде, содержащей 100 ш! KCI, 0,03/3 твин-20, 20 Ы&.1 hepes , рН 7,0 При 3?°С (Mcintosh, Davidson, 1984). Концентрации CaCIg, .vigCIg и п-1Ш варьйровати в зависимости от условий эксперимента. Са-независкшй гидролиз П-Н22 измеряли в среде без Са^+ в присутствии 0,5 ы'Л ЗГТА. Са-зависимый компонент гидролиза получали вычитанием Са-незавпсймой активности из общей активности. Активность п-®5азы выражала в мкмоль п-нитро1)енола/?лг балка в I мин. Везикулы CP нагружали по методу H.Masuda и J.de Meis (1974) с некоторыми модификациями. Регистрацию пассивного выхода из везикул CP, предварительно нагруженных оксалатом' кальция проводили рН-метрически в среде, содержащей ЮЗ KCi, 0,5 till ЗГТА, 0,8 ¡&] имидазол. рН 7,0 при 37°С. Регистрации трансаорта Са^+ везикудш/д С? с помощью арсеназо Ш проводили■при длине волны 650 н.ч на спектрофотометре "Beckman DU-б" в среде, содержащей 100 vli KCI, 50 мкМ арсеназо Ш, 10 tin H3PES , 3 MgCI2, рН 0,8 при 37°С, 200 tVKr белка СР.

Концентрации свободных АТ±>, п-НЗ>2 и рассчитывали исходя из величин константы связывания для Mg-AK, равной I-IJ4 ГГ1 (Hasselbach, MakinoBe, 1963) И константы диссоциации ДЛЯ МК-л-ЮЗ, равной 5,88-Ю"3 '«I (Robinson, 1981).

Кинетический анализ ингибирования Са-АТ1>азной и П-Н55-азной активностей препаратов CP проводили согласно М.Диксон и Э.Уэбб. (1Э79). Раствор ионованадата готовили согласно s. ' Vorga и соавт. (1985). Концентрации растворов ."'еС1? и CaCIo

определяла по методу П.П.Коростелева (1981) с некоторыми модификациями. Концентрацию белка СР определяли биуретовым методом (Согпа1 е.а.,1949) в присутствии 1?« дозокскхолата натрия.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

.Характеристика препаратов фрагмантпрованного СР. По данным электронной микроскопии, полученпая фракция С? состояла из замкнутых везикул (пузырьков) диаметром 0,1-0,3 мкм, целые митохондрии и их фрагменты во фракции отсутствовали. Основным белковым компонентом мембраны СР, как было показано, является компонент с моекулярной массой около 100 кЦа. На основании данных полученных по электрофорезу очищенной Са-зависимой А?1>азы данный компонент в мембране был идентифицирован как каталитический полипептид Са~АТ5азы,

о

Для увеличения проницаемости везикул для Са + в среду регистрации ферментативной активности добавляли детергент твин-20 в несолкбилизируащих концентрациях. При этом препараты теряли способность аккумулировать кальций, что способствовало исследовании кинетических параметров фермента. Транспортную активность определяли в отсутствие детергента.

В таблице I представлены количественные и функциональные характеристики препаратов СР, в том числе величина Са/АТР, представляющую собой эффективность транспортной системы, Определение активности Са-АКази фрагментов СР скелетных мышц лягушки при различных температурах в диапозоне от 20 до 40°С, показало, что наивысшая активность отмечается при 37°С.

Таблица I.

Характеристика препаратов С? скелетных шац лягушки ( в скобках указано количество препаратов, р4 0,05)

Выход бел- ¡Количество ¡Активность ! Са/АТ5 ¡Активность Са

ка .'белка Са-АТИОа-А'Пазы ! .'АЮаза в при-

мг/г ткани ¡азы от сб!мкмоль Р /мт ! !сутстзпи твии-

¡щего белка ¡белка мин ! ¡20 0,03,("'«'А')

¡препарата ! ! !

1.2о±0.3о ! 7о±3,3 ! 4.0±0.3 ¡1.62*0.1! 3.1*0.4 (35) ! (7) ! (25) ! (25) ! (20)

Влияние ззнадата натранспорт Са^+ и активность Са-АТ&азп СР_. Ванадат, добавленный в среду регистрации без оксалата, приводил к небольшому концентрационно-зависимому снижению скорости аккумуляции и увеличению количества поглощенного кальция, возможно за счет осаздения кальция. В присутствии в среде оксалата калия снижение скорости аккумуляции было значительно большим.

