Локальное разделение зарядов в мембране при адсорбции и ионном транспорте

Соколов, Валерий Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Локальное разделение зарядов в мембране при адсорбции и ионном транспорте
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Локальное разделение зарядов в мембране при адсорбции и ионном транспорте"

На правах рукописи

СОКОЛОВ ВАЛЕРИЙ СЕРГЕЕВИЧ

ЛОКАЛЬНОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ ЗАРЯДОВ В МЕМБРАНЕ ПРИ АДСОРБЦИИ И ИОННОМ ТРАНСПОРТЕ

Специальность 03.01.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

2 5 ОКТ 2012

Москва, 2012

005053812

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физической химии и электрохимии им. А.Н.Фрумкина РАН

Официальные оппоненты:

Антонов Валерий Федорович, доктор биологических наук, профессор, кафедра медицинской и биологической биофизики Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова, заведующий кафедрой

Яковенко Леонид Владимирович, доктор физико-математических наук, кафедра биофизики физического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова, профессор

Малев Валерий Вениаминович, доктор химических наук, профессор, кафедра электрохимии химического факультета СПбГУ, заведующий кафедрой

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН

Защита состоится 18 октября 2012 года в 14 часов на заседании совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук Д.501.001.96 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет, аудитория 389.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

Автореферат разослан «15» сентября 2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор биологических наук

М.Г.Страховская

Введение

В настоящее время бурно развивается направление, которое называют молекулярной биологией клетки; се важным разделом является биофизика мембран. Важность этого направления обусловлена тем, что мембранные структуры, широко представленные в клетке, выполняют множество функций: барьерную, информационную, обеспечивая генерацию и передачу нервного импульса, и энергетическую, осуществляя синтез АТФ. Все эти функции реализуются в ходе пассивного и активного транспорта заряженных частиц через мембраны, за который ответственны белковые молекулярные машины. Плазматическая мембрана, благодаря барьерным свойствам и транспортным белкам, поддерживает уникальный ионный состав клетки, отличающийся от состава внешней среды, что обеспечивает возможность жизни клетки в неравновесных условиях. Изучение мембранного транспорта дает ключ как к пониманию механизмов функционирования мембранных белков, так и к разработке препаратов и методов воздействия на мембранный транспорт, влияющих на функционирование отдельных клеток и организмов.

Несмотря на то, что механизм ионного транспорта изучается довольно давно, многие вопросы остаются открытыми. К ним в первую очередь относятся физические механизмы элементарных стадий переноса ионов в мембране. Мембранный транспорт включает в себя три основные стадии: диффузию в водном растворе, адсорбцию на границе раздела мембраны с водой и собственно перенос через мембрану. Предметом наших исследований является изучение двух последних стадий: адсорбция различных молекул на поверхности мембраны и собственно транспорт через липидный бислой, как пассивный, осуществляемый либо в результате прямого прохождения, либо с помощью ионофоров, так и активный, реализуемый №,К,АТР-азой. Скорость каждой из стадий определяется скачком электрического потенциала на соответствующем участке пути. Однако детальное исследование влияния локальных электрических полей на отдельные стадии ионного транспорта не удавалось изучить из-за недостатка экспериментальных методов их регистрации. В настоящей работе были разработаны как новые экспериментальные методы измерения граничных и внутримембранных скачков потенциала, так и оригинальные подходы к изучению механизма ионного транспорта, в частности, регистрации токов смещения при функционировании Ыа,К,АТР-азы.

На скорость отдельных стадий ионного транспорта могут влиять биологически активные соединения, молекулы которых встраиваются на границе мембраны и изменяют распределение электрического поля на границе мембраны с водой. Изучение взаимодействия таких соединений с липидной мембраной имеет как фундаментальное значение, поскольку они служат инструментом для изучения ионного транспорта, так и

прикладное, поскольку многие из них являются лекарственными препаратами. Эффективность действия этих соединений определяется не только способностью их связывания с мембраной, но и тем, на какой глубине в мембране это связывание происходит. В настоящей работе изучается связывание с липидной мембраной молекул различных соединений, обладающих заряженными группами. Глубина расположения заряженных групп в мембране определяется с помощью методов, позволяющих измерять скачки потенциала в плоскостях, расположенных на различном расстоянии от границы раздела мембраны с водой. На примере нескольких соединений, которые сами по себе представляют интерес, поскольку являются лекарственными препаратами либо зондами, были установлены основные закономерности их адсорбции.

Актуальность

Актуальность данного исследования определяется тем, что ионный транспорт необходим для поддержания жизнедеятельности клетки, и изучение функционирования молекулярных машин, осуществляющих этот транспорт, является одной из основных задач клеточной биологии. Установление молекулярного механизма ионного транспорта невозможно без знания окружения, в котором работают молекулярные устройства, осуществляющие ионный транспорт. Важным этапом в таком исследовании является установление детальной картины строения электрического поля в липидном бислое, в который встроены ионные переносчики. Решение этих задач потребовало создания нового направления, в котором исследуются локальные электрические поля в липидной мембране и способы их изменения. Это, в свою очередь, потребовало создания новых экспериментальных методов регистрации этих полей.

Научная новизна

Большинство результатов было получено с помощью разработанных нами оригинальных методов. В первую очередь к ним относится метод компенсации внутримембранного электрического поля, который позволил детально регистрировать и контролировать локальные электрические поля в мембране при адсорбции на ней различных соединений и при работе молекулярных машин, осуществляющих ионный транспорт. В результате исследований были открыты и изучены явления, которые ранее были недоступны для наблюдения: кинетика адсорбции заряженных и нейтральных молекул на границе БЛМ, электронейтральный транспорт органических ионов через мембрану, скачки потенциала, возникающие на границе мембраны при окислительных реакциях. Было показано, что, вопреки распространенной в литературе точке зрения, продукты цикла зрительного родопсина не разрушают мембраны как детергенты. Они обладают свойствами слабых фотосснсибшшзаторов, но основную роль в гибели

эпителиальных клеток играют продукты их автоокисления под действием освещения. Изучение влияния граничных потенциалов на индуцированную проводимость позволило установить механизм электрогенного обменного транспорта, осуществляемого антибиотиками нигерициновой группы, что, в свою очередь, позволило объяснить необычные свойства трансмембранных потенциалов при градиентах участвующих в транспорте ионов. Разработанный в работе метод адмиттанса для исследования механизма переноса заряда в натриевом насосе позволил изучить тс стадии переноса заряда при функционировании ¿Ча,К,АТР-азы, которые были недоступны для изучения с помощью традиционных электрофизиологичсских методов.

Практическая ценность

Практическая значимость работы состоит в том, что она позволяет детально исследовать биологически активные соединения, механизм действия которых включает их связывание с мембраной. Особое значение имели исследования взаимодействия с липидной мембраной фотосенсибилизаторов, использующихся при лечении онкологических заболеваний. Изучены различные стадии действия фотосенсибилизаторов на мембрану: их связывание на поверхности, а также механизмы разрушения как самих мембран, так и встроенных в них молекул-мишеней активными формами кислорода, образующимися при освещении. Было также исследовано взаимодействие с мембраной продуктов цикла зрительного родопсина, накопление которых в клетках зрительного эпителия приводит к развитию возрастной дегенерации сетчатки глаза. Эти исследования могут иметь существенное значение для разработки эффективных средств лечения данных заболеваний.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 53 статьи в ведущих международных и отечественных журналах, включенных в список ВАК: Biophysical Journal, Biochimica et Biophysica Acta, European Biophysical Journal, Journal of Photochemistry and Photobiology, J. Membrane Biol., Bioclectrochcmistry, Доклады Академии Наук СССР, Биофизика, Биологические мембраны. Автор участвовал в публикации нескольких обзоров: в журнале Биологические мембраны (1999), а также в сборниках Planar Lipid Bilaycrs (BLMs) and their applications (editors H.T.Tien and A.Ottova-Lcitmannova, Elsevier, 2003); Ultrathin Electrochemical Chemo- and Biosensors: Technology and Performance (editor V.M.Mirsky, Springer-Verlag, Heidelberg, 2004).

Апробация

Полученные нами результаты докладывались на авторитетных конференциях: съездах Американского биофизического общества (1996, Baltimore, 2001, New Orlean,

2007, Baltimore), Европейского биофизического общества (2007, London, UK; 2009, Genue, Italy), Съездах биофизиков России (Москва, 1982, Москва, 1999; Воронеж, 2004), Международных конференциях по Na,K,ATP-a3e (1993, Toodmos, Germany, 1997, Argentine; 2003, Elsenor, Dcnmark; 2008, Aarhus, Denmark), Международных Фрумкинеких симпозиумах.

Диссертация состоит из введения и 5 глав, в которых содержится литературный обзор, описание использованных в работе методов, а также результаты экспериментального исследования. В литературном обзоре представлены современные представления о строении электрического поля в мембране, способах измерения скачков потенциала на границе мембраны с раствором, влиянии различных соединений на ионный транспорт через мембрану посредством изменения этих скачков потенциала, а также о механизме активного транспорта, осуществляемого Na,K,ATP-a3oii. Результаты исследований содержатся в трех разделах, организованных в виде отдельных глав. Первый раздел посвящен исследованию адсорбции заряженных и нейтральных дипольных молекул на поверхности БЛМ. Сначала с помощью различных экспериментальных методов и теоретических моделей изучены основные закономерности их адсорбции. Далее приводятся результаты, полученные при изучении взаимодействия с БЛМ важных для медицины соединений - продуктов цикла зрительного родопсина и фотосенсибилизаторов, используемых при лечении раковых заболеваний. Во втором разделе излагаются результаты исследования пассивного элсктрогенного обменного транспорта, осуществляемого антибиотиками нигерициновой группы. В последнем разделе содержатся результаты исследования активного транспорта, осуществляемого Na,K,ATP-a3ofi.

1. Адсорбция заряженных или дипольных молекул на БЛМ

Исследование адсорбции различных соединений на БЛМ проводили с помощью трех методов, которые дополняют друг друга. Они позволили определить изменение потенциала в разных плоскостях по отношению к поверхности БЛМ. Эти методы включают в себя как оригинальный метод компенсации внутримембранного поля (КВП), так и широко известные, такие как измерение Ç-потснциала по электрофорстичсской подвижности липосом, а также определение скачков потенциала в мембране на основании измерения кинетических параметров пассивного ионного транспорта. Как будет показано ниже, совокупность этих методов позволяет не только установить факт адсорбции молекул на БЛМ, но и их погружение внутрь липидного бислоя, либо проникновение сквозь бислой.

1.1. Измерение разности граничных потенциалов БЛМ методом компенсации внутримембранного поля по второй гармонике емкостного тока

Для измерения разности граничных потенциалов асимметричных БЛМ нами был предложен метод компенсации внутримембранного поля (КВП), основанный на способности мембраны сжиматься в электрическом поле, уменьшая свою толщину и увеличивая электрическую емкость (Alvares and Latorre, 1978). Принцип измерения можно иллюстрировать с помощью упрощенной модели, в которой мембрана представлена в виде трех последовательно соединенных конденсаторов (рис.1). Внешние конденсаторы Ci и Сз представляют полярные области мембраны, где возникают граничные потенциалы, внутренний конденсатор С2 - гидрофобную область мембраны, способную сжиматься в электрическом поле. Из-за того, что гидрофобная область мембраны имеет большую толщину и более низкую диэлектрическую проницаемость по сравнению с областями, где расположены головки фосфолипидов, емкость внутреннего конденсатора много меньше емкостей внешних конденсаторов. Поэтому именно на С2 падает основная часть приложенного внешней цепью напряжения, что позволяет полагать именно эту область мембраны ответственной за се сжатие в электрическом поле.

с, с2 с3

Рис.1. Сверху - профиль распределения электрического потенциала на мембране в условиях короткозамкнутой цепи (сплошная линия) и компенсации внутримембранного поля (пунктир). Снизу - модель, представляющая гидрофобную область мембраны и се полярные области в виде электрических конденсаторов.

Падение напряжения <рт на внутреннем конденсаторе (которое и определяет виутримембранное поле) равно сумме напряжения и, приложенного внешней цепью, и разности падений напряжений на внешних конденсаторах Д(рь~^<рь-<рь (т.е. разности граничных потенциалов)

<Р,„=и-А<рь (1)

Если граничные потенциалы с двух сторон мембраны различны, в условиях короткозамкнутой цепи (т.е. при и=0) возникает внутримембранное поле (рис. 1, сплошная линия). Значение Дфь измеряют как напряжение между растворами, которое компенсирует это внутримембранное поле, в результате чего достигается минимальное значение емкости мембраны. Мы предложили удобный способ измерения Дфь, основанный на регистрации второй гармоники емкостного тока. Генерация высших гармоник происходит из-за того, что мембрана является нелинейным конденсатором, зависимость емкости которого от напряжения имеет минимум при и=Дфь. Эту зависимость при малых изменениях емкости можно аппроксимировать первым членом разложения в степенной ряд вблизи точки минимума

С = С0\ + а{и-А<рь)2\^ (2)

где Со - значение емкости в точке минимума, а - коэффициент, характеризующий способность мембраны сжиматься в электрическом поле. Пусть и изменяется во времени по закону

II = ио+ Ксоз(йЛ)

где 11о - постоянная составляющая напряжения, V - амплитуда и со - круговая частота переменной составляющей напряжения. Тогда ток, регистрируемый во внешней цепи, содержит, помимо основной, вторую и третью гармоники.

/ = -УсоС,

-» ссУ 1 + Зог({/0-Д%)-+ —

¡т(ая)-ЗаС0(оУ2(ио - Д№)зт(2^)--оС0й#35т(3<М') (4)

Амплитуда второй гармоники пропорциональна и^-Ащ, - отклонению постоянной составляющей напряжения от точки минимума емкости (или постоянной составляющей внутримембранного поля).

/2и = ЗоС0«Г2(£/0-Л%) (5)

Таким образом, разность граничных потенциалов А<рь можно определить как величину постоянной составляющей напряжения 1?о, обращающей этот сигнал в ноль. Преимуществом данного метода является высокая точность измерения Афь благодаря использованию селективных усилителей, а также возможность автоматической компенсации второй гармоники с помощью обратной связи, что дает возможность регистрации кинетики изменения граничных потенциалов на БЛМ.

С помощью описанного выше метода КВП и других методов мы исследовали изменение граничного потенциала БЛМ при адсорбции на ней различных веществ.

Наиболее простыми из них были неорганические и органические ионы, а также электронейтральные молекулы, обладающие дипольным моментом. Многие из этих соединений представляют отдельный интерес, и сама возможность изучения их взаимодействия с мембраной, открывшаяся благодаря данной методике, служит иллюстрацией ее перспективности для клеточной биологии.

1.2. Неорганические ионы

Неорганические ионы всегда присутствуют в среде, окружающей биологические мембраны, поэтому неудивительно, что исследование влияния этих ионов на свойства мембран, в частности, на электростатические потенциалы, представляет значительный интерес (см., например, обзоры (McLaughlin, 1977; Ccvc, 1990; Tocanne, 1990). Было показано, что потенциалы на границе заряженной БЛМ с растворами неорганических ионов удовлетворительно описываются теорией Гуи-Чспмена, согласно которой для 1:1 электролита потенциал удовлетворяет простому уравнению

В соответствии с этим уравнением, неорганические ионы влияют на поверхностный потенциал ф5 либо за счет изменения поверхностного заряда мембраны а вследствие адсорбции на БЛМ, либо за счет экранирования существующего заряда мембраны за счет изменения их концентрации с; в растворе. Предсказываемое данной теорией измснсешс потенциала происходит снаружи мембраны, в диффузном слое раствора электролита. Для определения потенциала в этой области существует- удобный метод, основанный на измерении элсюрофоретической подвижности липосом, и сопоставление этого метода и метода КВП позволило проверить способность последнего к измерению падения потенциала в диффузном слое. При этом следует отмстить, что плоскость скольжения, где определяется ¡¡-потенциал, измеряемый элсктрофорстичсским методом, не совпадает с условной поверхностью мембраны, в которой определяется поверхностный потенциал cps. Ранее было показано, что значения ¡¡-потенциала можно пересчитать, пользуясь теорией Гуи-Чспмена, в поверхностные потенциалы, предположив, что плоскость скольжения отстоит от поверхности мембраны на расстоянии около 2 А0, и тогда они согласуются с граничными потенциалами, измеренными по изменению проводимости в присутствии нонактина (McLaughlin, 1983). Мы показали, что аналогичная процедура позволяет получить совпадение поверхностных потенциалов, пересчитанных из ¡¡-потенциалов, с потенциалами, измеренными методом КВП, в случае адсорбции на БЛМ из фосфатидилхолина двухвалентных ионов магния или бериллия (рис.2).

(6)

Следует отметить, что такое хорошее совпадение, свидетельствующее, что изменение потенциала происходит только в диффузном слое, не всегда имело место даже в случае неорганических ионов. Далее будет рассмотрен целый класс соединений, где потенциалы, измеренные данными методами, не совпадали, и это позволило сделать вывод о том, что плоскость, где расположены заряды адсорбированных соединений, погружена в мембрану.

60 50 40

2 30

Э-"20 10 о

-5 -4 -3 -2 -1 0

1од(Ме), М

Рис.2. Зависимость изменения граничного потенциала бислойной липидной мембраны, сформированной из диолеилфосфатидилхолина, при адсорбции на ней двухвалентных ионов бериллия (кружки) и магния (треугольники) от концентрации этих ионов в растворе. Черными символами показаны потенциалы, измеренные на липосомах методом измерения электрофоретичсской подвижности, белые символы - потенциалы, измеренные на БЛМ методом КВП.

1.3. Амфифильные ионы

Амфифильные ионы представляют собой органические молекулы, имеющие гидрофобные группы на одном конце и заряженные полярные группы — на другом. Мы изучили адсорбцию ряда амфифильных ионов на БЛМ с помощью трех методов: КВП, электрофоретической подвижности и по изменению индуцированной проводимости. Было показано, что адсорбция амфифильных ионов на мембране, в отличие от неорганических ионов, сопровождается погружением их заряженных групп в мембрану, а в ряде случаев -проникновением ионов через мембрану в электронейтральном виде по механизму, включающему в себя протонирование или дспротонирование ионов на границах мембраны.

Зависимость потенциала от ионной силы. «Неэкранируемый скачок потенциала».

Нами было показано, что граничный потенциал, образующийся на БЛМ при адсорбции амфифильных ионов, зависит от ионной силы раствора значительно слабее,

чем следует из теории Гуи-Чепмена. Для объяснения этого экспериментального факта было выдвинуто предположение, что заряженные группы амфифильных ионов погружаются в мембрану. Аналогичное предположение высказывалось ранее в литературе при изучении гидрофобных ионов, которые, в отличие от амфифильных, свободно проникают через мембрану, увеличивая се проводимость. Согласно простейшей модели (Andersen et al, 1978), граничный потенциал состоит из двух частей.

<Pb=<Ps+(Ps (7)

Первое слагаемое - падение потенциала в диффузном слое, или поверхностный потенциал - экранируется электролитом в растворе (т. е. зависит от его концентрации в соответствии с теорией Гуи-Чепмсна). Вторая часть - <ps - возникает в примембранном слое между плоскостью адсорбции ионов и границей мембраны с водой, куда не могут свободно проникать ионы электролита из раствора. Этот потенциал не зависит от концентрации электролита, и поэтому, в соответствии с (Krasne et al, 1983), он был назван неэкранирусмым скачком потенциала. Нсэкранируемый потенциал пропорционален суммарному поверхностному заряду адсорбированных ионов а.

Ъ = (Т,С', (8)

где es - емкость поверхностного слоя мембраны, в котором происходит погружение ионов. Величина а связана с концентрацией ионов в растворе Са распределением Больцмана

a = zKCacx

RI , (9)

где z - валентность ионов, К - константа связывания.

Зависимость граничного потенциала фь от ионной силы тем слабее, чем больше вклад «нсэкранируемого» скачка потенциала <pg, т.е. чем глубже в мембране происходит адсорбция ионов. Слабая зависимость потенциала от ионной силы, свидетельствующая о возникновении нсэкранируемого потенциала, наблюдалась нами для многих амфифильных ионов различной структуры. На рис.3 показаны измеренные методом КВП зависимости изменения граничного потенциала от концентрации в растворе амфифильных ионов 4 различных видов: анионов додецилеульфата натрия (SDS) и флуоресцентного красителя (ANS), а также катионов ремантадина (REM) и тстракаина при разных концентрациях КС1. Рассмотренная выше теория (сплошные кривые) позволила объяснить зависимость изменения граничного потенциала БЛМ от ионной силы раствора и концентрации адсорбируемых ионов в растворе. В некоторых случаях зависимость граничного потенциала от концентрации амфифильных ионов имела высокий наклон,

который не мог быть описан рассмотренной выше теорией. Такой высокий наклон был объяснен нами с помощью более сложной теории, учитывающей дискретность распределения электрического поля адсорбированных ионов в мембране и их электрическое и неэлектрическое взаимодействия (Козлов и др., 1982).

Распределение электрического поля на границе мембраны с водой

Неэкранируемый потенциал, образующийся между плоскостью адсорбции ионов и поверхностью мембраны, можно обнаружить, измеряя потенциалы в плоскостях, расположенных на разных расстояниях по отношению к ее границе. Наиболее информативным оказалось сопоставление результатов измерения ^-потенциала и граничного потенциала, измеренного методом КВП. Первый метод определяет потенциал в плоскости скольжения снаружи мембраны, второй - в плоскости, расположенной внутри мембраны вблизи ее гидрофобной области.

-5 -4

log (SDS), М

ш 2

-4 -3

Log (ANS), М

-4 -3

log(Tetracain), М

m 2

8-<1

-4 -3

log(REM), М

Рис.3. Зависимость изменения граничного потенциала при адсорбции на бислойной липидной мембране амфифильных ионов от их концентрации в растворе. Белыми символами показаны потенциалы, измеренные на липосомах методом измерения электрофоретической подвижности, черные символы - потенциалы, измеренные на БЛМ методом КВП. Треугольниками отмечены результаты измерений в растворе 0,01 М KCl, кружками - в 0,1 М KCl. Сплошными линиями изображены теоретические кривые, построенные по уравнениям (6-9).

Как можно видеть на рис. 3, граничный потенциал, измеренный методом КВП на плоских мембранах, значительно превышает ¡¡-потенциал, измеренный электрофоретическим методом на липосомах, причем различие потенциалов зависит от структуры амфифильных ионов, что влияет, очевидно, на глубину их погружения в мембрану.

Мы изучали также распределение потенциала внутри мембраны, сравнивая потенциалы, измеренные методом КВП, и методом, основанным на измерении кинетических параметров транспорта через БЛМ гидрофобных анионов. Влияние граничного потенциата на транспорт гидрофобных ионов легче всего проиллюстрировать при симметричном распределении потенциала в мембране и одинаковых составах растворов по обе стороны от нее (рис. 4).

200

и мс

Рис.4. Слева - влияние симметричного изменения граничных потенциалов с двух сторон БЛМ на транспорт гидрофобных ионов. Сплошная линия на верхнем рисунке -первоначальный профиль потенциала в мембране, пунктирная - измененный профиль после адсорбции с двух сторон амфифильных ионов. На нижнем рисунке - разность этих профилей (в увеличенном масштабе). Справа - определение кинетических параметров транспорта гидрофобных ионов /о, ти ц методом релаксации тока. Подробности в тексте.

