Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Липополисахарид-зависимое репрограммирование воспалительного ответа макрофагов: роль сурфактантного белка D

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Липополисахарид-зависимое репрограммирование воспалительного ответа макрофагов: роль сурфактантного белка D"

На правах рукописи

Назаров Владимир Андреевич

ЛИПОПОЛИСАХАРИД-ЗАВИСИМОЕРЕПРОГРАММИРОВАНИЕ ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ОТВЕТА МАКРОФАГОВ: РОЛЬ СУРФАКТАНТ&ГО

БЕЛКА й

03 00 04 - биологическая химия 14 00 16 - патологическая физиология

□□3445928

Автореферат Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

О 4 ДОГ

Москва - 2008

003445928

Работа выполнена на базе лабораторий стресса и адаптации Государственного учреждения Научно- исследовательского института общей патологии и патофизиологии РАМН и Пенсильванского Университета США

Научные руководители Доктор медицинских наук, профессор Малышев Игорь Юрьевич Доктор медицинских наук, профессор Ларионов Николай Павлович

Официальные оппоненты

Доктор медицинских наук Давыдова Татьяна Викторовна Доктор биологических наук Шишкин Сергей Сергеевич

Ведущая организация

ГОУ ВПО Московская государственная медицинская академия имени Сеченова

Защита диссертации состоится «_19_»__сентября_2008 года в 14 00

на заседании диссертационного совета Д 212 203 13 при Российском университете дружбы народов по адресу 117198, Москва, ул Миклухо-Маклая, д 8, медицинский факультет

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу 117198, Москва, ул Миклухо-Маклая, д 6

Автореферат разослан к &»

2008 года

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 212 203 13,

доктор биологических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Одним из ключевых факторов, влияющих на воспалительную активность макрофагов в легких, является сурфактантный белок D (SP-D) Основная функция SP-D состоит в модулировании воспалительной реакции и иммунной защиты в легких (Crouch Е and Wright JR , 2001) SP-D стимулирует хемотаксис нейтрофилов (Crouch ЕС, et al 1995) и участвует в захвате антигенов альвеолярными фагоцитами (Kuan S F, et al 1994) Удаление sp-d гена приводит к существенному изменению морфологии альвеолярных макрофагов и развитию воспаления в легких Первоначально SP-D считался исключительно легочным белком, но впоследствии он был обнаружен не только в легких, но и в кишечнике, желудке, сердце Однако, роль SP-D в активности резидентных макрофагов других тканей в титературе не описана В связи с этим, нас заинтересовал ряд важных вопросов Влияет ли SP-D на воспалительную активность перитонеальных макрофагов'' И если да, то зависит ли это влияние от фенотипа воспалительной активности макрофагов (Goldmann О, von Kockritz-Blickwede М, Holtje С et al, 2007)

Ответы на эти вопросы помогут выяснить возможную роль SP-D в регуляции иммунитета на уровне всего организма, что, в свою очередь, даст возможность создания новых методик лечения хронических воспалительных заболеваний

Цель и задачи исследования

Цель настоящего исследования состояла в изучении возможности влияния SP-D на морфологию и функцию макрофагов, локализованных вне легких Для оценки роли SP-D были использованы две экспериментальных модели животных содержащие ген sp-d мыши дикого типа и мыши нокаутные по гену sp-d

В рамках поставленной цели решались следующие основные задачи:

1 Оценить влияние гена sp-d и его продукта не базальную продукцию цитокинов перитонеальными макрофагами

2 Оценить участие гена sp-d и его продукта в формировании провоспалительного (Ml) и антивоспалительного (М2) фенотипов

3 Оценить участие гена sp-d и его продукта в регуляции секреции перитонеальными макрофагами при действии высоких (500 нг/мл) доз липополисахарида (Л ПС)

4 Оценить участие гена sp-d и его продукта в регуляции секреции цитокинов перитонеальными макрофагами разных воспалительных фенотипов, стимулированных высокими дозами ЛПС

5 Оценить участие гена sp-d и его продукта в регуляции базальной продукции NO перитонеальными макрофагами

6 Оценить участие гена sp-d и его продукта в регуляции продукции монооксида азота (NO) перитонеальными макрофагами при действии низких (0,5 нг/мл и 5нг/мл) доз ЛПС

7 Оценить участие гена эр-с! и его продукта в регуляции продукции N0 перитонеальными макрофагами при действии высоких (500 нг/мл) доз ЛПС

8 Оценить участие гена эр-с! и его продукта в регуляции продукции N0 перитонеальными макрофагами разных воспалительных фенотипов при действии высоких доз ЛПС

Научная новизна исследования определяется следующими основными результатами

Впервые было показано, чго в отсутствии гена Бр-с1 базальная продукция про- и антивоспалительных цитокинов была полностью заблокирована Это позволяет нам предполагать, что БР-О влияет на базальную продукцию цитокинов перитонеальными макрофагами

Впервые было показано, что уровень секреции цитокинов перитонеальными макрофагами мышей нокаутных по гену Бр-с1 отличается от макрофагов диких мышей Продукция как про- так и антивоспалительных цитокинов уменьшается в отсутствии гена ар-с! Это свидетельствует о роли БР-Э в продукции цитокинов при формировании М1 и М2 фенотипов (т е при действии низких доз ЛПС) перитонеальных макрофагов

Впервые было показано, что продукция исследованных цитокинов, стимулированная высокими (500 нг/мл) дозами ЛПС, отличалась у перитонеальных макрофагов мышей дикого типа и нокаутных по гену эр-ё Это означает, что 8Р-0 специфически влияет на стимулированную ЛПС (500 нг/мл) продукцию про- и антивоспалительных цитокинов При этом регуляторные эффекты БР-О зависят от фенотипа перитонеальных макрофагов

Впервые было показано, что в отсутствие гена эр-с! происходит снижение продукции ТЫР-а в провоспалительном М1 фенотипе и усиление - в антивоспалительном М2 фенотипе Таким образом, наблюдается БР-Б-зависимая инверсия феномена репрограммирования в отношении продукции фактора некроза опухолей-а (Т№-а) перитонеальными макрофагами при действии высоких доз ЛПС Таким образом, БР-О может менять направленность процесса репрограммирования

Впервые было показано, что в отсутствии гена Бр-с1, ЛПС-индуцированная продукция 1ЫОБ снижается во всех фенотипах перитонеальных макрофагов Однако, в М2 фенотипе это снижение было выражено существенно больше, чем в М1 и наивном фенотипах Таким образом, впервые показано, что БР-О контролирует активность 1ЫОБ фенотип-зависимым образом

Впервые показано, что у макрофагов, полученных от мышей, нокаутных по гену Бр-с1, продукция конечного метаболита N0 - N02 - не различалась между наивным и М1 фенотипами У макрофагов наивного фенотипа, взятых от мышей дикой линии, продукция 1М02 была выше, чем у М1 фенотипа Таким образом, по параметру продукции Ы02- отсутствие гена Бр-с! привело к нарушению репрограммирования наивного фенотипа в М1, но не повлияло на репрограммирование наивного фенотипа в М2 фенотип

Теоретическое значение работы определяется следующим Во-первых, в работе доказана важная роль БР-О в регуляции базального и индуцированного синтеза как про-, так и антивоспалительных цитокинов перитонеальными макрофагами

Во-вторых, результаты работы дают основание предположить, что SP-D является не только локальным фактором легочного иммунитета, но, вероятно, также играет роль в генерализованном развитии иммунного ответа всего организма Вместе с тем, обнаружилась определенная специфика в регуляторных эффектах SP-D на макрофаги разного происхождения

В-третьих, в работе доказано, что регуляторная роль SP-D зависит от фенотипа секреторной активности макрофагов

В-четвертых, результаты работы о критической значимости SP-D в репрограммировании макрофагов и индуцированном секреторном ответе этих клеток позволяют сделать важное предположение о новом регуляторном механизме влияния SP-D на врожденный и адаптивный иммунные ответы

В целом, наши данные даю г теоретические предпосылки для развития новой концепции о том, что роль SP-D в регулировании врожденных и адаптивных иммунных ответов организма определяется

1) влиянием на баланс про- и антивоспалительных цитокинов макрофагов разного происхождения, 2) влиянием на репрограммирование макрофагов малыми дозами патогена и 3) тем, что регуляторная роль SP-D зависит от фенотипа секреторной активности макрофага

Практическое значение работы состоит в том, что данные о влиянии SP-D на воспалительную активность перитонеальных макрофагов могут быть использованы для разработки новых методов лечения и профилактики заболеваний, связанных с нарушением регуляторной секреторной активности макрофагов

Положения, выносимые на защиту:

1 Удаление 1ена sp-d приводит к полному прекращению базальной продукции цитокинов макрофагами Это означает, что SP-D необходим для обеспечения базальной продукции некоторых провоспалительных (INF-у) и антивоспалительных (IL-13) цитокинов перитонеальными макрофагами

2 Отсутствие гена sp-d оказывает влияние формирование М1 и М2 фенотипов перитонеальных макрофагов, что позволяет говорить от том, что SP-D участвует в регуляции ЛПС-зависимого репрограммирования нативных перитонеальных макрофагов в М1 или М2 фенотип

3 Отсутствие гена sp-d оказывает влияние на ЛПС-индуцированную продукцию перитонеальными макрофагами ПВ (М1) и AB (М2) цитокинов и экспрессию iNOS Это означает, что SP-D специфически контролирует ЛПС-индуцированную продукцию про- и антивоспалительных цитокинов и экспрессию iNOS в перитонеальных макрофагах

4 Секреция цитокинов макрофагами разных воспалительных фенотипов зависит от наличия гена sp-d Это означает, что участие SP-D в регуляции воспалительной активности макрофагов является фенотипзависимым

Апробация работы Основные результаты проведенных исследований были доложены на конкурсе «Перспективные научные работы молодых

ученых» на втором конгрессе Российского Медицинского Форума (Москва, 2007), где была удостоена диплома за актуальность научного исследования, на межлабораторном семинаре Университета Пенсильвании (Филадельфия, 2007), на совместном семинаре кафедры патофизиологии лечебного факультета и лаборатории клеточных биотехнологий Московского Государственного Медико-Стоматологического Университета (Москва, 2008) Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 112 страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения и выводов Список литературы содержит 190 источников Диссертация иллюстрирована четырьмя таблицами и 28 рисунками МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Эксперименты были выполнены на мышиных перитонеальных макрофагах, полученных от мышей линий C57BL/6 и SP-D (-/-) C57BL/6 Условия содержания животных

Мыши содержались в условиях аккредитованного вивария, не допускающих попадание патогенных микроорганизмов, в соответствии с протоколом Комиссии по содержанию животных (Пенсильванский Университет, США)

