Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Масляный трепонемный антиген в экспресс-диагностике сифилиса

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Масляный трепонемный антиген в экспресс-диагностике сифилиса"

На правах рукописи

КАЗИЕВ АЗРЕТ ХУСЕЕВИЧ

МАСЛЯНЫЙ ТРЕПОНЕМНЫЙ АНТИГЕН В ЭКСПРЕСС - ДИАГНОСТИКЕ СИФИЛИСА

03.00:07 - микробиология

Автореферат

диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ростов-на-Дону 1995

Работа выполнена в Ставропольской государственной медицинской академии.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

I--1

1 Крылова О. П. | Чеботарев ЕЕ

Научный консультант: доктор медицинских наук

Сазонова Л В.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Беднова Е Е Васильева Л К

Ведущая организация - Центральный кожно-венерологи-

чеекий институт

Защита состоится "_"_1995 года в_час.

на заседании диссертационного совета Д 084.53.01 при Ростовском государственном медицинском университете (344092, г. Ростов-на Дону, Нахичеваяский пер., 29).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ростовского государственного медицинского университета. Автореферат разослан "_"_ 1995 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доцент

Е Я. Корганов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Одной из актуальных задач практического здравоохранения Российской Федерации является снижение числа больных венерическими заболеваниями и, в первую очередь, заразными формами сифилиса.

Комплекс современных мероприятий для учреждения здравоохранения по оорм>» с распространен::;:!.! гепернчееких ааболеваний и применение новых методов диагностики и лечения регламентируется приказами N 1161 от 2. 09. 85 г. и N 286 ЫЗ РФ от 7.12. 93 г. Одним из важнейших факторов, способствующих стабилизации сифилитической инфекции, остается повышение эффективности ее лабораторной диагностики и, в частности, серологических исследований.

Отличительной особенностью серологических реакций является использование в качестве диагностикумов как специфических, так и неспецифических антигенов. Существенный недостаток при применении неспецифических антигенов связан с наличием в некоторых случаях положительных реакций при отсутствии заболевания сифилисом. Немаловажное значение в серодиагностике сифилиса принадлежит экспресс-методам. Наиболее распространенным из них является микрореакция с кардиолипиновым антигеном, которая выявляет реагины в сыворотке крови больного (Овчинников Н.М. с соавт. , 1987; Беднова В. Е , 1988).

Одним из перспективных путей уменьшения числа неспецифических реакций при серодиагностике сифилиса является использование в качестве диагностикумов трепонемных антигенов. Положительную оценку получили микроскопическая и макроскопическая

реакции агглютинации бледных трепонем, разработанные отечест-

«

V 4 4

венными учены?,ад (Васильева Г. Л , 1970. , Овчинников КМ. , 1970).

Приказ N 286 КЗ РФ от 7.12.93 г. предусматривает применение следующих реакций для серо- и ликвородиагностики сифилиса, а также отборочных исследований на сифилис:

1). Микрореакция преципитации (МР) с кардиолипиновым антигеном с плазмой крови и инактивированной сывороткой крови.

2). Реакция связавания комплемента (РСК)- с трепонемным и кардиолипиновым антигеном (реакция Вассермана - РВ), качественная и количественная методики постановки, термостатная и на холоде.

3). Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИТ), пробирочная и меланжерная методики постановки.

4). Реакция иммунофлюоресценции в следующих модификациях: РИФ с абсорбцией (РИФ-абс) с сывороткой крови и капиллярной кровью; РИФ-200, РИФ с. цельной спинномозговой жидкостью (РИФ-ц); качественные и количественные методики постановки.

5). Иммуноферментный анализ в модификациях (ИФА).

6). Реакция пассивной гемагглютинации (РИГА).

Профилактическое обследование на сифилис проводится с помощью экспрес-метода, а у беременных и доноров - комплекса серологических реакций.

Внедрение в практику экспресс-метода рассчитано не на замену им КСР, а на возможность увеличения контингентов лиц, обследуемых на сифилис. РСК с трепонемным антигеном является более чувствительной реакцией, чем МР.

В данной работе предпринята попытка добится увеличения специфичности и чувствительности микрореакции для экспресс-диагностики сифилиса путем создания нового, специфического диагностику!^ для МР. При планировании данной работы. учитывалось и

то обстоятельство, что кардиолипиновый антиген выпускается в СНГ (Харьковское предприятие по производству бактериальных препаратов "Биолек") и его покупка и доставка в Россию связана с большими экономическими и административно-таможенными сложностями.

