Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Липосомальные вакцины в промышленном птицеводстве
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология
Автореферат диссертации по теме "Липосомальные вакцины в промышленном птицеводстве"
СУХИНИН АЛЕКСАНДР АЛЕКСАНДРОВИЧ
ЛИПОСОМАЛЬНЫЕ ВАКЦИНЫ В ПРОМЫШЛЕННОМ ПТИЦЕВОДСТВЕ
03.00.23 - биотехнология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2004
Работа выполнена в ФГОУ ВПО Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины и в ФГОУ ВПО Санкт-Петербургском государственном технологическом институте (технический университет).
Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор Соколов Владимир Дмитриевич
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Мирзаев Микаиль Нурбагандович доктор биологических наук, профессор Хованских Александр Егорович доктор медицинских наук, профессор Смородинцев Александр Анатольевич
Ведущая организация: ФГУП СПбНИИВС и предприятие по производству бактерийных препаратов
Защита состоится 10 сентября 2004 года в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д 212.230.04 при ФГОУ ВПО Санкт-Петербургском государственном технологическом институте (техническом университете) по адресу: 190013, Санкт-Петербург, Московский пр-т, 26.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского государственного Технологического института (технического университета). Замечания и отзывы по данной работе, заверенные печатью, в одном экземпляре, просим направлять по адресу: 190013, Санкт-Петербург, Московский пр-т, 26, СПбТИ (ТУ), Ученый Совет.
Автореферат разослан_2004 года
Ученый секретарь диссертационного совета
Актуальность работы. В комплексе мер борьбы с инфекционными заболеваниями, включающими соблюдение ветеринарно-санитарных правил, условий содержания и кормления, вакцинопрофилактика занимает ведущее место. Применение живых и инактивированных вакцин обеспечивает надежную защиту птиц от ньюкаслской болезни (НБ), инфекционного бронхита кур (ИБК), синдрома снижения яйценоскости 76 (ССЯ-76), инфекционной бурсальной болезни (ИББ) и других инфекций (Хохлачев О.Ф., 1993; Алиев А.С., 1993; Смоленский В.И., 1999; Борисов А.В., 2000, Kinde H. et al, 1991; Nakamura К et al 1992, Lukert P.D., Saif Y.M., 1997; Alexander D.J., 1998).
Широко используется метод ассоциированной вакцинации птиц инактивированными масляно-эмульсионными вакцинами (Рождественский И.К. с соавт., 1998; Parsons D. et al, 1992, Bidin Z. et al, 1998).
Считается, что безопасность инактивированных вакцин достаточно гарантирована. Однако при их парентеральном применении нередки случаи появления общей и местной воспалительной реакции на месте введения с последующим развитием локальных абсцессов и гранулем (Медуницын Н.В., 1999; Edelman R., 1980; Vansdow RA, 1987), гиперсенсибилизации организма и активации аутоиммунных процессов.
Поэтому не случаен поиск более совершенных способов решения проблем иммунизации птиц, улучшения способа доставки антигена и обеспечения большего удобства в процессе вакцинации. Актуальной также остается разработка лекарственных форм вакцин, не вызывающих поствакцинальных осложнений.
Известно, что введение инактивированных вакцин другими методами, в частности энтеральным, мало эффективно. И, тем не менее, интерес у исследователей к этому направлению исследований не снижался. Поэтому успех, достигнутый в этом направлении не случаен. Учеными НИИ гриппа РАМН, ГНЦ ГосНИИОЧБ, НИИЭМ им.Л.Пастера (г.Санкт-Петербург) успешно осуществлено испытание сухой липосомальной инактивированной вакцины для перорального применения против гриппа человека (Кузнецов O.K. и соавт., 1998, Кузнецов О.И. и соавт., 1999; Avtushcnko S.S. et al.,
1998). Использование в работе липосомальных технологий, широко применяемых в разных областях медицины, позволило открыть новое, перспективное направление в науке, позволяющее конструировать лекарственные формы вакцин на основе наночастиц (Каплун А.П. и соавт.,
1999).
Многочисленные клинические испытания липосомальных препаратов, показали их безопасность для организмов животных и человека.
Учитывая, что в настоящее время на мировом рынке уже появилось
более десяти тысяч липосомальных (против
г '¡•'Ос. ЛЛЦИОМАЛЬНДЗ
библиотека
C.timpiypr tri-i-
Oi тЦихЭЭЪ*
ньюкаслской болезни и реовирусной инфекции - лицензия США; вакцина против ИЛТ - Россия и др.) и не меньшее количество находится на различных стадиях клинических испытаний, создание липосомальных инактивированных вакцин является актуальной задачей и представляет интерес для науки и для отечественного промышленного птицеводства.
Однако следует учитывать, что эффективность вакцинопрофилактики зависит не только от качества вакцины, но и от состояния иммунной системы птицы. Часто действующие стресс-факторы, в том числе технологическая перегруппировка поголовья в 120 дневном возрасте, оказывают негативное влияние на ее функциональную активность. Поэтому поиск стресспротективных препаратов и введение их в состав вакцинных композиций - одна из задач науки и практики, решение которой открывает новые пути к более эффективной профилактике многих заболеваний.
Цель и задачи исследований. Цель исследований - разработать новые средства специфической профилактики наиболее распространенных вирусных болезней птиц и предложить комплексные вакцинирующие композиции, имеющие в своем составе вещества, обладающие стресспротективным и иммуностимулирующим эффектом. В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:
— разработать четыре моновалентные липосомальные вакцины против НБ, ИББ, ИБК и ССЯ-76;
— разработать ассоциированную форму вакцины против НБ, ИББ, ИБК и ССЯ-76;
— разработать альтернативную форму применения указанных вакцин: сухую -для энтерального введения;
— изучить влияние этимизола на биохимические и иммунобиологические показатели крови цыплят при стрессе и его иммуностимулирующие свойства, ввести его в состав вакцины;
— разработать технологическую схему приготовления указанных вакцин и подобрать методики контроля и схемы применения;
— испытать вакцинные композиции в лабораторных и производственных условиях;
— разработать научно-техническую документацию на опытно-промышленное производство вакцин.
Научная новизна работы. Впервые разработана липосомальная инактивированная вакцина против НБ, ИББ, ИБК, ССЯ-76, отличающаяся формой выпуска и методом назначения для иммунизации птиц.
Разработан метод получения сухого вакцинного препарата выполненного в виде микрогранул, внутренняя часть которых содержит липосомальную везикулу с антигеном.
Разработан технологический регламент производства вакцин и методы контроля их качества.
Проведено сравнительное изучение иммунобиологических свойств вакцин при энтеральном, внутримышечном и подкожном способах введения.
Научно обоснованы и экспериментально подтверждены иммунизирующие дозы, способы введения и схемы применения вакцин.
Предложены комплексные вакцинирующие композиции, имеющие в своем составе этимизол, обладающий стресспротективными и иммуностимулирующими свойствами.
Практическая ценность работы. Результаты исследований, изложенные в диссертации, использованы для разработки:
шактивована лшосомальна вакцина "ЛШОСОМВАК" (моновалент та асоцшоваш форми) проти ньюкаслсь^ хвороби, шфекцшного бронхиу курей, iнфекцiйно i бурсальноi хвороби, синдрому зниження яйценоскость 76, техшчш умови утверждены Мiнiстерством аграрно! полiтики Украiны (ТУ У24.4.24792 862.597 - 2001);
настанова по застосуванню iнактивованоi лiпосомальноi вакцини "Л1ПОСОМВАК" (моновалент та асоцiйованi форми) проти ньюкаслсь^ хвороби, iнфекцiйного бронхиу курей, шфекщйно! бурсальноi хвороби, синдрому зниження яйценоскость76, утверждены 21.09.2001 г. Державшм департаментом ветеринарноi медицини;
наставления по профилактике транспортного стресса у цыплят с помощью аэрозолей этимизола, утвержденных ГУВ Госагропрома СССР 5 сентября 1988 года.
инструкции по изготовлению и контролю сухой формы липосомальной, инактивированной вакцины против ССЯ-76, НБ, ИББ и ИБК (утверждена ректором СПбГАВМ 10.01.01г.);
инструкции по изготовлению и контролю жидкой формы липосомальной, инактивированной вакцины против ССЯ-76, НБ, ИББ и ИБК (утверждена ректором СПбГАВМ 10.01.01г.);
методических рекомендаций по изготовлению ксеногенных сывороток к Т- и В-лимфоцитам птиц (утверждено на методическом совете СПбГАВМ, протокол № 1, от 20.11.2002 г.);
технических условий на сухую и жидкую формы липосомальной, инактивированной вакцины "ЛИПОСОМВАК" против ССЯ-76, НБ, ИББ и ИБК (находятся на рассмотрении в Департаменте ветеринарии МСХиП РФ);
наставления по применению сухой и жидкой формы липосомальной, инактивированной вакцины "ЛИПОСОМВАК" против ССЯ-76, НБ, ИББ и ИБК (находятся на рассмотрении в Департаменте ветеринарии МСХиП РФ).
Основные положения, выносимые на защиту. • Создание нового класса вакцин для специфической профилактики вирусных болезней птиц (НБ, ИББ, ИБК и ССЯ-76):
технологический регламент производства липосомальных инакти-вированных вакцин;
сравнительное изучение иммунобиологических свойств вакцин при энтералыюм, внутримышечном и подкожном способах введения. • Создание вакцинных композиций, включающих препарат, обладающий стресс-протективным и иммуностимулирующим эффектом.
Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-производственной конференции молодых ученых и аспирантов Всесоюзного НИВИ птицеводства (1984 г.); Всесоюзной научно-производственной конференции "Система мероприятий по обеспечению эпизоотического благополучия и рентабельности птицеводческих предприятий" (Ломоносов, 1985 г.); методическом и ученом советах Всесоюзного НИВИ птицеводства (1986 г.); на научной конференции "Современные средства и методы борьбы с заразными болезнями с/х птиц" (Ленинград, 1987 г.); на 1-ой межвузовской науч.-практ. конф. "Новые фармакологические средства в ветеринарии" (Ленинград, 1989 г.); научной конференции "Современные методы исследований в животноводстве и птицеводстве" (Ленинград, 1989 г.); научной конференции "Комплексная система ветеринарных мероприятий в птицеводстве - резерв повышения эффективности производства" (Ломоносов, 1989 г.); научной конференции "Фармакология и токсикология новых лекарственных средств и кормовых добавок в ветеринарии" (Ленинград, 1989 г.); на международной конференции, посвященной 30-летию Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института патологии, фармакологии и терапии 'Теоретические и практические аспекты возникновения и развития болезней животных и защита их здоровья в современных условиях" (Воронеж, 2000 г.), 25 международной научно-практической конференции "Новые фармакологические средства в ветеринарии", посвященной 300-летию Санкт-Петербурга (С.-Петербург, 2003 г.); IV Украшс^ конференций по птах^вництву з мiжнародною участю (Харюв, 2003 г.); межвузовской научной конференции профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов С.-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины (2001г., 2002 г., 2003 г., 2004 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 32 работы в том числе 2 монографии, получено 3 авторских свидетельства и 2 патента, в которых изложено основное ее содержание.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 288 страницах и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, выводов, практических предложений и приложения. Содержит 42 таблицы, 16 рисунков и 13 фотоснимков. Список использованной литературы содержит 476 наименований работ, в том числе отечественных - 137, иностранных — 339. В приложении представлены копии документов, подтверждающих достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.
Пользуясь случаем, автор сердечно благодарит научного консультанта
профессора В.Д.Соколова, академика РАСХН Р.Н.Коровина, профессора А.И.Гинака за неоценимую помощь при выполнении диссертации, и всех кто оказывал помощь в организации и проведении исследований по теме работы, а также сотрудников, которые перечислены в качестве соавторов в списке публикаций по теме диссертации.
В выполнении раздела электронно-микроскопических исследований принимали участие и оказывали практическую и консультативную помощь сотрудники НИИ гриппа РАМН Сухинин В.П., Сироткин А.К., за что автор приносит им сердечную благодарность.
II: СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Животные и эмбрионы. В экспериментальных исследованиях были использованы 8-10-сут. куриные эмбрионы, а также цыплята разных возрастных групп кроссов "Радонит", "ИЗА-15", "Бройлер-6". Птиц содержали в виварии, в клеточных батареях типа БКМ-ЗБ. Кормление осуществляли согласно "Рекомендациям по нормативному кормлению сельскохозяйственной птицы " (МСХ СССР, 1983).
Производственные испытания проводили на птицефабриках Российской Федерации и Украины.
Для экспериментальных и производственных исследований подопытные и контрольные группы формировали по принципу аналогов.
Для проведения исследований использовали инактивированный антиген вируса НБ, штамм "Ла-Сота" (титр до инактивации) - 9.0 ^ ЭИД5о; инактивированный антиген вируса ИББ, штамм "52/70М" (титр до инактивации) - 5,5 ^ ЭИД5о; инактивированный антиген вируса ИБК, тип Массачусетс, штамм "Чапаевский" (титр до инактивации) - 7,0 ^ ЭИД50; инактивированный антиген вируса ССЯ-76, штамм В8/78 - 512-2048 ГАЕ/05 мл. Хранение вирусных штаммов маточной расплодки осуществляли в лиофилизированном состоянии при температуре -30°С.
Для проведения диагностических исследований использовали наборы для выявления антител к вирусам НБ, ИББ, ИБК, ССЯ-76 иммуноферментным методом, зарегистрированные в РФ; диагностический набор для идентификации вирусов болезни Ньюкасла и гриппа птиц, зарегистрированный в РФ (ТУ 10-09-20-89); набор для диагностики инфекционной бурсальной болезни в РДП (ТУ 10.07-261-91); набор для диагностики ССЯ-76 в РТГА (ТУ 10.07.138-89).
При ретроспективном эпизоотологическом анализе распространения ССЯ-76, ИББ, ИБК и НБ в Российской Федерации применяли эпизоотологический метод, утвержденный ГУВ МСХиП и методику,
разработанную на кафедре эпизоотологии и инфекционных болезней животных СПбГАВМ, используя ветеринарные отчеты и производственные документы птицеводческих хозяйств.
Основной компонент липосом — фосфатидилхолин (ФХ) получали из сои и семян подсолнечника по методу предложенному Пейном с соавт. (1986). Качество ФХ контролировали согласно требованиям Минздрава СССР, предъявляемым к этому препарату. Анализ состава выделенных фосфолипидов проводили общепринятым методом.
Контроль стерильности липосомальных суспензий осуществляли по ГОСТ 28085-89.
Размеры и структуру липосом изучали под электронным микроскопом. Ультратонкие срезы, полученные на ультрамикротоме Ultracut (Reichert, Austria), контрастировали уранилацетатом натрия и цитратом свинца. Препараты просматривали на просвечивающем электронном микроскопе JEM-IOOS фирмы JEOL (Япония) при инструментальном увеличении 10000 - 50 000. Фотографирование проводили на пленку ФТ-41МД.
В зависимости от условий эксперимента опытные серии жидкой и сухой форм моновалентных и ассоциированных инактивированных вакцин были приготовлены из антигенов вирусов ССЯ-76, НБ, ИББ, ИБК (или их сочетаний), инактивированных формальдегидом или 0,3% раствором теотропина А-24, и соединенных с адъювантом - липосомами или гелем гидроокиси алюминия. Стерильность, степень инактивации вируса, стабильность, безвредность и иммуногенную активность полученных препаратов определяли общепринятыми методами.
Транспортный стресс у цыплят в эксперименте воспроизводили с помощью шуттелирования. С этой целью цыплят помещали в открытую коробку, закрепленную в шутгель-аппарате, и встряхивали в течение 2 часов, при интенсивности 120 колебаний в минуту.
Содержание гормона кортикостерона в крови определяли радиоиммунологическим методом.
Модель тимэктомии (снижение функции тимуса) у 3-х дневных цыплят воспроизводили путем инъекции гидрокортизона. Препарат вводили однократно интраперитонеально, в дозе 50 мг/кг живой массы. Подавление нормального развития бурсы Фабрициуса вызывали циклофосфаном. Препарат инъецировали в течение 3-х дней интраперитонеально в дозе 60 мг/кг живой массы. Контролем служили интактные цыплята, получавшие изотонический раствор натрия хлорида. Этимизол вводили через 2 часа после последнего введения иммунодепрессанта 3-х кратно с интервалом 24 часа. За птицами вели наблюдение в течение 20 дней.
Интенсивность синтеза нуклеиновых кислот оценивали по включению 3Н-тнмидина или 3Н-уридина, которые вводили внутрибрюшинно цыплятам за 3 часа до убоя (в 0,85 % растворе NaCl) из расчета 10 мкКи на 100 г массы тела. И1ггенсивность синтеза белка определяли по включению 14С-глицина,
который вводили тем же путем из расчета 10 мкКи на 100 г массы тела за 2 часа до убоя цыплят. Все радио-изотопы использовали в конечной концентрации 37 МБк/мл. Исследуемые ткани сразу после их извлечения' гомогенизировали в жидком азоте. Содержание нуклеиновых кислот в тканях определяли спектрофотометрическим методом, белка - спектро-фотометрически после добавления к гидролизату раствора Бенедикта, а интенсивность их синтеза — по включению 14С-глицина. Радиоактивность определяли в жидкостносцинтилляционном счетчике "Mark III" (США).
Количество иммунокомпетентных клеток в органах определяли методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием специфических иммунных сывороток к Т- и В-лимфоцитам птиц, полученных по разработанной нами технологии. Абсолютное содержание лимфоцитов вычисляли, исходя из абсолютного содержания лимфоцитов в 1 мкл крови.
Форменные элементы крови подсчитывали в мазках, окрашенных по Паппенгейму.
Уровень глюкозы определяли ортотолуидиновым методом.
Достоверность полученных результатов определяли методами математической статистики, предложенными Урбахом В.Ю.(1975), Ашмариным И. П. и Воробьевым А.А. (1962) и с помощью программы Microsoft Excel 97.
2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 2.2.1. Ретроспективный эпизоотологический анализ распространения ССЯ-76, ИББ, ИБК и НБ в Российской
Федерации
Для определения степени распространения ССЯ-76, ИББ, ИБК и НБ в РФ был проведен анализ отчетных данных и статистических обзоров Главного Управления ветеринарии по птицехозяйствам РФ, материалы клинико-эпизоотологических обследований хозяйств, наблюдаемых по данным заболеваниям. Установлено, что наиболее неблагополучная ситуация за последние годы складывалась по ИББ. Количество неблагополучных пунктов, зарегистрированных в РФ, увеличилось с 7, в 1994 году, до 20, в 1999 году. Наибольшее количество заболевшей птицы зарегистрировано в 1994 году, и составило 6,8 млн.голов, из которых 707 тыс.голов (10,4%) пало. В последующие годы, несмотря на увеличение количества неблагополучных хозяйств, наблюдается спад заболеваемости. Это связано с появлением на рынке качественных ветеринарных препаратов. Однако несмотря на положительную тенденцию распространения болезней, ситуация остается напряженной, о чем свидетельствует увеличение
количества провакцинированной птицы. Если в 1997 году было проиммунизировано 407,1 млн. гол., то в 1999 году - этот показатель возрос до 548,3 млн.голов.
Главным резервуаром вируса является больная и переболевшая птица. Чаще всего заболевание в хозяйствах возникает в результате заноса высоковирулентного вируса из других неблагополучных пунктов.
Достаточно напряженная ситуация в России складывается и по НБ. Пик заболеваемости приходится на 1996-97 годы, когда было зарегистрировано 20 неблагополучных пунктов. Количество заболевшей птицы составило 180 тыс.голов, из которых 65 тыс. (36%) — пало.
Анализ данных показывает, что в среднем последнее десятилетие против НБ в РФ вакцинируется около 700,0 млн.голов/год. Это больше чем против ИББ на 46% в 1997 году, на 32% - 1998 году, на 20% - 1999 году, и в 6-8 раз больше чем против ССЯ-76. В последнем случае такой разрыв объясняется применением при данном заболевании только инак-тивированной вакцины на взрослом поголовье и достаточно благополучной ситуацией, в то время как против НБ и ИББ кроме инактивированных вакцин применяются живые.
Отмечается тенденция повышения количества обработанной птицы против ИБК. Так в 1999 году было провакцинировано птиц на 33% больше по сравнению с 1998 г.
Таким образом, ситуация по выше перечисленным инфекциям далека от разрешения, и поиск способов усовершенствования вакцин и методов вакцинации остается актуальной научной задачей.
2.2.2. Технологический регламент изготовления инактивированных, моновалентных и ассоциированных липосомальных вакцин против ССЯ-76, НБ, ИББ и ИБК
В течение последнего десятилетия теория и практика производства вакцин достигли значительных успехов. Было внедрено современное технологическое оборудование, новые группы вспомогательных материалов и формообразующих компонентов. Это позволило конструировать новые лекарственные формы, повышать иммуногенную активность большинства из применяемых в настоящее время в ветеринарной практике инак-тивированных вакцин.
Известно, что инактивированные антигены в сочетании с адъювантами обладают более выраженной эффективностью, чем их водные растворы, и поэтому усилия многих исследователей, работающих в области создания и производства вакцин, направлены на поиск высокоэффективных адъювантов и удачных сочетаний компонентов в вакцинах.
В связи с тем, что фармакотерапевтическая эффективность препаратов определяется процессами их всасывания, распределения и элиминации
(выведения) из макроорганизма, мы уделяли особое внимание изучению этих процессов.
При разработке состава инактивированной вакцины мы исходили из следующих основных требований: вакцина должна быть стабильной, обладать выраженным адъювантным эффектом, сочетаемостью антигена и адъюванта, обеспечивающих создание высокоиммуногенного и вместе с тем безвредного для птицы вакцинного комплекса, её компоненты должны быть доступны, экономически приемлемы и технологичны.
Основной задачей при этом было создание такой формы препарата, которая позволила бы максимально повысить эффективность лекарственной композиции и до минимума снизить возможность нежелательного действия ее на организм.
Нами был отработан технологический регламент изготовления жидкой и сухой форм инактивированных моновалентных и ассоциированных липосомальных вакцин против ССЯ-76, НБ, ИББ и ИБК (рис. 1). Одна для инъекционного пути введения (внутримышечно или подкожно), другая — для энтерального (при выпаивании).
