Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование медленных стадий электрогенного транспорта ионов натрия Na,K,ATФазой

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Аюян, Артем Георгиевич

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Структура и выделение Na,K,AT<Pa3bi

Субстраты, последовательность реакций, цикл Альберса-Поста

Окклюзия натрия и калия. Селективность мест связывания

Электрогенность Na,K,ATOa3bi

Изучение электрогенного транспорта, осуществляемого

К,АТФазой

Регистрация переходных токов в системе БЛМ с адсорбированными фрагментами

Приращения емкости, связанные с работой Ка,К,АТФазы при добавлении АТФ и фотоактивации caged-АТФ

Модель активного транспорта ионов №а,К,АТФазой

Постановка задачи

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Экспериментальная система

Мембранные фрагменты

Электрические измерения

Обработка электрических сигналов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Регистрация переходных токов и приращений адмиттанса, связанных с перемещением заряда 1Ча,К,АТФазой при фотоактивации сАТФ. Влияние солевого состава среды на кинетику процессов.

Влияние хаотропных анионов на кинетику тока короткого замыкания.

Частотная зависимость изменения емкости и проводимости

Экспериментальные измерения изменений емкости и проводимости

Лимитирующая стадия переноса ионов натрия во внеклеточном канале №,К,АТФ-азы

Воздействие солей холина на кинетику тока короткого замыкания при симметричном и асимметричном распределении относительно сторон белка

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование медленных стадий электрогенного транспорта ионов натрия Na,K,ATФазой"

Мембранные системы активного транспорта играют ключевую роль в процессах жизнедеятельности клеток. В основе их работы лежит преобразование энергии одного вида, например химической, в энергию трансмембранного потенциала и концентрационного градиента ионов. В настоящее время выделяют несколько типов систем активного транспорта. Один из них составляют АТФазы Р-типа (P-type ATPases), к которым относится, в частности ЫаДДТФаза.

К,АТФаза представляет собой белок весом около 140 кДа, трансмембранная часть которого упакована в форме десяти спиралей. В одном транспортном цикле переносится три иона натрия наружу и два иона калия внутрь клетки, при этом гидролизируется одна молекула АТФ. То есть в одном транспортном цикле переносится единичный нескомпенсированный элементарный заряд, что позволяет исследовать некоторые аспекты механизма транспорта ионов посредством электрических измерений, с помощью которых можно охарактеризовать стадии связывания и переноса ионов внутри белка. Благодаря интенсивным исследованиям последних лет была построена феноменологическая схема работы этого белка, определены субстраты, стехиометрия процессов, обнаружены электрогенные стадии. Однако до настоящего времени не удалось построить детальную физическую модель транспорта ионов через мембрану, которая бы ответила на вопрос о том, как именно происходит преобразование энергии гидролиза АТФ в энергию электрохимического потенциала ионов.

Отсутствие такой модели объясняется несколькими причинами, во-первых, пока не удалось получить пространственную структуру Na,К,АТФазы с атомным разрешением, что оставляет большое поле для предположений относительно существования тех или иных структур внутри белка. Во-вторых, из-за больших размеров и высокой сложности упаковки белковой молекулы до сих пор не удалось реконструировать №,К,АТФазу в искусственной бислойной мембране, это заставляет использовать в исследованиях экспериментальные системы имеющие серьезные недостатков. До настоящего времени эксперименты проводились либо на изолированных клеточных мембранах методикой пэтч-кламп, либо на искусственной системе, представляющей собой незамкнутые мембранные фрагменты, содержащие очищенную Ыа,К,АТФазу в высокой концентрации, адсорбированные на бислойную липидную мембрану (БЛМ). В системах первого типа возникают трудности, связанные, в первую очередь, с наличием в клеточной мембране других транспортных систем помимо Ш,К,АТФазы. Системы же второго типа, накладывают серьезные ограничения на возможности контроля электрического потенциала, воздействующего на белок, кроме того, внеклеточная сторона мембраны фрагмента обращена к БЛМ и малодоступна. Все это ограничивает возможности сравнения результатов, полученных на обеих системах в работах разных авторов. Для аккуратного сопоставления результатов разных методов в первую очередь необходимо выяснить природу легко выделяемых, например лимитирующих скорость, стадий. Это позволит установить прямое соответствие между разными методиками и обобщить все полученные к настоящему времени результаты экспериментальные результаты.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Структура и выделение Na,К,АТФазы.

Структурно Na,K,ATOa3a состоит из двух субъединиц -а и р.а -субъединица состоит примерно из тысячи аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу порядка 100 к Да./? -субъединица представляет собой гликопротеид, содержащий около 300 аминокислотных и 50 углеводных остатков. Молекулярная масса белковой части составляет 3040 кДа. Углеводная часть проявляет значительные межвидовые отличия. Для нормальной активности АТФазы достаточно комплекса (afi), хотя в большинстве случаев фермент выделяется в форме тетрамера (о/?)г или высших комплексов [1]. а -субъединица содержит участок фосфорилирования, и участки связывания катионов [2]. АТФ-связывающий участок проявляет значительную межвидовую консервативность и гомологичность фрагментам фосфорилирования других ферментов, не только транспортных. Предполагается, что а-субъединица осуществляет каталитические функции, тогда как /?-субъединица ответственна за регуляторные функции [3], либо обеспечивает требуемую конформацию белка и его закрепление в мембране. На основании первичной аминокислотной последовательности предложена пространственная модель, предполагающая укладку а -субъединицы в виде семи [4] или восьми [5] трансмембранных столбов и большого цитоплазматического фрагмента, у?-субъединица содержит одну трансмембранную спираль и преимущественно экспонирована на внеклеточной стороне. Трансмембранные участки белковых цепей богаты неполярными аминокислотными остатками. Дополнительно конформация стабилизирована примерно двадцатью дисульфидными связями, образованными остатками цистеина, и расположенными преимущественно в трансмембранной части молекулы.

Анализ расположения неполярных аминокислотных остатков в молекуле белка, а также данные, полученные методом электронной микроскопии кристаллов комплекса фермента с ванадатом, позволили создать трехмерную модель размещения АТФазы в мембране. Согласно этой модели, около 60% белка находится в цитоплазме, а оставшаяся часть примерно поровну разделена между внеклеточной и трансмембранной частями.

Продолжаются интенсивные рентгеноструктурные исследования Na,К,АТФазы и родственных ей белков. В настоящее время получены картины с пространственной структурой Са-АТФазы в двух основных конформациях с разрешением 2,6 А [6]. Однако, с №,К,АТФазой удалось получить картину только с разрешением 11 А [7]. Более детальную структуру пытаются получить с помощью моделирования и сопоставления структуры гомологичных участков аминокислотных цепей Na,К,АТФазы и Са-АТФазы [8].

Выделение Na,К,АТФазы основано на различных модификациях метода Йоргенсена. Сущность метода состоит в последовательном удалении всех мембранных белков, кроме Na,К,АТФазы и части мембранных липидов. После дифференциального центрифугирования получается суспензия незамкнутых мембранных фрагментов, содержащих высокоактивный фермент в высокой концентрации (вплоть до 10000 димеров на квадратный микрометр). Степень очистки превышает 90% от общей массы белка [9]. Получаемые таким образом препараты Na,К,АТФазы широко применяются в структурных и функциональных исследованиях фермента.

Субстраты, последовательность реакций, цикл Альберса-Поста.

При нормальной работе Na,К,АТФазы гидролиз одной молекулы АТФ сопровождается переносом трех ионов натрия во внеклеточную среду и двух ионов калия в цитоплазму. Поскольку транспорт катионов каждого типа сопровождается повышением разности электрохимического потенциала между средой и цитоплазмой, он должен быть сопряжен с конформационной перестройкой белка, в ходе которой энергия переносимого иона повышается на величину, превышающую разность его свободных энергий в цитоплазме и внешней среде. Для работы фермента необходимо наличие, по меньшей мере, двух конформационных состояний белка, одного - с местами связывания ионов, способными обмениваться ионами данного типа с цитоплазмой, и другого - с местами связывании обменивающимися с внеклеточной средой. Такая модель лежит в основе схемы реакций переноса ионов, известной как схема Альберса - Поста [10], удовлетворительно объясняющей основные свойства фермента (см. рисунок 1). В настоящее время эта схема с различными модификациями является основой для описания стадий реакции переноса ионов №,К,АТФазой. В присутствии ионов натрия с цитоплазматической стороны белок фосфорилируется по реакции Е + ATP = Е-Р + ADP.

Помимо субстратов для работы фермента требуется присутствие ионов магния, действующих как кофактор [3]. Магний образует с АТФ комплекс, который служит субстратом в реакции фосфорилирования. В

E]^3NaATP

ATP

P- E23Na Ф Ф

E^Na ••• <—5

P-E22Ma

E]2K О О

О OO P-E22K

Рисунок 1. Схема Альберса - Поста. На рисунке представлена последовательность стадий, проходимых Ма+,К+,АТФазой в процессе транспорта ионов натрия и калия. высоких концентрациях (десятки мМ) магний обладает ингибирующим действием. В отсутствие калия фосфорилированное состояние является метастабильным, константа спонтанного дефосфорилирования при комнатной температуре составляет порядка нескольких секунд. В присутствии калия с внеклеточной стороны происходит быстрое высвобождение неорганического фосфата, возможно также обратное фосфорилирование белка неорганическим фосфатом по тому же остатку Asp, который фосфорилируется АТФ. Весь транспортный цикл обратим в соответствующих условиях. При одновременном наличии АТФ, ионов натрия и магния в цитоплазме и калия во внешней среде наблюдается стационарный гидролиз АТФ. При оптимальных концентрациях субстратов скорость оборота Na,К,АТФазы составляет около ста пятидесяти - двухсот обратных секунд при физиологической или двадцати - при комнатной температуре. и

Окклюзия натрия и калия. Селективность мест связывания ионов.

Кроме двух конформаций белка, которые могут быть стабилизированы в растворе соответствующего состава, могут существовать еще и промежуточные квазистационарные состояния. Так, в определенных условиях может быть стабилизировано и так называемое состояние окклюзии, в котором ионы связаны внутри белка и не обмениваются ни с цитоплазмой, ни с внеклеточным раствором. Это было показано прямыми измерениями с использованием радиоактивных изотопов калия, натрия, рубидия [11,11,12]. При помещении препаратов белка в раствор, содержащий К или Rb в отсутствие натрия, АТФ и фосфата, фермент связывает два иона на димерау?, что легко регистрируется после быстрой отмывки с помощью катионообменной хроматографии свободных изотопов. Скорость спонтанного высвобождения катиона составляет порядка десятых долей обратной секунды, однако этот процесс существенно ускоряется в присутствии АТФ или неорганического фосфата. Причем при добавлении АТФ ионы высвобождаются преимущественно с цитоплазматической стороны, тогда как при добавлении фосфата - с внеклеточной [13].

Окклюзия натрия значительно сложнее для наблюдения, поскольку после фосфорилирования белка все стадии до высвобождения натрия на внеклеточной стороне происходят сравнительно быстро. Однако при использовании агентов, предотвращающих основной конформационный переход белка, таких как N-этиленмалеимид или химотрипсин, оказалось возможным наблюдать связывание фосфорилированным ферментом трех ионов натрия на один димер aft. Добавление к такой системе АДФ вызывает выход натрия за счет обращения реакции фосфорилирования-окклюзии [3].

Селективность Na,К,АТФазы высока в натриевой части цикла и заметно ниже в калиевой. Ионы натрия могут заменяться только ионами лития и протонами, тогда как калий эффективно замещается многими однозарядными ионами, включая рубидий, таллий, цезий, литий, протоны [14].

Необходимым условием работы системы активного транспорта является изменение сродства участков связывания к переносимым ионам при конформационном переходе. В конформации Е\ натрий должен связываться более эффективно, чем калий, а в состоянии Е2 - менее. Попытки определения сродства участков связывания к ионам имели лишь ограниченный успех [15,16] ввиду невозможности достоверно отличить специфическое связывание от неспецифического. В силу этого участки связывания характеризуют кажущимся сродством к ионам каждого типа, определяемым как обратная величина концентрации катиона, при которой наблюдается половинная активность фермента. При переходе белка из конформации Е] в Е2 кажущееся сродство к ионам натрия изменяется на три порядка, а к ионам калия - примерно в пятьдесят раз.

Предполагается, что белок содержит одну общую полость, которая может вмещать либо два иона калия, либо три иона натрия, в зависимости от конформации. Считается, что места связывания ионов расположены в этой полости, в пользу такой модели говорит тот факт, что окклюзия ионов обоих типов обеспечивается с участием одних и тех же аминокислотных остатков, расположенных в трансмембранной части белка.

Электрогенность Na,К,АТФазы.

В физиологических условиях Ма,К,АТФаза переносит в одном цикле единичный суммарный заряд. Иными словами, транспорт является электрогенным. Это обстоятельство позволяет исследовать активность АТФазы с помощью электрических измерений.

Диэлектрические коэффициенты. Для количественной оценки электрогенности той или иной стадии транспорта был введен специальный параметр - диэлектрическая длина или диэлектрический коэффициент (ДК).

Существует несколько разных подходов к изучению электрогенного транспорта, и с каждым из них связан свой способ определения диэлектрического коэффициента. Общим является способ нормировки ДК - единичному его значению соответствует перенос одного элементарного заряда через всю толщину мембраны. ДК меньше единицы в случае если транспорт осуществляется не через всю толщину мембраны, или если диэлектрическая проницаемость окружения заряда на пути его переноса оказывается меньше таковой мембранных липидов.

Во многих случаях диэлектрический коэффициент может быть определен как отношение эффективной разности потенциалов, оказывающей влияние на перемещение заряда в одной стадии, к полной приложенной мембранной разности потенциалов. В общем же случае ДК процесса есть отношение работы, затрачиваемой для перемещения иона в этом процессе, к работе необходимой, для переноса иона между двумя растворами, разделенными мембраной.

При экспериментальном определении ДК некоторой стадии транспорта необходимо знать, сколько ионов в ней переносится, перемещаются ли другие заряды, например группы белка. Поэтому определение ДК связано с построением упрощенных моделей функционирования Na,К,АТФазы, и усложняется необходимостью проверки правомочности выбора той или иной схемы функционирования белка.

Изучение электрогенного транспорта, осуществляемого Na,K,AT<J>a30ii.

В ранних экспериментах регистрировались стационарные вольт-амперные характеристики (зависимость электрического тока АТФазы от приложенного постоянного потенциала) [17]. На основании сопоставления электрических токов и потоков меченых ионов была определена стехиометрия транспорта, зависящая от ионного состава среды и мембранного потенциала.

Вольт-амперные характеристики интерпретировались в рамках модели, предполагающей наличие двух стадий: одной электрогенной и другой, предшествующей первой - неэлектрогенной. Правомерность такого подхода была продемонстрирована ранее теоретически [18]. Экспериментальные данные описывались такой моделью трех состояний в случае, если скорость неэлектрогенной стадии предполагалась много меньше скорости последующей [19]. Зависимость вольт-амперных характеристик от внеклеточной концентрации ионов натрия указывала на то, что электрогенная стадия связана с выходом натрия на внешней стороне белка.

При измерениях стационарных токов в условиях с низкими концентрациями ионов натрия и калия во внеклеточной среде были обнаружены вольт-амперные характеристики с участками отрицательного наклона [20,21]. На основании этих данных была построена популярная в настоящее время модель ионного колодца или канала доступа, в рамках которой связывание ионов на внеклеточной стороне является потенциалзависимым благодаря наличию в белке узкого канала, где падает значительная часть мембранного потенциала. Электрогенной стадией является перемещение ионов внутри колодца, причем, поскольку эта стадия быстрая, она близка к равновесию [2]. Отрицательный наклон участков вольт-амперной характеристики в модели связывается с регуляторным эффектом концентрации ионов в канале, расположенном на внеклеточной стороне белка, на величину тока через АТФазу. Ионы натрия оказывают ингибирующее действие, а калия - стимулирующее. Кажущаяся константа активации ионами калия (или ингибирования ионами натрия) зависит от мембранного потенциала, что объясняется равновесным распределением ионов в канале. Модель позволила определить долю мембранного потенциала, влияющую на это распределение (диэлектрический коэффициент), которая оказалась различной для ионов натрия и калия, и изменялась при генетических мутациях белка, приводящих к укорачиванию его N-концевого участка [2,22].

