Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизм генерации кислородных радикалов при взаимодействии хинонов с эритроцитами

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Механизм генерации кислородных радикалов при взаимодействии хинонов с эритроцитами"

На правах рукописи

АФАНАСЬЕВ Илья Игоревич

МЕХАНИЗМ ГЕНЕРАЦИИ КИСЛОРОДНЫХ РАДИКАЛОВ ПРИ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ ХИНОНОВ С ЭРИТРОЦИТАМИ

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена в научно-исследовательской лаборатории патогенеза и экспериментальной терапии пневмокониозов в Российском Государственном медицинском университете.

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор Коркина Л.Г.

Официальные оппоненты: д.б.н., проф. Савина М. И.

к.б.н. Осипов А. Н, Ведущая организация: Всероссийский кардиологический научный

центр

Защита диссертации состоится "___"_____ 1996 г. в__

часов на заседании диссертационного Совета К.084.14.05 Российского государственого медицинского университета по адресу: Москва, 117869, ул. Островитянова, дом 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РГМУ

Автореферат разослан "___"__ 1996 года.

Ученый секретарь Диссертационного Совета - к.б.н., доцент Клушина Т. Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы: Известно, что хиноны и другие ароматические соединения, такие как производное хинолина - примаквин, могут взаимодействовать с эритроцитами, стимулируя генерацию активных форм кислорода, окисление гемоглобина и вызывая повреждения клеточной мембраны, приводящие к гемолизу клетки [Cohen G. and Hochstein P., 1964; Trad C.H. and Butterfield D.A., 1994]. В настоящее время установлено, что подобные деструктивные изменения наиболее ярко выражены в эритроцитах, взятых из крови больных различными гемоглобинопатиями, особенно, ß-талассемией, где генерация активных форм кислорода происходит даже в отсутствие хинонов [Grinberg L.N. et al., 1992].

Несмотря на обилие фактов, единой теории, объясняющей механизм проокислительного действия хинонов при их взаимодействии с эритроцитами, не существует. Тем не менее, важность разработки такой теории несомненна. Она подчеркивается тем фактом, что хиноны являются биологически активными соединениями, входящими в состав разнообразных лекарственных веществ.

Так, примаквин является антималярийным лекарством, находящим в этой связи самое широкое применение. Между тем, талассемия распространена приблизительно в тех же регионах земного шара, что и малярия [Schrier S.L., 1994]; это поднимает вопрос о возможных последствиях

назначения этого лекарства пациентам, страдающим от той и другой болезни одновременно.

Хинон доксорубицин (адриамииин) - сильное противораковое вещество, активно используемое в медицине в настоящее время. Менадион и его производное викасол входят в состав витамина К и поэтому необходимы для нормального функционирования организма.

Таким образом, изучение проокислигелыюго действия хинонов чрезвычайно важно д\я разработки новых методов и лекарств для борьбы с такими заболеваниями, как р-талассемия, малярия и некоторые онкологические процессы.

Все вышесказанное позволяет сделать вывод о насущной необходимости разработки теории, объясняющей проокислительные эффекты, которые возникают при взаимодействии хинонов с эритроцитами

Цель и задачи исследования: Цель настоящей работы заключалась в том, чтобы, изучив взаимодействие хинонов и прнмаквина с эритроцитами, сформулировать гипотезу, наиболее адекватно объясняющую механизм- их действия, и на ее основе сделать рекомендации по применению антиоксидантных препаратов для лечения заболеваний, обусловленных повреждением эритроцитов.

Для достижения этой цели решались следующие задачи:

1. Установить основные направления действия хинонов менадиона, викасола, доксорубицина и бензохинона, а также хинолинового производного

примаквина на эритроциты; сравнить действие хинонов на, донорские эритроциты и эритроциты из крови больных р-талассемией.

2. Изучить эффекты антиоксидантов и хелаторов (супероксиддисмутаза (СОД), рутин, липоевая кислота и 1-аллил-2-метил-3-гидроксипиридинон-4 (АМГП)) на процессы, происходящие- при взаимодействии хинонов с эритроцитами из донорской крови и крови больных р-талассемией.

3. Предложить механизм действия хинонов на эритроциты.

4. Сделать рекомендации по дальнейшему изучению антиоксидшггов и хелаторов в качестве перспективных фармацевтических препаратов- для лечения больным р-талассемией.