Гидрофобные ионы адсорбируются в некотором приповерхностном слое мембраны. Равновесная концентрация ионов в этом слое п связана с их концентрацией в растворе и разностью потенциалов между раствором и адсорбционным слоем <р„ распределением Больцмана (в области низких концентраций, когда можно пренебречь их взаимодействием и насыщением мест связывания). При постоянной концентрации ионов в растворе изменение Дфп приведет к изменению их равновесной концентрации в мембране согласно уравнению

п гРАт .

— =ехр(--

пп ЯТ

где по и п - концентрации гидрофобных ионов в мембране до и после изменения граничного потенциала.

Симметричное изменение граничных потенциалов с двух сторон мембраны вызывает изменение высоты потенциального барьера для ионов, причем на него влияет только та часть граничного потенциала, которая падает между плоскостью адсорбции гидрофобных ионов и плоскостью симметрии мембраны (рис. 4). Изменение этой разности потенциалов Л<рт приведет к изменению константы скорости перемещения ионов в мембране (если рассматривать это перемещение как прыжки через потенциальный барьер) согласно уравнению

RT , (11)

где v и Vo - константы скорости перемещения ионов в мембране до и после изменения граничных потенциалов. Если проводимость мембраны пропорциональна произведению концентрации гидрофобных ионов в мембране п на константу скорости их перемещения V, то, перемножив уравнения (13) и (14), можно получить простую формулу, описывающую изменение проводимости при изменении граничного потенциала.

So RT (12)

Эта формула, впервые полученная в (Lesslauer ct al, 1967), связывает изменение проводимости g с изменением граничного потенциала А<рь между объемом раствора и плоскостью симметрии мембраны. Она широко использовалась для определения граничного потенциала на БЛМ с помощью измерения проводимости, индуцированной различными ионофорами (см., например, обзор McLaughlin, 1977). Если удается определить изменение не только суммарной проводимости g, но и параметров л и V, то из уравнений (10) и (11) можно получить информацию о распределении граничного потенциала в мембране, разделив суммарный скачок Д<рь на 2 части. Одна из них, Дф„ падает между объемом раствора и плоскостью адсорбции гидрофобных анионов, другая, А<рг - между этой плоскостью и серединой БЛМ (рис.4).

В экспериментах мы использовали гидрофобные анионы тетрафенилбората (ТФБ) или дипикриламина (ДПА), механизм транспорта которых через мембрану хорошо изучен. Кинетические параметры транспорта определяли с помощью метода релаксации тока. В соответствии с (Andersen and Fuchs, 1975), значение константы скорости перемещения гидрофобных ионов через мембрану определяли как обратную постоянную времени экспоненциального спада тока х, количество ионов в мембране полагали

пропорциональным суммарному заряду д, перенесенному через мембрану, который определяли как интеграл аппроксимирующей ток экспоненты, а по амплитуде экспоненты /о определяли начальную проводимость. С помощью данного метода была исследована адсорбция амфифильных анионов БОБ. Полученные результаты показаны на рис. 5. Видно, что величина Д(/%, измеренная методом КВП, близка к полученной из изменения начальной проводимости БЛМ (формула 12). Адсорбция ЭОБ влияла на изменение суммарной проводимости в основном только за счет изменения коэффициента распределения гидрофобных ионов между мембраной и водой (Ащ, согласно формуле (10)), но практически не влияла на скорость транспорта этих ионов через мембрану {А<рг согласно формуле (11)). Полученные результаты показывают, что плоскость адсорбции ионов ЗБЭ расположена в мембране на меньшей глубине по сравнению с плоскостью адсорбции гидрофобных ионов, что неудивительно, если принять во внимание, что глубина погружения плоскости адсорбции ионов в мембрану тем больше, чем большая степень их гидрофобное™.

100

са

Ъ 50 э-<1

-5,0 -4,5 -4,0

1од (БОБ"), М

Рис.5. Изменения Дфп (темные точки) и потенциалов в гидрофобной области мембраны Асрт (светлые точки), рассчитанные по данным измерения постоянной времени релаксации тока в зависимости от концентрации 80Б в растворе. Для сравнения приведены значения Дф„, измеренные методом КВП (крестики). БЛМ сформирована из Ь-а-фосфатидилхолина (50 мг/мл декана) в растворе 0,5 М КС1. Кружками отмечены результаты измерения с ДПА, треугольниками - с ТФБ.

Электронейтральный транспорт амфифильных ионов через мембрану Метод КВП позволяет изучать адсорбцию на мембранах тех соединений, молекулы которых не могут проходить через БЛМ. Они адсорбируются и изменяют скачок потенциала на границе с одной стороны БЛМ, а граничный потенциал с противоположной стороны остается неизменным. Однако имеется ряд соединений, молекулы которых способны проходить через БЛМ и изменять граничные потенциалы на обеих се сторонах. Мы показали, что амфифильные ионы могут проникать через мембрану по механизму

-5,0 -4,5 -4

1од (ЗОБ ), М

электронейтрального транспорта. Этот транспорт связан с протонированисм/депротонированисм ионов на границе мембраны с водой, в результате чего ионы превращаются в элсктронсйтральные молекулы, которые проходят через мембрану на противоположную границу, где опять превращаются в ионы. С помощью метода КВП нами был изучен механизм такого транспорта на примере лекарственного препарата против гриппа ремантадина (REM), который является амфифильным катионом и слабым основанием. Механизм транспорта приведен на рис. 6, слева. Вследствие транспорта заряженные формы REM при его добавлении с одной стороны БЛМ появляются на обеих границах мембраны. Это доказывает эксперимент, согласно которому разность Дфь, измеренная методом КВП при одностороннем введении REM, оказывается значительно меньше изменения потенциала на каждой из границ мембраны при симметричном добавлении REM в оба раствора, измеренного по изменению проводимости (рис.6, в центре). Нами было показано, что на соотношение поверхностных концентраций заряженных форм ремантадина RH+ на границах мембраны влияет разность рН между растворами.

«— И'

неперем

мембрана RH.' RH.'

W н

• •

V 60 -ГЬ'---- и*

и до-го , , , А / ►

• • • V -20- 1 2

дрн

-4 -3 -2

log [REM], М

Рис.6. Слева - схема электронейтрального транспорта ремантадина через БЛМ. В центре -зависимость изменения граничного потенциала от концентрации REM в растворе с одной стороны БЛМ, измеренного методом КВП при рН 7,5 (кружки) и 5,0 (звезды), а также по изменению проводимости в присутствии пентахлорфенола (треугольники) или нонактина (перевернутые треугольники) при введении REM с обеих сторон БЛМ. Справа -зависимость Дфь, измеренного методом КВП, от разности рН с двух сторон БЛМ. Исходное значение рН раствора составляло 6,0.

Зависимость разности граничных потенциалов при введении REM в раствор с одной стороны БЛМ (которую будем называть цис-стороной) от ДрН, получаемой за счет изменения рН в противоположном растворе (с транс-стороны), представлена на рис. 6, справа. Видно, что Дфь при увеличении ДрН растет, выходя на предельное значение при ДрН около 2. Как мы показали, в этих условиях вся заряженная форма REM расположена на границе мембраны с цис-стороны, в то время как ее концентрация с транс-стороны оказывается ничтожно малой. Таким образом, предельное изменение потенциала, регистрируемое методом КВП при высоком ДрН, представляет собой изменение

потенциала, вызванное адсорбцией REM только на цис-границс, когда его транспортом через мембрану можно пренебречь. Если рН в транс-отсске изменять в другую сторону, Дфь уменьшается до нуля, а при дальнейшем изменении рН даже изменяет знак. Это соответствует другому предельному случаю, когда из-за транспорта REM через мембрану концентрация заряженной формы с транс-стороны БЛМ оказывается выше, чем с цис-стороны. Элсктронсйтральный транспорт РЕМ через мембрану подавляется при низких значениях рН с двух сторон 6ЛМ, когда концентрация нейтральной формы REM в БЛМ становится пренебрежимо малой. В этих условиях скачок потенциала на одной границе БЛМ, измеренный методом КВП при одностороннем введении РЕМ, совпадает со скачками на обеих границах, измеренными по изменению проводимости БЛМ при симметричном введении РЕМ (рис.6, в центре).

Перенос ремантадина через мембрану по данному механизму приводит к выделению ионов водорода на границе с цис-стороны и их поглощению - с транс-стороны. Это приводит к образованию градиентов рН в непсремсшивасмых слоях у поверхности мембраны. Их можно обнаружить, если ввести в мембрану протонофор, сделав ее селективной по протонам, и измерять мембранный потенциал (разность потенциалов между растворами в режиме разомкнутой цепи). Образование мембранного потенциала при элсктронейтральном транспорте слабых кислот или оснований через мембрану было обнаружено ранее (Антонснко, 1986). Аналогичные потенциалы, вызванные образованием градиентов рН в нспсрсмсшивасмых слоях, наблюдались нами и в случае с REM. Высказывалась гипотеза, что элсктронсйтральный транспорт и связанные с ним изменения рН играют важную роль в антивирусном действии данного препарата, поскольку известно, что фактором, вызывающим активизацию вируса и слияние его оболочки с мембраной, является понижение рН внутри эндосомы, чему такие препараты как ремантадин препятствуют.

Рассмотренный выше механизм нашел отражение в разработанной нами теоретической модели (Маркин и др., 1987), что позволило количественно описать экспериментальные зависимости разности граничных потенциалов от концентрации ремантадина и значений рН в растворах по разные стороны от мембраны. Данный механизм справедлив не только для ремантадина, но и для многих других соединений. Так, мы наблюдали аналогичные эффекты рН на разность граничных потенциалов при адсорбции ионов тстракаина (Черный и др., 1993) и фотосенсибилизатора гематопорфирина (Стожкова и др., 1995).

1.4. Нейтральные молекулы

Нами была изучена методом КВП адсорбция на БЛМ нейтральных молекул, обладающих дипольным моментом. Благодаря ориентации таких молекул на границе мембраны, они создают скачок потенциала, который называют дипольным потенциалом. Были исследованы как «классические», широко известные соединения - флоретин и флорицин, так и ранее не изученные - стириловые красители ГШ 421 и его аналоги.

Флоретин и флорицин

Зависимости измеренных методом КВП стационарных значений Дфь на БЛМ от концентрации флоретина и флорицина в растворе с одной стороны от мембраны представлены на рис. 7. То, что эти потенциалы — дипольные, доказывали эксперименты, согласно которым значения Дфь не зависели от ионной силы раствора и от собственного поверхностного заряда БЛМ. В образовании дипольного потенциала участвуют нейтральные формы флоретина и флорицина, адсорбированные на БЛМ, что подтверждала зависимость Дфь от рН: повышение рН в области, соответствующей рК этих соединений, приводило к значительному уменьшению Дфь-

т 50

&■

Рис.7. Изменения дипольного потенциапа в зависимости от концентрации флоретина (кружки) или флорицина (треугольники) в растворе, измеренные методами КВП (черные символы) или по изменению проводимости БЛМ в присутствии нонактина (белые символы).

Потенциалы, измеренные методом КВП, были сопоставлены с потенциалами, определенными методом проводимости в присутствии нонактина. Как можно видеть на рис.7, в случае флоретина метод КВП приводил к заниженным потенциалам. Последнее связано с переходом флоретина на другую границу мембраны, что приводит к изменению дипольного потенциала с противоположной стороны и уменьшению стационарного значения Дфь, измеренного методом КВП, но не влияет на потенциал, измеренный методом проводимости, где флоретин присутствует на обеих границах мембраны симметрично. Способность флоретина проникать через мембрану была подтверждена с помощью независимых методов (Уегктап,1985; Иокквкауа й а1, 1997). В случае

СР

СР •

• .А

» А

•Р А

о • АС,

••• о

• О* А А

,с£> А

• ••

7-6-5-4 1_од С, М

флоридина результаты, полученные двумя методами, совпали. Это свидетельствует, что проникновением флоридина через мембрану можно пренебречь. Различие проницаемостей БЛМ для флоретина и флорецина можно объяснить тем, что молекула последнего содержит гидрофильный глюкозндный остаток, затрудняющий проникновение этой молекулы через гидрофобную область мембраны.

Стартовые красители

Стириловые красители принадлежат к классу быстрых зондов электрического поля, которые изменяют спектр флуоресценции при изменении мембранного потенциала за время порядка миллисекунд. Молекула красителя электронейтральна и обладает значительным дипольным моментом (около 10 Д), который образуют делокалнзованный положительный заряд в пиридшювом комплексе и локализованный отрицательный заряд па сульфогруппе. Мы исследовали изменение граничного потенциала на БЛМ при адсорбции стириловых красителей КН421, 1Ш437, Ш1160 и (И-8-АМ-;РР8 и показали, что эти красители способны вызывать на границе БЛМ появление диполыюго потенциала значительной величшнл. Этот результат показывает, что данные красители не только являются флуоресцентными зондами - индикаторами электрического поля в мембране, но н сами могут существенно влиять па его величину.

Нами было показано, что при адсорбции КН-красителен на БЛМ значительно ускорялся транспорт гидрофобных анионов ДНА и ТФБ через мембрану (рис.8). При введении 1Ш-421 в ячейку с двух сторон БЛМ происходило уменьшение характерного времени т релаксации тока при скачкообразном изменении напряжения. При этом суммарное количество гидрофобных ионов в мембране п практически не изменялось. Для сравнения приведены результаты аналогичного эксперимента с флорицином, при адсорбции которого на БЛМ происходило заметное изменение обоих параметров.

I. мин I, мин

Рис.8. Изменения Дфь, Д<рт и Д<р„, вычисленные по уравнениям (13) - (15) из измерений кинетики релаксации тока в присутствии ТФБ при добавлении 1Ш 421 (слева) и флоретина (справа) с обеих сторон мембраны в момент времени, отмечешгый стрелкой.

Влияние адсорбции красителей только на постоянную времени х позволяет сделать вывод, что создаваемый ими скачок потенциала происходит не на поверхности мембраны, а значительно глубже плоскости адсорбции гидрофобных ионов (а также флорстина, где изменялись и т, и и). Нами было показано, что ¡¡-потенциал липосом при адсорбции красителей практически не меняется. Это позволило заключить, что красители адсорбируются в виде нейтральных молекул, образуя дипольный скачок потенциала на границе мембраны. Этот скачок потенциала имеет противоположный знак («плюс» в нсполярной области мембраны) по сравнению с потенциалом, создаваемым флоретином.

Зависимость относительного изменения х, пересчитанного по уравнению (11) в Афт, от концентрации БШ421 в растворе изображена на рис. 9. На этом же рисунке изображены значения Дфь, полученные методом КВП при одностороннем введении КН421 в раствор. Они оказались значительно меньше Дфх, полученных из экспериментов с гидрофобными ионами.

100

£ 50

°0 1 2 3

[ЯН 421]. мкМ

Рис.9. Зависимость изменения граничного потенциала от концентрации 11Н421 в растворе. Белые кружки - значения, вычисленные из изменения константы скорости релаксации тока в присутствии ТФБ. Черные кружки - результаты измерений методом КВП.

Это различие потенциалов можно было бы объяснить проникновением молекул стириловых красителей на противоположную сторону мембраны. Однако, из литературных данных, основанных на измерениях флуоресценции, известно, что эти красители не проникают через БЛМ. Мы объяснили заниженное значение граничного потенциала, полученное методом КВП, тем, что дипольные молекулы стириловых красителей слишком глубоко погружаются в мембрану. Сформулированный выше принцип измерения разности граничных потенциалов методом КВП был основан на предположении, что разделение зарядов, благодаря которому образуется граничный скачок потенциала, происходит за пределами той области мембраны, которая сжимается в электрическом поле. В частности, в модели трех конденсаторов на рис. 1 предполагалось, что вызванное адсорбцией изменение потенциала происходит на обкладках

/О

Р'

о-

л •

«¿»""в

конденсаторов, моделирующих грашщы мембраны, но не на центральном конденсаторе, моделирующем гидрофобную область мембраны, которая сжимается в электрическом поле. Однако, если на мембране адсорбируются длинные молекулы, такие как стирштовые красители, изменение электрического поля может происходить в области углеводородных цепей фосфолипидов, т.е. в гидрофобной области мембраны. В этом случае метод КВП должен давать систематическую ошибку в измерении разности граничных потенциалов.

Используя модель неоднородной упругой мембраны, мы показали, что смещение потенциала минимума емкости, которое обычно трактуется в рамках метода КВП как изменение граничного потенциала, в случае глубокого погружения дипольных молекул в мембрану оказывается заметно меньше фактического изменения граничного потенциала (Пасечник и Соколов, 2003). Эта ошибка зависит от глубины погружения. Она незначительна, если диполи расположены в неоднородной области поверхностного слоя мембраны, но резко возрастает при 1гх погружении в однородную гидрофобную область. Из всех изученных нами соединений метод КВП давал ошибку только в случае стириловых красителей, которые, как показали исследования кинетики транспорта гидрофобных ионов, глубже всех погружаются в БЛМ. По-видимому, глубина погружения диполей стириловых красителей настолько велика, что они попадают в гидрофобную область БЛМ с однородным распределением диэлектрической проницаемости, которая ответственна за сжатие мембраны в электрическом поле.

2. Моделирование фотодинамических реакции на БЛМ

Окисление жизненно важных молекул в мембране активными формами кислорода, образующимися при фотовозбуждешш фотосенсибилизаторов (ФС), лежит в основе метода фотодинамическон терапии раковых клеток. По схожему механизму происходит деградация мембранных структур зрительной системы продуктами, образованными в результате метаболизма зрительного родопсина. Наибольшее значение в этих процессах имеет синглетныи кислород, первичной мишенью которого в клетках являются мембранные белки и липиды (Красновский, 1990). Бислойные липидные мембраны являются удобной моделью, позволяющей изучить механизм данных процессов. Мы исследовали адсорбцию на БЛМ фотосенсибилизаторов, использующихся при лечении раковых заболеваний, а также продуктов цикла зрительного родопсина, имеющих свойства слабых фотосенсилнзаторов. Измерение граничного потенциала позволило также регистрировать реакции окисления молекул - мишеней синглетного кислорода, а также автоокисление фотосенсибилизаторов иа поверхности БЛМ при освещении.

2.1.Исследование взаимодействия продуктов цикла зрительного родопсина с БЛМ Это исследование направлено на выяснение механизмов развития патологических изменений сетчатки глаза, к которым, прежде всего, относится возрастная макулярная дегенерация эпителиальных клеток. Ключевая роль в развитии возрастной дегенерации сетчатки принадлежит липофусциновым гранулам или "пигменту старости", накапливающимся с возрастом в клетках рстинального пигментного эпителия. Липофусцин - гетерогенный комплекс, состоящий из смеси белков, липидов и ряда флуорофоров, поглощающих свет в синсй области спектра. Одними из основных флуорофоров являются бис-рстинилидсн этаноламин (сокращенное название А2Е) и его

А2Е ероху-А2Е

Рис.10. Структуры А2Е и эпокси-А2Е.

Встраивание А2Е в БЛМ регистрировалось по изменению граничного потенциала БЛМ методом КВП либо по элсктрофорстической подвижности липосом. При введении А2Е в раствор происходил рост Д(ръ, связанный с появлением положительного заряда на поверхности мембраны вследствие адсорбции на ней А2Е (рис.11).

Рис. 11. Кинетики изменения граничного потенциала при адсорбции А2Е и последующем включении света (А). Водный раствор содержал 10 мМ KCl, 1 мМ HEPES, рН=7,0. (Б) -изменение потенциала на границе мембрана/раствор при адсорбции нативного А2Е (1), а также предварительно подверженного освещению в растворе, содержащем кислород, в течение 1ч 30 мин (2) или 2 ч 40 мин (3).

Разность граничных потенциалов Дфъ, измеренных на несимметричных мембранах, один из монослоев которых состоял из смеси липида (DPhPC) с А2Е, совпадала с поверхностным потенциалом Дф5, полученным из результатов измерения Ç-потснциала. Совпадение потенциалов означает, что плоскость расположения зарядов адсорбированных молекул А2Е расположена на поверхности мембраны вблизи границы раздела с водой.

Эксперименты на БЛМ не подтвердили высказанную ранее в литературе гипотезу, согласно которой гибель эпителиальных зрительных клеток вызвана нарушением стабильности мембран под действием А2Е. Как показали наши эксперименты, встраивание до 25 мольных процентов А2Е в мембраны из дифитаноилфосфатидилхолина не приводило к заметному уменьшению их стабильности. Слабое детергентное действие А2Е было обнаружено на бислоях, содержащих заряженные фосфолипиды фосфатидилсерин или кардиолнпин.

При освещении БЛМ постоянным белым светом после завершения на ней адсорбции А2Е потенциал сначала возрастал, а затем уменьшался (рис. 11, А). Причины возрастания потенциала на начальных стадиях освещения не вполне ясны. Уменьшение потенциала под действием света можно объяснить образованием эпокси-А2Е, который, будучи менее липофильным, чем исходный А2Е, десорбируется с поверхности мембраны. Это подтверждают эксперименты, в которых исследовалась адсорбция эпокси-А2Е. Образование эпоксидов происходило в результате предварительного освещения растворов А2Е видимым светом в присутствии кислорода. В зависимости от времени освещения были получены смеси с разным соотношением А2Е и его эпокси-форм, что регистрировалось по изменению их спектров поглощения. Адсорбция образцов, предварительно экспонированных светом (кривые 2 и 3 на рис.11 Б), давала меньший адсорбционный потенциал, чем исходный препарат А2Е (кривая 1). Чем больше была длительность предварительного освещения, тем меньше было изменение граничного потенциала. Освещение БЛМ приводило к дальнейшему уменьшению граничного потенциала, которое, по-видимому, вызвано продолжением образования эпокси-форм А2Е в мембране и их десорбцией с поверхности мембраны. Эти эксперименты показали, что эпоксиды не способны встраиваться в мембрану, а значит, не могут влиять ни на се стабильность, ни па функционирование мембранных белков. Поэтому мишеныо эпоксидов в клетках являются не мембраны, а водорастворимые соединения, например, нуклеиновые кислоты (Sparrow, 2003).

2.2. Исследования адсорбции фотосенсибилизаторов и моделирование фотодинамических реакций на поверхности БЛМ

Мы исследовали адсорбцию на БЛМ различных фотосенсибилизаторов: гсматопорфиринов и фталоцианинов и показали, что она подчиняется общим закономерностям, установленным ранее при изучении амфифильных ионов. В случае адсорбции гсматопорфиринов было показано, что величина граничного потенциала, измеренного методом КВП на БЛМ, значительно превышала величину ^-потенциала на липосомах. Это свидетельствовало об образовании неэкранируемого скачка потенциала, связанного с погружением заряженных групп молекул гематопорфиринов в мембрану. Величина погружения оказалась различной для трех аналогов гсматопорфирина, различающихся степенью гидрофобности. Было также показано, что молекулы гсматопорфирина могут проникать через БЛМ в электронейтральном виде по механизму, рассмотренному выше для ремантадина, из-за чего Дфь зависит от разности рН по обе стороны мембраны.