Переходные нестационарные токи Na,К,АТФазы были впервые обнаружены в 1986 году Накао и Гэдсби при восстановлении стационарного состояния в ответ на скачкообразное изменение мембранного потенциала [23]. Эксперименты проводились на изолированных кардиомиоцитах морской свинки в условиях фиксации потенциала. Составы растворов были подобраны с целью минимизировать токи утечек, связанные с активностью других мембранных транспортных систем клетки. Ток Na,К,АТФазы определялся вычитанием фонового тока, регистрируемого в присутствии строфантидина. В контрольных опытах было показано, что эффекты строфантидина, не связанные с ингибированием АТФазы, пренебрежимо малы. В безкалиевой среде были обнаружены строфантидин-чувствительные токи, экспоненциально спадающие до нуля. Токи наблюдались только в присутствии АТФ и ионов натрия, при замене натрия на калий токи исчезали. На основании этого был сделан вывод о том, что токи возникают в условиях натрийнатриевого обмена. Зависимость перенесенного заряда от приложенного скачка потенциала аппроксимировалась функцией, описывающей равновесное распределение Больцмана для заряда с эффективной валентностью а, близкой к 1.

АО =-^-, (1) 1 + ехр(¥0 - afi<p) v ' где р= г! кТ, е - элементарный заряд, к - постоянная Больцмана, Т абсолютная температура, VF0 - параметр, характеризующий асимметрию распределения заряда в белке. Константа скорости релаксации тока зависела от потенциала. Если предположить, что обнаруженный нестационарный ток соответствует одной электрогенной стадии, то эффективная валентность равна ее диэлектрическому коэффициенту.

Тогда значение ДК, близкое к 1, означает перемещение заряда через всю толщину мембраны, что не согласуется со схемой Альберса-Поста, согласно которой перемещение иона состоит минимум из трех стадий.

Разумным представляется участие в процессе нескольких ионов.

Полученные данные можно удовлетворительно описать в рамках модели канала доступа [24,25]. Доступ ионов к местам связывания осуществляется через канал, изменение разности потенциалов в котором изменяет эффективную концентрацию ионов у мест связывания и вызывает релаксацию системы к новому состоянию равновесия, что и приводит к возникновению переходного тока. Тот факт, что константа скорости процесса невелика и сильно зависит от температуры (200 с"1 при 37 °С и 40 с"1 при 20 °С), говорит о том, что кинетика переходного тока определяется не перемещением ионов в канале, а какой-то медленной стадией, вероятно связыванием ионов, сопровождающейся конформационным переходом. Ток, связанный с перемещением ионов в канале, предположительно, должен иметь более высокую константу скорости.

В результате значительного улучшения техники эксперимента появилась возможность регистрации быстрых токов, связанных, как предполагается, с перераспределением ионов в канале доступа. Впервые обнаружить быстрый компонент переходного тока с Ка,К,АТФазой удалось Хильгеману с помощью разработанной им техники регистрации электрических сигналов на изолированном фрагменте клеточной мембраны сердечной клетки [26]. Экспериментальные данные показали, что диэлектрический коэффициент быстрого компонента переходного тока составляет около 0,25, что меньше ДК медленной стадии 0,9, полученного в тех же экспериментах. На основании различия величин ДК был сделан вывод о том, что они соответствуют двум различным процессам: медленный - перемещению первого иона натрия, а быстрый -двух оставшихся.

В последующих экспериментах на гигантским аксоне кальмара [27] и на открытых ооцитах [28] были обнаружены три фазы переходных токов: быстрая (<3 мкс), промежуточная (10-50 мкс) и медленная (5 мс). Быстрые переходные токи наблюдались только при высоких рН 8,6-9,6 среды. Эти факты говорят в поддержку модели [26] Д. Хильгемана, объясняющей быстрые токи переносом второго и третьего ионов натрия, так как известно, что центры их связывания лежат вблизи заряженных аминокислотных остатков. На основании рН-зависимости быстрых переходных токов можно сделать вывод о том, рК этих аминокислот лежат в области 7,6-8,6.

В моделях работы белка, объясняющих стационарные вольт-амперные характеристики, предполагалось, что ионы калия также перемещаются в канале доступа, расположенном с внеклеточной стороны белка. Тогда транспорт ионов калия также должен быть электрогенным, а скачок напряжения в условиях калий-калиевого обмена также должен вызывать переходный ток. Переходный ток, связанный с перемещением заряда в калиевой части цикла, удалось обнаружить только при понижении температуры до 14 °С и замене ионов калия на таллий, которые, как было показано, переносятся аналогично ионам калия, но имеют большее сродство к местам связывания внутри белка [29,30]. Кинетика калиевого тока оказалась быстрее натриевого.

Регистрация переходных токов в системе БЛМ с адсорбированными фрагментами.

До настоящего времени не удалось реконструировать Na,K,ATOa3y в бислойной липидной мембране без потери активности фермента. По этой причине оказалась очень удачной система, представляющая собой бислойную липидную мембрану (БЛМ), на которую адсорбированы незамкнутые мембранные фрагменты, содержащие очищенную АТФазу [31]. На такой системе нельзя регистрировать постоянные токи, возникающие при работе фермента, поскольку мембрана фрагмента включена последовательно с БЛМ, обладающей очень низкой проводимостью. Однако в ней можно измерять переменные токи, связанные с перезарядкой емкостей фрагмента и БЛМ. БЛМ в этом случае выполняет роль емкостного электрода, сопрягающего перенос заряда в белке с его переносом между отсеками ячейки. Переходный ток индуцируют путем синхронной активации молекул №,К,АТФ-азы в адсорбированных фрагментах. Это достигается быстрым скачком концентрации АТФ при вспышке УФ света.

Переходные токи на модельной системе в бескалиевой среде в ответ на высвобождение АТФ были впервые зарегистрированы в работе [31], затем более подробно изучены в [32]. Направление тока соответствовало перемещению положительного заряда через мембрану адсорбированного фрагмента из внешнего раствора в область его контакта с БЛМ. В серии контрольных экспериментов было показано, что переходный ток связан с работой Na,К,АТФазы. В безнатриевой среде переходные токи не регистрировались. При добавлении калия в среду, содержащую натрий, переходные токи сохранялись, хотя их кинетика несколько изменялась. На основании этого было сделано предположение о том, что электрогенной стадией, вызывающей появлении тока, является одна из стадий переноса натрия, следующая за фосфорилированием. Ток сначала возрастает до максимума, затем спадает до отрицательных значений, после чего медленно возвращается к нулю. Положительная фаза тока соответствует заряжению мембранного фрагмента, а отрицательная - его разрядке после остановки работы АТФазы. Зависимость тока от времени аппроксимируется суммой трех экспонент. Первые две экспоненты соответствуют положительным фазам роста и спада тока, третья, самая медленная - отрицательной фазе тока. Две первые экспоненты связывают с активностью АТФазы [33-35]. В пользу этого предположения говорит тот факт, что постоянные времени обоих компонент зависят от концентрации АТФ и ионов натрия. Отрицательную фазу тока связывают с утечками через мембраны и АТФазу, детальный механизм этого процесса в настоящее время не известен.

Качественная интерпретация переходных токов, вызванных фотоактивируемым скачком концентрации АТФ, была аналогична интерпретации переходных токов, возникающих при скачке потенциала. Сами токи объяснялись быстрым электрогенным выходом ионов натрия из белка с внеклеточной стороны [33,35], а их кинетика - медленной неэлектрогенной стадией, предшествующей быстрой электрогенной стадии. Наибольшую дискуссию вызывает вопрос о том, какая стадия работы белка является самой медленной и, следовательно, определяющей кинетику переходных токов. Для решения этой задачи предпринимались исследования, в которых кинетика переходного тока сопоставлялась с другими параметрами, полученными в сходных условиях независимыми методами. Так было показано, что кинетика перемещения заряда белком коррелировала с изменением флуоресценции белка, меченного 5-IAF зондом, который, предположительно, чувствителен к конформационному переходу Ei<->E2 белка [36]. Измерения флуоресценции с этим зондом, а также с RH-421, который чувствителен к связыванию белком ионов, сопоставлялись с результатами измерений переходных токов, и результаты удалось описать одной кинетической моделью [37]. На основании экспериментальных данных было сделано предположение, что самой медленной стадией, определяющей кинетику переходного тока, является конформационный переход Ei<->E2 белка.

В то же время в работах других авторов было проведено сопоставление кинетики переходного тока и фосфорилирования, характерное время, которого оказалось близким к характерному времени возрастания тока [33]. Было показано, что кинетика фосфорилирования белка замедлялась в присутствии caged-АТФ, что можно объяснить ингибирующим действием этого соединения. На основании измерений был сделан вывод, что самой медленной неэлектрогенной стадией является фосфорилирование белка, конформационный переход происходит быстро, а спад тока обусловлен обменом АТФ, связанного с белком, на caged-АТФ, и ингибированием активного транспорта.

Наиболее детальная интерпретация результатов измерения переходных токов была предпринята в работах Лойгера и Апелля, которые на основе цикла Альберса-Поста [35,38] построили формальную кинетическую модель транспорта ионов АТФазой. Модель описывала кинетику релаксации АТФазы после быстрого введения АТФ в результате фотолиза caged-АТФ по результатам электрических измерений в системе БЛМ/адсорбированные фрагменты, а также флуоресценции в суспензии фрагментов, меченных зондами RH-421 и 5-IAF. Это позволило оценить ряд кинетических параметров транспорта ионов натрия и диэлектрические коэффициенты отдельных стадий.

Были проведены исследования влияния приложенного к мембране напряжения на скорости отдельных электрогенных стадий транспорта [38]. Для этого мембрана заряжалась за малое время (1-2мкс) с помощью генератора импульсов. В одной серии опытов сначала происходило высвобождение АТФ, а по достижении стационарного состояния прикладывался импульс напряжения. В другой серии опытов мембрана предварительно заряжалась, после чего регистрировался ток в ответ на быстрое увеличение концентрации АТФ. Исследовалась зависимость велечины перенесенного заряда и кинетики его переноса от величины приложенного напряжения. Для удовлетворительного описания полученных результатов потребовалось ввести дополнительные стадии в схему транспорта натрия, модель содержала 11 стадий, из которых 4 -конформационный переход Ei<->E2 и последовательное высвобождение трех ионов натрия с внеклеточной стороны белка - являлись электрогенными. Диэлектрический коэффициент самой электрогенной стадии, это предположительно выход первого иона натрия, составлял 0,65, что находится в согласии с данными из других источников. ДК конформационного перехода составлял около 0,1, для выхода второго и третьего ионов натрия также около 0,1. Было показано, что предположение о значительной электрогенности конформационного перехода не позволяет объяснить ни собственные экспериментальные данные, ни результаты измерений на клеточных системах. Поэтому было введено дополнительное состояние белка, эквивалентное образованию канала доступа, соединяющего центр связывания первого иона натрия с внеклеточным раствором.

Приращения емкости, связанные с работой Na,К,АТФазы при добавлении АТФ и фотоактивации caged-АТФ.

Методу регистрации переходных токов при скачкообразном изменении потенциала в присутствии АТФ вполне эквивалентен метод, в котором измеряется полный адмиттанс мембраны. Эквивалентность двух методов: релаксации тока и адмиттанса была продемонстрирована при изучении пассивного транспорта на БЛМ в присутствии гидрофобных ионов и ионофоров. Позже было проведено сопоставление двух методов применительно к №,К,АТФазе [39]. Было показано, что электрогенный процесс, который приводит к экспоненциальному спаду тока в ответ на скачок напряжения [23]:

I = I0exp (-too), (2) приводит к приращению емкости А С и проводимости A G мембраны, зависящими от частоты

2 2

AC == Q 2~ 2 ' ЬО = С0а>0-£—;, (3) со + а>0 о) + щ причем характерная частота функции Лоренца соответствует характерному времени экспоненциального спада тока.

Другие параметры при измерениях методом релаксации тока определяли по зависимости перенесенного заряда AQ (вычисляемого как интеграл переходного тока) от приложенного напряжения <р [23]. Эту зависимость аппроксимировали функцией (1), описывающей равновесное распределение заряда в двух состояниях. Это позволяло определить потенциал точки симметрии , максимальный заряд Qmax, который может быть перенесен через мембрану, и диэлектрический коэффициент а, который определяет часть приложенного напряжения, эффективно влияющую на транспорт ионов в данном процессе. Те же параметры можно определить и методом адмиттанса, измеряя зависимость приращения емкости Со на низкой частоте от постоянной составляющей напряжения ср [39]. Эта зависимость является производной зависимости AQ ( ср ) по <р, то есть полностью ей эквивалентна.

Если при измерении релаксации тока % определяли по точке максимального наклона зависимости ДQ от <р, описываемой уравнением (1), то при измерении приращения емкости (4) этот параметр можно определить как величину постоянной составляющей напряжения, при которой приращение емкости максимально.

В случае если нестационарный электрический ток вызван не одной, а несколькими электрогенными стадиями транспорта, релаксация тока при скачке потенциала будет описываться суммой нескольких экспонент, а изменение емкости - суммой нескольких лоренцианов.

Таким образом, оба метода - релаксации тока и адмиттанса -эквивалентны друг другу. Если первый метод применялся на клетках, то второй оказался очень удобен для измерений на системе БЛМ/адсорбированные фрагменты.

Условия, при которых наблюдаются приращения емкости в [40], совпадают с условиями регистрации переходных токов в [23] (присутствие ионов натрия и АТФ и отсутствие калия). Это говорит о том, что в обоих случаях регистрируемые сигналы связаны со сходными электрогенными процессами, происходящими в АТФазе. На основании

Со=£(Д2) = а а(3

4) max аппроксимации экспериментальной зависимости приращения емкости от частоты сигнала функцией Лоренца (3), в работе [39] была определена характерная частота F0 лоренциана, которая при комнатной температуре (22 °С) составляла 200 Гц. Полученное значение скорости процесса (2 п F о=1200 с"1) оказалось сходным по порядку, хотя несколько выше, чем вычисленное на основании величины постоянной времени экспоненциального спада тока в работе [23], измеряемой в условиях фиксации потенциала (200-1000С"1). Это говорит о том, что оба метода регистрируют один и тот же процесс, а некоторое расхождение получаемых значений связано, вероятно, с неточностями аппроксимации, возникающими из-за многостадийности процесса, вызывающего электрический ток.

Изменения емкости при работе Na,К,АТФазы были обнаружены также на изолированной мембране сердечной клетки. Причем в одной серии экспериментов проводились измерения, как методом фиксации потенциала, так и методом адмиттанса. В обоих случаях были получены очень близкие значения параметров транспорта. Частотная зависимость изменения емкости оказалась близкой к частотной зависимости, получаемой на системе БЛМ/адсорбированные фрагменты. Аппроксимация ее лоренцианом дала значение F0 = 140 с"1. При увеличении частоты емкость, как и в измерениях на БЛМ, уменьшалась не до нулевого значения. Это можно объяснить наличием компоненты электрического тока с высокой характерной частотой. Соответствующий ей лоренциан не удалось зарегистрировать из-за недостаточного частотного диапазона. Вклад быстрой компоненты в полный ток составлял около 10%. На основании результатов измерения зависимости приращения емкости от частоты был определен диэлектрический коэффициент быстрого процесса, оказавшийся равным около 0,25. Это значение находится в согласии с предыдущими результатами.

Удобство системы БЛМ с адсорбированными фрагментами состоит в возможности проведения измерений на очищенном белке и в широком диапазоне условий среды, часто не доступных в опытах на клеточных системах. Так большой интерес вызывает поведение АТФазы при высоких концентрациях солей. В высоких концентрациях хлорида натрия был обнаружено снижение характерной скорости переноса заряда белком, которое не может быть объяснено лишь действием ионной силы. Возможно, что солевой эффект связан с воздействием анионов на конформационное состояние белка, которое называют эффектом Хофмейстера, поскольку было показано, что влияние высоких концентраций натриевой соли на соотношение состояний Ei/E2 в натрий-калиевой АТФазе специфично к анионному составу в соответствии с рядом Хофмейстера [41].

Модель активного транспорта ионов ГЧа,К,АТФазой.

На основании экспериментальных данных в настоящее время создана феноменологическая модель транспорта, объясняющая большинство известных фактов. Модель схематично представлена на рисунке 1. В исходном нефософорилированном состоянии белок находится в конформации Eb При этом открыт канал с цитоплазматической стороны мембраны, через который ионы натрия из раствора попадают внутрь белка и связываются в активном центре. Далее происходит гидролиз АТФ, запрещенный, если белком связано меньше трех ионов натрия. За гидролизом происходит окклюзия натрия, то есть ионы запираются внутри белка, затем происходит переход в состояние Е2, в котором открывается канал внеклеточной стороны. Через этот канал три иона натрия выходят в раствор, и вместо них связываются два иона калия. После этого происходит дефосфорилирование белка и переход в конформацию Ei через состояния окклюзии ионов калия и открытия канала с цитоплазматической стороны, в который эти ионы выходят, и цикл завершается.