ыо;шо предполагать, что снижение скорости поглощения кальция везикулами С Р обусловленно ингибирован'ием ванадат ом активности Са-АТРазц, причем степень иигибирования зависит от уровня внутриклеточного кальция. С целью проверки этого предположения были проведены эксперименты на препарат-ас С? с высокой проницаемостью для кальция. Активность Са-АТ2азы, регистрируемая в присутствии твйн-20, ингибировалась ванадатом. Йнгибирование углублялось с: увеличением концентрации занадата и было максимальным (50 и 93%) через I мин реакции при концентрации 10 и 100 мкы, соответственно.

Исследование зависимости активности Са-А?5аза от концентрации свободного Са'44" з среде регистрации показало, что вне-

сенпе в среду ванадата (10 ш&5) резко снижает активность Са-АТ5азы и сдвигает оптимум концентрации Са2+ от 10~° до М-^ М.

Наибольшая степень ингибкрования ванадатом отмечалась в даа-

Л л

пазоне концентраций 5-10""° - 1,5. На препаратах СР с неиз

мененной проницаемостью для Са^+ мы показали, что ингпбиро-вание ваяадатом Са-АИ>азной активности также зависит от концентрации внутри везикул. Повышение концентрации окса-лата, т.е. уменьшение концентрации внутригезпкулярного кальция, увеличивало ингибирующий эффект ванадата. В отсутствие оксалата этот эй-оект ванадата исчезал полностью. Исследование зависимости Са-АТЗазноГ; активности от концентрации Ив-АШ показало бесконкурентное ингибирозание Са-АТ5азы ванада-том в отношении к субстрату 1Ле АТ5.

Таким образом, влияние ванадата на систему транспорта в СР выражается в ингибирозании поглощения Са^+ и активности Са-АТ-5азы. Выявленная зависимость ингибирующего действия ванадата от концентрации кальция внутри и снаружи везикул предполагает участие кальциевых центров в реакци и фермента с ванадатом»

Характер действия ванадата па'тгибировате поглощения и увеличение количества поглощенного кальция за счет энергии гидролиза п-НМ был аналогичен как и в случае исполь-зовашш АТФ. Таким образом, и в этом случае можно предполагать зависимость эффекта ванадата от уровня внутривезикуляр-г него Са2+,

Ванадат не ингибировал Са-зависШ1ую п-Ш>азную активность в нативных везикулах СР, однако в присутствии детергента, который индуцирует выход кальция из везикул, отмечалось снижение активности на 40 и 6о;2 при концентрации свобод-лого Са"+ 100 и 10 мкМ, соответственно. Пнгибирование гидро-

лиза п-1Ш ванадатом было глубяе (на 90) и быстрое раззква- . лось в присутствие ког.ов и в отсутствии диметилсульфок-сида (ДМСО), чем в присутствии ионов Са2*. Следовательно, ионы кальция снизаат иигибирукидай эффект ванадата на Са-завнсимую п-Н!>Зазу.

В среде регистрации, содержащей твин-20 характер зависимости скорости гидролиза П-Н35 от концентра!""! Са^+ был двухфазным, что подобно эффекту, описанному в литератзгре с детергентом Тритоном Х-100 (McIntoBh, Davidson; 1984) . В области низких концентраций Са^+ Kg 5 для активации кальция была равна 2.1-10 Ш, тогда как в области высоких концентрации эта величина составила 1.1*10"° М. С увеличением концентращш ванадат сдвигал кривую зависимости в область более высоких концентраций Са2+ и эта зависимость становилась однофазной с Kg 5 = 3.5-Ю"^ РЛ при концентрации ванадата 20 т<М (рис.1 кривая 3). На графике зависимости активности п-1Г&5азы от концентрации Са2+, выраженной в двойных обратных величинах (вставка в рис Л) контрольная кривая (I) я кривые, полученные в присутствии ванадата (2,3) имеют общую точку пересечения на оси ордпиат, что указывает на конкурентное взаимоотношение мезду Са^+ и ванадатом.-Насыщение низкоаффинных Са-связывавдих центров (с рСа низе 4) предотвращало ингибирование фермента ванадатом. Эти данные свидетельствуют о защитном эффекте кальция против ингибирования ванадатом п-Н1>1>азьи Ингибирование гидролиза п-ПЮ ванадатом углублялось с увеличением концентрации свободного Mg^1" от 1.25 до 13.0 м;.*, в то время как в контроле активность Ьермепта не зависела от концентрации свободного Это указывает на то, что ионы магния необходимы для ингибиро-ванпя ванадатом гидролиза п-ПЗЗ.