В качестве основного компонента для построения липосом мы использовали фосфолипиды, и в первую очередь фосфатидилхолин. До настоящего времени основным сырьем для его получения в промышленности был желток диетических куриных яиц. Однако использование сырья животного происхождения при производстве биологических препаратов нежелательно из-за возможной контаминации инфекционными агентами. Поэтому мы остановили свой выбор на сырье растительного происхождения. В основе применяемой нами технологии лежит способ изготовления сухих пролипосом, предложенных Пейном и соавт (1986). Данный метод заключается в высушивании фосфолипидов на инертном носителе (сахароза, лактоза, сорбит). После добавления воды к высушенному порошку, частицы которого покрыты пленками фосфолипидов (сухими пролипосомами), последние набухают, носитель быстро растворяется, и в этот момент из фосфолипидов образуются одно-или многослойные замкнутые везикулы — липосомы. В отличие от других способов, данная методика позволила нам получить эффективные липосомальные препараты инактивированных антигенов.
Для приготовления липосом мы также использовали фосфолипиды семян подсолнечника - препарат "Витол", производства "НПФ Росма-плюс", г.Краснодар, содержащий 25% фосфатидилхолина, 24% фосфатидил-этаноламина, 17% глицерина и др. компоненты. Кроме «Витол-холина» для получения липосом использовали соевый лецитин «Lipoid S-100», Германия.
Экспериментальные серии жидких вакцин готовили следующим образом: навеску фосфолипидов растворяли в хлороформе, одновременно добавляли антиокислители - бутилоксианизол и а-токоферола ацетат в количестве 0,02% и 0,01% от общего количества липидов, соответственно.
Рис. 1 - Основные стадии получения липосомальных вакцин
Смесь выдерживали, периодически помешивая, до полного растворения фосфолипидов, которые брали из расчета содержания их в готовом липосомальном препарате не менее 10%.
После полного растворения липидов колбу присоединяли к роторному испарителю и на водяной бане при температуре +40°С, и пониженном давлении, создаваемым водоструйным насосом (4+2 мм рт.ст.), проводили выпаривание хлороформа. Подогрев регулировали так, чтобы не происходило сильное кипение хлороформа. После полного удаления органического растворителя на стенках колбы образовывалась тонкая пленка фосфолипидов, которую продували газообразным азотом или аргоном для предотвращения окисления липидов. В колбу с пленкой добавляли антиген, растворенный в фосфатном буфере рН 7,2-7,4, подогретый до + 38-40°С, и выдерживали в течение 2 часов в термостате при температуре + 38°С для набухания фосфолипидов. После этого в колбу вносили стерильные стеклянные шарики и встряхивали в течение нескольких минут для полного снятия пленки со стенок колбы и получения гомогенной суспензии. Полученную суспензию обрабатывали на ультразвуковом дезинтеграторе в атмосфере азота и исследовали в электронном микроскопе.
В результате мы получили липосомы с однородной структурой и размерами. Осадок образовывался в течение длительного времени хранения и легко ресуспензировался при встряхивании. При хранении препарата в течение 12 месяцев изменений внешнего вида суспензии, количества и качества липосом мы не обнаруживали.
Хорошая проницаемостью липидных мембран для молекул воды и снижение этого показателя при затвердевании их компонентов обеспечило нам возможность лиофильного высушивания липосом с последующей регидратацией, позволяющей не только получать исходную форму, но и включать в их внутренний объем водную фазу с растворенными в ней антигенами вирусов.
При получении сухой формы вакцины фосфолипиды подсолнечника мы помещали в колбу с притертой пробкой, куда добавляли хлороформ, бутилоксианизол и а-токоферола ацетат. Бутилоксианизол составлял 0,02%, а-токоферол ацетат 0,01% от количества фосфолипидов в препарате. Смесь выдерживали, периодически помешивая, до полного растворения фосфолипидов.
Раствор фосфолипидов в хлороформе мы смешивали с наполнителями полиглюкином и сорбитом, у которых предварительно была удалена остаточная влажность. Смесь тщательно перемешивали и колбу присоединяли к роторному испарителю. Проводили выпаривание хлороформа при таких же условиях, как и в предыдущей методике. Затем, колбу с полученным порошком помещали на 1 час в вакуумный сушильный шкаф (температура 36-40°С) для дальнейшей отгонки хлороформа.
По окончании высушивания вакуумный шкаф заполняли азотом или аргоном. Сухую смесь фосфолипидов с наполнителями тщательно измельчали в фарфоровой ступке до получения мелкодисперсного порошка, состоящего из наполнителя, частицы которого покрыты фосфолипидными пленками (пролипосомами). Полученный сухой мелкодисперсный порошок помещали в колбу, приливали воду и жидкий антиген. Туда же вводили защитные добавки и смесь тщательно перемешивали до получения однородной суспензии, разливали по стерильным металлическим поддонам (при изготовлении большого количества препарата) или в стеклянные флаконы, которые устанавливали на охлажденные полки сублимационной установки фирмы "Крист" ( Германия) и проводили лиофильное высушивание препарата.
2.2.3. Изучение механизма взаимодействия липосом с
клетками
В настоящее время широкий круг биологов, вирусологов, онкологов, иммунологов и специалисты многих других научных направлений используют липосомы в лабораторной и клинической практике.
В тоже время, необходимо отметить, что механизмы взаимодействия липосом с клетками млекопитающих и птиц недостаточно изучены. По литературным данным до сих пор не установлено, с какими структурами на поверхности клетки взаимодействуют липосомы. Нет достаточно адекватных методов изучения липосомоклеточных взаимодействий. Такой разрыв между фундаментальными исследованиями и практическим использованием липосом значительно тормозит прогресс познания в этой области. Результаты, полученные нами в процессе изучения взаимодействия липосом с перитонеальными макрофагами (адсорбция липосом на клеточной поверхности, слияние липосом с плазматической мембраной клетки, обмен липидамн между мембранами липосом и клеток, эндоцитоз липосом), легли в основу настоящей работы.
Фагоцитоз липосом изучали на перитонеальных макрофагах. Для этого липосомальный препарат разводили фосфатным буфером рН 7,4 в соотношении 1: 10 и в количестве 1мл внутрибрюшинно вводили подопытным мышам или цыплятам. Перитонеальные макрофаги получали через 15 мин, 30 мин, 60 мин и 3 часа после введения препарата путем промывания брюшной полости средой Игла, содержащей 200 мМ глютамина и 20 ЕД/мл гепарина. Перитонеальную жидкость центрифугировали в течение 20 мин. Осадок ресуспендировали в питательной среде до концентрации 10 кл/мл и фиксировали 3,5% раствором глютарового альдегида. В качестве контроля использовали интактные пернтонеальные макрофаги. Из фиксированных препаратов готовили срезы, которые изучали под электронным микроскопом.
Черсз 15 мин после введения липосом в брюшную полость последние адсорбировались по всей поверхности макрофага. При этом важно отмстить, что часть липосом уже за этот промежуток времени фагоцитировались макрофагами. На фотографиях хорошо видно формирование на плазматической мембране выпячивания, которое постепенно замыкаясь, захватывает липосомы. То есть, при эндоцитозе липосом макрофагами целые везикулы, заключенные в эндоцитозные пузырьки, транспортируются через цитоплазму к лизосоме.
Через 30 мин, все прикрепившиеся к клеточной мембране липосомы интернализировались в цитоплазму и сливались с лизосомами с образованием фагосом. При этом интересно отметить, что в цитоплазму включались не только единичные липосомы, но и скопления (кластеры) липосомальных везикул.
Электронно-микроскопическая картина, фагоцитоза через 1 час инкубации in vivo практически не отличалась от таковой при 30-минутной экспозиции.
Через 3 часа инкубации картина фагоцитоза существенно менялась. Поглощенные липосомы за этот период времени утрачивали внешние контуры и на их месте оставались «тени» липосом. Этот факт свидетельствует о том, что липосомы после слияния их с лизосомами подвергались биодеградации под действием липолитических ферментов макрофага.
Таким образом, процесс фагоцитоза липосом включает следующие стадии: адсорбцию частиц на наружной мембране макрофага, поглощение липосомальных везикул, переваривание биоматериала.
Учитывая высокую способность липосом поглощаться макрофагами, мы полагаем, что фагоцитоз является одним из важнейших механизмов взаимодействия липосом с клетками.
2.2.4. Моновалентные липосомальные вакцины против НБ,
ИББ, ИБК и ССЯ-76
Липосомальную форму, содержащую инактивированные антигены НБ, ИББ, ИБК и ССЯ-76 готовили по методике, описанной выше.
Для получения жидкой формы препарата полученную смесь тщательно перемешивали, разливали во флаконы, закрывали резиновыми пробками и закатывали колпачками.
Для получения сухой формы препарата полученную смесь тщательно перемешивали, разливали в поддоны из нержавеющей стали слоем высотой 3-10 мм или во флаконы, лиофилыю высушивали и расфасовывали во флаконы.
На каждом этапе технологического процесса сублимационного высушивания биопрепаратов мы проводили исследовательские работы для
оптимизации технологических режимов с целью гарантированного получения конечного продукта, обладающего требуемыми физико-химическими характеристиками, а также исходной биологической активностью и иммуногенностью в процессе их транспортирования и хранения.
При создании (конструировании) сухого биопрепарата особое внимание обращали на исходное содержание сухого вещества в высушиваемом материале. Данный параметр является критическим как в процессе его непосредственного сублимационного обезвоживания, так и при последующей регидратации конечного продукта.
Вакцинный препарат оптимального качества' мы получали при содержании в нем 10-15% сухого остатка. Поэтому апробируемые нами защитные среды содержали компоненты в количестве, не превышающем этого значения.
В процессе исследований ингредиентного состава липосом были изучены их физико-химические свойства, стабильность, безвредность и биологические свойства, что позволило предложить использовать их в качестве адъюванта в составе вакцин.
В предварительных опытах была подтверждена безвредность и ареактогенность суспензии названного состава для лабораторных животных. При контроле липосом установлено, что препарат сохранял высокую стабильность в течение 12 месяцев наблюдения (жидкая форма) и 18 месяцев (сухая форма).
Проведенные нами исследования по изучению сочетаемости инактивированных антигенов вирусов ССЯ-76, ИББ, НБ, ИБК и липосом предложенного состава показали, что ингредиенты антигена и адъюванта сравнительно легко соединялись, образуя гомогенную суспензию. Подбор условий, обеспечивающих необходимое смешивание антигена и адъюванта до уровня однородной мелкодисперсной эмульсии, позволил определить режим гомогенизации. Наибольшую стабильность препаратов обеспечивало соотношение 1 части антигена и 10 частей адъюванта. При электронно-микроскопическом исследовании полученных вакцинных препаратов было установлено, что образующийся комплекс "антиген - адъювант" имел вид расположенных равномерно в поле зрения частиц инактивированного вируса, инкорпорированного в липосомы. Структура инактивированных вирионов не была нарушена.
Полученные образцы сухой и жидкой липосомальной инактивированной вакцины и составляющие ее ингредиенты были испытаны на безвредность, антигенную и иммуногенную активность. Опыты проводили на птице 30, ПО и 170-дневного возраста.
В сравнительном аспекте было изучено проявление местных тканевых реакций на внутримышечное и подкожное введение вакцин, приготовленных на основе липосом или гидроокиси алюминия.
Установлено, что при использовании липосом местные реакции тканей были минимальными и наблюдались в течение 5 суток после инъекции. Нами отмечено легкое побледнение тканей, окружающих место инъекции 6 мм в диаметре, отсутствие воспаления и инкапсулированных остатков вакцины.
В случае использования гидроокиси алюминия в качестве адъюванта в течение 45 дней регистрировали отечность, побледнение окружающих тканей, гиперемию и воспалительную реакцию до 2 см в диаметре вокруг места инъекции (раны), кроме того, присутствовали остатки инкапсулированной или диффузно-разлитой вакцины, абсцессы и гранулемы.
В последующих исследованиях на птице была изучена антигенная и иммуногенная активность вакцины. В опыте использовали цыплят 30 и 110-дневного возраста, а при изучении > иммуногенных свойств вакцины против ССЯ-76 - 170-дневного возраста. Через 45 дней после иммунизации от птицы брали кровь, получали сыворотку, определяли количество специфических антител и проводили контрольное заражение (таблица 1-4).
В результате проведенных экспериментов было установлено, что испытуемые моновалентные липосомальные вакцины против НБ, ИББ, ИБК и ССЯ-76 безвредны, не вызывают каких-либо нарушений в клиническом состоянии и патологоанатомических изменений в органах и тканях птиц. Установлено, что вакцины обладают выраженной антигенной и иммуногенной активностью. Их введение в организм индуцирует образование специфических антител и предохраняет привитых птиц от заражения соответствующими вирусами. Иммунная реакция проявляется у вакцинированной птицы в виде повышения титра антител, достигая максимальных значений к 40 дню с момента иммунизации, удерживаясь на высоком уровне в течение 12 месяцев (срок наблюдения). Наивысшие значения иммуногенной активности отмечены при подкожном введении. Все испытанные вакцины стабильны в процессе хранения.
2.2.5. Ассоциированная липосомальная вакцина против НБ,
ИББ, ИБК и ССЯ-76
Основной задачей при разработке инактивированной липосомальной ассоциированной вакцины против НБ, ИББ, ИБК и ССЯ-76 было создание 4-х валентной вакцины таким образом, чтобы иммунный ответ был аналогичен применению моновалентных форм. Вакцина должна быть стабильной по составу, обладать выраженным адъювантным эффектом, сочетаемостью антигена и адъюванта, обеспечивающих создание высокоиммуногенного и вместе с тем безвредного для птицы вакцинного комплекса, её компоненты должны быть доступны, экономически приемлемы и технологичны.
№ гр. Наименование препарата Титр антител в РТГА (log2) Тканевая реакция
28 день после вакцинации 21 день после заражения
1 "ЛИПОСОМВАК" (per os) (сухая) 1 доза 5,90 ±0,24 6,21 ±0,20 -
2 "ЛИПОСОМВАК" (в/м) (жидкая) 1 доза 6,82 ±0,28 7,28 ±0,21 Легкая (в течение 5дн.)
3 "ЛИПОСОМВАК" (п/к) (жидкая) 1 доза 7,85 ±0,35 8,15 ±0,28 Легкая (в течение 5дн.)
4 "ЛИПОСОМВАК" (п/к) (жидкая) 0,5 дозы 6,26 ±0,29 "7,05 ±0,24 Легкая (в течение 5дн.)
5 "ЛИПОСОМВАК" (п/к) (жидкая) 10 доз 7,95 ±0,20 8,25 ±0,16 Легкая (в течение 5дн.)
6 Вакцина с ГОА (в/м) 6,22 ±0,23 " 6,71 ±0,19 Средняя (в течение 40 дн.)
7 Вакцина с ГОА (per os) 0,61 ±0,03 5,75 ±0,15 -
8 Коммерческая вакцина 6,16 + 0,19 6,34 ±0,21 Средняя (в течение 40 дн.)
9 "Чистый" контроль 0,60 ±0,03 5,69 ±0,13 -
Примечание: Титр до вакцинации - 0,52 ± 0,08 log2
№ гр Наименование препарата Титр антител в РТГА (log2) Тканевая реакция Иммунная птица (%)
28 день 45 день
1 "ЛИПОСОМВАК" (per os) (сухая) 1 доза 6,17 ±0,25 6,78 ±0,42 - 90 '
2 "ЛИПОСОМВАК" (в/м) (жидкая) 1 доза 7,56 + 0,71 7,85 ±0,75 Легкая (в течение 5 дн.) 95
3 "ЛИПОСОМВАК" (п/к) (жидкая) 1 доза 8,62 + 0,42 8,92 ±0,45 Легкая (в течение 5дн.) 100
4 "ЛИПОСОМВАК" (п/к) (жидкая) 0,5 дозы 7,15 + 0,18 7,45 ±0,32 Легкая (в течение 5 дн.) 95
5 "ЛИПОСОМВАК" (п/к) (жидкая) 10 доз 9,18 ±0,43 9,95 ±0,54 Легкая (в течение 5 дн.) 100
6 Вакцина с ГОА (в/м) 6,42 ±0,33 6,75 ±0,63 Средняя (в течение 40 дн.) 90
7 Вакщша с ГОА (per os) 2,11 ±0,19 2,28 ±0,24 - 0
8 Коммерческая вакцина 6,86 ±0,25 7,80 ±0,18 Средняя (в течение 40 дн.) 95
9 "Чистый" контроль 2,09 ±0,16 2,22 ±0,26 0
Примечание: Титр антител до вакцинации - 2,08 + 0,29 (log2)
№ гр. Наименование препарата Титр антител в ИФА Тканевая реакция "Иммунная птица (%)
28 день 45 день
1 "ЛИПОСОМВАК" (per os) (сухая) 1 доза 1 :7136+153 1 :7756±187 - 90
2 "ЛИПОСОМВАК" (в/м) (жидкая) 1 доза I : 10273 + 94 1 : 10860 ±253 Легкая (в течение 5 дн.) 95
3 "ЛИПОСОМВАК" (п/к) (жидкая) 1 доза 1 : 11364 + 156 1 : 11724 ±260 Легкая (в течение 5дн.) 100
4 "ЛИПОСОМВАК" (п/к) (жидкая) 0,5 дозы 1 :9058±101 1 : 10058 ±174 'Легкая (в течение 5 дн.) 95
5 "ЛИПОСОМВАК" (п/к) (жидкая) 10 доз 1 :10 9560+ 204 1 : 10862 ±110 Легкая (в течение 5 дн.) 100
6 Вакцина с ГОА (в/м) 1 :8298 ±98 1 : 9149 ±255 " Средняя (в течение 40 дн.) 95
7 Вакцина с ГОА (per os) 1 :1819±26 1 : 1910 ±45 - 10
8 Коммерческая вакцина 1 :9173+ 164 1 :9625 ±187 Средняя (в течение 40 дн.) 95
9 "Чистый" контроль 1 : 1723 ±35 1 :1845 ±49 - 10
Примечание: титр анпггел в ИФА до вакцинации - 1 : 1574 ± 84
№ гр. Наименование препарата Титр антител в ИФА Тканевая реакция Иммунная птица (%)
28 день 45день
1 "ЛИПОСОМВАК" (per os) (сухая) 1 доза 1 :5756 ±246 1 : 5987±189 - 95
2 "ЛИПОСОМВАК" (в/м) (жидкая) 1 доза 1 :8058+ 152 1 :8256 ±298 Легкая (в течение 5 дн.) 100
3 "ЛИПОСОМВАК" (п/к) (жидкая) 1 доза 1 :9750 + 301 1 : 10060 ±270 Легкая (в течение 5 дн.) 100
4 "ЛИПОСОМВАК" (п/к) (жидкая) 0,5 дозы 1 :7560 ±180 1 :7765 ±196 Легкая (в течение 5 дн.) 95
5 "ЛИПОСОМВАК" (п/к) (жидкая) 10 доз 1 : 10560 ±325 1 : 10952 + 312 Легкая (в течение 5 дн.) 100
6 Вакцина с ГОА (в/м) 1 : 7105+205 1 :7315 + 135 Средняя (в течение 40 дн.) 95
7 Вакцина с ГОА (per os) 1 :250 ±28 1 :280 ±31 - 0
8 Коммерческая вакцина 1 :7764 ±246 1 :8042 ± 244 Средняя (в течение 40 дн.) 95
9 "Чистый" контроль 1 :244 ±24 1 :265 ±28 - 0
Примечание: Титр антител в ИФА до вакцинации - 1:214+18
Липосомальлую форму, содержащую инактивированные антигены вирусов НБ - штамм "Ла-Сота", ИБК - штамм "Чапаевский", ИББ - штамм "52/70", ССЯ-76 - штамм "В8/78" готовили по описанной выше методике получения лилосомальных препаратов. В качестве контроля использовали те же антигены сорбированные на стандартной гидроокиси алюминия.
Проведенные нами исследования по изучению сочетаемости инактивированных антигенов и липосом описанного состава показали, что ингредиенты антигенов и адъюванта легко соединялись, образуя гомогенную суспензию. При электронно-микроскопическом исследовании полученных вакцинных препаратов было установлено, что образующийся комплекс "антиген - адъювант" представлял собой расположенные равномерно в поле зрения частицы инактивированного вируса, инкорпорированного в липосомы.
Полученные образцы липосомальной 4-х валентной инактивированной вакцины и составляющие ее ингредиенты были испытаны на безвредность, антигенную и иммуногенную активность. Результаты опыта представлены в таблице 5.
Результаты эксперимента показали, что вакцина была безвредна для птиц при разных способах введения и не вызывала каких-либо нарушений в клиническом состоянии и патологоанатомических изменений в организме птиц. Она обладала выраженной антигенной активностью и индуцировала в организме привитой птицы образование специфических антител. Изучение динамики антителообразования у вакцинированных птиц показало, что иммунная реакция проявлялась на 5-6 день после вакцинации и достигала максимальных значений к 45 дню с момента иммунизации, стабильно удерживаясь на высоком уровне в течение всего срока наблюдения (12 месяцев).
Вакцина обладала выраженными иммуногенными свойствами, создавала более высокий уровень иммунитета по сравнению с контрольной группой и предохраняла привитую птицу при заражении вирусами НБ, ИББ, ИБК и ССЯ-76, что характеризовалось отсутствием у подопытной птицы признаков этих болезней.