Принято считать, что после состояния окклюзии натрия происходит сначала открытие узкого канала, через который проходит первый ион натрия (узкий канал объясняет высокий ДК стадии). После этого канал увеличивается для выхода двух оставшихся ионов. Возможно также, что два последних иона обмениваются на калий неэлектрогенно, так как связываются вблизи заряженных аминокислот.

Интересно отметить, что для того, чтобы диэлектрический коэффициент процесса выхода первого иона натрия был велик, не требуется открытие узкого канала. Тот же электрический сигнал будет возникать при открытии широкого канала, соединяющего раствор и полость с тремя ионами натрия, заряды двух из которых экранированы белком [40].

Постановка задачи.

В последние десять лет проводились интенсивные исследования эектрогенного транспорта ионов натрия, осуществляемого №,К,АТФ-азой в безкалиевой среде. В этих условиях циклическая работа транспортной системы в стационарном режиме невозможна. Однако, при этом уменьшается количество возможных состояний белка, что позволяет изучать отдельные электрогенные стадии переноса ионов натрия с помощью нестационарных электрических измерений. Различные внешние воздействия приводят к появлению переходных токов, которые вызваны перемещением ионов Na+, а возможно, и зарядов самого белка в процессе конформационных перестроек. В настоящее время используются два способа воздействия на Na,K,ATP-a3y, вызывающих появление переходных токов. В одних экспериментах изучается кинетика тока короткого замыкания, вызванного быстрым высвобождением АТФ из неактивного предшественника в ответ на вспышку УФ-света. В других изучаются переходные токи, вызванные приложением к мембране переменного напряжения.

Несмотря на то, что физические механизмы возникновения переходных токов при обоих способах воздействия предполагаются сходными, сравнение результатов исследований двух типов вызывает проблемы. Первоначально переходные токи наблюдали на разных экспериментальных системах, и их параметры сильно различались для двух экспериментальных систем (клеточной и модельной), что можно объяснить различием окружения белка и условий его работы. Техника измерений малых приращений адмиттанса позволила проводить измерения обоих типов переходных токов на одной мембране. Было показано, что такая методика полностью эквивалентна применяемой на клетках, когда переходные токи регистрировались в ответ на скачек напряжения на мембране. Однако, анализ результатов проводился на основе упрощенной модели, предполагавшей, что процесс состоит только из одной стадии. Возможно, поэтому результаты измерений этим методом сильно различались от результатов, полученных на клетках.

Для сравнения параметров переходных токов обоих типов необходимо, чтобы эти токи описывались единой теоретической моделью. Однако, в настоящее время для их интерпретации используются разные подходы, каждый со своим набором параметров: переходные токи, вызванные фотолизом caged-АТФ, описываются с помощью кинетической модели, основанной на цикле Алберса - Поста [37,38,42,43], а переходные токи, вызванные переменным напряжением - феноменологической моделью перемещения ионов в канале [24].

Анализ кинетических параметров переноса заряда в первую очередь требует выяснения природы стадий, наблюдаемых разными методами, только после этого возможно построение детальной модели транспорта. В первую очередь необходимо определить самую медленную стадию всего процесса. На этот вопрос в настоящее время существует две точки зрения: первая предполагает самой медленной стадией фосфорилирование белка, вторая - конформационный переход, при котором в белке формируется канал, через который ионы натрия покидают места связывания и выходят во внеклеточный раствор. Для того чтобы определить, какая фаза нестационарного тока зависит от скорости конформационного перехода, и сравнить параметры переходных токов обоих типов, можно изменять скорость этой стадии с помощью определенного воздействия на белок. Если эта стадия является самой медленной в обоих типах нестационарного транспорта, изменение ее скорости должно сказаться на параметрах соответствующих нестационарных токов. Решить эту задачу можно с помощью известного в настоящее время неспецифического способа воздействия на конформацию белков - так называемого "солевого эффекта". Суть его состоит в замедлении конформационных переходов белков, в частности Ыа,К,АТФ-азы, в высоких концентрациях солей. Наиболее вероятное объяснение солевого эффекта состоит во влиянии некоторых ионов на энергию поверхности раздела макромолекула -раствор. В присутствии одних ионов эта энергия увеличивается, в присутствии других - уменьшается. Первые получили название космотропов, вторые - хаотропов [44].

В настоящей работе будет проведено усовершенствование техники измерений нестационарных токов в модельной системе, что позволит разрешить несколько стадий транспорта и определить их скорости. Будет исследован солевой эффект: влияние на кинетику транспорта солей холина с различными анионами, различающимися по хаотропным свойствам: хлорида, бромида и йодида. Это позволит выяснить, является ли медленной стадией транспорта конформационный переход Ei<->E2 белка. Детальное изучение солевого эффекта при разных температурах позволит выяснить влияние хаотропных анионов на энергию состояний Ei и Е2, а также на высоту активационного барьера между ними. Отдельный интерес представляет изучение возможности различного воздействия хаотропных анионов на разные (цитоплазматическую и внеклеточную) стороны Na,К,АТФазы. Эти исследования помогут уточнить физическую модель ионного транспорта, осуществляемого №,К,АТФ-азой.

На основании сказанного выше были сформулированы следующие задачи работы:

1. Разработка методики регистрации стадий переноса заряда №,К,АТФазой в условиях переменного трансмембранного потенциала. Методика должна позволять определение кинетических параметров отдельных стадий процесса при условии его многостадийности.

2. Выяснение природы скоростьлимитирующей стадии транспорта.

3. Анализ существующей физической модели транспорта ионов на основе полученных результатов.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Экспериментальная система.

Исследования электрических сигналов, ассоциированных с переносом №,К,АТФазой ионов натрия, проводились на основании методики, предложенной в [32] и развитой в [39,40]. Бислойная липидная мембрана (БЛМ) формировалась по методу Мюллера-Рудина из раствора 15 мг/мл дифитаноилфосфатидилхолина в декане на отверстии диаметром около 1,5 мм в перегородке, разделяющей два отсека тефлоновой ячейки. Ячейка имела два оптически прозрачных окна, предназначенные для визуального наблюдения за формированием БЛМ и освещения БЛМ вспышками УФ-света. В ходе измерений температура в ячейке поддерживалась на требуемом уровне с помощью элемента Пелтье, управляемого электронным термостатом. Погрешность поддержания заданной температуры не превышала 0,5 К.

После формирования БЛМ в отсек ячейки дальний по отношению к источнику УФ-света добавлялась суспензия мембранных фрагментов, содержащих №,К,АТФазу в высокой концентрации. Концентрация белка в ячейке составляла около 20 мкг/мл. В тот же отсек добавлялись дитиотрейтол и caged АТФ в концентрациях 1 мМ и 100 мкМ соответственно. С течением времени белоксодержащие мембранные фрагменты спонтанно адсорбируются на БЛМ. Этот процесс требует около 60 минут и может контролироваться по постепенному снижению емкости БЛМ. После указанного периода времени освещение БЛМ с адсорбированными фрагментами приводит к возникновению переходного тока, связанного с переносом белком положительного заряда из раствора в направлении БЛМ. Стандартный буфер содержал 150 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2, 30 мМ имидазола, 1 мМ ЭДТА, рН доводился до величины 6,5 добавлением НС1. В этот буфер добавлялись соли холина с требуемыми анионами. А hv ADP ATP Caged-ATP ATP

БЛМ натрий-калиевая АТРаза потенциал, возникающим при работе АТРазы мембранный фрагмент V

----------------at t® ! HZEH h-vwwv Ср

ЛАМ/W С

Rf

АЛЛАМ/—

CF

-41— m ^ О-^-ЛМЛМ—0

I(t) в

V(t) hv!

-II

Kt)

Рисунок 2. (А) Модельная система садсорбированными на БЯМ мембранными фрагментами. (Б) Эквивалентная схема системы. (В) Схема установки для измерения тока короткого замыкания в ответ на вспышку УФ-света. (Г) Схема установки для измерения малых приращений компонент адмиттанса, возникающих при работе Na+,K+, АТФазы.

Мембранные фрагменты.

Плоские незамкнутые мембранные фрагменты, содержащие №,К,АТФазу получали из ткани почек кролика согласно процедуре, предложенной Иоргенсеном. Фрагменты имеют диаметр 0,2 -1 мкм и содержат около 0,8 мг фосфолипидов и 0,2 мг холестерола на 1 мг белка [45]. Специфическая АТФазная активность фрагмента составляла Около 1800 мкмоль неорганического фосфата в час на 1 мг белка при 37 С. Суспензия мембранных фрагментов хранилась в течении нескольких месяцев при -18 С, при этом не происходило существенного снижения активности. При проведении экспериментов суспензия размораживалась и хранилась при 4 °С не более двух недель.

Na3-Ev 4 3

Na3-ErATP --- (Na3)ErP --^ Р-Е2 Na3 t

Na2-E1 А

Na-Ei

1 ^

P-E2Na2

4 > " P-E2Na

Р-Е"

Рисунок 3. Состояния цикла Альберса - Поста, проходимые Ма+,К+,АТФазой в безкалиевой среде. Переход 1 соответствует току короткого замыкания, возникающего в ответ на вспышку УФ-света. Переход 2 соответствует адмиттансным измерениям, 3 - конформационный переход.

Электрические измерения.

Принципиальная схема установки приведена на рисунке 2. Для регистрации электрических сигналов использовались хлорсеребряные электроды, соединенные с отсеками ячейки с помощью агарозных мостиков. Запись сигналов с последующей передачей их в компьютер осуществлялась с помощью либо цифрового осциллографа KDS-102 (Япония), либо платы сбора данных Lcard-780. При измерениях токов короткого замыкания один из электродов заземлялся, а другой соединялся со входом усилителя Keithel-427 (США). При измерениях малых приращений емкости и проводимости мембраны, ассоциированных с работой Ыа,К,АТФ-азы, на один из электродов ячейки поступал гармонический сигнал с выхода генератора Г3-34 или с выхода ЦАП платы сбора данных Lcard-780. Другой электрод ячейки соединялся с входом усилителя Keithel-427. Для повышения чувствительности измерения приращений емкости и проводимости системы сигнал с электрода ячейки на входе усилителя складывался с выходным сигналом инвертирующей схемы, позволяющей скомпенсировать ток, связанный с собственными емкостью и проводимостью БЛМ [40]. На второй канал осциллографа или платы сбора данных поступал сигнал напряжения.

Сигналы записывались после вспышки УФ-света. В эксперименте с одной мембраной возможно произвести несколько (около 20) записей токов, однако после каждой вспышки необходимо выждать 10 минут. Это гарантирует, что все молекулы белка претерпели спонтанное дефосфорилирование и вернулись в исходное состояние. В некоторых экспериментах в ячейке присутствовала апираза, в этом случае время между вспышками можно сократить до 3 минут. Накопление данных начиналось только после стабилизации амплитуды сигнала тока короткого замыкания, что означает окончание процесса адсорбции мембранных фрагментов на БЛМ.

Обработка электрических сигналов.

Ток короткого замыкания, возникающий в ответ на вспышку УФ-света (см. рис. 3) аппроксимировался суммой трех экспоненциальных

34 функций. Постоянные времени экспонент использовались в дальнейших анализах в качестве кинетических параметров переноса заряда.

Величины приращений емкости и проводимости, связанные с работой Ыа,К,АТФ-азы (рис. 3), вычислялись как разности средних значений емкости и проводимости до вспышки УФ-света и через 0,5 с после нее - за это время устанавливаются их новые стационарные значения. Полученный сигнал аппроксимировали линейной комбинацией косинуса и синуса с частотой приложенного напряжения. Амплитуды соответствующих функций, представляющие собой синфазную (с нулевым сдвигом фазы по отношению к переменному напряжению) и квадратурную (со сдвигом фазы в 90°) составляющие переменного тока Imeas, использовались для определения приращения емкости Cmeas и проводимости Gmeas БЛМ с адсорбированными фрагментами в соответствии с формулой

Imeas = GmeasVcOS(cOt) - CmeasG)Vsin(C0t). (5)

На рисунке 4 показаны типичные записи зависимости от времени тока после вычитания исходной переменной составляющей, его интеграла, используемого для нормировки результатов измерений адмиттанса, а также изменений емкости и проводимости.

100 50 0

6 4 и 2 с\ а о е к rs и <

8 6 4 2 0 -2

400 и

С 200

Гч

О < А Б В Г

О 1 2 t,c

Рисунок 4. Типичные экспериментальные записи (А) тока короткого замыкания, (Б) интеграла тока короткого замыкания, приращения (В) емкости и (Г) проводимости.

Вычисленные значения корректировались с учетом систематической ошибки, вносимой фильтрами усилителя, в соответствии с формулами: С — Cmeas iGmeas, (^a)

G = Gmeas " T®2 Cmeas, (66) где т представляет постоянную времени фильтра усилителя, а С и G -откорректированные значения емкости и проводимости.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Регистрация переходных токов и приращений адмиттанса, связанных с перемещением заряда Na,K,AT<Pa3ofi при фотоактивации сАТФ. Влияние солевого состава среды на кинетику процессов.

Влияние хаотропных анионов на кинетику тока короткого замыкания.

До настоящего времени используется два способа индуцирования переходного тока, связанного с переносом заряда мембранными транспортными системами, к которым относится и Ш,К,АТФаза (рис. 3). Первый метод заключается в приложении к мембране скачка потенциала, второй метод основан на быстром высвобождении какого-либо из субстратов интересуемой системы из неактивной формы, то есть на создании скачка его концентрации. В отношении Na,К,АТФазы до настоящего времени использовался caged-АТФ, выделяющий свободный АТФ под действием УФ-света. Бислойные липидные мембраны (БЛМ) с адсорбированными мембранными фрагментами, содержащими №,К,АТФазу в высокой концентрации являются удобной экспериментальной системой для исследования электрогенного

37 транспорта ионов Ыа,К,АТФазой [31,32]. В такой системе белоксодержащие мембраны находятся в состоянии емкостного сопряжения с БЛМ, что делает возможным регистрацию переходных токов, вызванных скачком концентрации АТФ и приложенным к мембране переменным напряжением [39,40,43].

Возникающие в такой системе в ответ на быстрое высвобождение АТФ из сАТФ после вспышки УФ-света токи короткого замыкания удовлетворительно аппроксимируются суммой трех экспоненциальных функций. Положительная фаза тока включает в себя рост с постоянной времени и спад с постоянной времени т2. Следующая за этим отрицательная фаза тока соответствует разрядке мембраны фрагмента после выработки всего АТФ или после фосфорилирования всех молекул белка. На рисунке 4а показана типичная запись тока короткого замыкания, возникающего в ответ на вспышку УФ-света. Было обнаружено, что при наличии во время адсорбции мембранных фрагментов растворе галогенидов холина происходит замедлении кинетики и уменьшение амплитуды тока короткого замыкания. Зависимость постоянных времени Tj и т2 приведена на рисунке 5. Очевидно, что эффект аниона возрастает в соответствии с рядом СГ<Вг"<Г.

I-1-1-1-1

-1-1-r~

0,04 -0,03 о 0,02

0,01 0

Br" i A A

СГ

--Г О

0,10

0,05

0,00

100 1000 концентрация соли холина, мМ

Рисунок 5. Зависимости харктерного времени роста (А) и спада (Б) тока короткого замыкания в растворах, содержащих соли холина. частота, Гц

Рисунок 6. Частотная зависимость возникающих при работе Na+,K+ - АТРазы приращений емкости (А), проводимости (Б) и характеристического параметра (В) (разъяснения в тексте). Данные нормализованы на перенесенный заряд и усреднены по 3-5 измерениям. Кружками представлены зависимости в нормальных условиях, треугольниками - данные для 850 мМ хлорида холина, звездочками - данные для 1350 мМ. Пунктирная линия показывает результаты аппроксимации данных суммой лоренциана и постоянной емкости. Остальные линии показывают результаты аппроксимации суммой двух лоренцианов.

Частотная зависимость изменения емкости и проводимости

Теоретическая модель.