1/ч

Рис. I, Зависимость активности п-НФЗазы СР от концентрации ионов кальция. I - контроль; 2- 10 мкМ и 3 - 20 ¿шЛ] вана-дат. Во вставке - та ие зависимость, выраженная в обратных величинах.

Анализ зависимости активности Са-п-НМазы от концентрации показал неконкурентный характер ингибирования ванадатом активности Са-п-НИ?азы ло отношению к субстрату. После удаления ионов Са2+ из среды и добавления ДМСО 'неконкурентный характер ингибирования ванадатом гидролиза п-ШФ сменялся на конкурентный (рис.2а). В этих условиях такие была доказана конкуренция между п-НЙ и АТ$, и п-Ш5 и РА за активный' центр фермента (рис.2б). Отмеченная конг.уренция мак-

Рис.2. Зависимость активности Са-нззависимой п-К55азы от концентрации выраженная в обратных величинах, а: I -

контроль; 2-1 мкМ и 3 - 2 а^ео'Л ванадат; б: I - контроль; 2 -2 ш! Рд ; 3 - 0.5 ¡гМ АТ5.

ду различны™ субстратам свидетельствует и связывании их с одним и тем не центром на ферменте» Наиболее вероятно - это центр фосфорилированил.

Неконкурентная природа ванадатного ингибирования Са-п-Н3>£азы предполагает, что п—Hi>3> и ванадат связываются в каталитическом центре с различными интермедиатными формами фермента. Такими формами могут'быть только формы Се^Ej и. нелиган-дированная Е форма фермента, которые способны фосфорилиро-ваться в прямом и обратном направлениях рекационного цикла, соответственно, п-НитрсфенилЪосфат подобно, нуклеотид^осфату связывается с формой CagEj (схема I). Наиболее вероятной формой, с которой связывается ваиадат в процессе работы фермента, является £ форма. Поэтому ванадат не мешает фосфорилированиа фермента с АТ5 или n-Hí>i> и не конкурирует с субстратами.

Различный характер ингибирования ванадатом Са-н-Нйазы и Са-АТ^азы может быть связан со специфической ролью AT3?, в отличие от п-НФ5,в функционировании каталитического центра Са-АТ5азы СР. Все реакционные группы молекулы АТФ важны в реакции АТ$ с каталитическим центром Са-АТЬазы. ^-фосфатная

2Са

2+

_L

Са

?В

НТР ^ Са

lE-NTP

ATP Mg2+

(1)

Са

(2)

Са

(3)

HDP

_J.—_ :Е~Р

Са

Са

(8)

(4)

*Е

(7)

(6)

(5)

Са

---- *е-Р ■» ^ > :*Е-Р

V ♦?+ Са

[Де нон 2Са ■

Схема I. Основные конформациошше состояния молекулы Са-МФазы.

1з-

группа ATS участвует прямо в фосфорцлировашш фермента, а связывание адепиловой группы и рибозного кольца в каталитическом центре обеспечивает ориентацию ^-фосфатной группы в сторону Asp -351 (центр фосйорилирования) в этом центре (Kubo е.а., 1990; iiignaco, 1990) . Благодаря таким взаимодействием увеличивается сродство для связывания АТ5 в каталитическом центре и ускоряется фосфорилпрование фермента АТЗ. Кроме того, после выделения АД-5 из каталитического центра. 5ермент монет- принимать другую молекулу ATS, которая остается прочно связанной па нуклеотид-связывающей части каталитического центра как регулятор превращения следующих интермедиатов в реакционном цикле Са-АГ5азы (inesi, de Meta, 1989; Seebregta, Me intoah,1989) . Бесконкурентное взаимоотношение между ва-надатом и A Tí обеспечивается связыванием ванадата с дефосфо-рилированной формой фермента, когда АТЗ представлен на нуклеотид-связывающей части каталитического центра.