Рис.12. Слева - кинетика изменения Дфь при адсорбции теграсульфированного алюмофталоцианина (А1РсБ4) на БЛМ из дифитаноилхолина (РС) или глицерилмоноолеата (вМО). Справа - зависимость Дфь от концентрации А1РсБ4 в растворах с различной ионной силой: 100 мМ КС1, 10 мМ НЕРЕЭ, рН 7,5 и 10 мМ КС1, 1 мМ НЕРЕБ, рН 7,5.

При исследовании адсорбции фталоцианинов было показано, что эффективность их адсорбции зависит от вида атома металла в центре молекулы: добавление в раствор фталоцианина с атомом цинка приводило к значительно большему изменению Дфь, чем для фталоцианина с атомом алюминия. Это объяснялось тем, что при адсорбции молекулы фталоцианина происходит образование координационной связи атома металла в центре молекулы с атомом фосфора молекулы фосфолипида. Добавление в раствор фторида, конкурирующего с фосфатом за образование связи с атомом алюминия, приводило к десорбции фталоцианина с БЛМ (рис.12, слева). Если БЛМ была сформирована из глицерилмоноолеата, молекулы которого не содержат фосфатных групп, адсорбции

фталоцианииов не происходило. Было также показано, что адсорбция тстрасульфированного алюмофталоцианина происходит на поверхности мембраны, поскольку измеренное методом КВГ1 значение Дфь совпадало с ^-потенциалом, измеренным по электрофоретической подвижности липосом, а зависимость потенциала от концентрации фталоцианина и от ионной силы раствора удовлетворяла уравнению Гуи-Чепмсна (рис. 12, справа).

С помощью метода КВП мы регистрировали реакции окисления молекул различных соединений на поверхности БЛМ синглетным кислородом, образующимся при освещении в присутствии фотосенсибилизатора. С этой целью использовались молекулы-мишени активных форм кислорода, способные адсорбироваться на БЛМ и создавать на границе мембраны дипольный скачок потенциала: флорицин, а также стириловые красители. Данный подход позволяет также определить проницаемость БЛМ для синглетного кислорода, сравнивая скорости окисления этих молекул на противоположных границах мембраны: либо с той же стороны мембраны, что и молекулы фотосенсибилизатора (которую будем обозначать eis), либо с противоположной (trans) стороны.

Пример кинетики изменения потенциала в этих экспериментах приведен на рис. 13.

Cis:

о.

100 200 t, мин

Trans:

'• 'о.'

100 200 t, МИН

Рис.13. Кинетики изменения Дфь после добавления флорицина, четырежды сульфированного алюмофталоцианина и освещения мембраны в моменты, указанные стрелками. Флорицин добавляли либо с цис-стороны (сверху), либо с транс-стороны (снизу). БЛМ сформирована из дифитаноилхолина, устойчивого к окислению.

Добавление флорицииа и фталоцианииа в ячейку с одной стороны от мембраны приводило к появлению разности граничных потенциалов вследствие их адсорбции на БЛМ. Освещение приводило к изменению потенциала, если в ячейке присутствовали одновременно и фталоцианин, и флоретин, но не влияло на потенциал в случае отсутствия одного из этих соединений. Верхний график на рис.13 соответствует случаю, когда флорицин и фталоцианин находятся в одном ("cis") отсеке и потенциачы, образующиеся при их адсорбции на БЛМ, оказываются одного знака. Если флорицин находится в противоположном ("trans") по отношению к фтапоцианину отсеке, то потенциал, образующийся при его адсорбции, оказывается противоположного знака (рис.13, снизу). Знаки фотоэффектов в этих экспериментах оказались тоже противоположными и соответствовали уменьшению потенциала, образующегося при адсорбции флорицина. Величина фотоиндуцированного изменения граничного потенциала была пропорциональна величине потенциала, образующегося при адсорбции флорицина. Полученные результаты свидетельствуют, что освещение приводит к разрушению флорицина, адсорбированного на мембране. Выключение света приводило к восстановлению потенциала, что объяснялось адсорбцией на БЛМ свежих молекул флорицина из раствора.

Если молекулы фтапоцнанина и флорицина находятся на противоположных границах мембраны, они не могут непосредственно взаимодействовать друг с другом. Поэтому транс-фотоэффект можно объяснить только предположив, что в реакции разрушения флорицина участвуют другие молекулы, образующиеся при освещении фталоцианина и способные проникать через мембрану. Ими являются молекулы синглетного кислорода, что подтвердилось последующими экспериментами с тушителями. Фотоэффект подавляется водорастворимым тушителем синглетного кислорода азидом натрия. Более сильным ингибитором оказался убихинон Q2. На БЛМ, сформированной из смеси фосфатидилхолина с убихиноном, фотоэффект в трансконфигурации ослаблялся. В цис-конфигурации, где синглстный кислород не должен проникать через мембрану, чтобы реагировать с флорицином, убихинон не ослаблял фотоэффект.

Сравнение скоростей окисления мишени в цис- и транс- конфигурациях может быть использовано для определения проницаемости Ро БЛМ для синглетного кислорода. Значение Ро определяли как коэффициент пропорциональности потока 102 сквозь мембрану У и разностью концентраций синглетного кислорода ['02], и ['<?,], на границах с противоположных сторон мембраны:

В эксперименте можно измерить отношение скоростей окисления флорицина с двух сторон БЛМ, которое равно отношению концентраций синглстного кислорода на границах:

Для того, чтобы выразить проницаемость через полученное в эксперименте отношение Rci/Rtnns, было рассмотрено уравнение диффузии и тушения синглстного кислорода в воде около БЛМ (Sokolov and Pohl, 2009), решение которого связывает поток 'О; сквозь мембрану с его стационарной концентрацией на границе. В результате была получена простая формула для оценки проницаемости БЛМ для синглстного кислорода

Измеренное в наших экспериментах значение RdJRirans составляло около 3. Для оценки были использованы известные значения константы скорости тушения синглстного кислорода в воде kq =3 х 10s с"1 (Rodgcrs and Snowdcn, 1982; Красновский, 1998) и коэффициента диффузии кислорода в воде D = 4,75 х 10 5 см2 с"1 (Fischkoff and Vanderkooi,

В результате было получено значение проницаемости мембраны для синглстного кислорода Рю = 2 см/с. Это значение значительно ниже проницаемости БЛМ для обычного кислорода, полученной методом ЭПР (согласно ЗиЬсгупБЫ ^ а1., 1989 и Ог1коу8к1 й а1., 2003, Р0 составляет около 200 см/с), но близко по порядку величины к проницаемости БЛМ для СО2, измеренной с помощью микроэлектродной техники.

3. Мембранный транспорт

3.1. Обменный транспорт (нигерицин)

Антибиотики нигерицинового типа могут служить моделью обменного транспорта ионов в биологических мембранах. Эти антибиотики, являясь слабыми кислотами, способны образовывать комплексы с ионами металлов. Поэтому они переносят через мембрану сразу два типа ионов: калия и водорода, осуществляя их обменный транспорт. Помимо обменного транспорта, антибиотики способны переносить через мембрану заряд, увеличивая таким образом се проводимость. Механизм переноса заряда изучался нами на БЛМ. Наиболее интересные экспериментальные результаты были получены при измерении потенциалов, образующихся на БЛМ при градиенте концентрации ионов водорода или калия (рис. 14). При градиенте рН знак потенциала противоположен знаку

(15)

1975).

равновесного потенциала мембраны, селективной по протонам, а при градиенте концентрации ионов калия потенциал превышает по величине равновесный потенциал мембраны, селективной по ионам калия. Эти необычные потенциалы объясняются переносом через БЛМ заряженных димеров нигерицина, благодаря чему обмен ионов калия на протоны оказывается неэквивалентным.

т 2

4 5 ДрН

▲

А »Р ' '

0,0 0,1 0,2 ^ 0,3 0,4 0,5

|°д(к,+/к/)

Рис.14. Слева - зависимость разности потенциалов в присутствии 5 цМ нигерицина от градиента рН. Исходное значение рН буферного раствора составляло 5,8. Значения концентрации КС1: 0,05 М (треугольники) и 0,5 М (кружки). Пунктирная прямая построена по уравнению Нернста для мембраны, селективной по протонам.

Справа - зависимость разности потенциалов в присутствии 5 /Ш нигерицина от градиента концентрации хлористого калия. Исходная концентрация КС1 в растворе составляла 0,05 М. Значения рН буферного раствора: 7,3 (кружки); 6,0 (квадраты); 4,2 (треугольники). Пунктирная прямая построена по уравнению Нернста для мембраны, селективной по ионам калия.

Образование потенциалов с необычными свойствами при неэквивалентном обмене ионов было нами проиллюстрировано с помощью термодинамического рассмотрения обменного транспорта. В случае, если один протон обменивается на два иона калия, в мембране наступает равновесие с образованием мембранного потенциала, зависящего от концентраций ионов в растворе в соответствии с простой формулой

<р = 2<рк-(р„, (16) где

ЯТ, К" ИТ, Н"

<рк =-1п- и <р,, =-1п- - равновесные потенциалы для ионов калия и

У7" АГ' F И1

водорода. Если концентрации ионов калия в растворах одинаковы, а значения рН

различны, потенциал имеет противоположный знак по сравнению с равновесным

потенциалом по протонам: <р = —<р„. Если значения рН растворов одинаковы, а

концентрации ионов калия различны, потенциал, хотя и совпадает по знаку с равновесным

калиевым потенциалом, вдвое превышает его по величине: д> = 2фк . Такие свойства

потенциала качественно согласуются с экспериментом. Количественное описание

потенциалов было получено нами с помощью теоретической модели, где предполагалось, что ионы калия и водорода переносятся через мембраны как мономерами, так и димерами нигерицина. Если обозначить диссоциированную молекулу нигерицина Т, недиссоцинрованную - ТН, а комплекс с ионом калия - ТК, можно предположить несколько возможных заряженных димеров нигерицина, как отрицательно заряженных: Т2Н" и Т2К", так и положительно заряженных: Т2Н2К4 и Т2НК2'. В принципе, неэквивалентный обмен ионов калия на протоны и связанные с ним необычные мембранные потенциалы теоретически можно объяснить как с отрицательно заряженными димерами (Магкт е1 а1, 1975), так и с положительно заряженными (Маркин и др., 1984). Окончательный выбор между этими моделями оказался возможен после того, как мы показали, что носители тока в мембране заряжены положительно.

Зависимость проводимости от поверхностного и дипольного потенциалов

Исследование зависимости проводимости от граничного потенциала позволило определить знак заряда носителей тока в БЛМ. Предполагается, что зависимость относительного изменения проводимости g/go от изменения граничного потенциала должна описываться простой формулой (12), где знак коэффициента г определяется знаком заряда носителей тока в мембране. При г<0 проводимость при увеличении граничного потенциала должна возрастать, а при г>0 - убывать.

В работе исследовалась зависимость изменения проводимости, индуцированной нигерицином или гризориксином, либо от изменения поверхностного потенциала, вызванного адсорбцией органического катиона цитилпиридиния бромистого, либо от изменения дипольного потенциала, вызванного адсорбцией флоретина. Изменение граничного потенциала при адсорбции флоретина или цитилпиридиния бромистого измерялось в отсутствии антибиотиков как разность граничного потенциала, возникшая после добавления этих веществ в раствор с одной стороны БЛМ. Изменение индуцированной проводимости БЛМ в присутствии антибиотиков измеряли при добавлении флоретина или бромистого цитилпиридиния с двух сторон БЛМ.

Зависимости граничного потенциала и проводимости БЛМ, индуцированной нигерицином, валиномицином или нонактином, от концентрации флоретина изображены на рис. 15, слева, а от концентрации цитилпиридиния бромистого - на рис. 15, справа. Для облегчения сопоставления изменений проводимости и граничного потенциала их зависимости от концентрации адсорбируемых веществ изображены на одних и тех же графиках. Масштаб и направления осей на обоих рисунках выбраны таким образом, чтобы эти зависимости могли совместиться в том случае, если выполняется формула (12) при

Валиномиции и нонактин, у которых носители тока известны (положительно заряженные комплексы с ионами калия) использовались в эксперименте для контроля.

О 150

□ д<ра

О нонактин

А нигерицин

▼ гризориксин

аосР

о 3

> £

О ДФЬ

А валиномицин • гризориксин

Л ¡А

log(phlor), М

-5,5

1од(ЦПБ), М

Рис.15. Слева - зависимость изменения граничного потенциала на БЛМ из ФЭА и ее проводимости, индуцированной присутствием в растворе 10"6 М нонактина, 5-10"6 М нигерицина или 5-Ю"6 М гризориксина, от концентрации флоретина. Исходный раствор: 0,05 М KCl, 5 мМ буфер, pH 6,0.

Справа - зависимость изменения граничного потенциала на БЛМ из ДОЛ и ее проводимости, индуцированной присутствием в растворе 10"7 М валиномицина или 510"6 М гризориксина, от концентрации цитилпиридиния бромистого. Помимо детергента и антибиотиков, раствор содержал 0,05 М KCl.

Увеличение проводимости при уменьшении дипольного потенциала, вызванного адсорбцией флоретина, так же, как уменьшение проводимости при увеличении поверхностного потенциала, вызванного адсорбцией цетилпиридиния, позволяют сделать вывод, что ток в БЛМ переносят положительно заряженные комплексы нигерицина или гризориксина. Разработанная нами модель ионного транспорта с положительно заряженными димерами удовлетворительно объяснила полученные в эксперименте зависимости проводимости и мембранного потенциала от концентрации ионов в растворах.

3.2.Актшный транспорт ионов Na,K,A ТР-юой

Na,K,ATP-a3a осуществляет активный транспорт ионов натрия из клетки и калия в клетку за счет энергии гидролиза одной молекулы АТР. Этот белок широко распространен в природе и играет важную роль в функционировании клетки. Механизм активного транспорта ионов Na,K,ATP-a3oi1 в общих чертах установлен: он осуществляется с помощью поочередного открытия каналов, соединяющих центры связывания ионов в белке с растворами либо с внутриклеточной, либо с внеклеточной стороны мембраны. Невыясненными остаются некоторые вопросы, такие как структура каналов и кинетические характеристики процесса. Существенную информацию об этом может дать изучение электрических токов, связанных с функционированием Na,K,ATP-a3bi. В

электрофизиологических исследованиях был обнаружен нестационарный электрический ток (ток смещения), связанный с перемещением ионов натрия в Na,K,ATP-a3e в условиях отсугствия ионов калия, когда этот ионный насос не может завершить полный ферментативный цикл. Подробное изучение этих токов позволило выяснить механизм транспорта ионов натрия во внеклеточном канале Na,K,ATPa3bi. Однако специфика экспериментов на клетках не позволяла изучить этот транспорт во внутриклеточном канале. Мы смогли получить существенную информацию о внутриклеточном канале в экспериментах на модельной системе БЛМ с адсорбированными мембранными фрагментами (МФ), содержащими очищенную Na,K,ATPa3y. Ток смещения в Na,K,ATPa3e можно вызвать с помощью либо быстрого изменения концентрации одного из субстратов ферментативного цикла (в большинстве случаев - АТР), либо быстрого изменения потенциала. Мы объединили оба эти подхода, регистрируя малые изменения адмиттанса (комплексной проводимости) мембраны, вызванные быстрым фотоактивируемым освобождением АТР из Caged-ATP.

Теоретическая модель

Для количественного исследования нестационарного транспорта в Na,K,ATP-a3e была разработана теоретическая модель, основанная на цикле Алберса-Поста -последовательности состояний белка, описывающей его ферментативный цикл - перенос трех ионов натрия во внеклеточный раствор и двух ионов калия в обратном направлении за счет гидролиза молекулы АТР. Нестационарные токи наблюдались в отсутствии ионов калия, поэтому модель рассматривает только натриевую часть этого цикла. Кроме того, учитывался транспорт только одного из 3 ионов натрия, поскольку, как показано ранее (Holmgrem et al, 2000; Apell 2004), именно этот ион вносит основной вклад в электрический ток. Модель определяет приращение емкости и проводимости мембраны с Na,K,ATP-a30i1 в ответ на быстрое освобождение АТР, вызванное электрогенным транспортом ионов натрия, который формально представлен в виде последовательных переходов между пятью состояниями белка (рис.16). Транспорт в канале доступа с цитоплазматической стороны белка рассматривается как обратимый переход между первым состоянием с двумя связанными ионами натрия, Ei(2Na) (которое в уравнениях будет обозначено "сО"), и вторым, где связаны три иона, E|(3Na) (обозначенным "el"). После гидролиза АТР цитоплазматический канал закрывается и Ыа,К,АТР-аза необратимо переходит в состояние фосфорилирования, в котором ионы заперты (состояние окклюзии, обозначенное просто цифрой "1"). Это состояние нестабильно и релаксирует в другие состояния, показанные на рисунке последующими двумя переходами. Первый из них -

переход в конформацию Р-Е;, в которой открывается внеклеточный канал доступа, но три иона остаются в центре связывания внутри бежа, Р-Е;(3№) (это состояние обозначено цифрой "2"). В дальнейшем первый Ь'а* ион освобождается в водную фазу, что формально представлено переходом белка в состояние Р-Е;(2№) (обозначено цифрой "3").

сО

2NV-E,

3NV-E,

(3NV)E;-P

P-E--3NV

P-E,-2Na

■\п

kioj|koi

Ю-

а-»

'ззЦки

Ы-

Рис. 16. Теоретическая модель нестационарного транспорта ионов натрия Na,K_,ATP-a30H. Слева - совокупность состояний Na,K,ATP-a3bi, реализующихся в ходе гидролиза АТР. с -цитоплазматическая сторона системы, е - внутриклеточная сторона. Символами Ei и Ез обозначен белок в двух разных конформациях. Справа - динамические потенциальные барьеры, введенные в рассмотрение Лойгером (Lauger, 1991) и Апелем (Apell et al., 1987). Ион натрия, участвующий в транспорте, обозначен черным кружком (подробнее в тексте).

С физической точки зрения все состояния белка могут быть представлены как последовательная смена потенциальных барьеров для ионов натрия в мембране (рис.16, справа). В состоянии окклюзии ион находится в потенциальной яме между двумя высокими потенциальными барьерами. В остальных состояниях остается только по одному из этих высоких барьеров, закрывающих канаты либо с внеклеточной (в состоя1шях сО и cl), либо с цнтоплазматической стороны (в состояниях 2 и 3). Электроге1шымн считаются только перемещения ионов натрия в цитоплазматическом и внеклеточном каналах доступа (переходы между состояниями сО и cl, а также между состояниями 2 и 3). Эти переходы, представляющие собой диффузию или миграцию Na+ в каналах доступа Ка,КДТР-азы, приводят к появлению электрического тока во внешней цепи.

Кинетические уравнения, описывающие перемещение ионов Na+ с внутриклеточной стороны белка, могут быть записаны в следующем виде:

^ = -V'c,+UNacko, (IV)

где пс0 - поверхностная плотность «видимых» молекул Na,K,ATP-a3bi в состоянии сО, пл - в состоянии cl, [Nac] - концентрация ионов натрия в водном растворе с цитоплазматической стороны. ко\ и кю - константы скоростей прямого и обратного переходов между состояниями сО и cl. В эксперименте измеряется изменение электрического тока, вызванное появлением АТР. Вклад в него вносят только те молекулы Na,K,ATP-a3bi в состоянии сО и cl, транспорт в которых блокируется в результате гидролиза АТР и последующего фосфорилирования белка. Их суммарная плотность равна "с;+"оо=Лг- (1В)

Транспорт ионов Na+ с внеклеточной стороны белка состоит из 2 стадий: переходы между состояниями 1 и 2 и между состояниями 2 и 3. Он описывается двумя независимыми уравнениями:

^- = -кпп,+к2Л (19)

^f- = knnl-(k2l+k2i)n2+k,2[Nac]n2 , (20)

где пь п2, и пз - поверхностные плотности в состояниях 1, 2 и 3 соответственно, [Nac] -концентрация ионов натрия в водном растворе с внеклеточной стороны белка, к\2 и k2i -константы скоростей прямых и обратных переходов между состояниями 1 и 2, кгз и кз2 -аналогичные константы переходов между состояниями 2 и 3. Суммарное количество молекул белка, участвующих в реакциях, равно числу молекул, фосфорилированных в результате гидролиза АТР, т.е. тому же самому числу «видимых в эксперименте» молекул Na,K,ATP-a3bi, которые рассматривались выше для внутриклеточной стороны мембраны, n)+n1 + n}=N. (21)

Приложение к мембране переменного напряжения приводит к перемещению ионов натрия либо в цитоплазматическом, либо во внеклеточном каналах доступа. В данной модели эти перемещения рассматриваются как прыжки через потенциальные барьеры, которые, в отличие от барьеров, запирающих каналы, имеют сравнительно малую высоту (рис. 16). Каналы доступа, согласно общепринятым представлениям, считаются узкими, и их можно рассматривать как среды с низкой диэлектрической проницаемостью (Lauger, 1991). В этом случае влияние электрического поля на константы скоростей соответствующих переходов между состояниями можно представить в виде простых

поправочных коэффициентов (Ьаи§ег, 1979; Ьащег, 1991; Маркин и Чизмаджев, 1974), которые в цитоплазматическом канале можно записать как *г01=Сехр(М/2)

к1а=к?0ехр(-#»е/2) (22)

и во внеклеточном канале как

*а=А£,ех Р(Ж/2) (23)

кп=к°2ех р(-Ж/2),

где /3 = с/А Г, А: - постоянная Больцмана, Г - абсолютная температура, е -элементарный заряд, - падение потенциала в цитоплазматическом канале, <ре - паде!ше потенциала во внеклеточном канале.