Для того чтобы рассчитать частотную зависимость компонент импеданса, рассмотрим следующую модель (см. рис. 1):

В=±С

А соответствует состоянию белка с ионом натрия в центре связывания, канал с внеклеточной стороны белка закрыт; переход в состояние В сопровождается открытием канала с внеклеточной стороны, ион натрия по-прежнему связан внутри; состояние С - ион натрия вышел в канал. Переход А <-> В соответствует конформационному переходу Е[ •<-» Ег белка, скорость этого процесса много меньше последующего перехода В <г> С. Кроме того, согласно литературным данным [38,46] переход А -о-В по сравнению с В о- С является практически не электрогененным. В работе [39] был рассмотрен случай, когда В <-> С является настолько быстрым в сравнении с частотой приложенного напряжения, что состояния В и С всегда находятся в равновесии. В таком приближении были получены следующие выражения, определяющие частотную зависимость приращения компонент адмиттанса:

ДС = С0^Ц-и (7а) а) + со 0 г О

ЬС = С0а>0—,-г. (76) со +со0

В работах [47,48] частотные зависимости емкости аппроксимировались суммой лоренциана и постоянного члена, позволяющего учесть неспецифические эффекты, например электрострикцию мембран, и сверхбыстрые перемещения зарядов внутри белка.

АС = С0 —г^—- + С, и (8а) со + щ со2

AG=C0co0—-(86) со + сой

В результате аппроксимации были получены значения <т>0 (около 1400 с"1) , которые плохо согласовались с результатами измерений на клетках. Согласно данным работы [27] электрогенный транспорт ионов натрия натрий-калиевой АТФазой включает в себя минимум три стадии, скорость медленной и промежуточной составляет порядка 100 и 5000 с"1 [27,38]. Это позволяет предположить, что неудовлетворительность аппроксимации экспериментальных данных уравнениями 8а,б вызвана многостадийностью процесса переноса заряда белком. Частотные зависимости емкости и проводимости в этом случае помимо медленной должны содержать также и компоненту с характерной частотой порядка 1000 с"1. Существующая модель [39] может быть расширена на этот случай. При измерениях на частотах много больше характерной частоты переходов А В амплитудой последних можно пренебречь, кроме того равновесие между В и С не будет достигаться. Обозначим долю состояния В через X, тогда доля С составит 1-Х. Переход В С - электрогенный. Электрический ток, возникающий при этом переходе, пропорционален X

X = -cX + d( 1-Х). (9)

Константы скорости end зависят от мембранного потенциала: aF<p с = к,е'ш-, (10а) aFtp d = к2е^т, (106) где а- диэлектрический коэффициент стадии, -мембранный потенциал, к2 и кх -константы скорости при нулевом потенциале. На основании (9) и (10 а,б) можно рассчитать адмиттанс системы, полагаем (p-U + Vsincot, причем амплитуда переменного сигнала мала, то есть a,F—« 1, что позволяет представить (9) в виде 2RT aFV ~ aFV

X = -к, (1 - =— sin<at)X + kJ\+ sinotf)(1 - X). (11) iv 2RT 2К 2RT ,

Стационарное решение этого уравнения имеет вид кi к^ ~ь к2 Х. (12)

Ищем решение в виде к. Г=Х. (13)

Уравнение принимает вид Y + ~ ~ ~ aFV (,к, + к2)-(к1-к2)—~ sin cot ZKl

Y= 2^4:--sin cot. (14) кх + к2 2RT

Сделаем следующие замены aFV пс ч

F=-, (15а)

2 RT

Y=Y3k^V, (156)

Jty "f" kj CO CO = ——— "I- k^

15b) т = (к1+к2), (15r)

J3=II^V. (15д)

С I К 2

В результате получим f+ [l-y^sin^r]f = sin^r. (16)

Член Yfismcor следующего порядка малости по сравнению с 7, следовательно с точностью до первого порядка получим уравнение

Y = sin£r, (17) решение которого имеет вид sinft5r mcosmr ^g^

1 + <у2 1 + <552

Отсюда, пренебрегая всеми гармониками, кроме первой, после обратных замен получим выражение для тока в системе: т> Q2cocoscot co2Qsmcot /1ЛЛ

Q +со Q +(о' где aFU aFU

Q = kl+k2=k/^ +k2e2RT . (20)

Проводимость и емкость находим из определения:

I = GU + C— = Gsma>t + Ca)cosci)t. (21) dt

То есть е = (22а)

Q +аг

22б>

Q + со что аналогично формулам (7 а,б), полученными в работе [39]. Таким образом, в случае двух стадий с сильно различающимися скоростями частотная зависимость приращений емкости и проводимости, возникающих после скачка концентрации АТФ, должна описываться выражениями вида

ДС^-^ + С.-^Ц-; (23а)

С0 СО1 +С0

236) а>0 +0) + а)2

Экспериментальные измерения изменений емкости и проводимости

На рисунке 6 представлены частотные зависимости приращений емкости и проводимости мембраны, возникающие после высвобождения АТФ из сАТФ в ответ на вспышку УФ-света. Значения емкости и проводимости нормализованы на суммарный перенесенный заряд, что позволяет сравнивать результаты разных экспериментов. Как видно из рисунка, в стандартных условиях приращение емкости спадает с ростом частоты в диапазоне до 10 Гц, при высоких частотах приращения емкости были постоянны. Приращение же проводимости возрастает во всем диапазоне частот и имеет немного меньший наклон в диапазоне от 10 до 50 Гц.

В теоретической модели была получена частотная зависимость изменений адмиттанса, описывающая электрогенный транспорт ионов натрия во внеклеточной канале, состоящий из нескольких стадий (формулы (23 а,б)). Однако, аппроксимация данных этой сложной функцией не может дать надежных численных параметров транспорта, так как для случая даже одного лоренциана необходимо анализировать зависимость емкости в очень широком диапазоне частот, что практически не возможно по техническим причинам. Одновременное измерение проводимости и емкости, то есть синфазной и квадратурной компонент тока, представляет трудности другого характера, возникающие из-за плохой воспроизводимости амплитуды сигналов в разных экспериментах. В связи с этим был выбран альтернативный подход к обработке экспериментальных результатов. Вместо анализа частотных зависимостей адмиттанса анализировался сдвиг фазы переменного токового сигнала как функция частоты переменного напряжения. Тангенс сдвига фаз сигнала может быть представлен в виде

24)

AG

Более удобным для анализа частотных характеристик является параметр, равный произведению абсолютной величины тангенса сдвига фаз на частоту сое1=а>2 — . (25) d AG

Очевидно, что если процесс описывается одним лоренцианом, значение этого параметра равно характерной частоте со0 процесса. Соответственно в этом случае частотная зависимость этого параметра будет представлять собой константу, равную характерной частоте процесса. Если же анализируемый процесс содержит две стадии, то частотная зависимость параметра сое1 будет представлять S-образную кривую, асимптотически стремящуюся к характерной частоте медленного процесса при низких частотах и к характерной частоте быстрого из процессов при высоких частотах. Таким образом, из простого анализа частотной зависимости параметра сое1 можно установить количество стадий, участвующих в процессе и определить их характерные частоты. Кроме того, значение этого параметра хорошо воспроизводится в разных экспериментах, что позволяет накапливать значительные объемы данных.

Для проверки такого подхода были проведены эксперименты с искусственными эквивалентами системы. В качестве эквивалентов были использованы соединенные последовательно резистор и конденсатор. Характерная частота лоренциана, описывающего такую цепь, равна величине обратного произведения емкости конденсатора на сопротивление резистора. YRC. В тестовых экспериментах значения соответствующих элементов были выбраны так, чтобы обеспечить

Таблица 1. Сопоставление кинетики тока короткого замыкания и характерной частоты "медленного" лоренциана ш0 частотной характеристики изменения адмиттанса.

XI , с т2 , с 1/Т2, с'1 ©о, с"1 C0/(C,+Ci) стан д. условия 0,0120±0,005 0,035±0,005 28,4±4.0 26,1 0,54 хлорид холина

350 мМ 0,013±0,003 0,046±0,012 21,6+5.6 25,3 0,56

850 мМ 0,015±0,004 0,051±0,012 19,7±4.7 13,7 0,37

1350 мМ 0,016±0,002 0,088±0,016 11,3+2.0 10,8 0,23

1850 мМ 0,019±0,006 0,093±0,016 10,8+1.9 16,5 бромид холина

150 мМ 0,021±0,002 0,064±0,008 15,5+1,9 13,7 0,35

350 мМ 0,031+0,008 0,109±0,023 9,2±1,9 12,3 характерные частоты, близкие к ожидаемым для натрий-калиевой АТФазы на основании работ [24,27,38]. На рисунке 7 представлены полученные при этом частотные зависимости емкости С, проводимости G и параметра сое1. Очевидно, что на основании непосредственной аппроксимации экспериментальных зависимостей емкости и проводимости нельзя однозначно различить одно- и двухстадийный процесс. С другой стороны параметр сое1 позволяет это сделать. В случае одной RC - цепи а>е1 практически не зависит от частоты, за исключением самых высоких и самых низких частот. Ошибка при низких частотах вызваны неточностями определения величины емкости, а при высоких частотах определяется искажениями, вносимыми фильтрами усилителя.

0 юоо с

О"4 500 0

4x105 3x105 5

И 2x10

Г\

СЪ 5

1x10 0

-1x105 1000 1 о

100

-I-1—I—I I I I 11

I—I I I II |-1-1-1—ГТ

О оХ (RC) + (RC) (RC), о* АR Ь

RC) °

Л Л ДЛ Л £

О о

IIII I I I I IIII■ ' ' ■ ■ I д

-I-г т

-|-1-1 I I I I I-1-г

Л'

RCV + (RC) д

- Й

Д А

8 О Д д о. д

RCL

RC),

I111111

111 м

-1-1-Г" 1 1 1 1 11- 1-1-Г" 1 1 1 1 '1 -г —1—1—1 1 1 В ■ r (RC)2 Ад л д д д д л л Д .

Д (RC)2 ■

RC)1 + Jb' ■ л о (RC),

Е % 1 1 1 .1 о J1L 0 1 1 1 О III > 111 1 1

1 10 100 частота, Гц

Рисунок 7. Контрольные эксперименты с RC-эквивалентами, имитирующими процессы перемещения заряда в белке.

Последующие измерения с Ма,К,АТФазой проводились в диапазоне частот, где указанные искажения не вносили ошибок. Частотные зависимости параметра сое, в случае двух RC - цепей представляли собой S-образиую кривую с асимптотическими значениями близкими к характерным частотам RC - цепей. На основании всего этого видно, что частотная зависимость параметра сое1 позволяет отличить одностадийный процесс от многостадийного и оценить скорости процессов.

На рисунке 6 представлена зависимость параметра сое1 для процесса переноса заряда Na,K,ATOa3ofi, полученная на основании результатов измерения частотных зависимостей емкости и проводимости. Величина параметра сое1 для Na,К,АТФазы монотонно возрастает с частотой и экспериментальные точки могут быть приближены S-образной кривой, аналогичной получаемой в тестовых экспериментах для двух RC -цепей. Асимптота в области нижних частот для сое1 составляла порядка 100 с"1, в области верхних частот около 2000 с"1. На основании этого можно заключить, что процесс переноса заряда №,К,АТФазой в эксперименте включает в себя, по меньшей мере, две стадии. Для определения кинетических параметров обеих стадий частотная зависимость приращений емкости и проводимости была представлена в виде:

2 2 СО п СОл

А с^о-р-^ + С,^—4-С,; (26 а)

0 +со щ +СО со0со2 сохсо2

AG = С0 —у^—+ С, -. (266) со0+о) со2 + со2

Постоянный член С, в этом выражении может описывать либо сверхбыстрый процесс, не разрешимый в диапазоне частот, в котором проводились измерения, либо неспецифические эффекты, связанные с электрострикцией мембраны и заряжением межмембранного пространства в ходе переноса заряда белком [39,40].

Рисунок 6 демонстрирует, что указанный теоретический подход применим для описания экспериментальных данных, по крайней мере, для стандартных условий, проведения эксперимента (150 мМ NaCl). Аппроксимация данных позволяет определить характерные частоты стадий процесса переноса заряда Na,K,AT<Da3oft. Частота быстрого процесса составляет около 1100 Гц, медленного - около 30 Гц. Первая величина близка к полученной в работе [39], когда экспериментальные данные приближались одним лоренцианом. Вторая частота хорошо соответствует константе скорости тока короткого замыкания, регистрируемого в ответ на скачек концентрации АТФ.

На рисунке 6 также показаны результаты измерений, полученные при измененном ионном составе среды. Сравнение данных, полученных в нормальных условиях и при добавлении в среду 850 мМ и 1350 мМ хлорида холина, показывают значительное различие частотных характеристик в области низких частот. Кроме того, с ростом концентрации хлорида происходит изменение относительных величин приращения емкости и проводимости при низких частотах. Значения и возрастали при увеличении концентрации хлорида при mах / -^шах частотах ниже 20 Гц. В случае зависимости ad при высокой концентрации соли точки сдвигаются на графике вниз. Это говорит о снижении характерной частоты медленного процесса. Для количественного определения этого параметра данные аппроксимировались зависимостями (26 а,б). Результаты аппроксимации приведены в таблице 1. Способность ионов снижать скорость медленной стадии была больше для Br", чем для СГ. Для сравнения в таблице 1 приведены значения характерных параметров токов короткого замыкания, возникающих при скачке концентрации АТФ. Значения V и ®0 Г2 совпадают с точностью до ошибки измерения во всем диапазоне концентраций солей Вг"и СГ . Кроме того, в таблице 1 приведены значения относительной амплитуды быстрой и медленной компонент. С ростом концентрации соли относительная амплитуда быстрой стадии уменьшается, в связи с этим не удается определить скорость быстрого процесса в высокой концентрации соли.

Лимитирующая стадия переноса ионов натрия во внеклеточном канале Na,K,AT<D>-a3bi.

После скачка концентрации АТФ в присутствии ионов натрия Ыа,К,АТФаза проходит часть нормального транспортного цикла, три иона натрия переносятся с цитоплазматической на внеклеточную сторону мембраны, при этом происходит гидролиз одной молекулы АТФ. Последовательность происходящих при этом реакций имеет вид: (Na3)ErP —» P-E2(Na3) —» P-E2Na2 —> P-E2Na P - E2. При отсутствии в среде ионов калия переход обратно в конформацию Ei происходит очень медленно [37], кроме того в отсутствии АДФ дефосфорилированием состояния (Na3)ErP за время одного измерения также можно пренебречь. Поэтому после фосфорилирования устанавливается равновесие между отдельными состояниями белка: (Na3)ErP P-E2(Na3) <-> P-E2Na2 P-E2Na <-> Р - Е2 (см. рис. 3). В результате недавних исследований было установлено, что, по меньшей мере, три из этих четырех реакций электрогенны и их диэлектрические коэффициенты и константы скорости были определены. Было обнаружено, что первый ион натрия проходит примерно 65% толщины белка [27,38]. Такое наблюдение было объяснено существованием в белке структуры подобной узкому каналу - каналу доступа ионов, между местами связывания ионов и внеклеточным раствором [14]. Высвобождение первого иона натрия приводит к последующему конформационному переходу в ходе, которого два оставшихся иона натрия перемещаются ближе к поверхности белка, так как величины диэлектрических коэффициентов для стадий их связывания-высвобождения составляют лишь 0,1 - 0,2 [26,27,38]. Электрогенность конформационного перехода относительно мала, как было показано ранее его диэлектрический коэффициент не превышает 10% [38], скорость этого процесса в зависимости от экспериментальных условий лежит в диапазоне от 30 с"1 до 400 с"1 [37,39,49-51]. Совсем недавно кинетика стадий связывания - выхода ионов была исследована с высокой точностью, при этом скорости деокклюзии натрия составили 1000 с"1 для второго и ~106с-1 для третьего ионов [27]. В экспериментах в модельной системе с адсорбированными фрагментами с использованием методики быстрой зарядке мембраны импульсами напряжения были получены следующие скорости стадий: 25 с"1 для конформационного перехода, 1400 с"1 для выхода первого и свыше 700 и 4000 с"1 для второго и третьего ионов натрия [38]. Сравнение приведенных результатов с данными, полученными в настоящей работе, представляет большой интерес.

В работе [39] была продемонстрирована эквивалентность методов основанных на приложении к мембране, содержащей АТФазу, скачков потенциала и переменного гармонического напряжения. Было показано, что в простейшем случае одноэкспоненциального переходного тока, возникающего в ответ на прямоугольный скачек напряжения постоянная времени экспоненты равна обратной характерной частоте лоренцианов, аппроксимирующих частотные характеристики приращений емкости и проводимости. В этой связи интересно сравнить результаты частотных измерений с данными, полученными в экспериментах по изучению релаксации тока в системе, содержащей натрий-калиевую АТФазу.