Предложенный нами трепонемный антиген для МР изготавля-ется из трепонемного антигена для РСК, который в России готовится » течение »ятогкх лот па стандартном оборудовании, что значительно облегчает как покупку, так и доставку препарата для МР в любое место на территории России. Использование нового специфического диагностику*© в МР приведет к повышению качества результатов обследования на сифилис, не увеличивая материальные затраты.

Цель и задачи исследования. Целью работы явилась разработка нового специфического трепонемного масляного антигена для экспресс-диагностики сифилиса и методики постановки экспресс-метода с ним.

Для достихения поставленной цели были выделены следующие конкретные задачи:

1. Разработать методику приготовления нового специфического диагностикума для ЫР на сифилис из трепонемного антигена для РСК

2. Изучить активность масляного трепанемного антигена, чувствительность и специфичность микрореакции с ним в сравнении с микрореакцией с кардиолипиновым антигеном.

3. Разработать методику постановки и учета данной реакции при массовых обследованиях населения.

Научная новизна Приведенные исследования защищены авторским свидетельством "Отборочный диагностический тест на си-

филис" N 47.50904/14(128001) от 22.04.91 г. Их научная новизна заключается в том, что:- впервые в нашей стране получен новый специфйческий трепо-немный антиген для экспресс-диагностики сифилиса с целью массовых обследований'населения;

- достоверно доказана высокая специфичность и чувствительность реакции агломерации масляного трепонемного антигена по сравнению с кардиолипиновым антигеном в микрореакции;

- разработана методика постановки МР с масляным трепонемным антигеном.

Практическая значимость. Примененный новый отечественный специфический масляный трепаномный антиген для МР при обследо-ваниивании населения на сифилис обладает более высокой активностью по сравнению с кардиолипиновым антигеном. Реакция агломерации с масляным трепонемным антигеном является более специфичной и чувствительной, чем микрореакция с кардиолипиновым, что привело к повышению процента выявляемости больных сифилисом на 4.1% и снижению частоты ложноположительных ответов на 1.4%. Большое практическое значение имеет доступность для любой лаборатории приготовления масляного трепонемного антигена для МР из антигена для РСК, а также сравнительно длительный срок годности изготовленного препарата - 10 дней при температуре +3 - +5'С. Несложна и доступна методика постановки и учета результатов данной реакции.

Апробация материалов диссертации. Основные положения диссертации были дожжены на Международном симпозиуме иммунологов, аллергологов, инфекционистов (г. Алма-Ата, 1991), на краевой конференции эпидемиологов (г. Ставрополь, 1992), на заседании краевого общества дерматологов и венерологов (г. Ставрополь,

1995), на межкафедральном заседании СтГМА (г.Ставрополь, 1995).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ. Имеется авторское свидетельство "Отборочный диагностический тест на сифилис" N 47.50904/14(128001) от 22.04.91 г.

Обьем и структура работы. Диссертация изложена на 153 страницах машинописи, иллюстрирована 22 таблицами, 12 рисунками и рпптпнт иа ттвпения, обзоюа литеоатуры. собственных наб-.чх'Дйний, ьа.'сл.'Очёния, выводов. Указатель литиршура 117 отечественных и 62 зарубежных источника.

МАТЕРИАЛЫ, МЕТОДЫ И РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Испытание масляного трепонемного антигена проводилось на 192 сыворотках крови больных сифилисом при одномоментной постановке реакции микропреципитации с кардиолипиновым антигеном и реакции связывания комплемента с ультраозвученным трепо-немным и кардиолипиновым антигенами. В случаях получения сомнительных результатов в указанных реакциях, сыворотки контролировали в реакции иммунной флюоресценции, как более специфичном и чувствительном тесте.

На следующем этапе испытания данного антигена были использованы 301 сыворотка крови доноров. Результаты исследований оценивали путем сравнения с данными реакций микропреципитации с кардиолипиновым антигеном и иммуноферментного анализа, которые, являются общепринятыми методами для контроля донорских сывороток.

Результаты исследований обработаны с помощью компьютера по специально составленной программе. В связи с тем, что результаты выражены в качественных показателях, анализ данных

проведен с использованием методов непараметрической статистики (Ефремов А. Ф., Ярыгина К А., 1956; Лакин Г. Ф. , 1990).