Перепады напряжения в цитоплазматическом и внеклеточном каналах, сд. и (,%, связаны с напряжением С/, приложенным между водными растворами, следующим соотношением:

грс = ааси, <р„ - аар , (24)

где а« и ОЕс - коэффициенты, определяющие, какая часть приложенного к мембране с №,К,АТР-азой напряжения падает соответственно во внеклеточном и цитоплазматическом каналах доступа, Св

Со + С г

(25)

а - коэффициент, определяющий, какая часть приложенного между растворами напряжения падает на мембранном фрагменте с Na,KyVTP-a3oi"i (согласно эквивалентной схеме на рис.17). Те же коэффициенты определяют связь перемещений ионов в каналах с током I, регистрируемым во внешней цепи: dn , dn,

I = аа е—I = аае—L. (26)

dt dt

Напряжение U, приложенное к мембране, изменяется во времени как U= Vcos(M). (27)

Периодическое напряжение приводит к появлению переменного тока, который в первом приближении можно представить линейной комбинацией синуса и косинуса с частотой со. Фосфорилирование белка в результате гидролиза АТР «выключает» транспорт с внутриклеточной стороны и «включает» - с внеклеточной стороны. Поэтому вызванное АТР приращение электрического тока представляет собой разность соответствующих токов. Это приращение пересчитывается в изменение емкости, СР, и проводимости мембраны, Gp согласно формуле

ЩАТР = К-1с=Ори + Ср^- . (28)

Написанные уравнения позволяют определить вызванные АТР изменения емкости и проводимости мембраны с Ка,К,АТРазой и их зависимость от частоты переменного напряжения и концентрации ионов натрия. При решении этих уравнений использовалось приближение малых отклонений Псо, п^, пь и пз от соответствующих равновесных значений (вокоЬу е1 а1., 2008). Полученные изменения емкости и проводимости могут быть представлены в виде суммы простых функций, так называемых «функций Лоренца»:

= (29)

р от+щ саг + ся; аг + а^

о} от о}

аг + щ от+щ аг + щ

Эти выражения показывают, что изменения емкости и проводимости мембраны связаны между собой и зависят от одних и тех же параметров: амплитуд Со, С] и С2 и характерных частот Шо, (0| и Шг. Отрицательный член, пропорциональный С2, описывает вклад транспорта ионов в канале с внутриклеточной стороны. Положительные члены, пропорциональные Со и С], отражают вклад транспорта в канале с внеклеточной стороны. Этих членов 2, поскольку транспорт состоит из двух стадий (конформационный переход и перенос ионов в канале), описываемых двумя независимыми уравнениями. Зависимость этих параметров от кинетических констант можно значительно упростить, если, в соответствии с (Но1ш^ет е1 а1, 2000; Аре11 2004), полагать, что скорость переноса иона натрия через внеклеточный канал значительно выше скорости конформационного перехода: к23 » к12. В этом случае можно получить приближенные выражения

С0 = еыр(аае)

(1 + [№сК)(1 + ЬЧК(^+1))2'

[На.]*.

С, = еЫР{аае)

(1 + [Кае]/д'

[Иа,]*,

(31)

(1 + [Ыае]/д(1 + [КаеК(К, + 1))'

С2 = еМ Р [пас )2 , ®2 = *1Р (1 + [N3, ] Кс)

Эти формулы показывают, как вызванные появлением АТР приращения емкости и проводимости мембраны зависят от частоты переменного напряжения и концентрации ионов натрия в растворе. Зависимости С0, Ci и С2 от концентрации ионов натрия имеют колоколообразный вид, достигая максимальных значений при концентрациях, соответствующих половинному заполнению мест связывания ионов в Na+,K+,ATP-a3e. Половинное заполнение происходит при концентрации, равной обратной константе равновесия связывания ионов. Согласно известным в литературе значениям этих констант, можно ожидать наибольший вклад в изменение адмитганса от цитоплазматического канала при низкой концентрации ионов натрия (1-10 мМ), а от внеклеточного - при высокой (0,1-1 М). Таким образом, электрические сигналы от цитоплазматического и внеклеточного каналов можно различить как по знаку приращений емкости и проводимости, так и по влиянию на них концентрации ионов натрия.

Экспериментальная система

Исследования электрогенного транспорта ионов №,К,АТР-азой выполнялись на модельной системе, состоящей из содержащих этот белок мембранных фрагментов (МФ), адсорбированных на БЛМ (рис. 17). Адсорбцию МФ на БЛМ контролировали по изменению емкости мембраны, а в ряде случаев - методом КВП. После введения суспензии МФ в один из отсеков ячейки потенциал, регистрируемый методом КВП, медленно рос во времени, достигая стационарного значения в течение 2 часов (рис.18а). Знак изменения потенциала соответствовал появлению отрицательного поверхностного заряда с той стороны мембраны, куда была добавлена суспензия МФ. Одновременно происходило изменение емкости мембраны, которая сначала росла, а затем медленно уменьшалась (рис.186). Уменьшение емкости говорит о том, что при адсорбции МФ на поверхности БЛМ происходит увеличение средней толщины мембраны. Потенциал, регистрируемый методом КВП при адсорбции МФ, может быть вызван электрическим полем, возникающим внутри БЛМ при сближении с ней отрицательно заряженного фрагмента на расстояние, сравнимое с толщиной диффузной обкладки двойного слоя (рис.18, в и г). Полученные в эксперименте результаты могут быть использованы для оценки величины электрического поля внутри мембран в области их контакта при условии, если известна степень покрытия поверхности БЛМ адсорбированными МФ. Взяв оценку степени покрытия около 30% (Borlinghaus et al, 1987), можно получить электрический потенциал на МФ в зоне контакта около 60 мВ.

i ADP / Caged-ATP —►ATP ATP

"p(t)

-Дмдл— Ч>

-0-l(t)

Рис.17. Схематическое изображение БЛМ с адсорбированным мембранным фрагментом, содержащими Ыа,К,АТР-азу (слева) и их эквивалентная схема (справа). Сплошной линией показан профиль электрического потенциала, возникающий в результате заряжения контактирующих мембран при переносе ионов Ка,К,АТР-азой в условиях короткозамкнутой цепи. Ср - суммарная емкость адсорбированных на БЛМ мембранных фрагментов, содержащих Ыа,К,АТР-азу, СР - емкость области БЛМ, контактирующей с фрагментами, 1Р(Ц - ток, генерируемый всеми активными Ка,К,АТР-азами, 1(1) - ток, регистрируемый в эксперименте.

Рис.18. Кинетика изменения потенциала, измеренного методом второй гармоники (а), и емкости (б) БЛМ после добавления суспензии мембранных фрагментов в момент, указанный стрелкой. Справа - распределение потенциала в БЛМ и заряженном фрагменте мембраны в двух предельных случаях: когда эти мембраны расположены на большом расстоянии (в) и после их сближения до расстояния, намного меньшего дебаевской длины

(О-

Электрогенный транспорт ионов натрия

На рис. 19 изображены зависимости от времени тока короткого замыкания, его интеграла, а также изменения емкости и проводимости БЛМ с адсорбированными на ней фрагментами, содержащими Na,K,ATP-a3y в ответ на освобождение АТР из Caged-ATP при вспышке ультрафиолетового света. Записи иллюстрируют два эксперимента,

различающиеся концентрацией ионов натрия: 150 мМ (слева) и 3 мМ (справа). Видно, что при высокой концентрации ионов натрия освобождение АТР вызывало увеличение

емкости и проводимости мембраны, а при низкой концентрации емкость уменьшалась.

150 мМ Na

3 мМ Na

.VW.-.'.VAV.V/.'.'.'.'.V,*,1

О 5000- 2к>:

/Vvywvv~~^VWVv\/- и зм

\\Ау

U I i J ч J

| t. сек T t, сек

hv hv

Рис. 19. Сигналы, регистрируемые в эксперименте при двух концентрациях ионов натрия: 150 мМ (слева) и 3 мМ (справа). Сверху вниз показаны: регистрируемый в эксперименте ток, интеграл этого тока, изменения емкости и проводимости во времени, полученные в результате вычислений и используемые для определения изменений адмиттанса мембраны. Стрелками указаны моменты вспышки УФ - света.

В соответствии с рассмотренной выше моделью, отрицательные приращения емкости и проводимости при низкой концентрации ионов натрия вызваны их электрогенным перемещением в цитоплазматическом канале Ка,К,АТР-азы, а положительные приращения при высокой концентрации этих ионов - их перемещением во внеклеточном канале Ка,К,АТР-азы.

Зависимости приращений емкости проводимости мембраны от частоты переменного напряжения измерялись при разных концентрациях ионов натрия в диапазоне от 3 мМ до 1 М. Для того, чтобы можно было усреднять результаты измерений, полученные на разных мембранах с разной активностью Ма,К,АТР-азы, приращения емкости и проводимости нормировали на величину заряда, перенесенного №,К,АТР-азой через мембрану после вспышки света. Эта величина определялась по максимальному значению интеграла тока короткого замыкания. Типичные частотные зависимости, полученные таким образом при нескольких концентрациях ионов натрия, изображены на рис.20, слева. Как показано в теоретической модели, частотная зависимость приращений емкости АС и проводимости Дв описывается линейной комбинацией функций Лоренца с разными характерными частотами, причем амплитуды лоренцианов зависят от концентрации ионов

натрия, принимая максимальные значения при концентрациях, близких к обратной константе связывания в соответствующей стадии. При низких концентрациях ионов натрия (менее 10 мМ) частотные зависимости аппроксимировали суммой трех функций Лоренца, одна из которых имеет отрицательную амплитуду. При концентрации ионов натрия от 20 мМ до 1 М вклад отрицательного приращения емкости исчезал, и для аппроксимации частотных зависимостей было достаточно двух функций Лоренца (т.е. в этих условиях С2 = 0) и постоянной компоненты. Примеры аппроксимации частотных зависимостей показаны на рисунке в виде кривых. Аналогичным образом были проведены аппроксимации частотных зависимостей в широком диапазоне концентраций ионов натрия, в результате чего были получены зависимости от этой концентрации амплитуд Со, С], Сг и характерных частот ox¡, соi, 0У1 трех Лоренцианов (рис.20, справа). Как можно видеть на рисунке, амплитуда «отрицательного» Лоренциана Сг убывает с ростом концентрации ионов натрия и при концентрации выше 10 мМ практически равна нулю. Его характерная частота coi при этом растет. Что касается «положительных» Лоренцианов, то амплитуда «медленного» компонента Со растет, а «быстрого» - уменьшается с концентрацией ионов натрия. Соответствующая медленному компоненту характерная частота растет с концентрацией ионов натрия, а частота «быстрого» Лоренциана сО[ во всем интервале концентраций остается практически постоянной.

Полученные в эксперименте зависимости амплитуд Со, С], Сг и характерных частот (О), а>\, Oh Лоренцианов от концентрации ионов натрия были аппроксимированы теоретическими кривыми, построенными по уравнениям (31). Это позволило определить ряд параметров транспорта ионов натрия в каналах доступа ионов Na,K,ATP-a3bi. Теоретические кривые приведены на рисунке 20 в виде сплошных линий, а значения параметров приведены в подписи к рисунку.

Теоретические кривые удовлетворительно описывают большинство экспериментальных данных в широком диапазоне концентраций ионов натрия. Это означает, что рассмотренная теоретическая модель в принципе способна объяснить результаты электрических измерений. Имеется некоторое несоответствие экспериментальных данных и теоретической кривой для зависимости амплитуды медленной стадии Со от концентрации ионов натрия. Возможно, это связано с чрезмерным «переупрощением» модели, которая учитывала перенос №,К,АТР-азой только одного из трех ионов натрия. В дальнейших исследованиях нами было показано, что на вид этой зависимости значительное влияние оказывает рН раствора (Гришанин и др., 2010), что указывает на возможную роль в этом процессе транспорта протонов.

Freq. Гц

Рис.20. Слева - зависимость приращений емкости и проводимости от частоты прикладываемого к мембране переменного напряжения. Водный раствор содержал: 10 мМ MgC.b, 1 мМ EDTA, 30 мМ имидазола, рН 6,5 и NaCl в концентрации 150 мМ (1), 7 мМ (2) и 3 мМ (3). Каждая точка получена в результате усреднения не менее 3 измерений. Сплошные линии построены по уравнениям (29-30) со следующими значениями параметров: СЬ= 1,2 V"1, Ci= 0,48 V1, С2=0, С,ш,= 0,17 V1, аь= 58 s"1, w= 2600 s"1, (сплошные линии); С0= 3,7 V"1, С,= 0, С2=-0,43 V"1, С),т- 0,06 V"1, аь= 17 s"', oh= 380 s"1 (пунктир); Со= 2,8 V"1, Ci= 0,13 V"1, С2 =-0,25 V1, Clim= -0,006 V"1, аь= 20 s"1, <м,= 1200 s"1 а),г= 570 s"1 (точки).

Справа - зависимость амплитуд (вверху) и характерных частот (внизу) функций Лоренца, аппроксимирующих частотные зависимости изменений емкости и проводимости, вызванных функционированием №,К,АТР-азы при скачкообразном освобождении АТР, от концентрации ионов натрия в растворе. Точки получены при усреднении результатов не менее 3 экспериментов. Сплошные линии - теоретические кривые, построенные по уравнениям (31) со следующими значениями параметров: А = 30 тМ; а, = 0,89; а, = 0,21; аг= 0,06; К = 200; 1 /Ке = 0,74 М; VKi = 1.5 мМ; kl2 = 2,4 s"1; fe3 = 1500 s"1; Mo =160 s"1.

Величина характерной частоты Wo определяется скоростью конформационного перехода Na,K,ATP-a3bi, что было подтверждено нами при изучении эффектов высоких концентраций солей на кинетику функционирования белка. Известно, что солевой эффект приводит к замедлению конформационного перехода. В наших экспериментах солевой эффект приводил к значительному уменьшению характерной частоты Шо (Sokolov et al., 2001). Найденные нами значения шц и Ш] (последнее характеризует скорость «промежуточной стадии») оказались меньше по сравнению с аналогичными параметрами, полученными на клеточной системе (Holmgren et al, 2000). Полученное в измерениях на клетках значение скорости «медленной» стадии в разных работах составляло: 100 с"1 (Holmgren et al, 2000), 200 с"1 (Nakao and Gadsby, 1986; Rakowski, 1993;Holmgren et al, 1994) или 400 с"1 (Hilgemann, 1994), в то время

как значение С0о в наших экспериментах изменялось от 20 до 100 с"'. Такое различие может быть связано с различием условий проведения измерений. Как показали нашн последние исследования, на величину характерной частоты С0о оказывает также существенное влияние рН раствора (Гришанин и др., 2010), который в наших экспериментах был ниже по сравнению с цитируемыми выше работами.

Константа диссоциации в активном центре с внеклеточной стороны, 1/Ке, оказалась около 0,74 М, а с внутриклеточной - 1,5 мМ. Эти значения близки к литературным, полученным с помощью флуоресцентных зондов, где они составляли соответственно 500 мМ и 1-5 мМ (в последнем случае значение зависело от концентрации ионов магния) (5сЬпееЬет§ег е! а1, 2000). Константа равновесия К\ между двумя конформациями Ка,К,АТР-азы в состояниях 1 (окклюзия и 2 (деокклюзия оказалась равна 200, что тоже близко к литературным значениям (\Vuddel and Аре11, 1996). В работе впервые определены константы скоростей обмена ионов натрия в цитоплазматическом канале: константа скорости освобождения ионов натрия (А/о) составила около 160 е-1. Константа скорости кг3 перехода между состояниями 2 и 3 (освобождение № из внеклеточного канала доступа) - около 1500

Диэлектрический коэффициент перемещения натрия (характеризующий относительную глубину канала, соединяющего раствор с центром связывания) с цитоплазматической стороны (0,2) оказался значительно меньше, чем с внеклеточной стороны (0,89). Таким образом, место связывания третьего иона натрия расположено в мембране асимметрично и находится ближе к цитоплазматической стороне мембраны. Несмотря на то, что сделанные оценки достаточно грубые, они хорошо согласуются с оценками диэлектрических коэффициентов, сделанными на основе измерений с электрохромными флуоресцентными красителями, где были получены значения диэлектрических коэффициентов 0,25 для цитоплазматического канала и 0,7 - для внеклеточного (Аре11, е! а1, 2001). Отметим, что оценки параметра, характеризующего скорость транспорта ионов натрия в цитоплазматическом канале, на основе прямых электрических измерений получены нами впервые.

Таким образом, исследование токов смещения, вызванных локальным разделением зарядов в мембране в процессе активного транспорта, осуществляемого Ыа,К,АТР-азой, позволило получить существенную информацию о механизме этого транспорта, в частности, оценить кинетические и равновесные параметры связывания ионов, а также относительные глубины каналов, соединяющих центры связывания ионов с растворами с двух сторон белка.

Выводы

1. Разработана методика исследования связывания с липидной мембраной молекул биологически активных соединений, обладающих заряженными группами или дипольным моментом. Она основана на оригинальном методе компенсации внутримембранного поля для измерения разности граничных потенциалов БЛМ по второй гармонике емкостного тока.

2. Сопоставление изменений компонентов граничного потенциала, измеренных методами КВП, проводимости и электрофоретической подвижности, при адсорбции этих соединений на границе мембраны с раствором позволило определить сравнительную глубину погружения их молекул в мембрану.

3. Показано, что погружение заряженной группы в мембрану органических ионов амфифильной структуры приводит к возникновению на границе мембраны скачка потенциала, не экранируемого электролитом.

4. Предложен способ изучения электронейтрального транспорта амфифильных ионов через мембрану, основанный на регистрации распределения заряженных форм этих ионов на границах мембраны. Показано, что это распределение регулируется разностью рН в растворах с двух сторон мембраны.

5. Изучено взаимодействие продуктов цикла зрительного родопсина с БЛМ. Показано, что они не способны дестабилизировать мембрану в темноте подобно детергентам. При освещении они обладают свойствами фотосенсибилизаторов, хотя и более слабо выраженными по сравнению с фотосенсибилизаторами, применяемыми против опухолевых клеток. Поэтому наибольшую роль в гибели зрительных клеток могут играть продукты их самоокисления при освещении, которые оказываются гидрофильными и десорбируются с поверхности мембраны.

6. Обнаружено изменение граничного потенциала при фотосенсибилизированном окислении молекул на поверхности мембраны синглетным кислородом, образующимся при освещении адсорбированного на мембране фотосенсибилизатора. Синглетный кислород проникает через мембрану, вызывая окисление мишеней на обеих ее границах, и по сравнению скоростей окисления с двух сторон мембраны сделана оценка проницаемости мембраны для синглетного кислорода.

потенциала противоположен знаку равновесного потенциала мембраны, селективной по протонам, а при градиенте концентрации ионов калия возникает потенциал, величина которого превышает равновесный потенциал мембраны, селективной по ионам калия.

8. Разработан оригинальный метод изучения электрогенного транспорта ионов в Ма,К,Л'ГР-азс, основанный на измерении малых приращений адмиттанса (емкости и проводимости) мембраны, связанных с локальным перемещением заряда внутри мембраны. С помощью этого метода определены кинетические характеристики перемещения ионов натрия в цитоплазматическом и внеклеточном каналах доступа ионов №,К,АТР-азы: относительные глубины каналов, константы связывания ионов натрия в активных центрах с двух сторон белка, константы скорости связывания ионов и конформационного перехода. Параметры транспорта в канале с внеклеточной стороны Ыа,К,АТР-азы согласуются с литературными данными. Константы скоростей связывания и освобождения ионов натрия в цитоплазматическом канале доступа ионов определены впервые.

Список публикаций по теме диссертации

1. Markin V.S., V.S.Sokolov, L.I.Bogulavsky, LS.Jaguzhinsky. Nigericin-induced charge transfer across membranes. J.Membr.Biol. 25 (l-2):23-45, 1975.

2. ChernyV.V., V.S.Sokolov, l.G.Abidor. 1980. Determination of surface charge of bilayer lipid membranes. Bioelectrochemistry and Bioenergetics 7:413-420.

3. Соколов B.C. В.Г.Кузьмин. 1980. Измерение разности поверхностных потенциалов бислойных мембран по второй гармонике емкостного тока. Биофизика 25:170-172.

4. Соколов B.C., В.В.Черный, И.Г.Абидор. 1980. Измерение поверхностного заряда бислойных липидных мембран. Доюады АН СССР 251:236-239.

5. Соколов B.C., Т.Д.Чуракова, В.Г.Булгаков, В.Е.Каган, М.В.Биленко, Л.И.Богуславский. 1981. Исследование механизмов действия продуктов перекисного окисления липидов на проницаемость бислойных липидных мембран. Биофизика 26:147-149.

6. Черный В.В., М.М.Козлов, В.С.Соколов, Ю.А.Ермаков, В.С.Маркин. 1982. Адсорбция 1-анилино-8-нафтален сульфоната на бислойных липидных мембранах. Биофизика 27:812-817.

7. Ермаков Ю.А., В.В.Черный, В.С.Соколов, С.А.Татулян. 1983. Граничные потенциалы на липидных мембранах в присутствии ионов 1-анилино-8-нафтален сульфоната. Биофизика 28:1010-1013.

8. Козлов М.М., В.В.Черный, В.С.Соколов, Ю.А.Ермаков, В.С.Маркин. 1983. Теория адсорбции гидрофобных ионов в БЛМ с учетом их латерального взаимодействия и дискретности зарядов. Биофизика 28:61-66.

9. Соколов B.C., В.С.Маркин. 1984. Электрогенный транспорт ионов калия и водорода через мембрану, осуществляемый антибиотиками нигерицином и гризориксином. Биологические мембраны 1:1071-1086.

10. Соколов B.C., В.В.Черный, В.С.Маркин. 1984. Измерение скачков потенциала при адсорбции флоретина и флорицина на поверхности липидных мембран методом компенсации внутримембранного поля. Биофизика 29:424-429.

11. Симонова М.В., В.В.Черный, Е.Донат, В.С.Соколов, В.С.Маркин. 1986. Граничные потенциалы на бислойной мембране в присутствии ремантадина. Анализ трех методов измерения. Биологические мембраны 3:846-857.

12. Симонова М.В., В.В.Черный, В.С.Соколов, В.С.Маркин. 1986. Транспорт нейтральной формы ремантадина через плоскую бислойную липидную мембрану. Биологические мембраны 3:397-403.

13. Маркин B.C., В.И.Портнов, М.В.Симонова, В.С.Соколов, В.В.Черный. Теория переноса ремантадина и его аналогов через мембраны: внутриклеточный сдвиг рН, неперемешиваемые слои и мембранные потенциалы. Биологические мембраны 4 (5):502-523,1987.

14. Маркин B.C., В.С.Соколов. 1988. Новая концепция мембранного равновесия и аномальные мембранные потенциалы при сопряженном транспорте ионов. Электрохимия 24:781-787.

15. Черный В.В., М.Пауличке, М.В.Симонова, Ю.А.Ермаков, Е.Хессель, В.С.Соколов, Д.Лерхе, В.С.Маркин. 1988. Изменение структуры биологических и модельных мембран при действии ремантадина. Биологические мембраны 5:648-657.

16. Markin V.S., V. S. Sokolov. A new concept of electrochemical membrane equilibrium. Coupled transport and membrane potential. Bioelectrochemistry and Bioenergetics 23:116, 1990.

17. Mirsky V.M., V.V.Cherny, V.S.Sokolov, V.S.Markin. 1990. Electrostatic assay of phospholipase A activity: an application of the second harmonic method of monitoring membrane boundary potentials. J. Biochem. Biophys. Methods 21:277-284.

18. Sokolov V.S., V.V.Cherny, M.V.Simonova, V.S.Markin. 1990. Electrical potential distribution over the bilayer lipid membrane due to amphiphilic ions adsorption. Bioelectrochemistry and Bioenergetics 23:27-44.

19. Cherny V.V., M.V.Simonova, V.S.Sokolov, V.S.Markin. Transport of the neutral form of amphiphilic drugs through a planar bilayer lipid meembrane: the role of the pH gradient. Bioelectrochemistry and Bioenergetics 23 (1): 17-26, 1990.

20. Cherny V.V., V.M.Mirsky, V.S.Sokolov, V.S.Markin. BLM as enzyme sensitive electrode: determination of the phospholipase activity. Bioelectrochemistry and Bioenergetics 23:373-378, 1990.

21. Соколов B.C., В.В.Черный, М.В.Симонова, В.С.Маркин. 1990. Распределение потенциала на границе мембрана/раствор при адсорбции амфифильных ионов. Биологические мембраны 7:872-884.