Процедура выделения альвеолярных макрофагов Альвеолярные макрофаги выделяли из бронхоальвеолярного смыва Для получения смыва легкие мышей через катетер промывали стерильным физиологическим раствором 5 раз Клетки отмывали путем центрифугирования и ресуспензировали в 1 мл культуральной среды RPMI-1640 без сыворотки с 100 Е/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина Процедура выделения перитонеальных макрофагов Перитонеальные макрофаги выделяли из перитонеального смыва от мышей, которым за 4 дня до этого вводили внутрибрюшинно 2 мл 4% бульона тиогликолята Перитонеальный смыв осуществляли с помощью стерильного раствора HBSS Клетки отмывали путем центрифугрования и ресуспензировали в 10 мл культуральной Анализ формы и размера клеток

Для анализа формы и размеров клеток использовалось окрашивание при помощи кита Diff Kwik (Thermo Shandon) Клетки смотрели под микроскопом Axiovert 200 при увеличении хЗОО

Репрограммирование макрофагов

Для получения Ml (провоспалительного) и М2 (противовоспалительного) фенотипов макрофагов была использована методика Zhang and Morrison (1993) Для этого в лунки добавлялся ЛПС (из Е coli Olli В4, List Biologic Laboratories, Campbell, CA), в концентрации 0,5 нг/мл и 5 нг/мл для получения про- и противовоспалительных фенотипов соответственно Индукции воспалительного ответа осуществлялась ЛПС в высокой концентрации 500 нг/мл (Zhang X, Morrison С , 1993) Активация производилась через 6 часов после добавления программирующих концентраций ЛПС или через 7 часов после посадки на планшеты Через 24 часа после индукции среда отбиралась из лунок для анализа

Биохимические исследования

Определение секреции цитокннов методом иммуноферментного анализа

Измерение цитокинов проводили методом иммуноферментного анализа (ИФА) Оценку содержания lNF-y, TNF-a, IL-12, IL-6, IL-10 и IL-13 проводили с помощью SearchLight® Technology multiplex cytokine assay (Pierce Biotechnology, Woburn, MA) TNF-a измеряли с помощью набора оценки цитотоксичности (Hirohashi, Morrison, 1996) Для определения IL-12, IL-6, и IL-10A были использованы специфические системы ELISA Для определения IL-10 использовали FLISA Kit полученный от Genzyme (чувствительность 15 pg/ml) IL-6 определяли с помощью ELISA и антимышиных IL-6 моноклональных антител и рекомбинантного мышиного IL-6, приобретенных от PharMingen (чувствительность 50 пг/мл) Для определения IL-12 использовали рекобинантный IL-12 и антимышиные IL-12 моноклональные антитела, приобре!енные от Genzyme

Определение экспрессии iNOS методом полимеразной цепной реакции

Количественный анализ экспрессии iNOS проводили с помощью метода обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (RT-PCR) и TaqManR Gene Expression Assays (Applied Biosystems, USA) используя ABI 7500 FAST Real Time PCR system Суммарную РНК макрофагов выделяли с использованием трайзола Реакцию обратной транскрипциии суммарной РНК проводили с использованием RETROscriptR First Strand Synthesis Kit for RT-PCR (Applied Biosystems, USA) и набора праймеров Нормализацию проводили по 18S Для измерения ДНК использовали систему ABI 7500 FAST Real Time PCR system (Applied Biosystems, USA)

Определение содержания конечных метаболитов NO, N02" в культуральной среде

Для определения содержания конечных метаболитов NO в культуральной среде проводилось восстановление общего азота при помощи хлорида ванадия в соляной кислоте при температуре 95° С до NO и определение последнею хемилюминесцентным методом с использованием Ionics/Sievers Nitric Oxide Analyzer 280

Статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента Различия считали достоверными при р<0,05 Результаты представлены в виде М+т

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнение морфологии альвеолярных и перитониальных макрофагов мышей дикого типа и SP-D (-/-).

Из Рисунка 1 видно, что альвеолярные макрофаги SP-D (-/-) мышей морфологически отличались от макрофагов, полученных от мышей дикого типа Альвеолярные макрофаги, полученные от SP-D (-/-) мышей, имели большие размеры по сравнению с нормальными, у них была снижена

плотность цитоплазмы и существенно уменьшено ядерно-цитоплазматическое соотношение.

Перитонеальные макрофаги мышей дикого типа и БР-Б (-/-) мышей, напротив, не имели ярко выраженных морфологических различий, из чего можно сделать вывод, что БР-Э не играет важной роли в поддержании морфологии перитонеальных макрофагов, в отличие от альвеолярных макрофагов.

Рисунок 1. Сравнение морфологии альвеолярных и перитонеальных макрофагов мышей дикого типа и ЬР-Э (-/-) мышей.

Альвеолярные макрофаги Мышей дикого типа 8Р-Э (-/-) мышей

Перитонеальные макрофаги Мышей дикого типа БР-Б (-/-) мышей

"10 мкм

Изучение влияния БР-Э на базальную продукцию цитокинов и N0 перитонеальньши макрофагами.

Сначала была измерена продукция трех провоспалительных цитокинов: Т№-а, 1РЫ§ и 1Ь-12. Из Рисунка 2 видно, что у перитонеальных макрофагов мышей дикого типа и БР-О (-/-) мышей отсутствовала базальная продукция основного провоспалительного цитокина Т№-а.

Рисунок 2. Влияние непрограммирующих доз ЛПС на продукцию ТОТ-а перитонеальными макрофагами мышей дикого и 8Р-0 (-/-) тина. \¥Т-мыши дикого типа; КО- 8Р-0 нокаутные мыши.

*- р<0,05 по сравнению с нашивным фенотипом; **-р<0,05 по сравнению с диким типом.

На Рисунке 3 показано, что базальная продукция IFN-g перитонеальными макрофагами мышей дикого типа составила 66,6± 6,0 пг/мл. У перитонеальных макрофагов SP-D (-/-) мышей базальная продукция IFN-g отсутствовала. Это означает, что SP-D участвует в регуляции продукции перитонеальными макрофагами IFN-g.

Рисунок 3. Влияние репрограммирующих доз J1IIC на продукцию IFN-g перитонеальными макрофагами мышей дикого и SP-D (-/-) типа. WT-мыши дикого типа: КО- SP-D нокаутные мыши, нг/мл

**

1WT

□ ко

N

66.6 о

М1 64,4 44,8

М2

129.2 О

*- р<0,05 по сравнению с нашивным фенотипом: **- р<0,05 по сравнению с диким типом.

Базальная продукция \L-\2 перитонеальными макрофагами мышей дикого типа отсутствует. У перитонеальных макрофагов 8Р-Б (-/-) мышей также отсутствует базальная продукция 1Ь-12.

Учитывая тот факт, что у перитонеальных макрофагов не наблюдалась базальная индукция ТЫР-а и 11_-12, а продукция 1РЫ-у'у БР-0 (-/-) макрофагов не происходила, можно сделать заключение, что в отсутствии 8Р-0 исследованные в работе провоспалительные цитокины перитониальными макрофагами не зкспрессируются.

Затем были исследованы наиболее важные антивоспалительные цитокины: 11.-6, 1И0, 1ИЗ.

Базальная продукция 1Ь-6 перитонеальными макрофагами, как мышей дикого типа, так и БР-Э (-/-) мышей была крайне низкой по сравнению с макрофагами подвергшимися воздействию ЛПС (рис.4).

Рисунок 4. Влияние репрограммирующих доз ЛПС на продукцию 1Ь-6 перитонеальными макрофагами мышей дикого и 8Р-0 (-/-) типа. \¥Т-мыши дикого типа: КО- ЭР-О нокаутные мыши, нг/мл

зооооо -

250000 --

200000 --

150000 --

ЮОООО--

50000 --

0 ■

N

■ т 122,9

□ КО 25,4

*- р<0,05 по сравнению с нашивным фенотипом: **- р<0,05 по сравнению с диким типом.

Продукция 1Ь-13 нестимулированными перитонеальными макрофагами мышей дикого типа была минимальна и составляла 4,6±0,3 пг/мл. У перитонеальных макрофагов 8Р-0 (-/-) мышей базальная продукция [ИЗ отсутствовала (рис.5)

Рисунок 5. Влияние репрограммирующих доз ЛПС на продукцию 1Ь-13 перитонеальными макрофагами мышей дикого и $Р-0 (-/-) типа. и'Т-мыши дикого типа: КО- ЭР-В нокаутные мыши.

нг/мл 120 100 -«0 50 -40 20 -0 J ■ Л"

□ ко

*- р<0,05 по сравнению с нашивным фенотипом;

Базальная продукция 1И0 перитонеальными макрофагами мышей дикого типа практически не наблюдалась. У перитонеальных макрофагов БР-Э (-/-) мышей полностью отсутствовала базальная продукция 1Ь-10 (рис. 6).

ю

Рисунок 6. Влияние репрограммирующих доз ЛПС на продукцию 1Ь-10 перитонеальнымн макрофагами мышей дикого и 8Р-0 (-/-) типа. "№Т-мыши дикого типа: КО- 8Р-1) нокаутные мыши.

нг/мл

*

Ш

^зЯ **

Л

I

N Ml М2

■ WT 6.2 123.4 5746

СКО 0 99.5 181.6

*-р<0,05 по сравнению с нашивным фенотипом; **-р<0,05 по сравнению с диким типом.

Таким образом, отсутствие SP-D в перитонеальных макрофагах привело к полному исчезновению продукции исследованных нами антивоспалительных цитокинов.

Наши исследования показали, что макрофаги SP-D (-/-) мышей, как и мышей дикого типа, не обладают исходной индукцией iNOS (рис. 7). Показано, что продукция iNOS у альвеолярных макрофагов SP-D нокаутных мышей повышена (Atochina E.N.. 2004). Таким образом, у перитониальных макрофагов SP-D (-/-) мышей в норме отсутствует один из основных медиаторов воспаления, продуцируемый макрофагами.

Рисунок 7. Влияние репрограммирующих доз ЛПС на индукцию ¡NOS перитонеальнымн макрофагами мышей дикого и SP-D (-/-) типа. WT-мыши дикого типа: КО- SP-D нокаутные мыши.

нг/мл 160,0 140,0 120,0 100,0 ао.о 60,0 40,0 20.0

*- р<0,05 по сравнению с нашивным фенотипом;

Результаты измерения концентрации конечного метаболита NO, N0?" в культуральной среде приведены на рисунке 8. Базальная продукция NCV перитонеальными макрофагами практически отсутствовала и не отличалась у нормальных и SP-D (-/'-) мышей.

Рисунок 8. Влияние репрограммирующих доз ЛПС на концентрацию NOj" в культуральной среде, созданную перитонеальными макрофагами мы шей дикого и SP-D (-/-) типа.

WT-мыши дикого пша; КО- SP-D нокаушые мыши, нг/мл

>---- *

■ лт о. 1 :: 1 з

□ко ::

*- р<0,05 по сравнению с наивным фенотипом; **- р<0,05 по сравнению с Оиким типом.

Изучение влияния 8Р-0 на продукцию цитокинов при формировании М1 и М2 фенотипов перитонеальных макрофагов.