п-Ш?5 и другие шнорные .субстраты не содержат группы,

которые могли бы обеспечивать оптимальное расположение фосфатной группы субстрата в каталитическом центре фермента и поэтому могут фосфорилировать фермент благодаря их высокой неспецифическои химической реактивности (inesi е.а,, 1980;

Chipman, Gencks, 1988; Teruel, Inesi, 1988; КиЪо е.a., 1990).

Поскольку в сруктуре минорных субстратов нет тех групп, которые могли бы реагировать помимо фоофорилирования и с другими учатскаш каталитического центра, эти субстраты не могут быть регуляторами в реакционном цикле еа-АН?азы, и связываются с ферментом только на стадии фоса^рилирования.

Таким образом, Са-АТ1аза в нелигандированной Е форме может взаимодействовать с Са^+ или ванадатом (или неорганичес-

ким фосфатом),Но не АТ$. Она мояет-быть фосаорилирована энер-годающими субстратами, если только фермент обработать органическим растворителем диметилеульфоксидом. ДГ'.ТСО изменяет гидрофобное ть каталитического центра Са-АТ2азы, увеличивая доступность центра фосфорилирования для различных субстратов (The, Haaselbach, 1977; Inesi е.а., Л980; Coan, 1-985; de Meia, Ineai, 19ь5; Buchet e,a., 1989) , это в своз очередь уравнивает реактивность каталитичесюшгаэ центра в отношении ко всем субстратам и приводит к котуревщп мезду ванадатом и этими субстратами за центр фосфорилирования фермента (см.рис.2).

Направление реакции каталитического цикла Са-АТЗазц от Е формы будет зависеть от лигандов, присутствующих в реакционна« растворе. Взаимодействие" Са^* с Е формой долено превращать фермент в Ej- конформацшо, что направляет-реакцию в сторону гидролиза ATI. В присутствие ионов :;1g2+ взаимодействие Р± с Е формой долкно превращать фермент в Eg конформацшо, что направляет реакцию в сторону синтеза.АТ5. Наконец, взаимодействие ванадата с Е формой в присутствии ионов долкно превращать фермент в конформащи подобную Eg, но намного более стабильную, поскольку сродство фермента к ванадату выше е 10^ раз, чем к ортофосфату (ineai е.а., 1984) ■ . Из состояния Eg*Van фермент может быть превращен в Са2 Ед- форму только после насыщения кальциел низкоаффпнных центров, что подобно пути превращения Е^-Р в обратной реакции.

Таким образом,, пали результаты указывают па то, что в мсяент работы фермента ванадат ззаимодейстзует с нелигандиро-ваннои формой Са-АГФазк, образующейся как промежуточная кон-формация иежду Е^ и Ет формами с образованием стабильного ^ Van -комплекса,- что вызывает мнга<Укрозан&е Са-АЧфагкой активности.

Влияние фторида натрия на транспорт и активность Са-АТ^азы фрагментов СР. С целью исследования действия на активность Са-АКазы СР ионов фтора эксперименты проводились в присутствии дефероксамина (Д5А) изветсного хелатирующего агента для ионов алюминия (Biackmore е.а., 1985) . ДМ препятствует образованию активного ио'яа

При концентрациях НаР до 2 Ш была отмечена стимуляция (около 20/0 транспорта Са^+ фрагментами СР, что, вероятно,, связано со способностью фторида натрия образовывать внутри везикул ретикулума малорастворишй осадок СаР2, подобный оксалату и ортофосфату кальция. В этих условиях повышалась эффективность транспортной системы, т.е. отношение Ca/ATi как результат снижения выхода Са^+ из везикул. При повышении концентраций ITaP выше 2 м:Л скорость поглощения Са^+ снижалась, что обусловлено ингибированием Са-АТЧ>азы. Действительно, в наших опытах наблюдалось ингибирование Са-АТФазы, которое однако, было неполным.