2.2.6. Подбор стресспротективного и иммуностимулирующего компонента для вакцинных
композиций
Чрезвычайные раздражители различной природы существенно влияют на деятельность гипоталамуса, гипофиза, коры надпочечников и организма в целом, что в конечном итоге негативно сказывается на общем состоянии птицы, ее продуктивности. Проведение массовых вакцинаций - это одна га причин вызывающая стрессовое состояние птицы в хозяйствах. Реализация стресс-реакции, т.е. мобилизация механизма общей адаптации, требует взаимодействия различных систем организма. Пусковым механизмом
Таблица 5 - Антигенная и иммуногенная активность инактивированной липосо-мальной ассоциированной вакцины против ССЯ-76, НБ, ИББ и ИБК "ЛИПОСОМВАК"
Наименование препарата Компонент . Титр антител Иммунная пгвда (%)
28 день после вакцинации 45 день после вакцинации
"ЛИПОСОМВАК" (per os) ИББ 1 :7715 1 :8454 90
ИБК 1 :5715 1 :6840 90
НБ 5,9+0,2 6,8±0,2 90
ССЯ-76 5,6+0,2 6,7±0,2 90
"ЛИПОСОМВАК" (п/к) ИББ 1:10561 1 :11520 100
ИБК 1 :9574 1 :10345 100
НБ 6,8+0,2 7,5±0,2 95
ССЯ-76 7,4±0,2 8,3±0,2 95
"ЛИПОСОМВАК" (в/м) ИББ 1 :8974 1 :9740 95
. ИБК • 1:8561 1:9510 95
НБ ■ 7,1+0,3 7,9+0,3 95
ССЯ-76 6,8+0,3 7,4+0,3 95
Вакцина с Al(OII)3 (в/м) ИББ 1 :8184 1:8940 95
ИБК 1 :7184 1 :8210 95
НБ 6,2±0,2 7,0±0,2 90
ССЯ-76 6,3±0,2 6,9±0,2 90
Вакцина с А1(ОН)3 (per os) ИББ 1 :385 1 :390 0
ИБК 1 :390 1 :395 0
НБ 1,6+0.2 1,6±0.1 0
ССЯ-76 0,2+0.1 0,2+0.1 0
Коммерческая вакцина ИББ 1 :8525 1 :9313 95
ИБК 1:7725 1 :8715 95
НБ 6,3+0,1 7,1±0,2 90
ССЯ-76 6,2±0,2 7,2+0,1 90
Чистый контроль ИББ 1 :380 1 :385 0
Чистый контроль ИБК 1 :380 1 :391 0
Чистый контроль НБ 1,7±0.1 1.8+0.1 0
Чистый контроль ССЯ-76 0,2+0.1 0,3+0.1 0
Примечание: Титр до вакцинации - ИББ - 1 : 320; ИБК - 1 : 275;
НБ -1,6 ±0.1; ССЯ-76 ±0.1.
каскада реакций организма на действие чрезвычайных раздражителей служит интенсивная секреция кортикостерона корой надпочечников в результате возбуждения. Поэтому определение кортикостерона в крови является объективным способом контроля стресс-реакции. Учитывая, что ее развитие имеет общие характерные признаки при действии различных стресс-факторов мы в качестве экспериментальной модели использовали транспортный стресс.
Было установлено, что через час после стрессирования, уровень кортикостерона в крови подопытных птиц увеличился почти в полтора раза и составил 6,59 мг/мл. Причем это было максимальное увеличение за весь период исследования (рис. 2).
Уровень кортикостерона оставался высоким (6,55 мг/мл) по сравнению с контрольной группой (4,58 мг/кг) в первые 2 дня исследования. На 3-и сутки после начала опыта секреция кортикостерона снижалась, опускалась ниже контроля с постепенным восстановлением нормальной концентрации на 7-е сутки исследования.
Результаты изучения влияния действия чрезвычайного раздражителя на углеводный обмен птицы показал, что мобилизация механизма общей адаптации организма сопровождается определенными метаболическими сдвигами. Являясь наиболее доступным энергетическим материалом, углеводы усиленно расходуются в первые минуты стресс-реакции (рис. 3). Увеличение содержания глюкозы в плазме крови сразу после окончания действия стресс-фактора составило 75% по сравнению с контрольной группой. В дальнейшем уровень глюкозы в крови снижался, но по-прежнему был выше, чем в контроле. Восстановление равновесия между катаболическими и анаболическими процессами, наблюдаемое на 7-й день сопровождалось нормализацией данного показателя.
Являясь сложным биологическим процессом, адаптация птицы к действию стресс-факторов сопровождается перестройкой многих систем организма. Одной из таких систем является кровь. Она чутко реагирует на действие чрезвычайных раздражителей. Еще работами Г.Селье и его школы было установлено, что характерными неспецифическими изменениями крови при стрессе является, эозинопения, лимфопения и нейтрофильный лейкоцитоз на фоне атрофии вилочковой железы.
Подобные характерные особенности мы отмечали и в наших экспериментах. Сразу после окончания воздействия транспортного стресса в крови подопытных птиц увеличивалось содержание сегментоядерных нейтрофилов на 33% и уменьшалось число лимфоцитов на 20% в сравнении с контрольной группой (рис. 4, 5).
Данный эффект сохранялся в течение 3-х дней. При этом увеличение сегментоядерных нейтрофилов составило 15-31%. Количество же лимфоцитов уменьшалось на 15 - 20%. На 7-й день происходило восстановление числа сегментоядерных нейтрофилов и лимфоцитов.
время, час
контроль -■— стресс стресс+этимизол
Рис. 2 - Влияние этимизола на содержание кортикостерона в сыворотке крови птиц при стрессе
О
24
48 72 время, час
96
120
контроль
•стресс стресс+этимизол
Рис. 3 - Влияние этимизола на уровень глюкозы в крови птиц при стрессе
10000 1
X о 9500 -
ф г 9000 -
к о 8500 -
в н 8000 -
о 0) 7500 -
п 7000 «
о * 6500 ' =
6000 4-
0 24 48 72 96 120 время, час
• контроль
стресс
стресс+этимизол
Рис. 4 - Влияние этимизола на содержание сегментоядерных ней-трофилов при стрессе.
* 15500 ^
® 14500
96 120
контроль
стресс —а— стресс+этимизол
Рис. 5 - Влияние этимизола на содержание лимфоцитов при стрессе
Наряду с изменениями морфологического состава (количество сегментоядерных нейтрофилов, лимфоцитов) и биохимических показателей крови (концентрации кортикостерона и глюкозы) развитие стресса сопровождалось нарушением процесса роста цыплят.
Результаты, полученные в ходе эксперимента, показали, что цыплята, подвергавшиеся воздействию транспортного стресса, имели живую массу в конце опыта нюке, чем у контрольных цыплят в среднем на 27%.
Этимизол снижал интенсивность развития стресс-реакции. Введение препарата способствовало лучшей мобилизации защитных сил организма для противодействия стресс-факторам, о чем свидетельствуют экспериментальные данные подтверждающие его способность положительно влиять на биохимические, морфологические и иммунологические показатели.
У стрессированных цыплят, обработанных этимизолом (рис. 2), как и в контроле отмечено увеличение уровня кортикостерона спустя 1 час после начала стрессирования. Однако этот показатель был ниже контрольного на 17%. Оставаясь в общем повышенным и на 1-е сутки исследования, он был значительно ниже по сравнению с контрольной группой.
Не было отмечено уменьшения уровня кортикостерона ниже нормы на 3-й день исследования, что свидетельствует о более быстрой адаптации птицы к стресс-фактору.
Из данных представленных на рис. 3 видно, что метаболические сдвига в условиях действия стресс-фактора, присущие цыплятам контрольной группы, удавалось нивелировать с помощью этимизола. О положительном влиянии этимизола на содержание глюкозы свидетельствует тот факт, что в условиях действия на организм транспортного стрессора уменьшалась гилергликемическая реакция.
Сразу после воздействия чрезвычайного раздражителя и спустя 24 часа отмечено незначительное увеличение глюкозы в крови, уровень которой восстанавливался до контрольных показателей на 3-й день исследования.
Анализ данных, полученных при исследовании периферической крови цыплят, получавших этимизол, показал, что при чрезвычайном воздействии отмечается незначительный нейтрофильный лейкоцитоз. Увеличение сегментоядерных нейтрофилов сразу после окончания воздействия стрессора составило 6%. Достоверные изменения в этой группе были отмечены и спустя 24 часа (количество сегментоядерных нейтрофилов выше нормативных показателей на 6-9%). Однако эти изменения носили кратковременный характер и нормализовались на 3-й сутки эксперимента.
Наблюдаемая лимфопения у птиц в этих группах также носила кратковременный характер. Достоверные изменения были отмечены сразу после окончания действия стресс-фактора (показатели ниже контрольных на 6-7%) и спустя 24 часа. Восстановление исходного количества лимфоцитов
происходило на 3-й сутки.
Кроме этого установлено, что этимизол способствует снижению отрицательного влияния транспортного стресса на прирост массы птицы. Цыплята, получавшие препарат, в конце опыта имели живую массу на 18% выше, чем цыплята стрессированные, но не получавшие этимизол.
Таким образом, применение этимизола нормализует обмен веществ при стрессовых состояниях цыплят, и способствует более эффективной и быстрой адаптации организма к экстремальным воздействиям.
Иммунный ответ представляет собой сложный многокомпонентный процесс, который регулируется специальными механизмами под влиянием нервных и гуморальных воздействий.
Важным для становления полноценного иммунитета является состояние организма птицы. Однако часто возникающие стресс-факторы в технологических процессах промышленного птицеводства, могут вызывать значительные изменения в системе иммунной защиты птиц на всех ее уровнях. Это обычно сопровождается уменьшением эффективности применения вакцин, увеличением отхода птицы, снижением продуктивности. Поэтому поиск препаратов, обладающих иммуностимулирующей активностью, является актуальной задачей ветеринарной науки и практики.
Мы учитывали, что функционирование иммунной системы непосредственно связано с работой нервной, эндокринной и других регуляторных систем организма. Поэтому положительный результат может быть достигнут только путем нормализации всех ответных реакций и координации работы всех звеньев выше названных систем. И в этом плане несомненный интерес представляет этимизол, препарат которому свойственны элементы нейротропного, стресс-протективного и иммуностимулируюего действия (Бородкин Ю.С. и соавт., 1986). Кроме того, этимизол является синтетическим препаратом, что делает его наиболее привлекательным при выборе, так как среди доступных препаратов иммунокоррегирующего действия есть такие, которые получают из сырья животного происхождения. Следовательно, каждая птица, получающая такой препарат, неизбежно попадает в группу риска по некоторым инфекционным болезням (например вирусным, возбудители которых фильтруются через микропористый фильтр и могут быть весьма устойчивы к термо- и химобработкам).
Экспериментальные исследования проведены на цыплятах суточного возраста, находившихся в одинаковых условиях содержания и кормления.
В наших опытах мы использовали гидрокортизон, который в дозе 50 мг/ кг снижал включение 3Н-тимидина в ДНК тимуса и бурсы Фабрициуса и 3Н-уридина в РНК иммунокомпетентных органов (таблица 6). Наибольший иммунодепрессивный эффект был отмечен в тимусе. На 5-е сутки после введения препарата интенсивность синтеза нуклеиновых кислот снижалась на 83 % (ДНК) и 73 % (РНК) по сравнению с контролем (р < 0,05). Низкий
Таблица 6 - Влияние этимизола на интенсивность синтеза нуклеиновых кислот
(имп/мин/мг нуклеиновой кислоты)
Условия Сроки Включение тимидина в Включение урндннав
опыта (сут) 3Н-ДНК клеток 3Н-РНК клеток
тимус бурса тимус бурса
Фабрициуса Фабрициуса
Интактные 1 2378+28 5712+115 4405+109 12624+225
5 2385+36 5921+89 4353+101 12406+135
15 2446+35 5944+112 4525+118 12945+186
Гидрокортизон 1 568+18* ' 3151+98*" ' 1833+92* 5321+111*
5 405+12* 3289+91* 1162+57* 4335+84*
15 345+11* 4208+81* 1603±61* 5462+149*
Гидрокортизон 1 693+16** 3632+102** 1914+87* 5435+98*
+ ЭТИМ ИЗ О л 5 720+19* 3923+88** 2120+42** 5720+83*
15 931+24* 4500+73** 2734+61** 6080+149*
Циклофосфан 1 1218+36* 1563+51* 3702+110* 3735+124*
5 1018+24* 909+31* 3575+102* 1549+115*
15 1248+41* 1785+47* 3897+101* 3070+119*
Циклофосфан 1 1250+36* ' 1983+41*" 3817+112* 4125+125*
+ эпшизол 5 1290+24* 2184+32' 3741+108* 3750+121*
15 1356+40* 2875+28* 3956+112* 5162+134*
* - статистически достоверно (р < 0,05) по сравнению с интактными птицами,
статистически достоверно (р < 0,05) по сравнению с контролем (гидрокортизон или щпслофосфан).
Таблица 7. Влияние этимизола на интенсивность включения 14С-глицина в белки лимфоидных органов при иммунодефиците (имп/мин/мг белка)
Включение 14С-глицина в
Условия Сроки белки
опыта исследования >
(сут) тимус бурса
Фабрициуса
Интактные 1 851+21 1588+24
5 893+16 1631+49
15 865+24 1613+51
Гидрокортизон 1 321+14* 1218+28*
5 241+16* 1228+34*
15 446+18* 1281+28*
Гидрокортизон + 1 441+13** 1370+34**
этимизол 5 456+18** 1320+27**
15 608+14** 1389+24**
Циклофосфан 1 679+15* 519+15*
5 672+12* 340+24*
15 724+13* 785+21*
Циклофосфан 1 738+12** 680+17**
+ этимизол 5 734+15** 610+21**
15 785+13** 975+28**
* - статистически достоверно (р < 0,05) по сравнению с интактными птицами;
** - статистически достоверно (р < 0,05) по сравнению с контролем (гидрокортизон или циклофосфан).
уровень биосинтеза ДНК и РНК наблюдался во все сроки исследования до окончания эксперимента.
На этом фоне этимизол усиливал обменные процессы в лимфоидных органах цыплят. Через сутки после введения препарата уровень синтеза ДНК и РНК был выше контрольных показателей. Данная динамика отмечена на 5 и 15-е дни исследования.
Циклофосфан оказывал менее выраженное действие на скорость включения 3Н-тимидина в клеточную ДНК или скорость включения 3Н-уридина в клеточную РНК тимуса. В тоже время препарат значительно подавлял синтез нуклеиновых кислот в бурсе Фабрициуса, где отмечен наибольший эффект. Показатели опытной группы на 5-е сутки были ниже контрольных на 85 % (ДНК) и на 87 % (РНК). Под действием этимизола синтез нуклеиновых кислот повышался с 1983 имп/мин/мг ДНК и с 4125 имп/мин/мг РНК на 1-е сутки исследования до 2875 и 5162 имп/мин/мг
Таблица 8 - Влияние этимизола на содержание Т- и В-лимфоцнтов в тимусе на 5-е сутки после воздействия
гидрокортизона
Группа Показатели
Масса тимуса, мг Лимф, в органе, х106 Т - лимф. хЮ6 В - лимф. хЮ6 О-лимф. хЮ6
Интактные 185,0+16,2 627,4+8,7 570,9+8,0 1,88+0,02 54,5+4,21
Гидрокортизон 68,2+6,4* 352,8+19,3* 285,8+3,18* 0,88+0,01* 66,0±3,1
Гидрокортизон + этимизол 94,5+9,4** 480,9+21,1** 420,4+9,2** 1,21+0,01 59,3±3,8
Таблица 9 - Влияние этимизола на содержание Т- и В-лимфоцитов в бурсе Фабрициуса на 5-е сутки после воздействия циклофосфана
Группа Показатели
Масса бурсы Фабриц., мг Лимф, в органе, хЮ6 Т-лимф. хЮ6 В - лимф. хЮ6 О - лимф. хЮ6
Интактные 139,1+11,4 524,3+22,4 51,2+5,6 345,1+28,2 128,0+13,5
Циклофосфан 61,2+4,3* 312,4+31,5* 44,4+11,2 211,3+11,5* 56,7+9,5*
Циклофосфан + этимизол 89,4+6,83** 395,5+24,3** 48,4±9,2 245,4+9,7** 100,7±15,2**
* - статистически достоверно (р < 0,05) по сравнению с интактными птицами,
** - статистически достоверно (р < 0,05) по сравнению с контролем (циклофосфан или гидрокортизон).
соответственно ДНК и РНК на 15-е сутки исследования. В то время как у контрольных цыплят показатели оставались на уровне 1785 и 3070 имп/ мин/мг.
Введение цыплятам гидрокортизона или циклофосфана сопровождалось снижением процессов биосинтеза белка в лимфоидных органах (табл. 7). Гидрокортизон вызывал наибольшее ингибирование биосинтеза белка в тимусе (снижение составило 73 %), циклофосфан - в бурсе Фабрициуса (79 %).
Установлено, что циклофосфан оказывал более выраженное влияние по сравнению с гидрокортизоном.
На фоне избирательной иммунодепрессии этимизол активировал биосинтез белка. Включение 14С - глицина в белки лимфоидных органов в опытной группе на 5-е сутки были на 85 % (тимус) и на 79 % (бурса Фабрициуса) выше, чем в контрольной.
Иммунодепрессия, вызванная введением циклофосфана и гидрокортизона, сопровождалась изменением субпопуляционного состава клеток тимуса и бурсы Фабрициуса (табл. 8, 9). Циклофосфан снижал количество В-лимфоцитов в бурсе Фабрициуса (39 %), а введение гидрокортизона сопровождалось преимущественно снижением Т-лимфоцитов в тимусе (50 %).
Оба иммунодепрессанта оказывали отрицательное действие на массу иммунокомпетентных органов цыплят. Циклофосфан уменьшал массу сумки Фабрициуса на 50%. Гидрокортизон наибольшее действие оказывал на тимус, снижая его массу на 63%. При этом установлено, что масса иммунокомпетентных органов имела прямую зависимость от содержания лимфоидных клеток.
Изменения иммунобиологических показателей цыплят сопровождались снижением продуктивности и сохранности цыплят. Среднесуточный привес интактных особей в 25-дневном возрасте составил 9,8 г при 100% сохранности, а цыплят, получавших гидрокортизон и циклофосфан — соответственно 7,0 г при сохранности 88,9% и 7,5 г при сохранности 79,2%.
Применение этимизола оказывало положительное действие на иммунобиологическое состояние организма птицы. На фоне иммунодепрессии препарат, усиливал обменные процессы в лимфоидных органах, повышал содержание Т- и В-лимфоцитов в исследуемых органах, массу этих органов, что в конечном итоге сказалось на сохранности и продуктивности птиц, которые были достоверно выше контрольных показателей.
Полученные положительные результаты послужили основанием для проведения исследований по изучению влияния этимизола на формирование иммунитета против НБ, ИББ, ИБК и ССЯ-76 в условиях стресса, вызванного вакцинацией и перемещением птицы. Как один из важнейших компонентов
со V© г~ 1 Я й О о 40 день <ч С-; о' + 1 ЧО ГО оС 6,4+0,4 | го го 00 0,3 |
|=: ^ н 1-= Н 03 Рн & Н
28 день 7,2+0,1 Г0+8'9 го ?| 1—1 оГ го +1 ЧО 8,0+0,2 го
ев из 5 Й 5 о н ' 40 день 7,2+0,2 го о' +1 г* чо 8,9+0,3 6,2+0,2 7,9+0,4 2,2+0,2
^ сЗ ]р Э-Рч н 28 день сч о' +1 О* +1 8,7+0,3 1 5,8+0,2 7,4+0,5 о' + оГ
Титр антител в ИФА (ИБК) 40 день 1:598 1:4367 1:7180 1:4107 1:7080 1:745
28 день 1:5865 1:4284 1:6772 1:3928 1:6452 1:691
< © К а иа X о Ч О 1:6364 1:5058 1:7650 1:4645 1:7240 1:885
5 И гп •ч-
её е- 28 день 1Г> сч V© тГ ю о\ тг 1Г1 оЗ г- ГЦ ЧО 1П ■ч- 10 о\ ЧО :780
н 1 ?—1 * '
- го тг ЧО
о, композиции, этимизол
® вводили в состав вакцины. ^ м В предварительных
® опытах были отработаны
^ Т дозы этимизола для
2а и липосомальной формы § • Ч. препарата. Они составили:
О Чн для парентерального
§ введения - 2,5 мг/кг, для
р о" перорального - 5 мг/кг
^ г N массы тела. Были изучены основные характеристики
м § Я
комплексного препарата. " ^ оч Установлено, что все + ^ .. вещества, входящие в его
.„Т состав, были совместимы; С \
е [д свойства содержащихся в нем веществ не изменялись Ш 5 <=> в процессе хранения; не 0 Я Т. изменялся рН; препарат был апирогенен.
§ ^ Исследования иммуно-
X и« стимулирующих свойств
проводили по следующей
м 5 I схеме: « Р й
003 Для жидкой формы
а препарата - вакцинация
и § (вакцина + этимизол) —» перемещение птицы в
| о другой птичник (модель
^ ^ через 24 часа применяли этимизол в виде аэрозоля
§ ¡2 из расчета 30 мг/м\ Для ^ 3 | сухой формы препарата -^ й я за 1 час до перемещения птицы применяли этимизол
транспортного стресса)
2 в вще аэрозоля из расчета
2 У 30 мг/м3 —» через 24 часа вакцинация (вакцина +
Сн 3*
Е53 3 Н этимгоол). р ^ а Установлено, что
оказывал
I ЬШЛИОТЕКА | I СПмервург *
I 05 ТОО «т *
негативное действие на птицу (табл.10). Титр антител к изучаемым антигенам был на 30-40% ниже, чем в группах, где птица была вакцинирована, но не подвергалась чрезвычайному воздействию. Однако в группах, где птица получала вакцинную композицию, содержащую этимизол, титр был достоверно выше по сравнению с группами, где этимизол не применяли. Данные изменения были отмечены как на 28-й день исследования после вакцинации, так и на 60-й день, что свидетельствует о стресспротективном и иммуностимулирующем действии препарата.
Фармакокинетику этимизола изучали в опыте на цыплятах 30-дневного возраста методом тонкослойной хроматографии, используя готовые пластинки Силуфол. Цыплятам внутримышечно вводили 1,5%-ный раствор препарата в дозе 20 мг/кг массы тела.
Остаточное количество этимизола определяли в мышцах и печени цыплят спустя 15 мин., 30 мин., 1 час, 2 часа, 4 часа и 8 часов после его введения.
Хроматографирование проводили с использованием в качестве элюента этилацетата, проявление в свете УФ-лампы. В качестве стандарта наносили раствор, содержащий 0,015 мг этимизола. По данным контрольных опытов минимально обнаруживаемое количество этимизола этим методом составляет 0,00025 мг. Установлено, что через 3-4 часа после введения, этимизол в экстрактах органов не обнаруживался, что свидетельствует о том, что его содержание в органах цыплят было ниже минимально определяемой концентрации.
2.2.7. Испытание экспериментальных серии вакцинных композиций в лабораторных и производственных условиях
Для проведения испытаний в лабораторных условиях были изготовлены экспериментальные серии вакцины. В качестве контроля использовали гидроокись алюминия. Сравнительную антигенную и иммуногенную активность и безвредность вакцины определяли на цыплятах 30, 110 и 170-дневного возраста.