На Рисунке 2 показана продукция Т№-а перитонеальными макрофагами через 6 часов после действия репрограммирующих доз ЛПС. У макрофагов, полученных от мышей дикого типа, уровень продукции ТОТ-а у фенотипов М1 и М2 достоверно не различался (2162± 108,1 пг/мл и 2300±115 пг/мл, соответственно). Продукция Т№-а макрофагами БР-Э нокаутных мышей также повышалась при действии репрограммирующих доз ЛПС, но это повышение было в 2,8 раза ниже по сравнению с мышами дикого типа. Уровень продукции ТЫР-а также не различался между фенотипами М1 и М2 нокаутных мышей (792±45,6 пг/мл и 772±44,5 пг/мл).

Полученные данные говорят о том, что БР-Э влияет на синтез ТЫР-а перитонеальными макрофагами при действии репрограммирующих доз ЛПС. В отсутствии БР-Э продукция Т№-а обоими исследованными фенотипами уменьшается.

Как видно из Рисунка 3, продукция макрофагами фенотипа М1

мышей дикого типа достоверно не изменилась по сравнению с наивным фенотипом. В фенотипе М2 продукция 1РЫ-§ увеличилась в 2 раза по сравнению с наивными макрофагами. Продукция IFN-g макрофагами 8Р-0 нокаутных мышей М1 фенотипа достоверно повышалась до 44,8±4,5 пг/мл. При этом, макрофаги фенотипа М2 нокаутных мышей не продуцировали

Продукция 1Ь-12 перитонеальными макрофагами, полученными как от мышей дикого, так и 5Р-Э (-/-) типа, при действии репрограммирующих доз

ЛПС не была обнаружена ни в фенотипе Ml, ни в фенотипе М2 Таким образом, можно говорить о том, что при репрограммировании не происходит увеличения продукции IL-12 перитонеальными макрофагами независимо от наличия SP-D

На Рисунке 4 показано, что после действия репрограммирующих доз ЛПС макрофаги мышей дикого типа начинали вырабатывать IL-6, причем уровень продукции IL-6 в фенотипе М2 был достоверно выше, чем в фенотипе М1 (66050±5944,5 пг/мп и 25090±2258 пг/мл, соответственно) Продукция IL-6 макрофагами SP-D нокаутных мышей также повышалась при действии репрограммирующих доз ЛПС Уровень повышения соответствовала таковой у макрофагов мышей дикого типа, т е уровень продукции в фенотипе М2 был достоверно выше, чем в фенотипе М1 (28755±3163 пг/мл и 15376±1691,3 пг/мл, соответственно) Продукция IL-6 макрофагами SP-D (-/-) мышей была достоверно ниже чем у мышей дикого типа как в фенотипе М1 (в 1,6 раза), так и в фенотипе М2 (в 2,3 раза)

Из Рисунка 5 можно видеть, что макрофаги мышей дикого типа при действии репрограммирующих доз ЛПС увеличивали выработку IL-13, причем уровень продукции IL-13 в фенотипе М2 был в 4,1 раза выше, чем в фенотипе Ml (48,1±2,9 пг/мл и 11,7±0,7пг/мл, соответственно) Макрофаги нокаутных мышей вообще не продуцировали 1L-I3 при действии репрограммирующих доз ЛПС, что говорит о необходимости наличия SP-D для синтеза IL-13 перитонеальными макрофагами при репрограммировании

На Рисунке 6 показано изменение продукции IL-10 при репрограммировании перитонеальных макрофагов Видно, что макрофаги мышей дикого типа начинали вырабатывать IL-10 при репрограммировании, причем уровень продукции IL-10 у фенотипа М2 был выше чем у М1 в 4,3 раза Продукция 1L-10 макрофагами нокаутных мышей также повышалась при действии репрограммирующих доз ЛПС Уровень продукции IL-10 макрофагами фенотипа М2 был выше чем у М1 в 1,8 раза Таким образом, динамика изменений продукции IL-10 макрофагами мышей дикого типа и SP-D (-/-) была сходной, однако уровень этой продукции для каждого фенотипа у макрофагов SP-D (-/-) мышей был достоверно ниже

Таким образом, SP-D участвует в репрограммировании перитонеальных макрофагов в отношении большинства изученных цитокинов

Как видно из Рисунка 7, при репрограммировании перитонеальные макрофаги мышей дикого типа начинали вырабатывать iNOS, причем уровень продукции iNOS в фенотипе М2 был достоверно выше, чем в М1, и составил 52,7±6,3 нг/мл и 2,3±0,3 нг/мл, соответственно Экспрессия iNOS макрофагами SP-D нокаутных мышей также повышалась при действии репрограммирующих доз ЛПС Уровень экспрессии iNOS макрофагами нокаутных мышей в фенотипе М2 был также достоверно выше, чем в М1, (49,6±4,8 нг/мл и 4,8±0,47 нг/мл, соответственно) и носил такой же характер, как и у мышей дикого типа Достоверных отличий в продукции iNOS между макрофагами SP-D (-/-) и мышей дикого типа при репрограммировании зафиксировано не было

Концентрация N02 в культуральной среде при действии 0,5 нг/мл (М1 фенотип) ЛПС практически не изменилась, см рисунок 8 Отличий между нормальными и SP-D (-/-) макрофагами обнаружено не было При действии 5

нг/мл ЛПС (М2 фенотип), произошло увеличение концентрации NOi", достоверных отличий между нормальными и SP-D (-/-) макрофагами не было.

Изучение влияния SP D на продукцию цитокннов перитонеальными макрофагами при действии высокой дозы ЛПС.

На следующем этапе работы было оценено влияние SP-D на активацию макрофагов высокой дозы ЛПС (500 нг/мл) Оценка продукции цитокинов и iNOS производилась через 72 часа после стимуляции перитонеальных макрофагов ЛПС.

На Рисунке 9 показано, что действие ЛПС вызывало достоверное повышение продукции TNF-a через 72 часа макрофагами мышей дикого типа до 3241± 162,1 пг/мл. У макрофагов SP-D (-/-) мышей также наблюдалось повышение продукции TNF-a после действия ЛПС, которое было достоверно выше по сравнению с макрофагами мышей дикого типа (4973± 286,5 пг/мл).

Рисунок 9. Влияние 500 нг/мл ЛПС на продукцию TNF-a наивными и репрограммированными перитонеальными макрофагами мышей дикого и SP-D (-/-) типа.

WT-мыши дикого типа; КО- SP-D нокаутные мыши, нг/мл

6000 т 5000 ■ <000 3000 2000 -1000 -

• т

□ га

*- р<0,05 по сравнению с наивным фенотипом; **- р<0,05 по сравнению с диким типом.

Действие ЛПС вызывало достоверное повышение продукции Ш!^ через 72 часа макрофагами мышей дикого типа до 119,4±8,4 пг/мл (рис. 10). У макрофагов БР-Э (-/-) мышей также наблюдалось повышение продукции ШМ-g, причем это повышение было достоверно выше по сравнению с макрофагами мышей дикого типа (234,5±21,1 пг/мл), несмотря на то, что базальная продукция макрофагами БР-О (-/-) мышей отсутствовала.

Рисунок 10. Влияние 500 нг/мл ЛПС на продукцию 1Р1М^ наивными и репрограммированными перитонеальными макрофагами мышей дикого и ЭР-О (-/-) типа.

ХУТ-мыши дикого типа: КО- 5Р-Э нокаутные мыши.

3241 497!

4695 3331

3117 5107

нг/мл

* ж*

N М1 М2

■ WITT 119,4 246.3 474 9

¡□ко 234,5 356,8 452.4

* **

р<0,05 по сравнению с наивным фенотипом; - р<0,05 по сравнению с диким типом.

На Рисунке 11 представлены аналогичные данные относительно продукции IL-12. Действие ЛПС вызывало достоверное повышение продукции IL-12 макрофагами мышей дикого типа до 16,8±,0,8 пг/мл. У макрофагов SP-D (-/-) мышей также наблюдалось повышение продукции IL-12, которые было достоверно выше по сравнению с макрофагами мышей дикого типа и составило 21,9±2,2 пг/мл.

Рисунок П. Влияние 500 hi мл ЛПС на продукцию IL-12 наивными и репрограммированными перитонеальными макрофагами мышей дикого и SP-D (-/-) типа.

WT-мыши дикого типа: КО- SP-D нокаутные мыши, нг/мл

*- р<0,05 по сравнению с наивным фенотипом; **- р<0,05 по сравнению с диким типом.

Таким образом, нами наблюдалось повышение продукции всех исследованных провоспалительных цитокинов перитонеальными макрофагами в отсутствии SP-D. Этот факт можно объяснить описанной ранее способностью SP-D угнетать продукцию провоспалительных цитокинов перитонеальными макрофагами через рецептор SIRP-a (William .1 Janssen. Kathleen A McPhillips, 2008).

Далее была исследована продукция группы антивовоспалительных цитокинов при действии высокой дозы ЛПС. На Рисунке 12 можно видеть достоверное

повышение продукции IL-6 макрофагами мышей дикого типа через 72 часа после действия ЛПС до 180660± 16259.4 пг/мл. У макрофагов SP-D (-/-) мышей также наблюдается повышение продукции IL-6. которое составило 148855±10866,4 пг/мл.

Таким образом, продукция II.-6 макрофагами SP-D (-/-) мышей при действии высоких доз ЛПС достоверно не отличалась от макрофагов мышей дикого типа.

Рисунок 12. Влияние 500 нг/мл ЛПС на продукцию IL-6 нативными и репрограммированны.ми перитонеальными макрофагами мышей дикого и SP-D (-/-) типа.

WT-мыши дикого типа: КО- SP-D нокау шые мыши.

нг/мл

N m М2

■ WT 180660 249S45 183050

□ КО 148855 265340 199620

*- р<0,05 по сравнению с нашивным фенотипом;

Продукция IL-13 макрофагами мышей дикого типа достоверно повышалась до 53±2,5 пг/мл (рис. 13). У макрофагов SP-D (-/-) мышей также наблюдалось повышение продукции IL-13. которое было достоверно ниже, чем у макрофагов мышей дикого типа и составило 37,2±3,7 пг/мл.

Рисунок 13. Влияние 500 нг/мл ЛПС на продукцию ÎL-I3 наивными и репрограммированными перитонеальными макрофагами мышей дикого и SP-D (-/-) типа, нг/мл 120 100 80 60 40 20 0

1WT

□ КО

*- р<0,05 по сравнению с наивным фенотипом; **- р<0,05 по сравнению с диким типом.

На Рисунке 14 показано, что действие высокой дозы ЛПС вызывало достоверное повышение продукции (L-10 макрофагами мышей дикого типа до 192,2±19,4 пг/мл. У макрофагов SP-D (-/-) мышей также наблюдалось

1б

повышение продукции 11.-10, которое было достоверно ниже, чем у макрофагов мышей дикого типа и составило 94,5±6,0 пг/мл.

Рисунок 14. Влияние 500 нг/мл ЛПС на продукцию 1Ь-10 нативными и ренрограммированными перитонеальными макрофагами мышей дикого и 8Р-0 (-/-) типа.