Для решения поставленных задач испытаны пять видов масел для приготовления мелкодисперсной масляной змульсии, которая стала основой предлагаемого антигена. Были взяты касторовое, репейное, оливковое, рафинированное масло подсолнечника и автомобильное моторное масло для легковых карбюраторных автомобилей. Первые три вида масла были аптечного изготовления. При подборе вида масла обращали внимание на максимальный срок сохранения стабильности масляной эмульсии во времени. Было приготовлено и апробировано на стабильность 25 серий масляных эмульсий. Контроль стабильности осуществляли путем визуального осмотра в падающем и проходящем свете, после чего данная масляная эмульсия рассматривалась в обычном световом микроскопе с объективом х40. Макро- и микроскопию осуществляли ежедневно. На сроки стабильности масляной змульсии влияла концентрация масла в изотоническом растворе натрия хлорида. Первую серию масляных эмульсий готовили из всех пяти видов масел в. следующей пропорции: 1 мл масла и 25 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида Вторая серия масляных эмульсий состояла из 1.3 мл масла и 20 мл изотонического раствора натрия хлорида. Третья, четвертая и пятая серии масляных эмульсий состояли из 2.5; 3. 0; 3. 5 мл масла в 25 мл изотонического раствора натрия хлорида соответственно. Для большей стабилизации исследуемых серий масляных эмульсий в каждую из них добавляли 3-5 капель 5% раствора буры. В результате проведенных исследований установили, что мелкодисперсная эмульсия на основе оливкового масла в его количестве 1.3 мл в 20 мл изотонического раствора натрия хлорида сохраняла стабильность

максимальное время - 10 суток. Автомобильное масло оказалось самым нестабильным: положительный микроскопический контроль сохранялся менее 2-х суток, а при микроскопии качество данной эмульсии оценивалось как неудовлетворительное уже в конце первых суток. Из остальных видов масляных эмульсий максимальный срок стабильности определялся у репейной эмульсии, которая сохраняла качество визуально и микроскопически в течение около 2 ;: 5 сухо;: ссо^'хохйешш Грие. ч). к снн»и с полутеням/!* результатами было решено для дальнейших исследований использб-вать мелкодисперсную эмульсию на основе оливкового масла, которая готовилась по следующей схеме:

1. 3 мл оливкового масла растворяли интенсивным встряхиванием в 20 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида и добавляли 3-5 капель 5%-ного раствора буры. Следующий этап в разработке масляного трепонемного антигена заключался в определении количества сухого вещества уль-траозвученного трепонемного антигена, необходимого для сенсибилизации мелкодисперсной масляной эмульсии. С этой целью были изготовлены 10 пробных серий антигена, каждая из которых отличалась по количеству ультраозвученного антигена и составляла: 1 мг ультраозвученного трепонемного антигена в 1 мл изотонического раствора натрия хлорида; 2 мг, 11, 12, 13, 14, 15 мг в 5 мл изотонического раствора натрия хлорида. Все приготовленные серии масляного трепонемного антигена испытывали в реакциях с 20 заведомо положительными и 20 заведомо отрицательными сыворотками крови (поставлено 400 микрореакций). В процессе испытания антигена при постановке указанных реакций с каждой серией препарата внимание обращали на четкость положительного результата в реакциях, который определяли визуально. Наилучший

888

888

«я»

888

»»к 888

в»» 888

#»8 888

«»И «88

888 888

8«« 888

888 888

888 888

888 888

888 888

а«« »«к

»»»

Обозначения:

О - оливковое Р - репейное К - касторовое П - подсолнечное Н - моторное

»«в

визуальный контроль

микроскопический контроль

К П

Рис. 1. График стабильности масляных эмульсий, подвергшихся наблюдении при хранении.

результат показал антиген V серии. При взаимодействии с заведомо положительными сыворотками крови препарат этой серии дал наиболее четко оформленный преципитат по центру раствора и просветвление по периферии. Увеличение же концентрации ультра-озвученного трепонемного антигена до 11-15 мг приводило к ухудшению положительного феномена с препаратом VII серии до появления феномена зоны с препаратом VI серии, где количество у.;ц>'хисЮЗвученного трепонемного антигена составило максимальнее по сравнению с другими девятью сериями и равнялось 15 мг сухого трепонемного антигена в 5 мл изотонического раствора натрия хлорида (табл. 1).