Испытуемые препараты во всех случаях вводили внутримышечно, подкожно и энтерально однократно. Через 45 дней с момента иммунизации от цыплят всех групп брали кровь для серологического исследования, после чего птиц заражали вирусом НБ, ИББ, ИБК и ССЯ-76. В ходе эксперимента учитывали клиническое состояние и продуктивность птицы.
Полученные результаты показали, что испытуемые вакцины были стерильны, т.е. свободны от контаминации бактериальной флорой и грибами, обладали выраженными антигенными и иммуногенными свойствами. Инфекционные свойства вируса в препаратах отсутствовали. Птица, получившая вакцины в 10-кратной дозе, оставалась клинически здоровой в течение всего срока наблюдения, что служило подтверждением
безвредности вакцины. Данные препараты были представлены для проведения комиссионных испытаний в России и Украине.
В Российской Федерации испытания проводились в соответствии с программой, утвержденной 30 марта 2001 года директором ВГНКИ ветпрепаратов, академиком Паниным А.Н.
Исследования проводились на птице, полученной из хозяйств, благополучных по острым инфекционным заболеваниям.
В результате комиссионной проверки было установлено, что испытуемые серии вакцины стерильны, полностью инактивированны и безвредны для птицы, обладают антигенной и иммуногенной активность. Уровень поствакцинальных антител через 28 суток составил: ССЯ-76 — 5,1 log2 - 5,0 log2; ИББ - 13539 - 18997 (EL1SA); ИБК - 21796 - 23775 (EL1SA); НБ — 5,0 log2 соответственно для энтералыюго и парентерального методов введения (отчет об испытаниях инактивированной вакцины "Липосомвак" против ИББ, ИБК, НБ и ССЯ-76 утвержден директором ВГНКИ ветпрепаратов академиком А.Н.Паниным 14 мая 2001 года).
На основании полученных результатов было рекомендовано утвердить научно-техническую документацию и разрешить широкие производственные испытания препаратов.
Комиссионные испытания экспериментальной серии сухой и жидкой инактивированной липосомальной вакцины против ССЯ-76, НБ, ИБК, ИББ и этимизола были проведены на птицефабриках Российской Федерации и Украины на птицах кроссов Радонит, ИЗА, размещенных в типовых птичниках. Вакцинацию проводили в возрасте 120 дней. Контролем служила птица этих же кроссов, которая была проиммунизирована внутримышечно коммерческой вакциной в соответствии с наставлением по ее применению.
В течение всего периода наблюдения проводили клинические наблюдения, вели учет сохранности и продуктивности птицы, осуществляли серологический контроль.
В результате проведенной работы было установлено, что испытуемая вакцина (сухая и жидкая форма) не вызывала у привитой птицы поствакцинальных осложнений и не оказывала отрицательного влияния на ее физиологическое развитие. Это подтверждено данными по сохранности и продуктивности птицы в опытных и контрольных группах.
Анализ результатов патологоанатомического вскрытия павшей птицы показал, что основными причинами падежа, как в опытных, так и в контрольной группах, были энтерит, травмы, выпадение яйцевода, желточный перитонит, расклев. При этом существенных закономерных отличий по группам не установлено.
Напряженность поствакцинального иммунитета у привитой птицы контролировали методом иммуноферментного анализа (ИБК и ИББ) и с помощью реакции торможения гемагглютинации (ССЯ-76 и НБ). Взятие
крови и получение сыворотки проводили до вакцинации и ежемесячно после вакцинации.
Результаты серологических исследований показали, что динамика образования антител к антигену вируса ССЯ-76, ньюкаслской болезни, инфекционного бронхита кур и инфекционной бурсальной болезни у птицы опытных и контрольной групп выявлялась стабильно в возрастающих титрах.
В результате комиссионных испытаний установлено, что испытуемые серии сухой и жидкой инактивированной липосомальной вакцины против ССЯ-76, НБ, ИБК и ИББ были безвредны для птиц, обладали высокой антигенной активностью и эффективны в условиях птицехозяйств. Испытуемые препараты не вызывали у привитых кур поствакцинальных осложнений общего или местного характера. Комиссией было отмечено, что энтеральный метод вакцинации прост в применении и значительно снижает трудозатраты, разработка не имеет мировых аналогов. Сухая и жидкая формы инактивированной липосомальной вакцины против ССЯ-76, НБ, ИБК и ИББ может быть рекомендована для специфической профилактики болезней птиц.
Ш.выводы
1. Впервые разработан новый класс биотехнологических препаратов для промышленного птицеводства: вакцинные композиции изготовленные на основе использования липосом и этимизола. Они являются экономически и эпизоотически эффективными средствами для профилактики НБ, ИББ, ИБК и ССЯ-76. Предполагается что их применение в перспективе должно органично войти в схему специфической профилактики вышеназванных заболеваний в промышленном птицеводстве РФ.
2. Впервые созданы четыре моновалентные липосомальные инакти-вированные вакцины против НБ, ИББ, ИБК, ССЯ-76.
3. Впервые разработана ассоциированная липосомальная инактивированная вакцина против НБ, ИББ, ИБК, ССЯ-76.
4. Разработана альтернативная форма применения указанных вакцин: сухая для энтерального введения, позволяющая значительно снизить затраты на проведение вакцинации.
5. Изучено влияние этимизола на иммунобиологические показатели птиц, установлены его стресспротективные и иммуностимулирующие свойства, определены профилактические дозы в составе вакцин.
6. Разработаны технологические схемы приготовления названных выше вакцин и вакцинных композиций, подобраны методики контроля готовых препаратов и определены сроки их хранения. Вакцина не теряет исходные свойства при температуре +4 - +6°С в течение 12 месяцев жидкая форма и 18-сухая.
7. Разработанные вакцины испытаны в лабораторных и производственных условиях. Испытания показали, что антигенная и иммуногенная активность липосомальных вакцин, как в жидкой, так и в сухой форме не уступает коммерческим вакцинам, а энтеральный метод введения устраняет появление поствакцинальных осложнений. Введение в вакцинирующие композиции этимизола в дозе 5 мг/кг снижает поствакцинальный стресс, что приводит к снижению времени восстановления гомеостаза с 10 до 3 суток, а также повышает эффективность вакцинации на 20-30%.
8. Приобретенный через 28-35 суток после прививки иммунитет, сохраняется в течение 12 месяцев и передается потомству.
9. Разработана научно-техническая документация на опытно-промышленное производство моновалентных и ассоциированных вакцин в соответствии с действующей нормативной базой.
IV. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Соколов В.Д., Бородкин Ю.С., Сухинин А.А. Предупреждение стресса у молодняка при транспортировке//Птицеводство. - 1986.- №11. - С.28-30.
2. Сухинин А.А., Колабская Л.С., Шорникова-Л.Л., Попова В.Д. Влияние транспортировки на уровень естественной резистентности птиц // Передовой научно-производственный опыт в птицеводстве. 1986. - №8 -с.22-25.
3. Сухинин А.А. Применение этимизола для повышения естественной резистентности в условиях температурного стресса // Передовой научно-производственный опыт в птицеводстве. 1986. - №10 - с.18-20.
4. Сухинин А.А., Чебанова Л.П. Влияние этимизола и нуклеината натрия на формирование поствакцинального иммунитета при инфекционном ларинготрахеите птиц /Сб.науч.тр.Всесоюзного НИВИ птицеводства // Современные средства и методы борьбы с заразными болезнями с/х птиц. -Ленинград, 1987. - С. 45-47.
5. Сухинин А.А., Соколов В.Д., Малыхин В.А. Применение этимизола для профилактики транспортного стресса у птиц // Информационный листок № 184-89 (номер государственной регистрации - 01820081953). -Ленинградский межотраслевой территориальный центр научно-технической информации и пропаганды, 1989. - 2с.
6. Сухинин А.А., Ли Н.М. Профилактика температурного стресса у птиц // Тезисы докл. к Всесоюзной научно-прошводственной конференции "Комплексная система ветеринарных мероприятии в птицеводстве - резерв повышения эффективности производства". - Ленинград, 1989. - С. 104-105.
7. Алиев А.С., Сухинин А.А, Шабанова Л.Ф., Барклай-де-Толли М.Н. Способ определения Т-лимфоцитов в крови у птиц. А.С. № 1635135. 1990. Бюлл.№ 3.
8. Сухинин А.А, Маковклн Н.А., Сухинина Т.Л. Влияние стресс-факторов на уровень содержания кортикостерона и глюкозы к крови цыплят // Тезисы докл. Всесоюзной конференции "Ветеринарные проблемы птицеводства". -Ленинград, 1990 - с.61-64
9. Алиев А.С., Сухинин А.А, Шабанова Л.Ф., Барклай-де-Толли М.Н. Выявление Т-лимфоцитов птиц с помощью розеткообразования // Тез.докл. Всесоюзной конференции "Современные проблемы иммунологии, биотехнологии, генной и клеточной инженерии в ветеринарной медицине". -Нижний Новгород, 1990. - с.2-3.
10. Сухинин А.А, Сухинина Т.Л., Иванова Н.В. Влияние гидрокортизона и циклофосфана на иммунобиологическое состояние организма птиц / Сб.науч.тр. Всесоюзного НИВИ птицеводства // "Эффективные средства методы диагностики и профилактики болезней птиц в промышленном птицеводстве".- Ленинград, 1991 .-С.44-52.
11. Сухинин А.А, Морозова Ю.А., Виноходов В.О. Новый эффективный способ профилактики синдрома снижения яйценоскости-76(ССЯ-76) // Архив ветеринарных наук. - С.Петербург, Ломоносов, 1999, т.2(49) ч.1. -С.31-36.
12. Соколов В.Д., Сухинин А.А., Пиотровский Л.Б., Александрова И.Я. Токсикологическая характеристика этимшола // Сб.науч.тр. Ленинградского ветеринарного института/ Фармакология и токсикология новых лекарственных средств и кормовых добавок в ветеринарии. - Ленинград, 1999.-С.144-146.
13. Сухинин А.А, Виноходов В.О. Разработка технологии получения сухой, липосомальной, инактивированной вакцины // Тез.докл. Международной конф. 'Теоретич. и практ.аспекты возникновения и развития болезней животных и защита их здоровья в соврем.условиях"-Воронеж, 2000. - С.223-224.
14. Сухинин А.А, Виноходов В.О. Экспериментальное изучение сухой, липосомальной, инактивированной вакцины для перорального применения // Тез.докл. Международной конф. "Теоретич. и практ.аспекты возникновения и развития болезней животных и защита их здоровья в соврем.условиях"-Воронеж, 2000. - С.224-225.
15. Сухинин А.А, Кобатов А.И., Автушенко С.С., Виноходов В.О., Антонов С.Ф., Морозова Ю.А. Вакцинный препарат. А.С. № 12968. 20.03.2000 г. Бюлл.№ 8.
16. Сухинин А.А, Кобатов А.И., Автушенко С.С., Виноходов В.О., Антонов С.Ф., Морозова Ю.А. Вакцина против "Синдрома снижения яйценоскости-76" и способ вакцинации. Патент № 2155030. 27.08.2000 г. Бюлл.№ 24.
17. Виноходов В.О., Виноходов Д.О, Сухинин А.А. Инактивированный вакцинный препарат. А.С. № 12969. 20.03.2000 г. Бюлл.№ 8.
18. Сухинин А.А. Вакцинный препарат и способ вакцинации птиц. Патент №2169581. 27.06.2001 г. Бюлл.№ 18.
19. Морозова Ю.А., Сухинин А.А, Виноходов В.О. Изучение механгома взаимодействия липосом с клетками // Ветеринарная практика, 2001. - №4 (15).-С. 60-63.
20. Соколов В.Д., Сухинин А.А. Влияние этимизола на иммунные показатели при вакцинации птицы против НБ, ССЯ-76, ИББ, ИБК в условиях стресса // Новые ветеринарные препараты и кормовые добавки. Экспресс-информация №11.- С.-Петербург, 2001. - с. 22-23.
21. Сухинин А.А. Сравнительное изучение иммуноадъювантной активности липосом и гидроокиси алюминия // Новые ветеринарные препараты и кормовые добавки. Экспресс-информация №11. -С.-Петербург, 2001. - с. 2223.
22. Соколов В.Д., Сухинин А.А, Фармакокоррекция транспортного стресса этимизолом // Новые ветеринарные препараты и кормовые добавки. Экспресс-информация №11.- С.-Петербург, 2001. - с. 9-10.
23. Придыбайло Н.Д., Сухинин А.А., Виноходов О.В., Коровин Р.Н. Липосомы. Использование при конструировании вакцин и перспективы применения в птицеводстве // Сельскохозяйственная биология. - 2002. - № 4.-С.21-29.
24. Сухинин А.А, Виноходов В.О., Морозова Ю.А. Первая инактивированная вирус-вакцина для перорального применения // Ветеринария в птицеводстве, 2002.-№1.- С. 16-17.
25. Виноходов В.О., Сухинин А.А. Синдромы в патологии птиц // Ветеринария в птицеводстве, 2002. - № 4. - с.20-25
26. Сухинин А.А. Повышение эффективности вакцинопрофилактики вирусных инфекций птиц с помощью липосом и иммуностимуляторов // Материалы XIV международной межвузовской научно-практической конференции "Новые фармакологические средства в ветеринарии". - Санкт-Петербург, 2002. - С.90.
27. Морозова Ю.А., Потокин И.Л., Гинак А.И., Сорокин Е.М., Антонов С.Ф., Виноходов В.О., Сухинин А.А. Изучение механизма взаимодействия липосом с перитонеальными макрофагами мышей и исследование степени включения антигена в липосомы // Биотехнология. - 2003. - № 5. - С. 88-94.
28. Авдосьева I.K., Мельничук 1.Л., Регенчук В.В., Басараб О.Б., Сухшш А.А., Виноходов В.О., Морозова Ю.А., Григорашева 1.М. Сучасш аспекти специф1чно1 профиактики в1русних захворювань птищ // Матер1али IV Украшсько1 конференцй' по птах1вництву з м1ждународною участю. -Харшв, 2003. - Випуск 53. - с.491-493.
29. Сухинин А.А. Влияние этимизола на формирование иммунитета в условиях стресса // Новые ветеринарные препараты и кормовые добавки. Экспресс-информация - дополнение к 25 международной научно-практической конференции "Новые фармакологические средства в ветеринарии", посвященной 300-летию Санкт-Петербурга. - С.-Петербург.-2003.-С. 17-18.
30. Сухинин А.А. Этимизол: стресс-протективные и иммуностимулирующие свойства. - Изд-во "Архив ветеринарных наук", - С.Петербург, 2003 г.- 60 с.
31. Сухинин А.А. Липосомальные вакцины против болезней птиц (теория, практика, технология). Изд-во "Архив ветеринарных наук", - С.Петербург, 2003 г.-162 с.
32. Сухинин А.А., Лосев НА, Сапронов Н.С. Фармакокоррекция стресса и иммунодефицита этимизолом // Новости медикобиологических наук (News ofBiol. Med. Sci. - 2004 г. - № 1. - С. 115-124.
Подписано к печати 2004 г. Формат бумаги 60X84 1/16. Бумага офсетная.
Печать ризографическая. Объем 2 п.л. Тираж 100 экз. Заказ 3279. Отпечатано в отделе оперативной полиграфии НИИХ СПбГУ с оригинал-макета заказчика. 198504, Санкт-Петербург, Старый Петергоф, Университетский пр., 26.
Содержание диссертации, доктора биологических наук, Сухинин, Александр Александрович
Список используемых сокращений.
ВВЕДЕНИЕ.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Краткая характеристика наиболее опасных вирусных болезней птиц
1.1.1. Ньюкаслская болезнь.
1.1.2. Инфекционная бурсальная болезнь.
1.1.3. Инфекционный бронхит птиц.
1.1.4. Синдром снижения яйценоскости - 76.
1.2. Средства и методы специфической профилактики вирусных болезней 46 птиц.
1.3. Липосомы.
1.3.1. Характеристика липосом.
1.3.2. Строение, структура, свойства и способы приготовления липосом
1.3.3. Использование липосом для конструирования вакцин.
1.3.4. Методы введения липосом.
1.3.5. Использование липосом в качестве иммунологических адъювантов в 78 птицеводстве.
1.4. Фармакокоррекция стрессов и иммунодефицитных состояний.
1.4.1. Фармакологическая характеристика этимизола.
2.0. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.1. Материалы и методы исследований.
2.1.1. Используемые животные и эмбрионы.
2.1.2. Характеристика использованных в работе штаммов вирусов.
2.1.3. Методы проведения диагностических исследований.
2.1.3.1. Определение антигенной активности вируса НБ.
2.1.3.2.0пределение антигенной активности вируса ИБК.
2.1.3.3.Определение антигенной активности врфуса ИББ.
2.1.3.4.Определение антигенной активности вируса ССЯ- 76.
2.1.3.5. Ретроспективный эпизоотологический анализ.
-32.1.4. Получение липосом.
2.1.5. Контроль качества липосом.
2.1.6. Методы получения и контроля лабораторных серий инактивирован- 103 ной вакцины.
2.1.6.1. Определение стерильности.
2.1.6.2. Определение полноты инактивации вирусов ИБК, ИББ, НБ и 104 ССЯ-76.
2.1.6.3. Безвредность, иммуногенная и антигенная активность вакцины
2.1.6.4. Определение размеров и содержимого липосом.
2.1.6.5. Стабильность вакцины.
2.1.6.6. Определение коэффициента включения вирусов в липосомы.
2.1.7. Статистический анализ результатов.
2.2. Использование липосом при разработке вакцины.
2.2.1. Ретроспективный эпизоотологический анализ распространения НБ, 112 ИББ, ССЯ-76, ИБК и в Российской Федерации.
2.2.2. Технологический регламент изготовления инактивированных, моно- 118 валентных и ассоциированных липосомальных вакцин против
ССЯ-76, НБ, ИББ и ИБК.
2.2.2.1. Технологический регламент изготовления липосом.
2.2.2.1.1. Сведения о приборах, используемых при получении и контроле 120 липосом.
2.2.2.1.2. Биохимическая характеристика исходного сырья для получения 121 липосом.
2.2.2.1.3. Получение мультиламелярных везикул.
2.2.2.1.3. 1. Получение жидких липосом.
2.2.2.1.3. 2. Получение сухих липосом.
2.2.2.1.3. 3. Стабилизация и стерилизация липосом.
2.2.2.1.3. 4. Контроль качества липосом и их физико-химических и биологических свойств.
2.2.2.1.3.5. Определение токсичности липосом.
2.2.3. Изучение механизма взаимодействия липосом с клетками (фагоцитоз липосом макрофагами).
2.2.4. Технологический регламент изготовления сухой и жидкой форм 138 инактивированных липосомальных моновалентных вакцин против ССЯ-76, НБ, ИББ, ИБК.
2.2.4.1. Экспериментальные исследования липосомальной моновалентной 143 вакцины против ССЯ-76 на безвредность, антигенную и иммуногенную активность, стабильность.
2.2.4.2. Экспериментальные исследования липосомальной моновалентной вакцины против НБ на безвредность, антигенную и иммуногенную активность, стабильность.
2.2.4.3. Экспериментальные исследования липосомальной моновалентной вакцины против ИББ на безвредность, антигенную и иммуногенную активность, стабильность.
2.2.4.4. Экспериментальные исследования липосомальной моновалентной вакцины против ИБК на безвредность, антигенную и иммуногенную активность, стабильность.
2.2.4.5. Разработка технологического регламента изготовления ассоции- 175 рованной инактивированной липосомальной вакцины против
ССЯ-76, НБ, ИББ и ИБК.
2.2.4.6. Лабораторный технологический регламент изготовления инакти- 183 вированной, липосомальной вакцины против НБ, ИББ, ИБК и
ССЯ-76.
2.2.4.7. Лабораторный регламент биологического контроля инактивирован- 190 ной, липосомальной вакцины против НБ, ИББ, ИБК и ССЯ-76.
2.3. Стресспротективные, иммуностимулирующие свойства и токсико- 198 биологическая оценка этимизола.
2.3.1. Стресспротективные свойства этимизола.
2.3.2. Иммуностимулирующие свойства этимизола.
2.3.3. Токсико-биологическая оценка этимизола.
2.4 . Испытание экспериментальных серий вакцинных композиций в лабораторных и производственных условиях.
3.0. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
ВЫВОДЫ.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Липосомальные вакцины в промышленном птицеводстве"
Актуальность проблемы. В комплексе мер борьбы с инфекционными заболеваниями, включающими соблюдение ветеринарно-санитарных правил, условий содержания и кормления, вакцинопрофилактика занимает ведущее место. Применение живых и инактивированных вакцин обеспечивает надежную защиту птиц от ньюкаслской болезни, инфекционного бронхита кур, синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционной бурсальной болезни и других инфекций [6, 21, 120, 134, 146,314, 340, 363].
Широко используется метод ассоциированной вакцинации птиц инактивированными, масляно-эмульсионными вакцинами [104, 185, 380].
Считается, что безопасность инактивированных вакцин достаточно гарантирована. Однако при их парентеральном применении возможно появление общей и местной воспалительной реакции на месте введения с последующим развитием локальных абсцессов и гранулем [82, 236, 453]; гиперсенсибилизация организма и активация аутоиммунных процессов.
Поэтому не случаен поиск нетрадиционных способов решения проблем иммунизации птиц, улучшения способа доставки антигена и обеспечения большего удобства при применении. Актуальной остается разработка оптимальных лекарственных форм, позволяющих полностью снять негативные эффекты, наблюдаемые после введения препаратов.
Известно, что применение инактивированных вакцин другими методами, в частности энтеральным, мало эффективно. И, тем не менее, интерес у исследователей к не парентеральным методам вакцинации не снижался. Поэтому успех, достигнутый в этом направлении, не случаен. Учеными НИИ гриппа РАМН, ГНЦ ГосНИИОЧБ, НИИЭМ им.Л.Пастера (г.Санкт-Петербург) успешно осуществлено создание сухой, липосомальной, инактивированной вакцины для перорального применения против гриппа человека [67, 68, 159]. Использование в работе липосомальных технологий, широко применяемых в разных областях медицины, позволило открыть новое, перспективное направление в науке, позволяющее конструировать лекарственные формы вакцин на основе наночастиц [55].