Научная новизна: В ходе решения поставленных задач впервые был изучен механизм действия примаквина, менадиона, викасола, доксорубицика и бензохинона на эритроциты доноров и больных талассемией.

Впервые прн изучении действия прооксидантов на эти клетки определялись одновременно изменение концентрации восстановленного глутатиона, окисление гемоглобина и способность клеток восстанавливать цитохром с.

Впервые была предложена теория, объясняющая эффект указанных прооксидантов на свободно-радикальные процессы в совокупности.

Впервые изучены защитные эффекты антиоксидантон рутина, липоевой кислоты и хелатора 1-аллил-2-метил-3-гидроксипиридинона-4 против

повреждающего действия прооксидантов на эритроциты здоровых доноров и больных талассемией.

Впервые определены стехиометрия, константы устойчивости и валентность металла в комплексах дигидролидоевой кислоты и АМГП с железом.

Научно-практическое значение: Результаты данной работы вносят вклад в развитие представлений о механизмах регуляции свободно-радикального статуса эритроцитов, а. также позволяют прогнозировать-будущее использование антиоксидантов и хелаторов при лечении больных р-талассемией.

Апробация работы: Результаты работы были представлены на- Ю-©м Всероссийском семинаре "Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине" (Минск, 1992 год);

12-ом симпозиуме "Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине" (Киев, 1995 год);

International conference "Chelating Agents in Pharmacology, Toxicology and Therapeutics" ( Pilsen, Czech Republic, 1993);

14th European Drug Metabolism Workshop ( Paris, France, 1994);

4th European Congress of Toxicology ( Prague, Czech Republic, 1995),

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Структура и объём диссертации; Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, описания результатов исследования и

их обсуждения, заключения и выводов. Библиографический указатель. содержит 151 наименование. В диссертации содержится 17 рисунков и три таблицы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Материалы и метолы исследования. В работе использовались- хиноны менадион (MD), викасол (1,4-нафтохинон-2-метил-3-сульфонатг NOMSJ, доксорубицип (Dox) и 1,4-бензохинон (ВО), а также хинолиновое производное примаквин (РО). В качестве антиоксидантов применялись липоевая кислота и рутин, в качестве хелатора - 1-аллил-2-метил-3-гидроксипиридгаюн-4 (АМГП-).

Концентрацию ионов двух- и трехвалентного железа в растворе определяли фенантролиновым методом. Дигидролипоевую кислоту получали восстановлением липоевой кислоты боргидридом натрия в атмосфере аргона,

Спектрофотометрические измерения выполнялись- на спектрофотометрах DU-6500 фирмы Beckman и Ultrospec 4050 компании LKB, Спектры ЭПР снимали на спектрометре Varían. Е-4, полярографические измерения проводили на газовом анализаторе ОП-215 фирмы Radelkis (Будапешт). Хемилюминесценцию измеряли на хемилюмгаюметре ХЛМ-3 (Россия).

В экспериментах использовалась кровь здоровых доноров и 7 детей, больных р-талассемией (возраст до 9 лет) и проходящих лечение в клинических гематологических отделениях РДКБ г. Москвы.

Для приготовления суспензии эритроцитов использовалась свежевзятая гепаринизированная кровь. Эритроциты -отделялись центрифугированием при 1500 д в течение 10 минут, после чего четыре раза промывались фосфатным буфером, содержащим 75 мМ ЫаС1 и 75 мМ . Ыа2НР04^аН2Р04 при рН 7.4. Эксперименты показали, что отмытые таким образом эритроциты можно было использовать в течение суток. До непосредственного использования клетки хранились при 4 градусах в таком же фосфатном буфере, в который было добавлено еще 5.5 мМ глюкозы.

Концентрация восстановленного цитохрома с определялась по следующей методике. Отмытые эритроциты помещались в описанный выше фосфатный буфер (конечная концентрация 2% (у/у)). К полученной суспензии добавлялись требуемые концентрации цитохрома с, хинонов и других реактивов.

Для того, чтобы учесть естественное восстановление цитохрома с, проводились контрольные эксперименты, растворы в которых содержали хиноны и цитохром с (а также при необходимости другие перечисленные выше компоненты), но не содержали эритроцитов.

После часовой инкубации при 37 градусах приготовленные таким образом образцы центрифугировались 5 минут при 1500 д, после чего супернатант помещался в кювету спектрофотометра для определения концентрации восстановленного цитохрома с, а осадок использовался для определния степени окисления гемоглобина.