\УТ-мыши дикого типа; КО- БР-й нокаутные мыши, нг/мл

*- р<0,05 по сравнению с наивным фенотипом: **- р<0,05 по сравнению с диким типом.

Таким образом, было зафиксировано понижение продукции большинства исследованных антивоспалительных цитокинов перитонеальными макрофагами в отсутствии SP-D. Это можно объяснить способностью SP-D стимулировать продукцию антивоспалительных цитокинов макрофагами.

Действие ЛПС вызывало достоверное повышение индукции iNOS через 72 часа макрофагами мышей дикого типа до 76,1±4,15 нг/мл (рис. 15). У макрофагов SP-D (-/-) мышей также наблюдалось повышение продукции ¡NOS до 53±4,77 нг/мл при действии 500 нг/мл. Таким образом, продукция iNOS макрофагами SP-D (-/-) мышей была достоверно ниже, чем у мышей дикого типа.

Рисунок 15. Влияние 500 нг/мл ЛПС на индукцию iNOS наивными и репрограммированными перитонеальными макрофагами мышей дикого и SP-D (-/-) типа.

WT-мьшш дикого типа; КО- SP-D нокаутные мыши.

нг/мл

N М1 М2

■ WT 76,1 142,0 120,7

□ ко 53,0 103,8 45,2

*- р<0,05 по сравнению с наивным фенотипом; **- р<0,05 по сравнению с диким типом.

Действие ЛПС вызвало достоверное повышение концентрации ЫСЬ" созданной макрофагами дикого типа до 15,4±0,6 нг/мл (рис. 16). У макрофагов БР-О (-/-) мышей также наблюдалось увеличение выделения N0?" до 11,6 ±1,45 нг/мл.

Рисунок 16. Влияние 500 нг/мл ЛПС на концентрацию N0 созданную наивными и репрограммированными перитонеальными макрофагами мышей дикого и вР-Э (-/-) типа в культуральной среде.

\УТ-мыши дикого типа: КО- вР-И нокаутные мыши, нг/мл

**

*

25 20

10 5 о

■ WT

□ ко

*- р<0,05 по сравнению с наивным фенотипом; **- р<0,05 по сравнению с диким типом.

Вышеприведенные данные показывают, что в отсутствии SP-D происходит понижение продукции большинства противовоспалительных цитокинов и ¡NOS на фоне повышения провоспалительных цитокинов, что означает смещение баланса воспалительной активности в сторону М1 фенотипа. Таким образом, SP-D участвует в регуляции воспалительной активности перитонеальных макрофагов при их активации высокими дозами ЛПС.

По нашему мнению, полученные данные можно объяснить отсутствием у макрофагов SP-D нокаутных мышей ограничения продукции провоспалительных и стимуляции антивоспалительных цитокинов (Atoshina-Vasserman, 2008).

Изучение влияния SP-D на продукцию цитокинов перитонеальными макрофагами разных воспалительных фенотипов при действии высоких доз ЛПС.

Последним этапом экспериментальной работы было изучение влияния SP-D на продукцию цитокинов и ¡NOS перитонеальными макрофагами фенотипов М1 и М2, стимулированных высокой дозой ЛПС.

Как видно из Рисунка 9, у мышей дикого типа увеличение продукции ТОТ-а при действии 500 нг/мл ЛПС репрограммированными макрофагами М1 фенотипа было достоверно выше, чем у наивных макрофагов на 44,9% Однако у репрограммированных макрофагов фенотипа М2 продукция ТОТ-а при действии 500 нг/мл ЛПС достоверно не отличалась от наивных макрофагов У ЗР-Э (-/-) мышей повышение продукции ТИР-а при действии 500 нг/мл ЛПС репрограммированными макрофагами М1 фенотипа было достоверно ниже чем у наивных макрофагов на 33% Продукция ТОТ-а перитонеальными макрофагами фенотипа М2 при действии 500 нг/мл ЛПС достоверно не отличалась от таковой у наивных макрофагов

Таким образом, у ЬР-Э (-/-) макрофагов наблюдалась инверсия феномена репрограммирования

На Рисунке 10 показано, что у мышей дикого типа повышение продукции ШЫ^ при действии ЛПС макрофагами М1 фенотипа было в 2 раза выше, чем у наивных макрофагов У макрофагов фенотипа М2 продукция 1РМ-g при действии ЛПС достоверно увеличилась в 3,9 раза по сравнению с наивными макрофагами У БР-Э (-/-) мышей продукция репрограммированными макрофагами М1 и М2 фенотипов при действии ЛПС была достоверно выше, чем у наивных макрофагов в 1,5 и 1,9 раза соответственно

Таким образом, у макрофагов БР-0 (-/-) и мышей дикого типа наблюдается схожая динамика продукции при активации

репрограммированных макрофагов При этом, продукция ШЫ^ наивными и М1 макрофагами БР-Э (-/-) мышей достоверно выше по сравнению с макрофагами мышей дикого типа, а в фенотипе М2 достоверных отличий между БР-О (-/-) и мышами дикого типа нет Однако, учитывая, что у макрофагов фенотипа М2 мышей дикого типа продукция ШЫ^ была исходно повышена (с 129,2±11,6 пг/мл до 474,9±33,2 пг/мл у макрофагов мышей дикого типа и с 0 пг/мл до 452,4±47,7 пг/мл у макрофагов БР-О (-/-) мышей), можно говорить о том, что прирост продукции 1РЫ-£ у макрофагов БР-О (-/-) мышей был больше

У макрофагов мышей дикого типа увеличение продукции 1Ь-12 при действии 500 нг/мл ЛПС макрофагами М1 фенотипа было достоверно выше, чем у наивных макрофагов на 20% (рис 11) Однако, у макрофагов фенотипа М2 продукция 1Ь-12 при действии ЛПС практически исчезала У 8Р-0 (-/-) мышей продукция 1Ь-12 при действии ЛПС на макрофаги М1 фенотипа достоверно не отличалась от таковой наивных макрофагов У репрограммированных БР-О (-/-) макрофагов фенотипа М2 продукции 1Ь-12 при действии ЛПС вообще зафиксировано не было

Исследование продукции антивоспалительных цитокинов показало, что у макрофагов, полученных от мышей дикого типа, увеличение продукции 1Ь-6 при действии высокой дозы ЛПС макрофагами М1 фенотипа было достоверно выше, чем у наивных макрофагов на 38% (рис 12) Однако, у макрофагов фенотипа М2 продукция 1Ь-6 при действии ЛПС достоверно не отличалась от наивных макрофагов У БР-Э (-/-) мышей повышение продукции 1Ь-6 при действии ЛПС макрофагами М1 фенотипа было выше на 78%, чем у наивных

макрофагов При этом у макрофагов фенотипа М2 продукция 11,-6 при действии высокой дозы ЛПС достоверно не отличалась от наивных макрофагов

Рисунок 13 показывает, что у мышей дикого типа не наблюдалось достоверного повышения продукции 1Ь-13 при действии 500 нг/мл ЛПС макрофагами М1 фенотипа У макрофагов фенотипа М2 продукция 1Ь-13 при действии ЛПС была выше, чем у наивных макрофагов, подвергшихся такому же воздействию, в 1,96 раза У (-/-) мышей повышение продукции 1ИЗ макрофагами М2 фенотипа при действии ЛПС было достоверно выше, чем у наивных макрофагов в 2,1 раза, соответственно

Таким образом, достоверных отличий между М1 и М2 фенотипами БР-О (-/-) макрофагов по продукции данного цитокина обнаружено не было, что говорит об отсутствии феномена репрограммирования по данному цитокину у макрофагов БР-О (-/-) мышей, в отличие от макрофагов мышей дикого типа

На Рисунке 14 показано, что у мышей дикого типа происходило достоверное уменьшение продукции 11.-10 при действии 500 нг/мл ЛПС макрофагами М1 фенотипа в 1,9 раза У макрофагов фенотипа М2 продукция 1Р-10 достоверно увеличилась в 2,6 раза по сравнению с наивными макрофагами при действии ЛПС У БР-О (-/-) мышей не наблюдалось повышение продукции 1Ь-10 при действии ЛПС макрофагами М1 фенотипа Однако, у макрофагов фенотипа М2 продукция 1Ь-10 при действии ЛПС была достоверно выше таковой у наивных макрофагов в 4,5 раза Таким образом, БР-О влияет на продукцию макрофагами П.-10

Из Рисунка 15 можно видеть, что у мышей дикого типа увеличение индукции 1М05 макрофагами М1 фенотипа при действии высокой дозы ЛПС было достоверно выше, чем у наивных макрофагов в 1,86 раз У репрограммированных макрофагов фенотипа М2 индукция 1ЫОБ при действии 500 нг/мл ЛПС снизилась по сравнению с М1 в 1,2 раза У 8Р-0 (-/-) мышей повышение индукции 1ЫОБ при действии 500 нг/мл ЛПС репрограммированными макрофагами М1 фенотипа было достоверно выше, чем у наивных макрофагов в 1,9 раз Однако, у макрофагов фенотипа М2 индукция при действии 500 нг/мл ЛПС достоверно не отличалась от

таковой у наивных макрофагов Поскольку репрограммирование макрофагов нокаутных мышей в фенотип М2 само по себе вызывает повышение продукции 1>Ю8, можно говорить о том, что высокая доза ЛПС не вызывает дополнительной индукции 1ЫОБ у таких макрофагов

М1 макрофаги выделяли в 1,6 раза меньше Ы02\ чем наивные макрофаги (рис 16) Достоверных огличий между наивными и М1 макрофагами БР-Э (-/-) мышей обнаружено не было Концентрация М02" созданная М2 макрофагами нормальных и 8Р-0(-/-) мышей практически не различалась, но была достоверно выше по сравнению с наивными макрофагами

выводы

1 Отсутствие гена sp-d не приводит к изменению морфологии наивных перитонеальных макрофагов

2 Макрофаги, выделенные от мышей нокаутных по гену sp-d, в отличие от макрофагов мышей дикого типа, не секретируют провоспалительный цитокин INF- у и антивоспалительный цитокин IL-13 Это дает основание считать, что SP-D участвует в поддержании базальной продукции провоспалительных и антивоспалительных цитокинов

3 Показано, что перитонеальные макрофаги нокаутных по гену sp-d мышей, характеризуются снижением продукции как про-, так и антивоспалительных цитокинов (INF-y, TNF-a, IL-6, IL-10, IL-13) при действии репрограммирующих концентраций ЛПС Это указывает на то, что SP-D вовлечен в механизмы ЛПС-зависимого репрограммирования фенотипа секреторной активности перитонеальных макрофагов

4 У макрофагов нокаутных по гену sp-d мышей происходит специфическое фенотипзависимое изменение ЛПС-индуцированной продукции про- и антивоспалительных цитокинов перитонеальными макрофагами Что может говорить о том, что SP-D является фактором регуляции иммунного ответа и, возможно, его нарушений