В последующих экспериментах с целью исследования влияния фторида натрия на активность Са-АК?азы СР измерения провидили в присутствие детергента твин-20 (0,02/2 V/V ). В этих условиях 10 f.i.'I НаР вызывает ингибирование Са-АТФазы развивающееся во времени. Ингибирование при этой концентрации не достигает 100/2. Однако при одновременном внесении в среду регистрации НаР (Ю й) и А1С13 (25 мкМ) в отсутствие ДМ ингибирование ускоряется и его уровень достигает 100%.

Увеличивая концентрацию NaP (до М), можно добиться

полного тормонения Са-АТЗазы и без aici3. Полумаксимальное

—2

ингибирование наблюдалось при концентрации NaP Ю ГЛ. цаС1 (до 200 f.i.i, с учетом находящегося в среде) не вызывал ингиби-

рования. AICI2 в концентрации до 100 лжМ в присутствии 0,4 мЛ NaF не влиял на активность Са-АТ5азы. Потенциация ппгибиро-вания хлоридом алюминия проявлялась при тех же концентрациях' NaF , при которых наблюдалось ингибирозание одним фторидом в отсутствие AlCIg. Динамика развития потенцпнрундего эффекта AlCIg, наблюдаемого при увеличении концентрации NaF , характеризуется следующими особенвогшпш: при концентрации NaF 0.1-0.4 м'л потенщтроваавЕ ¡отсутствует, в диапазоне 0.4-3 aí.í NaF - возрастает, 3ámi постепенно снижается до нуля. Снижение потенциирования обусловленно ингибирующим действием самого NaF , приближающимся к. максимальному. Это дает основание считать, что при совместном ингибирующем действии NaF и AlCIg определяющая роль принадлежит ЫаР .

Анализ механизма действия одного HaF и комплекса его с AlCIg показал, что эти оба агента не влияют на Са-связываю-щий центр АТФазн CP, поскольку не меняется характер кривой зависимости активности фермента от концентрации Са^+ в среде, а'ртмечается только снижение скорости гидролиза AT2?. Однако ингибирование активности фермента засисит от концентрации внутривезпкулярного Са2+. С увеличением концентрации Са2+ внутри везикул ингибирование углубляется, причем степень инги-бирования была выше при действии комплекса NaF и AlCIg.

■ Из анализа зависимости активности Са-АТ5азы от концентрации АТ5 в присутствии различных концентраций NaF следует, что фторид увеличивает значение Кт не изменяя величину Vmax. Это указывает на конкурентный по отношению к AT¿> тип ингиби-ровакия ферментативной активности, что вероятно, обусловленно взаимодействием фторида натрия с АТ5 - связывающим центром ATl-азк. В.присутствии 10 мкМ ЛГС1, характер ингибирования изменяется: из конкурентного и;:г2:бнрозание становилось сме-

шанлшл. Действительно, при этом увеличение значения Кт сопровождалось снижением величин vwax (рис.3). Таким образом, на конкурентное воздействие одного фторида натрия накладывается неконкурентное влияние AIGIg, проявляющееся только в среде с ИаР . Скорее всего, в этом случае, происходит совместное действие ИаР и AlCIg на фосфат-связывающий центр Са-АТЗазы СР по аналогии с описанным'в литературе влиянием этих веществ на На,к-АТ£азу и Са,[Ле-АТ£азу плазмалеммы (iiiesiaen o.a., 1988).

Характер влияния NaP на скорость гидролиза л-Шй фрагментами СР, i<ait и в случае с гидролизом АТЗ, меняется при внесении одновременно с НаР AICIg.'B этом случае неконкурентный по отношению к п-Н-55, тип ингибирования фторидом натрия менялся на смешанный тип в присутствии AIGIg.

1/v

3

•с сз

tlj щ

а) о

Ö

1,2

■s 0,8

р-.

Й

о

О >4

2

I

1,2

0,8 0,4

2

А 3

-I

-1

3 4

АТ5 MVi

Рис.3. Кинетический анализ (метод Лайнуивера-Берка) ингибирования Са-АТ5азы СР от концентрации АТЬ. iiaP(a) и ИаР «-AlCIg (б). 1,2,3 - 0; 10; 23 ьй ИаР , соответственно.