Спектр супернатанта прописывался в интервале длин волн от 500 до 600 нм. Концентрация восстановленного цитохрома с (выраженная в цМ) рассчитавалась, исходя из коэффициентов экстинкции восстановленного и окисленного цитохрома с и оксигемоглобина по формуле:

|cyt c(red)) = 47.6*А550 - 9.8*Л557 - 31.8^542 где А550, А557 и А542 - значения оптического поглощения при длинах волн 550, 557 и 542 нм соответственно.

При определении степени окисления гемоглобина и общего содержания гемоглобина в растворе полученный во время определении концентрации восстановленного цитохрома с осадок лизировался холодной дистиллированой водой. После отделения теней гемолизат помещался в кювету спектрофотометра, где прописывался спектр при длинах волн от 500 до 650 нм. Концентрации окси- и метгемоглобина (выраженные в мМ) определялись по следующим формулам:

[ОхуНЬ] = -0.0196*А5ео + 0.026ГА577 - 0.0078*Аезо [MetHb] = -0.0124*А560 4- 0.0057*А577 + 0.0733* Авз0 где А560, А577 и Ав30 - значения оптического поглощения при 560, 577 и 630 нм. Общее содержание гемоглобина определялось как сумма концентраций окси- и метгемоглобина в растворе и пересчитывалось с учетом разбавления, произведенного при этом измерении.

Определение концентрации восстановленного глутатиона проводилось по следующей методике. В фосфатный буфер, состав и

с»

концентрация которого были описаны выше, добавлялась суспензия эритроцитов (5%, v/v), хиноны, а также другие реагенты. Смесь инкубировалась в течение часа при 37 градусах, после чего центрифугировалась (1500 д, 5 минут). Получению таким образом эритроциты лизировались холодной дистиллированной водой, после чего растворённый в воде белок отделялся добавлением трихлоруксусной кислоты. Концентрация -SH-групп определялась по взаимодействию раствора с 5,5'-дитиобис(2-шггробеизойной кислотой) в слабощелочной среде. При этом измерялось оптическое поглощение этого раствора при 412 нм. Концентрация восстановленного глутатиона (выраженная в мМ) в исходном образце определялась с учетом этого коэффициента и разведения и вычислялась как [GSH]= A4i2*0.280, где Аш - значение оптического поглощения при 412 нм.

Результаты исследования и их обсуждение.

Генерация АФК при взаимодействии хиыоыов с эритроцитами.

Генерацию свободных радикалов при взаимодействии хинонов менадиона, викасола, доксорубицина и бензохинона, а также примаквина с эритроцитами определяли по восстановлению цитохрома с. Как видно из таблицы 1, хиноны в определенной степени восстановливали цитохром в растворе, однако в присутсвии эритроцитов этот процесс многократно усиливался. Восстановление цитохрома с в растворе ингибировалось

супероксиддисмутазой (СОД) на 80%, тогда как в присутствии эритроцитов вклад СОД-ингибируемой реакции не превышал 25-30%.

Таблица 1. Восстановление цитохрома с хинонами в присутствии и отсутствии эритроцитов. (Концентрации хинонов - 10 цМ, примаквина - 0.5 мМ, СОД - 7.5 Ш/ш1, с^ с - 0.05 шМ)

Прооксидант Восстаноа отсутствие (нмоль/мл '.аше цитохрома с в эритроцитов Восстановление цитохрома с эритроцитами (нмоль/ грамм НЬ)

- БОО + ЙОО Ингибир. 0/ /о -ьоо + ьоо Ингибир. %

Отсутствует РО 0.21+0.62 1.51±0.72 0.0+0.24 0.16±0.28 100 89 0.63+0.38 7.54+2.00 0.53+0.25 5.38+0.56 16 29

МИ 2.91±0.80 0.77±0.05 74 16.94±2.0 12.0±1.31 29

^МБ Пох 2.15+0.77 1.29±0.80 0.49+0.17 0.31+0.82 73 76 13.7+0.80 9,31+2.05 8.69+0.22 8.97+0.42 37 4

во 5.19±0.47 4.34+1.4 16 18.82±1.6 14.55±1.7 23

Как видно из таблицы, наиболее эффективными прооксидантами являются бензохинон и менадион.

Эритроциты больных р-талассемией (рисунок 1) проявляли

повышенную способность восстанавливать цитохром с, причем, как видно из рисунка, разница между эффектами талассемических и нормальных эритроцитов соответствовала СОД-зависимой составляющей.