В работе [39] частотная зависимость перемещения заряда в последовательности стадий (Na3)E]-P <-> Р-Е2(№з) P-E2Na2 <-» P-E2Na •<-> Р - Е2 аппроксимировалась функцией Лоренца, определяемая при этом характерная частота процесса составляла около 200 Гц. Эта величина много больше той, которую можно было бы ожидать на основании результатов измерений на кардиомиоцитах и ооцитах в работах [23,24,26] или на гигантском аксоне кальмара в [27]. Однако в работах [39,47,50] с одной стороны в области низких частот отчетливо видно отклонение экспериментальных точек от теоретических кривых, с другой стороны в них не удалось достоверно определить плато в зависимости емкости в той же области частот. С учетом этого характерная частота лоренциана не может быть определена удовлетворительно.

Чтобы обойти указанные трудности в настоящей работе был использован иной подход для анализа частотных зависимостей приращений адмиттанса, основанный на определении характера частотной зависимости сдвига фазы токового сигнала по отношению к фазе приложенного напряжения. Преимущества данного подхода заключаются в том, что результаты анализа не зависят от амплитуды сигнала, которая плохо воспроизводится от эксперимента к эксперименту, кроме того, при определении фазочастотных характеристик можно ограничится меньшим диапазоном частот, так как определение характерных частот процесса меньше зависит от величины сигнала на низких частотах. Возможные трудности такого подхода заключаются в возможных искажениях фазы сигнала, возникающих в результате процессов, не связанных с движением заряда внутри белка. Наиболее вероятным источником ошибок является фильтр усилителя. Вносимые им искажения фазы учитывались при обработке результатов (см. Материалы и методы). Другим потенциальным источником искажений может выступать система мембрана - электроды, в экспериментах постоянная времени ячейки, равная произведению емкости мембраны на сопротивление доступа электродов, составляла около 10~4 с, что ограничивает сверху диапазон частот измерения величиной юм = 2 • 103 Гц. Во избежание искажений, связанных с постоянной времени ячейки, измерения проводились при частотах не выше 1 кГц. Неспецифический сдвиг фаз может также привноситься сложной структурой БЛМ -адсорбированные фрагменты. Эквивалентная схема такой системы приведена на рисунке 2, на основании ее анализа можно вывести выражение для сдвига фаз [52]: фт^ = фр~4+2фр> (27) где фтеш - измеряемый сдвиг фаз, фр - сдвиг фаз, определяемый переносом заряда в белке, ф( - определяется постоянной времени разрядки емкости мембранных фрагментов и БЛМ в соответствии с со(Ср+Ср)

Кг 'г > (28) i>F - сдвиг фаз, определяемый постоянной времени разрядки БЛМ:

29) F

В работе [53] а основании известных параметров БЛМ и мембранных фрагментов показано, что для частот выше 10 Гц верно соотношение это позволяет пренебречь сдвигом фаз, вносимым соединенными последовательно БЛМ и фрагментами:

Фтеа^ФР- (30)

При низких же частотах влияние мембранной системы на сдвиг фаз оказывается значительным. Проводимостью БЛМ можно пренебречь [32], следовательно, tgфF стремится к бесконечности, то есть БЛМ представима в виде идеального конденсатора, и фР ~ - ^. Из выражения (29) следует, что tgфt есть произведение круговой частоты сигнала и постоянной времени разрядки области контакта двух мембран. Оценка снизу этой постоянной времени, по данным работ [32,38] составляет около 300 мс, что приводит к ощутимым отклонениям ф1 от -^>2 только при частотах сигнала порядка 0,5 Гц или ниже, эта частота меньше той, что использовалась в данной работе (2 Гц). На основании всего сказанного можно заключить, что искажения фазы, создаваемые системой БЛМ -фрагменты были пренебрежимо малы в условиях экспериментов, представленных в настоящей работе.

На основании того, что экспериментально зарегистрированный сдвиг фаз определяется перемещением заряда внутри Na,К,АТФазы, из частотной зависимости, приведенной на рисунке 6, можно заключить, что релаксация заряда в белке имеет минимум две стадии с характерными скоростями около 30 и 1500 с"1. Величина меньшей из скоростей хорошо согласуется со скоростью спада тока короткого замыкания и с константами скорости для конформационного перехода белка, полученными на клетках [23,54], если произвести пересчет величины скорости с условий 36 С° (измерения на клетках) до 22 °С (измерения в модельной системе), энергия активации процесса составляет около 100 кДж/моль [54], на основании этого можно заключить, что медленный процесс в экспериментах обоих типов соответствует одной и той же лимитирующей скорость стадии.

Существование зависимости кинетики переноса заряда от солевого состава среды было показано ранее [37,39,43,50]. В присутствии высоких концентраций хлоридов натрия и холина был обнаружен сдвиг частотных зависимостей приращений емкости [39]. Однако детальные измерения, представленные в настоящей работе, демонстрируют, что ранее производились сравнения различных электрогенных стадий, а именно быстрая стадия в нормальных условиях сравнивалась с медленной в условиях высокой концентрации соли.

Анализ данных, представленных выше, показывает, что характерная частота медленной стадии снижается в концентрированных растворах солей холина, это снижение кореллирует с уменьшением скорости спада тока короткого замыкания, измеренного в тех же условиях (таблица 1). Эффективность солей возрастает в ряду СГ^Вг^сГ1 (см. рис. 5). Тот факт, что сила эффекта анионов соответствует их положению в ряду Хоффмейстера [44] позволяет предположить, что замедление связано с хаотропным воздействием указанных ионов, аналогичным их влиянию на равновесие между двумя состояниями Р-Ei и Р-Е2 фосфорилированного белка, наблюдавшемуся ранее [41]. Эти наблюдения говорят в пользу гипотезы, согласно которой скоростьлимитирующей стадией всего процесса является конфармационный переход между состояниями P-Ej и Р-Е2 белка.

Следует отметить, что в литературе существует альтернативная точка зрения на природу скоростьлимитирующей стадии. Так в работах [33,47,55] конформационный переход предполагается быстрым процессом, определяющим кинетику фазы роста тока короткого замыкания после фотолиза сАТФ. Фаза спада тока, при этом, относилась к процессу обмена в центре связывания неактивного сАТФ на свободный АТФ, находящийся в пространстве близ БЛМ. Однако, как показано в настоящей работе, добавление солей холина оказывает гораздо более сильное воздействие на кинетику спада тока короткого замыкания, в сравнении с кинетикой его роста (см. таблицу 1 и рис. 5). В ходе частотных измерений стадия перед конформационным переходом отсутствует (см рис. 3), следовательно переход, чувствительный к солевому составу среды может быть только конформационным переходом белка, так как ни у кого не вызывает сомнений тот факт, что связывание -высвобождение ионов - быстрый процесс [27,38,46]. Таким образом, экспериментальные результаты говорят в пользу того, что кинетика роста тока короткого замыкания определяется скоростью фотолиза сАТФ и фосфорилированием белка, тогда как кинетика спада тока короткого замыкания зависит в первую очередь от скорости конформационного перехода натрий-калиевой АТФазы [37,38,43].

Частотная зависимость параметра сое1 говорит о существовании второго лоренциана с характерной частотой около 2000 с"1, что означает существование второго электрогенного процесса (рис. 6). В отличие от медленного, это быстрый процесс практически не чувствителен к высоким концентрациям солей. Данные, показанные на рисунке 6, демонстрируют, что солевой эффект наблюдается только в области низких частот. Высокие концентрации солей холина, тем не менее, вызывают уменьшение амплитуды быстрого процесса по отношению к амплитуде медленного (см. таблицу 1). Это наблюдение также может быть объяснено сдвигом равновесия между двумя конформациями белка. Этим эффектом также объясняется невозможность определения характерной частоты быстрого процесса при высокой концентрации солей холина. В соответствии со схемой реакций (см. рис. 3) последовательность электрогенных стадий связывания-высвобождения ионов натрия имеет вид P-E2(Na3) <-» P-E2Na2 о P-E2Na <г-> Р-Е2. Какой-то из переходов в этой цепочке равновесий является быстрой стадией, соответствующей второму лоренциану с характерной частотой около 2000 с"1. Фосфорилирование дефосфорилирование белка можно не учитывать, так как в среде АДФ практически отсутствует. В соответствии с литературными данными наиболее электрогенен переход, сопровождающийся выходом в раствор первого иона натрия: P-E2(Na3) <-> P-E2Na2. Эта стадия имеет диэлектрический коэффициент около 0,65 и константу скорости < 1000 с"1 [27] или 1400 с"1 [38]. Скорость высвобождения последующих ионов значительно выше [27]. На основании этого можно заключить, что быстрый процесс, обнаруженный при анализе частотных зависимости емкости и проводимости, соответствует выходу во внеклеточный раствор из мест связывания первого из трех ионов натрия. Постоянный член С, , необходимый для аппроксимации экспериментальных данных на высоких частотах, может рассматриваться как плато следующего лоренциана с очень высокой характерной частотой, соответствующего выходу во внеклеточный раствор второго иона натрия.

Воздействие солей холина на кинетику тока короткого замыкания при их симметричном и асимметричном распределении относительно сторон белка.

Воздействие солевого состава среды на равновесие конформаций натрий-калиевой АТФазы и кинетику переходов между ними в настоящее время является установленным фактом [39,41,50]. Несмотря на это до, сих пор неизвестен механизм этого явления. Его предполагаемые объяснения включают в себя хаотропный эффект анионов [41,50], изменение свойств непосредственного липидного окружения белка [56], изменение сродства мест связывания нуклеотида, что приводит к изменению скорости фосфорилирования [57].

До настоящего времени все исследования эффекта солевого состава среды, включая результаты, представленные в первой части настоящей работы, проводились в симметричных условиях, когда и цитоплазматическая и внеклеточная сторона белка соприкасались с раствором одного и того же ионного состава (различия, возникающие из-за разной концентрации субстратов, здесь не учитываются). Было бы разумным ожидать различий в эффектах солей, воздействующих на разные стороны белковой молекулы. Удобство системы с адсорбированными на БЛМ фрагментами состоит в возможности проведения измерений при асимметричном распределении ионов относительно мембраны фрагмента, а, следовательно, и относительно белка. В одном случае интересующая соль добавляется в буферный раствор до адсорбции фрагментов, в результате ионный состав симметричен относительно мембраны фрагмента. В другом случае соль добавляется уже после адсорбции фрагментов на БЛМ, и ионный состав оказывается различным в пространстве между двумя мембранами, где он концентрация хлорида холина, мМ

Рисунок 8. Зависимость постоянной времени спада тока короткого замыкания от концентрации хлорида холина при симметричном (квадраты) и асимметричном (кружки) распределении. близок к исходному составу буфера, и в растворе, куда обращена цитоплазматическая часть белка. Результаты измерений токов короткого замыкания в присутствии в среде хлорида холина при симметричном и асимметричном распределении приведены на рисунке 8.

При наличии хлорида холина только с цитоплазматической стороны белка ощутимое замедление кинетики спада тока короткого замыкания, характеризующейся постоянной времени г2, наступало уже при концентрации соли около 50 мМ, то есть гораздо раньше, чем при симметричном распределении хлорида холина. Различий в зависимости величин г, от концентрации соли в двух случаях обнаружено не было. В экспериментах обоих типов г, зависело от концентрации хлорида холина одинаково, рисунок 5.

Влияние солей хлора на скорости и равновесия отдельных стадий в транспортном цикле Na,К,АТФазы в литературе объясняется в первую очередь воздействием высокой ионной силы раствора на электростатические взаимодействия зарядов в белке. Этим эффектом, в частности, в работах [57,58] объясняется увеличение константы связывания АТФ белком при росте концентрации хлорида натрия. Кроме того, высокая ионная сила может приводить к замедлению скорости фотолиза сАТФ, что вместе с замедлением процесса фосфорилирования может объяснить рост характерного времени тх при высоких концентрациях хлорида. Поведение же в этих условиях параметра т2 нельзя описать замедлением фосфорилирования, потому что в этом случае число молекул белка, гидролизующих АТФ после вспышки УФ-света, будет уменьшаться с увеличением ионной силы среды, что должно приводить к уменьшению суммарного заряда, переносимого через мембрану фрагмента после фотолиза сАТФ. Однако из данных, представленных на рисунке 9, видно, что это не так.

§ 0,9

1 °'8 О о и

1,0 0

100

200

300

400

Рисунок 9. Зависимость относительной скорости спада тока короткого замыкания (черные кружки) и нормированного заряда (светлые кружки) от концентрации хлорида холина.

С ростом концентрации хлоридов холина и натрия происходит замедление скорости процесса, определяющего кинетику спада тока короткого замыкания, и одновременно с этим происходит увеличение перенесенного в системе заряда. В настоящей работе уже было показано, что стадия с характерной скоростью V соответствует конформационному переходу Е]<->Е2 белка. Таким образом, повышение ионной силы раствора приводит к замедлению скорости конформационного перехода и одновременно к росту переносимого белком заряда. Подобный эффект не может быть объяснен снижением скорости или эффективности фосфорилирования Na,К,АТФазы. Поэтому ниже предлагается другое объяснение влияния одностороннего введения хлорида холина на перенос ионов натрия белком. Оно основано на предположении, что асимметричное экранирование поверхностного заряда мембраны приводит к появлению внутримембранного поля, которое влияет на распределение ионов натрия в канале с внеклеточной стороны белка. Модель, описывающая влияние электрического поля на распределение ионов в канале, уже рассматривалась в литературе [24]. Она позволила объяснить спадающие токи, зарегистрированные на мембранах клеток при скачкообразном изменении напряжения.

В модели, предложенной в [24], величина суммарного заряда, перенесенного белком при скачкообразном изменении напряжения на мембране, описывается выражением вида: где Qtot - максимальный заряд, а - диэлектрический коэффициент соответствующей стадии, <р — электрический потенциал на мембране, а Ч,ч

- потенциал половинного связывания для этой стадии. При этом скорость релаксации тока, вызванного этим изменением напряжения, определяется выражением: где а - константа скорости перехода Ej^E2, b - константа скорости обратного перехода Е2—>Ei (см. рис. 7). В соответствии с зависимостями (31, 32) скорость процесса уменьшается, а величина перенесенного заряда увеличивается с ростом потенциала на мембране. В литературе, в частности в работах [59,60], рассматривается эффект возникновения трансмембранного потенциала при асимметричном экранировании поверхностного заряда с двух сторон мембраны. Это может иметь место, когда мембрана из заряженных липидов разделяет растворы разной ионной силы. В использованной нами системе с адсорбированными фрагментами в принципе возможно возникновение подобных эффектов. Липиды, составляющие БЛМ в наших экспериментах, были нейтральными (дифитаноилфосфотидилхолин), однако, как известно из литературы,

31)

32) белоксодержащие мембранные фрагменты примерно на 15% состоят из заряженных отрицательно липидов. Аналогично тому, как это сделано в [61], выясним распределение электрического потенциала в водных растворах, граничащих с мембраной фрагмента и БЛМ, межмембранном пространстве, мембране фрагмента, плотность заряда на поверхности которой равна а = -1, и БЛМ. Для этого воспользуемся теорией диффузного слоя в приближении малых зарядов поверхности. В этом случае потенциал спадает в растворе при удалении от мембраны по экспоненциальному закону. Распределение потенциала внутри мембраны будем предполагать линейным. Сближение заряженной мембраны фрагмента и нейтральной БЛМ на расстояние, порядка дебаевской длины экранирования, приводит к частичному вытеснению противоионов из диффузного слоя в пространстве между мембранами в наружный раствор. Это приводит к появлению дополнительного электрического поля внутри БЛМ и фрагменте, зависящего от расстояния между ними. Потенциал в водной среде вблизи мембраны фрагмента в общем случае будет иметь вид:

Ф, = С, ехр(/с,х), (33 а) потенциал внутри мембраны фрагмента имеет вид:

Ф2 = С2х + В.

33 6) потенциал в межмембранном пространстве: Ф3 = С3 ехр(/с3х) + Вг ехр(-/с3х) ,

33 в) потенциал в БЛМ:

Ф4 = С4х + В4,

33 г) потенциал в правом растворе близ БЛМ: Ф5 = С5 ехр(~д-5х).