В наших экспериментах по мере увеличения содержания Pi в среде наблюдалось возрастание величины Kq 5» при этом практически не изменялось значение максимального иигибирования Са-АТФазы в присутствии 10 шМ AIGI3 и NaP, используемого в различных концентрациях. Это может иметь ыгето при конкуренции Pi и НаР+ AlCIg за,один и тот es участок связывания на молекуле фермента. В ходе шжибирования АТ&азы одним фторидом натрия конкуренции 2ПаО? с за фоосфат-связывающии центр фермента, видимо, не происходит, т.к. при'увеличении концентрации РА не уменьшается сродство фермента к ПаР .

В отсутствие HaF активность Са-АТЗазы не изменялась под действием Pi .

Таким образом, есть основание полагать, что Са-АТЬаза СР подвергается пнгибирухщему действию НаР вследствие взаимодействия последнего непосредственно с АГ5-связывающим участком каталитического центра фермента. При совместном действии НаР • и AlCIg имеет место наложение двух процессов взаимодействия НаР с ATS-связывающим участком и взаимодействия комплекса НаР и AlCIg с Pi участком Са-АГ5азы. Модулирующее действие

60 а __ Рис.4. Ингибирование актив-

ности Са-АТ5азы СР ванадатом и фторидом натрия а: рСа 3,5; б: рСа 5,1 - 15 ;дкМ ванадат; 2-10 }£п НаР ; 3 - ванадат + НаР; 4 - ванадат + ДиСО (20/£, (v/v); 5-0,4 i.l.i NaP+ 50мкМ A1CI3; 5-0,4 ¡U.ИаР+ 50 мкМ

AI

Ui О +

дмсэ (го;;)

AlCIg состоит в той, что он, не изменяя сродства фермента к WaP, увеличивает максимальный ипгибиторный эффект. Действие AlCIg проявляется только на фоне эффективных концентраций самого фторида натрия. По-видимому, связывание Nal1 с ферментом приводит к модификации последнего и создает возможность взаимодействия комплекса AIF^ с фосфатсвязывающим .участком каталитического центра. О том, что Пар взаимодействуя с ферментом, вызывает модификацию его и, по всей видимости облегчает доступ различных агентов к фосфат-связивавдему центру свидетельствуют данные, представленные на рис.4. В условиях высокой концентрации (рСа - 3,5) не проявлялось ингибирувщее дей-

ствие ванадата в концентрации 15 мкН, тогда как^аР снижал активность Са-АТЗазы (на 49±1%). Однако при совместном действии НаР и ванадата проявлялось ингибирующее действие ванадата. Это похоже на эффект ванадата в присутствии ДМСО (рис. 4а). ДМСО такие выявлял в наших опытах ингибируювдй эффект комплекса NaP + AICI3 при низких концентрациях фторида натрия (0,4 мМ), который в отсутствие Д?ЛС0 не вызывал ингибирования Са-АТФазы GP (рис..46).

В настоящее время фторид алюминия рассматривается, наряду с ванадатом, как аналог фосфата (cimbre, 1990). В силу этого представляло интерес использовать оба агента для исследования механизмов фосфотрансферазной реакции Са-АТ^азы СР.

В отличие от литературных данных (Miasiaen е.а., 1983), где на АИазные активности действовал только комплекс фторида алюминия, но не действовал фторид и алюминий отдельно, в наших экспериментах проявились эффекты и одного фторида, и в комплексе с алюминием, тогда как один алюминий не оказивал влияния на Са-АТ5азную активность. Это вцзвало необходимость исследовать механизма действия обоих агентов на Са-АТ&апнуш

активность СР, Полагая, что эффект фторида на Са-АТ5азу ср сложен и мокет включать действие на нуклеотид-связывающий и Са-связывающий центры, мы .проверили обе возможности и нашли, что фторид не оказывал влияние на Са-центр, поскольку характер кривой зависимости ферментативной активности от концентрации Са2+ не менялся. Возмоаность действия фторида на фосфат-свя-зывавдий центр полностью исключается в салу отсутствия конкуренции На?с Р1 за фоарат-сваззтаыдий центр фермента. Следовательно, реальной остается вшздоаность ингпбирования Са-АТ5азы фторидом посредством влияния его на пуклеотид-связывающий центр фермента, что доказывает кааи эксперименты (см.рис.3). Эфоекты фторида оказались специфичными только по отношению к нуклеотиду (АЕ>), тогда как характер ингибирования гидролиза П-К53 фторидом был неконкурентным. Это напоминает неконкурентное действие ванадата на п-1Шазу СР. Разница в действии фторида на Са-п-Нйазу и Са-АИ>азу в этом случае также связана со специфической ролью АТ2, в отличие от п-Ш>3, в функционировании каталитического центра фермента.