Липосомы (от греческого липос - жир и сома - тельце или частица) - это замкнутые многослойные макроструктуры, состоящие из концентрических липидных бислоев, разделенных изолированными водными промежутками. Они широко используются как модельная система, воспроизводящая многие свойства биологических мембран [92].
Одним из важных свойств липосом является способность включать и удерживать в себе те вещества, которые содержатся в окружающей их среде. Это могут быть как неорганические ионы, так и крупные белки, вирусы, бактерии. Например, включенные в готовые липосомы путем простой инкубации альбумин, инсулин, и иммуноглобулины оставались связанными с липосомами даже после гель-фильтрации, что свидетельствует о прочной связи между ними [331, 456, 457].
Кроме роли хранилища, из которого препарат высвобождается постепенно, с определенной скоростью, липосомы могут использоваться как переносчики лекарственных препаратов, в том числе антигенов [55, 57, 163]. Поэтому не случайно в научной литературе часто встречаются такие названия липосом, как "конверто-подобные структуры", "сейфы" для хранения, "контейнеры" для доставки биологических субстанций.
Многочисленные клинические испытания липосомальных препаратов, показали их безопасность для организмов животных и человека.
Учитывая, что в настоящее время на мировом рынке уже появилось более десяти тысяч липосомальных препаратов, в том числе вакцин (против ньюкаслской болезни и реовирусной инфекции - лицензия США; вакцина против ИЛТ - Россия и др.) и не меньшее количество находится на различных стадиях клинических испытаний - мы поставили перед собой цель создание липосомальных инактивированных вакцин, как актуальную и представляющую интерес и для науки, и для отечественного промышленного птицеводства.
Однако следует учитывать, что эффективность вакцинопрофилактики зависит не только от качества вакцины, но и от состояния иммунной системы птицы. Часто действующие стресс-факторы, в том числе перегруппировка в 120 дневном возрасте, оказывают негативное влияние на ее функциональную активность.
Поэтому поиск стресспротективиых препаратов и введение их в состав вакцинных композиций - одна из задач науки и практики, решение которой открывает новые пути к более эффективной профилактике многих заболеваний [61].
Цель и задачи исследований. Цель исследований - разработать новые средства специфической профилактики наиболее распространенных вирусных болезней птиц и предложить комплексные вакцинирующие композиции имеющие в своем составе вещества обладающие стресспротективным и иммуностимулирующим эффектом.
В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:
- разработать четыре моновалентные липосомальные вакцины против НБ, ИББ, ИБК и ССЯ-76;
- разработать ассоциированную форму вакцины против НБ, ИББ, ИБК и ССЯ-76;
- разработать альтернативную форму применения указанных вакцин: сухую -для энтерального введения;
- изучить влияние этимизола на биохимические и иммунобиологические показатели крови цыплят при стрессе и его иммуностимулирующие свойства, ввести его в состав вакцины;
- разработать технологическую схему приготовления указанных вакцин и подобрать методики контроля и схемы применения;
- испытать вакцинные композиции в лабораторных и производственных условиях;
- разработать научно-техническую документацию на опытно-промышленное производство вакцины.
Научная новизна работы. Впервые разработана липосомальная инактивированная вакцина против НБ, ИББ, ИБК, ССЯ-76, отличающаяся формой выпуска и новым способом введения.
Разработан метод получения сухого вакцинного препарата выполненного в виде микрогранул, внутренняя часть которых содержит липосомальную везикулу с антигеном.
Разработан технологический регламент производства вакцин и методы контроля их качества.
Проведено сравнительное изучение иммунобиологических свойств вакцин при разных способах введения (энтеральном, внутримышечном и подкожном).
Научно обоснованы и экспериментально подтверждены иммунизирующие дозы, способы введения и схемы применения вакцин.
Предложены комплексные вакцинирующие композиции, имеющие в своем составе этимизол, обладающий стресспротективным и иммуностимулирующим эффектом.
Практическая ценность работы. Результаты исследований, изложенные в диссертации, использованы для разработки:
- шактивована лшосомальна вакцина "ШПОСОМВАК" (моновалекп та асоцшоваш форми) проти ньюкаслсько! хвороби, шфекцшного бронхиу курей, шфекцШно1 бурсально1 хвороби, синдрому знижения яйценоскость76, техшчш умови утверждени Мшютерством arpapHoi полггики Украшы (ТУ У24.4.24792 862.597 - 2001);
- настанова по застосуванню шактивовано1 лшосомально1 вакцини "ЛШОСОМВАК" (моноваленп та асоцШоваш форми) проти нькжаслсько1 хвороби, шфекцшного бронх1ту курей, шфекцшно! бурсально1 хвороби, синдрому знижения яйценоскость76, утверждени 21.09.2001 г. Державн1м департаментом ветеринаржн медицини;
- наставление по профилактике транспортного стресса у цыплят с помощью аэрозолей этимизола, утвержденных ГУВ Госагропрома СССР 5 сентября 1988 года.
- инструкции по изготовлению и контролю сухой формы липосомальной, инактивированной вакцины против ССЯ-76, НБ, ИББ и ИБК (утверждена ректором СПбГАВМ 10.01.01г.);
- инструкции по изготовлению и контролю жидкой формы липосомальной, инактивированной вакцины против ССЯ-76, НБ, ИББ и ИБК (утверждена ректором СПбГАВМ 10.01.01г.);
- методических рекомендаций по изготовлению ксеногенных сывороток к Т- и В-лимфоцитам птиц (утверждено на методическом совете СПбГАВМ, протокол № 1, от 20.11.2002 г.);
- технических условий на сухую и жидкую формы липосомальной, инактивированной вакцины "ЛИПОСОМВАК" против ССЯ-76, НБ, ИББ и ИБК (находятся на рассмотрении в Департаменте ветеринарии МСХиП РФ);
- наставления по применению сухой и жидкой формы липосомальной, инактивированной вакцины "ЛИПОСОМВАК" против ССЯ-76, НБ, ИББ и ИБК (находятся на рассмотрении в Департаменте ветеринарии МСХиП РФ).
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Создание нового класса вакцин для специфической профилактики особо опасных вирусных болезней птиц (НБ, ИББ, ИБК и ССЯ-76):
- технологический регламент производства липосомальных инактивированных вакцин;
- сравнительное изучение иммунобиологических свойств вакцин при разных способах введения (энтеральном, внутримышечном, подкожном).
2. Создание вакцинных композиций включающих препарат, обладающий стресс-протективным и иммуностимулирующим эффектом.
Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-производственной конференции молодых ученых и аспирантов Всесоюзного НИВИ птицеводства (1984 г.); Всесоюзной научно-производственной конференции "Система мероприятий по обеспечению эпизоотического благополучия и рентабельности птицеводческих предприятий" (г.Ломоносов, 1985г.); методическом и ученом советах Всесоюзного НИВИ птицеводства (1986г.); на научной конференции "Современные средства и методы борьбы с заразными болезнями с/х птиц" (Ленинград, 1987 г.); на 1-ой межвузовской науч.-практ. конф. "Новые фармакологические средства в ветеринарии" (Ленинград, 1989 г.); научной конференции "Современные методы исследований в животноводстве и птицеводстве" (Ленинград, 1989 г.); научной конференции "Комплексная система ветеринарных мероприятий в птицеводстве - резерв повышения эффективности производства" (г.Ломоносов, 1989 г.); научной конференции "Фармакология и токсикология новых лекарственных средств и кормовых добавок в ветеринарии" (Ленинград, 1989 г.); на международной конференции, посвященной 30-летию Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института патологии, фармакологии и терапии "Теоретические и практические аспекты возникновения и развития болезней животных и защита их здоровья в современных условиях" (Воронеж, 2000 г.), 25 международной научно-практической конференции "Новые фармакологические средства в ветеринарии", посвященной 300-летию Санкт-Петербурга (С.-Петербург, 2003 г.); IV Украшско1 конференцп по птах1вництву з м1жнародною участю (Харюв, 2003 г.); межвузовской научной конференции профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины (2001г., 2002 г., 2003 г., 2004 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 32 работы, в том числе 2 монографии, получено 3 авторских свидетельства и 2 патента, в которых изложено основное ее содержание.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 287 страницах и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, выводов, практических предложений и приложения. Содержит 42 таблицы, 16 рисунков и 13 фотоснимков. Список использованной литературы содержит 476 наименований работ отечественных и зарубежных авторов, в том числе отечественных - 137, иностранных - 339. В приложении представлены копии документов, подтверждающих достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.
Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Сухинин, Александр Александрович
ВЫВОДЫ
1. Впервые разработан новый класс биотехнологических препаратов для промышленного птицеводства: вакцинные композиции изготовленные на основе использования липосом и этимизола. Они являются экономически и эпизоотически эффективными средствами для профилактики НБ, ИББ, ИБК и ССЯ-76. Предполагается, что их применение в перспективе должно органично войти в схему специфической профилактики вышеназванных заболеваний в промышленном птицеводстве РФ.
2. Впервые созданы четыре моновалентные липосомальные инактивированные вакцины против НБ, ИББ, ИБК, ССЯ-76.
3. Впервые разработана ассоциированная липосомальная инактивированная вакцина против НБ, ИББ, ИБК, ССЯ-76.
4. Разработана альтернативная форма применения указанных вакцин: сухая для энтерального введения, позволяющая значительно снизить затраты на проведение вакцинации.
5. Изучено влияние этимизола на иммунобиологические показатели птиц, установлены его стресспротективные и иммуностимулирующие свойства, определены профилактические дозы в составе вакцин.
6. Разработаны технологические схемы приготовления названных выше вакцин и вакцинных композиций, подобраны методики контроля готовых препаратов и определены сроки их хранения. Вакцина не теряет исходные свойства при температуре +4 - +6°С в течение 12 месяцев жидкая форма и 18 - сухая.
7. Разработанные вакцины испытаны в лабораторных и производственных условиях. Испытания показали, что антигенная и иммуногенная активность липосомальных вакцин, как в жидкой, так и в сухой форме не уступает коммерческим вакцинам, а энтеральный метод введения устраняет появление поствакцинальных осложнений. Введение в вакцинирующие композиции этимизола в дозе 5 мг/кг снижает поствакцинальный стресс, что приводит к снижению времени восстановления гомеостаза с 10 до 3 суток, а также повышает эффективность вакцинации на 20-30%.
-2428. Приобретенный через 28-35 суток после прививки иммунитет, сохраняется в течение 12 месяцев и передается потомству. 9. Разработана научно-техническая документация на опытно-промышленное производство моновалентных и ассоциированных вакцин в соответствии с действующей нормативной базой.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ Результаты исследований, изложенные в диссертации, использованы для разработки:
- шактивована лшосомальна вакцина "ШПОСОМВАК" (моновалент! та асоцшоваш форми) проти ньюкаслсько! хвороби, шфекщйного бронхггу курей, шфекцшжи бурсальшл хвороби, синдрому знижения яйценоскость76, TexHi4Hi умови утверждены Мшгстерством arpapHoi шхштики Украшы (ТУ У24.4.24792 862.597 - 2001);
- настанова по застосуванню шактивовано1 лшосомальшн вакцини "ШПОСОМВАК" (моноваленп та асоцшоваш форми) проти ньюкаслсько1 хвороби, шфекцшного бронхггу курей, шфекцшно1 бурсально1 хвороби, синдрому знижения яйценоскость76, утверждены 21.09.2001 г. Державшм департаментом ветеринарно1 медицини;
- наставления по профилактике транспортного стресса у цыплят с помощью аэрозолей этимизола, утвержденных ГУВ Госагропрома СССР 5 сентября 1988 года.
- инструкции по изготовлению и контролю сухой формы липосомальной, инактивированной вакцины против ССЯ-76, НБ, ИББ и ИБК (утверждена ректором СПбГАВМ 10.01.01г.);
- инструкции по изготовлению и контролю жидкой формы липосомальной, инактивированной вакцины против ССЯ-76, НБ, ИББ и ИБК (утверждена ректором СПбГАВМ 10.01.01г.);
- методических рекомендаций по изготовлению ксеногенных сывороток к Т- и В-лимфоцитам птиц (утверждено на методическом совете СПбГАВМ, протокол № 1, от 20.11.2002 г.);
- технических условий на сухую и жидкую формы липосомальной, инактивированной вакцины "ЛИПОСОМВАК" против ССЯ-76, НБ, ИББ и ИБК (находятся на рассмотрении в Департаменте ветеринарии МСХиП РФ);
- наставления по применению сухой и жидкой формы липосомальной, инактивированной вакцины "ЛИПОСОМВАК" против ССЯ-76, НБ, ИББ и ИБК (находятся на рассмотрении в Департаменте ветеринарии МСХиП РФ);
Новизна полученных результатов подтверждена авторскими свидетельствами и патентами (А.С. №1635135. 1990 г.; А.С. 12968 от 20.03.2000 г.; А.С.12969 от 20.03.2000 г.; патент № 2155030 от 27.08.2000г., Патент № 2169581. 27.06.2001 г.).
-245
Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Сухинин, Александр Александрович, Санкт-Петербург
1. Абрамов В.В. Взаимозависимость функционирования иммунной и нервной систем //Успехи современной биологии. 1991. - Т.111, вып.6. - С.840-844.
2. Александрова И.Я., Ткаченко Е.И., Сапронов Н.С. и др. Структура, синтез и фармакологическая активность метаболита этимизола //Химико-фармацевтический журнал, 1986. №2. - С. 164-168.
3. Алиев А. С. Эпизоотология инфекционного бурсита //Комплексная система вет. Меропр. в птицеводстве резерв повышения эффективности пр-ва: Тез. докл. Всесоюз. науч.-произв.конф., сент. 1989 г. - Л, 1989. - С. 39-40.
4. Алиев А.С. Иммунодепрессивная активность различных штаммов вируса ИББ //Передовой научно-производственный опыт в птицеводстве, рекомендуемый для внедрения. Загорск, 1992. - № 5. - С. 34-39.
5. Алиев А.С. Инфекционная бурсальная болезнь птиц (эпизоотология, этиология, диагностика и профилактика): Автореф.дисс. д.вет.наук. С.Петербург,- 1993.-42с.
6. Алиев А.С., Калыкова Т.К., Белостоцкая Г.Б. Экспресс-диагностика инфекционной бурсальной болезни индеек //Вирусные болезни с.-х. ж-ных: Тез. докл. Всерос. науч.-практ. конф. Владимир, 1995.-С.251.
7. Алиев А.С., Кудрявцев Ф.С., Джавадов Э.Д., Бакулин В.А. Диагностика инфекционной бурсальной болезни (методические указания). Ленинград, 1991 г. - Юс.
8. Алиев А.С., Кудрявцев Ф.С., Зеленская Н.П. и др. Свойства вируса инфекционного бурсита кур //Ветеринария. 1986. - № 5. - С. 36-38.
9. Архипенко И.В., Невзорова В.А., Гельцер Б.И. Оценка бронхолитического эффекта липосомальной формы беротека //Тез. докл. II Российск. национ. конгресса «Человек и лекарство» (10-15 апреля 1995 г.). М., 1995. - C.I 10.
10. Бакулин В.А. Влияние вируса болезни Гамборо на развитие аденовирусного гепатита с тельцами-включениями //Проблемы вет. проф. в пром. Птицеводстве: Тез. докл. Межрегион, науч.-произв. коорд. совещ., Петрозаводск, 2-4 марта 1994г. СПб.,1994.-С.32.
11. Бакулин В.А. Патоморфогенез и дифференциальная диагностика болезни Гамборо, аденовирусной инфекции и других иммунодепрессивных болезней птиц: Приложение //Архив вет. наук. СПб., Ломоносов, 1998. - Т. 1(48). -322с.
12. Барсуков А.И. Липосомы //Соровский образовательный журнал, 1998, 10, 2-9.
13. Бессарабов Б., Сушкова Н. Препарат против вакцинального стресса //Птицеводство. 1989, № 5. - С.29-30.
14. Богданова М.И., Зубжицкий Ю.Н., Лосев Н.А. и др. О действии производного антифеина-этимизола на уровень антител в эксперименте //Иммунология, 1985. №4. - С. 82-83.
15. Богословская С.И. Об особенностях действия этимизола на метаболические процессы в тканях //Фармакология и токсикология, 1974. №6. С. 708-709.
16. Бородкин Ю.С., Зайцев Ю.В., Лосев В.В., Богословская С.И. Этимизол -оригинальное средство повышения адаптивных возможностей организма //Фармакологическая регуляция состояний дезадаптации. М., 1986. - С. 44-53.
17. Бузлама B.C., Рецкий М.И., Морозов М.П., Кузнецов Л.С. Перспективный стресс-протектор //Ветеринария, 1985. №4. - С.60.
18. Бурцев В.И., Бесхлебнов В.А., Козлова Д.И. Синдром снижения яйценоскости-76 //Вопросы ветеринарной вирусологии /Тез.докл.научн.конф. 1983. -Покров. С.61-66.
19. Васильев Ч.Л. Адъюванты имммунного ответа и макрофаги //Успехи современной биологии. 1986. Т. 101, вып.З - С.430-435.
20. Воронина Т.А. Современные проблемы фармакологии ноотропов: состояние и перспективы //Фармакология и токсикология. 1991 г. - Т.54, № 2. - С. 6-11.
21. Герман В.В., Красников Г.А., Берхане И., Бибин В. Инфекционная бурсальная болезнь (болезнь Гамборо) //Экспресс-информация. Харьков. 1994. - 13 с.
22. Голод Я.Р. К диагностике некоторых вирусных заболеваний цыплят//Сб.науч. трудов/ ВГНКИ. -М., 1975. - № 21. - С.95-97.
23. Горизонтов П.Д., Федотова М.И., Белоусова О.И. и др. Роль Т- и В-лимфоцитов в реакции кроветворной системы на стрессорные воздействия //Бюлл. экспер. биол. и мед., 1980. Т. 89. - №4. - С. 415-417.
24. Горизонтова М.П., Миронова И.В., Решетняк В.К. Влияние этимизола на развитие нейропатического болевого синдрома //Бюлл. эксперим. биол. и мед. 1996. - № 3. - С. 258-261.
25. Горячев В., Худякова Т., Шведкова А., Ложкина Т. Что дало внедрение "Прогресса" //Птицеводство 1991. - № 2. - С.22-26.
26. Гринько Р.А. Стабилизация бислойных фосфолипидных везикул (липосом), содержащих антибиотик //Матер.научно-практ.конф., поев. 75-летию санэпидслужбы России "Здоровье населения и среда обитания". Ставрополь, 1997. -С.251-252.
27. Гречко А.Т. Физиологические механизмы адаптации и ее фармакологическая коррекция "быстродействующими адаптогенами" //Международное медицинское обозрение. 1994 г. - Т.2, № 5. - С. 330-333.
28. Гречко А.Т., Глазников А.А., Бутко Д.Ю. Повышение адаптивной устойчивости раненых к действию факторов воздушно-транспортной эвакуации //Военно-медицинский журнал. 1996 г. - Т.317, №11. - С. 11-13.
29. ГрязноваН.С., Петюшенко P.M., Белявская И.В. и др. Получение липосомальных препаратов различных биологически активных веществ методом детергентного проточного диализа //Антибиотики и химиотерапия. 1992, 37, 7, 3-8.
30. Дворкин В.М. Получение липосом методом обращения фаз без ультразвуковой обработки //Биохимия, 1985, 50, 5.
31. Джавадов Э.Д., Алиев А, С., Кудрявцев Ф.С. и др. Применение иммуноферментного анализа для выявления вируса инфекционного бурсита кур //Ветеринария. 1987. - № 12. - С. 40-42.
32. Джавадов Э.Д., Горбачев Е.Н. Диагностика инфекционного бурсита кур с помощью иммуноферментного анализа//Ветеринария. 1993.-№ 4. - С. 50-52.
33. Евсеев В.А., Магаева С.В.Стресс в механизме развития вторичных иммунодефицитных состояний //Вестник АМН СССР, 1985. 8. С. 18-23.
34. Евстратова К.И., Бахолдина JI.A., Гришин В.В. с соавт. Липосомальная лекарственная форма на основе препаратов, стимулирующих метаболические процессы //Тез.докл. II Российск. национ. конгресса «Человек и лекарство», 1015 апреля 1995.- М., 1995.-С.319.
35. Ефременко В.И. Липосомы (получение, свойства, аспекты применения в биологии и медицине). Ставрополь, 1999. - С. 107.
36. Заводская И.С., Мигас Э.А., Морева Е.В. Применение нейротропных средств, стимулирующих тканевые трофические процессы при лечении язв пораженной слизистой оболочки желудка //Фармакология и токсикология, 1984. Т.47. -№2. - С. 23-28.
37. Заводская И.С., Мигас Э.А., Новиков В.П. Молекулярные основы действия этимизола //Фармакология и токсикология, 1982. № 2. - С. 5-9.
38. Зимин Ю.И. Иммунокомпетентные клетки при стрессе: Автореф. дис. д.мед. наук. М., 1981.-34 с.
39. Ибрагимов А.А., Осидзе С.Д. Синдром снижения яйценоскости-76 (Обзор литературы) //Ветеринария. 1988. - №3.
40. Калыкова Г.К. Вирус инфекционной бурсальной болезни индеек //Вирусные болезни с.-х. ж-ных: Тез. докл. Всерос. науч.-практ. конф. Владимир, 1995. -С. 250.
41. Каплун А.П., Шон Ле Банг, Краснопольский Ю.М., Швец В.И. Липосомы и другие наночастицы как средство доставки лекарственных веществ //Вопросы медицинской химии. 1999, т.45, вып. 1 /99.
42. Кириллов О.И. Процессы клеточного обновления и роста в условиях стресса. -М.: Наука, 1977. 120 с.
43. Кобринский Г.Д. Липосомы транспортеры лекарств //Изд-во «Знание». - М., 1989.-49 с.
44. Корнева Е.А., Шхинек Э.К. Физиологические механизмы влияния стресса на иммунную систему //Вестник АМН СССР, 1985. № 8. - С. 44-50.
45. Коровин Р.Н., Рождественский И.К. Аденовирусные инфекции сельскохозяйственной птицы. В.О. "Агропромиздат". - Л. - 1990.
46. Коровин Р.Н. Ветеринарная профилактика: решение проблемы //Птицеводство. -2001 г.-№4.-С. 51-54.