5 Отсутствие гена sp-d у мышей не повлияло на базальную экспрессию iNOS и продукцию конечных метаболитов NO перитонеальными макрофагами Это свидетельствует о том, что SP-D не контролирует механизмы базальной продукции N0 у перитонеальных макрофагов

6 В отсутствие у перитонеальных макрофагов гена sp-d происходит снижение ЛПС-индуцированной активации экспрессии гена mos во всех фенотипах перитонеальных макрофагов При этом в М2 фенотипе снижение экспрессии было более значительным, по сравнению с наивным и М1 фенотипами, что указывает на фенотипспецифическую регуляторная роль SP-D по отношению к индукции iNOS Таким образом, SP-D вовлечен в механизмы адекватной ЛПС-зависимой активации систем генерации N0

7 Отсутствие у перитонеальных макрофагов гена sp-d приводит к устранению М1-репрограмирующего эффекта низких доз ЛПС и не влияет на М2-репрограмирующий эффект Это дает основания полагать, что SP-D вовлечен в механизмы фенотипспецифического контроля концентрации конечных метаболитов N0 перитонеальными макрофагами

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Малышева Е В , Круглов С В , Назаров В.А., Манухина Е Б , Малышев И Ю Внутриклеточный и внеклеточный N0 дифференциально модулирует стресс-ответ и апоптоз в макрофагах, подвергнутых воздействию биологических или физических факторов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2007 Том 143, №6

2 Назаров В.А , Круглов С В , Хоменко И П, Бахтина Л Ю, Малышева Е В , Пшенникова М Г , Манухина Е Б , Малышев И Ю Инверсия феномена репрограммирования стресс-ответа в липополисахаридстимулированных альвеолярных макрофагах // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2007 Том 144, №10

3 Аточина-Вассерман Е Н , Абрамова Е В , Томер Я, Скатт П, Дружинина Г , Назаров В.А , Круглов С В , Беарс М Ф , Гоу А Д , Малышев И Ю SP-D - ЗАВИСИМАЯ РЕГУЛЯЦИЯ МЕТАБОЛИЗМА NO В ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГАХ РЕПРГРАММИРОВАННЫХ И СТИМУЛИРОВАННЫХ ЛПС // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - в печати

Список сокращений

ЛПС- липополисахарид INF-y-интерферон гамма

SP-D- сурфактантный белок Д TNF-a-фактор некроза опухоли

альфа

iNOS- индуцибельная N0 синтаза

IL- интерлейкин

М1 - фенотип макрофагов,

характеризующийся продукцией HBSS- среда Хенкса

провоспалительных цитокинов

М2 - фенотип макрофагов, характеризующийся продукцией антивоспалительных цитокинов

PBS- фосфатный буфер

РЕЗЮМЕ

Назаров Владимир Андреевич

ЛИПОПОЛИСАХАРИД-МВИСИМОЕ РЕПРОГРАММИРОВАНИЕ

ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ОТВЕТА МАКРОФАГОВ РОЛЬ СУРФАКТАНТНОГО БЕЛКА D

Сурфактлнтный беток D (SP-D) вырабатывается в легких и регулирует местную продукцию N0 и цитокшюв альвеолярными макрофагами SP-D был обнаружен и в других органах и тканях, однако, его функции за пределами легких до сих пор оставались не изученными В связи с этим, в данной работе была изучена возможность влияния SP-D на морфологию перитонеальных макрофагов и регуляцию синтеза N0 и цитокинов перитонеальными макрофагами Бы m проанализирована зависимость эффектов SP-D от фенотипа секреторной активности макрофагов, а также влияние SP-D на продукцию перитонеальными макрофагами N0 и цитокинов при действии высоких доз липополисахарида (ЛПС) Результаты работы показали, что отсутствие гена sp-d у мышей не приводит к изменению морфологии наивных перитонеальных макрофагов Удаление гена sp-d приводит к подавлению базальной секреции провоспалителыюго цитокина интерферона у и антивоспалителышго цигокина итерлсйкинаЛЗ нативными перитонеальными макрофагами Отсутствие гена sp-d в организме мышей приводит к снижению продукции исстедованных про- и антивоспалительных цитокинов перитонеальными макрофагами при действии репрограммирующих концентраций ЛПС Отсутствие гена sp-d у мышей не влияет на базальную экспрессию индуцибетьной NO-синтазы (iNOS) перитонеальными макрофагами, при этом ЛПС-индуцированная активация экспрессии гена mos во всех фенотипах перитонеальных макрофагов снижается Однако, у макрофагов антивоспалительного фенотипа снижение экспрессии iNOS было выражено сильнее, чем у макрофагов наивного и провоспалительного фенотипов

Abstract

Nazarov Vladimir Andreevich

Lypopolysacchande-dependent reprogramming of the macrophage inflammatory response: the role of surfactant protein D

Surfactant protein D (SP-D) is expressed in lung tissue and regulates local NO and cytokine production by alveolai macrophages SP-D also was found in other organs and tissues but the role it plays outside lung tissue remained unknown Therefore this work was designed to study if the SP-D has an effect on morphological features of peritoneal macrophages and on the level of NO and cytokine production by these macrophages The correlation between SP-D effects and macrophages secretory phenotype and the effect of SP-D on macrophage NO and cytokine pioduction under the action of high dose lipopolysacchande (LPS) were also analyzed It was shown that absence of spd gene in mice does not change the morphology of naive peritoneal

macrophages Removal of sp-d gene eliminates basal secretion of proinflammatory cytokine [FN--/ and anti-inflammatory cytokine IL-13 by naive peritoneal macrophages The level of cytokine production by peritoneal macrophages obtained from sp-d gene knockout mice under the action of reprogramming doses LPS decreases in comparison to control Absence of sp-d gene does not atfect basal expression of inducible NO synthase (iNOS) by peritoneal macrophages but LPS-dependent activation of iNOS expression was decreased in absence of sp-d in all phenotypes of peritoneal macrophages In anti-inflammatory phenotype macrophages decrease of iNOS expression was more pronounced that in naive and pro-inflammatory macrophages

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Назаров, Владимир Андреевич

Содержание

Список сокращений

Введение

1 Обзор литературы

Секреторная активность макрофагов и ее роль в воспалительной реакции и механизмах врожденного иммунитета

1.1.1. Общий патогенез воспалительной реакции

1.1.2. Регуляторная роль макрофагов в реализации 15 воспалительного ответа.

1.1.3. Характеристика цитокинов, выделяемых макрофагами для участия в воспалительном ответе k »

1.1.4. Существующая концепция о роли цитокиновой сети в 25 инициации и регулировании воспалительного процесса, а также врожденного и адаптивного иммунитета.

1.1.5. Феномен «репрограммирования» макрофагов. 29 1.2. Роль SP-D в регуляции воспалительного процесса.

1.2.1. Природа SP-D.

1.2.2. Участие SP-Dj в„ регуляции воспалительной активности макрофагов.

1.3. Роль монооксида азота (N0) в регуляции воспалительной 35 реакции

2. Материалы и цетоды

3. Результаты исследования

3.1 Изучение влияния утраты гена sp-d на продукцию ФНО-а 49 перитонеальными макрофагами.

3.2 Изучение влияния утраты гена sp-d на продукцию

ИНФ-у перитонеальными макрофагами.

3.3 Изучение влияния утраты гена sp-d на продукцию ИЛ

3.4 Изучение влияния утраты гена sp-d на продукцию ИЛ-6 59 перитонеальными макрофагами.

3.5 Изучение влияния утраты гена sp-d на продукцию ИЛ-13 62 перитонеальными макрофагами.

3.6 Изучение влияния утраты гена sp-d на продукцию ИЛ-10 65 перитонеальными макрофагами.

3.7 Изучение влияния утраты гена sp-d на продукцию iNOS перитонеальными макрофагами.

3.8 Сравнение мор(фодогии альвеолярных и перитонеальных 71 макрофагов мышей дикого типа и SP-D (-/-).

4 Обсуждение результатов

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Липополисахарид-зависимое репрограммирование воспалительного ответа макрофагов: роль сурфактантного белка D"

Актуальность исследования

При анализе литературы посвященной воспалительным процессам, часто упоминается сурфактантный белок D (SP-D), в качестве фактора влияющего на активность макрофагов (JF Van Iwaarden, Н Shimizu, 1992;

Miyamura К, Leigh LE, 1994; van Golde LM, 1995; O'Riordan DM, Standing JE, j .

1995; Giannoni E, Sawa T, Allen L, Wiener-Kronish J, Hawgood S., 2006; Wang JY, Reid KB, 2007). Основная функция легочных SP-D состоит в модулировании воспаления и иммунной защиты в легких (Crouch Е and Wright JR., 2001). Дефицит SP-D наблюдается при различных легочных заболеваниях. Роль SP-D активно исследовалась на альвеолярных макрофагах, однако, в 1998 году Hogenkamp М. Et al, обнаружили SP-D в других органах: сердце, желудке, кишечнике. Данные относительно возможного участия SP-D в регуляции активности других тканевых макрофагов в литературе отсутствуют. Остается неясным, является ли SP-D локальным фактором легочного иммунитета, или же он может быть вовлечен в генерализованное развитие иммунного ответа всего организма.

Альвеолярные макрофаги непрерывно сталкиваются с антигенами, поступающими в организм из окружающей среды, т.е. играют роль защитного барьера. Другим местом непрерывного поступления антигенов в организм является кишечник, поэтому перитонеальпые макрофаги также играют барьерную роль, участвуя в обезвреживании этих антигенов. Поэтому мы решили исследовать возможность влияния SP-D на развитие воспалительного ответа с участием макрофагов.

Поскольку воспалительный ответ макрофагов реализуется путем продукции различного спектра про- и антивоспалительных цитокинов (Ройт

А., Бростофф Дж., Иммунология), было предложено оценить как меняется их продукция в отсутствии гена sp-d. Также, если предположить, что SP-D участвует в регуляции ^воспалительного ответа перитонеальных макрофагов было бы интересно изучить его возможное участие в реализации феномена репрограммирования. В соответствии с вышеизложенным, целью данной работы являлось изучение возможности участия SP-D в регуляции воспалительной активности перитонеальных макрофагов.

В рамках поставленной цели решались следующие основные задачи:

1. Оценить влияние гена sp-d и его продукта не базальную продукцию цитокинов перитонеальными макрофагами.

2. Оценить участие гена sp-d и его продукта в формировании провоспалительного (Ml) и; антивоспалительного (М2) фенотипов.

3. Оцепить участие гена sp-d и его продукта в регуляции секреции перитонеальными макрофагами при действии высоких доз липополисахарида (ЛПС).

4. Оценить участие гена sp-d и его продукта в регуляции секреции цитокинов перитонеальными макрофагами разных воспалительных фенотипов, стимулированных высокими дозами ЛПС .

5. Оценить участие гена sp-d и его продукта в регуляции базальной продукции N0 перитонеальными макрофагами.

6. Оценить участие feiia sp-d и его продукта в регулящга продукции N0 перитонеальными макрофагами при действии низких (0,5 нг/мл и 5нг/мл) доз ЛПС.