Таким образом, активность Са-АГЗ>азы СР может быть снижена фторидом натрия через взаимодействие его с нуклеотид-связываю-щим центром.

Анализ ннгибпрующего действия"фторида алюминия выявил характерные особенности, по сравнению с действием-фторида. Это ' выражается в появлении сд:епанного характера ингибирования .гидролиза АТ5 и п-1155 по отноиениа к субстратам (см.рис.3). В этом случае проявляется действие фторида алюминия на фосфат-сзязиваюций центр (см.рис.З). Зторид, действуя аналогично дг^етилсулъфокскду, облегчает доступ фторида алюминия к центру ^сформирования. Та-сим рбразом фторид алюминия, ингибируя ферментативную активность, действует как анатог. фосфата.

Место действия фторида алюминия в реакционном цикле -скорее всего форма Са^-З-^ (см.схему I). Это доказывается тем, что ингибкрующий эффект этих агентов не зависит от концентрации Са^+ в среде и снижается при увеличении концентрации А13. С другой стороны, с увеличением концентрации Са^+ внутри везикул торможение усиливается. Аккумуляция внутреннего кальция приводит к обращению цикла и к накоплению Са2-3£-АД5 форми (КЪапапзЬуНх ,0епс1са, 1938; йе Иоаз, 1989) . Именно эта форма содержит в достаточном количестве связанный АД5. Связываясь с этой формой фторид алюминия мохет образовать прочный комплекс с АД5, в котором он играет роль фосфата АК>.

Несмотря на то, что валадат и фторид алюдяния являются аналогами фосфата, они действуют на различные этапы реакционного цикла. По видимому, это объясняется различием в механизмах действия ванадата и фторида алюминия. Ванадат может связываться с АД5, представленном в реакционном цикле фермента. При этом образуется пятивалентная бипирашдалъная структура, подобная ^-фосфату АТ5 во время гидролиза. Однако образуемая негидролизуемая форма Е^АДФ'Уап неустойчива (сиаЬге, 1990) и не монет вызвать ингибирования. Фторид алюминия образует устойчивое состояние Е^-- АДЬ- и в этом отношении скорее напоминает негидролизуемий аналог АТЗ^з . Более того, ва-надат может и не связываться с АДФ, поскольку он намного легче взаимодействует с нелигавдированной Е формой Са-АТЗазы.

ВЫВОДЫ

I. Показано, что ванадат (в микромолярных концентрациях) и фторид натрия (в миллимолярных концентрациях) сниа&ют скорость аккумуляции и увеличивают количество поглощенного каль- ■

ция фрагментами саркоплазматического ретикулума, что обусловлена, соответственно, ингибированием активности Са-АТ2азы и с осаждением кальция в полости везикул.

2. Показано, что насыщение внутривезикулярных низкоаффинных Са-связывшощих центров способствует ингибирующему действию ИаР и. комплекса ИаР + А1С1д на-Са-АТ5азу саркоплазмати-ческого ретикулума, но защищает фермент против ипгибирования ванадатом.

3.. Ингибировашгё й2$зз2нта фторидом -конкурентно по отношению к Мд -АТФ, по неконкурентно по отношению к ме -п-НФ1>. Ингибируюищй эффект комплекса ИаР + А1С13 имеет смешанный характер по отношению к обоим субстратам.

4. Пнгибироваиие ванадатом неконкурентно по отношению к 1% -п-НЗЗ и бесконкурентно по отношению к -АТ5. В присутствии диметилсульфоксида в бескальциевой среде неконкурентный характер ингибпрования гидролиза п-Ш>±> ванадатом сменяется на. конкурентный. В этих условиях также имеет место конкуренция между п-Н55 и АГ5 вп-НМ и неорганическим фосфатом.