Используя опыт подкрашивания метиленовым синим или генци-анвиолетом диагностикума бруцеллезного с целью улучшения учета положительных реакций Райта при обследовании на бруцеллез (Никитин В. М., 1982; Пяткин К.Д., 1971), было решено испытать несколько серий масляного трепонемного антигена, подкрашенные метиленовым синим. Ожидаемого положительного эффекта не оказалось: результаты реакций изменились в худшую сторону. Серии антигена, давшие положительные результаты, стали имитировать отрицательные.

Далее было необходимо определить оптимальную сенсибилизирующую дозу взвеси ультраозвученного трепонемного антигена. С этой целью были приготовлены три серии препарата, отличающиеся различной концентрацией взвеси ультраозвученных трепонем. В серии, обозначенной А и приготовленной по вышеуказанной схеме, сенсибилизирующая доза антигена и масляная эмульсия взаимодействовали в пропорциях 1:1; в серии Б, В соотношение менялось 1:2 и 1:3 соответственно в сторону увеличения количества взвеси ультраозвученного трепонемного антигена.

Таблица 1

Результаты применения масляного трепонемного антигена с разными объемами ультраозвученного трепонемного антигена.

Варианты Изотони- Нльтраозву- Количе- Результаты

масляного ческий ченный трепо- ство

трепонем- раствор немный анти- сыворо-

ного ан- натрия ген (сухого ток МР РАМТА

тигена N хлориа.мл веществаКмг) крови

I 1 1 20 4 1. 2

II 5 2 20 4 2

III 5 3 20 4 2, 3

IU 5 5 20 4 3.4

и 5 10 20 4 4

ÜI 5 15 20 4 Феномен зоны

Uli 5 И 20 4 Част.фен.зоны '

Ulli 5 12 20 4 Част.фен.зоны

.IX 5 13 20 4 Феномен зоны

X 5 14 20 4 феномен зоны

Для определения оптимального соотношения серии А, 5, В испытывали в микрореакциях с 33 положительными и 33 отрицательными сыворотками крови. Результаты взаимодействия масляного. трепонемного антигена с полоаительными сыворотками крови распределялись следующим образом: препарат серии А дал положительный результат в 90.92, препарат серии Б - в 75.?'/., препарат £ерии В - в 62.7'/., то есть соотношение основных компонен-

Таблица 2

Результаты испытания активности НТЙ в реакциях с сыворотками крови больных сифилисом и доноров.

Серии МТА I Сыворотки крови Совпадающие результаты (%)

Больные СИфИЛ. Доноры Сыворотки öольнах сифилисом Сыворотки ДСНирОЗ

положит отриц. половит отриц

А 30 3 0 33 90.92 100%

Б 25 8 5 27 75.77. 81.8%

В 20 13 . 9 24 62.77. 72.6%

тов препарата при взаимодействии с полонительными сыворотками оптимально в пропорциях 1:1.

При постановке микрореакций с отрицательными сыворотками максимальную специфичность показал препарат серии fl, давший в 33 опытах с отрицательными сыворотками 33 отрицательных результата, тогда как препараты Б и В 81.8% и 72.5'/., соответственно. После выполнения этого этапа работы было определено, что оптимальное соотношение масляной эмульсии на основе оливкового масла и взвеси ультраозвученных трепонем составляет в пропорции, 1:1. (_табл. 2).

В результате всех вышеприведенных исследований было установлено нижеследующее:

- подкрашивание масляного трепонемного антигена нецелесообразно, так как приводит к ухудшению качества результатов в

микрореакциях с заведомо положительными сыворотками крови;

- определена оптимальная концентрация сухого вещества ультра-озвученного антигена в изотоническом растворе натрия хлорида для сенсибилизации мелкодисперсной масляной эмульсии на основе оливкового масла;

- определена методика приготовления масляного "трепонемного антигена.

Методика заключается в следующем.

1. Приготовление масляной эмульсии: 1.3 мл оливкового масла растворяют в 20 мл изотонического раствора натрия хлорида, добавляют в раствор 3-5 капель 5%-ного раствора буры. Интенсивно встряхивают в течение 10-15 минут, оставляют масляную эмульсию на 15 минут при комнатной температуре.

2. Приготовление взвеси ультраозвученного трепонемного антигена: 10 мг этого препарата растворяют в 5 мл изотонического раствора натрия хлорида. При легком встряхивании тре-понемный антиген хорошо растворяется, а при визуальном контроле в падающем, а особенно в проходящем, свете хорошо определяется степень растворения антигена.