22. Черный В.В., В.М.Мирский, В.С.Соколов, В.С.Маркин. 1990. Электростатический метод определения активности фосфолипазы А. Биохимия 55:445-450.

23. Ермаков Ю.А., В.В.Черный, В.С.Соколов. 1992. Адсорбция бериллия на нейтральных и заряженных липидных мембранах. Биологические мембраны 9:201213.

24. Черный В.В., М.Г.Сихарулидзе, В.М.Мирекий, В.С.Соколов. 1992. Распределение потенциалов на бислойной липидной мембране при функционировании фосфолипазы Аг. Биологические мембраны 9:733-740.

25. Стожкова И.Н., В.М.Мирекий, В.С.Соколов. 1993. Стехиометрия фотохимической реакции, индуцирующей повреждение липидного бислоя в присутствии фотосенсибилизатора. Биологические мембраны 10:44-49.

26. Черный А.В., В.С.Соколов, В.В.Черный. 1993. Распределение потенциала на границе мембрана/раствор при адсорбции тетракаина. Электрохимия 29:364-368.

27. Малков Д.Ю., В.С.Соколов. 1995. Дипольный скачок потенциала на границе мембрана/раствор при адсорбции стириловых красителей RH-421, RH-237 и RH-160. Биологические мембраны 12:658-669.

28. Один А.П., В.А.Александрова, В.С.Соколов, Д.А.Топчиев. 1995. Электростатическое взаимодействие катионных полиэлектролитов с клеточной мембраной в реализации антимутагенного эффекта. Биологические мембраны 12:185-190.

29. Стожкова И.Н., В.В.Черный, В.С.Соколов. 1995. Транспорт диметилового эфира гематопорфирина через бислойную липидную мембрану. Биологические мембраны 12:200-207.

30. Malkov D.Y., V.S.Sokolov. 1996. Fluorescent styryl dyes of the RH series affect a potential drop on the membrane/solution boundary. Biochim. Biophys. Acla 1278:197204.

31. Malkov D.Y., K.V.Pavlov, V.S.Sokolov. 1997. Dipole potential drop due to RH-dye on the lipid bilayer and its influence on NaVK'-ATPase activity. Ann. N. Y. Acad. Sci. 834:357-360.

32. Соколов B.C., С.М.Стуколов, А.С.Дармостук, Х.-Ю.Апель. 1997. Изучение нестационарного электрогенного транспорта ионов натрия Na,K,ATP-a3ofi методом измерения емкости. Биологические мембраны 14:529-548.

33. Стожкова И.Н., В.В.Черный, В.С.Соколов, Ю.А.Ермаков. 1997. Адсорбция гематопорфиринов на плоской бислойной мембране. Биологические мембраны 14:310-323.

34. Apell H.J., A.Schneeberger, V.S.Sokolov. 1998. Partial reactions of the Na,K-ATPase: kinetic analysis and transport properties. Acta Physiol Scand. Suppl 643:235-245.

35. Sokolov V.S., H.J.Apell, J.E.T.Corrie, D.R.Trenthara. 1998. Fast Transient Currents in Na,K-ATPase Induced by ATP Concentration Jumps from the P3-[l-(3',5'-Dimethoxyphenyl)-2-Phenyl-2-Oxo]ethyl Ester of ATP. Biophys. J. 74:2285-2298.

36. Sokolov V.S., S.M.Stukolov, A.S.Darmostuk, H.J.Apell. 1998. Influence of sodium concentration on changes of membrane capacitance associated with the electrogenic ion transport by the Na,K-ATPase. Eur. Biophys. J. 27:605-617.

37. Павлов K.B., В.С.Соколов. 1999. Электрогенный транспорт ионов Na/K-АТРазой. Биологические мембраны 16:604-638.

38. Sokolov V.S., M.Block, I.N.Stozhkova, P.Pohl. 2000. Membrane Photopotential Generation by Interfacial Differences in the Turnover of a Photodynamic Reaction. Biophys. J. 79:2121-2131.

39. Sokolov V.S., A.G.Ayuan, H.J.Apell. 2001. Assignment of charge movements to electrogenic reaction steps of the Na,K-ATPase by analysis of salt effects on the kinetics of charge movements. European Biophysics Journal 30:515-527.

40. Passechnik V.I., V.S.Sokolov. Estimation of electrochrome dyes position in the bilayer through the 2nd harmonic of capacitive current. Bioelectrochemistry 55 (l-2):47-51, 2002.

41.Ermakov Yu.A., V.S.Sokolov. 2003. Boundary potentials of bilayer lipid membranes: methods and interpretations. In Planar Lipid Bilayers (BLMs) and their applications. H.T.Tien and A.Ottova-Leitmannova, editors. Elsevier, 109-141.

42. Пасечник В.П., В.С.Соколов. 2003. Использование метода компенсации внутримембранного поля для оценки глубины погружения в мембрану электрохромных стириловых красителей. Биологические мембраны 20:433-442.

43. Sokolov V.S., V.M.Mirsky. 2004. Electrostatic potentials of bilayer lipid membranes: basic research and analytical applications. In Ultrathin Electrochemical Chemo- and Biosensors: Technology and Performance. V.M.Mirsky, editor. Springer-Verlag, Heidelberg. 255-291.

44. Соколов B.C., Е.А.Соколенко, А.В.Соколов, О.А.Финогенова, А.Е.Донцов, М.А.Островскнй. 2005. Взаимодействие бис-ретинилиден этаноламина (А2Е) с бислойными липидными мембранами в темноте и при действии света. Биологические мембраны 22:361-369.

45. Ayuyan A.G., V.S.Sokolov, A.A.Lenz, H.J.Apell. 2006. Effect of chaotropic anions on the sodium transport by the Na,K-ATPase. Eur.Biophvs.J. 35 (3):247-254.

46. Pashkovskaya A.A., E.A.Sokolenko, V.S.Sokolov, E.A.Kotova, Y.N.Antonenko. 2007. Photodynamic activity and binding of sulfonated metallophthalocyanines to phospholipid membranes: Contribution of metal-phosphate coordination. Biochim. Biophys. Acta 1768:2459-2465.

47. Sokolov V.S., E.A.Sokolenko, A.V.Sokolov, A.E.Dontsov, Y.A.Chizmadzhev, M.A.Ostrovsky. 2007. Interaction of pyridinium bis-retinoid (A2E) with bilayer lipid membranes. J. Photochem. Photobiol. 86:177-185.

48. Соколов B.C., Е.А.Соколенко, Д.В.Филинский, Ю.А.Ермаков, О.Д.Лопина, X.-Ю.Апель. 2007. Электрические потенциалы, возникающие при адсорбции фрагментов мембран с №,К,АТР-азой на липидных бислоях. Биологические мембраны 24:333-347.

49. Sokolov V.S., A.A.Shcherbakov, A.A.Lenz, Y.A.Chizmadzhev, H.J.Apell. 2008. Electrogenic transport of Na-ions in cytoplasmic and extracellular ion access channels о Na,K,ATP-ase probed by admittance measurement technique. Biochemistry (Moscow) Supplement Series A: Membrane and Cell Biology, 2 (2): 161-180.

50. Соколов A.B., В.С.Соколов, Т.Б.Фельдман, М.А.Островский. 2008. Взаимодействие полностью-транс-ретинапя с бислойными липидными мембранами. Биологические мембраны 25:501-508.

51. Князев Д.Г., В.А.Радюхин, В.С.Соколов. 2008. Изучение межмолекулярных взаимодействий белков Ml вируса гриппа на поверхности модельной липидной мембраны методом компенсации внутримембранного поля. Биологические мембраны 25 (6):491-800.

52. Sokolov V.S., P.Pohl. 2009. Membrane transport of singlet oxygen monitored by dipole potential measurements. Biophys. J. 96 (l):77-85.

53. Гришанин K.O., В.Ю.Ташкин, А.А.Ленц, Х.Ю.Апель, В.С.Соколов. 2010. О возможном участии протонов в функционировании Na+,K+,ATP-a3bi. Биологические мембраны 27 (6):512-518.

Подписано в печать 6 сентября 2012 г. Объем 2,0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 504 Отпечатано в Центре оперативной полиграфии ООО «Ол Би Принт» Москва, Ленинский пр-т, д.37

Содержание диссертации, доктора физико-математических наук, Соколов, Валерий Сергеевич

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Электростатика мембран

1.1.1. Структура липидов и липидные бислои

1.1.2. Электростатические граничные потенциалы

1.1.3. Распределение электрического поля в мембране

1.2. Методы измерения граничных потенциалов

1.2.1. Электрофоретическая подвижность и ¿¡-потенциал

1.2.2. Поверхностный потенциал монослоев

1.2.3. Зонды и проводимость БЛМ в присутствии ионофоров

1.2.4. Нестационарный мембранный потенциал на БЛМ

1.2.5. Методы компенсации внутримембранного поля

1.3. Пассивный ионный транспорт

1.3.1. Ионофоры и гидрофобные ионы

1.3.2. Антибиотики нигерициновой группы

1.3.3. Влияние электростатических потенциалов на ионный транспорт

1.4. Активный транспорт. Транспортные АТР-азы Р-типа

1.4.1. Модель транспорта. Цикл Альберса-Поста

1.4.2. Структура Ыа,К,АТР-азы и Са,АТР-азы

1.4.3. Исследование кинетики функционирования Ыа,К-АТР-азы

1.4.4. Изучение электрогенного транспорта, осуществляемого №,К,АТР-азой а) Общие принципы б) Экспериментальные исследования на клетках в) Экспериментальные исследования на модельных мембранах

1.4.5. Физическая модель электрогенного транспорта: итоги и проблемы

Глава 2. Методы исследования

2.1. Измерение потенциала

2.2. Измерение разности граничных потенциалов

2.3. Нестационарный транспорт - гидрофобные ионы

2.4. Нестационарный транспорт - Иа,К,АТР-аза

Глава 3. Электростатические потенциалы при связывании нейтральных и заряженных молекул на поверхности мембраны

3.1. Заряженные липиды и неорганические ионы

3.2. Амфифильные органические ионы

3.2.1. Теоретические модели адсорбции амфифильных и гидрофобных ионов

3.2.2. Распределение потенциала на границе мембраны

3.2.3. Электронейтральный транспорт амфифильных ионов через мембраны

3.3. Нейтральные молекулы и дипольные потенциалы

3.3.1. Связывание на БЛМ аналогов флоретина и стириловых красителей

3.3.2. Распределение потенциала и глубина адсорбции дипольных молекул

3.3.3. Влияние дипольного потенциала на электрическое поле в белках

3.4. Фото динамические реакции и транспорт синглетного кислорода через мембрану

3.4.1. Воздействие продуктов цикла зрительного родопсина

3.4.2. Действие на БЛМ фотосенсибилизаторов 117 а) Адсорбция фотосенсибилизаторов б) Моделирование фотодинамических реакций на поверхности БЛМ

Глава 4. Электростатические потенциалы и пассивный транспорт через мембрану

4.1. Пассивный обменный транспорт (нигерицин)

4.1.1. Аномальные мембранные потенциалы при электрогенном обменном транспорте

4.1.2. Механизм переноса заряда через мембрану

Глава 5. Нестационарный электрогенный транспорт ионов натрия, осуществляемый Na,KyATP-a30Ù

5.1. Электрические поля при адсорбции мембранных фрагментов на БЛМ

5.1.1. Теория

5.1.2. Экспериментальное исследование

5.2. Нестационарный транспорт ионов натрия Na,K,ATP-a3oM

5.2.1. Теоретическая модель

5.2.2.Экспериментальные измерения

Введение Диссертация по биологии, на тему "Локальное разделение зарядов в мембране при адсорбции и ионном транспорте"

В настоящее время бурно развивается направление, которое называют молекулярной биологией клетки, важным разделом которого является биофизика мембран. Важность этого направления обусловлена тем, что мембранные структуры, широко представленные в клетке, выполняют множество функций: барьерную, информационную, обеспечивая генерацию и передачу нервного импульса, и энергетическую, осуществляя синтез АТР. Все эти функции реализуются в ходе пассивного и активного транспорта заряженных частиц через мембраны, за который ответственны белковые молекулярные машины. Плазматическая мембрана, благодаря барьерным свойствам и транспортным белкам -обеспечивает уникальный ионный состав клетки, отличающийся от состава внешней среды, что обеспечивает возможность поддержания жизни клетки в неравновесных условиях. Функционирование мембранных белков можно изучать с помощью различных (например, оптических) зондов. Однако такой подход не позволяет установить механизм функционирования мембранных молекулярных машин, таких как ионные каналы и насосы. Это позволяют сделать модели, максимально приближенные к биологическим мембранам. К таким моделям относятся бислойные липидные мембраны.

Мембранный транспорт включает в себя три основные стадии: диффузию в водном растворе, адсорбцию на границе раздела мембраны с водой и собственно перенос через мембрану. Предметом наших исследований является изучение всех перечисленных стадий, включая как адсорбцию различных молекул на поверхности мембраны, так и собственно транспорт через липидный бислой, как пассивный, реализуемый антибиотиком нигерицином, так и активный, реализуемый Ыа,К,АТР-азой. Скорость каждой из стадий определяется скачком электрического потенциала на соответствующем участке пути. Это потребовало разработки как новых экспериментальных методов измерения граничных и внутримембранных скачков потенциала, так и оригинальных подходов к изучению механизма ионного транспорта, в частности, регистрации токов смещения при функционировании Ыа,К,АТР-азы.

Актуальность

Актуальность данного исследования определяется тем, что ионный транспорт необходим для поддержания жизнедеятельности клетки, и изучение функционирования молекулярных машин, осуществляющих этот транспорт, является одной из основных задач клеточной биологии. Исследование механизмов ионного транспорта невозможно без создания новых экспериментальных методов. Один из оригинальных методов, разработанных в настоящей работе, открыл новое направление, в котором с помощью регистрации электрических полей на границе мембраны с раствором исследуются процессы, происходящие на поверхности липидных мембран. Исследование этих процессов приобретает все большее значение в последнее время, поскольку позволяет понять детальные механизмы функционирования мембранных белков, важных в осуществлении жизнедеятельности клетки, изучить связывание на поверхности мембраны ионов и биологически активных соединений.

Научная новизна

Большинство результатов было получено с помощью разработанных нами оригинальных методов. В первую очередь к ним относится метод компенсации внутримембранного электрического поля, который позволяет измерять скачок электрического потенциала на границе мембраны и обладает рядом преимуществ по сравнению с методами, использовавшимися ранее. В результате исследований были открыты и изучены явления, которые ранее были недоступны для наблюдения: адсорбция заряженных и нейтральных молекул на поверхности БЛМ, распределение возникающего при этом скачка потенциала, электронейтральный транспорт органических ионов через мембрану, скачки потенциала, возникающие на границе мембраны при окислительных реакциях. Изучение влияния граничных потенциалов на индуцированную проводимость, позволил установить механизм электрогенного обменного транспорта, осуществляемого антибиотиками нигерициновой группы, что, в свою очередь, позволило объяснить необычные свойства трансмембранных потенциалов при градиентах участвующих в транспорте ионов. Новый метод - адмиттанса - предложен нами для исследования механизма переноса заряда в натриевом насосе, что позволило изучить те стадии переноса заряда при функционировании Ыа,К,АТР-азы, которые были недоступны для изучения с помощью традиционных электрофизиологических методов.

Практическая ценность

Практическая значимость работы состоит в том, что она позволила детально исследовать действие на мембраны биологически активных соединений. Особое значение имели исследования взаимодействия с липидной мембраной фотосенсибилизаторов, использующихся при лечении онкологических заболеваний. С помощью оригинальных методов изучены различные стадии действия фотосенсибилизаторов на мембрану: их связывание на поверхности, а также механизмы разрушения как самих мембран, так и встроенных в них молекул-мишеней активными формами кислорода, образующимися при освещении. Было также исследовано взаимодействие с мембраной продуктов цикла зрительного родопсина, накопление которых в клетках зрительного эпителия приводит к развитию возрастной дегенерации сетчатки глаза. Было показано, что, вопреки распространенной в литературе точке зрения, эти соединения не разрушают мембраны как детергенты. Они обладают свойствами слабых фотосенсибилизаторов, но основную роль в гибели эпителиальных клеток играют продукты их автоокисления под действием освещения. Эти исследования могут иметь существенное значение для разработки эффективных средств лечения данных заболеваний.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано около 80 статей в ведущих международных и отечественных журналах. Biophysical Journal,. Biochimica et Biophysica Acta, European Biophysical Journal, Journal of Photochemistry and Photobiology, J. Membrane Biol., Bioelectrochemistry, Доклады Академии Наук СССР, Биофизика, Биологические мембраны. Автор участвовал в публикации нескольких обзоров: в журнале Биологические мембраны (1999), а также в сборниках Planar Lipid Bilayers (BLMs) and their applications, editors H.T.Tien and A.Ottova-Leitmannova, Elsevier (2003); Ultrathin Electrochemical Chemo-and Biosensors: Technology and Performance, editor V.M.Mirsky, Springer-Verlag, Heidelberg (2004).

Апробация

Полученные нами результаты докладывались на авторитетных конференциях: съездах Американского биофизического общества, (1996, Baltimore, 2001, New Orlean, 2007, Baltimore), Европейского биофизического общества (2007, London, UK; 2009, Genue, Italy) Съездах биофизиков России (Москва, 1982; Москва, 1999; Воронеж, 2004), Международных конференциях по Ыа,К,АТР-азе (1993, Toodmos, Germany, 1997, Argentine; 2003, Elsenor, Denmark; 2008, Aarhus, Denmark), Международных Фрумкинских симпозиумах.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Соколов, Валерий Сергеевич

Выводы

7. Показано, что обменный транспорт ионов калия и водорода, осуществляемый антибиотиками нигерициновой группы, является электрогенным из-за участия в нем положительно заряженных димеров. Этот транспорт приводит к появлению мембранных потенциалов с необычными свойствами: при градиенте рН знак потенциала противоположен знаку равновесного потенциала мембраны, селективной по протонам, а при градиенте концентрации ионов калия возникает потенциал, величина которого превышает равновесный потенциал мембраны, селективной по ионам калия.

8. Разработан оригинальный метод изучения электрогенного транспорта ионов в Ма,К,АТР-азе, основанный на измерении малых приращений адмиттанса (емкости и проводимости) мембраны, связанных с локальным перемещением заряда внутри мембраны. С помощью этого метода определены кинетические характеристики перемещения ионов натрия в цитоплазматическом и внеклеточном каналах доступа ионов Ыа,К,АТР-азы: относительные глубины каналов, константы связывания ионов натрия в активных центрах с двух сторон белка, константы скорости связывания ионов и конформационного перехода. Параметры транспорта в канале с внеклеточной стороны Ка,К,АТР-азы согласуются с литературными данными. Константы скоростей связывания и освобождения ионов натрия в цитоплазматическом канале доступа ионов определены впервые.

Библиография Диссертация по биологии, доктора физико-математических наук, Соколов, Валерий Сергеевич, Москва

1. Tocanne J.F., Teissie J. Ionization of phospholipids and phospholipid supported interfacial lateral diffusion of protons in membrane model systems // Biochim. Biophys. Acta 1990. -V. 1031. -P. 111-142.

2. McLaughlin S.G.A. Electrostatic potentials at membrane-solution interfaces // Current topic in membrane and transport 1977. - V.9.-P.71-144.

3. Cafiso D., McLaughlin A., McLaughlin S., Winiski A. Measuring electrostatic potentials adjacent to membranes // Meth. Enzymol. 1989. - V. 171. - P. 342-364.

4. Clarke R.J. The dipole potential of phospholipid membranes and methods for its detection // Adv. Colloid Interface Sci. 2001. - V. 89-90. - P. 263-281.

5. Cevc G. Membrane electrostatics // Biochim. Biophys. Acta 1990. - V. 1031. - P. 311382.

6. Ermakov Yu.A. and Sokolov V.S. Boundary potentials of bilayer lipid membranes: methods and interpretations. In Planar Lipid Bilayers (BLMs) and their applications. Tien, H. T. and Ottova-Leitmannova, A. // Elsevier, P. 109-141 (2003).

7. McLaughlin A., Grathwohl C., McLaughlin S.G.A. The adsorption of divalent cations to phosphatidylcholine bilayer membranes // Biochim. Biophys. Acta 1978. - V. 513. - P. 338-357.

8. Ohki S., Ohki C.B. Monolayers at the oil/water interface as a proper model for bilayer membranes // J. Theor. Biol. 1976. - V. 62. - P. 389-407.

9. Ohki S., Sauve R. Surface potential of phosphatidylserine monolayers. 1. Divalent ion binding effect. // Biochim. Biophys. Acta 1978. - V. 511. - P. 377-387.

10. Ohki S., Kurland R. Surface potential of phosphatidylserine monolayers. II. Divalent and monovalent ion binding. // Biochim. Biophys. Acta 1981. - V. 645. - P. 170-176.

11. Lauger P., Neumcke B. Theoretical analysis of ion conductance in lipid bilayer membranes // Membranes. 1973. - V. 2. - P. 1-59.

12. Маркин B.C. и Чизмаджев Ю.А. Индуцированный ионный транспорт. // Наука, Москва. 1974.

13. Lesslauer W., Richter J., Lauger P. Some electrical properties of bimolecular phosphatidyl inositol membranes // Nature (London) 1967. - V. 213. - P. 1224-1226.

14. McLaughlin S.G., Szabo G., Eisenman G., Ciani S.M. Surface charge and the conductance of phospholipid membranes // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1970. - V. 67. - P. 12681275.

15. Laprade R., Ciani S., Eisenman G., Szabo G. The kinetics of carrier-mediated ion permeation in lipid bilayers and its theoretical interpreatation // Membranes. 1975. - V. 3. -P. 127-214.

16. Haydon D.A., Hladky S.B. Ion transport across thin lipid membranes: a critical discussion of mechanisms in selected systems // Quart. Rev. Biophys. 1972. - V. 5. - P. 187-282.

17. Hladky S.B. Ion transport and displacement currents with membrane bound carriers: The theory for voltage - clamp currents, charge - pulse transients and admittance for symmetrical systems // J. Membrane Biol. - 1979. - V. 49. - P. 213-237.

18. Fahr A., Lauger P., Bamberg E. Photocurrent kinetics of purple membrane sheets bound to planar bilayer membranes // J. Membrane Biol. - 1981. - V. 60. - P. 51-62.

19. Andersen O.S., Finkelstein A., Katz I., Cass A. Effect of phloretin on the permeability of thin lipid membranes // J. Gen. Physiol. 1976. - V. 67. - P. 749-771.

20. Melnik E., Latorre R., Hall J.E., Tosteson D.C. Phloretin-induced changes in ion transport across lipid bilayer membranes // J. Gen. Physiol. 1977. - V. 69. - P. 243-257.

21. Черный А.В., Соколов B.C., Черный В.В. Распределение потенциала на границе мембрана/раствор при адсорбции тетракаина // Электрохимия 1993. - Т. 29. - С. 364368.

22. Malkov D. Y., Sokolov V.S. Fluorescent styryl dyes of the RH series affect a potential drop on the membrane/solution boundary // Biochim. Biophys. Acta 1996. - V. 1278. - P. 197204.