5. По отношению к ?± идгйбировайие фермента фторидом неконкурентно, тогда как ингибирование комплексом наР + А1С1д-конкурентно.

6. Представленные данные указывают на то, что в процессе работы фермента ванадат взаимодействует с фосфат-связывающим центром нелпгандированной Е формы Са-АТ5азы, возникащей в каталитическом и транспортном цшеле между и Е^ формали, с образованием '¿2'Уап комплекса, что приводит к ингибированию фермента..

7. Иигибирующее действие на? развивается в процессе работы фермента вследствие его взаимодействия с АЕ-связываэщим

центром каталитического центра фермента з Cag-Sj форме. Б случае совместного действия НаР и AICI3 происходит одновременно два процесса: взаимодействиеïïaF с ЛТЗ-связнваюдам центром и взаимодействие îiaP'Aic^c Pi -центром Са-АТЗазы. Комплекс НаР + ÄlCIg взаимодействует с Cag-Sj формой только после связывания с ней одного ПаР . Cm комплекс мокет взаимодействовать с Са2* ¿¡J*АД^ формой только после заполнения кальцием низкоаффинных ваутризезикулярних Са-связываищих центров.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО TS:ЛЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Успанова ¿.К.» мурзахметова M .К., Мукатаева 1а.!Л., Утегалиева P.C., Защенко В.И., Есирев О.В. Влияние свободных жирных кислот, кверцетина- и d-токоферола на транспорт кальция в саркоплазматическом ретикулуме // Тез. науч, сообщ. I съезда физиологов Узбекистана. Ташкент. 1988 . С.91-92.

2. Утегалиева P.C., Ващенко В.И., Сарсенова 111.С., Каль-<циевый насос ретикулума мышечной клетки и свободные мирные

кислоты //' Тез. докл. I съезда физиологов Казахстана. Алма-Ата. 1983. С.12о.

3. Утегалиева P.C., Ващенко В.И..Кинетический анализ системы транспорта кальция фрагментярованного ретикулума. Влияние фторида-натрия // Материалы науч. конф. молодых ученых "Физиология и биохимия висцеральных систем". Алма-Ата. 1989. Рукоп. деп. в ВИНИТИ. Деп. Ii 7457-BS9. С. 10-15.

4. Ёсырев О.В., Башенко В.И., Успанова Я.К., Утегалиева P.C. Ингибиторы транспортных АТФаз как инструменты исследования молекулярных.механизмов транспорта ионов // Тез. докл. Международного симпозиума "Транспорт ионов и механизмы его регуляции". Тбилиси, 1989. С.53.

5. Мукатаева 7i.lL, Утегалиева Р.С., Ваденко В.К., Успано-ва Е.К. Модуляция вирао£ кислотой регулирующего влияния внут- . ривезккулярного кальция на систему транспорта ионов саркоплаз-матического ретикулума // Изв. АН КазССР, сер. биол. 1ЭЭ0

Й 4, с. 4Ч-<±9.

6. Утегалиева Р.С., Ващенко В.И., йсыров 0.3. Конкурентное ингибдровапке Са-АТ-Зазы саиашзазматического ретикулума . фторидом натрия // У к р. йаашгл. «ура, 1990 т. 62. J." 5. С. ^3-48.

7. Втегалиева Р.С., Мугсагаева 2.М., Ващенко В.И. Слеин цыщылы, кверцетии зкане ванадаттыц саркоплазмалыц ретикулум-ныц сульфгидрилд1 тобына scepi // Оборник.Цазан; тШ-гылым т1л1. Алма-Ата. Наука. 1990. С.262.

О. Vashchenko V.I., Utegalieva R.S., Ksyrev O.V. Vanadate inhibition of aATP and p-nitrophenol phosphate hydrolysis in the fragmented sarcoplasmic reticulum// Biochim et Biophys Acta. 1991. V.1079. No1. P. 8-14.

. ■ 9. Отегалиева P.O.,.Ьашеико Б.И., Оспанова Д.К., Есырев С.В. Банадат, фтдр жэне алюминий иондарыныц биологиялыц мсмбраналарга acepiniu механизм!.// Тез. докл. II съезда физиологов Казахстана. Караганда. 19У2. С. 124. .