¿ООО

^gl 4000 —

г

AUMUPCIUXC

иритрициты

Эритроциты (Зольных Сета—талассемиев

Рисунок 1. Восстановление цитохрома с эритроцитами доноров и больных 6ета~талассемией.

ИЯ - образцы, не содержащие SOD

| образцы, содержащие по 7.5 UI/ml SOD

Далее нами был изучен эффект хинонов на окисление гемоглобина в эритроцитах и лизатах. Как видно из таблицы 2, все прооксидаиты вызывают СОД-независимое окисление ОхуНЬ, которое в некоторой степени коррелирует со способностью эритроцитов восстанавливать цитохром с. Действительно, как видно из рисунка 2, те хиноны, которые вызывают незначительное окисление ОхуНЬ, также слабо стимулируют восстановление цитохрома с, однако концентрация восстановленного цитохрома с всегда больше концентрации образующегося меттемоглобина в 6-7 раз. В то же время, для сильных прооксидантов это различие не превышает 2-3 раз.

Таблица 2. Окисление оксигемоглобина в эритроцитах и гемолизатах.

Прооксидант [МеШЬ]/[ОхуНЬ] в эритроцитах |МеШЬ]/[ОхуНЬ] в лизате

Отсутствует 0.045 ± 0.025 0.053 + 0.016

РО 0.21 ± 0.05 0.65 ± 0.07

МБ 0.79 ± 0.07 1.13 ± 0.19

NQMS 0.45 + 0.04 0.31 ± 0.01

Юох 0.045 ± 0.060 0.00 ± 0.02

во 0.33 ±0.11 0.53 ± 0.41

V

Ъ

20

Концентрация МеШЬ и эритроцитах, цМ

Рисунок 2. Корреляция между способностью прооксидаита вызывать окисление ОхуНЬ в эритроцитах и восстановление цитохрома с).

О

1.4

Как видно из рисунка 3, гемоглобин в эритроцитах, взятых из крови больных р-талассемией, окисляется несколько сильнее, чем в нормальных эритроцитах, хотя это различие не является статистически достоверным.

Приведенные данные позволяют предположить, что, попадая внутрь эритроцита, прооксиданты окисляют гемоглобин и при этом сами восстанавливаются до соответствующих семихинонов,

О + НЬС>2 —> О- + МеШЬ + 02 Семихиноны далее могут восстанавливать цитохром с или кислород до супероксида как внутри, так и вне клетки.

О - + 02 о О + 02-" О- + С^ с(III) о 0 + С>а с{11) Поскольку 02 " также способен восстанавливать суХ с, СОД частично ингибирует суммарный процесс.

Вероятно, в эритроцитах больных (3-таласссмисй существует еще один механизм генерации свободных радикалов. Он обусловлен наличием ионов свободного железа, высвобождаемых в результате деструкции нестабильного гемоглобина, входящего в состав этих клеток, и локализованных на поверхности мембран, Возможно, что хиноны восстанавливаются ионами железа, что и является дополнительным источником свободных радикалов в талассемических эритроцитах.

Помимо взаимодействия с оксигемоглобином, нами было изучено окисление восстановленного глутатиона б эритроцитах и лизатах под

действием прооксидантов. Как видно из рис. 4, добавление хинонов и примаквина проводило к резкому уменьшению концентрации СБН как в эритроцитах так и в лизатах, причем максимальные эффекты наблюдались в случае бензохинона и менадиона. Поскольку оба хинона имеют незамещенные положения в хинонном кольце, то можно предположить, что основным направлением реакции является ковалентное присоединение СБН к хинонам, а не одноэлектронное окисление глутатиона.

Влияние хелаторов и антиоксидантов на взаимодействие хинонов с эритроцитами.

Известно, что в качестве ингибиторов свободно-радикальных процессов могут быть использованы антиоксиданты, т.е. соединения, реагирующие с активными свободными радикалами с образованием неактивных продуктов, и хелаторы, образующие неактивные комплексы с металлами переменной валентности, в первую очередь, с железом, и подавляющие тем самым образование гидроксильных радикалов по реакции Фентона. В настоящей работе были изучены эффекты трех соединений, флавоноида рутина, липоевой кислоты и орального хелатора АМГП. Хелатирующая и антиоксидантная активность рутина была показана ранее, поэтому в данной работе исследовались липоевая/дигидролипоевая кислоты и АМГП.

1.2 —

0.8

I

Ь 0.4 —

0.0 —1

и!