33 д)

Здесь СпВ. - некоторые константы, к, - величины обратные дебаевской длине в соответствующей среде, х - расстояние вдоль оси системы, отсчитываемое от левой границы мембраны фрагмента. Скачок электрической индукции на незаряженной границе мембраны равен нулю, на заряженной - 4па. В случае короткого замыкания, когда потенциалы правого и левого растворов равны, то есть

ЕЛФ,=0, (34) 1 из (33 а, б, в, г, д) при заданных граничных условиях для потенциала и электрической индукции получим распределение потенциалов, показанное на рисунке 10. Расчеты показывают, что разность потенциалов на мембране фрагмента при постоянной плотности заряда зависит от разности величин кг, и кг, которые определяются ионными силами растворов по обе стороны от фрагмента. После адсорбции мембранных фрагментов на БЛМ раствор в межмембранном пространстве не может обмениваться ионами с внешним объемом, очевидно, что это необходимо для возможности наблюдения переходных токов короткого замыкания в системе. Если после адсорбции фрагментов увеличить концентрацию соли, то есть увеличить ионную силу левого и правого растворов кг, = к5 > кг, это приведет к повышению разности потенциалов на мембране фрагмента (см. рис. 10). Разбавление обоих растворов (/с, =к5 <к3) будет иметь обратный эффект, при этом потенциал может даже поменять знак (см. рис. 10). Если теперь в таком мембранном фрагменте встроены молекулы Na,К,АТФазы, то транспорт ими ионов натрия, то есть электрического заряда, в ответ на скачок концентрации АТФ, будет описываться формулами, аналогичными (30, 31), что приведет к представленным на рисунке 10 экспериментальным зависимостям

1" •0.02

-О 04 •D.06 •О 08

150 200 В водный раствор

Мембранный фрагмент q

Межмембранное пространство водный раствор

БЛМ

Заряженные поверхности

Рисунок 10. Распределение потенциала в системе адсорбированных на БЛМ мембранных фрагментов при кх =к5=къ (А), кх =к5ж3 (Б) и кх =к5 <к3 (В). Потенциал выражен в относительных единицах, расстояние - в А. перенесенного заряда и скорости процесса от концентрации соли в растворе.

В отличие от солей хлора, влияние солей брома и особенно йода не удается сколь либо удовлетворительно связать с изменением ионной силы среды, так как эффект этих солей проявляется в концентрациях на порядок ниже (см. рис 5).

Зависимость постоянной времени спада тока короткого замыкания при симметричном распределении ионов йода в пределах ошибки измерения совпадает с таковой при асимметричном распределении йодида холина во всем диапазоне концентраций, результаты представлены на рисунке 5.

Температурные зависимости кинетики переходных токов. Эффекты, наблюдаемые при изменении солевого состава среды и интенсивности вспышки УФ-света.

Изменение равновесия и скорости переходов между определенными состояниями белка в присутствии определенных солей можно описывать в терминах высоты энергетических уровней квазистационарных и переходных состояний системы белок - транспортируемые ионы [14,62]. Для проведения подобного анализа была исследована зависимость кинетических параметров тока короткого замыкания от температуры. С этой целью были проведены измерения токов короткого замыкания в присутствии хлорида, бромида и йодида холина при температурах в диапазоне 288 К - 302 К. Характерные скорости роста и спада тока короткого замыкания представлялись как функции температуры в

Аппроксимация в таких координатах экспериментальных точек линейной зависимостью позволяет вычислить аррениусовскую энергию активации процесса Еа и предэкспоненциальный фактор А в соответствии с определением: координатах где г„ = г,,т2, а Г-абсолютная температура.

Е,

На рисунке 11 приведены температурные зависимости г, и т2 в нормальных условиях, то есть в отсутствие солей холина. Значения энергий активации, полученные из аппроксимации этих данных, составляют 98 кДж/моль и 65 кДж/моль для г, и т2 соответственно. Эти значения находятся в согласии с величинами 101 кДж/моль и 68 кДж/моль, приведенными в работе [33]. При наличии в среде хлорида

Рисунок 11. Температурные зависимости постоянной времени роста тока короткого замыкания г, (треугольники) и постоянной времени спада тока короткого замыкания т2 (кружки). холина в концентрациях вплоть до 500 мМ не наблюдается изменения энергии активации стадий роста и спада тока короткого замыкания, как при симметричной, так и асимметричной добавке соли. Замедление кинетики обоих процессов, видное из рисунков 5 и 8, происходит целиком за счет снижения предэкспонента А. Это означает, что показатель

0,0033

0,0034

0,0035

1/Т,Г экспоненты в формулах (26, 27) мал, то есть потенциал на мембране фрагмента не превышает 10 мВ. В этом случае вклад электростатической энергии aF<p в суммарную энергию активации электрогенного процесса будет очень небольшим, и его нельзя будет достоверно определить по температурным зависимостям константы скорости.

В отличии от хлорида холина добавление йодида холина приводит к сильному изменению температурных зависимостей г, и т2. В его

1/Т, К1

Рисунок 12. Температурные зависимости постоянных времени роста тока короткого замыкания в нормальных условиях (кружки) и при 60 мМ йодида холина (треугольники). присутствии происходит замедление процесса роста тока короткого замыкания, г, возрастает, происходит это за счет уменьшения величины предэкспоненциального множителя А (см. рис. 5 и 12). Различие в поведении г, при симметричной и асимметричной добавке йодида, как и в случае с хлоридом обнаружить не удается. Как показано выше, по-видимому, кинетика фазы роста тока в основном определяется связанными с фосфорилированием белка процессами, происходящими с цитоплазматической, то есть обращенной в раствор, стороны белка. Это объясняет тот факт, что г, меняется одинаково при одно- и двухсторонней добавке солей холина. В обоих случаях цитоплазматическая часть белка, содержащая места связывания АТФ и фосфорилирования, находится в условиях одинаковой концентрации солей. полученные при симметричном распределении йодида холина. Отчетливо видно снижение наклона температурной зависимости (что эквивалентно уменьшению энергии активации Еа) при росте концентрации йодида. На рисунке 14 приведены зависимости параметров линейной аппроксимации температурных зависимостей Еа и А от концентрации йодида холина, полученных при его симметричном и асимметричном распределении относительно фрагментов с Ка,К,АТФ-азой. Во всех экспериментах повышение концентрации соли приводит к уменьшению обоих параметров: Еа и А. При симметричном распределении эффект оказывается значительно сильнее. Следует отметить, что при асимметричной добавке йодистого холина нельзя гарантировать, что концентрация ионов йода с внеклеточной стороны белка равна нулю. В действительности ионы йода могут перетекать из раствора в пространство между мембраной фрагмента и БЛМ. Это может приводить к постепенному выравниванию их концентраций с двух сторон Na,К,АТФазы. Тогда при асимметричной добавке концентрация ионов йода с внеклеточной стороны белка будет не нулевой, а лишь несколько меньше концентрации в объеме ячейки. По этой причине снижение обоих параметров при симметричной и асимметричной добавках йодистого холина, скорее всего, определяется одним и тем же механизмом. Разумно предположить, что природа этого эффекта та же, что и в работе [41], где

На рисунке 13 показаны температурные зависимости добавление в среду солей брома и йода приводило к сдвигу равновесия Ei-f-»E2 в сторону Е]. Эксперименты в этой работе проводились в условиях симметричного распределения указанных ионов (использовалась суспензия незамкнутых мембранных фрагментов). Воздействие определенных анионов, таких как перхлорат, йодид, роданид и бромид,

1/Т, к1

Рисунок 13. Температурные зависимости характерного времени спада тока короткого замыкания в нормальных условиях (кружки), 15 мМ (квадратики), 35 мМ (перевернутые треугольники), 60 мМ (треугольники) йодида холина. на кинетику работы и равновесие отдельных стадий в цикле натрий-калиевой АТФазы в работах [41,47,50] связывается с их хаотропным эффектом. Известно, что конформация растворенных в воде макромолекул зависит от ионного состава среды. Механизм этого эффекта до конца не выяснен. Наиболее вероятным объяснение состоит во влиянии ионов в растворе на энергию поверхности раздела макромолекула -раствор. В присутствии одних веществ эта энергия увеличивается, в присутствии других - уменьшается. Первые получили название космотропов, вторые - хаотропов [44]. Возможен и другой механизм влияния исследованных анионов на кинетику электрогенного транспорта, осуществляемого №,К,АТФ-азой. Давно установленным экспериментальным фактом является их способность адсорбироваться на поверхности бислойных липидных мембран. В работе [63] на основании изменения проводимости каналов, образованных в мембране концентрация йодида холина, мМ

Рисунок 14. Зависимость энергии активации (треугольники) и предэкспоненциального фактора (квадратики) от концентрации йодида холина. Черные символы соответствуют симметричному распределению соли, светлые -асимметричному. нонактином, в присутствии перхлорат и роданид анионов был сделан вывод, что указанные анионы вызывают изменение поверхностного потенциала липидной мембраны. Величина этого изменения была не велика - всего около - 45 мВ при концентрации перхлората в растворе

0,5 М. Аналогичные результаты были получены при измерении д -потенциала липидных визикул. Подобное заряжение мембран можно объяснить простой адсорбцией указанных хаотропных анионов на липидных мембранах. В работе [64] были проведены исследования изменения флуоресценции электрохромного зонда RH 421 в присутствии хаотропных ионов. Результаты хорошо объяснялись гипотезой уменьшения дипольного скачка потенциала внутри мембраны при адсорбции на нее анионов. Следует, однако, отметить, что спектр флуоресценции указанного электрохромного зонда зависит от некоторого среднего значения напряженности электрического поля вдоль его молекулы, с учетом этого на основании экспериментов, представленных в [64], можно лишь говорить об изменении напряженности электрического поля в месте нахождения зонда.

Если в натрий-калиевой АТФазе имеются структуры, обладающие достаточно большим дипольным моментом, и эти структуры перемещаются относительно диэлектрика мембраны во время конформационных переходов молекулы, то изменение локального электрического поля в местах их локализации может оказывать непосредственное влияние на кинетику конформационных перестроек. Так в работе [65] было зарегистрировано изменение кинетики тока короткого замыкания при адсорбции на мембрану дипольных молекул. Аналогичный механизм может лежать и в основе воздействия хаотропных ионов на Na,К,АТФазу.

Из выражений (30, 31) следует, что константа скорости, характеризующая кинетику переходных токов, представляет собой сумму констант скорости переходов Е]—»Е2 и Е2—»Еь причем скорость второй реакции дополнительно определяется концентрацией ионов натрия с внеклеточной стороны и величиной падающего на мембране электрического потенциала. В опытах, проводимых на клеточных мембранах, потенциал в системе легко контролируется, не так дело обстоит в системе с адсорбированными на БЛМ мембранными фрагментами. Падение потенциала на мембране фрагмента, а, следовательно, и на АТФазе, есть величина неизвестная. Кроме того, из анализа эквивалентной схемы, приведенной на рисунке 2, следует, что в результате переноса молекулами белка через мембрану фрагмента электрического заряда на ней будет создаваться некоторый потенциал, определяемый выражением: где Q - перенесенный всеми встроенными в мембрану фрагмента АТФазами заряд, Cfr - емкость мембраны фрагмента [39]. Величина перенесенного заряда в некотором диапазоне пропорциональна количеству выделившегося после вспышки УФ-света АТФ, то есть, при уменьшении интенсивности вспышки будет происходить снижение наводимого белками на мембране фрагмента потенциала, а следовательно и скорости всего процесса. В использованной нами экспериментальной установке интенсивность вспышки УФ-света с хорошей точностью пропорциональна энергии, запасенной в накопительном конденсаторе источника питания УФ-лампы, таким образом, можно считать, что перенесенный в системе после вспышки света заряд пропорционален квадрату напряжения U на накопительном конденсаторе:

36)

QkU2.

37) к, с"1 20

10

1,0 1,5 2,0 U2, В2

Рисунок 15. Зависимость константы скорости (обратной величины характерного времени) спада тока короткого замыкания от квадрата напряжения на накопительном конденсаторе источника питания УФ-лампы (квадратики -302 К, кружки - 298 К, треугольники - 294 К).

На рисунке 15 представлены зависимости константы скорости спада тока короткого замыкания ( V ) от квадрата напряжения на тг накопительном конденсаторе. Зависимости линейны для нескольких температур. Отсюда мы опять можем заключить, что наводимый на мембране фрагмента потенциал мал, и, учитывая малость величины Ч^ при наших экспериментальных условиях [27], выражение (32) для скорости можно представить в виде: к=а+Ъ + ь{^[¥к-ср^, (38) причем знак <р, возникающего на мембране фрагмента отрицателен. Точка пересечения прямых с осью ординат на рисунке 15 позволяет оценить величину

7 LI 1 aF^k kn = a+ b I 1 +-

RT

Она составляет небольшую ■ 1. .- 1" '■".

Сц

ЧЗ П

Vi-гЯ Ь-

1 - 1 \

0,0033

0,0034

0,0035

1/T, К'

Рисунок 16. Температурные зависимости характерного времени спада тока короткого замыкания при нормальной интенсивности УФ-света (кружки) и интенсивности 45% от нормальной (квадратики). долю в суммарной константе скорости, получаемой при максимальной интенсивности вспышки, на основании этого можно сделать заключение, что при Q~QmM а «Ь+Ь^~["¥к . Это позволяет идентифицировать стадию, которой соответствует энергия активации, определяемая из экспериментальных зависимостей, представленной на рисунке 13, с учетом соотношения a «b + b(^~[4/k ~g>]j ею является переход Е2—ИВ].

При уменьшении энергии вспышки может возникнуть ситуация, когда а » Ь + к - <р\\, это должно привести к изменению наклона температурной зависимости константы скорости. На рисунке 16 представлена зависимость константы скорости V от температуры при Г2 интенсивности вспышки около 45% от максимальной. Отчетливо видно изменение наклона зависимости при росте температуры, в точке перелома

-(р^, тогда как левее + наклон левой части температурной зависимости соответствует энергии активации около 125 кДж/моль.

Тот факт, что энергия активации 65 кДж/моль соответствует переходу E2-»Ej позволяет интерпретировать зависимость энергии активации от концентрации хаотропных ионов. Само по себе уменьшение Еа должно приводить к увеличению константы скорости Ь, что при неизменности а будет равносильно сдвигу равновесия Ej-oT^ влево, в соответствии с данными работ [41,47]. Однако, одновременно с уменьшением энергии активации хаотропные ионы вызывают сильное уменьшение предэспоненциального фактора А, что, вероятно, связано со снижением скорости фосфорилирования белка, как это предполагается например в [66]. На основании того, что симметричная добавка йодида или бромида холина, влияла на энергию активации больше, чем асимметричная, можно сделать вывод, что структура в молекуле белка, на которую оказывают воздействие анионы, либо находится во внеклеточной среде, либо погружена в мембрану вблизи ее внеклеточной поверхности. Как уже говорилось, такая структура может обладать дипольным моментом, определяющим ее энергию в электрическом поле. На основании недавних данных, касающихся структуры кальциевой АТФазы [6], очень близкой к натрий-калиевой АТФазе по строению [46], на роль такой гипотетической структуры можно предложить участки трансмембранных спиралей белка, образующих канал, по которому движутся ионы из мест связывания в раствор и обратно. В настоящее время можно считать установленным факт изменения, а именно, частичного раскручивания этих спиралей во время конформационного перехода белка [6]. С учетом этого можно предположить, что в состоянии Е2, когда открыт внеклеточный канал, геометрия системы такова, что дипольные моменты трансмембранных структур, образующих канал, располагаются так, что энергия системы находится в локальном минимуме. При закрытии канала, то есть обратном переходе в Еь должна измениться величина дипольного момента и/или его ориентация, это, очевидно, требует совершения работы против поля. Если же при адсорбции хаотропных анионов на мембрану скачек дипольного потенциала понижается, то это означает и снижение поля в некотором слое внутри мембраны. Внутри этого слоя переориентация дипольных групп будет уже менее энергоемкой, что означает снижение барьера. В самом общем случае энергию системы диполей во внешнем поле можно записать в виде: где d - проекция дипольного момента системы на направление поля, е -напряженность поля. Вклад работы переориентации диполей в активационную энергию:

Изменение напряженности поля при адсорбции можно записать в виде:

ДЕ - изменение дипольного скачка потенциала в мембране, вызванное адсорбцией хаотропного иона, х - эффективная толщина слоя дипольного скачка. Согласно данным [64] при небольших концентрациях анионов в растворе АН можно представить в виде

Е - de,

39)

ДЕ = Ads

40)

41)

ДН = = , (42) здесь Kads - константа адсорбции аниона на мембране, С - концентрация аниона, £ - некая константа. Объединяя уравнения (39 - 42), получим

AE = Z'rh£7;- (43)

1 + Kad.sL

С, мМ

Рисунок 17. Зависимость изменения энергии активации от концентрации в среде ионов йода.

На рисунке 17 представлена изменение энергии активации стадии спада тока короткого замыкания (по данным, представленным на рис. 14) как функция концентрации ионов йода при их симметричном распределении относительно мембраны фрагмента. На рисунке 17 представлены те же данные, но в координатах у^ ~ Ус, в которых изотерма адсорбции (42) линейна. Из графика следует, что зависимость (43) удовлетворительно описывает экспериментальные резулбтаты. На том же графике представлены данные для ионов брома, константа адсорбции для них равна около 4 М"1, для ионов йода 21 М"1. Эти величины по порядку величины хорошо согласуются с ожидаемыми на основании результатов измерений, представленных в работе [64] с использованием электрохромного зонда RH 421. Таким образом, можно утверждать, что влияние хаотропных ионов на натрий-калиевую АТФазу можно описать без привлечения представлений об изменении энергии границы раздела белок - раствор, исходя лишь из модели адсорбции анионов на бислойную мембрану.