47. Коромыслов Г.Ф., Игнатов П.Е. Иммуностимуляция: средства, методы, перспектива //Сельскохозяйственная биология, 1983. № 7. - С. 99-107.
48. Корсун Л. Вирус можна подолати //АПК: наука, техника, практика. 1990.- №4.-С.13-14.
49. Коханов Н.Н. Профилактика ССЯ-76 //Птицеводство. 1991. - №8. - С.18-19.
50. Красников Г.А., Герман В.В., Берхане Й.Й., Ольховик JI.A. Гистологические исследования фабрициевой бурсы при болезни Гамборо //Ветеринария. 1996. -№2.-С. 21-25.
51. Крыжаковский Г.Н. Стресс и иммунитет //Вестник АМН СССР, 1985. № 8. -С. 3-12.
52. Кузнецов O.K., Киселев О.И., Автушенко С.С. и др. Экспериментальное изучение сухой липосомальной инактивированной гриппозной вакцины (ЛИГВ) для перорального введения. Современная вакцинология, 1998, Пермь, 107.
53. Кузьмин С.Н., Першин Б.Б., Овсянникова И.Г. Местный иммунитет и проблемы фенотипической иммунокоррекции //Проблемы ветеринарной иммунологии. М.: Агропромиздат, 1985. - С. 23-28.
54. Кузякова JI.M., Ефременко В.И. Медикаментозное преодоление анатомических и клеточных барьеров с помощью липосом. Ставрополь, 2000 г., 170 с.
55. Кукайн Э.М., Муцениеце Р.К., Клуша В.Е. Сопоставление нейро- и иммуномодуляторных свойств низкомолекулярных нейропептидов ///Бюлл. эксп. биол. и мед., 1982. № 8. - С. 79-82.
56. Куликова О.Г., Белявцева JI.M., Рейхардт Б.А., Бородкин Ю.С. Современные аспекты поиска эффективных ноотропных средств //Вестник Росс. Академии мед.наук. 1992. 8. - С. 56-60.
57. Куриленко А.Н., Седов В.А. Основные направления профилактики инфекционного бронхита кур //Ветеринария. 1985, № 6. - С.35-37.
58. Кырге П.К. Глюкокортикоиды в регуляции метаболизма в функции миокарда //Успехи современной биологии, 1984. Т. 97. - Вып. 3 - С. 384-398.
59. Лагуткин Н.А., Вишняков И.Ф. Инфекционная бурсальная болезнь птиц //Ветеринарная газета. 1996. - № 14. - С. 4.
60. Лагуткин Н.А., Вишняков Н.Ф., Кожемяка Н.В. Занос инфекционных болезней птиц // Ветеринария. 1998, № 10. - С.7-9.
61. Ландышев Ю.С., Соболева Г.А. Новый метод эндоб-ронхиального лечения бронхиальной астмы липосомами и водными растворами интала //Тез.докл. II Российск. национ. конгресса «Человек и лекарство» (10-15 апреля 1995).-М., 1995.-C.I 13.
62. Липосомы в биологических системах / Под ред. Г. Грегориадиса, А. Аллисона. М.: Медицина, 1983.
63. Макрушин П.В. Стресс и продуктивность сельскохозяйственных животных. -Саратов, 1985.-48 с.
64. МарголисЛ.Б., Бергельсон Л.Д. Липосомы и их взаимодействие с клетками. М.: Наука, 1986.
65. Медуницин Н.В. Вакцинология. М., 1999. - 272 с.
66. Меерсон Ф.З. Физиология адаптационных процессов. М.: Наука, 1986. - 635с.
67. Мигас Э.А. Пуринергическое действие этимизола //Бюлл. эксп. биол. и мед., 1982.-№9.-С. 70-71.
68. Младенова В., Божкова А., Ярмин П. Методи за лабораторна диагностика на инфекциозния бурзит при пилета //Вет. мед. -1998. Т. 4, №1 .-С. 14-16.
69. Молотковский Ю. Г., Бабак В. П., Бергельсон JI. Д. Антрил- и периленоилмеченые липиды как мембранные зонды //Биол. мембраны, 1984, 1, 33^3.
70. Николаева И.П., Рождественский И.К. Репродукция вируса ССЯ-76 в культуре клеток //Ветеринария. 1982. - №4. -С.28-30.
71. Новиков Б.В., Дмитренко В.В. Влияние вируса болезни Гамборо и В-активина на формирование иммунитета у цыплят против ньюкаслской болезни //Вопр. вет. вирусол., микробиол., эпизоотол. : Мат. науч. конф. ВНИИВВиМ. -Покров, 1992. -Ч. 1.-С. 166-167.
72. Петрова М.И, Новицкий А. А., Кононов А.В., Драновская Е.А. Иммуноадъювантное действие липосом при экспериментальном бруцеллезе опыты на морских свинках. Пробл. адаптации с.-х. животных, Новосибирск, 1997 (1998), 123-124.
73. Плетнева О.П., Оксинойд О.Э., Афонин Н.И. Некоторые аспекты создания лекарственной формы липосомального препарата цитарабина //Вестн. акад. мед.наук.1990, 8, 33 34.
74. Придыбайло Н.Д. Средства и методы повышения эффективности специфической профилактики болезни Марека: Автореф. дис. докт.вет.наук. -Ленинград, 1991 г. 33 с.
75. Придыбайло Н.Д., Шорников В.В., Белкина И.В. и др. Липосомальная вакцина против инфекционного ларинготрахеита //Птицеводство, 1999, 6, 3435.
76. Придыбайло Н.Д., Белкина И.В., Шорников В.В. и др. Липосомальная форма вакцины против ИЛТ //Архив ветеринарных наук, 1999, т.2(49), ч.2, 321-325.
77. Рейхардт Б.А., Куликова О.Г., Белявцева Л.М., Бородкин Ю.С. //Бюлл. эксперим. биол. и мед. 1991. - № 4. - С. 25.
78. Рождественский И.К., Терюханов А.Б., Хохлачев О.Ф. Вакцинопрофилактика вирусных болезней //Птицеводство, 1998, №4, с.34.
79. Руденко Т. Н. Вакцина против ньюкаслской болезни из штамма "ГАМ-61". Автор, дис.канд.биол.наук. М., 2000. - 25 с. с.281-289.
80. Рыбаков С.С. Новые тенденции в исследованиях и разработке вакцин //Ветеринария. 1998. № 10. С.50-52.
81. Сапроненков П.М. Иммунология желудочно-кишечного тракта. Л. Наука. -1987.- 159 с.
82. Савельев В.Ю. и др. Основные параметры отечественных масляных адъювантов.- В кн.: Материалы семинара специалистов стран членов СЭВ /Разработка и использование новых адъювантов для биотехнологических целей. Тез. докл., Владимир, 1990, 9-10.
83. Святковский А.В. Применение оксазепама в животноводстве //Незаразные болезни животных. Научно-технический бюллетень ВАСХНИЛ. -Новосибирск, 1985.-Вып. 13.-С. 10-13.
84. Сазыкин Ю.О., Навашин П.С. Липосомальные лекарственные формы антимикробных агентов //Тез. докл. II Российск. национ. конгресса «Человек и лекарство» (10-15 апреля 1995). -М., 1995.-С.183.
85. Сергеев В.Д. Диагностика инфекционного бронхита кур //Архив ветеринарных наук. 1999. - Т.2(49), ч.2. - С.261-285.
86. Скутарь И.Р., Крецу И.С., Зеленин С.А. Профилактика инфекционных болезней птиц в условиях Республики Молдова //Ветеринария. 1997. - № 2. -С. 12-15.
87. Сухинин А.А. Этимизол: стресс-протективные и иммуностимулирующие свойства. Изд-во "Архив ветеринарных наук", - С.Петербург, 2003 г.- 60 с.
88. Сухинин А.А. Липосомальные вакцины против болезней птиц (теория, практика, технология). Изд-во "Архив ветеринарных наук", С.Петербург, 2003 г.-162 с.
89. Создан Росптицесоюз //Птицеводство. 2001 г. - № 4. - С. 51.
90. Соколов В.Д., Вышвыркин С.В., Андреева Н.Л., Бацанов Н.П. Фармакокоррекция транспортного стресса телят в условиях промышленной технологии выращивания //Методические рекомендации. Л., 1988. — 10 с.
91. Смоленский В.И. Средства и методы специфической профилактики болезней птиц вирусной этиологии. Автореф.дисс. д.биол.наук.- Москва, -1999.-45с.
92. Сухинина Т.Л. Биохимическая и иммунологическая характеристика экспериментального иммунодефицита птиц и его коррекция пептидными препаратами: Автореф. дис. канд.биол.наук. С.Петербург, 1992. - 21 с.
93. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Фомина Н.В. Диагностика вирусных болезней животных. М., 1991. С. 339.
94. Темниханов Ю.Д., Козей Л.Г. Диагностическое сопровождение вакцинопрофилактики в птицеводческиххозяйствах Украины //Вкник Сумського державного аграрного ушверситету. 2000 г. - Вып.5. - С. 118-120.
95. Терюханов А.Б. Мероприятия при ИБК //Ветеринария. 1986. - №6. - С.34-37.
96. Токарских В.В. Специфическая профилактика инфекционного бронхита кур //Архив ветеринарных наук. 1999. - Т.2(49), ч.2. - С.201-260.
97. Трновец Т., Шолтес Л., Безек Ш. и соавт. Фаромакокинетика этимизола //Физиологически активные вещества в медицине. Ереван, 1982 г. С. 287.
98. Фурдуй Ф.И. Гомеостаз, стресс и адаптация //Известия АН МССР. Сер. Биологических и химических наук, 1981. №3. - С. 74-87.
99. Фурдуй Ф.И. Фармакологические механизмы стресса и адаптации при остром действии стресс-факторов. Кишинев: Штиинца, 1986. - 240 с.
100. Хаитов P.M., Лесков В.П. Иммунитет и стресс //Российский физиологический журнал им.И.М.Сеченова. 2001 г. - Т.87, № 8. - С. 10601072.
101. Холодова Е.А., Забаровская З.В., Данилова Л.И. Липосомы в диабетологии //Пробл. эндокринологии. 1990, 36:6, 80-83.
102. Хохлачев О.Ф. Конструирование вакцины и разработка технологии получения и методики вакцинации против синдрома снижения яйценоскости кур: Автореф. дисс. к.вет.наук. С.Петербург, - 1993. - 18с.
103. Шитый А.Г. Стрессоры, стресс и его профилактика в животноводстве //Незаразные болезни животных. Научно-технический бюллетень. -Новосибирск, 1985. Вып. II. - С. 3-5.
104. Яковлев Г.М., Новиков B.C., Хавинсон В.Х. Резистентность, стресс, регуляцияю. Ленинград, " Наука". 1990 г. - С. 238.
105. Яковлева Е.Г., Коковия Л.М., Карапетова Л.Б. и др. Превентивное действие феназепана при кратковременном стрессе у цыплят //Сб. науч. трудов / Туркменский СХИ, 1983. Вып. 2. - Т. 26. - С. 145-152.
106. Adair В.М. Studies on the development of avian adenoviruses in cell cultures //Avian Pathol.- 1978. 7:541-550.
107. Adair B.M., Curran W.L., McFerran J.B. Ultrastructural studies of the replication of fowl adenovirus in primary cell cultures //Avian Pathol.- 1979. 8:133-144.
108. Adair B.M., McFerran J.B., Connor T.J. et al. Biological and physical properties of a virus (strain 127) associated with the egg drop syndrome 1976 //Avian Pathol.-1979. 8:249-264.
109. Aini I; Ibrahim AL; Spradbrow PB. Field trials of a food-based vaccine to protect village chickens against Newcastle disease //Res. Vet. Sci., 1990 Sep, 49:2, 216-9.
110. Albassam M.A., Winterfield R.W., Thacker H.L. Comparison of the nephropathogenicity of four strains of infectious bronchitis virus //Avian Dis.- 1986. 30:468-476.
111. Aleksander D.J. Newcastle Disease and Other Paramyxovirus Infections //Disease Poultry: 1998. -P.648-663.
112. Alexander D.J. Newcastle disease and other paramyxovirus infections. 1992. P.496-519.
113. Alexander D.J. Newcastle Disease Virus -An Avian Paramyxovirus. In D.J. Alexander (ed.), Newcastle Disease, -1988. pp. 11-22. Kluwer Academic Publ, Boston.
114. Alexander D.J. Newcastle Disease: Methods of Spread. In D.J. Alexander (ed.), Newcastle Disease, -1988. pp. 256-272. Kluwer Academic Publ, Boston.
115. Alexander D.J., Allan W.H. Newcastle disease virus pathotypes //Avian Pathol. -1974. 3:269-278.
116. Alexander DJ; Campbell G; Manvell RJ; et al. Characterisation of an antigenically unusual virus responsible for two outbreaks of Newcastle disease in the Republic of Ireland in 1990 //Vet. Rec., 1992 Jan, 130:4, 65-8.
117. Allan W.H., Lancaster J.E., Toth B. Newcastle disease vaccines-their production and use. FAO Anim Prod SerNo. 10. FAO, Rome, -1978.
118. Allison A.C., Gregoriadis G. Liposomes as immunological adjuvants . Nature, 1974, 252, 252.-259154. Alving C.R. Liposome as carriers of antigen and adjuvants //J .Immunol.Methods,1991, 140, 1-14.
119. Ambali, A.G., Jones, R.C. Early pathogenesis of an enterotropic variant of infectious bronchitis virus in chickens. //Avian Diseases .1990. - 34, 809-817.
120. Amhrosch H., Wietfermann J., Jonas S. el al. Immunogenicitty and protectivity of a new Liposomal hepatitis A vaccine // Vaccine, 1997,15, 1209-1213.
121. Andrade L.F., Villegas P., Fletcher O.J. Vaccination of day-old broilers against infectious bronchitis: Effect of vaccine strain and route of administration //Avian Dis.- 1983.-27:178-187.
122. Azad A.A., Hudson P.J., O'Doppell J.J. Infectious bursal disease virus vaccine //Annu rept. CSIRO. Div.Protein cnem. Merbourhe, 1983-1984. P. 40-41.
123. Babei I; Samira S; Barenholz Y. et al. A novel influenza subunit vaccine composed of liposome-encapsulated haemagglutinin/neuraminidase and IL-2 or GM-CSF. I. Vaccine characterization and efficacy studies in mice //Vaccine, 1999, 17:910, 1223-1238.
124. Badstue P.B., Smidt B. Egg drop syndrome 76 in Danish poultry //Nord. Vet. Med.- 1978. 30:498-505.
125. Bangham A.D., Home R.W. Negative Staining of Phospholipids and their Structured Modification by Surface Agents as Observed in the Electron Microscope //J. Mol. Biol. 1964, 8, 660-668.
126. Barbour EK; Newman JA Preliminary data on efficacy of Mycoplasma gallisepticum vaccines containing different adjuvants in laying hens //Vet. Immunol. Immunopathol., 1990, 26:2, 115-123.
127. Barbour EK; Newman JA Comparison of Mycoplasma gallisepticum subunit and whole organism vaccines containing different adjuvants by western immunoblotting //Vet. Immunol. Immunopathol., 1989, 22:2, 135-144.
128. Barbour EK; Newman JA; Sivanandan V; Halvorson DA; Sasipreeyajan J Protection and immunity in commercial chicken layers administered Mycoplasma gallisepticum liposomal bacterins //Avian Dis, 1987 Oct, 31:4, 723-729.
129. Bartha A. Dropped egg production in ducks associated with adenovirus infection //Avian Pathology. 1984. - V.13, №1. - PI 19-126.
130. Bartha A.J., Meszaros J., Tanyi J. Antibodies against EDS 76 avian adenovirus in bird species before 1975 //Avian Pathol.- 1982. 11:511-513.
131. Baxendale W. Egg drop syndrome 76 //Vet.Rec. 1978. - V.102, №13. - P285-286.
132. Baxendale W., Lutticken D., Hein R., McPherson I. The results of field trials conducted with an inactivated vaccine against the egg drop syndrome 76 (EDS 76)// Avian Pathol.- 1980. 9:77-91.
133. Bayyari G.R., Skeeles J.K., Story J.D. Slavik M.F. Determination of infectious bursal disease virus titration and neutralization endpoints using fluorogenic staining //Avian Dis. 1991. -V. 35.N3.-P. 476-480.
134. Bayyari G.R.; Story J.D.; Beasley J.N.; Skeeles J.K Antigenic characterization of an Arkansas isolate of infectious bursal disease virus //Avian Dis, 1996 Jul, 40:3, 588-99.
135. Beard C.W, Easterday B.C. The influence of route of administration of Newcastle disease virus on host response //J. Infect. Dis.- 1967. 117:55-70.
136. Beard P.D., Spalatin J., Hanson R.P. Strain identification of NDV in tissue culture// Avian Dis. 1970. - 14:636-645.
137. Beard C.W, Hanson R.P. Newcastle disease. In M.S. Hofstad, H.J. Barnes, B.W. Calnek, W.M. Reid, H.W Yoder (eds.), Diseases of Poultry, 8th Ed., -1984. pp. 452-470. Iowa State Univ Press, Ames.
138. Beard C.W. Serologic procedures. In S.B. Hitchner, C.H. Domermuth, H.G. Purchase, and J.E. Williams (eds). Isolation and Identification of Avian Pathogens, -1980. pp. 129-135. Am Assoc Avian Pathol, Ken-nett Square, PA.
139. Bell IG; Nicholls PJ; Norman C; Cooper K; Cross GM. The serological responses of chickens to mass vaccination with a live V4 Newcastle disease virus vaccine in the field and in the laboratory. 1. Meat chickens //Aust. Vet. J., 1991 Mar, 68:3, 859.
140. Bengelsdorff H.-J., Bernhardt D. Serological examinations after vaccination of chicks with mouse-adapted infectious bursitis disease //Proc. 19th World Vet. Congr., Mexico City, Mexico, 1971. Mexico City, Mexico, 1971. - V. 2. - P. 786-787.
141. Bennejean G., Guittet M., Picault J. Chute de ponte associee a la production d'oeufs sans coquille: nouvelle maladi infectieuse de la poule //Bull. Soc.Sc.Veter.Med.Comp. Lyon. 1979. - V.81, №3. -P.159-165.
142. Berg T.P. van den, Meulemans G. Acute infectious bursal disease in poultry: protection affroded by maternally derived antibodies and interference with live vaccination //Avian Pathol. 1991. - V. 20, N3.-P. 409-421.
143. Berclaz Т., McConnell H. M. Phase equilibria in binary mixtures of dimyristoylphosphatidylcholine and cardiolipin //Biochemistry, 1981, 20, 6635— 6640.
144. Bhattachaijee P. S., Jones R. C. Susceptibility of organ cultures from chicken tissues for strains of infectious bronchitis virus isolated from the intestine //Avian Pathology (1997)26,553-563.
145. Bidin Z; Cajavec S; Sladic D., et al. Protection of broiler breeders by an inactivated combined water-in-oil-in-water viral vaccine. //Acta Vet Hung, 1998, 46:1,25-34.
146. Borzemska W., Romanik A., Sobiepanek M. et al. Ostra forma choroby Gumboro u 18-tygodniowych kur //Med. Wet. 1994. - V. 50, N 12.-P. 603-604.
147. Box P.G. Potency of infectious bursal disease (IBD) killed vaccines //Poultry Intern. 1989. - V. 28, N 5. - P. 62.
148. Box P.G., Holmes H.C., Finney P.M., Froymann R. Infectious bronchitis in laying hens: The relationship between hemagglutination inhibition antibody levels and resistance to experimental challenge //Avian Pathol.- 1988. 17:349-361.
149. Brugere-Picoux J. La maladie de Gumboro (Bursite infectiouse) //Bull. Soc. Vet. Prat. Fr. 1990. - V. 74, N 2. - P. 65-84.
150. Brown ТР., Glisson J.R., Resales G., et al. Studies of avian urolithiasis associated with an infectious bronchitis virus //Avian Dis.- 1987. 31:629-636.
151. Buckl I. (Бакл Д.) Гормоны животных. М.: Мир, 1986 г. - 86 с.
152. Capua, I., Gough, R.E., Mancini, М., Casaccia, С., Weiss, С. A novel infectious bronchitis strain infecting broiler chickens in Italy. //Journal of Veterinary Medicine Series B, 1994.- 41, 83-89.
153. Cavanagh, D. Advances in avian diagnostic technology. Лп Xth World Veterinary Poultry Association Congress, Sydney, 1993, pp. 57-70.
154. Cavanagh, D. The Coronavirus surface glycoprotein. Яп S.G. Siddell (Ed.), The Coronaviridae (pp. 73-113). New York: Plenum Press.- 1995.
155. Chandravanshi R.R.S. Strategic planning of IBD control //Poultry Adviser. -1993.-V. 26, N 8. P. 25-27.
156. Charles SD; Hussain I; Choi CU; Nagaraja KV; Sivanandan V. Adjuvanted subunit vaccines for the control of Salmonella enteritidis infection in turkeys //Am. J. Vet. Res., 1994, 55:5, 636-642.
157. Chen B.Y., Hosi S., Nunoya Т., Itakura C. Histopathology and immunohistochemistry of renal lesions due to infectious bronchitis vims in chicks. //Avion Pathology,- 1996. 25, 269-283.
158. Chen H.Y., Zhou Q., Zhang M.F., Giambrone J.J. Sequence analysis of the VP2 hyper-variable region of nine infectious bursal disease virus isolates from Mainland China //Avian Dis. 1999. - V. 42, N 4. - P. 762-769.
159. Chetty M.S., Rao A.S., Reddy T.V. Seroprevalevse of egg drop syndrome in ducks in Andhra Pradesh //Kerala Jour.Veter.Sc. 1987. - V.18, №2. - P.49-54.
160. Cheville N.F, Stone H., Riley J., Rit-chie A.E. Pathogenesis of virulent Newcastle disease in chickens //J. Am. Vet. Med. Assoc . -1972.- 161:169-179.
161. Childers N.K.; Michalek S.M; Pritchard D.G; McGhee J.R. Mucosal and systemic responses to an oral liposome-Streptococcus mutans carbohydrate vaccine in humans //Reg. Immunol., 1990, 3:6, 289-96.
162. Chu H.R, Snell G., Alexander D.J., Schild G.C. A single radial immunodiffusion test for antibodies to Newcastle disease virus //Avian Pathol. -1982. 11:227-234.