а

Рисунок 3. Окисление оксигемоглобина эритроцитами кропи доноров и больных бета—талассмисй.

^Н — донорские эритроциты

— эритроциты больных бета—талассемией.

100 —

0 —1

Рисунок 4. Изменение концентрации СЭН я эритроцитах и гемолилате под действием хиыоаов и РО. (Концентрация глутатпопа в пестимулирояавных эритроцитах принята за 100%).

^Н — в эритроцитах

в гемолнэате

Ш

Было обнаружено, что при взаимодействии железа с АМГП образуется смесь октаэдрических комплексов трехвалентного железа Fe3+(AMrnj2 и Fe3+(AMrn)3, константа связывания была определена равной lg К= 8.33 (mol Г1)-2. Это говорит о том, что АМГП является эффективным хелатором этого металла, способным выводить его из организма при различных заболеваниях. Интересно, что при реакции с двухвалентным железом оно в ходе реакции окисляется кислородом воздуха с образованием активных форм кислорода, это может быть источником некоторой проокислительной активности данного хелатора.

Аналогичные результаты, полученные для взаимодействия железа с липоевой/дигидролипоевой кислотой (ЛК/ДГЛК) говорят о том, что реагирует с ионами Fe только ДГЛК и только в интервале рН от 8 до 11 (константа связывания lgK = 3.97 (mol I"1)"2] с образованием комплекса Ре2+(ДГЛК)2. Это вещество, таким образом, не может бьггь хелатором железа при физиологических условиях. Однако, ДГЛК может восстанавливать ионы Fe34" до двухвалентного состояния (независимо то того, свяжутся они затем в комплекс или нет), и это может быть источником проокислительной активности данного соединения.

Инкубация АМГП с донорскими эритроцитами в присутствии и отсутствии менадиона (рисунок 5) приводила к уменьшению скорости восстановления цитохрома с, что было особенно заметно в случае стимулированных клеток. Важно также, что эта способность зависит от

концентрации хелатора. Особенно ярко указанная особенность выражена у клеток из крови больных |3-талассемией, однако, присутствует и у донорских эритроцитов. С другой стороны, никакого влияния на концентрацию метгемеглобина или СБН добавление АМГП не оказывала.

3

ЧУ

ъ

/э

/

I 1 I

1 2 3 + 1д[АМГП|, шМ

-Л

Рисунок И. Ваяниис ЛЛ1ГП ил соосабшнль мратрофггов

яосетаншляитъ цктохрйм с.

1 - эритроциты щ крови больных бега талассемней, стимулированные меввдновои!

1 — нестимулированвые эритроциты из крови больных бета-талассбмиЁй;

3 " донорские эритроциты, стимулированные

мциадииним;

4 сестпмулиронйнные донорские эритроциты.

Приведенные данные подтверждают предложенную ранее гипотезу о том, что свободное железо, адсорбировавшееся на мембране клетки, может являться источником свободных радикалов, что, разумеется, сильнее всего выражено у клеток из крови больных (3-таласссмисй. Кроме того, как видно из

1Н

рисунка, нестабильный гемоглобин активнее разрушается под действием хинонов, хотя это никак не отражается на окисляемости ОхуНЬ.

Таблица 3. Влияние липоевой кислоты (1 мМ) на восстановление цитохрома с и окисление оксигемоглобина стимулированными и нестимулированными эритроцитами.

Прооксидант Восстановление цитохрома с эритроцитами в отсутствие ЛК (нмоль/грамм НЬ) Восстановление цитохрома с эритроцитами и присугстиии ЛК (нмоль/грамм НЪ)

Отсутствует 205+80 1100+140

РО 1300+60 2060±34

MD 2430+11 2500+400

NQMS 2900±260 2600+43

Dox 3001130 112012

ВО 3400+50 3700+300

Прооксидант [МеШЬ]/[ОхуНЬ] в эритроцитах в отсутствие ЛК [ МеШ Ь ] / [ ОхуН Ь ] в эритроцитах в присутствии ЛК

Отсутстяует 0.01±0.03 0.00+0.009

PQ 0.005+0.002 0.02610.015

MD 0.00x0.004 0.8710.044

NQMS 0.89±0.045 0.8610.019

Dox 0.04+0.022 0.07+0.027

BQ 0.26+0.002 0.3610.029

При небольших концентрациях АМГП наблюдается некоторая интенсификация процессов восстановления цитохрома с, вероятно, это связано с отмеченной выше проокислительной способностью этого соединения.