Рисунок 18. Зависимость изменения энергии активации от концентрации в среде хаотропных ионов (треугольники соответствуют бромиду холина, а кружки - йодиду холина).

Отдельный интерес представляет собой сравнение величин энергии активации прямого и обратного конформационных переходов с литературными данными. В проведении такого сравнения могут возникнуть трудности, связанные с использованием в разных экспериментах препаратов натрий-калиевой АТФазы различного

0,0015

0,0000

0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07

1/С, мМ"1 происхождения. Анализ имеет смысл проводить среди данных, относящихся к препаратам белка, выделенных из близких организмов и, желательно, из одних и тех же тканей. Полученные нами в условиях транспорта натрий-калиевой АТФазой ионов натрия значения энергии активации прямого и обратного конформационного перехода 125 и 65 кДж/моль, отлично согласуются с данными, полученными на том же белке в [62]. В этой работе была исследована температурная зависимость скорости гидролиза АТФ белком при циклическом процессе. Температурная зависимость имела два участка с наклонами, соответствующими энергиям активации 66 и 115 кДж/моль. Очевидно, что в циклическом процессе им будут соответствовать скоростьлимитирующие стадии. В той же работе была определена энергия активации процесса АТФ-Е2(К2)-»К2ЕГАТФ, оказавшаяся равной 66 кДж/моль. Эти результаты означают, что энергия активации процесса (Na3)EiP—>PE2(Na3) составляет 115 кДж/моль, а PE2(K2)-KK2)EiP - 66 кДж/моль. В настоящей же работе были подучены величины 125 кДж/моль для (Na3)EiP—>PE2(Na3) и 65 кДж/моль для PE2(Na3)—»(Na3)EiP близость этой величины к полученной в [62] позволяет сделать заключение о том, что переход натрий-калиевой АТФазой из Е2 в состояние Е] имеет один и тот же энергетический барьер не зависимо от того, какие ионы (К+ или Na+) занимают места связывания, это говорит о том, что конформационный переход с точки зрения энергии эквивалентен в этих двух случаях. Это позволяет с большей уверенностью распространять результаты экспериментов, полученных в безкалиевой среде, на весь транспортный цикл белка.

ГЛАВА 4. ВЫВОДЫ.

1. С помощью усовершенствованного метода измерения и анализа приращений адмиттанса при функционировании №,К,АТФ-азы показано, что перенос ионов натрия состоит минимум из 2 электрогенных стадий. Их характерные скорости составляли 30 с"1 и около 1100 с"1, что хорошо согласуется с результатами измерений на других системах. Скорость 1100 с"1, по-видимому, соответствует процессу выхода первого иона натрия из места связывания во внеклеточный канал.

2. Обнаружено, что характерная скорость медленной стадии, полученная из измерений адмиттанса, совпадает с обратной постоянной времени спада тока короткого замыкания. Совпадение этих параметров свидетельствует в пользу того, что самой медленной стадией транспорта является конформационный переход Е]ОЕ2 белка.

3. Показано, что оба параметра синхронно уменьшаются в присутствии солей холина в среде. Эффективность соли определялась анионом и возрастала в ряду С1<Вг<1. Этот эффект был объяснен воздействием солей на равновесие конформаций E]/E2 белка и скорость перехода между ними.

4. Обнаружено, что соли холина по-разному влияют на скорость медленной стадии электрогенного транспорта в зависимости от того, с какой стороны белковой молекулы они находятся. Хлорид более эффективен, если он присутствует только с цитоплазматической стороны. Это было объяснено с помощью модели, предполагающей изменение трансмембранного потенциала в результате асимметричного экранирования поверхностного заряда липидной мембраны.

5. С помощью измерений температурных зависимостей кинетики переноса заряда №,К,АТФ-азой показано, что йодид и бромид холина уменьшают аррениусовскую энергию активации медленной стадии. Эффект оказывается значительно более сильным, если соли находятся с внеклеточной стороны белка.

6. Предложена модель влияния хаотропных ионов на №,К,АТФ-азу, основанная на двух возможных механизмах. Один механизм предполагает, воздействие ионов на структуру воды на поверхности белка, другой - изменение напряженности электрического поля внутри липидной мембраны, при адсорбции ионов на ее поверхности.

ЛИТЕРАТУРА.

1. Norby,J.G. 1987. Na,K-ATPase - Structure and Kinetics - Comparison with Other Ion- Transport Systems. Chemica Scripta 27B:119-129.

2. Vasilets,L.A., T.Ohta, S.Noguchi, M.Kawamura, and W.Schwarz. 1993. Voltage-Dependent inhibition of the Sodium-Pump by External Sodium -Species-Differences and Possible Role of the N-Terminus of the Alpha-Subunit. Eur. Biophys. J. 21:433-443.

3. Glynn,I.M. 1985. The Na+,K+-transporting adenosine triphosphatase. In The Enzymes of Biological Membranes. A.N.Martonosi, editor. Plenum Press, New York. 35-114.

4. Jorgensen,P.L. and J.P.Andersen. 1988. Structural basis forEi-E2 conformational transitions in Na,K-pump and Ca-pump proteins. J. Membrane Biol 103:95-120.

5. Ovchinnikov,Y.A., N.M.Arzamazova, E.A.Aristarkhova, N.M.Gevondyan, N.A.Aldanova, and N.N.Modyanov. 1987. Detailed structural analysis of exposed domains of membrane- bound Na,K ATPase. FEBS Lett. 217:269274.

6. Toyoshima,C., M.Nakasako, H.Nomura, and H.Ogawa. 2002. Crystal structure of the calcium pump of sarcoplasmic reticulum at 2.6 A resolution. Nature 405:647-655.

7. Rice,W.J., H.S.Young, D.W.Martin, J.R.Sachs, and D.L.Stokes. 2001. Structure of Na,K-ATPase at 11-A Resolution: Comparison with Ca-ATPase in El and E2 States. Biophys. J. 80:2187-2197.

8. Sweadner,K.J. andK.Donnet. 2001. Structural similarities ofNa,K,ATPase and SERCA, the Ca -ATPase of the sarcoplasmic reticulum. Biochem. J. 356:685-704.

9. Jorgensen,P.L. 1974. Isolation of the Na,K-ATPase. Meth. Enzymol. 32:277290.

10. Albers,R.W. 1967. Biochemical aspects of active transport. Annu. Rev. Biochem. 36:727-756.

11. Kaplan,J.H., I.B.Forbush, and J.F.Hoffman. 1978. Rapid photolytic release of adenosine 5'-triphosphate from a protected analogue: utilization by the Na:K pump of hunab red blood cell ghosts. Biochemistry 17:1929-1935.

12. Glynn,I.M., Y.Hara, D.E.Richards, and M.Steinberg. 1987. Comparison of Rates of Cation Release and of Conformational Change in Dog Kidney Na,K-ATPase. J. Physiol -London 383:477-485.

13. Forbush,I.B. 1988. Rapid 86Rb release from an occluded state of the Na,K-pump reflects the rate of dephosphorylation or dearsenylation. J. Biol. Chem. 263:7961-7969.

14. Lauger,P. 1991. Electrogenic Ion Pumps. Sinauer associates, Inc., Sunderland, Massachusets, USA.

15. Jensen,J.H., J.G.Norby, and P.Ottolenghi. 1984. Binding of sodium and potassium to the sodium pump of pig kidney evaluated from nucleotide-binding behaviour. J. Physiol. 346:219-241.

16. Homareda,H., H.Matsui, and T.Nozaki. 1987. Interaction of Sodium and Potassium-Ions with Na+,K+-ATPase .3. Cooperative Effect of ATP and Na+ on Complete Release of K+ from E2K. J. Biochem., 101:789-793.

17. De Weer,P., D.C.Gadsby, and R.F.Rakowski. 1988. Voltage Dependence of the Na-K Pump. Ann. Rev. Physiol. 50:225-241.

18. Hansen,U.-P., D.Gradmann, D.Sanders, and C.L.Slayman. 1981. Interpretation of current-voltage relationships for "active" ion transport systems. I. Steady-state reaction kinetic analysis of Class-1 mechanisms. J. Membrane Biol. 63:165-190.

19. Gadsby,D.C., M.Nakao, and A.Bahinski. 1989. Voltage Dependence of Na/K Pump Current. Curr. Top. Membr. Transp. 34:269-288.

20. Lafaire,A.F. and W.Schwarz. 1986. Voltage dependence of the rheogenic Na/K ATPase in the membrane of oocytes of Xenopus Laevis. J. Membrane Biol. 91:43-51.

21. Gadsby,D.C., M.Nakao, A.Bahinski, G.Nagel, and M.Suenson. 1994. Charge movements via the cardiac Na,K-ATPase. Acta Physiol. Scand. Suppl. 607:111-123.

22. Omay,H.S. and W.Schwarz. 1992. Voltage-Dependent Stimulation of Na+/K+-Pump Current by External Cations - Selectivity of Different K+ Congeners. Biochim. Biophys. Acta 1104:167-173.

23. Nakao,M. and D.C.Gadsby. 1986. Voltage Dependence of Na Translocation by the Na/K Pump. Nature 323:628-630.

24. Rakowski,R.F. 1993. Charge Movement by the Na/K Pump in Xenopus Oocytes. J. Gen. Physiol. 101:117-144.

25. Sagar,A. and R.F.Rakowski. 1994. Access Channel Model for the Voltage Dependence of the Forward- running Na+/K+ Pump. J. Gen. Physiol. 103:869894.

26. Hilgemann,D.W. 1994. Channel-Like Function of the Na,K Pump Probed at Microsecond Resolution in Giant Membrane Patches. Science 263:14291432.

27. Holmgren,M., J.Wagg, F.Bezanilla, R.F.Rakowski, P.De Weer, and D.C.Gadsby. 2000. Three distinct and sequential steps in the release of sodium ions. Nature 403:898-901.

28. Rakowski, R. F., Bezanilla, F., De Weer, P., Gadsby, D. C., Holmgren, M., and Wagg, J. Charge translocation by the Na/K pump. Beauge, L. A., Gadsby, D. C., and Garrahan, P. J. 834, 231-241. 1997. New York, Annals of the New York Academy of Sciences. Na/K-ATPase and related transport ATPases. Structure, mechanism and regulation.

29. Peluffo,R.D. and J.R.Berlin. 1996. Transient Charge Movement During K+ Translocating Steps by the Na Pump. Biophys. J. 70:SUAM4.

30. Peluffo,R.D. and J.R.Berlin. 1997. Electrogenic K+ transport by the Na+,K+ pump in rat cardiac ventricular myocytes. Journal Of Physiology London 501:33-40.

31. Fendler,K., E.Grell, M.Haubs, and E.Bamberg. 1985. Pump Currents Generated by the Na+,K+-ATPase from kidney on Black Lipid Membranes. EMBOJ. 4:3079-3085.

32. Borlinghaus,R., H.-J.Apell, and P.Lauger. 1987. Fast Charge Translocation Assotiated with Partial Rections of the Na,K-Pump: I. Current and Voltage Transients after Photochemical Release of ATP. J. Membrane Biol. 97:161178.

33. Fendler,K., S.Jarushewski, A.S.Hobbs, W.Albers, and J.P.Froehlich. 1993. Pre-Steady-State Charge Translocation in Na,K-ATPase from Eel Electric Organ .J. Gen. Physiol. 102:631-666.

34. Nagel,G., E.Bamberg, K.Fendler, and E.Grell. 1987. Na+ Currents Generated by the Purified (Na+ - K+)-ATPase on Planar Lipid-Membranes. Biochim. Biophys. Acta 901:239-249.

35. Borlinghaus,R. and H.-J.Apell. 1988. Current transients generated by the Na+/K+-ATPase after an ATP concentration jump - dependence on sodium and ATP concentration. Biochim. Biophys. Acta 939:197-206.

36. Sturmer,W., P.Lauger, I.Wuddel, and H.-J.Apell. 1989. Conformational Transitions and Charge Translocation by the Na,K Pump - Comparison of Optical and Electrical Transients Elicited by ATP-Concentration Jumps. J. Membrane Biol. 110:67-86.

37. Heyse,S., I.Wuddel, H.-J.Apell, and W.Sturmer. 1994. Partial reactions of the Na,K-ATPase: determination of rate constants. J. Gen. Physiol. 104:197240.

38. Wuddel,I. and H.-J.Apell. 1995. Electrogenity of the Sodium Transport Pathway in the Na,K-ATPase Probed by Charge-Pulse Experiments. Biophys. J. 69:909-921.

39. Соколов,В.С., С.М.Стуколов, А.С.Дармостук, and Х.-Ю.Апель. 1997. Изучение нестационарного электрогенного транспорта ионов натрия №,К,АТР-азой методом измерения емкости. Биологические мембраны 14:529-548.

40. Соколов,B.C., К.В.Павлов, К.Н.Джанджугазян, and Е.Бамберг. 1992. Изменение емкости и проводимости модельной мембраны при функционировании №,К-АТФазы. Биологические мембраны 9:961-969.

41. Post, R. L. and Suzuki, К. A Hoffmeister Effect on the Phosphoenzyme of Na,K-ATPase. De Weer, P. and Kaplan, J. H. 202-209. 1991. New York, Rockfeller University Press. The Sodium Pump: Structure, Mechanism and Regulation.

42. Apell,H.-J., R.Borlinghaus, and P.Lauger. 1987. Fast Charge Translocation Assotiated with Partial Rections of the Na,K-Pump: II. Microscopic Analysis of Transient Currents. J. Membrane Biol. 97:179-191.

43. Sokolov,V.S., H.-J.Apell, J.E.T.Corrie, and D.R.Trentham. 1998. Fast transient currents in the Na,K-ATPase induced by ATP concentration jumps from DMB-caged ATP. Biophys. J. 74:2285-2298.

44. Cacace,M.G., E.M.Landau, and J.J.Ramsden. 1997. The Hofmeister series: salt and solvent effects on interfacial phenomena. Quart. Rev. Biophys. 30:241-277.

45. Buhler,R., W.Sturmer, H.-J.Apell, and P.Lauger. 1991. Charge translocation by the Na,K-pump: I. Kinetics of local field changes studied by time-resolved fluorescence measurements. J. Membrane Biol. 121:141-161.

46. Apell,H.J. and S.J.Karlish. 2001. Functional properties of Na,K-ATPase, and their structural implications, as detected with biophysical techniques. J. Membrane Biol. 180:1-9.

47. Babes,A. and K.Fendler. 2000. Na+ Transport, and the EjP-E2P Conformational Transition of the Na+/K+-ATPase. Biophys. J. 79:2557-2571.

48. Lu,C.-C., A.Kabakov, V.S.Markin, S.Mager, S.Frazier, G.A.Frazier, and D.W.Hilgemann. 1995. Membrane Transport Mechanisms Probed by Capacitance Measurements with Megahertz Voltage Clamp. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1995:11220-11224.

49. Clarke,R.J., D.J.Kane, H.-J.Apell, M.Roudna, and E.Bamberg. 1998. Kinetics of Na(+)-dependent conformational changes of rabbit kidney Na+,K(+)-ATPase. Biophys. J. 75:1340-1353.

50. Ganea,C., A.Babes, C.Lupfert, E.Grell, K.Fendler, and R.J.Clarke. 1999. Hofmeister effects of anions on the kinetics of partial reactions of the Na+,K+-ATPase. Biophys. J. 77:267-281.

51. Pratap,P.R. and J.D.Robinson. 1993. Rapid kinetic analyses of the Na+/K+-ATPase distinguish among different criteria for conformational change. Biochim. Biophys. Acta 1151:89-98.

52. Sokolov,V.S., A.G.Ayuyan, and H.-J.Apell. 2001. Assignment of charge movements to electrogenic reaction steps of the Na,K-ATPase by analysis of salt effects on the kinetics of charge movements. European Biophysics Journal 30:515-527.

53. Sokolov,V.S., S.M.Stukolov, A.S.Darrnostuk, and H.J.Apell. 1998. Influence of sodium concentration on changes of membrane capacitance associated with the electrogenic ion transport by the Na,K-ATPase. European Biophysics Journal With Biophysics Letters 27:605-617.