163. Chubb R.C. The detection of antibody to avian infectious bronchitis virus by the use of immuno-fluorescence with tissue sections of nephritic kidneys //Aust. Vet. J.-1986.-63:131-132.
164. Cohen S.; Alonso M.J.; Langer R. Novel approaches to controlled-release antigen delivery//Int J. Technol Assess Health Care, 1994, 10:1, 121-30.
165. Coman Т., Coman S., Gugiu L. et al. Raspunsul imun indus de unele tulpini de virus al bursitei infectioase aviare utilzate in prepararea vaccinului inactivat uleios //Zootechn. Med. Vet. 1990. - V. 50, N 2.-P. 30-38.
166. Cook J.K.A., Darbyshire J.H. Longitudinal studies on the egg drop syndrome 1976 (EDS 76) in the fowl following experimental infection at 1-day old //Avian Pathol.- 1981. 10:449-459.
167. Cook J.K.A. The classification of new serotypes of infectious bronchitis virus isolated from poultry flocks in Britain between 1981 and 1983 //Avian Pathol.- 1984. 13:733-741.
168. Coria M.F. Stabilizing effect of magnesium sulfate on avian infectious bronchitis virus propagated in chicken embryo kidney cells //Appi. Microbiol. -1972. 23:281284.
169. Cosgrove, A.S. An apparently new disease of chickens—avian nephrosis //Avian Dis. 1962. 6:385-389.
170. Co wen B. Update on adenoviruses in chickens //Zootech.Intern. 1979. -№11.-P.3-8.
171. Cowen B.S., Wideman R.F., Rothenbacher H., Braune M.O. An outbreak of avian urolithiasis on a large commercial egg farm //Avian Dis. -1987.- 31:392-397.
172. Cowen B.S., Wideman R.F., Braune M.O., Owen R.L. An infectious bronchitis virus isolated from chickens experiencing a urolithiasis outbreak. I. In vitro characterization studies //Avian Dis.- 1987. 31:878-883.
173. Crinion R.A.P, Ball R.A., Hofstad M.S. Abnormalities in laying chickens following exposure to infectious bronchitis virus at one day old //Avian Dis.- 1971. -15:42-48.
174. Cruz-Coy J.S., Giambrone J.J., Hoerr F.J. Immunohistochemical detection of infectious bursal disease virus in formalin-fixed, paraffin-embedded chicken tissues using monoclonal antibody //Avian Dis. 1993. - V. 37, N 2. - P. 577-582.
175. Cryz S.J., One J.U., Gluck R. Virosome vaccine antigen delivery system does not stimulate an antiphospholipid antibody response in humans // Vaccine, 1996, 14, 1381-1383.
176. Csermelyi M., Thijssen R., Orthel F., et al. Serologicat classification of recent infectious bronchitis virus isolates by the neutralization of immunofluorescent foci //Avian Pathol.- 1988. 17:139-148.
177. Cullis P. R. Lateral diffusion rates of phosphatidylcholine in vesicle membranes: Effects of cholesterol and hydrocarbon, pliase transition.- FEBS Lett., 1976, 70, 223—228.
178. Cullen G.A. Infectious bursal disease (Gumboro disease) //Comp.Rep. Techn. Items Present. Intern. Commit. Regional Commis. -1994.-P. 19-29.-265224. Cunningham C.H. Avian infectious bronchitis //Adv. Vet. Sci. Сотр. Med.- 1970. 14:105-148.
179. Cursiefen D., Vielitz E., Landgraf H., Becht H. Evaluation of vaccine against infectious bursal disease in field trials //Avian Pathol. 1979.-V. 8.-P. 341-351.
180. Darbyshire J.H., Peters R.W. Studies on EDS-76 virus infection in laying chickens //Avian Pathol. 1980, №3. -P.277-290.
181. Davelaar F.G., Kouwenhoven B. Vaccination of 1-day-old broilers against infectious bronchitis by eye drop application or coarse droplet spray and the effect of revaccination by spray //Avian Pathol.- 1980. 9:499-510.
182. Davelaar F.G., Kouwenhoven В., Burger A.G. Occurrence and significance of infectious bronchitis vims variant strains in egg and broiler production in the Netherlands //Vet. Q. -1984. 6:114-120.
183. De Krijf В., Zoelen E. G. G., Deenen L. L. M. Glycophorin facilitates tlie transhilayer movement of phospatidylcholine in vesicle //Biochim. et biopliys. acta, 1978, 509, 537—542.
184. De Wit J. J., de Jong M. С. M., Pijpers A. , Verheijden J. H. M. Transmission of infectious bronchitis virus within vaccinated and unvaccinated groups of chickens //Avian Pathology .- 1998. 27. - P. 464-71.
185. Dhinakar Raj, G., Jones, R.C. Immunopathogenesis of infection in SPF chicks and commercial broiler chickens of variant infectious bronchitis virus of economic importance. //Avian Pathology, 1996. 25,481-501.
186. Dhinakar RAJ G., Jones R. C. Infectious bronchitis virus: immunopathogenesis of infection in the chicken //Avian Pathology (1997) 26, 677-706.
187. Dhinakar RAJ. G, Jones R. C. Cross-reactive cellular immune responses in chickens vaccinated with live infectious bronchitis virus vaccine //Avian Pathology (1997)26, 641- 649.
188. Dobos P., Rowe D. Peptide map comparison of infectious pancreatic necrosis virus-specific proteins //J. Virol. 1977. - V. 24. - P. 805-820.
189. Edgar S.A., Cho У. Avian nephrosis (Gumboro disease) and its control by immunization //Poultry Sci. 1965. - V. 44. - P. 1366.
190. Eterradossi N; Picault J.; Drouin P. Et al. Pathogenicity and preliminary antigenic charac- terization of six infectious bursal disease virus strains isolated in France from acute outbreaks //Zentralbl Veterinarmed B., 1992 Nov, 39:9, 683-91.
191. Everly I., Rosenfeld R. (Эверли Д.С., Розенфельд Р.). Стресс: природа и лечениеЮ М.: Медицина, 1985 г. - 224 с.
192. Fahey K. J., McWaters P. , Brown M.A.et al. Virus-Neutralizing and Passively Protective Monoclonal Antibodies to Infectious Bursal Disease Virus of Chickens //Avian Dis. 1991.35:365-373.
193. Faragher J. Т., Allan W.H., Cullen G.A. Immunosuppressive effect of the infectious bursal agent in the chicken //Nature New Biol. -1972.-V.237.-P. 118-119.
194. Fatunmbi 0.0., NewmanJ.A., SivandanV., et al. Efficacy of avridine and liposomes as adjuvant for avian influenza vims antigens in turkeys //Avian Pathol, 1992,21,2, 225-237.
195. Fatunmbi O.O; Newman J.A; Sivanandan V; Halvorson D.A. Enhancement of antibody response of turkeys to trivalent avian influenza vaccine by positively charged liposomal avridine adjuvant //Vaccine, 1992, 10:9, 623-6.
196. Fiani M.L., Grimaldi P., Sargiacomo M. et al. Development for liposomal carrier specific for mucosal immunity //Ann. Sclavo. 1986 (1987). -N 1-2. -P.123-124.
197. Firth G.A., Hall M.J., McFerran J.B. Isolation of a hemagglutinating adenolike virus related to virus 127 from an Australian poultry flock with an egg drop syndrome//Aust Vet. 1981.- 57:239-242.
198. Frazard F. Liposomes: from biophysics to the design of peptide vaccines //Braz. J. Med. Biol. Res, 1999, 32:2, 181-9.
199. Freire E., Snyder B. Compositional domain structure of lipid membranes.- In: Membrane and transport. N.Y.; L., 1982, 1, 37—41.
200. French, E.L., George T.D. St., Percy J.J. Infection of chicks with recently isolated Newcastle disease viruses of low virulence //Aust. Vet. J.- 1967. 43:404-409.
201. Frey A., Neutra M.R. Targeting of mukosal vaccines to Peyers's patch M cells. 1997 Feb, 98, 376-389.
202. Friederichs M., Siegmann O, Heffels Redmann U. Et al. Pathogenesis of "egg drop syndrome (EDS 76)" after experimental infection of day-old chicks and laying hens //Berliner und Munchen Tierarztliche Wochenschrift. 1987. - VI00, №2. -P41-47.
203. Fukasawa M; Shimizu Y; Shikata K. et al. Liposome oligomannose-coated with neoglycolipid, a new candidate for a safe adjuvant for induction of CD8+ cytotoxic T lymphocytes. FEBS Lett, 1998 Dec 28, 441:3, 353-356.
204. Giambrone J J; Closser J. Effect of breeder vaccination on immunization of progeny against Newcastle disease //Avian Dis., 1990 Jan, 34:1, 114-9.
205. Githkopoulos P., Paschaleri-Papadopoulou E., Panagiotidou-Mamalouka V. Serological survey for the presence of haemahhlutination-inhibition to egg drop syndrome 76 virus in N.Greece //Bull.Helen.Veter.Med.Soc. 1983, v.34, №3. P.230-235.
206. Click B. How it all began: the continuing story of the bursa of fabricius //Avian Immunol.: Basis and Practic. Florida, 1987. - V. l.-P. 1-7.
207. Gluck U., Gebbers J.O., Gluck R. Phase I evaluation ofintranasal virosomal influenza vaccine with and without Escherichia coli heat-labile toxin in adult volunteers //Journal virology, 1999, Sep., 73:9, 7780-7786.
208. Gluck R. Adjuvant activity of immunopotentiating reconstituted influensa virosomes (IRIVs)//Vaccine, 1999, 17, 1782-1787.
209. Goater E. Contre "le sindrome EDS-76" solutions: L'hygiene et la vaccination //Le courrier avicole. 1978. -V.34, №713. - P.9-12.
210. Gould Fogerite S; Edghill Smith Y; Kheiri M. et al. Lipid matrix-based subunit vaccines: a structure-function approach to oral and parenteral immunization. AIDS Res Hum Retroviruses, 1994, 10, 2:, 99-103.
211. Gregoricidis G., Davis D., Davies A. Liposomes as immunological adjuvants: antigen incorporation studies // Vaccine 1987, 5, 145-151.
212. Gregoriadis G., Panagiotidi C. Immunoadjuvant action of liposomes: comparison with other adjuvants //Immunology Letters, 1989, 20,237-240.
213. Gregoriadis G. Immunological adjuvants: a role for liposomes //Immunology Today, 1990, 11, 89-97.
214. Gregoriadis G. The immunological adjuvant and vaccine carrier properties of liposomes //J. Drug Target, 1994,2:5, 351-6.
215. Gregoriadis G. Engineering liposomes for drug delivery: progress and problems. Trends. Biotechnol, 1995, 13:12, 527-37.
216. Guittet M., Picault J.P., Bennejean G. Experimental soft-shelled eggs disease (EDS 76) in guinea fowl (Numida meleagridis). Proc 7th Int Congr World Vet Poult Assoc,-1981.-pp. 22.
217. Gulka C.M., Piela Т.Н., Yates V.J., Bagshaw C. Evidence of exposure of waterfowl and other aquatic birds to the hemagglutinating duck adenovirus identicalto EDS-76 virus //Jour.Wildlife Dis. 1984. - V.20, №1. - P.l-5.
218. Haan A; Renegar KB; Small PA Jr; Wilschut J. Induction of a secretory IgA response in the murine female urogenital tract by immunization of the lungs with liposome-supplemented viral subunit antigen //Vaccine, 1995 May, 13:7, 613-616.
219. Hanson R.P, Brandly C.A. Identification of vaccine strains of Newcastle disease virus //Science, -1955. 122:156-157.
220. Hale A., Ruebush M., Lyies D. S., Harris D. Antigen-liposome modification of target cells as a method to alter their susceptibility to lysis by cytotoxic T-lymphocytes //Proc. Nat. Acad. Sci. US, 1980, 77, 6105—6108.
221. Halvorson DA; Shaw D; Sivanandan V; et al. Serological response in broiler chicks to different commercial Newcastle disease and infectious bronchitis vaccines //Avian Dis., 1991 Oct, 35:4, 978-81.
222. Harokopakis E. Childers N.K., Michaiek S.M. et al. Conjugation of cholera toxin or its В subunit to liposomes for targeted delivery of antigens //J.Immunol.Meth. -1995.-V. 185, N1. P.31-42.
223. Hassan M.K.; Natour M.Q.; Ward L.A.; Saif Y.M. Pathogenicity, attenuation, and immunogenicity of infectious bursal disease virus //Avian Dis, 1996 Jul, 40:3, 567-71.
224. Hathcock T.L., Giambrone J.J. Dioxigenin-labeled nucleic acid probe for the detection of infectious bursal disease virus in infected cells //Avian Dis. 1992. - V. 36, N2.-P. 206-210.
225. Hilgers LA; Nicolas I; Lejeune G; et al. Alkyl-esters of polyacrylic acid as vaccine adjuvants //Vaccine, 1998 Oct, 16:16, 1575-81.
226. Hitchner S.B. Infectivity of infectious bursal disease virus for embryonating eggs //Poultry Sci. 1970. - V. 49. - P. 511-516.
227. Hofstad M.S. Avian infectious bronchitis. In M.S. Hofstad, H.J. Barnes, B.W. Calnek, W.M. Reid, and H.W. Yoder, Jr., (eds.). Diseases of Poultry, 8th Ed., -1984. pp. 429-443. Iowa State Univ Press, Ames.
228. Holzer B.R., Hats C., Schmidt-Sissolak D. el al. Immunogenicity and adverse effects of inactivated virosome versus alum-adsorbed hepatitis A vaccine: a randomized controlled trial// Vaccine, 1996,14, 982-986.
229. Hopkins S.R., Beard C.W. Studies on methods for determining the efficacy of oil emulsion vaccines against infectious bronchitis virus //J. Am. Vet. Med. Assoc.-1985. 187:305.
230. Horocopakis E.; Hajishengallis G; Michalek SM. Effectiveness of liposomes possessing surface-linked recombinant В subunit of cholera toxin as an oral antigen delivery system //Infect. Immun., 1998, 66:9, 4299-4304.
231. Hoshi S.; Nakamura Т.; Nunoya Т.; Ueda S. Induction of protective immunity in chickens orally immunized with inactivated infectious bursal disease virus //Vaccine, 1995 Feb, 13:3,245-52.
232. Htth://www.oil.int/http://www/oil/int/office international des Epizooties. Chapter 2.1.15. Newcastle disease.
233. Hugh-Jones M., Allan W.H., Dark F.A., Harper G.J. The evidence for the airborne spread of Newcastle disease //J. Hyg. Camb. 1973. - 71:325-339.
234. Hwang M.H., Lamas J.M., Hipolito 0., Silva E.N. Egg drop syndrome 1976: A serological survey in Brazil. Proc 6th Eur Poult Conf, 1980. pp. 371-378.
235. Ignjatovic, J., Ashton, F. Detection and differentiation of infectious bronchitis viruses using a monoclonal antibody based EUSA //Avian Pathology, -199). 25, 721736.
236. Ignjatovic J., Sapats S. I., Ashto F. S A long-term study of Australian infectious bronchitis viruses indicates a major antigenic change in recently isolated strains //AvianPathology (1997) 26, 535-552.
237. Iordanis T.V., Kompati M., Artopios E.V. The role maternal in antibodies in preventing infectious bursal disease (IBD, Gumboro disease) during the first weeks of age of chicks //Bull. Hellen. Med. Soc. 1991. - V. 42, N 4. - P. 245-249.
238. Ishii N; Fukushima J; Kaneko T; et al. Cationic liposomes are a strong adjuvant for a DNA vaccine of human immunodeficiency virus type 1. AIDS Res Hum Retroviruses, 1997,13:16, 1421-1428.
239. Jackwood D J., Saif Y.M. Prevalence of antibodies to infectious bursal disease virus serotypes 1 and 11 in 75 Ohio chicken flocks //Avian Disease. 1983. -Vol.27. - P.850-854.
240. Jackwood D.J., Hanes G., Miller S.H. Infectious bursal disease viral RNA amplification using RT/PCR from bursa tissue following phenol: chloroform inactivation of the virus //Avian Dis. 1996. - V. 40, N 2.-P. 457-460.
241. Jackwood DJ; Sommer SE Restriction fragment length polymorphisms in the VP2 gene of infectious bursal disease viruses //Avian Dis., 1997 Jul, 41:3, 627-37.
242. Jackwood DJ; Sommer SE Genetic heterogeneity in the VP2 gene of infectious bursal disease viruses detected in commercially reared chickens. //Avian Dis, 1998 Apr, 42:2, 321-39.
243. Jackwood DJ; Sommer SE Restriction fragment length polymorphisms in the VP2 gene of infectious bursal disease viruses from outside the United States //Avian Dis, 1999 Apr, 43:2, 310-4.
244. Jackwood D.J., Sommer S.E., Odor E. Correlation of enzyme-linked immunosorbent assay titers with protection against infectious bursal disease virus //Avian Dis. 1999. - V. 43, N 2. - P. 189-197.
245. Kaleta E.E, Khalaf S.E.D., Siegmann 0. Antibodies to egg drop syndrome 76 virus in wild birds and in possible conjunction with egg shell problem //Avian Pathol.- 1980. 9:587-590.
246. Kalomboheti Т.; Chaisri U; Srimanote P; Pongponratn E; Chaicumpa W. Immunogenicity and protective role of three formulations of oral cholera vaccine //Vaccine, 1998, 16:2-3, 201-207.
247. Khemka V; See D; See J. et al. The capacity of a combined liposomal hepatitis В and С vaccine to stimulate humoral and cellular responses in mice //Viral. Immunol., 1998, 11:2, 73-8.
248. Kibenge F.S.B., Dhillon A.S., Russell R. G. Biochemistry and immunology of infectious bursal disease virus //J. gen. Virol. 1988. -V. 69.N8.-P. 1757-1775.
249. Kim S., Martin G. Preparation of cell-size unilammelar liposomes with high captured volume and defined size distribution //Biochim. et biophys. acta. 1981. -V.646. - P. 1-9.
250. King D.J., Hopkins S.R. Rapid sero-typing of infectious bronchitis virus isolates with the hemagglutination inhibition test //Avian Dis.- 1984. 28:727-733.
251. King , DJ. A comparison of infectious bronchitis vims hemagglutination-inhibition test procedures //Avian Dis.- 1988. 32:335-341.
252. King D.J., Cavanagh D. Infectious bronchitis. 1992. P. 471-484.
253. Klieve A.V., Cumming R.B. Immunity and cross-protection to nephritis produced by Australian infectious bronchitis viruses used as vaccines //Avian Pathol.- 1988. -17:829-839.
254. Knigt C.G. Liposomes: From physical structure to therapeutic applications. 1981.- 497 p. 726. Fiani M.L., Grimaldi P., Sargiacomo M. et al. Development for liposomal carrier specific for mucosal immunity //Ann. Sclavo. 1986 (1987). -N 12. -P.123-124.
255. Koch G., Hartog L., Kant A., et al. Antigenic differentiation of avian infectious bronchitis virus variant strains employing monoclonal antibodies //Isr. J. Vet. Med.-1986.-42:89-97.
256. Kraft V, Grund S., Monreal G. Ultra-structural characterisation of isolate 127 of egg drop syndrome 1976 virus as an adenovirus //Avian Pathol.- 1979. 8:353-361.
257. Krecov N., Vasic В., Simic V. et al. Immunogenic value of inactivated egg drop syndrome vaccine produced in this country //Veterinaria Sarajevo. 1980. - V.29, №403. - P.273-278.
258. Kumar S., Wallach D.F.H. Non-phospholipid liposome bused vaccines for use in poultry. Proc. 19 th World Poultry Congr. Amsterdam 19-24, sept. 1992, 1,475.
259. Kusters J.G., Niesters H.G.M., Bleumink-Pluym N.M.C., et al. Molecular epidemiology of infectious bronchitis virus in the Netherlands //J. Gen. Virol. -1987.- 68:343-352.
260. Kwon, H.M., Jackwood, M.W., Brown, T.P., Hilt, D.A. Polymerase chain reaction and a biotin-lahelled DNA probe for detection of infectious bronchitis virus in chickens. //Avian Diseases, 1993-37, 149-156.
261. Lachmcm I.B., Ozpolat В., Rao X.M. Cytokine containing liposomes as vaccine adjuvants //European Cytokine Netw, 1996, 7, 693-698.
262. Lancaster J.E., Alexander D.J. Newcastle disease: Virus and spread. Monogr No. 11, Can Dep Agric, Ottawa, 1975.
263. Laser H.N., Shane S.M. Infection bursal disease //World Poultry Science Jornal.-July 1994, V.50, p.133-166.
264. Lasic D.D. Novel applications of liposomes. TIBTECH ,1998 , 16, 307-322.
265. Lasher H.N.; Davis V.S. History of infectious bursal disease in the U.S.A.—the first two decades //Avian Dis, 1997 Jan, 41:1,11-9.
266. Lee A. G. Lipid phase transitions and phase diagrams. II. Mixtures involving lipids. Biochim. et biophys. acta, 1977, 472,285—344.
267. Lin T.L., Wu C.C. Molecular detection and differentiation of infectious bursal disease virus: Abstr. //25th World. Vet. Congr., 1995, Yokohama, Japan. Yokohama, Japan, 1995.-P. 259.
268. Linuma H., Nerome K., Yoshioka Y. et al. Characteristics ofcytotoxic T lymphocytes directed to influenza virus haemagglutinin eicited by immunization with muramyldipeptide-influenza liposome vaccine //Scandinavian journal of immunology, 1995,41, 1-10.
269. Liposome letters/Ed. A. D. Bangham. L.; N. Y.: Acad, press, 1983, 421 p.
270. Lu Y.S., Lin D.F., Tsai H.J. et al. Outbreaks of egg drop syndrome-1976 in Taiwan and isolation of the etiologi-cal agent //J. Chin. Soc. Vet. Sci.- 1985. -11:157-165.
271. Lukert P.D. Infectious bronchitis. In S.B. Hitchner, C.H. Domermuth, H.G. Purchase, and J.E. Williams (eds.), Isolation and Identification of Avian Pathogens, 2nd Ed., -1980. -pp. 70-72. Am Assoc Avian Pathol, Kennett Square, PA.
272. Lukert P.D., Hitchner S.B. Infectious bursal disease //Diseases of Poultry: Edet.by M.S. Hofstad et.al. Files, 70 WA, 1984. P. 566-576.