7. Оценить участие гена sp-d и его продукта в регуляции продукции N0 перитонеальными макрофагами при действии высоких доз ЛПС.

8. Оценить участие гена sp-d и его продукта в регуляции продукции N0 перитонеальными макрофагами разных воспалительных фенотипов при действии высоких доз ЛПС.

Научная новизна исследования определяется следующими основными результатами.

Впервые было показано, что SP-D влияет на базальную продукцию про-и антивоспалительных цитокинов перитонеальными макрофагами. Было показано что в отсутствии SP-D исследованные про- и антивоспалительные цитокины не экспрессировались.

Впервые было показано что SP-D влияет на продукцию про- и антивоспалительных цитокинов при формировании Ml и М2 фенотипов репрограммированных перитонеальных макрофагов. Продукция большинства про- и антивоспалительных цитокинов уменьшается в отсутствии SP-D.

Впервые было показано что SP-D повышает продукцию провоспалительных цитокинов перитонеальными макрофагами при действии высоких доз ЛПС (500 нг/мл).

Впервые было показано что SP-D снижает продукцию „ антивоспалительных цитокинов перитонеальными макрофагами при действии высоких доз ЛПС (500 нг/мл).

Впервые была показана SP-D-зависимая инверсия феномена репрограммирования в отношении продукции ТНФ-а перитонеальными макрофагами при действии высоких доз ЛПС.

Впервые было показано что в отсутствии SP-D, снижается продукция iNOS перитонеальными макрофагами при действии высоких доз ЛПС.

Впервые было показано что в отсутствии SP-D наблюдается сходная с диким типом динамика индукции iNOS у репрограммированных

J . перитонеальных макрофагов, при этом интенсивность индукции достоверно ниже чем у мышей дикого типа.

Теоретическое значение работы состоит в том, что в ней продемонстрирована возможность влияния SP-D на функцию перитонеальных макрофагов, что доказывает более универсальную природу регуляторного действия SP-D, который не является узкоспецифическим фактором легочной защиты. Продемонстрировано влияние SP-D на продукцию про- и антивоспалительных цитокинов, репрограммированными перитонеальными макрофагами. Показана возможность инверсии феномена репрограммирования в отношении отдельных цитокинов в отсутствии SP-D.

Практическое значение работы состоит в том, что данные о влиянии SP-D на воспалительную активность перитонеальных макрофагов могут быть использованы для разработки новых методов лечения и профилактики воспалительных заболеваний брюшной полости.

Положения, выносимые на защиту:

1. Удаление гена sp-d приводит к полному прекращению базальной продукции цитокинов макрофагами. Это означает, что SP-D обеспечивает базальную продукцию некоторых провоспалительных (INF-y) и антивоспалительных (ИЛ-13) цитокинов перитонеальными макрофагами.

2. Отсутствие гена sp-d оказывает влияние формирование Ml и М2 фенотипов перито!неальных макрофагов, что позволяет говорить от том, что SP-D участвует в регуляции ЛПС-зависимого репрограммирования нативных перитонеальных макрофагов в Ml или М2 фенотип. Благодаря этому, обеспечивается дополнительная пластичность макрофагов в модуляции своих секреторных ответов.

3. Отсутствие гена sp-d оказывает влияние на ЛПС-индуцированную продукцию ПВ и АВ цитокинов и экспрессию iNOS. Это означает, что SP-D специфически контролирует ЛПС-индуцировапиую продукцию про- и антивоспалительных цитокинов и экспрессию iNOS в перитонеальных Макрофагах.

4. Секреция цитокинов макрофагами разных воспалительных фенотипов зависит от наличия гена sp-d.

Апробация работы. Основные результаты проведенных исследований были доложены на конкурсе «Перспективные научные работы молодых ученых» на втором конгрессе Российского Медицинского Форума (Москва, 2007), на межлабораторном семинаре Университета Пенсильвании (Филадельфия, 2007), семинаре кафедры патофизиологии л/ф МГМСУ (Москва, 2008).

1. Обзор литературы

Секреторная активность макрофагов и ее роль в воспалительной реакции и механизмах врожденного иммунитета

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Назаров, Владимир Андреевич

Выводы

1. Отсутствие гена sp-d не приводит к изменению морфологии наивных перитонеальных макрофагов.

2. Макрофаги, выделенные от мышей нокаутных по гену sp-d, в отличие от макрофагов мышей дикого типа, не секретируют провоспалительный цитокин INF- у и антивоспалительный цитокин TL-13. Это дает основание считать, что SP-D участвует в поддержании базальной продукции провоспалительных и антивоспалительных цитокинов.

3. Показано, что перито*неальные макрофаги нокаутных по гену sp-d мышей, характеризуются снижением продукции как про-, так и антивоспалительных цитокинов (INF-y, TNF-a, IL-6, IL-10, IL-13) при действии репрограммирующих концентраций ЛПС. Это указывает на то, что SP-D вовлечен в механизмы ЛПС-зависимого репрограммирования фенотипа секреторной активности перитонеальных макрофагов.

4. У макрофагов нокаутных по гену sp-d мышей происходит специфическое фенотппзависимое изменение ЛПС-индуцированной продукции про- и антивоспалительных цитокинов перитонеальными макрофагами. Это может говорить о том, что SP-D является фактором регуляции иммунного ответа и, возможно, его нарушений.

5. Отсутствие гена sp-d у мышей не повлияло на базальную экспрессию iNOS и продукцию конечных метаболитов N0 перитонеальными макрофагами. Это свидетельствует о том, что SP-D не контролирует механизмы базальной продукции N0 у перитонеальных макрофагов.

6. В отсутствие у перитонеальных макрофагов гена sp-d происходит снижение ЛПС-индуцироваппой активации экспрессии гена inos во всех фенотипах перитонеальных макрофагов. При этом в М2 фенотипе снижение экспрессии было боЛее., значительным, по сравнению с наивным и Ml фенотипами, что указывает на фенотипспецифическую регуляторная роль SP-D по отношению к индукции iNOS. Таким образом, SP-D вовлечен в механизмы адекватной ЛПС-зависимой активации систем генерации NO.

7. Отсутствие у перитон£адьных макрофагов гена sp-d приводит к устранению М 1-репрограмирующего эффекта низких доз ЛПС и не влияет на М2-репрограмирующий эффект. Это дает основания полагать, что SP-D вовлечен в механизмы фенотипспецифического контроля концентрации конечных метаболитов NO перитонеальными макрофагами.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Назаров, Владимир Андреевич, Москва

1. Албертс А., Брей Д., Льюис Р. и др. Молекулярная биология клетки: В 3 т.: Пер. с англ. 2-е изд. М.: Мир, 1994.

2. Зеленин К.Н. Оксид азота (II): Новые возможности давно известной молекулы // Срррсовский Образовательный Журнал. 1997. № 10. С. 105-110.

3. Реутов В.П. Цикл окиси азота в организме млекопитающих // Успехи биол. химии. 1995. Т. 35. С. 189-228.

4. Ванин А.Ф. Оксид азота в биомедицинских исследованиях // Весты. РАМН. 2000. №4. С. 3-5.

5. Дюйзен И.В. Значение оксида азота в механизмах развития боли: автореф. дис. . д-ра мед. наук. Владивосток, 2004. 44 с.

6. Елисеева Е.В. Морфологические основы нитроксидергической регуляции органов дыхания: автореф. дис. . д-ра мед. наук. Владивосток, 2001. 42 с.

7. Маеда X., Акаике Т. Оксид азота и кислородные радикалы при инфекции, воспалении и раке // Биохимия. 1998. Т. 63, вып. 7. С. 1007-1019.

8. Маянский Д.Н., Маянский А.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. Новосибирск: Наука, 1989. 200 с.

9. Меныцикова Е.Б., Зенков Н.К., Реутов В.П. Оксид азота и NO-синтазы в организме млекопитающих при различных функциональных состояниях // Биохимия. 2000. Т. 65, вып. 4. С. 485-503.

10. Сосунов А.А. Оксид азота как межклеточный посредник // Соросовский образовательный журн. 2000. Т. 6. С. 27-34.

11. Тотолян А.А., Фрейдлин И.С. Клетки иммунной системы. СПб.: Наука, 2000. 232 с.

12. A1-Ramadi В.К., Meissler J.J., Huang D., Eisenstein Т.К. Immunosupres^ion induced by nitric oxide and itsinhibihion by interleukin-4 // Eur. J. Immunol. 1992. Vol. 22. P. 2249-2254.

13. Bamberger Т., Masson I., Mathieu J. et al. Nitric oxide mediates the depression of lymphoproliferative responsesfollowing burn injury in rats // Biomed. and Pharmacother. 1992. Vol. 46. P. 495-500.

14. Beckmann J.S., Ye Yz, Anderson P.G. et al. Extensive nitration of protein tyrosines in human atherosclerosisdetected by immunohistochemistry // Biol. Chem. Hoppe Seyler. 1994. Vol. 375. P. 81-88.

15. Beck.mann J.S.^ Koppenol W.H. Nitric oxide, superoxide andf 0peroxynitrite: the good, the bad and ugly // Am. J.Physiol. 1996. Vol. 271. P. 1424-1437.

16. Burgner D., Rockett K., Kwiatkowski D. Nitric oxide and infectious diseases//Arch. Dis. ChHJId. 1999. Vol. 8,N 2. P. 185-189.

17. Fang F.C. Mechanisms of nitric oxide-related antimicrobial activity // J. Clin. Invest. 1997. Vol. 99, N 12.P. 2818-2825.

18. WHJlko-Sarsat V., Rieu Ph., Descamps-Latscha B. et al. NeutrophMJTs: moleculars, functions and pathophysiologicalaspects//Lab. Invest. 2000. Vol. 80. P. 617Ц53.

19. Zamora R., Vodovotz V., ВИЛПаг T.R. Inducible nitric oxide synthase and inflammatory diseases // Molec. Med.2000. Vol. 6, N 5. P. 347-373.

20. Munder M, Mallo M, Eichmann K, Modolell M. Murine macrophages secrete interferon gamma upon combined stimulation with interleukin (ИЛ)-12 and ИЛ-18: A novel pathway of autocrine macrophage activation. J Exp Med. 1998 Jun 15; 187( 12):2103-8.

21. Hayes MP, WaVig J, Norcross MA. Regulation of interleukin-12 expression in human monocytes: selective priming by interferon-gamma of lipopolysaccharide-inducible p35 and p40 genes. Blood. 1995 Jul 15;86(2):646-50.

22. McDonald V, Bancroft GJ. Mechanisms of innate and acquired resistance to Cryptosporidium parvum infection in SCID mice. Parasite Immunol. 1994 Jun; 16(6):315-20.

23. Bogdan C, Vocjovotz Y, Nathan C. Macrophage deactivation byvinterleukin 10. J Exp Med. 1991 Dec l;174(6):1549-55.

24. Hirohashi N, Morrison DC. Low-dose lipopolysaccharide (LPS) pretreatment of mouse macrophages modulates LPS-dependent interleukin-6 production in vitro. Infect Immun. 1996 Mai-;64(3): 1011-5.