3. Приготовление масляного трепонемного антигена: к 1 мл мелкодисперсной оливковой масляной эмульсии добавляют 1 мл взвеси ультраозвученных бледных трепонем, легко встряхивают в течение 10-15 минут. Этот раствор следует оставить на 30 минут при комнатной температуре. Далее гомогенный, сероватый, мутный без осадка раствор готов к использованию для постановки микрореакции для экспресс-диагностики сифилиса.

В связи с тем, что масляный трепонемный антиген предложен для экспресс-диагностики сифилиса при массовом обследовании населения, то есть предполагается постановка и учет микрореак-

ций в десятках и даже сотнях исследований в течение одного рабочего дня, необходимо было изучить факторы, которые усложняют, а, следовательно, и замедляют процесс профилактического обследования населения на сифилис.

Нам представляется, что основными факторами, отрицательно влияющими на процесс постановки и учета реакции в большом числе случаев обследования, являются следующие:

1». пои м1«"гяяовке £ инокам антиге-

ном в каждую лунку в определенной последовательности вносят семь капель необходимых инградиентов, при условии, что в серологических лабораториях, занимающихся рутинной диагностикой сифилиса, наборы специального оборудования находятся на примитивном уровне, совершенно очевидно, что процесс раскапывания -достаточно сложная, громоздкая работа и, естественно, говорить о постановке в десятках и тем более в сотнях случаев за один рабочий день очень сложно;

2). начало учета реакции зависит от времени выпадения хлопьев в лунке со слабоположительной сывороткой, то есть в условиях дефицита времени при массовых обследованиях, необходимо держать под контролем и ато явление;

3). при массовом обследовании на сифилис используют планшеты (пластины) с 72 лунками, часть из которых идет для постановки контролей, чем, естественно, уменьшается количество обследуемых сывороток. Следовательно, количество пластин может достигать значительного числа, что при отсутствии специального оборудования для упорядоченного расположения пластин с последующим учетом приводит к увеличению физической нагрузки на персонал, влияет на конечную оценку микрореакции.

В связи с перечисленным выше, поиск оптимальной методики

с - 14 -

постановки реакции агломерации масляного трепонемного антигена мы провели в нескольких направлениях. Первое направление заключалось в уменьшении ингредиентов и их объемов.

Второе направление представляло использование различных вариантов освещения, определенного фона, на котором более четко был бы виден результат этой реакции.

Третье направление состояло в разработке простого, доступного для любой серологической лаборатории специального стола для учета микрореакций при большом числе постановок.

Четвертое направление было связано с максимальным упрощением в трактовании и оценке данной реакции.

В результате исследований по разработке более простой методики постановки реакции с масляным трепонемным антигеном, чем постановка микрореакции с кардиолипиновым антигеном, при массовом обследовании населения на сифилис было решено использовать следующий принцип; состав инградиентов и методику ее постановки.

Принцип реакции. Происходит взаимодействие противотрепо-немных антител сыворотки крови с частицами мелкодисперстной эмульсии на основе оливкового масла, сенсибилизированной взвесью ультраозвученных трепонем, что приводит к образованию преципитата, состоящего из крупнодисперсных частиц масляного трепонемного антигена по центру лунки.

Ингредиенты: ультраозвученный трепонемный антиген для реакции связывания комплемента, аптечное оливковое масло.

Растворы: изотонический раствор натрия хлорида 0.97.; 5% раствор буры.

Принцип приготовления масляного трепонемного антигена

состоит из трех основных этапов.

I этап - приготовление мелкодисперсной масляной эмульсии на основе оливкового масла.

II этап - приготовление взвеси сухого ультраозвученного трепонемного антигена в стерильном изотоническом растворе натрия хлорида.

III - сенсибилизация мелкодисперсной масляной эмульсии

¿иьионем в рчннух об^е"?^.

Сыворотки крови для исследования в данной микрореакции готовятся как и для РСК. Для постановки реакции с масляным тре-понемным антигеном использовали цельные инактивированные сыворотки крови. Это объясняется несколькими причинами. Приготовление разведений сывороток при массовой постановке реакции сильно усложнит весь процесс подготовки и постановки реакции, что уменьшит число обследований в единицу времени. Вторая причина обьясняется тем, что количество антител в цельной сыворотке больше, чем в разведенной.

Методика постановки реакции агломерации масляного трепонемного антигена.

Пастеровской пипеткой вносят в лунки по одной капле масляного трепонемного антигена. В первую лунку вносят каплю изотонического раствора натрия хлорида, а в остальные лунки -по одной капле исследуемых сывороток крови. В каждую лунку добавляют инактивированную сыворотку крови только от одного обследуемого лица и нумеруют ее соответственно списку в регистрационном журнале. Инградиенты перемешивают встряхиванием с течение 5 минут, результат учитывают через 5-7 минут после встряхивания.