273. Lukert P.D., Saif У.М Infectious bursal disease //Disease Poultry: Iowa State Univ. Press, Ames, Iowa, Ames, Iowa, 1997. - P. 721-738.
274. Lukert P.D., Saif Y.M. Infectious bursal disease //Disease Poultry: 1998. P.648-663.
275. Madbouly H.M., Afifi M.A. Comparison between solid phase ELISA, dot ELISA and agar gel precipitation test for detection of bursal disease viral antigen in bursal homogenates //Vet. Med. J. Giza. -1995.-V.48.N1.-P. 37-42.
276. Mahadrika L.G.N.K. Untersuchungen uber die genetische Grund-lage der Antigenverwandtschaft zwischen den beiden Serotypen des Vims der infecktiosen Bursitis: Inaug. Diss.- Giessen, 1995. 123 S.
277. Makkay AM; Krell PJ; Nagy E. Antibody detection-based differential ELISA for NDV-infected or vaccinated chickens versus NDV HN-subunit vaccinated chickens // Vet.Microbiol, 1999 Apr, 66:3, 209-22.
278. Malkinson M., Weismann Y. Serological survey of the prevalence of antibodies to egg drop syndrome 1976 virus in domesticated and wild birds in Israel //Avian Pathol. 1980. - V.9, №3. - P421-426.
279. McFerran J.B., McCracken R.M., McKillop E.R. et al. Studies on a depressed egg production syndrome in Northern Ireland //Avian Pathol.- 1978. 35-47.
280. Mcferran J.B. Egg drop syndrome 1976 //Veter. Q. 1979. - V. 1, №4. P. 176-180.
281. McFerran J.B., McCracken R.M. Newcastle disease. In D.J. Alexander (ed.), Newcastle Disease, -1988. pp. 161-183. Kluwer Academic Publ, Boston.
282. McFerran J.B. EDS-76:revisited. Preceding of 37-th Western poultry disease conference, Davis, Colifornia. - 1988, 29.02-02.03. - P. 14-16.
283. Mengiardi В., Berger R., Just M. et al. Virosomes as carries for combined vaccines//Vaccine, 1995, 13, 1306-1315.
284. Mesteckly J. The common mucosal immune responses in external secretions //J.Clin.Immunol, 1987, 7,4, 265-276.
285. Meulemans G., Dekegel D., Peeters J. et al. Isolation of an adenolike virus from laying chickens affected by egg dropsyndrome 1976. Vlaams Diergeneeskd Tijdschr. 1979. 2:151-157.
286. Meulemans G., Carlier M.C., Gonze M., et al. Incidence, characterization, and prophylaxis of nephropathogenic avian infectious bronchitis viruses //Vet. Rec.-1987.- 120:205-206.
287. Meulemans G. Control by vaccination. In D.J. Alexander (ed.), Newcastle Disease, -1988. pp. 318-332. Kluwer Academic Publ, Boston.
288. Michelek SM; Childers NK; Katz J. et al. Liposomes as oral adjuvants //Curr. Top. Microbiol. Immunol., 1989, 146:, 51-8.
289. Millar N.S., Emmerson P.T. Molecular cloning and nucleotide sequencing of Newcastle disease virus. In D.J. Alexander (ed.), Newcastle Disease, pp. 79-97. Kluwer Academic Publ, Boston, 1988.
290. Mobiuddin S.M. Controlling IBD //Poultry Int. 1996. - V. 35, N 7. - P. 22.
291. Muirhead S. Improved disease protection comes from liposome adju-vanted vaccines//Feedstuffs, 1988, 60,39, 12-13.
292. Nakamura K; Narita M; Imai K; Matsumura T; Maeda M; Tanimura T The effect of mixed live vaccines of Newcastle disease and infectious bronchitis on the chicken respiratory tract. //J Comp Pathol, 1992 May, 106:4, 341-50.
293. Nakamura Т., Otaki F., Lin Z., Kato A. Rapid and quantitative assay system for measuring anti-infectious bursal disease vims antibody using monoclonal antibody bound to polystyrene latex microscopheres //Avian Dis. 1993. - V. 37, N 3. - P. 786-792.
294. Nakamura Т., Hoshi S., Nagasawa Y., Ueda S. The effect of route of inoculation on protection by killed vaccines in chickens //Avian Dis. 1995. - V. 39, N 3. - P. 507-513.
295. Nakanishi Т., Kunisawa J., Hayashi A. et al. Positively Charged Liposome Functions as an Efficient Immunoadjuvant in Inducing Immune Responses to Soluble Proteins. Biochemikal and biopfysical research communications, 1997, 240, 3,793797.
296. Nakanishi Т., Kunisawa J., Hayashi A. et al. Positively charged liposome functions as an efficient immunoadjuvant in inducing cell-mediated immune response to soluble proteins //J.Controlled Release, 1999, 61:1-2, 233-240.
297. Naito S; Horino A; Nakayama M. et al. Ovalbumin-liposome conjugate induces IgG but not IgE antibody production //Int. Arch. Allergy Immunol. 1996, 109:3,2238.
298. Nerome K., Yoshioka Y., Ishida M. et al. Development of a new type of influenza subunit vaccine made by muramyldipeptide-liposome: enhancement of humoral and cellular immune responses //Vaccine, 1990, 8, 503-509.
299. Okoye J.O.A., Uzoukwu M. Pathogenesis of infectious bursal disease in embryonally bursectomised chickens //Avian Pathol. 1990. -V. 19, N3.- P. 555-569.
300. Orga P.L., Lamm M.E., McGhee J.R. et al. Handbook of Mucosal Immunology. Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1994, 1-176.
301. Otsuki K., Yamamoto H., Tsubokura M. Studies on avian infectious bronchitis virus (IBV). 1. Resistance of IBV to chemical and physical treatments //Arch. Virol. -1979.-60:25-32.
302. Otsuki K., Huggins M.B. , Cook J.K.A. Comparison of the susceptibility to avian infectious bronchitis virus infection of two inbred lines of white leghorn chickens. //Avian Pathology-1990-19, 467-475.
303. Palya V. Manual for the production of Marek's disease, Gumboro disease and inactivated Newcastle disease vaccines. Rome, 1991. -IX, 47-87 p.
304. Pampori Z.A. Combined infection of IBD vims and adeno viruses in broilers //Poultry Adviser. -1994. V. 27, N 8. - P. 41-42.
305. Panda S.K., Rao A. T. Effect of infectious bursal disease virus infection on immunity to ranikheit disease in chickens //Poultry Adviser. 1993. - V. 26, N 10. -P. 35-38.
306. Parsons D.G, Bracewell C.D., Parsons G. Experimental infection of turkeys with egg drop syndrome 1976 virus and studies on the application of the haemagglutination inhibition test //Res. Vet. Sci.- 1980. 29:89-92.
307. Parsons D; Ellis MM; Cavanagh D; Cook JK Characterisation of an infectious bronchitis virus isolated from vaccinated broiler breeder flocks. //Vet Rec, 1992 Oct, 131:18,408-11.
308. Patel H.M., Ryman B.E. in Liposomes: From physical structure to therapeutic applications (Editor G.G.Knight). Elsevier/North-Holland biomedical press, 1981, 423-424.
309. Patel H.M., Ryman B.E. in Liposomes: From physical structure to therapeutic applications (Editor G.G.Knight). Elsevier/North-Holland biomedical press, 1981, 432.
310. Payne N.I., Timmins P., Ambrose V. et al. Proliposomes: a novel solution to an old problem //J.Pharm.Sci., 1986, 75, 325-329.
311. Perera C.L., Noda J., Cuello S. et al. ELISA para deteccion de anticuerpos matemos у post-vacunale a Gumboro en progenis de reproductoras vacunadas //Rev. Salud Animal. 1996. - V. 48, N 3. -P. 151-154.
312. Picault J.P. Chute de ponte associees a la production d' oeufs et coqueille fragile; proprietes de l'agente infecteux isolate au cours de la maladie //L'aviculteur. 1978. -№379. - P.57-64.
313. Polte-Frank F., Zurbriggen R., Hefg A. et al. Use of reconstituted influenza virus virosomes as an immunopotentiating delivery system for a peptide-based vaccine //Clinical experimental immunology, 1999,117,496-503.
314. Poultry tips. Watch out Gumboro and Newcastle disease //Poultry Adviser. -1993.-V. 26, N6. -P. 55-58.
315. Raj D.D., Thangavelu A., Nachimuthu K., Venugopalan A,T. Fluorescent antibody technique in the diagnosis of infectious bursal disease //Indian J. Anim. Sci. 1992. - V. 62, N 5. - P. 418-419.
316. Raj GD; Thangavelu A; Elankumaran S; Koteeswaran A; Venugopalan AT . Quantitative counter-immunoelectrophoresis for estimation of antibodies to infectious bursal disease virus //Vet Res Commun, 1994, 18:4, 289-93.
317. Rampin Т., Enice F., Gallazzi D., Mandelli G. Osservazioni sulla sindrom calo di ovariole in allevamenti italiani di ovariole e riproduttori //Clin. Veter. 1978. -V.101, №5. — P.254-256.
318. Riddell C. Avian Histopathology. Am Assoc Avian Pathol, Kennett Square, PA, 1987.
319. Roy P; Venugopalan AT; Koteeswaran A. Efficacy of live adjuvanted mesogenic Newcastle disease vaccine in chickens //Vaccine, 1999 Jun, 17:20-21, 2674-6.
320. QureschiA.A. Gumboro disease in Pakistan //Poultry Int. 1999. - V. 38, N 4.-P. 42-43.
321. Saif Y.M. Infectious bursal disease virus types //Proc. 19th Nat. Meet. Poultry Health. Condemn., Ocean City, Md. Ocean City, Md.,1984.-P. 105-107.
322. Saini S.S.; Sodhi S.S.; Maiti N.K.; Sharma S.N. Immune response of chicks to oral vaccination against Newcastle disease and fowl pox //Сотр. Immunol. Microbiol. Infect.Dis., 1990,13:1,1-6.
323. Samson A.C.R. Virus structure. In D.J. Alexander (ed.), Newcastle Disease, pp. 23-44. Ktuwer Academic Publ, Boston, 1988.
324. Sandra A., Paltzer W., Thomas M. Morphological differentiation of murine neuroblastoma induced by liposomes: Lipid specificity and pathway of liposome uptake//Exp. tell Res., 1981, 132, 473—477.
325. Schelling E., Thiir В., Griot C., Audige L. Epidemiological study of Newcastle disease in backyard poultry and wild bird populations in Switzerland //Avion Pathology (1999) 28, 263-272.
326. Schloer G., Spalatin J., Hanson R.P. Newcastle disease virus antigens and strain variation //Am. J. Vet. Res.- 1975. 36:505-508.
327. Schloer G.M. Frequency of antibody to adenovirus 127 in domestic ducks and wild waterfowl //Avian Dis. 1980. - V.24, №1. - P.91-98.
328. Sha Z; Vincent MJ; Compans RW. Enhancement of mucosal immune responses to the influenza virus HA protein by alternative approaches to DNA immunization //Immunobiology, 1999 Feb, 200:1, 21-30.
329. Sharma J.M. Effect of infectious bursal disease virus on protection against Marek's disease by turkey herpesvims vaccine //Avian Dis. 1984. - V. 28, N 3. - P. 629-640.
330. Sheats J. R., McConnell H. M. A photochemical technique for measuring lateral diffusion of spin-labeled phopsholipids in membranes. Proc. Nat. Acad. Sci. US, 1978, 75, 4661—4663.
331. Siegel H.S. Physiological stress in birds //Bio Sc., 1980. V. 30, №8. - P. 529534.
332. Siegel H.S., Kampen M. Energy relationsjips in growing chickens geiven daily injectiens of corticosterone //Brit. Poultry Sc., 1984. V. 63, №4. - P. 477-485.
333. Siegel H.S. Immunological responses an Indicators of stress //World ' s Poultry Sc 1985. V. 41, №1. - P. 36-44.
334. Sing K.Y., Chew-Lim M. Breeder farm egg drop syndrome 1976 (EDS 76) in Singapore //Sing. Vet. J. -1981. -5:8-13.
335. Smith H.W, Cook J.K.A., Parsell Z.E. The experimental infection of chickens with mixtures of infectious bronchitis virus and Escherichia coli //J. Gen. Virol.-1985. 66:777-786.
336. Smith R. Multi-faceted program helps minimize heat stress //Feedstuffs, 1986. — V. 58, №16.-P. 10-11.
337. Snyder D.B. Changes in the field status of infectious bursal disease virus //Avian Pathol. 1990. V. 19, N 3. - P. 419-423.
338. Snyder D.B., Vakharia V.N., Savage P.K. Naturally occurring-neutralizing monoclonal antibody escape variants define the epidemiology of infectious bursal disease virus in the United States //Arch. Virol. 1992. - V. 127. - P. 89-101.
339. Soltes L., Bezek S., Trnovec T. et al. Determination of ethimisol and two of its metabolites in serum by hith-pressure liquca chromotograthy //Pharmacology, 1983. -V. 26.-P. 198-204.
340. Solyom F, Nemesi M., Forgacs A., et al. Studies on EDS vaccine //Develop. Bioi. Stand.- 1982.-51:105-121.
341. Song C-S., Lee Y-J., Kirn J-H et al. Epidemiological classification of infectious bronchitis virus isolated in Korea between 1986 and 1997 //Avion Pathology (1998) 27,409-416.
342. Springer W.T., Olson КО., Kerr K., Fabacher C.J. Responses of specific-pathogen-free chicks to concomitant infectious of reovirus (WVU-2937) and infectious bursal disease virus //Avian Dis. -1983.-V.27.-P. 911-917.
343. Staats H.F., Jackson R.J., Marinaro M., et al. Mucosal immunity to infection with implications for vaccine development //Curr.Opin.Immunol, 1994, 6, 572583.
344. Stone H.D., Brugh М., Hopkins S.R., et al. Preparation of inactivated oil-emulsion vaccines with avian viral or mycoplasma antigens //Avian Dis.- 1978. 22:666-674.
345. Stone H; Mitchell B; Brugh M. In ovo vaccination of chicken embryos with experimental Newcastle disease and avian influenza oil-emulsion vaccines //Avian Dis., 1997 Oct, 41:4, 856-63.
346. Sulochana S., Sudharma D. Seroprevalence of egg drop syndrome virus infection in domestic and free flying birds in Kerala //Kerala Jour.Veter.Sc. 1987. - V.18, №1. -P.83-88.
347. Takai S., Higashihara M., Matumoto M. Purification and hemagglutinating properties of egg drop syndrome 1976 virus //Arch. Virol.- 1984. 80:59-67.
348. Takakuwa H; Ito T; Takada A; Okazaki K; Kida H. An attenuation mechanism of Newcastle disease vaccine strain TCND//Arch. Virol., 1998, 143:6, 1129-43.
349. Taniguchi Т., Yamaguchi S., Maeda M., et al. Pathological changes in laying hens inoculated with the JPA-1 strain of egg drop syndrome 1976 virus. Nat Inst Anim Health Q (Tokyo). 1981. - 21:83-93.
350. Tanimura N., Tsukamoto K., Nakamura K., Narita M., Maeda M. Association between pathogenicity of infectious bursal disease virus and viral antigen distribution detected by immunohistochemistry //Avian Dis. 39:9-20.1995.
351. Tanimura N; Sharma JM. Insitu apoptosis in chickens infected with infectious bursal disease virus //J Comp Pathol, 1998 Jan, 118:1,15-27.
352. Tham KM., Young L. W., Moon C.D. Detection of infectious bursal disease virus by reverse transcription-polymerase chain reaction amplification of the virus segment A gene //J. Virol. Methods. -1995. V. 53, N 2-3. - P. 201-212.
353. Tokatomi S, Ohki K., Ohnlshi S.I. Proton induced phase separation in phosphatidylserine/ phosphatidylcholine membranes //Biochim. et biophys. acta, 1980, 596, 192—200.
354. Tono H., Schemera В., Kaleta E.F. Serological differentiation of avian infectious bronchitis field isolates using an enzyme immunoassay: Presence of Dutch strains in West Germany //Avian Dis.- 1987. 31:187-192.
355. Tripathi S.C., Sharma P.J. Infectious avian nephrosis //Poultry Adviser. 1988. -Vol.21, №11.-P. 37-39.
356. Trnovec Т., Soltes L., Durisova M. et al. Pharmacokinetics of Ethimizol //Gen. Physiol. Biophys., 1985.- № 4. P. 429-432.
357. Tsukamoto K., Obata H., Hihara H. Improved preparation of ELISA antigen of infectious bursal disease virus //Avian Dis. 1990.-V. 34.N1.-P. 209-213.
358. Tsukamoto K., Tanimura N., Hihara H. et al. Isolation of virulent infectious bursal disease virus from field outbreak 5 with high mortality in Japan //J. Vet. Med. Sci. 1992. 54:153-155.
359. Tsukamoto K., Tanimura N., Kakita S. et al. Efficacy of Three Live Vaccines against Highly Virulent Infectious Bursal Disease Virus in Chickens with or without Maternal Antibodies //Avian Dis. 1995. 39:218-229.
360. Tyth K; Duda E. Reconstituted Newcastle disease virus envelopes as a split vaccine//Acta. Virol, 1991 Apr, 35:2, 165-173.
361. Vacharia V.N., Ahamed D., He J. Use ofpolymerase reaction for efficient of dsRNA segmente of infectious bursal diseases virus //Avian Disease . 1992. - V.36, №3. - P. 736-742.
362. Vakharia V.N.; Snyder D.B.; Letticken D.et al. Active and passive protection against variant and classic infectious bursal disease virus strains induced by baculovirus-expressed structural proteins //Vaccine, 1994 Apr, 12:5, 452-6.
363. Van Eck J.H.H. Egg transmission of egg drop syndrome 1976 virus in fowl //Veterinary Quarterly. 1980. - V.2, №3. - P. 176-178.
364. Vanselow B.A. The application of adjuvants to veterinary medicine //Veter. Bull.-1987.- Vol.57, №11.- P.881- 896.
365. Vasanta S.; Antony A; Lai SM Liposome encapsulated subunit (VP1) and virion vaccines against foot-and-mouth disease //Acta Virol., 1987, 31:2, 109-15.
366. Velinova M., Read N. Kirby C. et al. Morphological observations on the fate of liposomes in the regional lymph nodes after footpad injection into rats //Biochimica et biophysica acta, 1996, 1299, 2, 207-215.
367. Wa W.C., Jacobson K., Papuliudjopoulos D. Lateral diffusion in pliospholipid multibilayers measured by fluorescence recovery after photobieacliing //Biochemistry, 1977, 16,3936—3941.
368. Wa W.G., Huang С. H. Effect of whaler mobility on lateral diffusion of nhosoholimds in liposomes. Lipids, 1981, 16, 820—822.
369. Wadey C.N., Faragher J.T. Australian infectious bronchitis viruses: Identification of nine subtypes by a neutralization test //Res. Vet. Sci.- 1981. 30:70-74.
370. Wakenell P.S., Sharma J.M. Chicken embryonal vaccination with avian infectious bronchitis virus //Am.J. Vet. Res.- 1986. 47:933-938.
371. Walker L., Piela Т. H., Yates V.J., Gulka G.M. Heat inactivation of a duck adenovirus serologically indistinguichable from adenovirus 127 //Avian Dis. 1982. - V.26, №3. P.602-605.
372. Watanabe Т., Ohmi H. Susceptibility of guinea fowls to the virus of infectious laryngotrache-itis and egg drop syndrome 1976 //J. Agric. Sci.(Japan).- 1983. -28:193-200.
373. Whetzel P.L., Jackwood D.J. Comparison of neutralizing epitopes among infectious bursal disease viruses using radioimmunoprecipitation //Avian Dis. 1995. - V. 39, N 3. - P. 499-506.
374. Wilczynski S.R, Cook M.L., Stevens J.G. Newcastle disease as a model for paramyxovirus-induced neurologic syndromes //Am. J. Pathol. -1977. 89:649-666.
375. Winterfield R.W. Immunity response to the infectious bursal agent //Avian Dis. -1969. V. 13, N 3. - P. 548-567.
376. Winterfield R. W., Thacker H.L. Immune response and pathogenicity of different strains of infectious bursal disease virus applied as vaccines //Avian Dis. 1978. - V. 22,N4.-P. 721-731.
377. Wyeth P.J. Gumboro vaccination to go oil-based? //Poultry World. 1979. - N 3, May. - P. 16-27.
378. Wyeth PJ; Chettle NJ; Mohepat AR Use of an inactivated infectious bursal disease oil emulsion vaccine in commercial layer chicks. //Vet Rec, 1992 Jan, 130:2, 30-2.
379. Yamaguchi S., Imada Т., Kawamura H., et al. Outbreaks of egg drop syndrome -1976 in Japan and itos etiological agent //Avian Dis. 1980. - V.25, №3. - P.628-641.
380. Yamaguchi S., Imada H., Kawamura H. et al. Outbreaks of egg drop syndrome-1976 in Japan and its etiological agent //Avian Dis.- 1981. 25:628-641.
381. Zanella A., Donato A., Nigrelli R., Poli G. Egg drop syndrome (EDS-76): etiopathogenesis, epidemiology, immunology and control of the disease //Clinica Veterinaria. 1980. - V.103, №7. - P.459-469.
382. Zanella A., Marchi R. Inactivated vaccines in oil emulsion in the control of the infections diseases of poultry //Develop. Biol.Stand. 1982. - V.51. - P. 19-31.
383. Zsak L., Szekely A., Kisary J. Experimental infection of young and laying geese with egg drop syndrome 1976 adenovirus strain B8/78 //Avian Pathol.- 1982. -11:555-562.
-
Сухинин, Александр Александрович
-
доктора биологических наук
-
Санкт-Петербург, 2004
-
ВАК 03.00.23
- Липосомальная система доставки антигена вируса ССЯ-76 для пероральной иммунизации птиц
- Создание комплексной системы профилактики бактериальных болезней птиц в хозяйствах промышленного типа
- Иммунобиологические свойства бирнавируса птиц и разработка средств специфической профилактики инфекционной бурсальной болезни
- Липосомальный противовирусный препарат рекомбинантного альфа-2b интерферона человека: получение и свойства
- Липосомальный противовирусный препарат рекомбинантного альфа-2b интерферона человека: получение и свойства