25. Mosmann TR, Cherwinski H, Bond MW, Giedlin MA, Coffman RL. Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profTUles of lympholcine activities and secreted proteins. 1986. J Immunol. 2005 Jul 1;175(1):5-14.

26. Paul WE, Sede^ RA. Lymphocyte responses and cytokines. Cell. 1994 Jan 28;76(2):24I-51.

27. Bradley LM, Yoshimoto K, Swain SL. The cytokines ИЛ-4, ИНФ-gamma, and ИЛ-12 regulate the development of subsets of memory effector helper T cells in vitro. J Immunol. 1995 Aug 15; 155(4): 1713-24.

28. Germann T, Rude E. Interleulcin-12. Int Arch Allergy Immunol. 1995 Oct; 108(2): 103-12.л f

29. Barnes PF, Abrams JS, Lu S, Sieling PA, Rea TH, Modlin RL. Patterns of cytokine production by mycobacterium-reactive human T-cell clones. Infect Immun. 1993 Jan;61(l): 197-203.

30. Crouch, E. C. 1998. Structure, biologic properties, and expression of surfactant protein D (SP-D). Biochimica et Biophysica Acta 1408:278289

31. Crouch E and Wright JR. Surfactant proteins and d and pulmonary host defense. AnnuRevPhysiol 63: 521-554, 2001)

32. Crouch EC, Perssdn A, Griffin GL, Chang D, and Senior RM. Interactions of pulmonary surfactant protein D (SP-D) with human blood leukocytes. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology 12: 410-415, 1995

33. Kuan SF, Persson A, Parghi D, and Crouch E. Lectin-mediated interactions of surfactant protein D with alveolar macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology 10: 430436, 1994

34. Kuan SF, Persson A, Parghi D, and Crouch E. Lectin-mediated interactions of Surfactant protein D with alveolar macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology 10: 430436,1994

35. Wert, S. E., M. Yoshida, A. M. LeVine, M. Ikegami, T. Jones, G. F. Ross, J. H. Fisher, T. R. ICorfhagen, and J. A. Whitsett. 2000 Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97:5972-5977.

36. Botas, C., F. Poulain, J. Akiyama, C. Brown, L. Allen, J. Goerke, J.

37. Clements, E. Carlson, A. M. GHJIlespie, C. Epstein, and S. Hawgood.i 11998. Altered surfactant homeostasis and alveolar type II cell morphology in mice lacking surfactant protein D. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:11869-11874.

38. LeVine, A. M., J. A. Whitsett, J. A. Gwozdz, T. R. Richardson, J. H. Fisher, M. S. Burhans, and T. R. Korfhagen. 2000. Distinct effects of surfactant protein A or D deficiency during bacterial infection on the lung. Journal of Immunology 165:3934-3940.

39. Tino, M. J. and J. R. Wright. 1999. Surfactant proteins A and D specifically stimulate directed actin-based responses in alveolar macrophages. Am.J.Physiol 276:L164-L174.

40. Bridges, J. P., H. W. Davis, M. Daniodarasamy, Y. Kuroki, G. Howies,f 4'

41. D. Y. Hui, and F. X. McCormack. 2000. Pulmonary surfactant proteins

42. A and D are potent endogenous inhibitors of lipid peroxidation and oxidative cellular injury. J.Biol.Chem. 275:38848-38855.

43. Kuan SF, Persson A, Parghi D, and Crouch E. Lectin-mediated interactions of surfactant protein D with alveolar macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology 10: 430436, 1994.

44. Hogenkamp A, Herlas MV, Tooten PC, Veldhuizen EJ, Haagsman HP. Effects of surfactant protein D on growth, adhesion and epithelial invasion of intestinal Gram-negative bacteria. Mol Immunol. 2007 Jul;44( 14):3517-27. Epub 2007 May 2.

45. Atochina, E. N., M. F. Beers, S. Hawgood, F. Poulain, C. Davis, T. Fusaro, and A. J. Gow. 2004. Surfactant protein-D, a mediator of innate lung immunity, alters the products of nitric oxide metabolism. Am.J.Respir.Cell Mol.Biol. 30:271-279.

46. Atochina-Vasserman et al, In Press, Journal of Immunology, 2007.

47. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:11869-11874.1. J „

48. Wert, S. E., M. Yoshida, A. M. LeVine, M. Ikegami, T. Jones, G. F. Ross, J. H. Fisher, T. R. Korfhagen, and J. A. Whitsett. 2000 Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97:5972-5977.

49. Албертс А., Брей Д., Льюис P. и др. Молекулярная биология клетки:

50. В 3 т.: Пер. с ^нгл. 2-е изд. М.: Мир, 1994.f 11

51. Зеленин К.Н. Оксид азота (II): Новые возможности давно известной молекулы // Соросовский Образовательный Журнал. 1997. № 10. С. 105-110.

52. Реутов В.П. Цикл окиси азота в организме млекопитающих // Успехи биол. химии. 1995. Т. 35. С. 189-228.

53. Garthwaite J. Neural Nitric Oxide Signalling // Trends Neurosci. 1995. Vol. 18. P. 51-56.

54. Moncada S., Palmer R.M.J., Higgs E.A. Nitric Oxide: Physiology,

55. Pathophysiology, and Pharmacology // Pharmacol. Rev. 1991. Vol. 43.i 111. P. 109-141.

56. Ванин А.Ф. Оксид азота в биомедицинских исследованиях // Вестн. РАМН. 2000. №4. С. 3-5.

57. Дюйзен И.В. Значение оксида азота в механизмах развития боли: автореф. дис. . д-ра мед. наук. Владивосток,70.2004. 44 с.

58. Елисеева Е.В. Морфологические основы нитроксидергической регуляции органов дыхания: автореф.72.дис. . д-ра мед. наук. Владивосток, 2001. 42 с.f 11

59. Маеда X., Акаике Т. Оксид азота и кислородные радикалы при инфекции, воспалении и раке // Биохимия.74.1998. Т. 63, вып. 7. С. 1007-1019.

60. Маянский Д.Н., Маянский А.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. Новосибирск: Наука, 1989. 200 с.„

61. Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К., Реутов В.П. Оксид азота и N0-синтазы в организме млекопитающих при77.различных функциональных состояниях // Биохимия. 2000. Т. 65, вып. 4. С. 485-503.

62. Проскуряков СЛ., Бикетов С.И., Иванников А.И., Скворцов В.Г. Оксид азота в механизмах патогенеза79.внутриклеточных инфекций // Иммунология. 2000. № 4. С. 9-20.

63. Реутов В.П., Сорокина Е.Г., Охотин В.Е., Косицын Н.С. Циклические Превращения оксида азота в организме81 .млекопитающих. М.: Наука, 1997. 165 с.

64. Сосунов А.А. Оксид азота как межклеточный посредник // Соросовский образовательный журн. 2000.83.Т. 6. С. 27-34.8410. Тотолян А.А., Фрейдлин И.С. Клетки иммунной системы. СПб.:

65. Наука, 2000. 232 с. 85.A1-Ramadi В.К., Meissler J.J., Huang D., Eisenstein Т.К.1.munosupression induced by nitric oxide and its 86.inhibihion by ikerleukin-4 // Eur. J. Immunol. 1992. Vol. 22. P. 22492254.

66. Bamberger Т., Masson I., Mathieu J. et al. Nitric oxide mediates the depression of lymphoproliferative responses88.following burn injury in rats // Biomed. and Pharmacother. 1992. Vol. 46. P. 495-500.

67. Physiol. 1996. Vol. 271. P. 1424-1437.

68. Burgner D., Rqckett K., Kwiatkowski D. Nitric oxide and infectious diseases // Arch. Dis. ChRJId. 1999. Vol. 8,94.N 2. P. 185-189.

69. Fang F.C. Mechanisms of nitric oxide-related antimicrobial activity // J. Clin. Invest. 1997. Vol. 99, N 12.96.P. 2818-2825.9717. Klebanoff S.J. Myeloperoxidase: friend and foe // J. Leukocyte Biol. 2005. Vol. 77, N 1. P. 529-557.

70. Nathan C., ShHJIoh M. Reactive oxygen and nitrogen intermediates in the relationship between mammalian hosts99.and microbial pathogens // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2000. Vol. 97, N 16. P. 8841-8848.

71. WHJIko-Sarsat V., Rieu Ph., Descamps-Latscha B. et al. Neutrophils: moleculars, functions and pathophysiological101. aspects//Lab. Invest. 2000. Vol. 80. P. 617-653.

72. Zamora R., Vodovotz V., BHJIliar T.R. Inducible nitric oxide synthase and inflammatory diseases // Molec. Med.103. 2000. Vol. 6, N 5. P. 347-373.1

73. Micallef MJ, Ohtsuki T, Kohno K, Tanabe F, Ushio S, Namba M,

74. Munder M, rvlallo M, Eichmann K, Modolell M. Murine macrophages secrete interferon gamma upon combined stimulation with interleukin (ИЛ)-12 and ИЛ-18: A novel pathway of autocrine macrophage activation. J Exp Med. 1998 Jun 15;187(12):2103-8.

75. Hayes MP, Wang J, Norcross MA. Regulation of interleukin-12 expression in human monocytes: selective priming by interferon-gamma of lipopolysaccharide-inducible p35 and p40 genes. Blood. 1995 Jul15;86(2):646-50.

76. McDonald V, Bancroft GJ. Mechanisms of innate and acquired resistance to Cryptosporidium parvum infection in SCID mice. Parasite Immunol. 1994 Jun; 16(6):315-20.

77. Bogdan C, Vodovotz Y, Nathan C. Macrophage deactivation by interleukin 10. J Exp Med. 1991 Dec 1; 174(6): 1549-55.

78. Fiorentino Dl7, Zlotnik A, Mosmann TR, Howard M, O'Garra А. ИЛ-10 inhibits cytokine production by activated macrophages. J Immunol. 1991 Dec 1;147(11):3815-22.

79. Bogdan C, Vodovotz Y, Nathan C. Macrophage deactivation by interleukin 10. J Exp Med. 1991 Dec 1; 174(6): 1549-55.

80. Barnes PF, Abrams JS, Lu S, Sieling PA, Rea TH, Modlin RL. Patterns of cytokine production by mycobacterium-reactive human T-cell clones. Infect Immun. 1993 Jan;61(l): 197-203.

81. ICatsikis PD, Cohen SB, Murison JG, Uren J, Hibbart LM, Callard RE, Di Padova F, Feldmann M, Londei M. Human alpha beta T-cell receptor CD4-CD8 T-cell clones are predominantly ThO-like. Immunology. 1995 Apr;84(4):501-4.

82. ICatsikis PD, Cohen SB, Londei M, Feldmann M. Are CD4+ Thl cells pro-inflammatory or anti-inflammatory? The ratio of ИЛ-10 to ИНФ-gamma or ИЛ-2 determines their function. Int Immunol. 1995 Aug;7(8): 1287-94.