Оценка результатов. Для определения результатов реакции с

масляным трепонемным антигеном необходимо пользоваться контролем антигена, как критерием отрицательной реакции. Просветление раствора по переферии и образование крупнодисперсного преципитата по центру лунки говорит о положительном результате. Одинаковая мутность и в опытной, и в контрольной лунках свидетельствует об отрицательном результате реакции. Учитывая необходимость срочного и качественного учета при большом числе учитываемых реакций во время профилактических осмотров населения, мы рекомендуем не пользоваться системой "крестов (+)", а использовать только два варианта- плюс (+) или минус (-), то есть положительный или отрицательный результат соответственно.

Источники ошибок, неравномерная концентрация антигена в эмульсии вследствие недостаточного перемешивания ее перед использованием. Бактериальное загрязнение эмульсии. Нарушение условий и сроков хранения сыворотк крови, антигена, его эмульсии, растворов. Использование при постановке реакции загрязненных пробирок, пипеток, пластинок, растворов. Вышеуказанные ошибки могут приводить к появлению как ложноположительных,, так и ложноотрицательных результатов реакции.

С целью 'большей оптимизации учета результатов в предлагаемой микрореак$щ были исследованы разные варианты освещения пластийки: 1) освещение искусственное снизу планшета; 2) сбоку; 3) сверху; 4) освещение естественное.

Из исследованных вариантов освещения наиболее подходящими оказались два - освещение искусственное сверху и освещение естественное. Но и в первом, и во втором вариантах есть минусы, а именно: осгвещэние вертикальное сверху требует определенного взаиморасположения источников света, лаборанта и пластин, где осуществляется учет микрореакции. Освещение

естественное позволяет быть более мобильным во время учета, не требует строгого расположения лаборанта и штатива, но очень сильно зависит от состояния погоды. В связи с невозможностью решить проблему оптимизации учета данной реакции при массовой постановке ее только улучшая освещенность, была попытка использовать учет реакции в увеличенном виде. С использованием увеличительной линзы или лупы учет реакции значительно облегчался СГ><?7МСП* Г^ЛСС^ ВРЗМЛ Уь^а и«аи«1

ции, что при постановке большого числа реакции даст значительную экономию рабочего времени. Однако после, проведенных экспериментов стало ясно, что для решения поставленной задачи необходимо использовать: 1) полезное сочетания источника света, который не зависит от погодных условий и не требует определенного вынужденного расположения лаборанта во время учета; 2) наличие увеличительной линзы; 3) переоборудование рабочего места. Для облегчения усилий персонала при учете большого числа микрореакций мы рекомендуем произвести несложное, доступное для любого лечебно-профилактического учреждения переоборудование рабочего стола, заключающееся в том, что по всей длине его крышки делают углубление аирииой 1СЭ мм. Эта прорезь позволяет пластинке удерживаться на уровне поверхности стола без посторонней помощи. В зависимости от длины прорези в крышке будет и число пластинок, которое может находиться на этом столе одномоментно. Внутри стола устанавливают искусственный источник света в определенном положении, которое в каждом случае зависит от ширины, высоты стола, качества самого источника света. При помощи небольшой модернизации обычного штатива, использующегося с различными целями в практической медицине, необходимо стационарно закрепить увеличитель-

ное стекло в максимально удобном для учитывающего сотрудника положения. Такое сочетание освещенности, не зависящее от погодных условий, отсутствие необходимости рассматривать результаты реакций в пластинке, держа ее в руках, использования увеличительного прибора, значительно уменьшает напряжение глаз лаборанта при постановке и учете большого числа реакций.

Исходя из полученных данных, можно сделать следующее заключение:

- методика постановки микрореакции с масляным трепонемным антигеном значительно упрощена по сравнению с микрореакцией с кардиолипиновым антигеном;

- время от начала постановки до учета предлагаемой реакции значительно меньше;

- использование сочетания источников света, увеличительной линзы и. переоборудованного стола для учета микрореакции с масляным трепонемным антигеном делает реальным проведение данной реакции в десятках и даже сотнях случаев в течение рабочего дня.

Очень важными показателями при оценке предполагаемого антигена являемся активность его при выявлении больных сифилисом, специфичность и чувствительность микрореакции с ним при взаимодействии с сыворотками крови доноров, больных сифилисом и пациентов, прошедших полный курс противосифилитического лечения, в связи с чем снимающихся с учета.