54. Friedrich,T., E.Bamberg, and G.Nagel. 1996. Na+/K+-ATPase Pump Currents in Giant Excised Patches Activated by an ATP Concentration Jump. Biophys. J. 71:2486-2500.

55. Friedrich,T. and G.Nagel. 1997. Comparison of Na+/K+-ATPase Pump Currents Activated by ATP Concentration or Voltage Jumps. Biophys. J. 73:186-194.

56. Klodos,I., R.L.Post, and I.B.Forbush. 1994. Kinetic Heterogeneity of Phosphoenzyme of Na,K ATPase Modeled by Unmixed Lipid Phases Competence of the Phosphointermediate. J. Biol Chem. 269:1734-1743.

57. Norby,J.G. and M.Esmann. 1997. The effect of ionic strength and specific anions on substrate binding and hydro lytic activities of Na,K-ATPase. J. Gen. Physiol 109:555-570.

58. Fedosova, N. U, Champeil, P, and Esmann, M. Characterization of the electrostatic component of the nucleotide binding to Na,K-APTase. 19. 8-82002. 10th International Conference on Na,K-ATPase and Related Pumps, Elsinore, Denmark, 2-14 August 2002.

59. Muller,R.U. and A.Finkelstein. 1972. Voltage-dependent conductance induced in thin lipid membranes by monazomycin. J. Gen. Physiol. 60:263284.

60. Muller,R.U. and A.Finkelstein. 1972. The effect of surface charge on the voltage-dependent conductions induced in thin lipid membranes by monazomycin. J. Gen. Physiol 60:285-306.

61. Айтьян,С.Х., М.Л.Белая, and Ю.А.Чизмаджев. 1981. Взаимодействие заряженных бислойных липидных мембран. ДАН СССР 256:990-994.

62. Apell,H.-J. 1997. Kinetic and Energetic Aspects of Na/K-Transport Cycle Steps. In Na/K-ATPase & related Transport ATPases. Stucture, Mechanism, and Regulation. Annals of the New York Academy of Sciences, 221-30.

63. McLaughlin S, Bruder A, Chen S, and Moser C. 1975. Chaotropic anions and surface potential of bilayer membranes. Biochim. Biophys. Acta.

64. Clarke,R.J. and C.Lupfert. 1999. Influence of Anions and Cations on the Dipole Potential of Phosphatidilcholine Vesicles: A Basis for the Hoffmeister Effect. Biophys. J. 76:2614-2624.

65. Malkov, D. Y., Pavlov, К. V., and Sokolov, V. S. Dipole potential drop due to RH-dye on the lipid bilayer and its influence on Na+/K+-ATPase activity. Beauge, L. A., Gadsby, D. C., and Garrahan, P. J. 834, 357-360. 1997. New York, Annals of the New York Academy of Sciences. Na/K-ATPase and related transport ATPases. Structure, mechanism and regulation.

66. Esmann, M. and Fedosova, N. U. Probing the nucleotide site on Na,K-ATPase with eosin. 2002. 10th International Conference on Na,K-ATPase and related Cation Pumps, Denmark.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Аюян, Артем Георгиевич, Москва

1. Norby,J.G. 1987. Na,K-ATPase - Structure and Kinetics - Comparison with Other Ion- Transport Systems. Chemica Scripta 27B:119-129.

2. Vasilets,L.A., T.Ohta, S.Noguchi, M.Kawamura, and W.Schwarz. 1993.Voltage-Dependent inhibition of the Sodium-Pump by External Sodium Species-Differences and Possible Role of the N-Terminus of the AlphaSubunit. Eur. Biophys. J. 21:433-443.

3. G lynn ,LM. 1985. The Na'^,K^-transporting adenosine triphosphatase. In TheEnzymes of Biological Membranes. A.N.Martonosi, editor. Plenum Press, New York. 35-114.

4. Jorgensen,P.L. and J.P.Andersen. 1988. Structural basis fo rE i -E2conformational transitions in Na,K-pump and Ca-pump proteins. J. Membrane Biol. 103:95-120.

5. Ovchinnikov,Y.A., N.M.Arzamazova, E.A.Aristarkhova, N.M.Gevondyan,N.A.Aldanova, and N.N.Modyanov. 1987. Detailed structural analysis of exposed domains of membrane- bound Na ,K ATPase. FEBS Lett. 217:269274.

6. Toyoshima,C., M.Nakasako, H.Nomura, and H.Ogawa. 2002. Crystal structureof the calcium pump of sarcoplasmic reticulum at 2.6 A resolution. Nature 405:647-655.

7. Rice,W.J., H.S.Young, D.W.Martin, J.R.Sachs, and D.L.Stokes. 2001.Structure of Na,K-ATPase at 11-A Resolution: Comparison with Ca-ATPase in E l and E2 States. Biophys. J. 80:2187-2197.

8. Sweadner,K.J. andK.Donnet. 2001. Structural similarities of Na,K,ATPaseand S E R C A , the Ca^^-ATPase of the sarcoplasmic reticulum. Biochem. J. 356:685-704.

9. Jorgensen,P.L. 1974. Isolation of the Na,K-ATPase. Meth. Enzymol. 32:277290.

10. Albers,R.W. 1967. Biochemical aspects of active transport. Annu. Rev.Biochem. 36:727-756.

11. Kaplan,J.H., I.B.Forbush, and J.F.Hoffman. 1978. Rapid photolytic releaseof adenosine 5'-triphosphate from a protected analogue: utilization by the Na :K pump of hunab red blood cell ghosts. Biochemistry 17:1929-1935.

12. Glynn,I.M., Y.Hara, D.E.Richards, and M.Steinberg. 1987. Comparison ofRates of Cation Release and of Conformational Change in Dog Kidney Na,KATPase. J. Physiol. -London 383:477-485.

13. ForbushJ.B. 1988. Rapid Rb release from an occluded state of the Na,Kpump reflects the rate of dephosphorylation or dearsenylation. J. Biol. Chem. 263:7961-7969.

14. Lauger,P. 1991. Electrogenic Ion Pumps. Sinauer associates, Inc.,Sunderland, Massachusets, U S A .

15. Jensen,J.H., J.G.Norby, and P.Ottolenghi. 1984. Binding of sodium andpotassium to the sodium pump of pig kidney evaluated from nucleotidebinding behaviour. J. Physiol. 346:219-241.

16. Homareda,H., H.Matsui, and T.Nozaki. 1987. Interaction of Sodium andPotassium-Ions with Na^,K^-ATPase .3. Cooperative Effect of A T P and Na-ton Complete Release of K+ from E jK . J. Biochem., 101:789-793.

17. De Weer,P., D.C.Gadsby, and R.F.Rakowski. 1988. Voltage Dependenceof theNa-K Pump. Лил. Rev. Physiol 50:225-241.

18. Hansen,U.-P., D.Gradmann, D.Sanders, and C.L.Slayman. 1981.1.terpretation of current-voltage relationships for "active" ion transport systems. I. Steady-state reaction kinetic analysis of Class-1 mechanisms. J. Membrane Biol. 63:165-190.

19. Gadsby,D.C., M.Nakao, and A.Bahinski. 1989. Voltage Dependence ofN a / K Pump Current. Curr. Top. Membr. Tramp. 34:269-288.

20. Lafaire,A.F. and W.Schwarz. 1986. Voltage dependence of the rheogenicNa /K ATPase in the membrane of oocytes of Xenopus Laevis. J. Membrane Biol. 91:43-51.

21. Gadsby,D.C., M.Nakao, A.Bahinski, G.Nagel, and M.Suenson. 1994.Charge movements via the cardiac Na,K-ATPase. Acta Physiol. Scand. Suppl. 607:111-123.

22. Omay,H.S. and W.Schwarz. 1992. Voltage-Dependent Stimulation ofNaVK^-Pump Current by External Cations - Selectivity of Different K"^ Congeners. Biochim. Biophys. Acta 1104:167-173.

23. Nakao,M. and D.C.Gadsby. 1986. Voltage Dependence of NaTranslocation by the Na /K Pump. Nature 323:628-630.

24. Rakowski,R.F. 1993. Charge Movement by the Na /K Pump in XenopusOocytes. J. Gen. Physiol. 101:117-144.

25. Sagar,A. and R.F.Rakowski. 1994. Access Channel Model for the VoltageDependence of the Forward- running Na7K^ Pump. J. Gen. Physiol. 103:869894.

26. Hilgemann,D.W. 1994. Channel-Like Function of the Na ,K Pump Probedat Microsecond Resolution in Giant Membrane Patches. Science 263:14291432.

27. Holmgren,M., J.Wagg, F.Bezanilla, R.F.Rakowski, P.De Weer, andD.C.Gadsby. 2000. Three distinct and sequential steps in the release of sodium ions. Nature 403:898-901.

28. Peluffo,R.D. and J.R.Berlin. 1996. Transient Charge Movement During K+Translocating Steps by the N a Pump. Biophys. J. 70 :SUAM4.

29. Peluffo,R.D. and J.R.Beriin. 1997. Electrogenic K"" transport by the Na^,K''pump in rat cardiac ventricular myocytes. Journal Of Physiology London 501:33-40.

30. Fendler,K., E.Grell , M.Haubs, and E.Bamberg. 1985. Pump CurrentsGenerated by the Na"^,K'*'-ATPase from kidney on Black L ip id Membranes. EMBOJ. 4:3079-3085.

31. Borlinghaus,R., H.-J.Apell, andP.Lauger. 1987. Fast Charge TranslocationAssotiated with Partial Rections of the Na,K-Pump: I. Current and Voltage Transients after Photochemical Release of A T P . J. Membrane Biol. 97:161178.

32. Fendler,K., S.Jarushewski, A.S.Hobbs, W.Albers, and J.P.Froehlich. 1993.Pre-Steady-State Charge Translocation in Na,K-ATPase from Eel Electric Organ. J. Gen. Physiol. 102:631-666.

33. Nagel,G., E.Bamberg, K.Fendler, and E.Grell . 1987. Na^ CurrentsGenerated by the Purifled (Na"^ - K"^)-ATPase on Planar Lipid-Membranes. Biochim. Biophys. Acta 901:239-249.

34. Borlinghaus,R. and H.-J.Apell . 1988. Current transients generated by theNaVK"^-ATPase after an A T P concentration jump - dependence on sodium and A T P concentration. Biochim. Biophys. Acta 939:197-206.

35. Stürmer,W., P.Lauger, I.Wuddel, and H.-J.Apell. 1989. ConformationalTransitions and Charge Translocation by the Na ,K Pump - Comparison of Optical and Electrical Transients Elicited by ATP-Concentration Jumps. Membrane Biol. 110:67-86.

36. Heyse,S., I.Wuddel, H.-J.Apell, and W.Sturmer. 1994. Partial reactions ofthe Na,K-ATPase: determination of rate constants. J. Gen. Physiol. 104:197240.

37. Wuddel,!. and H.-J.Apell . 1995. Electrogenity of the Sodium TransportPathway in the Na,K-ATPase Probed by Charge-Pulse Experiments. Biophys. J. 69:909-921.

39. Соколов,В-С., К.В.Павлов, К.Н.Джанджугазян, and Е.Бамберг. 1992.Изменение емкости и проводимости модельной мембраны при функционировании Ма,К-АТФазы. Биологические мембраны 9:961-969.

40. Post, R. L . and Suzuki, К. А Hoffmeister Effect on the Phosphoenzyme ofNa,K-ATPase. De Weer, P. and Kaplan, J. H . 202-209. 1991. New York, Rockfeller University Press. The Sodium Pump: Structure, Mechanism and Regulation.

41. Apell ,H.-J. , R.Borlinghaus, and P.Lauger. 1987. Fast Charge TranslocationAssotiated with Partial Rections of the Na,K-Pump: II. Microscopic Analysis of Transient Currents. / Membrane Biol. 97:179-191.

42. Sokolov,V.S., H.-J.Apell, J.E.T.Corrie, and D.R.Trentham. 1998. Fasttransient currents in the Na,K-ATPase induced by A T P concentration jumps from DMB-caged A T P . Biophys. J. 74:2285-2298.

43. Cacace,M.G., E.M.Landau, and J.J.Ramsden. 1997. The Hofmeister series:salt and solvent effects on interfacial phenomena. Quart. Rev. Biophys. 30:241-277.

44. Buhler,R., W.Sturmer, H.-J.Apell, and P.Lauger. 1991. Chargetranslocation by the Na,K-pump: I. Kinetics of local field changes studied by time-resolved fluorescence measurements. J. Membrane Biol. 121:141-161.

45. Apell ,H.J. and S.J.Karlish. 2001. Functional properties of Na,K-ATPase,and their structural implications, as detected with biophysical techniques. J. Membrane Biol. 180:1-9.

46. Babes,A. and K.Fendler. 2000. Na^ Transport, and the E1P-E2PConformational Transition of the NaVK^-ATPase. Biophys. J. 19:2551-251 \.

47. Lu ,C. -C. , A.Kabakov, V.S.Markin, S.Mager, S.Frazier, G.A.Frazier, andD.W.Hilgemann. 1995. Membrane Transport Mechanisms Probed by Capacitance Measurements with Megahertz Voltage Clamp. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1995:11220-11224.

48. Clarke,R.J., D.J.Kane, H.-J.Apell , M.Roudna, and E.Bamberg. 1998.Kinetics of Na(+)-dependent conformational changes of rabbit kidney Na+,K(+)-ATPase. 5zo;?/2;;5, J. 75:1340-1353.

49. Ganea,C., A.Babes, C.Lupfert, E.Grell , K.Fendler, and R.J.Clarke. 1999.Hofmeister effects of anions on the kinetics of partial reactions of the Na+,K+-ATPase. Biophys. J. 77:267-281.

50. Pratap,P.R. and J.D.Robinson. 1993. Rapid kinetic analyses of the NaVK"^ATPase distinguish among different criteria for conformational change. Biochim. Biophys. Acta 1151:89-98.

51. Sokolov,V.S., A.G.Ayuyan, and H.-J.Apell . 2001. Assignment of chargemovements to electrogenic reaction steps of the Na,K-ATPase by analysis of salt effects on the kinetics of charge movements. European Biophysics Journal 30:515-527.

52. Friedrich,T., E.Bamberg, and G.Nagel. 1996. Na^/K^-ATPase PumpCurrents in Giant Excised Patches Activated by an A T P Concentration Jump. Biophys. J 71:2486-2500.

53. Friedrich,T. and G.Nagel. 1997. Comparison of Na^K^-ATPase PumpCurrents Activated by A T P Concentration or Voltage Jumps. Biophys. J. 73:186-194.

54. Klodos,I., R.L.Post, and I.B.Forbush. 1994. Kinetic Heterogeneity ofPhosphoenzyme of Na ,K ATPase Modeled by Unmixed L ip id Phases Competence of the Phosphointermediate. / . Biol Chem. 269:1734-1743.

55. Norby,J.G. and M.Esmann. 1997. The effect of ionic strength and specificanions on substrate binding and hydro lytic activities of Na,K-ATPase. J. Gen. Physiol. 109:555-570.

56. Fedosova, N . U , Champeil, P, and Esmann, M . Characterization of theelectrostatic component of the nucleotide binding to Na,K-APTase. 19. 8-82002. 10th International Conference on Na,K-ATPase and Related Pumps, Elsinore, Denmark, 2-14 August 2002.

57. Muller ,R.U. and A.Finkelstein. 1972. Voltage-dependent conductanceinduced in thin lipid membranes by monazomycin. / . Gen. Physiol. 60:263284.

58. Muller ,R.U, and A.Finkelstein. 1972. The effect of surface charge on thevoltage-dependent conductions induced in thin lipid membranes by monazomycin. J. Gen. Physiol. 60:285-306.

59. Айтьян,С.Х., М.Л.Белая, and Ю.А.Чизмаджев. 1981. Взаимодействиезаряженных бислойных липидных мембран. Д Л Я СССР 256:990-994.

60. Apell ,H.-J . 1997. Kinetic and Energetic Aspects of Na/K-Transport CycleSteps. In Na/K-ATPase & related Transport ATPases. Stucture, Mechanism, and Regulation. Annals of the New York Academy of Sciences, 221-30.

61. McLaughlin S, Bruder A , Chen S, and Moser 1975. Chaotropic anionsand surface potential of bilayer membranes. Biochim. Biophys. Acta.

62. Clarke,R.J. and C.Lupfert. 1999. Influence of Anions and Cations on theDipole Potential of Phosphatidilcholine Vesicles: A Basis for the Hoffmeister Effect. Biophys. J. 76:2614-2624.

63. Esmann, M . and Fedosova, N . U . Probing the nucleotide site on Na ,KATPase with eosin. 2002. 10th International Conference on Na,K-ATPase and related Cation Pumps, Denmark.