83. Crouch, E. С: 1998. Structure, biologic properties, and expression of surfactant protein D (SP-D). Biochimica et Biophysica Acta 1408:278289

84. Crouch E and Wright JR. Surfactant proteins and d and pulmonary host defense. AnnuRevPhysiol 63: 521-554, 2001)

85. Crouch EC, Persson A, Griffin GL, Chang D, and Senior RM. Interactions of pulmonary surfactant protein D (SP-D) with human blood leukocytes. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology 12: 410-415, 1995

86. Kuan SF, Persson A, Parghi D, and Crouch E. Lectin-mediated interactions of surfactant protein D with alveolar macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology 10: 430436,1994

87. Kuan SF, Persson A, Parghi D, and Crouch E. Lectin-mediated interactions of surfactant protein D with alveolar macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology 10: 430436, 1994

88. Wert, S. E., M. Yoshida, A. M. LeVine, M. Ikegami, T. Jones, G. F. Ross, J. H. Fisher, T. R. Korfhagen, and J. A. Whitsett. 2000 Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97:5972-5977.

89. LeVine AM^Whitsett JA, Gwozdz JA, Richardson TR, Fisher JH,f и

90. Burhans MS, Korfhagen TR. Distinct effects of surfactant protein A or D deficiency during bacterial infection on the lung. J Immunol 165: 39343940, 2000.

91. LeVine AM, Whitsett JA, Hartshorn KL, Crouch EC, Korfhagen TR. Surfactant protein D enhances clearance of influenza A virus from the lung in vivo. J Immunol 167: 5868-5873, 2001.

92. LeVine, A. M„ J. A. Whitsett, J. A. Gwozdz, T. R. Richardson, J. H. Fisher, M. S. Burhans, and T. R. Korfhagen. 2000. Distinct effects of surfactant protein A or D deficiency during bacterial infection on the lung. Journal of Immunology 165:3934-3940.

93. Tino, M. J. and J. R. Wright. 1999. Surfactant proteins A and D specifically stimulate directed actin-based responses in alveolar macrophages. Am.J.Physiol 276:L164-L174.

94. Kuan SF, Persson A, Parghi D, and Crouch E. Lectin-mediated interactions of surfactant protein D with alveolar macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology 10: 430436, 1994.

95. Hogenkamp A, Herias MV, Tooten PC, Veldhuizen EJ, Haagsman HP. Effects of surfactant protein D on growth, adhesion and epithelial invasion of intestinal Gram-negative bacteria. Mol Immunol. 2007 Jul;44(14):3517-27. Epub 2007 May 2.*

96. Atochina, E. Ы.,'М. F. Beers, S. Hawgood, F. Poulain, C. Davis, T. Fusaro, and A. J. Gow. 2004. Surfactant protein-D, a mediator of innate lung immunity, alters the products of nitric oxide metabolism. Am.J.Respir.Cell Mol.Biol. 30:271-279.

97. Atochina-Vasserman et al, In Press, Journal of Immunology, 2007.

98. Kuan SF, Persson A, Parghi D, and Crouch E. Lectin-mediated interactions of surfactant protein D with alveolar macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology 10: 430436, 1994.

99. Mahajan L, Madan T, Kamal N et al. Recombinant surfactant protein-D selectively increases apoptosis in eosinophHJTs of allergic asthmatics and enhances uptake of apoptotic eosinophHJTs by macrophages. Int Immunol. Aug 200820(8):993-1007, .

100. Hortobagyi L, Kierstein S, Krytska К et al. Surfactant protein D inhibits ФНО-alpha production by macrophages and dendritic cells in mice. Journal Allergy Clinikal Immunollogy., 11 Jun 2008.

101. Janssen WJ, McPhHJIlips KA, Dickinson MG. Surfactant proteins A and D suppress alveolar macrophage phagocytosis via interaction with SIHP alpha. J fcespir Crit Care Med. 2008 Jul 15; 178(2): 158-67.

102. Pritchard KA Jr. Surfactant protein D: not just for the lung anymore. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2008 May;294(5):H2053-9.

103. Brandt EB, Mingler MK, Stevenson MD et al. Surfactant protein D alters allergic lung responses in mice and human subjects. J Allergy Clin Immunol. 2008 May; 121 (5): 1140-1147.e2.

104. Torre lies JB, Azad AK, Henning LN et al. Role of C-type lectins in mycobacterial infections. Сurr Drug Targets. 2008 Feb;9(2):102-12.

105. Griese M, Steinecker M, Schumacher S, Braun A, Lohse P, Heinrich S. ChHJIdren with absent surfactant protein D in bronchoalveolar lavage have more frequently pneumonia. Pediatr Allergy Immunol. 2008 Feb 11.

106. Sims MW, Tal-Singer RM, Kierstein S et al. Chronic obstructive pulmonary disease and inhaled steroids alter surfactant protein D (SP-D) levels: across-sectional study. Respir Res. 2008 Jan 28;9:13.

107. Cooley J, McDonald B, Accurso FJ, Crouch EC, Remold-O'Donnell E. Patterns of neutrophHJI serine protease-dependent cleavage of surfactant protein D in inflammatory lung disease. J Leukoc Biol. 2008 Apr;83(4):946-55.

108. Kankavi O, Ata A, Celik-Ozenci C, Sati L et al. Presence and subcellular localizations of surfactant proteins A and D in human spermatozoa. FertPUI SterMJI. 2008 Jan 11.

109. Wang H, He^d J, Kosma P, Brade H et al. Recognition of heptoses and the inner core of bacterial lipopolysaccharides by surfactant protein D. Biochemistry. 2008 Jan 15;47(2):710-20.

110. Ikegami M, ScovHJlle EA, Grant S, Korfhagcn T et al. Surfactant protein-D and surfactant inhibit endotoxin-induced pulmonary inflammation. Chest. 2007 Nov; 132(5): 1447-54.

111. Knudsen L, Ochs M, Mackay R, Townsend P et al. Truncated recombinant human SP-D attenuates emphysema and type II cell changes in SP-D deficient mice. Respir Res. 2007 Oct 3;8:70.

112. Pastva AM, fright JR, WMJIliams KL. Immunomodulatory roles of surfactant proteins A and D: implications in lung disease. Proc Am Thorac Soc. 2007 Jul;4(3):252-7.

113. Lin CF, Tsai CC, Huang WC, Wang CY et al. ИНФ-gamma synergizes witli LPS to induce nitric oxide biosynthesis through glycogen synthase kinase-3-inhibited ИЛ-10. J Cell Biochem. 2008 Jul 24.

114. Salminen A, Paananen R, Vuolteenaho R et al. Maternal endotoxin-induced preterm birth in mice: fetal responses in toll-like receptors, collectins, and cytokines. Pediatr Res. 2008 Mar;63(3):280-6.

115. Iwamoto T, Okamoto H, Toyama Y, Momohara S. Molecular aspects of rheumatoid arthritis: chemokines in the joints of patients. FEBS J. 2008 Jul 24.

116. Lin CF, Tsai <CC„ Huang WC, Wang CY et al. ИНФ-gamma synergizes with LPS to induce nitric oxide biosynthesis through glycogen synthase kinase-3-inhibited ИЛ-10. J Cell Biochem. 2008 Jul 24.

117. Kirkeboen KA, Strand OA. The role of nitric oxide in sepsis—an overview. Acta Anaesthesiol Scand. 1999 Mar;43(3):275-88.

118. Jobe AH, Bancalari E. Bronchopulmonary dysplasia. Am J Respir Grit Care Med 2001; 163:1723-9.

119. Lobel B, Rodriguez A. Chronic prostatitis: what we know, what we do not know, and what we should do! World journal of urology. 2003;21:57-63. doi: 10.1007/s00345-003-0336-l.

120. Ardlie KG, Kruglyak L, Seielstad M. Patterns of linkage disequHJIibrium in the human genome. Nat Rev Genet 2002;3:299-309.

121. МШПап-Rodriguez F, Palou J, Bujons-Tur A, Musquera-Felip M, SevRflla-Cecpyiia C, Serrallach-Orejas M, Baez-Angles C,

122. VHJIlavicencio-Mavrich H. Acute bacterial prostatitis: two different sub-categories according to a previous manipulation of the lower urinary tract. World journal of urology. 2006;24:45-50. doi: 10.1007/s00345-005-0040-4.

123. Lahti M, Lofgren J, MarttHJla R, Renko M, Klaavuniemi T, Haataja R et al. Surfactant protein D gene polymorphism associated with severe respiratory syncytial virus infection. Pediatr Res 2002:51:696-9.

124. Haataja R, MarttHJla R, Uimari P, Lofgren J, Ramet M. Respiratory distress syndrome: evaluation of genetic susceptibHJIity and protection by transmission dteequHJJibrium test. Hum Genet 2001:109:351-5.

125. MarttHJla R, Haataja R, Ramet M, Lofgren J, Hallman M. Surfactant protein В polymorphism and respiratory distress syndrome in premature twins. Hum Genet 2003:112:18-23.

126. Oberley RE, Ault KA, NeffTL, Khubchandani KR, Crouch EC, Snyder JM. Surfactant proteins A and D enhance the phagocytosis of Chlamydia into THP-1 cells. American journal of physiology. 2004;287:L296-306.

127. Vayrynen 0, Glumoff V, Hallman M. Regulation of surfactant proteins by LPS and proinflammatory cytokines in fetal and newborn lung. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2002;282:L803-10.

128. Hartshorn KL, White MR, Crouch EC. Contributions of the N- and C-terminal domains of surfactant protein d to the binding, aggregation, and phagocytic uptake of bacteria. Infection and immunity. 2002;70:6129-6139. doi: 10.1128/IAI.70.11.6129-6139.2002.

129. Wang G, Umstead TM, Phelps DS, Al-Mondhiry H, Floras J. The effect of ozone exposure on the abMJIity of human surfactant protein a variants to stimulate cytokine production. Environ Health Perspect 2002; 1 10:79-84.

130. Nogee LM, Dunbar AE III, Wert S, Askin F, Hamvas A, Whitsett JA. Mutations in the surfactant protein С gene associated with interstitial lung disease. Cjhest 2002; 121 (Suppl 3):20S-1.

131. Rebecca E Oberley, Kelli L Goss, et al. Regulation of surfactant protein D in the rodent prostate. Reprod Biol Endocrinol. 2007; 5: 42.

132. Ferguson JS, Voelker DR, Ufnar JA, Dawson AJ, Schlesinger LS. Surfactant protein D inhibition of human macrophage uptake of Mycobacterium tuberculosis is independent of bacterial agglutination. J Immunol. 2002; 168:1309-1314.

133. Brinker KG, Martin E, Borron P, Mostaghel E, Doyle C, Harding CV, Wright JR. Surfactant protein D enhances bacterial antigen presentation by bone marroyz-derived dendritic cells. American journal of physiology. 2001 ;281 1453—63.

134. Lin Z, Floras J. Heterogeneous allele expression of pulmonary SP-D gene in rat large intestine and other tissues. Physiological genomics.2002; 1 1:235-243.I