Для определения активности масляного трепонемного антигена были исследованы 192 сыворотки крови больных сифилисом при одномоментной постановке микрореакции с кардиолипиновым антигеном и РСК с кардиолипиновым и ультраозвученным антигенами. В сомнительных случаях использовали результаты РИФ.

При постановке .микрореакции с масляным трепонемным антигеном со 192 сыворотками крови больных сифилисом было получено 177 (92.1%) положительных результатов, тогда как в микрореакции с кардиолипиновым антигеном - 170 (88.0%). Реакция связывания комплемента с кардиолипиновым антигеном была несколько более активна (у 172 - 89.5%) по сравнению с микрореакцией с кардиолипиновым антигеном. Реакция связывания комплемента с

ТТТТ^тр^"^.«."• спит ип.яп МЧ.Ш |«ИТН ЛЛИГШ п

175 случаях (90.9%).

Данными РИФ пользовались только в 32 случаях, когда результаты тестов были сомнительными (табл. 3). Сравнительный статистический анализ сомнительных результатов показал, что отрицательных результатов в РАМТА получено в достоверно (р<0.01) меньшем количестве случаев в сравнении с РСК (ТА) (г=30, р<0.01); РСК (КА) (2=27, р<0.01) и МР (КА) (г=25, р<0. 01), что свидетельствует о более высокой активности МТА; чем указанных выше реакций.

Из приведенных данных видно, что максимальной активностью обладал масляный трепонемный антиген, активность которого выше на л. 1 т- р. 5%; 1. о% показателей кардшлшшнового, в

микрореакции, кардиолипинового, а такж ультраозвученного в реакции связывания комплемента соответственно.

Полученные результаты статистического анализа и данные исследования, представленные в процентах, свидетельствуют о достоверно (р<0.01) более высокой активности МТА в сравнении с кардиолипиновым и ультраозвученным трепонемным антигеном в МР и РСК

Для определения специфичности микрореакции с масляным трепонемным антигеном были исследованы сыворотки крови 301 до-

Таблица 3.

Сравнительный анализ активности МТЙ, кардиолипинового, трепонемного антигенов в реакциях с сыворотками больных сифилисом.

Количество Реакции

сывороток больных

Р С К Н Р Р й МТЙ РИФ

сифилисом

й Н Т И Г Е Н а

Т А К й К й МТЙ

192 175 172 170 177 32

17 20 22 15 0

Примечание: РИФ использовали в сомнительных случаях. В числителе - число положительных результатов, в знаменателе - число отрицательных результатов.

нора при одномоментной постановке реакции с кардиолипиновым антигеном и иммуноферментным анализом. Результаты иммунофер-ментного анализа и микрореакции с масляным трепонемным антигеном во всех случаях были отрицательными, тогда как микрореакция с кардиолипиновым антигеном дала 4 (1.4%) положительных результата.

Полученные в наших исследованиях данные определения специфичности РЙМТЙ. полностью совпадали с результатами ИФА, что

свидетельствует о высокой специфичности предполагаемого теста.

Для определения чувствительности РАНГА были исследованы сыворотки крови 23 больных сифилисом, прошедших полный курс противосифилитического лечения, в связи с чем снимающихся с учета. Чувствительность микрореакции с кардиолипиновым антигеном в данном случае оказалась равной нулю, так как со всеми 23 сыворотками полноценно пролеченных больных сифилисом были по-отрицательные рянультатм. Реакция свявкваякя комплемзя-та с кардиолипиновым антигеном в 2-х случаях была положительной, з 21 был получен отрицательный результат; с ультраозву-ченным трепонемным антигеном в этой реакции были получены следующие результаты - 6 положительных и 17 отрицательных.

Реакция агломерации масляного трепонемного антигена с указанны».™ сыворотками в 18 случаях была положительной, в 5-ти отрицательной. Эти данные свидетельствуют о высокой чувствительности нового теста, так как полученные результаты в нем совпадают с таковыми в РИФ. Что подтверждается и результатами статистического анализа, при котором было выявлено, как с помощью критерия знаков, так и методом Х2 достоверно (р<0.01, р<0.05) более высокая способность МТА в реакции агломерации взаимодействовать со специфическими антителами сывороток крови по сравнению с МР (Х2=32.9, р<0.01), РСК с ТА (Х2=12.5, р<0. 01) и РСК с КА (Х2=25. 5, р<0.01). Таким образом, новый экспресс-тест, как и РИФ, не может служить критерием излечен-ности сифилиса.

- 22 -ВЫВОДЫ

1. Предложен новый отечественный специфический антиген для микрореакции на сифилис, представляющий собой мелкодисперсную взвесь оливкового масла в изотоническом растворе натрия хлорида, сенсибилизированную ультаозвученным трепонемным антигеном для реакции связывания комплемента производственного изготовления (НПО "Аллерген", г. Ставрополь). Методика приготовления антигена защищена авторским свидетельством "Отборочный диагностический тест на сифилис" N 47.50904/14(128001) от 22.04.91 г. Особенностью антигена является возможность его приготовления в лечебно-профилактических учреждениях из готовых инградиентов.

2. Разработана оригинальная методика постановки и учета результатов отборочного теста на сифилис с масляным трепонемным антигеном. Показана простота и доступность ее для экспресс-диагностики сифилиса при использовании в лабораториях любого уровня при массовых профилактических обследованиях населения.

3. Установлена высокая активность масляного трепонемного антигена £92.1%), значительно превышающая активность кардиоли-пинового аИтигрна на 4.1%. Показана на сыворотках доноров высокая специфичность реакции агломерации масляного трепонемного антигена (100%), превышающая результаты теста с кардиоли-пиновым антигеном (98.6%), и полностью' совпадающая с результатами иммуноферментного анализа.

4. Использование микрореакции с масляным трепонемным антигеном, как и других специфических серологических тестов, в качестве критерия излеченности сифилиса не допускается в связи с более длительной выработкой специфических антител в организ-

М8 больного сифилисом, по сравнению с неспецифическими реагинами.

5. Установлен экономический эффект от использования экспресс теста с масляным трепонемным антигеном: стоимость масляного трепонешюго антигена в расчете на 100 исследований в 17.7 раз дешевле,, чем стоимость в микрореакцки с ¡сардин::ценовым антигеном, и в 91 раз дешевле стошости' реакции связывания с ?лгг!*г°ном. -т» суммы составляют соответственно 132, 2330 и 13 015 рублей (в ценах на июнь 1995), что позволяет расширять экспресс-диагностику сифилиса, особенно в регионах, неблагополучных по заболеваемости сифилисом.

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ

Ыасляный трепонемный антиген используется з лаборатории, краевого клинического кожно-венерологического диспансера г. Ставрополя и серологической лаборатории Ставропольской краевой станции переливания крови.

Разработаны и утверждены Ученым советом Ставропольской государственной кодиынской академии "Методические рекомендации по применению нового специфического трепонешюго антигена для экспресс-диагностики сифилиса" для работников серологи1 ческих лабораторий кожно-венерических диспансеров и станций переливания крови.

Основные научные положения и практические положения работы внедрены в учебный процесс Ставропольской государственно,"! медицинской академии на кафедрах микробиологии и дерматовенерологии для студентов трех факультетов и для слушателей фа-

культетов повышения квалификации врачей и преподавателей медицинских училищ.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Авторское свидетельство: Отборочный диагностический тест на сифилис N 47.50904/14(128001) (Крылова О. П., Верею-тина О. А.} - Комитет по изобретениям, Мэсква, 1991.

2. Некоторые аспекты совершенствования лабораторной диагностики сифилиса. - //Тез. конф. молодых ученых. - Махачкала, 1990. - С. 231-232.

3. Использование масляного трепонемного антигена в экспресс-тесте на сифилис (Вереютина О. А.). - //В кн.: Материалы международного симпозиума иммунологов, аллергологов, инфекционистов. - Алма-Ата, 1991. - С. 30-31.

4. Применение экспресс-диагностики с масляным трепонемным антигеном в диагностике и профилактике сифилиса (Вереютина O.A.). - //Материалы научно-практической конференции "Эпидемиологические аспекты краевой патологии Ставрополья". Ставрополь, 1992. - С. 78-80.

5.- Применение нового антигена для экспресс-диагностики сифилиса (Чеботарев В.R). - //Материалы итоговой научной конференции. - Сб. науч. тр. Ставропольской гос. мед. академии. -Ставрополь, 1994. - С. 136-137.

Зак. 416 15/11 - 1995г, Тираж 100.

Отпечатано в Ставропольском краевом комитете

государственной статистики г.Ставрополь, ул.Пушкина. 4 тел.24-48-24