23. Соколов B.C., Черный В.В., Симонова M.В., Маркин B.C. Распределение потенциала на границе мембрана.раствор при адсорбции амфифильных ионов // Биол. мембраны- 1990. Т. 7. - С. 872-884.

24. Wang С.-С., Bruner L.J. Dielectric saturation of the aqueous boundary layers adjacent to charged bilayer membranes // J. Membrane Biol. 1978. - V. 38. - P. 311-331.

25. Benz R., Frohlich O., Lauger P. Influence of membrane structure on the kinetics of carrier-mediated ion transport through lipid bilayers // Biochim. Biophys. Acta 1977. - V. 464. -P. 465-481.

26. Cseh R., Benz R. The adsorption of phloretin to lipid monolayers and bilayers cannot be explained by langmuir adsorption isotherms alone // Biophys. J. 1998. - V. 74. - P. 13991408.

27. Szabo G. Dual mechanism for the action of cholesterol on membrane permeability // Nature 1974. - V. 252. - P. 47-49.

28. Симонова M.В., Черный В.В., Донат Е., Соколов B.C., Маркин B.C. Граничные потенциалы на бислойной мембране в присутствии ремантадина. Анализ трех методов измерения // Биол. мембраны 1986. - Т. 3. - С. 846-857.

29. Pickar A.D., Benz R. Transport of oppositely charged lipophylic probe ions in lipid bilayer membranes having various structures // J. Membrane Biol. 1978. - V. 44. - P. 353-376.

30. Hong F.T. Charge transfer across pigmented bilayer lipid membrane and its interfaces // Photochem. Photobiol. 1976. - V. 24. - P. 155-189.

31. Petrov A.G., Sokolov V.S. Curvature-electric effect in black lipid membranes. Dynamic characteristics // Eur. Biophys. J. 1986. - V. 13. - P. 139-155.

32. Petrov A.G. The Liotropic State of Matter. Molecular Physics and Living Matter Physics. // Oversease Publishers Association., Amsterdam. 1998.

33. MacDonald R.C., Bangham A.D. Comparison of double layer potentials in lipid monolayers and lipid bilayers membranes // J. Membrane Biol. 1972. - V. 7. - P. 29-53.

34. Muller R.U., Finkelstein A. Voltage-dependent conductance induced in thin lipid membranes by monazomycin. // J. Gen. Physiol. 1972. - V. 60. - P. 263-284.

35. Muller R.U., Finkelstein A. The effect of surface charge on the voltage-dependent conductions induced in thin lipid membranes by monazomycin // J. Gen. Physiol. 1972. -V. 60. - P. 285-306.

36. Apell H.J., Bamberg E., Lauger P. Effects of surface charge on the conductance of the gramicidin channel // Biochim. Biophys. Acta 1979. - V. 552. - P. 369-378.

37. Latorre R., Hall J.E. Dipole potential measurements in asymmetric membranes // Nature -1976. -V. 264.-P. 361-363.

38. Schoch P., Sargent D.F., Schwyzer R. Capacitance and conductance as tools for the measurement of asymmetric surface potentials and energy barriers of lipid bilayer membranes // J. Membrane Biol. 1979. - V. 46. - P. 71-89.

39. Чизмаджев Ю.А., Черномордик JI.B., Пастушенко В.Ф., Абидор И.Г. Электрический пробой бислойных липидных мембран. В книге Ионные каналы и их модели. Ред. Костюк П. Г. // ВИНИТИ, Москва. С. 161-266 (1982).

40. Babakov A.V., Ermishkin L.N., Liberman Е.А. Influence of electric field on the capacilty of phospholipid membranes. // Nature 1966. - V. 210. - P. 953-955.

41. Пасечник В.И., Гианик Т. Измерение частотной зависимости модуля упругости бислойных липидных мембран // Биофизика 1977. - Т. 22. - С. 548-549.

42. Берестовский Г.Н. Электрострикция плоских липидных мембран и модули упругости // Биофизика 1981. - Т. 26. - С. 474-480.

43. Wobshall D. Voltage dependence of bilayer membrane capacitance // J. Colloid Interface Sci. 1972.-V. 40.-P. 417-423.

44. Абидор И.Г., Глазунов И., Лейкин С.Л., Чизмаджев Ю.А. Экспериментальное и теоретическое изучение природы быстрого изменения емкости бислойных липидных мембран в электрическом поле // Биол. мембраны 1986. - Т. 3. - С. 627-637.

45. Schoch P., Sargent D.F. Surface potentials of asymmetric charged lipid bilayers // Experimentia 1976. - V. 32. - P. 81149. Alvarez O., Latorre R. Voltage-dependent capacitance in lipid bilayers made frommonolayers//Biophys. J. 1978. - V. 21. - P. 1-17.

46. Абидор И.Г., Айтьян С.Х., Черный В.В., Черномордик Л.В., Чизмаджев Ю.А. Измерение внутримембранного скачка потенциала потенциодинамическим методом //ДАН СССР 1979. - Т. 245. - С. 977-981.

47. Соколов B.C., Кузьмин В.Г. Измерение разности поверхностных потенциалов бислойных мембран по второй гармонике емкостного тока // Биофизика 1980. - Т. 25.-С. 170-172.

48. Passechnik V.I., Hianik Т. Elastic properties of the bilayer membranes in the direction perpendicular to the membrane plane // Kolloidn. Zh. 1977. - V. 38. - P. 1180-1185.

49. Carius W. Voltage dependence of bilayer membrane capacitance. Harmonic responce to ac exitation with dc bias // J. Colloid Interface Sci. 1976. - V. 57. - P. 301-307.

50. Benz R., Janko K. Voltage induced capacitance relaxation of lipid bilayer membranes. Effects of membrane composition. // Biochim. Biophys. Acta - 1976. - V. 455. - P. 721738.

51. Carius W. Generation of 2-nd harmonic due to dielectric saturation at modified lipid bilayers. Dipycrylamine in lecithin membranes // BER. BUNSEN-GES. PHYS. CHEM. -1979. -V. 83. P. 905-911.

52. Флеров М.Н., Пасечник В.И., Гианик Т. Изучение вольт-амперных характеристик ионных каналов по гармоникам трансмембранного тока // Биофизика 1981. - Т. 26. -С. 277-283.

53. Mueller P., Rudin D.O., Tien H.T., Wescott W.C. Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an axitable system // Nature 1962. - V. 194. -P. 979-980.

54. Ciani, S. M., Eisenman, G., Laprade, P., and Szabo, G. Theoretical analysis of carrier-mediated electrical properties of bilayer membranes. Eisenman, G. // Marcel Deccer, New-York. P.61-177 (1973).

55. Овчинников Ю.А., Иванов В.Т., Шкроб A.M. Мембраноактивные комплексоны. // Наука, Москва. 1974.

56. Лебедев А.В., Богуславский Л.И. Эксперименальное исследование механизма проницаемости искусственных фосфолипидных мембран методом измерения импеданса // Биофизика 1973. - V. 16. - Р. 221-229.

57. Borisova M.P., Ermishkin L.N., Liberman Е.А., Silberstein A.Y., Trofimov E.M. Mechanism of conductivity of bimolecular lipid membranes in the presence of tetrachlorotrifluoromethylbenzimidazole // J. Membrane Biol. 1974. - V. 18. - P. 243-261.

58. McLaughlin S. The mechanism of action of DNP on phospholipid bilayer membranes // J. Membrane Biol. 1972. - V. 9. - P. 361-372.

59. Smejtek P., Hsu K., Perman W.H. Electrical conductivity in lipid bilayer membranes induced by pentachlorophenol // Biophys. J. 1976. - V. 16. - P. 319-336.

60. Stark G., Ketterer В., Benz R., Lauger P. The rate constants of valinomycin-mediated ion transport through thin lipid membranes // Biophys. J. 1971. - V. 11. - P. 981-994.

61. Andersen O.S., Fuchs M. Potential Energy Barriers to Ion Transport within Lipid Bilayers. Studies with Tetraphenylborate // Biophys. J. 1975. - V. 15. - P. 795-830.

62. Le Blank O.H. Tetraphenylborate conductance through lipid bilayer membrane // Biochim. Biophys. Acta 1969. - V. 193. - P. 350-360.

63. Григорьев П.А., Ермишкин Л.H., Маркин B.C. Прямое прохождение ионов через липидные мембраны. II. Экспериментальная часть // Биофизика 1972. - Т. 17. - С. 788-793.

64. Cohen F.S., Eisenberg M., McLaughlin S. The kinetic mechanism of action of an uncoupler of oxidative phosphorylation // J. Membrane Biol. 1977. - V. 37. - P. 361-396.

65. Neumke B. and Bamberg E. The action of uncouplers on lipid bilayer membranes. // Marcel Dekker, New-York and Basel. P.215-253 (1975).

66. Benz R., Stark G., Janko K., Lauger P. Valinomycin-mediated ion transport through neutral lipid membranes: influence of hydrocarbon chain length and temperature // J. Membrane Biol. 1973. - V. 14. - P. 339-364.

67. Wulf J., Benz R., Pohl W.G. Properties of bilayer membranes in the presence of dipicrylamine. A comparative study by optical absorption and electrical relaxation measurements // Biochim. Biophys. Acta 1977. - V. 465. - P. 429-442.

68. Pohl G.W., Knoll W., Gisin B.F., Stark G. Optical and electrical studies on dansyllysine-valinomycin in thin lipid membranes // Biophys. Struct. Mech. 1976. - V. 2. - P. 119-137.

69. Wang C.C., Bruner L.J. Lipid-dependent and phloretin-induced modifications of dipicrylamine adsorption by bilayer membranes // Nature 1978. - V. 272. - P. 268-270.

70. Pressman B.C. Ioonophores antibiotics as models for bioligical transport // Fed. Proc. -1968. -V. 27. P. 1283-1288.

71. Hinkle P., Mitchell P. Effect of membrane potential on equilibrium poise between cytochrome a and cytochrome c in rat liver mitochondria // J. Bioenerg. 1970. - V. 1. - P. 45-60.

72. Pressman B.C. Biological applications of ionophores // Annu. Rev. Biochem. 1976. - V. 45. - P. 501-530.

73. Graven S.N., Estrada O., Lardy H.A. Alkali metal cation release and respiratory inhibition induced by nigericin in rat liver mitochondria // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1966. - V. 56. - P. 654-658.

74. Henderson P.J. Ion transport by energy-conserving biological membranes // Annu. Rev. Microbiol. 1971. - V. 25. - P. 393-428.

75. Henderson P. J., McGivan J.D., Chappell J.B. The action of certain antibiotics on mitochondrial, erythrocyte and artificial phospholipid membranes. The role of induced proton permeability // Biochem. J 1969. - V. 111. - P. 521-535.

76. Pressman B.C., Harris E.J., Jagger W.S., Johnson J.H. Antibiotic-mediated transport of alkali ions across lipid barriers // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1967. - V. 58. - P. 19491956.

77. Harris E.J., Pressman B.C. Obligate cation exchanges in red cells // Nature 1967. - V. 216. - P. 918-920.

78. Shavit N., Thore A., Keister D.L., San Pietro A. Inhibition by nigericin of the light-induced pH change in Rhodospirillum rubrum chromatophores // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A- 1968.-V. 59.-P. 917-922.

79. Packer L. Effect of nigericin upon light-dependent monovalent cation transport in chloroplasts // Biochem. Biophys Res. Commun. 1967. - V. 28. - P. 1022-1027.

80. Ashton R., Steinrauf L.K. Thermodynamic consideration of the ion transporting antibiotics // J Mol. Biol. 1970. - V. 49. - P. 547-556.

81. Steinrauf L.K., Czerwinski E.W., Pinkerton M. Comparison of the monovalent cation complexes of monensin, nigericin, and dianemycin // Biochem. Biophys Res. Commun. -1971. -V. 45. P. 1279-1283.

82. Shiro M., Koyama H.J. Crystal structure of silver polyetherin A // Chem. Soc. , Ser. B -1970. P. 243-253.

83. Kubota T., Matsutani S., Shiro M. The structure of polyetherin A // The Chemical Society Chem. Commun, 1968. - P. 1541-1543.

84. Lutz W.K., Wipf H.-K., Simon W. Alkalitionen Spezifität und trager - eingeschaften der antibiotica nigericin und monensin // Helv. Chim Acta - 1970. - V. 53. - P. 1741-1746.

85. Lutz W.K., Früh P.U., Simon W. Microcalorimetric determination of dH, dG and dS for the interaction of the carrier antibiotics nigericin and monensin with sodium and potassium ions // Helv. Chim Acta 1971. - V. 54. - P. 2767-2770.

86. Alleaume M., Hickel D. The Crystal structure of grisorixin silver salt // J. Chem. Soc. Chem. Comm. 1970. - P. 1422-1423.

87. Gachon P., Chaput G., Jeminet G., Jillard J., Morel J.P. Grisorixin, an ionophorous antibiotics of nigericin group. Part IV. Complexation of monovalent cations // J. Chem. Soc. (Perkin II) 1975. - P. 907-911.

88. Estrada O., Graven S.N., Lardy H.A. Potassium Ion-dependent hydrolysis of adenosine triphosphate induced by nigericin in mitochondria // J Biol. Chem. 1967. - V. 242. - P. 2925-2932.

89. Shavit N., San Pietro A. K+ -dependent uncoupling of photophosphorylation by nigericin // Biochem. Biophys Res. Commun. 1967. - V. 28. - P. 277-283.

90. Fergusson S.H.F., Estrada-O.S., Lardy H.A. Potassium specific uncoupling by nigericin //J. Biol. Chem. - 1971. -V. 246. - P. 5645-5652.

91. Toro M., Gomez-Lojero C., Montai M., Estrada O. Charge transfer mediated by nigericin in black lipid membranes // J Bioenerg. 1976. - V. 8. - P. 19-26.

92. Pohl P., Antonenko Y.N., Yaguzhinsky L.S. Kinetic properties of cation/H(+)-exchange: calcimycin (A23187)-mediated Ca2+/2H(+)-exchange on the bilayer lipid membrane // Biochim. Biophys Acta 1990. - V. 1027. - P. 295-300.

93. Antonenko Y.N., Yaguzhinsky L.S. A new method of the measurement of the electrically neutral fluxes of cations through lipid hilayer membranes induced by Men+/nH+-exchangers // FEBS Lett. 1983. - T. 163. - C. 42-45.

94. Ивков В.Г. и Берестовский Г.Н. Динамическая структура липидного бислоя. // Наука, Москва. 1981.

95. Benz R., Frohlich О., Lauger P., Montai M. Electrical capacity of black lipid films and of lipid bilayers made from monolayers // Biochim. Biophys. Acta 1975. - V. 394. - P. 323334.

96. Benz R., Gisin B.F. Influence of membrane structure on ion transport through lipid bilayer membranes // J. Membrane Biol. 1978. - V. 40. - P. 293-314.

97. Hladky S.B. The effect of stirring on the flux of carriers into black lipid membranes // Biochim. Biophys. Acta 1973. - V. 307. - P. 261-269.

98. Krasne S., Eisenman G., Szabo G. Freezing and melting of lipid bilayers and the mode of action of nonactin, valinomycin, and gramicidin // Science 1971. - V. 174. - P. 412-415.

99. Stark G., Benz R., Pohl G.W., Janko K. Valinomycin as a probe for the study of structural changes of black lipid membranes // Biochim. Biophys. Acta 1972. - V. 266. - P. 603612.

100. Benz R., Cros D. Influence of sterols on ion transport through lipid bilayer membranes // Biochim. Biophys. Acta 1978. - V. 506. - P. 265-280.

101. Szabo G. Mechanisms by which small molecules alter ionic permeability through lipid bilayer membranes // Adv. Exp. Med. Biol. 1977. - V. 84. - P. 167-190.

102. Szabo G. The influence of dipole potentials on the magnitude and the kinetics of ion transport in lipid bilayer membranes. In: Extreme, environments. : mechanisms, of microbial, adaptation. Ed. by Heinrich M.R. // Academic. Press, New York. 1976.

103. Kuo K.H., Fukuto T.R., Miller T.A., Bruner L.J. Blocking of valinomycin-mediated bilayer membrane conductance by substituted benzimidazoles // Biophys. J. 1976. - V. 16. -P. 143-150.

104. Ketterer В., Neumke В., Lauger P. Transport mechanism of hydrophobic ions through lipid bilayer membranes // J. Membrane Biol. 1971. - V. 5. - P. 225-245.

105. Andersen O.S., Feldberg S., Nakadomari H., Levy S., McLaughlin S. Electrostatic interactions among hydrophobic ions in lipid bilayer membranes // Biophys. J. 1978. - V. 21. - P. 35-70.

106. Hladky S.B., Haydon D.A. Membrane conductance and surface potential // Biochim. Biophys. Acta 1973. - V. 318. - P. 464-468.

107. Alvarado F. Hypothesis for the interaction of phlorizin and phloretin with membrane carriers for sugars // Biochim. Biophys. Acta 1967. - V. 135. - P. 483-495.

108. Jennings M.L., Solomon A.K. Interaction between phloretin and the red blood cell membrane // J. Gen. Physiol 1976. - V. 67. - P. 381-397.

109. Toon M.R., Solomon A.K. Modulation of water and urea transport in human red cells: effects of pH and phloretin // J. Membr. Biol. 1987. - V. 99. - P. 157-164.

110. Strichartz G.R., Oxford G.S., Ramon F. Effects of the dipolar form of phloretin on potassium conductance in squid giant axons // Biophys. J. 1980. - V. 31. - P. 229-246.

111. Reyes J., Motais R., Latorre R. Phloretin and phloretin analogs: mode of action in planar lipid bilayers // J. Membrane Biol. 1983. - V. 72. - P. 93-103.

112. Franklin J.C., Cafiso D.S. Internal electrostatic potentials in bilayers: measuring and controlling dipole potentials in lipid vesicles // Biophys. J. 1993. - V. 65. - P. 289-299.

113. Verkman A.S., Solomon A.K. A stepwise mechanism for the permeation of phloretin through a lipid bilayer // J Gen. Physiol 1982. - V. 80. - P. 557-581.

114. Verkman A.S. The quenching of an intramembrane fluirescent probe. A method to study the binding and permeation of phloretin through bilayers // Biochim. Biophys. Acta 1980. - V. 599. - P. 370-379.

115. Соколов B.C., Черный B.B., Маркин B.C. Измерение скачков потенциала при адсорбции флоретина и флорицина на поверхности липидных мембран методом компенсации внутримембранного поля // Биофизика 1984. - Т. 29. - С. 424-429.

116. Cseh R., Benz R. Interaction of phloretin with lipid monolayers: relationship between structural changes and dipole potential change // Biophys. J. 1999. - V. 77. - P. 14771488.

117. Verkman A.S., Pandiscio A.A., Jennings M., Solomon A.K. An improved temperature-jump apparatus // Anal. Biochem. 1980. - V. 102. - P. 189-195.

118. Verkman A.S., Solomon A.K. Kinetics of phloretin binding to phosphatidylcholine vesicle membranes // J Gen. Physiol 1980. - V. 75. - P. 673-692.

119. Awiszus R., Stark G. A laser-T-jump study of the adsorption of dipolar molecules to planar lipid membranes. II. Phloretin and phloretin analogues // Eur. Biophys. J. 1988. -V. 15.-P. 321-328.

120. Awiszus R., Stark G. A laser-T-jump study of the adsorption of dipolar molecules to planar lipid membranes. I. 2,4-dichlorophenoxyacetic acid. // Eur. Biophys. J. 1988. - V. 15.-P. 299-310.

121. Franklin J.C., Cafiso D.S., Flewelling R.F., Hubbell W.L. Probes of membrane electrostatics: synthesis and voltage- dependent partitioning of negative hydrophobic ion spin labels in lipid vesicles // Biophys. J. 1993. - V. 64. - P. 642-653.

122. Осипов В.В., Ростовцева Т.К., Лев А.А. Вольтамперные характеристики одиночных грамицидиновь!х каналов при симметричных и асимметричных условиях сорбции на мембранах анионов 1-анилинонафталин-8-сульфоната// Биол. мембраны 1988. - Т. 5. - С. 162-172.

123. Ростовцева Т.К., Осипов В.В., Лев А.А. Зависимость проводимости одиночных грамицидиновых каналов от потенциала, задаваемого адсорбцией анионов 1 -анилинонафталин-8-сульфоната на липидных мембранах // Биол. мембраны 1988. -Т. 4.- С. 955-964.

124. Jordan P.C. Electrostatic modeling of ion pores. II. Effects attributable to the membrane dipole potential // Biophys. J. 1983. - V. 41. - P. 189-195.

125. Rokitskaya T.I., Antonenko Y.N., Kotova E.A. Effect of the dipole potential of a bilayer lipid membrane on gramicidin channel dissociation kinetics // Biophys. J. 1997. - V. 73. -P. 850-854.

126. Latorre R., Alvarez O. Voltage-Dependent Channels in Planar Lipid Bilayer Membranes // Physiological Reviews 1981. - V. 61. - P. 77-150.

127. Malev V.V., Schagina L.V., Gurnev P.A., Takemoto J.Y., Nestorovich E.M., Bezrukov S.M. Syringomycin E channel: a lipidic pore stabilized by lipopeptide? // Biophys. J. -2002. -V. 82. P. 1985-1994.

128. Schagina L.V., Gurnev P.A., Takemoto J.Y., Malev V.V. Effective gating charge of ion channels induced by toxin syringomycin E in lipid bilayers // Bioelectrochemistry. 2003. -V. 60.-P. 21-27.

129. Болдырев, А. А. Транспортные АТФазы. 1. Na,K-ATOa3a и ее биологическое значение.//Наука, Москва. 1985.

130. Лопина, О.Д. Na+,K+-ATP-a3a: структура, механизм и регуляция активности // Биол. мембраны,. 1999. - Т. 16. - С. 584-603.

131. Lauger, P. Electrogenic Ion Pumps. // Sinauer associates, Inc., Sunderland, Massachusets, USA. 1991.

132. Павлов К.В., Соколов B.C. Электрогенный транспорт ионов Na/K-АТРазой // Биол. мембраны 1999. - Т. 16. - С. 604-638.

133. Skou J.С. The influence of some cations on an adenosinetriphosphatase from peripheral nerves // Biochim. Biophys. Acta 1957. - V. 23. - P. 394-401.

134. Albers R.W. Biochemical aspects of active transport // Annu. Rev. Biochem. 1967. - V. 36. - P. 727-756.

135. Glynn, I. M. The Na+,K+-transporting adenosine triphosphatase. In The Enzymes of Biological Membranes. Ed. By Martonosi, A. N. // Plenum Press, New York. P.35-114 (1985).

136. Sachs J.R. Interaction of Magnesium with the Sodium-Pump of the Human Red- Cell // J. Physiol. -London 1988. - V. 400. - P. 575-591.

137. Richards D.E. Occlusion of Cobalt Ions Within the Phosphorylated Forms of the Na+- K+ Pump Isolated from Dog Kidney // J. Physiol. -London 1988. - V. 404. - P. 497-514.