Добавление к суспензии эритроцитов липоевой кислоты приводит к парадоксальному, на первый взгляд, увеличению генерации свободных радикалов (таблица 3), что выражается как в способности клеток восстанавливать цитохром с, так и в увеличенном окислении оксигемоглобина.

Указанный проокислительный эффект можно понять, исходя из описанной выше способности ДГАК восстанавливать трехвалентное железо. Более того, это вещество может и непосредственно восстановить используемые хиноны, что приводит к увеличенному образованию восстановленного цитохрома с. Окисление ОгуНЬ происходит, видимо, уже после этого под действием образующихся затем супероксида и других АФК.

Шшш

1. Изученные соединения примаквин, менадион, викасол, доксорубицин и бензохинон являются прооксидшггами, вызывая восстановление эритроцитами цитохрома с, окисление содержащегося в них оксигемоглобина и уменьшение концентрации восстановленного глутатиона,

2. Восстановление цитохрома с, окисление ОхуНЬ и уменьшение концентрации СБН регистрируется не только в донорских эритроцитах, но и в эритроцитах больных р-талассемией, однако в последнем случае они ярче выражены; особенно это касается восстановления цитохрома с.

3. Из всех описанных процессов БСШ-зависимой является только способность эритроцитов восстанавливать цитохром с, в случае клеток из крови больных талассемией эта способность также уменьшаться под действием хелаторов железа.

4. Первичным действием хинонов является окисление ими оксигемоглобина с образованием соответствующего семихинона, а также окисление и ковалентное связывание содержащегося в клетках восстановленного глутатиона.

5. В клетках больных талассемией семихинон и супероксид образуются также в результате взаимодействия хинонов с адсорбировавшимся на мембране железом, из чего следует вывод об эффективности применения хелаторов при лечении данной болезни.

6. Парадоксальный эффект липоевой кислоты связан со способностью ее восстановленной формы восстанавливать хиноны до семихинонов.

7. С практической точки зрения комбинированнное применение хелаторов и перехватчиков свободных радикалов при лечении талассемии представляется весьма эффективным методом, способным дать продолжительный терапевтический эффект.

Рекомендации по использованию результатов исследования

1. При исследовании генерации АФК при взаимодействии хинонов с эритроцитами по восстановлению ими цитохрома с определять всё восстановление, а не только СОД-зависимую его часть.

2. При исследовании комплексообразования при взаимодействии железа с дигидролипоевой кислотой измерения проводить в отсутствие кислорода при слабо-щелочных рН.

3. При лечении талассемии и других железоперегрузочных анемий полезно совместно использовать хелаторы и перехватчики свободных радикалов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Afanas'ev IB., Afanas'ev I.I., Ostrachovich E.A., Korkina L.G. Free radical mechanisms of iron toxicity: effects of chelators and antioxidants. The Sth international symposium "Chelating agents in pharmacology, toxicology and therapeutics (Book of abstracts), 1996, 17.

2. Afanas'ev I.B., Afanas'ev I.I., Deeva I.B., Korkina L.G. Stimulation of free radical mediated processes in normal and thalassemic erythrocytes by prooxidant drugs: defence by a chelator and an antioxidant., Biochem.Pharmacol., в печати.

3. Afanas'ev I.B., Osato Т., Afanas'ev I.I., Korkina L.G., Antioxidant regulation of oxidative stress in normal and thalassemic erythrocytes. Oxidative stress and redox regulation: cellular signalling, aids, cancer and other diseases (Book of abstracts)., 1996, 240.

4. Afanas'ev I. I., Afanas'ev I. B., Deeva I. B., Korkina L. G. Enhanced quinone-induced oxidative stress in erythrocytes of thalassemic patients. Toxicology Letters, 1995, Supplement 1/78: 16.

5. Afanas'ev I. I., Kozlov A. V., Korkina L G., Afanas'ev 1. B. Mechanisms of chelation of iron ions by oral chelating drugs ( l-alIyI-2-methyI-3-hydroxypyrid-4-one (LI) and lipoic acid). Plzen. Lec. Sborn., 1993, Suppl. 68: 35.

6. I. I. Afanas'ev, A. V. Kozlov, L G. Korkina The Effect of 1 -allyl-2-methyl-3-hydroxypyrid-4-one (LI) on Hemoglobin Structure: EPR Investigation. Free Rod Biol & Medicine, 1994, 16: 7-16.