138. Rice W.J., Young H.S., Martin D.W., Sachs J.R., Stokes D.L. Structure of Nal,Kl-ATPase at 11-Е Resolution: Comparison with Ca21-ATPase in El and E2 States // Biophys. J. 2001. - V. 80. - P. 2187-2197.

139. Glynn, I. M. The electrogenic sodium pump. Electrogenic transport. In Fundamental principles and physiological implications. Blaustein, M. P. and Lieberman, M. // Raven Press, New York. P.34-48 (1985).

140. Glynn I.M., Hara Y., Richards D.E., Steinberg M. Comparison of Rates of Cation Release and of Conformational Change in Dog Kidney Na,K-ATPase // J. Physiol. -London 1987. -V. 383.-P. 477-485.

141. Steinberg M., Karlish S.J. Studies on conformational changes in Na,K-ATPase labeled with 5- iodoacetamidofluorescein // J. Biol. Chem. 1989. - V. 264. - P. 2726-2734.

142. Forbush I.B. Rapid 86Rb release from an occluded state of the Na,K-pump reflects the rate of dephosphorylation or dearsenylation // J. Biol. Chem. 1988. - V. 263. - P. 7961-7969.

143. Heyse S., Wuddel I., Apell H.J., Sturmer W. Partial reactions of the Na,K-ATPase: determination of rate constants // J. Gen. Physiol. 1994. - V. 104. - P. 197-240.

144. Norby J.G. Na,K-ATPase Structure and Kinetics - Comparison with Other Ion- Transport Systems // Chemica Scripta - 1987. - V. 27B. - P. 119-129.

145. Shull G.E., Schwarz A., Lingrel J.B. Amino-acid sequence of the catalitic subunit of the Na,K pump deduced from complementary DNA // Nature 1985. - V. 316. - P. 691-695.

146. Ogawa H., Shinoda T., Cornelius F., Toyoshima C. Crystal structure of the sodium-potassium pump (Na+,K+-ATPase) with bound potassium and ouabain // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 2009. - V. 106. - P. 13742-13747.

147. Shinoda T., Ogawa H., Cornelius F., Toyoshima C. Crystal structure of the sodium-potassium pump at 2.4 A resolution // Nature 2009. - V. 459. - P. 446-450.

148. Berrebi-Bertran I., Robert P., Camelin J.C., Bril A., Souchet M. The g-subunit of (Na+,K+)-ATPase: a representative example of human single transmembrane protein with a key regulatory role // Cell. Mol. Biol. 2001. - V. 47. - P. 285-296.

149. Cornelius F., Mahmmoud Y.A., Christensen H.R. Modulation of Na,K-ATPase by associated small transmembrane regulatory proteins and by lipids // J. Bioenerg. Biomembr. 2001. - V. 33. - P. 415-423.

150. Therien A.G., Pu H.X., Karlish S.J., Blostein R. Molecular and functional studies of the gamma subunit of the sodium pump // J. Bioenerg. Biomembr. 2001. - V. 33. - P. 407414.

151. Morth J.P., Pedersen B.P., Toustrup-Jensen M.S., Sorensen T.L., Petersen J., Andersen

152. J.P., Vilsen B., Nissen P. Crystal structure of the sodium-potassium pump // Nature 2007. -V. 450.-P. 1043-1049.

153. Toyoshima C., Nakasako M., Nomura H., Ogawa H. Crystal structure of the calcium pump of sarcoplasmic reticulum at 2.6 A resolution // Nature 2000. - V. 405. - P. 647-655.

154. Toyoshima C. Structural aspects of ion pumping by Ca -ATPase of sarcoplasmic reticulum // Arch. Biochem. Biophys 2008. - V. 476. - P. 3-11.

155. Toyoshima C. How Ca -ATPase pumps ions across the sarcoplasmic reticulum membrane // Biochim. Biophys. Acta 2009. - V. 1793. - P. 941-946.

156. Schack V.R., Morth J.P., Toustrup-Jensen M.S., Anthonisen A.N., Nissen P., Andersen

157. J.P., Vilsen B. Identification and function of a cytoplasmic K+ site of the Na+, K+ -ATPase // J. Biol. Chem. 2008. - V. 283. - P. 27982-27990.

158. Nielsen J.M., Pedersen P.A., Karlish S.J., Jorgensen P.L. Importance of intramembrane carboxylic acids for occlusion of K+ ions at equilibrium in renal Na,K-ATPase // Biochemistry 1998. - V. 37. - P. 1961-1968.

159. Ogawa H., Toyoshima C. Homology modeling of the cation binding sites of Na+K+-ATPase // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 2002. - V. 99. - P. 15977-15982.

160. Li C., Capendeguy O., Geering K., Horisberger J.D. A third Na+-binding site in the sodium pump // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 2005. - V. 102. - P. 12706-12711.

161. Li C., Geering K., Horisberger J.D. The third sodium binding site of Na,K-ATPase is functionally linked to acidic pH-activated inward current // J. Membrane Biol. 2006. - V. 213. - P. 1-9.

162. Deguchi N., Jorgensen P.L., Maunsbach A.B. Ultrastructure of the sodium pump. Comparison of thin sectioning, negative staining and freeze-fracture of purified membrane-bound (Na+,K+)-ATPase // J. Cell Biol. 1977. - V. 75. - P. 619-634.

163. Jorgensen P.L. Isolation of the Na,K-ATPase // Meth. Enzymol. 1974. - V. 32. - P. 277290.

164. Hobbs A.S., Albers R.W., Froehlich J.P. Complex time dependence of phosphoenzyme formation and decomposition in electroplax Na,K ATPase // 1988. P. 307-314.

165. Rephaeli A., Richards D.E., Karlish S.J.D. Conformational transitions in fluorescent-labeled Na,K ATPase reconstituted into phospholipid vesicles // J. Biol. Chem. 1986. - V. 261. - P. 6248-6254.

166. Lupfert C., Grell E., Pintschovius V., Apell H.J., Cornelius F., Clarke R.J. Rate limitation of the Na+,K+-ATPase pump cycle // Biophys. J. 2001. - V. 81. - P. 2069-2081.

167. Humphrey P. A., Lupfert C., Apell H.J., Cornelius F., Clarke R.J. Mechanism of the rate-determining step of the Na+,K+-ATPase pump cycle // Biochemistry 2002. - V. 41. - P. 9496-9507.

168. Clarke R.J., Humphrey P.A., Lupfert C., Apell H.J., Cornelius F. Kinetic investigations of the mechanism of the rate-determining step of the Na+,K+-ATPase pump cycle // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2003. - V. 986. - P. 159-162.

169. Khalid M., Fouassier G., Apell H.J., Cornelius F., Clarke R.J. Interaction of ATP with the phosphoenzyme of the Na(+),K(+)-ATPase // Biochemistry 2010. - V. 49. - P. 1248-1258.

170. Clarke R.J., Kane D.J., Apell H.-J., Roudna M., Bamberg E. Kinetics of Na(+)-dependent conformational changes of rabbit kidney Na+,K+-ATPase // Biophys. J. 1998. - V. 75. - P. 1340-1353.

171. McCray J.A., Herbette L., Kihara T., Trentham D.R. A new approach to time-resolved studies of ATP-requiring biological systems: Laserflash photolisys of caged ATP // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1980. - V. 77. - P. 7237-7241.

172. Klodos I., Forbush I.B. Rapid conformational changes of the Na/K pump revealed by a fluorecsent dye, RH-160 // J. Gen. Physiol. 1988. - V. 92. - P. 46a-46a.

173. Gadsby D.C. Influence of the sodium pump current on electrical activity of cardiac cells // Soc. Gen. Physiol Ser. 1984. - V. 38. - P. 215-238.

174. Forbush I.B., Klodos I. Rate-Limiting Steps in Na+ Translocation by the Na/K-Pump // 1991. P. 211-225.

175. Buhler R., Sturmer W., Apell H.-J., Lauger P. Charge translocation by the Na,K-pump: I. Kinetics of local field changes studied by time-resolved fluorescence measurements // J. Membrane Biol. 1991. - V. 121. - P. 141-161.

176. Sturmer W., Buhler R., Apell H.J., Lauger P. Charge translocation by the Na,K-pump: II. Ion binding and release at the extracellular face // J. Membrane Biol. 1991. - V. 121. - P. 163-176.

177. Kaplan J.H. Ion movement through sodium pump // Ann. Rev. Physiol. 1985. - V. 47. -P. 535-544.

178. Apell H.J., Roudna M., Corrie J.E., Trentham D.R. Kinetics of the phosphorylation of Na,K-ATPase by inorganic phosphate detected by a fluorescence method // Biochemistry -1996. -V. 35. P. 10922-10930.

179. Forbush I.B. An apparatus for rapid kinetic analysis of isotopic efflux from membrane vesicles and of ligand dissociation from membrane proteins // Anal. Biochem. 1984. - V. 140. - P. 495-505.

180. Forbush I.B. Na+, K+, and Rb+ Movements in a Single Turnover of the Na/K Pump // Curr. Top. Membr. Transp. 1987. - V. 28. - P. 19-39.

181. Lauger P., Apell H.-J. A microscopic model for the current voltage behaviour of the Na/K-pump // Eur. Biophys. J. - 1986. - V. 13. - P. 309-321.

182. De Weer P., Gadsby D.C., Rakowski R.F. Voltage Dependence of the Na-K Pump // Ann. Rev. Physiol. 1988. - V. 50. - P. 225-241.

183. Маркин B.C., Соколов B.C. Мембранный потенциал при сопряженном электрогенном транспорте. Термодинамическое рассмотрение // Биол. мембраны -1986.-Т. 3,-С. 638-649.

184. Markin V.S., Sokolov V.S. A new concept of electrochemical membrane equilibrium. Coupled transport and membrane potential // Bioelectrochem. Bioenerg. 1990. - V. 23. -P. 1-16.

185. De Weer P., Gadsby D.C., Rakowski R.F. Stoishiometry and voltage dependence of the Na,K pump. In: The Na,K pump, part A: molecular aspects. Ed. By Skou C.; Norby J.G.; Mannsbach A.B.; Esmann M. // A.R. Liss, New York 1988. P. 307-314.

186. Rakowski R.F., Gadsby D.C., De Weer P. Stoichiometry and Voltage Dependence of the Sodium-Pump in Voltage- Clamped, Internally Dialyzed SQUID Giant-Axon // J. Gen. Physiol. 1989. - V. 93. - P. 903-941.

187. Markin V.S., Sokolov V.S., Boguslavsky L.I., Jaguzhinsky L.S. Nigericin-induced charge transport across membranes // J. Membrane Biol. 1975. - V. 25. - P. 23-45.

188. Соколов B.C., Маркин B.C. Электрогенный транспорт ионов калия и водорода через мембрану, осуществляемый артибиотиками нигерициноми и гризориксином // Биол. мембраны 1984. - Т. 1. - С. 1071-1086.

189. Reinhardt R., Lindemann В., Anner В.M. Leakage channel conductance of single (Na-K)-ATPase molecules incorporated into planar bilayer by fusion of liposomes // Biochim. Biophys. Acta - 1984. - V. 774. - P. 147-150.

190. Adrian R.H., Slayman C.L. Membrane potential and conductance during transport of sodium, potassium and rubidium in frog muscle // J. Physiol. 1966. - V. 184. - P. 9701017.

191. Carrasquer G., Rehm W.S., Schwartz M. Biochim. Biophys. Acta 1986. - V. 862. - P. 178-178.

192. Lauger P., Jauch P. Microscopic description of voltage effects on ion-driven cotransport systems//J. Membrane Biol. 1986. -V. 91. - P. 275-284.

193. Schwarz W., Gu Q.B. Characteristics of the Na+/K+-ATPase from Torpedo- Californica Expressed in Xenopus Oocytes a Combination of Tracer Flux Measurements with Electrophysiological Measurements // Biochim. Biophys. Acta - 1988. - V. 945. - P. 167174.

194. Rakowski R.F. Simultaneous Measurement of Changes in Current and Tracer Flux in Voltage-Clamped SQUID Giant-Axon // Biophys. J. 1989. - V. 55. - P. 663-671.

195. Lauger P. Thermodynamic and Kinetic properties of electrogenic ion pump // Biochim. Biophys. Acta 1984. - V. 779. - P. 307-341.

196. Apell H.-J., Borlinghaus R., Lauger P. Electrogenic Properties of the Na/K Pump -Voltage Dependence and Kinetics of Charge Translocation // Curr. Top. Membr. Transp. -1989. -V. 34. P. 229-252.

197. Hansen U.-P., Gradmann D., Sanders D., Slayman C.L. Interpretation of current-voltage relationships for "active" ion transport systems. I. Steady-state reaction kinetic analysis of Class-1 mechanisms//J. Membrane Biol. 1981. - V. 63. - P. 165-190.

198. Gadsby D.C., Nakao M. Steady-State Current-Voltage Relationship of the Na/K Pump in Guinea- Pig Ventricular Myocytes // J. Gen. Physiol. 1989. - V. 94. - P. 511-537.

199. Nakao M., Gadsby D.C. Na. and [K] Dependence of the Na/K Pump Current-Voltage Relationship in Guinea-Pig Ventricular Myocytes // J. Gen. Physiol. 1989. - V. 94. - P. 539-565.

200. Lafaire A.F., Schwarz W. Voltage dependence of the rheogenic Na/K ATPase in the membrane of oocytes of Xenopus Laevis II J. Membrane Biol. 1986. - V. 91. - P. 43-51.

201. Schweigert B., Schwarz W., Lafaire A.V. Voltage Dependence of the Na-K ATPase -Measurements of Ouabain- Dependent Membrane Current and Ouabain Binding in Oocytes of Xenopus- Laevis // Pflugers Arch. -Eur. J. Physiol. 1988. - V. 412. - P. 579-588.

202. Glitsch H.G., Krahn T., Pusch H. The Dependence of Sodium-Pump Current on Internal Na Concentration and Membrane-Potential in Cardioballs from Sheep Purkinje-Fibers // Pflugers Arch. -Eur. J. Physiol. 1989. - V. 414. - P. 52-58.

203. Bielen F.V., Glitsch H.G., Verdonck F. Dependence of the Na pump current on external monovalent cations and membrane potential in rabbit cardiac Purkinje cells // J. Physiol. -1991. -V. 442. P. 169-180.

204. Rakowski R.F., Vasilets L.A., LaTona J., Schwarz W. A Negative Slope in the Current-Voltage Relationship of the Na+/K+ Pump in Xenopus Oocytes Produced by Reduction of External (K+) // J. Membrane Biol. 1991. - V. 121. - P. 177-187.

205. Sagar A., Rakowski R.F. Access Channel Model for the Voltage Dependence of the Forward- running Na+/K+ Pump // J. Gen. Physiol. 1994. - V. 103. - P. 869-894.

206. Gadsby D.C., Nakao M., Bahinski A., Nagel G., Suenson M. Charge movements via the cardiac Na,K-ATPase // Acta Physiol. Scand. 1994. - V. 607. - P. 111-123.

207. Tverdislov V.A., Iakovenko L.V., Rezaeva M.N. Mechanism of coupling of ion transport and ATP hydrolysis in the Na-pump. // Mol. Biol. (Mosk) 1979. - V. 13. - P. 377-382.

208. Vasilets L.A., Omay H.S., Ohta T., Noguchi S., Kawamura M., Schwarz W. Stimulation of the Na+/K+ Pump by External (K+) is Regulated by Voltage-Dependent Gating // J. Biol. Chem. 1991. - V. 266. - P. 6285-6288.

209. Omay H.S., Schwarz W. Voltage-Dependent Stimulation of Na+/K+-Pump Current by External Cations Selectivity of Different K+ Congeners // Biochim. Biophys. Acta - 1992. -V. 1104. - P. 167-173.

210. Gadsby D.C., Rakowski R.F., De Weer P. Extracellular Access to the Na,K-Pump: Pathway Similar to ion Channel // Science 1993. - V. 260. - P. 100-103.

211. Nakao M., Gadsby D.C. Voltage Dependence of Na Translocation by the Na/K Pump // Nature 1986. - V. 323. - P. 628-630.

212. Bahinski A., Gadsby D.C., Nakao M. Potassium translocation by the Na+/K+ pump is voltage insensitive // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1988. - V. 85. - P. 3412-3416.

213. Rakowski R.F. Charge Movement by the Na/K Pump in Xenopus Oocytes // J. Gen. Physiol. 1993. -V. 101. - P. 117-144.

214. Rettinger J., Vasilets L.A., Schwarz W. Analysis the Na+/K+-pump in Outside-out Giant Membrane Patches of Xenopus Oocytes // 1994. P. 553-556.

215. Holmgren M., Rakowski R.F. Pre-Steady-State Transient Currents Mediated by the Na/K Pump in Internaly Perfused Xenopus Oocytes // Biophys. J. 1994. - V. 66. - P. 912-922.

216. Dempski R.E., Hartung K., Friedrich T., Bamberg E. Fluorometric measurements of intermolecular distances between the alpha- and beta-subunits of the Na+/K+-ATPase // J. Biol. Chem. 2006. - V. 281. - P. 36338-36346.

217. Dempski R.E., Friedrich T., Bamberg E. The beta subunit of the Na+/K+-ATPase follows the conformational state of the holoenzyme // J. Gen. Physiol. 2005. - V. 125. - P. 505520.

218. Geibel S., Kaplan J.H., Bamberg E., Friedrich T. Conformational dynamics of the Na+/K+-ATPase probed by voltage clamp fluorometry // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 2003. - V. 100.-P. 964-969.

219. Hilgemann D.W. Channel-Like Function of the Na,K Pump Probed at Microsecond Resolution in Giant Membrane Patches // Science 1994. - V. 263. - P. 1429-1432.

220. Wagg J., Holmgren M., Gadsby D.C., Bezanilla F., Rakowski R.F., De Weer P. Na/K-pump-mediated charge movements as an assay of Na+ translocation and occlusion/deocclusion rates // Biophys. J. 1996. - V. 70. - P. A19-A19.

221. Rakowski R.F., Bezanilla F., De Weer P., Gadsby D.C., Holmgren M., Wagg J. Charge translocation by the Na/K pump // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1997. V. 834. - P. 231-241.

222. Holmgren M., Wagg J., Bezanilla F., Rakowski R.F., De Weer P., Gadsby D.C. Three distinct and sequential steps in the release of sodium ions by the Na+/K+-ATPase // Nature -2000. -V. 403. P. 898-901.

223. Gadsby D., Bezanilla F., Rakowski R.F., De Weer P., Holmgren M. The dynamic relationships between the three events that release individual Na+ ions from the Na+/K+ -ATPase // Nature Communications 2012. - V. 1673. - P. 1-6.

224. Khater K.A., Rakowski R.F. Effect of pH on charge movement by the Na/K pump in Xenopus oocytes // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1997. - V. 834. - P. 350-353.

225. Hilgemann D.W. Recent electric snapshots of the cardiac Na,K pump // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1997.-V. 834.-P. 260-269.

226. Gadsby D.C., Nakao M., Bahinski A. Voltage Dependence of Na/K Pump Current // Curr. Top. Membr. Transp. 1989. - V. 34. - P. 269-288.

227. Gadsby D.C., Nakao M., Bahinski A. Voltage Dependence of Transient and Steady-State Na/K Pump Currents in Myocytes // Mol. Cell. Biochem. 1989. - V. 89. - P. 141-146.

228. Peluffo R.D., Berlin J.R. Electrogenic K+ transport by the Na+,K+ pump in rat cardiac ventricular myocytes // Journal of Physiology London 1997. - V. 501. - P. 33-40.

229. Berlin J.R., Peluffo R.D. Mechanism of electrogenic reaction steps during K+ transport by the Na,K-ATPase // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1997. - V. 834. - P. 251-259.

230. Kimelberg H.K. Alterations in phospholipid-dependent (Na+-K+)-ATPase activity due to lipid fluidity. Effects of cholesterol and Mg2+ // Biochim. Biophys Acta 1975. - V. 413. -P. 143-156.

231. Anner B.M., Moosmayer M. Preparation of Na,K-ATPase containing liposomes with predictable transport properties by a procedure relating the Na,K-transport capacity to the ATPase activity // J. Biochem. Biophys. Methods 1982. - V. 5. - P. 200-306.

232. Cornelius F. Incorporation of CnEg-solubilized Na+,K+-ATPase into liposomes -determination of sidedness and orientation // Meth. Enzymol. 1988. - V. 156. - P. 156167.

233. Hokin L.E., Dixon J.F. Reconstitution of the Na,K-pump by freeze thaw sonication -estimation of coupling ratio and electrogenicity // Meth. Enzymol. 1988. - V. 156. - P. 141-155.

234. Marcus M.M., Apell H.J., Roudna M., Schwendener R.A., Weder H.G., Lauger P. (Na+-K+)-ATPase in artificial lipid vesicles: influence of lipid structure on pumping rate // Biochim. Biophys. Acta 1986. - V. 854. - P. 270-278.

235. Cornelius F., Skou J.C. Reconstitution of (Na+-K+)-ATPase into phospholipid vesicles with full recovery of its specific activity // Biochim. Biophys. Acta 1984. - V. 772. - P. 357-373.

236. Jogansson A., Smith G.A., Metcalfe J.C. The effect of bilayer thickness on activity of (Na-K)-ATPase // Biochim. Biophys. Acta 1981. - V. 641. - P. 416-421.

237. Mueller P., Rudin D.O., Tien H.T., Wescott W.C. Methods for the formation of single bimolecular lipid membranes in aqueous solution // J. Phys. Chem. 1963. - V. 67. - P. 534-535.

238. Jain M.K., White F.P., Strickholm A., Williams E., Cordes E.H. Studies concerning the possible reconstitution of an active cation pump across an artificial membrane // J. Membrane Biol. 1972. - V. 8. - P. 363-380.

239. Hayman E.S. Electrogenesis from an ATPase-ATP-sodium pseudo pump // J. Membrane Biol. 1977. - V. 37. - P. 263-263.

240. Сорокина 3. А. Ионофорные свойства пептидных фрагментов церебральной Na,K-АТФазы // Укр. Биохим. Ж. СССР 1984. - Т. 56. - С. 413-417.

241. Mironova G.D., Bocharnikova N.I., Mirsalikhova N.M., Mironov G.P. Ion transporting properties and ATPase activity of (Na+-K+)- ATPase large subunit incorporated into bilayer lipid membranes // Biochim. Biophys. Acta - 1986. - V. 861. - P. 224-236.

242. Gadsby D.C. Ion channels versus ion pumps: the principal difference, in principle // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2009. - V. 10. - P. 344-352.

243. Gadsby D.C., Takeuchi A., Artigas P., Reyes N. Review. Peering into an ATPase ion pump with single-channel recordings // Philos. Trans. R. Soc. Lond В Biol. Sei. 2009. -V. 364. - P. 229-238.

244. Takeuchi A., Reyes N., Artigas P., Gadsby D.C. The ion pathway through the opened Na(+),K(+)-ATPase pump //Nature 2008. - V. 456. - P. 413-416.

245. Rakowski R.F., Artigas P., Palma F., Holmgren M., De Weer P., Gadsby D.C. Sodium flux ratio in Na/K pump-channels opened by palytoxin // J. Gen. Physiol. 2007. - V. 130. -P. 41-54.

246. Artigas P., Gadsby D.C. Ion occlusion/deocclusion partial reactions in individual palytoxin-modified Na/K pumps // Ann. N. Y. Acad. Sei. 2003. - V. 986. - P. 116-126.

247. Artigas P., Gadsby D.C. Na+/K+-pump ligands modulate gating of palytoxin-induced ion channels // Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A 2003. - V. 100. - P. 501-505.

248. Montal M., Mueller P. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties // Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A 1972. - V. 69. - P. 3561-3566.

249. Stengelin M., Eisenrauch A., Fendler K., Nagel G., van der Hijden H.T., de Pont J.J., Grell E., Bamberg E. Charge translocation of H,K-ATPase and Na,K-ATPase // Ann. N. Y. Acad. Sei. 1992. - V. 671. - P. 170-188.

250. Eisenrauch A., Grell E., Bamberg E. Voltage Dependence of the Na,K-ATPase incorporated into Planar Lipid Membranes //1991. P. 317-326.

251. Fendler K., Grell E., Haubs M., Bamberg E. Pump Currents Generated by the Na+,K+-ATPase from kidney on Black Lipid Membranes // EMBO J. 1985. - V. 4. - P. 30793085.

252. Borlinghaus R., Apell H.J., Lauger P. Fast charge translocations associated with partial reactions of the Na,K-pump: I. Current and voltage transients after photochemical release of ATP // J. Membrane Biol. 1987. - V. 97. - P. 161-178.

253. Drachev L.A., Jasaitis A.A., Mikelsaar H., Nemecek I.B., Semenov A.Y., Semenova E.G., Severina 1.1., Skulachev V.P. Reconstitution of biological molecular generators of electric current // J. Biol. Chem. 1976. - V. 251. - P. 7077-7082.

254. Apell H.J., Borlinghaus R., Lauger P. Fast charge translocations associated with partial reactions of the Na,K-pump: II. Microscopic analysis of transient currents // J. Membrane Biol. 1987. -V. 97. - P. 179-191.

255. Wuddel I., Apell H.J. Electrogenicity of the sodium transport pathway in the Na,K-ATPase probed by charge-pulse experiments // Biophys. J. 1995. - V. 69. - P. 909-921.

256. Nagel G., Bamberg E., Fendler K., Grell E. Na+ Currents Generated by the Purified (Na+ -K+)-ATPase on Planar Lipid-Membranes // Biochim. Biophys. Acta 1987. - V. 901. - P. 239-249.

257. Fendler K., Jaruschewski S., Hobbs A., Albers W., Froehlich J.P. Pre-steady-state charge translocation in NaK-ATPase from eel electric organ // J. Gen. Physiol. 1993. - V. 102. -P. 631-666.

258. Borlinghaus R., Apell H.J. Current transients generated by the Na+/K+-ATPase after an ATP concentration jump: dependence on sodium and ATP concentration // Biochim. Biophys. Acta 1988. - V. 939. - P. 197-206.

259. Friedrich Т., Bamberg E., Nagel G. Na+/K+-ATPase Pump Currents in Giant Excised Patches Activated by an ATP Concentration Jump // Biophys. J. 1996. - V. 71. - P. 24862500.

260. Wuddel I. Untersuchung kinetischer und dielectrischer eigenschaften der Na,K-ATPase: hemmstoff und ladungspuls-experimente // 1994. P. 1-126.

261. Sturmer W., Apell H.J., Wuddel I., Lauger P. Conformational transitions and change translocation by the Na,K pump: comparison of optical and electrical transients elicited by ATP-concentration jumps // J. Membrane Biol. 1989. - V. 110. - P. 67-86.

262. Friedrich Т., Nagel G. Comparison of Na+/K+-ATPase Pump Currents Activated by ATP Concentration or Voltage Jumps // Biophys. J. 1997. - V. 73. - P. 186-194.

263. Walker J.W., Reid G.P., McCray J.A., Trentham D.R. Photolabile l-(2-nitrophenyl)ethyl phosphate esters of adenine nucleotide analogues // J. Am. Chem. Soc. 1988. - V. 110. -P. 7170-7177.

264. McCray J.A., Trentham D.R. Properties and uses of photoreactive caged compaunds // Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 1989. - V. 18. - P. 239-270.

265. Fendler K., Bamberg E., Grell E. Kinetics of Pump Currents Generated by the Na+,K+-ATPase // FEBS Lett. 1987. - V. 224. - P. 83-88.

266. Sokolov V.S., Apell H.J., Corrie J.E., Trentham D.R. Fast transient currents in Na,K-ATPase induced by ATP concentration jumps from the P3-l-(3',5'-dimethoxyphenyl)-2-phenyl-2-oxo.ethyl ester of ATP // Biophys. J. 1998. - V. 74. - P. 2285-2298.

267. Соколов B.C., Стуколов C.M., Дармостук A.C., Апель Х.-Ю. Изучение нестационарного электрогенного транспорта ионов натрия Na,K,ATP-a3oii методом измерения емкости // Биол. мембраны 1997. - Т. 14. - С. 529-548.

268. Lu С.-С., Kabakov А., Markin V.S., Mager S., Frazier S., Frazier G.A., Hilgemann D.W. Membrane Transport Mechanisms Probed by Capacitance Measurements with Megahertz Voltage Clamp // Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A 1995. - V. 1995. - P. 11220-11224.

269. Соколов B.C., Павлов K.B., Джанджугазян K.H., Бамберг E. Изменение емкости и проводимости модельной мембраны при функционировании Na,K-ATOa3bi // Биол. мембраны 1992. - Т. 9. - С. 961-969.

270. Sokolov V.S., Pavlov K.V., Dzhandzhugazyan K.N. Change of Membrane Capacitance Coupled with Electrogenic Transport by Na,K-ATPase // 1994. P. 529-533.

271. Pintschovius J., Fendler K., Bamberg E. Charge translocation by the Na+/K+-ATPase investigated on solid supported membranes: Cytoplasmic cation binding and release // Biophys. J. 1999. - V. 76. - P. 827-836.

272. Pintschovius J., Fendler K. Charge translocation by the Na+/K+-ATPase investigated on solid supported membranes: Rapid solution exchange with a new technique // Biophys. J. -1999. -V. 76. P. 814-826.

273. Burzik C., Kaim G., Dimroth P., Bamberg E., Fendler K. Charge displacements during ATP-hydrolysis and synthesis of the Na+-transporting FoFl-ATPase of Ilyobacter tartaricus // Biophys. J. 2003. - V. 85. - P. 2044-2054.

274. Tadini-Buoninsegni F., Bartolommei G., Moncelli M.R., Fendler K. Charge transfer in P-type ATPases investigated on planar membranes // Arch. Biochem. Biophys 2008. - V. 476. - P. 75-86.

275. Ganea C., Fendler K. Bacterial transporters: charge translocation and mechanism // Biochim. Biophys Acta 2009. - V. 1787. - P. 706-713.

276. Rakowski R.F., Gadsby D.C., De Weer P. Voltage dependence of the Na/K pump // J. Membrane Biol. 1997. -V. 155. - P. 105-112.

277. Apell H.J., Diller A. Do H+ ions obscure electrogenic Na+ and K+ binding in the El state of the Na,K-ATPase? // FEBS Lett. 2002. - V. 532. - P. 198-202.

278. Apell H.-J., Benz G., Sauerbrunn D. Proton Diet for the Sodium Pump // Biochemistry -2011.-V. 50.-P. 409-418.

279. Sokolov V.S., Stukolov S.M., Darmostuk A.S., Apell H.J. Influence of sodium concentration on changes of membrane capacitance associated with the electrogenic ion transport by the Na,K-ATPase // Eur. Biophys. J. 1998. - V. 27. - P. 605-617.

280. Or E., Goldshleger R., Karlish S.J.D. An Effect of Voltage on Binding of Na+ at the Cytoplasmic Surface of the Na+ K+ Pump // J. Biol. Chem. 1996. - V. 271. - P. 24702477.

281. Schneeberger A., Apell H.J. Ion selectivity of the cytoplasmic binding sites of the Na,K-ATPase: I. Sodium binding is associated with a conformational rearrangement // J. Membrane Biol. 1999. - V. 168. - P. 221-228.

282. Sokolov V.S., Ayuyan A.G., Apell H.J. Assignment of charge movements to electrogenic reaction steps of Na,K-ATPase by analysis of salt effects on the kinetics of charge movements // Eur. Biophys. J. 2001. - V. 30. - P. 515-527.

283. Cevc, G. and Marsh, D. Phospholipid Bilayers. Physical Principles and Models. // Willey-Interscience Publication,New York. 1987.

284. Eisenberg M., Gresalfi T., Riccio T., McLaughlin S. Adsorption of Monovalent Cations to Bilayer Membranes Containing Negative Phospholipids // Biochemistry 1979. - V. 18. -P. 5213-5223.

285. McLaughlin S., Mulrine N., Gresalfi T., Vaio G., McLaughlin A. Adsorption of divalent cations to bilayer membranes containing phosphatidylserine // J. Gen. Physiol. 1981. - V. 77.- P. 445-473.

286. McLaughlin, S. Experimental Test of the Assumptions Inherent in the Gouy-Chapman-Stern Theory of the Aqueous Diffuse Double Layer. In Physical Chemistry of Transmembrane Ion Motions. Spach, G. // Elsevier, Amsterdam. P.69-76 (1983).

287. Ermakov Yu.A., Averbakh A.Z., Yusipovich A.I., Sukharev S.I. Dipole Potentials Indicate Restructuring of the Membrane Interface Induced by Gadolinium and Beryllium Ions // Biophys. J. 2001. - V. 80. - P. 1851-1862.

288. Haynes D.A. ANS: a fluorescent indicator of ion binding and electrostatic potential on the membrane surface. // J. Membrane Biol. 1974. - V. 81. - P. 1755-1761.

289. Черный В.В., Козлов M.M., Соколов B.C., Ермаков Ю.А., Маркин B.C. Адсорбция 1-анилино-8-нафтален сульфоната на бислойных лииидных мембранах // Биофизика -1982.-Т. 27.-С. 812-817.

290. Krasne S. Interactions of voltage-sensing dyes with membranes. III. Electrical properties induced by merocyanine 540 // Biophys. J. 1983. - V. 44. - P. 305-314.

291. Ермаков Ю.А., Черный В.В., Соколов B.C., Татулян С.А. Граничные потенциалы на липидных мембранах в присутствии ионов 1-анилино-8-нафтален сульфоната // Биофизика 1983. - Т. 28. - С. 1010-1013.

292. Стожкова И.Н., Черный В.В., Соколов B.C., Ермаков Ю.А. Адсорбция гематопорфиринов на плоской бислойной мембране // Биол. мембраны 1997. - Т. 14. -С. 310-323.

293. Козлов М.М., Черный В.В., Соколов B.C., Ермаков Ю.А., Маркин B.C. Теория адсорбции гидрофобных ионов в БЛМ с учетом их латерального взаимодействия и дискретности зарядов // Биофизика 1983. - Т. 28. - С. 61-66.

294. Antonenko Y.N., Yaguzhinsky L.S. The role of pH gradient in the unstirred layers in the transport of weak acids and bases through bilayer lipid membranes. // Bioelectrochem. Bioenerg. 1984. - V. 13. - P. 85-92.

295. Antonenko Y.N., Yaguzhinsky L.S. Generation of potential in bilayer lipid membranes as a result of proton-transfer reactions in the unstirred layers // J. Bioenergetics and Biomembranes 1982. - V. 14. - P. 457-465.

296. Симонова М.В., Черный В.В., Соколов B.C., Маркин B.C. Транспорт нейтральной формы ремантадина через плоскую бислойную липидную мембрану // Биол. мембраны 1986. - Т. 3. - С. 397-403.

297. Маркин B.C., Портнов В.И., Симонова М.В., Соколов B.C., Черный В.В. Теория переноса ремантадина и его аналогов через мембраны внутриклеточный сдвин рН неперемешиваемые слои и мембранные потенциалы // Биол. мембраны 1987. - Т. 4. -С. 502-523.

298. Стожкова И.Н., Черный В.В., Соколов B.C. Транспорт диметилового эфира гематопорфирина через бислойную липидную мембрану // Биол. мембраны 1995. -Т. 12. - С. 200-207.

299. Antonenko Y.N., Yaguzhinskii L.S. Model of non-electrogenic transport of cations through bilayer lipid membranes. // Biofizika 1984. - V. 29. - P. 232-236.

300. Waggoner A.S. Dye indicators of membrane potential // Annu. Rev. Biophys. Bioeng. -1979.-V. 8.-P. 47-68.

301. Loew L.M., Simpson L.L. Charge-shift probes of membrane potential: a probable electrochromic mechanism for p-aminostyrylpyridinium probes on a hemispherical lipid bilayer // Biophys. J. 1981. - V. 34. - P. 353-365.

302. Grinvald A., Hildesheim R., Farber I.C., Anglister L. Improved fluorescent probes for the measurement of rapid changes in membrane potential // Biophys. J. 1982. - V. 39. - P. 301-308.

303. Fluhler E., Burnham V.G., Loew L.M. Spectra, membrane binding, and potentiometric responses of new charge shift probes // Biochemistry 1985. - V. 24. - P. 5749-5755.

304. Loew L.M. Design and characterization of electrochromic membrane probes // J. Biochem. Biophys. Methods 1982. - V. 6. - P. 243-260.

305. Loew L.M., Scully S., Simpson L., Waggoner A.S. Evidence for a charge-shift electrochromic mechanism in a probe of membrane potential // Nature 1979. - V. 281. - P. 497-499.

306. Muller W., Windisch H., Tritthart H.A. Fluorescent styryl dyes applied as fast optical probes of cardiac action potential // Eur. Biophys. J. 1986. - V. 14. - P. 103-111.

307. Малков Д.Ю., Соколов B.C. Дипольный скачок потенциала на границе мембрана.раствор при адсорбции стириловых красителей RH-421, RH-237 и RH-160 // Биол. мембраны 1995. - Т. 12. - С. 658-669.

308. Hianik, Т. and Passechnik, V. I. Bilayer Lipid Membranes: Structure and Mechanical Properties. // Ister Science, Bratislava. 1995.

309. Пасечник В.И., Соколов B.C. Использование метода компенсации внутримембранного поля для оценки глубины погружения в мембрану электрохромных стириловых красителей // Биол. мембраны 2003. - Т. 20. - С. 433442.

310. Klusemann J., Meves Н. The effect of phloretin on single potassium channels in myelinated nerve // Eur. Biophys J 1992. - V. 21. - P. 93-97.

311. O'Connor A.E., Gallagher W.M., Byrne A.T. Porphyrin and nonporphyrin photosensitizers in oncology: preclinical and clinical advances in photodynamic therapy // Photochem. Photobiol. 2009. - V. 85. - P. 1053-1074.

312. Островский M.A. Молекулярные механизмы повреждающего действия света на структуры глаза и системы защиты от такого повреждения // Успехи биологической химии 2005. - Т. 45. - С. 173-204.

313. Красновский, А. А. мл. Синглетный молекулярный кислород и первичные механизмы фотодинамического действия оптического излучения. In Современные проблемы лазерной физики. Ахманов, С. A. and Черняева, Е. Б. // ВИНИТИ, Москва. Т.64-128 (1990).

314. Sparrow J.R., Fishkin N., Zhou J., Cai В., Jang Y.P., Krane S., Itagaki Y., Nakanishi K. A2E, a byproduct of the visual cycle // Vision Res. 2003. - V. 43. - P. 2983-2990.

315. Sparrow J.R., Parish C.A., Hashimoto M., Nakanishi К. A2E, a lipofuscin fluorophore, in human retinal pigmented epithelial cells in culture // Invest Urol. 1999. - V. 40. - P. 29882995.

316. Черный В.В., Мирский В.М., Соколов B.C., Маркин B.C. Электростатический метод определения активности фосфолипазы А // Биохимия 1990. - Т. 55. - С. 445-450.

317. Черный В.В., Сихарулидзе М.Г., Мирский В.М., Соколов B.C. Распределение потенциалов на бислойной липидной мембране при функционировании фосфолипазы Аг // Биол. мембраны 1992. - Т. 9. - С. 733-740.

318. Mirsky V.M., Cherny V.V., Sokolov V.S., Markin V.S. Electrostatic assay of phospholipase A activity: an application of the second harmonic method of monitoring membrane boundary potentials // J. Biochem. Biophys. Methods 1990. - V. 21. - P. 277284.

319. Стожкова И.Н., Мирский B.M., Соколов B.C. Стехиометрия фотохимической реакции, индуцирующей повреждение липидного бислоя в присутствии фотосенсибилизатора// Биол. мембраны 1993. - Т. 10. - С. 44-49.

320. Sokolov V.S., Sokolenko Е.А., Sokolov A.V., Dontsov A.E., Chizmadzhev Y.A., Ostrovsky M.A. Interaction of pyridinium bis-retinoid (A2E) with bilayer lipid membranes // J. Photochem. Photobiol. 2007. - V. 86. - P. 177-185.

321. Sokolov V.S., Block M., Stozhkova I.N., Pohl P. Membrane photopotential generation by interfacial differences in the turnover of a photodynamic reaction // Biophys. J. 2000. - V. 79. -P. 2121-2131.

322. Sokolov V.S., Pohl P. Membrane transport of singlet oxygen monitored by dipole potential measurements // Biophys. J. 2009. - V. 96. - P. 77-85.

323. Ivanov 1.1., Fedorov G.E., Gus'kova R.A., Ivanov K.I., Rubin A.B. Permeability of lipid membranes to dioxygen // Biochem Biophys Res Commun. 2004. - V. 322. - P. 746-750.

324. Bamberg E., Butt H.J., Eisenrauch A., Fendler K. Charge transport of ion pumps on lipid bilayer membranes // Quart. Rev. Biophys. 1993. - V. 26. - P. 1-25.

325. Айтьян C.X., Белая M.JI., Чизмаджев Ю.А. Взаимодействие заряженных бислойных липидных мембран // ДАН СССР 1981. - V. 256. - Р. 990-994.

326. Айтьян С.Х., Белая М.Л., Чизмаджев Ю.А. Взаимодействие мембран, несущих постоянный поверхностный заряд // Биофизика 1981. - Т. 26. - С. 467-473.

327. Егорова Е.М., Черномордик Л.В., Абидор И.Г., Чизмаджев Ю.А. Исследование взаимодействия липосом с БЛМ потенциодинамическим методом // Биофизика -1981.-Т. 26.-С. 363-365.

328. Егорова Е.М., Черномордик Л.В., Абидор И.Г., Чизмаджев Ю.А. Слияние липосом с плоской липидной мембраной // Биофизика 1981. - Т. 26. - С. 145-147.

329. Черный В.В., Пауличке М., Симонова М.В., Ермаков Ю.А., Хессель Е., Соколов B.C., Лерхе Д., Маркин B.C. Изменение структуры биологических и модельных мембран при действии ремантадина// Биол. мембраны 1988. - Т. 5. - С. 648-657.

330. Ермаков Ю.А., Юсипович А.И. Граничный потенциал и натяжение плоских БЛМ в присутствии гадолиния. Регистрация в условиях непрерывной перфузии ячейки. // Биол. мембраны 2002. - Т. 19. - С. 541-548.

331. Skriver E., Maunsbach А.В., Anner B.M., Jorgensen P.L. Electron microscopy of phospholipid vesicles reconstituted with purified renal Na,K-ATPase // Cell Biol. Int. Rep. 1980. -V. 4. - P. 585-591.

332. Аюян А.Г., Соколов B.C., Апель Х.-Ю. Влияние солей холина на скорость лимитирующей стадии активного транспорта ионов натрия Ыа+,К+,АТР-азой // Биол. мембраны 2004. - Т. 21. - С. 406-414.

333. Holmgren М., Rakowski R.F. Charge translocation by the Na+/K+ pump under Na+/Na+ exchange conditions: intracellular Na+ dependence // Biophys. J. 2006. - V. 90. - P. 16071616.

334. Lauger P. A channel mechanism for electrogenic ion pumps // Biochim. Biophys. Acta -1979. -V. 552. P. 143-161.

335. Соколов B.C., Соколенко E.A., Филинский Д.В., Ермаков Ю.А., Лопина О.Д., Апель Х.-Ю. Электрические потенциалы, возникающие при адсорбции фрагментов мембран с Ыа,К,АТР-азой на липидных бислоях // Биол. мембраны 2007. - Т. 24. - С. 333-347.

336. Apell H.-J. Structure-function relationship in P-type ATPases—a biophysical approach // Rev. Physiol Biochem. Pharmacol. 2003. - V. 150. - P. 1-35.

337. Гришанин К.О., Ташкин В.Ю., Ленц А.А., Апель Х.-Ю., Соколов B.C. О возможном участии протонов в функционировании Na+,K+,ATP-a3bi // Биол. мембраны 2010. -Т. 27. - С. 512-518.

338. Schneeberger A., Apell H.J. Ion selectivity of the cytoplasmic binding sites of the Na,K-ATPase: II. Competition of various cations // J. Membrane Biol. 2001. - V. 179. - P. 263273.

339. Apell H.J., Karlish S.J. Functional properties of Na,K-ATPase, and their structural implications, as detected with biophysical techniques // J. Membrane Biol. 2001. - V. 180. -P. 1-9.

340. Apell H.J. Toward an understanding of ion transport through the Na,K-ATPase // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2003. - V. 986. - P. 133-140.

341. Krasnovsky A.A., Jr. Singlet molecular oxygen in photobiochemical systems: IR phosphorescence studies // Membr. Cell Biol. 1998. - V. 12. - P. 665-690.

342. Rodgers M.A., Snowden P.T. Lifetime of singlet oxygen in liquid water as determined by time resolved infrared luminescence measurements. // J. Am. Chem. Soc. 1982. - V. 104. -P. 5541-5543.

343. Fischkoff S., Vanderkooi J.M. Oxygen Diffusion in Biological and Artificial Membranes Determined by Fluorochrome Pyrene // J. Gen. Physiol. 1975. - V. 65. - P. 663-676.

344. Dzikovski B.G., Livshits V.A., Marsh D. Oxygen permeation profile in lipid membranes: comparison with transmembrane polarity profile // Biophys. J. 2003. - V. 85. - P. 10051012

345. Subczynski W.K., Hyde J.S., Kusumi A. Oxygen permeability of phosphatidylcholine— cholesterol membranes // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1989. - V. 86. - P. 4474-4478.

Информация о работе

Соколов, Валерий Сергеевич
доктора физико-математических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.02

Диссертация

Локальное разделение зарядов в мембране при адсорбции и ионном транспорте - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Локальное разделение зарядов в мембране при адсорбции и ионном транспорте ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Локальное разделение зарядов в мембране при адсорбции и ионном транспорте"

Содержание диссертации, доктора физико-математических наук, Соколов, Валерий Сергеевич

Введение Диссертация по биологии, на тему "Локальное разделение зарядов в мембране при адсорбции и ионном транспорте"

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Соколов, Валерий Сергеевич

Библиография Диссертация по биологии, доктора физико-математических наук, Соколов, Валерий Сергеевич, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Локальное разделение зарядов в мембране при адсорбции и ионном транспорте
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика