Линейные и разветвленные поли- и олигопептиды на основе лизинга как средства доставки генных конструкций в клетки млекопитающих

Егорова, Анна Алексеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Линейные и разветвленные поли- и олигопептиды на основе лизинга как средства доставки генных конструкций в клетки млекопитающих
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Линейные и разветвленные поли- и олигопептиды на основе лизинга как средства доставки генных конструкций в клетки млекопитающих"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

К-..и 6- г

На правах рукописи

ЕГОРОВА Анна Алексеевна

00348126Э

ЛИНЕЙНЫЕ И РАЗВЕТВЛЕННЫЕ ПОЛИ- И ОЛИГОПЕПТИДЫ НА ОСНОВЕ ЛИЗИНА КАК СРЕДСТВА ДОСТАВКИ ГЕННЫХ КОНСТРУКЦИЙ В КЛЕТКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

Специальность: 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 3 О':'

Санкт-Петербург 2009

003481269

Работа выполнена в НИИ акушерства и гинекологии им. Д О. Отга СЗО РАМН, Санкт-Петербург, в Санкт-Петербургском Государственном Университете и в Университете г. Хельсинки, Финляндия.

Научный руководитель: член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Баранов Владислав Сергеевич

Официальные оппонеты: доктор биологических наук, профессор Перевозчиков Андрей Петрович

доктор медицинских наук, профессор Имянитов Евгений Наумович

Ведущее учреждение: Институт цитологии РАН

Защита состоится НОЯ&рЯ 2009 г. ъ часов на заседании совета Д.212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском Государственном университете по адресу: 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан £fcnul^/Îig2009 г.

Ученый секретарь . Диссертационного совета

кандидат биологических наук Л.А. Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Генная терапия является перспективным подходом к лечению наследственных и приобретенных заболеваний с помощью генов и продуктов их экспрессии. Результатом генной терапии является нормализация, ослабление или ликвидация патологического процесса, полное или частичное восстановление поврежденных или утраченных функций клеток, тканей, органов и излечение организма. Одной из центральных проблем генной терапии является отсутствие эффективных способов доставки генных конструкций в клетки. Наблюдаемая в большинстве случаев низкая эффективность трансфекции с использованием "незащищенной" ДНК послужила толчком к разработке средств внутриклеточной доставки генетических конструкций. На сегодняшний день вирус-опосредованный перенос считают наиболее эффективным способом доставки ДНК в клетки млекопитающих in vivo. Однако использование вирусных векторов серьезно ограничено их иммуногенностью и риском инсерционногО мутагенеза. Альтернативным подходом является поиск невирусных носителей, способных повысить эффективность доставки гена "интереса" в клетки.

Перспективным направлением в разработке средств доставки генов является создание невирусных носителей на основе поли- и олигопептидов. Высокомолекулярный полилизин был одним из первых полимеров, использованных для невирусной доставки ДНК в организм (Wu, Wu, 1988). На первых этапах таких работ исследователей привлекала биодеградируемостъ полилизина и его производных, наличие стандартизованных и недорогих методов синтеза и очистки. Важным преимуществом таких носителей была возможность их модификации сигналами для преодоления вне- и внутриклеточных барьеров транспорта ДНК (Pouton, Seymour, 2001 ; Morris et al., 2000).

Одним из направлений модификации высокомолекулярного линейного полилизина явилось оздание разветвленных полимеров. Плотность положительного заряда на разветвленной молекуле ущественно выше по сравнению с линейным поликатионом. Методом светорассеяния установлено, то форма разветвленного полилизина по сравнению с линейным полилизином приближается к ферической, и в значительной мере напоминает структуру глобулярных белков. Наличие т.н. <гистоновой мимикрии» данной группы соединений предопределило интерес к исследованию их в ачестве невирусных средств доставки ДНК (Власов, 2006). Способность к трансфекции в значительной мере зависит от присутствия на поверхности носителя ункциональных групп. Вводя в состав носителя те или иные химические группировки, можно збирательно влиять на эффективность преодоления определенного барьера. Ранее в работах по оучению лизин-гистидинового сополимера была отмечена перспекгавность такой модификации. За чет выхода комплексов ДНК/носитель из эндосом полученные соединения обеспечивали более ффективную доставку ДНК, чем сам полилизин в присутствии эндосомолитического агента (Midoux, onsigny, 1999).

Основным недостатком использования высокомолекулярных полимеров оказалась их высокая оксичность (Brown et al., 2001). Возможным способом снижения токсичности было уменьшение олекулярного веса. Однако способность низкомолекулярных соединений образовывать комплексы с НК, стабильные при физиологических условиях оказалась сниженной. Это явилось предпосылкой к азвитию направления, связанного со стабилизацией таких носителей методом перекрестных сшивок dami, Rice, 1999). Возможным подходом к образованию перекрестных сшивок между молекулами осителя является его модификация остатками цистеина (McKenzie et al., 2000). Наличие остатков истеина обуславливает возможность образования дисульфидных связей между молекулами. В езультате образуется полимер, который в сравнении с низкомолекулярными соединениями способен олее эффективно конденсировать ДНК в стабильные комплексы. При попадании в клетку полимер аспадзется за счет редукции дисульфидных связей, что снижает его токсичность. Необходимым требованием при разработке средств доставки ДНК является создание носителей, особных обеспечивать специфичный перенос генных конструкций, путем их модификации гандами к соответствующим тканеспецнфичным рецепторам (Schaffner, Dard, 2003; Kawakami et al., Э4; Parie et al., 2006). Для генной и клеточной терапии актуальным направлением является создание стемы направленного транспорта генов в стволовые и опухолевые клетки. Возможным подходом я направленной доставки генов в эти клетки является модификация носителя лигандом к мокиновому рецептору CXCR4, который присутствует в более чем 20 видах опухолей и представлен поверхности некоторых типов стволовых клеток (Juarez et al., 2004).

Вышесказанное предопределило направление данного исследования, связанного с изучением серии разветвленных аминокислотных носителей с неупорядоченным ветвлением, самосшивающихся цистеин-богатых пептидов и сигнальных пептидов для связывания с рецептором CXCR4 на поверхности клеток.

Целью данной работы является поиск перспективных невирусных носителей на основе поли- и олиголизина для направленной доставки генных конструкций в клетки млекопитающих.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследование влияния состава носителей на условия образования комплексов с ДНК.

2. Определение влияния состава пептидных носителей на трансфекционную активность их комплексов с ДНК in vitro.

3. Анализ токсических свойств комплексов ДНК с гиперразветвленными и цистеин-богатыми пептидами.

4. Разработка пептидных последовательностей для адресной доставки ДНК в клетки с экспрессией рецептора CXCR4.

5. Изучение особенностей проникновения сигнальных пептидов в клетки экспрессирующие рецептор CXCR4.

6. Изучение особенностей трансфекции клеток in vitro комплексами сигнальных пептидов и ДНК.

Научная новизна работы. Впервые были изучены серии оригинальных синтетических поли- i олигопептидов в качестве средств доставки генетических конструкций в клетки. Проанализирован влияние состава и структуры исследованных лизин-богатых носителей на трансфекционн) активность комплексов с ДНК in vitro. Впервые были исследованы N-концевые последовательности хемокинов SDF-1 и vMIP-II в качестве лигандов для рецептор-опосредованного переноса геннь конструкций в клетки. Продемонстрированы специфичность связывания данных последовательности' с рецептором и направленная доставка ДНК в клетки с экспрессией CXCR4.

Практическая значимость работы. Полученные результаты могут служить основой для создан невирусного модульного носителя, содержащего сигналы для преодоления барьеров внутриклеточног транспорта и адресной доставки генных конструкций в клетки. Разработан вариант пептидног носителя, который может найти применение при разработке генной терапии ряда наследственных онкологических заболеваний.

Положения, выносимые на защиту. Замещение в составе гиперразветвленного полилизина час терминальных остатков лизина на гистидин увеличивает трансфекционную активность его комплекте с ДНК. Тип полимеризации, длина и состав самосшивающихся цистеин-богатых пептидов влияют н эффективность трансфекции комплексов ДНК/носитель. При оптимальных зарядовых соотношени самосшивающиеся пептиды менее токсичны, чем гиперразветвленные полилизинь Последовательности N-концевых фрагментов хемокинов SDF-1 и vMIP-II обеспечивают адресн; доставку ДНК в клетки с рецептором CXCR4. Сигнальные пептидные носители связываются рецептором CXCR4, избирательно проникают и доставляют ДНК в клетки.

Апробация работы. Представленные в диссертации результаты были доложены на Ш съез ВОГИС (2004); в материалах 5 конгресса медицинских генетиков (2005); на 6 международн конференции по генетике соматических клеток (2005); на 11, 12, 13, 14, 15 и 16 Конгресс Европейского Общества Генной Терапии (2003, 2004, 2005, 2006, 2007, 2008); на 14, 15 и Европейской Конференции по Генетике Человека (2004, 2005, 2007); на 9 Ежегодной конференц Американского Общества Генной Терапии (2006); на конференции Британского общества генн терапии (2006); на 4 и 7 конференциях по наномедицине (2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 22 работы.

Объем и структура диссертаиии. Диссертационная работа состоит из «Введения», «Спис сокращений», «Обзора литературы», «Материала и методов», «Результатов», «Обсуждения «Выводов», «Списка литературы», состоящего из 314 источников, и «Приложения». Работа изложе1 на 178 страницах и содержит 46 рисунков и 2 таблицы.

Благодарности. Автор благодарит директора Центра исследования лекарств п фармацевтическом факультете Университета г. Хельсинки (Финляндия) профессора Арто Уртги предоставленную возможность выполнить значительную часть экспериментальной работы.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Эксперименты по невирусной доставке ДНК-конструкций in vitro проводили на культурах клеток эпителиальной карциномы человека HeLa, глиобластомы человека А172 (коллекция клеточных культур Института цитологии РАН, Санкт-Петербург) и карциномы яичников хомячка СНО (коллекция клеточных культур Университета г. Куопио, Финляндия). Культуры клеток HeLa, А172 и СНО вели согласно стандартной методике "Fundamental Techniques in Cell Culture" S1GMA-ALDRICH (Salisbury Wiltshire, SP4, OJG, Великобрэтания).

Для экспериментов использовали плазмиды pCMV nls LacZ и pCluc. Конструкция pCMV nls LacZ содержит маркерный ген lacZ под контролем цитомегатовирусного промотора с ядерной локализацией продукта экспрессии (ß-галактозидазы) (Университет им. Эразма Роттердамского, Роттердам, Нидерланды). Конструкция pCluc содержит маркерный ген люциферазы под контролем цитомегаловирусного промотора (Promega, Madison, WI, USA). В работе были использованы следующие невирусные носители:

• гиперразветвленные поли-Ь-лизины (spLL, spLLI110:l (соотношение терминальных остатков лизина и гистидина 1:1) и spLLHl:l (соотношение терминальных остатков лизина и гистидина 1:10)) и линейный поли-1^лизин pLL (Sigma);

• самосшивающиеся цистеин-богаггые пептиды (CLPK6 (СНККККККНС), CLPK12 (СНККККККННККККККНС), CLPR6 (CHRRRRRRHC)). При исследовании самосшивающихся пептидов использовали два подхода: матричную полимеризацию (образование дисульфидных связей между пептидами непосредственно на матрице ДНК - полимер образуется в процессе комплексообразования) и окислительную поликонденсацшо (под воздействием катализаторов образуется полимер в результате дисульфидных сшивок, далее происходит компактизация ДНК данным полимером). После окислительной поликонденсации образованные полимеры получили название CLPK6p, CLPK12p, CLPRöp;

• пептиды, несущие сигнал связывания с рецептором CXCR4 (long CDP (KPVSLSYRSPSRFFESH-sahx-Eahx-KKKKKKKK-K(e-biotinyl)), short CDP (KPVSLSYR-eahx-£ahx-KKKKKKKK-K(s-biotinyl)), viral CDP (D-LGAS'lW/?№/i-Eahx-£aJix-KKKKKKKK-K(c-biotmyl)), CP (KKKKKKKK K(e-biotinyl)) - контрольный пептид без сигнала).

Эцдосомолитические агенты: глицерин;

синтетический пептид JTS-1 (GLFEALLELLESLWELLEA).

Носители spLL, spLLH10:l, spLLHl:l, а также пептид JTS-1 были синтезированы в лаборатории имии физиологически активных полимеров института Высокомолекулярных Соединений РАН (ИВС АН, Санкт-Петербург). Носители CLPK6, CLPK12, CLPR6, long CDP, short CDP, viral CDP, CP были интезированы фирмой ООО "НПФ Верта" (Санкт-Петербург).

В качестве контроля в экспериментах использовали полкамидоаминный дендример Polyfect Quiagen) или разветвленный полиэтиленимин (ПЭИ) с молекулярным весом 25 кДа (Sigma-Aldrich).

Изучение условий формирования комплексов ДНК/носитель, эффективности связывания ДНК осителем и стабильности сформированных комплексов проводили методом ретардации в агарозном еле и с помощью теста на вытеснение бромистого этвдия. Измерение интенсивности флуоресценции ромистого этидия проводили на приборе Wallac 1420D при длинах волн 540/590 нм. Мониторинг бразования комплексов ДНК с самосшивающимися цистеин-богатыми пептидами проводили етодом вытеснения флуоресцентного красителя SybrGreea Измеряли интенсивность флуоресценции а многофункциональном счетчике Varioscan при длинах волн 495/600 нм через различные интервалы ремени. Анализ относительного количества свободных тнольных групп в цистеин-богатых пептидах ри формировании комплексов с ДНК проводили с помощью метода Эллмана. Измеряли нтенсивность свечения реагента Эллмана на спектрофотометре Wallac 1420D при длине волны 405 м. Способность носителей защищать ДНК от ферментативной деградации исследовали методом ащиты» от ДНКазы I. Размеры комплексов ДНК/носитель измеряли методом динамического веторассеяния с использованием прибора Zetasizer 1000HS (Malvern Instruments Ltd, Malvern, UK). Для трансфекции клеток на культур альных 24- и 48-луночных планшетах использовали комплексы НК/носитель из расчета 2 мкг плазмидной ДНК на каждую лунку планшета. Для изучения ндосомолитической активности носителей трансфекцию проводили в присутствии глицерина (Zauner t al., 1996) и, в ряде случаев, пептида JTS-1 (Gottschalk et al., 1996). Выявление активности ß-

гапактозидазы проводили по стандартной методике с субстратом X-gal (5-бром-4-хлор-3-индолил-Р-0-галактопиранозида) (Sambrook et al., 1989). Анализ экспрессии маркерного гена lacZ проводили на инвертированном микроскопе Opton Axiovert при увеличении в 100-400 х. Эффективность трансфекции оценивали как долю клеток, экспрессирующих маркерный ген lacZ, к общему количеству клеток на культуральном планшете. Активность гена люциферазы определяли количественным методом с помощью люциферин-содержащего раствора. Измерение люминесценции проводили на многофункциональном счетчике Varioscan. Эффективность трансфекции с использованием гена люциферазы рассчитывали в количестве относительных световых единиц (relative light units, RLU) на 1 мг белка. Общее количество клеточного белка определяли методом Бредфорд. Проводили измерение интенсивности свечения на спектрофотометре Wallac 1420D при длине волны 620 нм. Анализ влияния комплексов с изученными пептидами на метаболическую активность клеток проводили с помощью флуоресцентного красителя Alamar Blue. Интенсивность флуоресценции красителя измеряли на многофункциональном счетчике Varioscan при длинах волн 530/590 нм.

Цитофлуорометрический анализ экспрессии рецептора CXCR4 на поверхности клеток HeLa, А172 и СНО проводили с помощью моноклональных airm-CXCR4 антител 12G5 (BD Pharmingen, CA, США). Анализ проводили на проточном цитофлуориметре BD LSRH. Специфичность связывания пептидов long CDP, short CDP, viral CDP и CP с рецептором CXCR4 оценивали с помощью конкурентного вытеснения моноклональных анти CXCR4 антител 12G5 методом проточной цитофлуорометрии. Анализ эффективности проникновения конъюгатов сигнальных пептидов и меченного авидин-ФИТЦ в клетку проводили на проточном цитофлуориметре BD LSRI1.

Достоверность различий между контролем и опытом, а также между опытами оценивали при помощи t-критерия Стьюдента (р<0.05) с использованием статистической' программы Prism5. Результаты экспериментов представлены на рисунках с учетом ± S.D.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Изучение гиперразветвленных попи-1_-лизинов (эрИ-в)

В данной работе проведено исследование трех соединений с неупорядоченным характере, ветвления цепей: гомополимера БрЬЬ и гетероаминокислотных носителей - $р1ХН10:1 и зрШН1:1 модифицированных по поверхности остатками гистидина (соотношение терминальных остатко лизина и гистидина - 10/1 и 1/1 соответственно). Соединения врЬЬН были разработаны I синтезированы для придания гиперразветвленному полимеру эндосомолитических свойств. Известно что включение в состав пептидных носителей гистидина способствует выходу комплексов и эндосом, благодаря эффекту "протонной губки".

Анализ конденсаиии ДНК в составе комплексов с носителями йрЩ !уЬЬН10:1, $уЬЬП1:1

Степень компактизацш

плазмцдной ДНК в комплексе гиперразветвленными носителям анализировали методо

вытеснения бромистого этид! (БЭ). За 100% интенсивное! флуоресценции принимал

свечение БЭ с плазмидной ДНК отсутствие носителя.

В результате проведеннь исследований показано, что пр возрастании концентраци

носителя зр1Х (рис. 1) отмечалос постепенное угасани

флуоресценции, обусловленно ограничением доступа молеку красителя к ДНК по мер увеличения плотное:

формирующихся комплексо Постепенное гашени

1/0.1 1/0.2 1/0.4 1/0.6 1/0.8 1/1 1/2 1/3 1/5 Весовые соотношения ДНК/носитель —spLL -B-spLLH10:1 -*-spLLH1:1

Рис. 1. Изменение интенсивности флуоресценции бромистого этидия при увеличении весовых соотношений ДНК/носитель в комплексах ДНК/врЩ ДНК/ц)1ЛМ10:\ и ДНЮзрШП:!.

флуоресценции наблюдали, начиная с соотношения 1/0.2, в интервале от 1/0.2 до 1/0.6. При дальнейшем увеличении количества носителя в составе комплексов кривая интенсивности флуоресценции выходила на плато. Наблюдавшееся падение флуоресценции свидетельствовало о возрастании плотности формировавшихся комплексов. Выход кривой на плато указывал на то, что комплексы достигали плотности, достаточной для полного гашения флуоресценции бромистого этидия.

Для соединений spLLH10:l и spLLHl:l (рис. 1) резкое гашение флуоресценции наблюдали при соотношении 1/0.8. Однако, для соединения spLLHl:l при соотношении 1/0.8 уровень интенсивности флуоресценции составлял 50%. При дальнейшем увеличении количества включенного в состав комплексов носителя spLLHl:l, начиная с весового соотношения 1/1, кривая интенсивности флуоресценции выходила на плато. Полученные данные свидетельствуют о том, что модификация носителей гистидином приводит к ухудшению /1ДК-связывающих свойств по сравнению с исходным гомоаминокислотным соединением spLL. Согласно литературным данным, поли-Ь-гистидин при физиологических рН среды не может образовывать комплексы с ДНК, поскольку имидазольные группы шстидина при данном рН остаются незаряжеными (Midoux, Monsigny, 1999). Имидазольные группы гистидина способны протонироваться при рН ниже 6.0 (Pichón et al., 2001). Поскольку рН воды выше 6.0, то при формировании комплексов ДНК/spLLHlO:! и ДНК/spLLH 1:1 в водном растворе молекулы гистидина в составе данных соединений оставались незаряженными. Это, по нашему мнению, и являлось причиной ухудшения ДНК-комлактизующих свойств гистидин-содержащих полилизинов по сравнению с немодифицированным соединением spLL.

Изучение трансфекционной активности комплексов ДНК/spLL. ДНК/spLLHlO:!, ДНК/spLLHl:!

в жспершнентах in vitro Проведена серия экспериментов по трансфекции клеток культуры HeLa комплексами, сформированными при весовом соотношении ДНК/носитель 1/3. В экспериментах использовали

плазмиду pCMV nis LacZ. Также проведена серия экспериментов по трансфекции клеток культуры HeLa комплексами ДНК/spLL,

flHK/spLLH10:l и ДНК/spLLHl :1 в присутствии мембраноактивного агента глицерина (рис. 2).

В отсутствие глицерина для комплексов ДНК/spLLH 10:1

наблюдали увеличение

трансфекционной активности в 12 раз до уровня 1.29% по сравнению с комплексами ДНК/spLL. Для комплексов ДНК/spLLH 1:1

наблюдали 4-х кратное повышение эффективности трансфекции по Рис. 2. Доля клеток с экспрессией гена fi-гялактозидазы сравнению с комплексами после трансфекции комплексами ДНК/spLL, ДНК/spLLHlO: 1 и днк/spLL до 0.42%. Таким образом, flHK/spLLHLi (весовое соотношение ДНК/носитель 1/3) в В1ШЮЧение гистидина в состав отсутствии и присутствии глицерина. * - р<0.05 по молеКулы носителя приводит к сравнению с эффективностью трансфекции без добавления повышению эффективности

глицерина. трансфекции комплексов ДНК с

модифицированными полилизинами. Полученные данные согласуются с исследованиями зарубежных авторов, изучавших сополимеры лизина и гистидина. В работе Беннса с соавторами были изучены сополимеры лизина и гистидина, в которых 25% e-аминогрупп полилизина, были коньюгированы с цепочками поли-Ь-гистидина, что привело к увеличению эффективности трансфекции исследуемого носителя по сравнению с немодифицированным поли-L-лизином (Benns et al., 2000). Возрастание трансфекционной активности при модификации полилизина гистидином было показано также другими исследователями (Pichón et al., 2001).

Аминокислоты й состав носителей spLLH 10:1 и spLLH 1:1 предполагает наличие у них собственной эндосомолитичекой активности за счет протонирования имидазольных групп гистидина при

понижении уровня pH в эндосомах. Протонирование имидазольных групп приводит к набуханию и разрыву эндоеомы вследствие осмотического шока (Pichón et al., 2001). Было показано, что в присутствии глицерина эффективность трансакции комплексами ДТIK/spLLH 10:1 1/3 достоверно не отличалась от результатов трансфекции этими комплексами без применения дополнительного мембраноактивного агента. Отсутствие влияния дополнительного эндосомолитического агента на эффективность носителя spLLH10:l возможно свидетельствует о наличии у данного соединения собственных эндосомолитических свойств. В тоже время, эффективность трансфекции комплексами ДНК/spLLHl :1 1/3 в присутствии глицерина возросла до 1.1%. Полученные данные свидетельствуют о том, что spLLHl:l обладает менее выраженной эндосомолитической активностью по сравнению с глицерином. Таким образом, остатки гистидина в составе молекулы носителя могут оказывать влияние как на трансфекционную, так и эндосомолитическую шсгивность.

При исследовании носителей spLLH10:l и spLLHl:!, модифицированных гистидином на 9% и 50%, было показано, что гетероаминокислотный суперразветвленный полимер spLLH10:l является наиболее перспективным носителем за счет способности высвобождаться из эндосом и препятствовать лизосомальной деградации ДНК.

2. Изучение самосшивающихся цистеин-богатых пептидов (CLPs)

Проведено исследование трех самосшивающихся цистеин-богатых пептидов: двух олиголизинов (CLPK6, CLPK12) и олигоаргинина (CLPR6). На основ ании результатов собственных исследований, а также литературных данных, гистидин был включен в состав пептидов для придания им эндосомолитических свойств (Midoux, Monsigny, 1999). Соединение CLPKó было синтезировано на основе данных полученных МакКеши с коллегами (McKenzie et al., 20006). Пептид CLPK12 является аналогом CLPK6, полученным при удвоении последовательности НК6Н. Предполагалось, что увеличение молекулярного веса соединения позволит увеличить эффективность трансфекции (Mannisto et al., 2002). Замена остатков аминокислоты лизина на аргинин в соединении CLPR6 была обусловлена данными об аминокислотном составе природных пенетратинов, в частности, ТАТ-пептида (ignatovich et al., 2003). Для каждого из соединений при образовании комплексов с ДНК использовали как матричную полимеризацию (CLPK6, CLPK12, CLPR6), так и окислительную поликонденсацию (CLPK6p, CLPK12p, CLPR6p).

Изучение степени релаксаиии комплексов ДНК с носителями CLPK6. CLPK6p, CLPK12. CLPK12p.

CLPR6. CLPRfip после добавления гепарансулъфата (ГО

Взаимодействие комплексов с внеклеточными и внутриклеточными полианионами, такими как

гликозамингликаны или молекулы РНК, может оказывать влияние на

эффективность трансфекции. Такие отрицательно заряженные компоненты могут нарушать доставку генетических конструкций. С одной стороны, они могут связываться с комплексами и ингибировать их или высвобождать ДНК из состава

комплексов, снижая эффективность доставки (Riipcmen et al., 1999). С другой

• с

без ГС 0 мин 20 мин 40 мин 1 час Время

—CLPK6 t/20 -в-О.РК6р 1/20

-*-CLPK12p 1/20 —в—CLPR6 1/20

бчасое 16часов 24часа

É-CLPK12 1/20 •-CLPR6P 1/20

Рис. 3. Релаксация комплексов ДНК с пептидами CLPK6, CLPK6p, CLPK12, CLPK12p, CLPR6, ClPR6p 1/3 при помощи добавления ГС. * - р<0.05 при сравнении комплексов с матричной полимеризацией и окислительной поликонденсацией.

стороны, способность носителей высвобождать ДНК из состава комплексов для последующей экспрессии трансгена является важным параметром, повышающим эффективность трансфекции. Для изучения степени релаксации ДНК в комплексах с пептидами CLPK6, CLPK6p, CLPK12, CLPK12p, CLPR6, CLPR6p проведено тестирование проб комплексов с зарядовым соотношением ДНК/носитель 1/20. Измерение проводили в отсутствие ГС и после его добавления (в троекратном избытке пептид/ГС по зарядам) в следующие промежутки времени: 0 мин, 20 мин, 40 мин, 1 час, 6 часов, 16 часов, 24 часа (рис. 3). Анализ проводили методом вытеснения бромистого этидия (БЭ). За 100% интенсивности флуоресценции принимали свечение БЭ с плазмидной ДНК в отсутствие носителя.

Интенсивность флуоресценции БЭ в комплексах ДНК/СЬРКбр, ДНК/СЬРК12р, ДНК/CLPRóp по окончании времени инкубации с ГС повысилась до 30 - 40%. Интенсивность флуоресценции БЭ в комплексах ДНК/СЬРКбр, ДНК/СЬРК12р, ДНК/СЬРЯ6р оказалась значительно ниже и в конце инкубации с ГС составила около 10% (рис. 3). Таким образом, комплексы, образованные в результате окислительной поликонденсации, оказались менее устойчивыми к разрушению. Однако более выраженная способность данных носителей высвобождать ДНК внутри клетки может положительно влиять на эффективность трансфекции.

Сравнительное изучение тушсфекиионной активности комплексов ДНЮСЬРКб, J1HK/CLPKJ2.

ДНК/CLPRÓ: ДНК/СЬРКбр. ДНК/СЬРК12у, ДНК/СЬРКбр на клетках СНО Проведена серия экспериментов по трансфекции клеток культуры СНО комплексами ДНК/СЬРКб, ДНК/СЬРК12, ДНК/СЬРЯб, ДНК/СЬРКбр, ДНК/СЬРК12р, ДНК/CLPRóp, сформированными при зарядовых соотношениях ДНК/носитель 1/5, 1/20. В экспериментах использовали плазмиду pCluc с геном люциферазы. В качестве положительного контроля использовали ДНК, упакованную в коммерческий носитель ПЭИ (25 кДа), с зарядовым соотношением ДНК/носитель 1/8 (рис. 4).

При использовании матричной полимеризации и окислительной полимеризации наибольшая трансфекционная активность была продемонстрирована для комплексов ДНК с соединениями CLPR6 и CLPRóp. При всех исследуемых соотношениях ДНК/носитель от 1/5 до 1/20 эффективность комплексов ДНК/CLPRóp была сравнима и в ряде случаев в 2 - 20 раз превышала эффективность комплексов ДНК/ПЭИ. Трансфекционную активность комплексов ДНК с аргинин-богатыми соединениями связывают с наличием в их составе гуанидиновых групп, которые, взаимодействуя с

некоторыми компонентами клеточной мембраны, увеличивают эффективность проникновения в клетки аргинин-богатых соединений (Futaki, 2006). Повышенная способность олигоаргининов, по сравнению с

олиголизином, проникать в клетки была отмечена ранее (Mitchell et al., 2000).

Для комплексов ДНК/СЬРК6 и

ДНК/СЬРКбр с

зарядовым соотношением 1/20 показано, что носитель СЬРКбр способен в 280 раз более эффективно

CLPK6 1/5 CLPK6 1/20 CLPK12 1/5 CLPK12 CLPR6 1/5 CLPR6 1/20 1/20

Зарэдовые соотношения ДНК/носитель

• матричная полимеризация

С]поликонденсация

Рис. 4. Активность гена люциферазы после трансфекции комплексами ДНК/СЬРКб, ДНК/СЬРК12, ДНК/СЬРЯб, ДНК/СЬРКбр, ДНЮСЬРК12р, ДНК/СЬРКбр кпеток культуры СНО. * - р<0.05 по сравнению с эффективностью комплексов, сформированных при матричной полимеризации.

доставлять ДНК в клетки, чем носитель СЬРКб. При соотношении ДНК/носитель 1/20 полипептид СЬРК12р был способен в 35 раз более эффективно доставлять ДНК в клетки, чем пептид СЬРК12. Комплексы ДНК/СЬРКбр при зарядовом соотношении 1/5 были в 4000 раз более эффективны при трансфекции, чем ДHK/CLPR6. Их активность составила 64166677 К1Х!/1 мг белка. Таким образом,

установлено, что пептиды, образованные в результате окислительной поликонденсации, способны более эффективно доставлять ДНК в клетки, чем те же пептиды в условиях матричной полимеризации. Одним из вероятных параметров, повышающих эффективность трансфекции комплексов с носителями, является их способность высвобождачъ ДНК. Комплексы, сформированные после окислительной поликонденсации, были способны более эффективно высвобождать ДНК, чем комплексы, сформированные результате матричной полимеризации. Таким образом, данный факт является одним из вероятных параметров, повышающих эффективность трансфекции комплексов с носителями СЬРКбр, CLPK12p, CLPRóp.

Влияние дитиотрейтола на сохранность комплексов ДНК с носителями CLPK6, СЬРКбу.

CLPK12. CLPK12o. CLPR6, CLPRÓv

Нами была изучена способность комплексов ДНК с носителями CLPK6, CLPK12, CLPR6, СЬРКбр, CLPK12p и CLPRóp к разрушению под действием ДТ'Г методом вытеснения бромистого этидия (БЭ). Комплексы ДНК/р1Х220 оказались устойчивыми к действию данного агента вследствие отсутствия в их составе SH-групп. В случае матричной полимеризации при инкубации комплексов ДНК/СЬРКб и ДНК/CLPRó с ДТТ наблюдалось достоверное увеличение проницаемости данных комплексов. Наиболее устойчивыми к действию ДТТ оказались комплексы ДНК/СЬРК12. Было показано, что ДТТ

способен увеличивать их проницаемость для БЭ только в 1,6 раз (рис. 5а). В случае окислительной поликонденсации достоверное увеличение проницаемости

наблюдалась для всех изученных комплексов (рис.5б).

Активное внутриклеточное

высвобождение ДНК из состава комплексов с самосшивающимися цистеин-богатыми пептидами

происходит благодаря нескольким механизмам. Во-первых, за счет отрицательно заряженных молекул, во-вторых, благодаря веществам, разрушающим дисульфидные связи, таким как глютатион (Ostergaard et al., 2004). Следует упомянуть, что структура комплексов при двух типах полимеризации SH-пептидов различается. Поскольку при матричной полимеризации

дисульфидные связи могут замыкаться в кольцевые структуры из моно- и олигопептидов, высвобождение молекул ДНК невозможно без редукции S-S связей. После окислительной

поликонденсации сформированный Рис. 5. Изменение интенсивности флуоресценции носитель содержит небольшое бромистого этидия после инкубации комплексов количество свободных тиольных ДНК/С1РК6, MHK/CLPK12, ДНЮ'СЬРЯб (а) и ДНК/СЬРКбр, групп, поэтому образование ДНК/СЬРК12р, ДНК/CLPRóp (б) с ДТТ. * - р<0.05 по кольцевых структур при данном сравнению с интенсивностью флуоресценции БЭ без способе образования комплексов добавления ДТТ. менее вероятно. Такие комплексы

являются более доступными для релаксации отрицательно заряженными молекулами. Эффективность разрушения дисульфидных связей и высвобождение ДНК для носителей, сформированных при окислительной поликонденсации

CLPK6 CLPK12 CLPK12 CLPR6 CLPR6 pLL220 pl.L220 1/4 1/3 1/4 1/3 1/4 1/3 1/4 Зарядовые соотношения ДНК/носитель

_ *

□ без ДТТ

В с ДТТ

1*8

_I а Ьятя Г^ЧДга

CLPK6p CLPK12D CLPKl2p CLPR6p CLPR6p pLL220 pU-220 1/4 1/3 1/4 1/3 1/4 1/3 I/4

Зарядовы« соотношения ДНК/ност*ль

также выше, чем сформированных в

при матричной полимеризации (рис. 5). Такие результате окислительной поликонденсации, могли

эффект

а Й|

§ §

о,

3d я й-

II » &

"9-4

s ш

s -1

о й* Й о Щ

5 Ч § £ •О йч

II ® &

£ Ч § £

I *

^ о

Со V

§ £

u ¡2

8 ti

о У

«а ¡5

§ й

| fct

5J 45

S Ой

■й а.

а £

о, t^

особенности носителей, оказать положительный на эффективность трансфекции комплексами с данными соединениями. Вместе с тем, наши результаты

свидетельствуют о важности баланса между эффективностью высвобождения ДНК и ее сохранностью в составе комплексов до проникновения в ядро.

Сравнительный анализ токсичности комплексов ДНК/СЬРК6. ДНК/аРК12. ЛИ К/С LPR6; ДНК/ЫРКбу.

ДНК/СЬРК12р, ДНК/ЫРЛбр на клетках СНО Важной особенностью носителя является способность доставить генетическую

конструкцию, не оказывая негативного влияния на жизнеспособность клеток. При этом токсические свойства носителей зависят от таких параметров, как молекулярный вес, плотность заряда и др. В наших исследованиях оценка токсичности комплексов ДНК с

самосшивающимися цистеин-богатыми пептидами проводилась с использованием красителя

AlamarBlue (рис. 6). Токсичность исследованных комплексов

сравнивали с токсичностью комплексов ДНК с ПЭИ, гиперразветвленными полилизинами (spLLH10:l,

spLLHl:l) и линейными полилизинами с молекулярным весом 22,5 кДа (pLL22,5) и 220 кДа (pLL220), а также интактной ДНК.

Известно, что комплексы ДНК с ПЭИ являются токсичными для клеток (Fischer et al., 2003). Количество живых клеток после обработки данными комплексами составило 71,96%. Токсичность комплексов ДНК с линейными полилизинами возрастает при увеличении молекулярного веса соединения, а уровень

пролиферации уменьшается до 45,72% при соотношении ДНК/носитель 1/5 и до 0,18% при

соотношении 1/20. Токсичность, опосредованную молекулярным весом поликатиона, можно объяснить силой взаимодействия поликатиона с отрицательно заряженными компонентами клеточной мембраны (Morgan et al., 1989). Комплексы с гиперразветвленными соединениями оказались токсичными даже при низких весовых соотношениях. После инкубации клеток с комплексами JlHK/spLLH10:l и ДИК/spLLHl: 1 при весовом соотношении 1/3 количество живых клеток составляло 40,56% и 53,95%, соответственно.

В результате исследования самосшивающихся пептидов мы обнаружили, что уровень пролиферации после обработки комплексами ДНК/СЬРК6, ДНК/(ХРК12, ДНК/CLPRö был сравним с количеством живых клеток после внесения в лунку некомпактизованной ДНК и оставался практически неизмененным. Более токсичными оказались комплексы с полимерами, полученными после поликонденсации. Наиболее токсичными были комплексы ДНК/(ХРК12р: при зарядовом соотношении ДНК/носитель 1/20 количество живых клеток составило только 1,79%. После обработки клеток комплексами ДНК/СЬРК6р 1/5 пролиферация клеток достоверно не отличалась от таковой после их обработки незащищенной ДНК. Наибольшую токсичность обнаруживали комплексы с полимерами, образованными после поликонденсации, сформированные при большом зарядовом соотношении (1/20). Однако токсичность цистеин-богатых пептидов в среднем оказалась ниже, чем высокомолекулярных полилизинов, в том числе гиперразветвленных. Большая токсичность комплексов с носителями после окислительной поликонденсации может быть обусловлена более высоким молекулярным весом данных соединений, по сравнению с пептидами после матричной полимеризации. Согласно литературным данным диссоциация комплексов с носителями может влиять на их токсические свойства. После диссоциации комплексов, положительно заряженные полимеры Moiyr взаимодействовать с отрицательно заряженными компонентами внеклеточного матрикса и дестабилизировать плазматическую мембрану (Fischer et al., 2003). Изученные в нашей работе носители после окислительной поликонденсации способны более эффективно высвобождать ДНК из состава комплексов, чем при матричной полимеризации (рис. 4). Высвобождение положительно заряженных молекул носителя также является одним из возможных объяснений более высокой токсичности комплексов с полимерами, образованными после поликонденсации, сформированных при большом зарядовом соотношении.

На основании полученных данных о цистеин-богатых пептидах можно заключить, что наименее токсичными и наиболее трансфекционно активными оказались комплексы ДНК/CLPRôp 1/5 и ДНК/СЦРЯб 1/20. Данные соединения в дальнейшем можно рекомендовать к использованию при разработке модульных носителей.

3. Изучение сигнальных пептидов (CDPs)

Нами были получены и исследованы четыре экспериментальных соединения данной группы. В состав двух соединений (short CDP, long CDP) был включен фрагмент последовательности N-конца белка SDF-1 (KPVSLSYR). Выбор сигнального участка был обусловлен данными зарубежных исследователей о роли N-терминального домена в связывании и активации рецептора CXCR4. Кроме того, согласно литературным данным, важную роль в процессах связывания и активации CXCR4 играет мотив RFFESH хемокина SDF-1 (Crump et al., 1997). Дополнительно к сигналу KPVSLSYR, последовательность RFFESH была включена в состав соединения long CDP. Рецептор CXCR4 также способен связываться с вирусным хемокином vMIP-II из вируса саркомы Калоши. Нами было получено соединение с сигнальной последовательностью из этого хемокина (viral CDP). Этот пептид был модифицирован N-терминальной последовательностью, которая ответственна за связывание рецептора. Следует отметить, что данный сигнал был синтезирован из D-аминокислот, что должно было способствовать повышению специфичности связывания с рецептором (Zhou et al., 2002). Для компактизации плазмидной ДНК через линкер к сигнальным последовательностям соединений short CDP, long CDP и viral CDP была присоединена олиголизиновая группа (К8). Ранее Ле Бон с коллегами (Le Bon et al., 2004) подчеркивали значительный вклад ПЭИ и катионных липидов, модифицированных лигандом к рецептору CXCR4, при неспецифической доставке ДНК в CXCR4(+) клетки. Поэтому последовательность К8 была отобрана для минимизации неспецифического влияния ДНК-связывающей части носителя на эффективность трансфекции. В работе по изучению пептидных лигандов к рецептору серпин-белкового комплекса было показано, что эффективность пептидов зависит от отдаленности ДНК-связывающей и сигнальной последовательности (Patel et al., 2001). Поэтому нами дополнительно в состав сигнальных пептидов long CDP, short CDP и viral CDP был

включен разделяющий спейеер из 2 остатков а-аминогексановой кислоты (Ahx). Для анализа процессов проникновения в клетки £-аминогруппу С-концевого лизина модифицировали молекулами биотина. Контрольный пептид (CP), использованный в работе, содержал только олиголизиновую I группу и биотин.

' Оценка специфичности связывания пептидов lone CDP, short CDP, viral CDP и CP с рецептором

CXCR4

Эксперименты по определению специфичности носителей к рецептору CXCR4 проводили на культуре клеток глиобластомы А172 с помощью метода проточной цитофлуорометрии. Рецептор CXCR4 широко представлен на поверхности клеток А172, что подтверждают собственные данные, а j также работы других исследователей (Salmaggi et al, 2004). Способность пептидов связываться с рецептором была продемонстрирована с помощью конкурентного вытеснения моноклональных анти CXCR4 антител 12G5. Количество клеток, связанных с антителами в отсутствие сигнального пептида принималась за 100%.

Показано, что увеличение количества пептида приводило к вытеснению антител с рецептора (рис. 7). Согласно литературным данным, узнавание рецептора хемокином SDF-la происходит на основе зарядового взаимодействия. Положительно заряженный кор хемокина (+8) напрямую участвует в узнавании отрицательно заряженной (-9) внеклеточной части рецептора (Dealwis et al., 1998). Следовательно, пептид CP за счет своего положительного заряда способен взаимодействовать с рецептором и вытеснять антитела. Более эффективное вытеснение продемонстрировано для 5 нмоль пептида long CDP, полученного из хемокина SDF-la. Этот пептид был способен вытеснять антитела до уровня 1,5%. Полученный результат достоверно отличается от эффективности контрольного пептида, лишенного специфического сигнала. Полученный результат свидетельствует в пользу специфических взаимодействий пептида long CDP с рецептором. Способность сигнального пептида, полученного из N-концевой части SDF-1 (аминокислоты 1 ■ 13), вытеснять антитела ранее была показана в работе Хевекера с коллегами (Heveker et al., 1998). Вместе с тем, другие сигнальные пептиды short CDP и viral CDP, как было нами установлено, обладают меньшим сродством к рецептору CXCR4 по сравнению с антителами 12G5.

Анализ внутриклеточного проникновения пептидов lone CDP. short CDP, viral CDP и CP

Для изучения внутриклеточного проникновения пептидов нами были получены коньюгаты пептидов, меченных биотином, и авидин-ФИТЦ. Анализ проводили с помощью метода проточной цитофлуорометрии на клетках А172 (рис. 8). При анализе учитывали только живые клетки. Количество клеток, в которые проникли коньюгаты пептидов и авидин-ФИТЦ, определяли путем построения на гистограмме области, охвагывающей все ФИТЦ(+) живые клетки за исключением клеток, флуоресценция которых вызвана добавлением авидин-ФИТЦ.

После обработки клеток сигнальными пептидами long, short and viral CDP, меченными ФИТЦ, по возрастанию флуоресценции мы наблюдали проникновение пептидов в клетки А172. Пептид long CDP проникал в 65.1% клеток (рис. 8А), short CDP - в 79.2% клеток (рис. 8Б) и viral CDP - в 46.4% клеток (рис. 8В). В тоже время контрольный пептид без сигнала - CP проникал только в 18,5% проанализированных клеток (рис. 8Г). Данный результат доказывает важную роль рецептора CXCR4 для эффективного внутриклеточного проникновения сигнальных пептидов.

S 20 long CDP shorl CDP viral CDP CP о

□ 0.05 нмоль DO.5 нмоль Й2.5 нмоль ■ 5 нмоль

Рис. 7. Конкурентное вытеснение моноклональных анти-СХСИ4 антител 12G5 пептидами long CDP, short CDP, viral CDP и CP на клетках A172. * - p<0,05 no сравнению с контрольным пептидом СР.

long CDP (65.1*8.1%)

111/ Л

short CDP (79.2±1.1%)

ЬШЛ : t,

viral CDP (46.4±0.1 %)

CP (I8.i±4.9%)

Рис. 8.

_ Цитофлуоромет-рический анализ проникновения в клетки AI 72 пептидов long CDP (A), short CDP (Б),

~T« viral CDP (В), CP (Г), меченых ФИТЦ. Серым цветом показан уровень автофлуоресценции после обработки клеток авидином-ФИТЦ.

Изучение трансфекционной активности комплексов ЛНКЛопе СВР, ДНК/short CDP, ДНК/viral CDP, ДНК/CP в экспериментах in vitro Повышенная способность сигнальных пептидов доставлять ДНК в клетки с мембранным рецептором CXCR4 может являться дополнительным подтверждением участия сигнальных последовательностей в процессе внутриклеточного транспорта. Для изучения трансфекционной активности комплексов ДНК с пептидами long CDP, short CDP, viral CDP и CP был проведен ряд экспериментов по трансфекции клеток HeLa комплексами ДНК/носитель при следующих зарядовых соотношениях: 1/3, 1/6, 1/9, 1/12. Низкая эффективность поли - и олиголизинов ранее уже отмечалась

в наших исследованиях, а также другими авторами (Zauner et al., 1997). Поэтому для доставки генетических конструкций с помощью лизин-богатых соединений необходимо присутствие

дополнительного мембранолитического агента. В наших исследованиях был использован глицерин (Zauner et al., 1996).

Трансфекционная активность

комплексов с пептидами long CDP и short CDP, несущими сигнальные последовательности SDF-1, превышала в 10 - 100 раз активность комплексов ДНК/CP. Следует отметить, что эффективность комплексов ДНК с пептидами long CDP и short CDP была сравнима с эффективностью комплексов ДНК/ПЭИ, а в ряде случаев даже превышала ее в 3 раза. Сравнимые результаты эффективности трансфекции комплексов с сигналами из белка SDF-1 и коммерческим носителем ПЭИ позволяют сделать вывод о перспективности использования данных сигнальных пептидов для доставки генетического материала в клетки, на поверхности которых

Рис. 9. Измерение активности люциферазы после трансфещии теток НеЬа комплексами ДНКЛоп$ СОР, ДНКАИоп СОР, ДНШга1 СОР, ДНЮСР в присутствии глицерина. * - р<0,05 по сравнению с эффективностью комплексов ДНК/СР.

присутствует рецептор CXCR4. Максимальный уровень трансфекции был зарегистрирован для комплексов ДНК/long CDP при зарядовом соотношении, равном 1/6, и составил 2457174 RLU/1 мг белка. Эффективность комплексов с вирусным пептидом была выше, чем с контрольным, при более высоких зарядовых соотношениях ДНК/пептид. Полученный результат указывает на специфичность сигнальных последовательностей в процессе доставки генных конструкций в клетку. Кроме того, эффективность комплексов с пептидами long CDP и short CDP выше по сравнению с комплексами ДНК/viral CDP. Различия в эффективности трансфекции можно объяснить природой сигнальной последовательности. Сигнальные последовательности, полученные из белка SDF - это агонисты, которые способны связывать и активировать рецептор с его последующей интернализацией (Heveker et al., 1998). Вирусный пептид viral CDP является антагонистом и способен связывать рецептор без активации (Zhou et al., 2002). Поэтому возможным вариантом проникновения комплексов с данным пептидом в клетку является пассивный эндоцитоз тех комплексов, которые оказались связанными с рецептором CXCR4. При этом известно, что скорость пассивного эндоцитоза ниже скорости активного.

Изучение трансфекиионной активности комплексов ДНК/lone CDP, ДНК/short CDP, ДНК/viral CDP. ДНК/CP в экспериментах in vitro на клетках А172 сравнения

Для

трансфекиионной активности комплексов ДНК/пептид была проведена серия экспериментов по трансфекции клеток

культуры А172 в присутствии глицерина комплексами ДНКЛогщ СВР, ДНКМоП СОР, ДНКМга! СОР, ДНК/СР,

сформированными при следующих зарядовых соотношениях ДНК/пептид: 1/9, 1/12.

Культура клеток А172 является более трудно трансфецируемой по

сравнению с клетками НеЬа

1.0E+Q5

3 1.0Е+05

й 1.0Е+04 - -

f* с 1 .ОЕ+0Э ЧЭ

^ 1.0Е+02 о

о 1.0Е+01 |

** 1.0Е+00

1/12 ВНК ПЭИ

Зарядовые соотношения ДНК/носитель

a long CDP

t; о _i cc 1,0Е+06 --

1 1.0Е+05 --

• 3 -е- £ X » =Г о 1.0Е+04 -

1.0Е+03 --

}> 1.0Е+02 --

ш 1.0Е+01 --

< 1.0Е+00 --

IX,

Рис. 11. Измерение активности гена люциферазы после трансфекции клеток СНО комплексами ДНКЛощ СВР, ДНК/зИоП СОР, ДНКМт! СОР, ДНК/СР в присутствии глицерина.

Рис. 10. Активность гена люциферазы после трансфекции клеток А172 комплексами ДНК/long CDP, ДНК/short CDP, ДНК/viral CDP, ДНК/СР в присутствии глицерина. * - р<0,05 по сравнению с эффективностью комплексов ДНЮ'СР.

(www.aroaxa.com). Поэтому при проведении экспериментов по трансфекции данных клеток мы наблюдали понижение общего уровня трансфекции для комплексов со всеми изученными носителями, включая контрольный ПЭИ. Было показано, что при всех исследуемых соотношениях ДНК/пептид

трансфекционная активность

комплексов ДНК/long CDP, ДНК/short CDP, ДНК/viral CDP достоверно превышала

эффективность комплексов ДНК/СР (рис. 10). Трансфекционная эффективность комплексов

ДНК/long CDP в 11 раз превысила таковую у комплексов ДНЮ'СР при зарядовом соотношении 1/9.

1/9 1/12 ДНК ПЭИ

Зарядовые соотношения ДНК/носитель

BtonoCDP О short CDP □ viral CDP □ CP

Наибольшие отличия по эффективности трансфекции комплексов ДНК/short CDP и ДНК/CP отмечены также при зарядовом соотношении 1/9. Так комплексы ДНК/short CDP оказались эффективнее комплексов ДНК/CP в 32 раза. При этом уровень трансфекционной активности наших комплексов с сигнальными пептидами был сравним с эффективностью комплексов ДНК/ПЭИ. Полученный результат также свидетельствует об участии рецептора CXCR4 в процессе доставки генных конструкций в клетку.

Изучение трансфекционной активности комплексов ДНК/lone CDP. ДНК/short CDP. ДНК/viral

CDP. ДНК/CP в экспериментах in vitro на клетках СИ О Проведена серия экспериментов по трансфекции меток культуры СНО в присутствии глицерина комплексами ДНК/long CDP, ДНК/short CDP, flHK'viral CDP, ДНК/CP, сформированными при зарядовых соотношениях ДНК/пегггид 1/9 и 1/12.

Показано, что сигнальные пептиды long CDP, short CDP, viral CDP доставляли ДНК в 5-50 раз менее эффективно, чем ПЭИ. В тоже время эффективность комплексов ДНК/long CDP, ДНК/short CDP, ДНК/viral CDP была сравнима с эффективностью комплексов ДНК/CP (рис. 11). Таким образом, использованные в нашей работе сигнальные пептиды были неспособны обеспечить высокий уровень трансфекции в клетках, лишенных рецептора CXCR4. В тоже время достоверные отличия в эффективности трансфекции комплексов ДНК с сигнаиьными пептидами и некомпактнзованной ДНК свидетельствует также об участии неспецифического эндоцитоза в процессе доставки ДНК в клетку с помощью данных пептидных носителей.

Комплексы ДНК с сигнальными пептидами long CDP, short CDP и viral CDP, как и ДНК/CP могут проникать в клетку с помощью неспецифического эндощггоза. Вместе с тем, наши данные указывают на важную роль рецептора CXCR4 в процессе доставки ДНК в клетку с помощью сигнальных пептидов. При этом эффективность лигандов, полученных из белка SDF-1, выше по сравнению с вирусным лигандом. Трансфекционная активность комплексов с пептидами long CDP, short CDP в большинстве случаев сравнима и даже превышает эффективность комплексов с коммерческим носителем ПЭИ. Полученные данные позволяют сделать вывод о перспективности использования данных сигнальных пептидов для доставки генетического материала в клетки с рецептором CXCR4. Наиболее эффективным оказался пептид long CDP, который не только способен специфически доставлять ДНК в клетки, но также обладает повышенным сродством к рецептору.

Заключение. Изучение способности комплексов к трансфекции клеток в зависимости от присутствия функциональных групп на поверхности носителя позволяет приблизиться к решению проблемы эффективности транспорта чужеродной ДНК в клетку. Нами установлено, что замещение части терминальных остатков лизина на гистидин в составе гиперразветвленных полилизинов привод! гг к увеличению трансфекционной активности комплексов за счет появления эндосомолитической активности. Нами так же показано, что трансфекционная активность комплексов ДНК с цисггеин-богатыми пептидами в ряде случаен сравнима и даже превышает эффективность комплексов ДНК/ПЭИ. Кроме того, пептиды, полученные из N-концевой части хемокина SDF-1 способны специфически доставлять ДНК в клетки, па поверхности которых представлен рецептор CXCR4. Полученные результаты могут служить основой для создания более сложных и совершенных модульных носителей, способных обеспечивать успешное преодоление внеклеточных и внутриклеточных барьеров и адресную доставку генетических конструкций.

вывода.

1. Замещение части терминальных остатков лизина :в составе гиперразветвленного полилизина на гистидин достоверно (до 20 раз) увеличивает трансфекционную активность его комплексов с ДНК.

2. Тип полимеризации, длина и состав самосшивающихся цистеин-богатых пептидов влияют на эффективность трансфекции комплексов ДНК/носитель.

3. При оптимальных соотношениях токсичность самосшивающихся пептидов вдвое меньше токсичности гиперразветвленных полилизинов.

4. На основе N-концевых фрагментов хемокинов SDF-1 и vMIP-II разработаны пептидные лиганды, обеспечивающие адресную доставку ДНК в клетки с мембранным рецептором CXCR4.

5. Сигнальные пептидные носители специфически связываются с рецептором CXCR4 и проникают в клетки, несущие данный рецептор.

6. Комплексы сигнальных пептидов и ДНК способны избирательно трансфецировать клетки, на поверхности которых представлен рецептор CXCR4.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Киселев А.В., Ильина П.Л., Егорова А.А., Баранов А.Н., Гурьянов И.А., Баянова Н.В., Тарасенко И.И., Лесина Е.А., Власов Г.П., Баранов B.C. Изучение лизиновых дендримеров, как векторов доставки генных конструкций в клетки эукариот // Генетика. 2007. Т.43 (4). Стр. 593-600.

2. Eropona А.А., Киселев А.В., Тарасенко И.И., Ильина П.Л., Панкова Г.А., Ильина И.Е., Баранов B.C., Власов Г.П. Гиперразветвленнные полилизины модифицированные гистидином и аргинином: оптимизация ДНК компактизируюгцих и эндосомолитических свойств // Биоорганическая химия. 2009. Т.35 (4). Стр. 483-492.

3. Egorova A., Kiselev A., Hakli М., Ruponen М., Baranov V., Urtti A. Chemokine derived peptides as carriers for gene delivery to CXCR4 expressing cells // The Journal of Gene Medicine. 2009. V.I 1. P.772-781.

4. Егорова A.A., Киселев A.B., Баранов B.C. Способ направленной доставки ДНК в опухолевые и стволовые клетки. // Заявка на изобретение №2008153051/13, приоритет от 25.12.2008.

5. A. Baranov, A. Kiselev, Е. Lesina, A. Egorova, О. Ostapenko, N. Bajanova, I. Gur'janov, G. Vlasov, V. Baranov. Correlation between structure and transfection properties of new linear and branched peptide vehicles //11th Meeting of the ESGT. Edinburgh, UK. 14-17 November 2003. P.95.

6. Киселев A.B., Лесина E.A., Баранов A.H., Егорова А.А., Баянова Н.В., Власов Г.П., Баранов B.C. Синтез и изучение трансфекциониой активности разветвленных пептидов // III съезд ВОГИС "Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития". Москва, 6-12 июня, 2004. Т.2.С. 11.

7. Е. Lesina, A. Baranov, A. Kiselev, A. Egorova, N. Bayanova, I. Gur'janov, P. Il'ina, I. Dyachkov, G. Vlasov, V. Baranov. Transfection capacities of some novel peptide - based gene delivery systems //The European Human Genetics Conference 2004. Munich, Germany, 12-15 June, 2004. P.I214.

8. A V Kiselev, E A Lesina, A N Baranov, I A Gur'yanov, A A Egorova, P L Il'ina, G P Vlasov, V S Baranov. Gene delivery capacities of asymmetric lysine dendrimers and lipopeptides in vitro // XII Annual Congress of ESGT. 4-7 November, 2004, Tampere, Finland. P.92.

9. P L Il'ina, A A Egorova, I I Tarasenko, A N Baranov, E A Lesina, A V Kiselev, I A Gur'yanov, G P Vlasov, V S Baranov. Investigation of gene delivery with branched polylisine-based carriers // European Journal of Human genetics. 7-10 May, 2005. Prague, Czech Republic. P1404.

10. ЛесинаE.A., Ильина П.Л., Егорова A.A., Баранов А.Н.,Тарасенко И.И., Киселев А.В., Власов Г.П., Баранов B.C. Изучение серии суперразветвленных полилизинов как средств доставки ДНК в клетки эукариот// VI международная конференция "Молекулярная генетика соматических клеток". 12-16 декабря, 2005. Звенигород, Москва. С.77.

11. Kiselev A, H'ina Р, Egorova A, Baranov A, Lesina Е, Tarasenko I, Vlasov G, Baranov V Application of fifth generation lysine dendrimers as gene delivery vehicles // XIII Annual Congress of ESGT. October 29 to November 1, 2005, Prague, Czech Republic. P.158.

12. Egorova A, H'ina P, Kiselev A, Baranov A, Tarasenko I, Vlasov G, Baranov V. Effect of modification with lipophilic fragments and inclusion of endosomolitic peptide on transfection efficiency mediated by lysine dendrimers // 9th Annual Meeting of ASGT. May 31 to June 4, 2006, Baltimore, USA. P.44.

13. H'ina P, Egorova A, Kiselev A, Baranov A, Tarasenko I, Vlasov G, Baranov V. Asymetric lysine dendrimers of fifth generation as DNA-deliveiy vehicles //31st FEBS Congress "Molecules in Health and Disease". 24-29 June, 2006, Istanbul, Turkey.

14. Il'ina P, Egorova A, Kiselev A, Baranov A, Gur'janov I, Tarasenko I, Vlasov G, Baranov V. Characterization of novel lysine-based dendrimers as gene delivery vehicles // BSHG Annual Conference on Human Genetics. 18-20 September, 2006 York, UK. P.5.02.

15. Egorova A., H'ina P., Kiselev A., Aksenova V., Baranov A., Baranov V. Hyperbranched polylysmes and lysine dendrimers as gene delivery vehicles // // XVI Annual Congress of ESGT. 4-7 November, 2006, Athens, Greece. P.63

16. Лесина E.A., Егорова A.A., Ильина П.Л., Тарасенко И.И., Баранов А.Н., Киселев А.В., Гурьянов И.А., Власов Г.П., Баранов B.C. Изучение особенностей доставки генных конструкций с

использованием разветвленных носителей на основе полилизина // Материалы 5 конгресса медицинских генетиков. Часть 2. Медицинская генетика. 2005. Т. 4(5). С. 218-219.

17. A. A. Egorova, А. V. Kiselev, P. L. Il'ina, V. Y. Aksenova, А. N. Baranov, V. S. Baranov. Hyperbranched polylysines as vehicles for gene delivery into eucaryotic cells // Annual Conference of ESHG, 2007. Nice, France, 16-19 June, 2007. P.828.

18. Egorova A., Kiselev A., Baranov A., Baranov V. Development of synthetic peptide-based gene delivery systems targeted to chemokine receptor CXCR4 // Human Gene Therapy. 2007. V. 18 (10). Abstracts of the 15th Annual Congress of the European Society of Gene and Cell Therapy. Rotterdam, The Netherlands, 27-30 October, 2007. P. 1050.

19. Egorova A., Kiselev A., Baranov V., Urtti A. Development of synthetic peptide-based gene delivery systems targeted to chemokine receptor CXCR4 II Abstracts of 7th Conference and Workshop on Biological Barriers and Nanomedicine - Advanced Drug Delivery and Predictive non vivo Testing Technologies. Saarbrücken, Germany, 20-29 February, 2008. P. 19.

20. Egorova A., Kiselev A., Baranov V., Urtti A. Investigation of chemokine derived peptides for targeted gene transfer to CXCR4-expressing cells // Abstracts of 4th International workshop "Nanomedicines: Nanoparticulates for drug deliver)'". Patras, Greece, 11-22 September, 2008. P.10

21. Egorova A., Kiselev A., Baranov V., Urtti A. Chemokine derived peptides for CXCR4-targeted gene delivery // Abstracts of 16th Annual Congress of the European Society of Gene and Cell Therapy. Brugge, Belgium, 13-16 November, 2008. P. 143

22. Kiselev A., Egorova A., Baranov V., Urtti A. Evaluation of cystein-flanked cross-linking peptides as carriers for gene delivery // Abstracts of 16th Annual Congress of the European Society of Gene and Cell Therapy. Brugge, Belgium, 13-16 November, 2008. P. 151.

Подписано в печать «2» октября 2009 г. Формат 60x84/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,3. Тираж 100 экз. Заказ № 657

Типография «Восстания -1» 191036, Санкт-Петербург, Восстания, 1.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Егорова, Анна Алексеевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Генная терапия. Успехи и тенденции развития.

2. Генетические конструкции и способы их доставки.

2.1 Генетические конструкции.

2.2 Способы доставки генетических конструкций.

2.3. Общие требования к носителям генетических конструкций.

3. вне- И В1 1УТРИКЛЕТ0ЧНЫЕ барьеры транспорта генных KOI 1струкций с использованием невирусных носителей.

3.1. Стабильность во внеклеточной среде.

3.2. Проникновение в клетку.

3.3. Выход из эндосом и проникновение в ядро.

4. Невируспые носители.

4.1 Катионные липиды.

4.2. Природные ирекомбинантные белки.

4.3. Полимеры.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ.

1. Материал.

2. Методы.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. Изучение гиперразветвленных i юли-Ь-лизинов (spLLs).

2. Изучение самосшивающихся цистеин-богатых пептидов (CLPs).

3. Изучение сигнальных пептидов (CDPs).

ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Гиперразветвленные iюли-Ь-лизины (SPLLS).

2. Самосшивающиеся цистеин-богатые пептиды (CLPs).

3. Сип 1альные пептиды (CDPs).

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Линейные и разветвленные поли- и олигопептиды на основе лизинга как средства доставки генных конструкций в клетки млекопитающих"

Генная терапия является подходом к лечению наследственных и приобретенных заболеваний с помощью генов и продуктов их экспрессии. Результатом 1енной терапии является нормализация, ослабление или ликвидация патологического процесса, полное или частичное восстановление поврежденных или утраченных функций клеток, тканей, органов и излечение организма. Ориентированность на борьбу с первичными биохимическими дефектами, а не с симгпомами и последствиями заболевания отличает генную терапию от подходов традиционной медицины. Существенно, что при этом в роли лекарственных препаратов выступают молекулы нуклеиновых кислот.

Одной из центральных проблем генной терапии является отсутствие эффективных способов доставки генных конструкций в клетки. Наблюдаемая в большинстве случаев низкая эффективность трансфекции с использованием "незащищенной" ДНК послужила толчком к разработке средств внутриклеточной доставки генетических конструкций. Система доставки должна защищать ДНК от деградации вне - и внутриклеточными ферментами, обеспечивая ее адресную клеточную доставку и транспорт в ядро, кроме того, быть нетоксичной и безопасной в использовании. На сегодняшний день вирус-опосредованный перенос считают наиболее эффективным способом доставки ДНК в клетки млекопитающих in vivo. Однако использование вирусных векторов серьезно ограничено их иммуногенностью. Альтернативным направлением является поиск невирусных носителей, способных повысить эффективность доставки гена "интереса" в клетки.

Перспективным направлением в разработке средств доставки генов является создание невирусных носителей на основе поли- и олигопептидов. Высокомолекулярный полилизин был одним из первых полимеров, использованных для невирусной доставки ДНК в организм (Wu, Wu, 1987; Wu, Wu, 1988). На первых этапах таких рабоч исследователей привлекала биодеградируемость полилизипа и его производных, наличие стандартизованных и недорогих методов синтеза и очистки. Кроме того, важным преимуществом таких носителей была возможность их модификации сигналами для связывания рецепторов, выхода из эндосом и транспорта в ядро (Pouton, Seymour, 2001; Morris et al., 2000).

Одним из направлений модификации высокомолекулярного линейного полилизина явилось создание разветвленных полимеров. Плотность положительного заряда на разветвленной молекуле существенно выше по сравнению с линейным поликатионом. Методом светорассеяния установлено, что форма разветвленного полилизина по сравнению с линейным полилизином приближается к сферической, и в значительной мере напоминает структуру глобулярных белков. Наличие т.н. «гистоновой мимикрии» данной группы соединений предопределило интерес к исследованию их в качестве невирусных средств доставки ДНК (Власов, 2006).

Способность к трансфекции в значительной мере зависит от присутствия на поверхности носителя функциональных групп. Вводя в состав носителя те или иные химические группировки, можно избирательно влиять на эффективность преодоления определенного барьера. Ранее в работах по изучению лизин-гистидинового сополимера была отмечена перспективность такой модификации. За счет выхода комплексов ДНК/носитель из эндосом полученные соединения обеспечивали более эффективную доставку ДНК, чем сам полилизин в присутствии эндосомолитического агента (Midoux, Monsigny, 1999).

Основным недостатком использования таких высокомолекулярных полимеров оказалась их высокая токсичность (Brown et al., 2001). Возможным способом снижения токсичности было уменьшение молекулярного веса. Однако способность низкомолекулярных соединений образовывать комплексы с ДНК, стабильные при физиологических условиях оказалась сниженной. Это явилось предпосылкой к развитию направления, связанного со стабилизацией таких носителей методом перекрестных сшивок (Adami, Rice, 1999). Возможным подходом к образованию перекрестных сшивок между молекулами носителя является его модификация остатками цистеина (McKenzie et al., 2000а). Наличие остатков цистеина обуславливает возможность образования дисульфидиых связей между молекулами. В результате образуется полимер, который в сравнении с низкомолекулярными соединениями способен компактизовать ДНК в стабильные комплексы. При попадании в клетку полимер распадается за счет редукции дисульфидных связей, что снижает его токсичность.

Необходимым требованием при разработке средств доставки ДНК является создание носителей, способных обеспечивать специфичный перенос генных конструкций, путем их модификации лигандами к соответствующим тканеспецифичным рецепторам (Schaffner, Dard, 2003; Kawakami et al., 2004; Park et al., 2006). Для целей генной и клеточной терапии актуальным направлением является создание системы направленного транспорта генов в стволовые и опухолевые клетки. Возможным подходом для направленной доставки генов в эти клетки является модификация носителя лигандом к хемокиповому рецептору CXCR4, который присутствует в более чем 20 видах опухолей и представлен на поверхности некоторых типов стволовых клеток (Juarez et al., 2004).

Вышесказанное и предопределило направление данного исследования, связанного с изучением серии разветвленных аминокислотных носителей с неупорядоченным ветвлением, самосшивающихся цистеин-богатых пептидов и сигнальных пептидов для связывания с рецептором CXCR4 на поверхности клеток.

Цель работы: поиск перспективных невирусных носителей на основе поли- и олиголизина для направленной доставки генных конструкций в клетки млекопитающих.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследование влияния состава носителей на условия образования комплексов с ДНК.

2. Определение влияния состава пептидных носителей на трансфекционную активность их комплексов с ДНК in vitro.

3. Анализ токсических свойств комплексов ДНК с гиперразветвленными и цистеин-богатыми пептидами.

4. Разработка пептидных последовательностей для адресной доставки ДНК в клетки с экспрессией рецептора CXCR4.

5. Изучение особенностей проникновения сигнальных пептидов в клетки экспрессирующие рецептор CXCR4.

6. Изучение особенностей трапсфекции клеток in vitro комплексами сигнальных пептидов и ДНК.

Научная новизна

Впервые были изучены серии оригинальных синтетических поли- и олигопептидов в качестве средств доставки генетических конструкций в клетки. Проанализировано влияние состава и структуры исследованных лизин-богатых носителей на трансфекционную активность комплексов с ДНК in vitro. Впервые были исследованы N-концевые последовательности хемокинов SDF-1 и vMIP-II в качестве лигандов для рецептор-опосредованного переноса генных конструкций в клетки. Продемонстрированы специфичность связывания данных последовательностей с рецептором и направленная доставка ДНК в клетки с экспрессией CXCR4. 9

Практическая значимость

Полученные результаты могут служить основой для создания невирусного модульного носителя, содержащего сигналы для преодоления барьеров внутриклеточного транспорта и адресной доставки генных конструкций в клетки. Разработан вариант пептидного носителя, который может найти применение при разработке генной терапии ряда наследственных и онкологических заболеваний.

Положения, выносимые на защиту

1) Замещение в составе гиперразветвленпого полилизина части терминальных остатков лизина на гистидин увеличивает трансфекционную активность его комплексов с ДНК.

2) Тип полимеризации, длина и состав самосшивающихся цистеин-богатых пептидов влияют на эффективность трансфекции комплексов ДНК/носитель.

3) При оптимальных зарядовых соотношениях самосшивающиеся пептиды менее токсичны, чем гиперразветвленные полилизины.

4) Последовательности N-концевых фрагментов хемокинов SDF-1 и vMIP-II обеспечивают адресную доставку ДНК в клетки с рецептором CXCR4 .

5) Сигнальные пептидные носители связываются с рецептором CXCR4, избирательно проникают и доставляют ДНК в клетки.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 22 работы (3 статьи, 1 заявка на изобретение, 18 тезисов конференций).

Работа выполнена в лаборатории пренатальной диагностики врожденных и наследственных заболеваний человека НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта СЗО РАМН, Россия, и в лаборатории доставки лекарств и нанотехнологии Центра исследования лекарств при фармацевтическом факультете Университета г. Хельсинки, Финляндия.

Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Егорова, Анна Алексеевна

Выводы

1) Замещение части терминальных остатков лизина в составе гиперразветвленного полилизина на гистидин достоверно (до 20 раз) увеличивает трансфекционную активность его комплексов с ДНК.

3) При оптимальных соотношениях токсичность самосшивающихся пептидов вдвое меньше токсичности гиперразветвленных полилизинов.

4) На основе N-концевых фрагментов хемокинов SDF-1 и vMIP-II разработаны пептидные лиганды, обеспечивающие адресную доставку ДНК в клетки с мембранным рецептором CXCR4.

5) Сигнальные пептидные носители специфически связываются с рецептором CXCR4 и проникают в клетки, несущие данный рецептор.

6) Комплексы сигнальных пептидов и ДНК способны избирательно трансфецировать клетки, на поверхности которых представлен рецептор CXCR4.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Егорова, Анна Алексеевна, Санкт-Петербург

1. Власов Г.П. Звездообразные, разветвленные и гиперразветвленные биодеградируемые полимерные системы как носители ДНК // Биоорганическая химия. 2006. - Т.32, №3. -С.227-242.

2. Горбунова В.Н., Баранов B.C. Введение в пренатальную диагностику и генную терапию наследственных болезней. СПб: Интермедика, 1997. - 286с.

3. Остапенко О.В., Бойцов А.С., Баранов А.Н., Лесина Е.А., Михайлов В.М, Баранов B.C. Зависимость эффективности трансфекции мышечных волокон in vivo от условий электропорации // Генетика. 2004. - Т. 40, №1. - С. 41-48.

4. Подобед О.В., Жданов Р.И. Генный перенос с помощью невирусных векторов на основе поликатионов и гидрофобных поликатионов в целях генной терапии // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 1999. -N4. - с. 7-15.

5. Aartsma-Rus A., van Ommen G.J. Antisense-mediated exon skipping: a versatile tool with therapeutic and research applications // RNA. 2007. - v. 13( 10). - P. 1609-24.

6. Adami R.C., Collard W.T., Gupta S.A., Kwok K.Y., Bonadio J., Rice K.G. Stability of peptide-condensed plasmid DNA formulations // J Pharm Sci. 1998. - v.87. - P.678 - 683.

7. Adami R.C., Rice K.G. Metabolic stability of glutaraldehyde cross-linked peptide DNA condensates // J Pharm Sci. 1999. - v.88. - P.739 - 746.

8. Aigner A. Applications of RNA interference: current state and prospects for siRNA-based strategies in vivo // Appl Microbiol Biotechnol. — 2007. — v.76(l). — P.9-21.

9. Aigner A. Gene silencing through RNA interference (RNAi) in vivo: strategies based on the direct application of siRNAs // J Biotechnol. 2006. - v. 124(1). P. 12-25.

10. Akinc A, Thomas M, Klibanov AM, Langer R. Exploring polyethylenimine-mediated DNA transfection and the proton sponge hypothesis // J Gene Med. 2005. - v.7, №5. - P.657-663.

11. Alexeev V., Igoucheva O., Domashenko A., Cotsarelis G., Yoon K. Localized in vivo genotypic and phenotypic correction of the albino mutation in skin by RNA-DNA oligonucleotide // Nat Biotechnol. 2000. - v. 18(1). - P.43-7.

12. Andersen M.S., Sorensen C.B., Bolund L., Jensen T.G. Mechanisms underlying targeted gene correction using chimeric RNA/DNA and single-stranded DNA oligonucleotides // J Mol Med. -2002. v.80( 12). - P.770-81.

13. Anderson W.F., Blaese R.M., Culver K. The ADA human gene therapy clinical protocol: Points to Consider response with clinical protocol // Hum Gene Ther. 1990.- v.l, №3. - P.331-62.

14. Andrieu-Soler C., Halhal M., Boatright J.H., Padove S.A., Nickerson J.M., Stodulkova E., Stewart R.E., Ciavatta V.T., Doat M., Jeanny J.C., de Bizemont Т., Sennlaub F., Courtois Y.,

15. Behar-Cohen F. Single-stranded oligonucleotide-mediated in vivo gene repair in the rdl retina // Mol Vis. 2007. - v. 13. - P.692-706.

16. Aoki K., Furuhata S., Hatanaka K., Maeda M., Remy J.S., Behr J.P., Terada M., Yoshida T. Polyethylenimine-mediated gene transfer into pancreatic tumor dissemination in the murine peritoneal cavity // Gene Ther. 2001. - v.8, №7. - P.508-514.

17. Arima H., Kihara F., Hirayama F., Uekama K. Enhancement of gene expression by polyamidoamine dendrimer conjugates with alpha-, beta-, and gamma-cyclodextrins // Bioconjug Chem. 2001. - v. 12(4). - P.476-84.

18. Aronsohn A.I., Hughes J.A. Nuclear localization signal peptides enhance cationic liposome-mediated gene therapy // J Drug Target. 1998. - v.5(3). - P. 163-9.

19. Bainbridge J.W., Ali R.R. Keeping an eye on clinical trials in 2008 // Gene Ther. 2008. -v.l5(9). — P.633-4.

20. Balicki D., Beutler E. Gene therapy of human disease // Medicine. 2002. - v.81, № 1. - P.69-86.

21. Balicki D., Beutler E. Histone H2A significantly enhances in vitro DNA transfection // Mol. Med. 1997. - v.3. - P.782—787.

22. Baque P., Pierrefite-Carle V., Gavelli A., Brossette N., Benchimol D., Bourgeon A., Staccini P., Saint-Paul M.C., Rossi B. Naked DNA injection for liver metastases treatment in rats // Hepatology. 2002. - v.35(5). - P. 1144-52.

23. Bayele H.K., Sakthivel T, O'Donell M., Pasi K.J., Wilderspin A.F., Lee C.A., Toth I., Florence A.T. Versatile peptide dendrimers for nucleic acid delivery // J Pharm Sci. 2005. -v.94, №2. - P.446-457.

24. Belting M., Sandgren S., Wittrup A. Nuclear delivery of macromolecules: barriers and carriers // Adv Drug Deliv Rev. 2005. - v.57, №4. - P.505-527.

25. Benns J.M., Choi J.S., Mahato R.I., Park J.S., Kim S.W. pH-sensitive cationic polymer gene delivery vehicle: N-Ac-poly(L-histidine)-graft-poly(L-lysine) comb shaped polymer // Bioconjug Chem. 2000. - v. 11, №5. - P.637-645.

26. Bigey P., Bureau M.F., Scherman D. In vivo plasmid DNA electrotransfer // Curr Opin Biotechnol. 2002. - v. 13(5). - P.443-7.

27. Bikram M., Ahn C.-H., Chae S.Y., Lee M., Yockman J.W., Kim S.W. Biodegradable Poly(ethylene glycol)-co-poly(l-lysine)-g-histidine Multiblock Copolymers for Nonviral Gene Delivery // Macromolecules. 2004. - v.37(5). - P. 1903-1916.

28. Bleul C.C., Farzan M., Choe H., Parolin C., Clark-Lewis I., Sodroski J., Springer T.A. The lymphocyte chemoattractant SDF-1 is a ligand for LESTR/fusin and blocks H1V-1 entry // Nature. 1996. - v.382(6594). - P.829-33.

29. Bloomfield V.A. DNA condensation with multivalent cations // Biopolymers. 1997. -v.44(3). - P.269-282.

30. Bloquel C., Fabre E., Bureau M.F., Scherman D. Plasmid DNA electrotransfer for intracellular and secreted proteins expression: new methodological developments and applications // J Gene Med. 2004. - v.6 Suppl 1. - P.S11 -23.

31. Boas U., Heegaard P. Dendrimers in drug research // Chem Soc Rev. — 2004. v.33. - P.43 -63.

32. Borchard G. Chitosans for gene delivery // Adv Drug Deliv Rev. 2001. - v.52, №2. -P.145-150.

33. Bremner K.H., Seymour L.W., Logan A., Read M.L. Factors influencing the ability of nuclear localization sequence peptides to enhance nonviral gene delivery // Bioconjug Chem. -2004. — v.15(1). — P.152-61.

34. Brown M.D., Scha'tzlein A.G., Uchegbu I.F. Gene delivery with synthetic (non viral) carriers // International journal of pharmaceutics. 2001. - v. 229. - P. 1-21.

35. Chan C.K., Jans D.A. Enhancement of polylysine-mediated transferrinfection by nuclear localization sequences: polylysine does not function as a nuclear localization sequence // Hum Gene Ther. 1999. - v. 10(10). - P. 1695-702.

36. Chan C.K., Jans D.A. Using nuclear targeting signals to enhance non-viral gene transfer // Immunol Cell Biol. 2002. - v.80, №2. - P. 119-130.

37. Chen C.P., Kim J.S., Steenblock E., Liu D., Rice K.G. Gene transfer with poly-melittin peptides // Bioconjug Chem. 2006. - v. 17(4). - P. 1057-62.

38. Chen Q.R., Zhang L., Stass S.A., Mixson A.J. Branched co-polymers of histidine and lysine are efficient carriers of plasmids //Nucleic Acids Res. -2001. v.29, №6. - P. 1334-1340.

39. Chia M.C., Shi W., Li J.H., Sanchez O., Strathdee C.A., Huang D., Busson P., Klamut H.J., Liu F.F. A conditionally replicating adenovirus for nasopharyngeal carcinoma gene therapy // Mol Ther. 2004. - v.9(6). - P.804-17.

40. Chiu Y.L., Ali A., Chu C.Y., Cao H., Rana T.M. Visualizing a correlation between siRNA localization, cellular uptake, and RNAi in living cells // Chem Biol. 2004. - v.l 1(8). - P.l165-75.

41. Cho W.Y., Kim J.D., Park K. Polycation gene delivery systems: escape from endosomes to cytosol // JPP. 2003. - v.55. - P.721-734.

42. Choi J.S., Nam K., Park J.Y., Kim J.В., Lee J.K., Park J.S. Enhanced transfection efficiency of РАМАМ dendrimer by surface modification with L-arginine // J Control Release. 2004. -v.99(3). - P.445-56.

43. Choi Y.I L, Liu F., Choi JS., Kim S.W., Park J.S. Characterization of a targeted gene carrier, lactose-polyethylene glycol-grafted poly-L-lysine and its complex with plasmid DNA // Hum Gene Ther. 1999. - v. 10, №16. - P.2657-2665.

44. Collas P., Alestrom P. Nuclear localization signal of SV40 T antigen directs import of plasmid DNA into sea urchin male pronuclei in vitro // Mol Reprod Dev. 1996. - v.45(4). -P.431-8.

45. Conner S.D., Schmid S.L. Regulated portals of entry into the cell // Nature. 2003. - v.422, №6927. - P.37-44.

46. Dang J.M., Leong K.W. Natural polymers for gene delivery and tissue engineering // Advanced Drug Delivery Reviews. 2006. - v.58. - P.487-499.

47. Dankewalter R.G., Kolc J. and Lukasavage W.J. Macromolecular Highly Branched Homogeneous Compound Based on Lysine Units // U.S. Patent 4 289 872, September 15, 1981.

48. Dean D.A. Import of plasmid DNA into the nucleus is sequence specific // Exp Cell Res. -1997. v.230, №2. - P.293-302.

49. Diaz-Font A., Cormand В., Chabas A., Vilageliu L., Grinberg D. Unsuccessful chimeraplast strategy for the correction of a mutation causing Gaucher disease // Blood Cells Mol Dis. 2003. — v.31(2). — P.183-6.

50. Dorsett Y., Tuschl T. siRNAs: applications in functional genomics and potential as therapeutics // Nat Rev Drug Discov. 2004. - v.3(4). - P.318-29.

51. Doudna J.A., Cech T.R., Sullenger B.A. Selection of an RNA molecule that mimics a major autoantigenic epitope of human insulin receptor // Proc Natl Acad Sci USA.- 1995. v.92(6). -P.2355-9.

52. Drapkin P.T., O'Riordan C.R., Yi S.M., Chiorini J.A., Cardella J., Zabner J., Welsh M.J. Targeting the urokinase plasminogen activator receptor enhances gene transfer to human airway epithelia // J Clin Invest. 2000. - v. 105(5). - P.589-96.

53. Drew J., Martin L. What is gene therapy? in "Understanding gene therapy" edited by N.R. Lemoine.-UK:BIOS scientific publishers, 1999.- 172p.

54. Driessen W.H., Fujii N., Tamamura H., Sullivan S.M. Development of peptide-targeted lipoplexes to CXCR4-expressing rat glioma cells and rat proliferating endothelial cells // Mol Ther. 2008. - v. 16(3). - P.516-24.

55. Dufes С., Keith W.N., Bilsland A., Proutski I., Uchegbu I.F., Schatzlein A.G. Synthetic anticancer gene medicine exploits intrinsic antitumor activity of cationic vector to cure established tumors // Cancer Res. 2005(6). - v.65(18). - P.8079-84.

56. Dufes C., Uchegbu I.F., Schatzlein A.G. Dendrimers in gene delivery // Adv Drug Deliv Rev. 2005(a). - v.57, № 15. - P.2177-2202.

57. Duncan A., Hadlaczky G. Chromosomal engineering // Curr Opin Biotechnol. 2007. -v. 18(5). — P.420-4.

58. Dunlap D.D., Maggi A., Soria M.R., Monaco L. Nanoscopic structure of DNA condensed for gene delivery //Nucleic Acids Res. 1997. - v.25, №15. - P.3095-3101.

59. Edelstein M.L., Abedi M.R., Wixon J. Gene therapy clinical trials worldwide to 2007—an update // J Gene Med. 2007. - v.9(10). - P.833-42.

60. Edelstein M.L., Abedi M.R., Wixon J., Edelstein R.M. Gene therapy clinical trials worldwide 1989-2004 an overview // J Gene Med. - 2004. - V.6. - P.597-602.

61. Elouahabi A., Ruysschaert J.M. Formation and intracellular trafficking of lipoplexes and polyplexes // Mol Ther. 2005. - v.l 1(3). - P.336-47.

62. Eom K.D., Park S.M., Tran H.D., Kim M.S., Yu R.N., Yoo H. Dendritic a,s-Poly(L-lysine)s as Delivery Agents for Antisense Oligonucleotides // Pharmaceutical Research. — 2007. — v.24(8). -P. 1581-9.

63. Escriou V., Carriere M., Scherman D., Wils P. NLS bioconjugates for targeting therapeutic genes to the nucleus // Adv Drug Deliv Rev. 2003. - v.55(2). - P.295-306.

64. Esfand R., Tomalia D.A. Poly(amidoamine) (РАМАМ) dendrimers: from biomimicry to drug delivery and biomedical applications // Drug Discov Today.- 2001. v.6, №8. - P.427-436.

65. Essner J.J., Mclvor R.S., Hackett P.B. Awakening gene therapy with Sleeping Beauty transposons // Curr Opin Pharmacol. 2005. - v.5(5). - P.513-9.

66. Evans C.H., Gouze E., Gouze J.-N., Robbins P.D., Ghivizzani S.C. Gene therapeutic approaches—transfer in vivo // Adv Drug Deliv Rev. 2006. - v.58, Issue 2. - P.243-258.

67. Feigner P.L., Gadek T.R., Holm M., Roman R., Chan H.W., Wenz M., Northrop J.P., Ringold M., Danielsen M. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure // Proc Natl Acad Sci USA. 1987. - v.84, №21. - P.7413-7417.

68. Fernandez-Carneado J., Kogan M.J., Pujals S., Giralt E. Amphipathic peptides and drug delivery // Biopolymers. 2004. - v.76, №2. - P. 196-203.

69. Fichou Y., Ferec C. The potential of oligonucleotides for therapeutic applications // Trends Biotechnol. 2006. - v.24( 12). - P.563-70.

70. Fischer D., Li Y., Ahlemeyer В., Krieglstein J., Kissel T. In vitro cytotoxicity testing of polycations: influence of polymer structure on cell viability and hemolysis // Biomaterials. — 2003.-v.24(7).-P. 1121-31.

71. Futaki S. Oligoarginine vectors for intracellular delivery: design and cellular-uptake mechanisms // Biopolymers. 2006. - v.84, №3. - P.241-249.

72. Gao X., Kim K.S, Liu D. Nonviral gene delivery: what we know and what is next // AAPS J. 2007. - v.9( 1). - P.E92-104.

73. Gardlic R., Palffy R., Hodosy J., Turna J., Celec P. Vectors and delivery systems in gene therapy // Med Sci Monit. 2005. - v. 11, №4. - P. 110-121.

74. Gariepy J., Kawamura K. Vectorial delivery of macromolecules into cells using peptide-based vehicles.// Trends Biotechnol. 2001. - v. 19( 1). - P.21 -8.

75. Godbey W.T., Wu K.K., Mikos A.G. Size matters: molecular weight affects the efficiency of poly(ethylenimine) as a gene delivery vehicle // J Biomed Mater Res. 1999. - v.45, №3. - P.268-275.

76. Gosselin M.A. , Guo W., Lee R.J. Efficient gene transfer using reversibly cross-linked low molecular weight polyethylenimine // Bioconjug. Chem. 2001. - v.12. - P.989-994.

77. Gottschalk S., Sparrow J.T., Hauer J., Mims M.P., Leland F.E., Woo S.L.C., Smith L.C. A novel DNA-peptide complex for efficient gene transfer and expression in mammalian cells // Gene therapy. 1996. -v.3.- P.448-457.

78. Graham 1R, Dickson G. Gene repair and mutagenesis mediated by chimeric RNA-DNA oligonucleotides: chimeraplasty for gene therapy and conversion of single nucleotide polymorphisms (SNPs)// Biochim Biophys Acta. 2002. - v. 1587(1). - P. 1-6.

79. Grosse S., Aron Y., Thevenot G., Francois D., Monsigny M., Fajac I. Potocytosis and cellular exit of complexes as cellular pathways for gene delivery by polycations // J Gene Med. 2005. -v.7, №10. - P.1275-1286.

80. Hackett P.B., Ekker S.C., Largaespada D.A., Mclvor R.S. Sleeping Beauty Transposon-Mediated Gene Therapy for Prolonged Expression // Non-Viral Vectors for Gene Therapy, 2nd Edition. Leaf Huang, Ernest Wagner and Mien-Chie Hung, eds., 2004. - 52p

81. Haensler J., Szoka F.C. Jr. Polyamidoamine cascade polymers mediate efficient transfection of cells in culture // Bioconjug Chem. 1993. — v.4(5). - P.372-9.

82. Haider H.K., Elmadbouh I., Jean-Baptiste M., Ashraf M. Nonviral1 vector gene modification of stem cells for myocardial repair// Mol Med. -2008. v. 14(1-2). - P.79-86.

83. Haider M., Ghandehari H. Influence of poly(aminoacid) composition on the complexation of plasmid DNA and transfection efficiency // Journal of bioactive and compatible polymers. -2003. — v.18. P.93-111.

84. Hart S.L., Collins L., Gustafsson K., Fabre J.W. Integrin-mediated transfection with peptides containing arginine-glycine-aspartic acid domains // Gene Ther. — 1997. v.4. - P. 1225 - 1230.

85. Heemskerk H., Aguilera В., Janson A., Pang K.H., van Ommen G.-J., van Deutekom J., Aartsma-Rus A. Muscle binding peptides found by phage display as delivery agent for antisense oligonucleotides // J Control Release. 2008. - v. 132(3). - P.E3-E5

86. Herweijer H., Wolff J.A. Progress and prospects: naked DNA gene transfer and therapy // Gene therapy. 2003.- v. 10, №6.- P.453-458.

87. Heveker N., Montes M., Germeroth L., Amara A., Trautmann A., Alizon M., Schneider-Mergener J. Dissociation of the signalling and antiviral properties of SDF-1-derived small peptides // Curr Biol. 1998. - v.8(7). - P.369-76.

88. Hudde Т., Rayner S.A., Comer R.M., Weber M., Isaacs J.D., Waldmann H., Larkin D.F., George A.J. Activated polyamidoamine dendrimers, a non-viral vector for gene transfer to the corneal endothelium // Gene Ther. 1999. - v.6, №5. - P.939-943.

89. Hwang D.S., Kim K.R., Lim S., Choi Y.S., Cha H.J. Recombinant mussel adhesive protein as a gene delivery material // Biotechnol Bioeng. 2009. - v. 102(2). - P.616-23.

90. Ivies Z., Hackett P.B., Plasterk R.H., Izsvak Z. Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tcl-like transposon from fish, and its transposition in human cells // Cell. — 1997. — v.91(4).-P.501-10.

91. Juarez J., Bendall L., Bradstock K. Chemokines and their receptors as therapeutic targets: the role of the SDF-1/CXCR4 axis // Curr Pharm Des. 2004. - v. 10(11). - P. 1245-59.

92. Kabanov V.A., Zezin А.В., Rogacheva V.B., Gulyaeva Z.G., Zansochova M.F., Joosten J.G.H., Brackman J. Interaction of Astramol Poly(propyleneimine) Dendrimers with Linear Polyanions // Macromolecules. 1999. - v.32(6). - P. 1904-1909.

93. Kang H.C., Kim S., Lee M., Bae Y.H. Polymeric gene carrier for insulin secreting cells: poly(L-lysine)-g-sulfonylurea for receptor mediated transfection // J Control Release. — 2005. — v. 105, №1-2.-P. 164-176.

94. Kaouass M, Beaulieu R, Balicki D. Histonefection: Novel and potent non-viral gene delivery // J Control Rel. 2006. - v. 113. - P.245-254.

95. Katoh M., Ayabe F., Norikane S., Okada Т., Masumoto H., Horike S., Shirayoshi Y., Oshimura M. Construction of a novel human artificial chromosome,vector for gene delivery // Biochem Biophys Res Commun. 2004. - v.321(2). - P.280-90.

96. Kawabata K., Takakura Y., Hashida M. The. fate of plasmid DNA after intravenous injection in mice: involvement of scavenger receptors in its hepatic uptake // Pharm Res. — 1995. — v.12(6). — P.825-30.

97. Kean Т., Roth S., Thanou M. Trimethylated chitosans as non-viral gene delivery vectors: cytotoxicity and transfection efficiency // J Control Release. 2005. - v. 103(3). - P.643-53.

98. Khachigian L.M. DNAzymes as molecular agents that manipulate Egr-1 gene expression // Biochem Pharmacol. 2004. - v.68(6). - P. 1023-5.

99. Khalil I.A., Kogure K., Akita H., Harashima H. Uptake Pathways and Subsequent Intracellular Trafficking in Nonviral Gene Delivery // Pharmacol Rev. 2006. - v.58. - P.32—45.

100. Kiang Т., Wen J., Lim H.W., Leong K.W. The effect of the degree of chitosan deacetylation on the efficiency of gene transfection // Biomaterials. 2004. - v.25(22). — P.5293-301.

101. Kichler A., Leborgne C., Marz J., Danos O., Bechinger B. Histidine-rich amphipathic peptide antibiotics promote efficient delivery of DNA into mammalian cells // Proc Natl Acad Sci U S A.-2003. v. 100(4). - P. 1564-8.

102. Kichler A., Mason A.J., Bechinger B. Cationic amphipathic histidine-rich peptides for gene delivery // Biochim Biophys Acta. 2006. - v. 1758(3). - P.301-7.

103. Kim T.I., Baek J.U., Zhe Bai C., Park J.S. Arginine-conjugated polypropylenimine dendrimer as a non-toxic and efficient gene delivery carrier // Biomaterials. — 2007(6). -v.28(l 1). — P.2061-7.

104. Kircheis R., Wagner E. Polycation/DNA complexes for in vivo gene delivery // Gene therapy and regulation. 2000. - v.l, №1. - P.95-114.

105. Kootstra N.A., Verma l.M. Gene therapy with viral vectors // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2003.-v.43.- P.413-439.

106. Kopatz 1., Remy J.S., Behr J.P. A model for non-viral gene delivery: through syndecan adhesion molecules and powered by actin // J Gene Med. 2004. - v.6. - P.769-776.

107. Kren B.T., Bandyopadhyay P., Steer C.J. In vivo site-directed mutagenesis of the factor IX gene by chimeric RNA/DNA oligonucleotides // Nat Med. 1998. - v.4(3). - P.285-90.

108. Kumar R., Dammai V., Yadava P.K., Kleinau S. Gene targeting by ribozyme against TNF-alpha mRNA inhibits autoimmune arthritis // Gene Ther. 2005. - v. 12(20). - P. 1486-93.

109. Lechardeur D, Verkman AS, Lukacs GL. Intracellular routing of plasmid DNA during non-viral gene transfer// Adv Drug Deliv Rev. 2005. - v.57, №5. - P.755-767.

110. Lechardeur D., Lukacs G.L. Intracellular barriers to non-viral gene transfer // Curr Gene Ther. 2002. - v.2, №2. - P. 183-194.

111. Lee K.Y. Chitosan and Its Derivatives for Gene Delivery // Macromolecular Research. — 2007.- v. 15(3).-P. 195-201.

112. Lee Y., Mo H., Koo H., Park J.Y., Cho M.Y., Jin G.W., Park J.S. Visualization of the degradation of a disulfide polymer, linear poly(ethylenimine sulfide), for gene delivery // Bioconjug Chem. 2007. - v. 18( 1). - P. 13-8.

113. Lemkine G.F., Goula D., Becker N., Paleari L., Levi G., Demeneix B.A. Optimisation of polyethylenimine-based gene delivery to mouse brain // J Drug Target. 1999. - v.7, № 4. -P.305-312.

114. Li S., Ma Z. Nonviral gene therapy//Current gene therapy. 2001. - v.l. - P.201-226.

115. Li S., Tseng W.C., Stolz D.B., Wu S.P., Watkins S.C., Huang L. Dynamic changes in the characteristics of cationic lipidic vectors after exposure to mouse serum: implications for intravenous lipofection//Gene Ther. 1999.- v.6, №4. - P.585-594.

116. Li S.D., Huang L. Non-viral is superior to viral gene delivery // J Control Release. 2007. — v. 123(3). — P. 181-3.

117. Li W., Szoka F.C. Jr. Lipid-based nanoparticles for nucleic acid delivery // Pharm Res. -2007. — v.24(3). — P.438-49.

118. Liang Z.X., Yoon Y.H., Votaw J., Goodman M.M., Williams L., Shim H. Silencing of CXCR4 blocks breast cancer metastasis // Cancer Res. 2005. - v.65. - P.967-971.

119. Liu G, Li D, Pasumarthy MK, Kowalczyk TH, Gedeon CR, Hyatt SL, Payne JM, Milleri

120. TJ, Brunovskis P, Fink TL, Muhammad O, Moen RC, Hanson RW, Cooper MJ. Nanoparticles of compacted DNA transfect postmitotic cells // J Biol Chem. 2003(6). - v.278, №35.- P.32578-32586.

121. Liu L., Mah C., Fletcher B.S. Sustained FVIII expression and phenotypic correction of hemophilia A in neonatal mice using an endothelial-targeted sleeping beauty transposon // Mol Ther. 2006. - v. 13(5). - P. 1006-15.

122. Liu X., Tian P.K., Ju D.W., Zhang M.H., Yao M., Cao X.T., Gu J.R. Systemic genetic transfer of p21WAF-l and GM-CSF utilizing of a novel oligopeptide-based EGF receptor targeting polyplex // Cancer Gene Ther. 2003(a). - v. 10, № 7. - P.529-39.

123. Liu Z., Li M., Cui D., Fei J. Macro-branched cell-penetrating peptide design for gene delivery // J Control Release. -2005. v. 102(3). - P.699-710.

124. Lochmann D., Jauk E., Zimmer A. Drug delivery of oligonucleotides by peptides // Eur J Pharm Biopharm. 2004. - v.58, №2. - P.237-251.

125. Lowe D.B., Shearer M.H., Kennedy R.C. DNA vaccines: Successes and limitations in cancer and infectious disease // Journal of Cellular Biochemistry. 2006. - v.98, Issue 2. - P.235 -242.

126. Lu D.R, Zhou J.M., Zheng В., Qiu X.F., Xue J.L., Wang J.M., Meng P.L., Han F.L., Ming B.H., Wang X.P., et al. Stage I clinical trial of gene therapy for hemophilia В // Sci China В.-1993.- v.36(l 1). P. 1342-51.

127. Lukacs G.L., Haggie P., Seksek O., Lechardeur D., Freedman N., Vcrkman A.S. Size-dependent DNA mobility in cytoplasm and nucleus // J Biol Chem. 2000. -v.275. - P. 16251629.

128. Lundstrom K. Latest development in viral vectors for gene therapy // Trends Biotechnol. — 2003. — v.21(3). — P. 117-22.

129. Lungwitz U., Breunig M., Blunk Т., Gopferich A. Polyethylenimine-based non-viral gene delivery systems // Eur J of Pharm Biopharm. 2005. - v.60. - P.247-266.

130. Luten J., van Nostrum C.F., De Smedt S.C., Hennink W.E. Biodegradable polymers as non-viral carriers for plasmid DNA delivery // J Control Release. 2008. - v. 126(2). - P.97-110.

131. Manickam D.S., Bisht H.S., Wan L., Mao G., Oupicky D. Influence of TAT-peptide polymerization on properties and transfection activity of TAT/DNA polyplexes // J Control Release. 2005. - v. 102( 1). - P.293-306.

132. Manickam D.S., Oupicky D: Multiblock reducible copolypeptides containing histidine-rich and nuclear localization sequences for gene delivery // Bioconjug Chem. 2006. — v. 17(6). — P.1395-403.

133. Mann A., Thakur G., Shukla V., Ganguli M. Peptides in DNA delivery: current insights and future directions // Drug Discovery Today. 2008. - v. 13, № 3-4. - P. 152-60.

134. Martin M.E., Rice K.G. Peptide-guided Gene Delivery // The AAPS Journal. 2007. -v.9(l). - P.E18-29.

135. Mason A.J., Leborgne С., Moulay G., Martinez A., Danos O., Bechinger В., Kichler A. Optimising histidine rich peptides for efficient DNA delivery in the presence of serum // J Control Release. 2007. - v. 118(1). - P.95-104.

136. McKenzie D.L., Collard W.T., Rice K.G. Comparative gene transfer efficiency of low molecular weight polylysine DNA-condensing peptides // J Pept Res. 1999. - v.54. - P.311 -318.

137. McKenzie D.L., Kwok K.Y., Rice K.G. A potent new class of reductively activated peptide gene delivery agents // J Biol Chem. 2000(a). - v.275. - P.9970 - 9977.

138. McKenzie D.L., Smiley E., Kwok K.Y., Rice K.G. Low Molecular Weight Disulfide Cross-Linking Peptides as Nonviral Gene Delivery Carriers // Bioconjugate Chem. — 2000(6). — v.lL-P.901-909.

139. Meade B.R., Dowdy S.F. Enhancing the cellular uptake of siRNA duplexes following noncovalent packaging with protein transduction domain peptides // Adv Drug Deliv Rev. -2008. v.60(4-5). P.530-6.

140. Medina-Kauwe L.K., Xie J., Hamm-Alvarez S. Intracellular trafficking of nonviral vectors // Gene Ther. 2005. - v. 12, №24. - P. 1734-1751.

141. Mehier-Humbert S., Guy R.H. Physical methods for gene transfer: improving the kinetics of gene delivery into cells // Adv Drug Deliv Rev. 2005. - v.57, №5. - P.733-753.

142. Mercatante D.R., Mohler J.L., Kole R. Cellular response to an antisense-mediated shift of Bcl-x pre-mRNA splicing and antineoplastic agents // J Biol Chem. 2002. - v.277(51). -P.49374-82.

143. Midoux P., Monsigny M. Efficient gene transfer by histidylated polylysine/pDNA complexes // Bioconjug Chem. 1999. - v. 10, №3. - P.406-411.

144. Miller DL, Song J. Tumor growth reduction and DNA transfer by cavitation-enhanced high-intensity focused ultrasound in vivo // Ultrasound Med Biol. 2003. - v.29(6). - P.887-93.

145. Mintzer M:A., Simanek E.E. Nonviral vectors for gene delivery // Chem Rev. 2009. -v. 109(2).-P.259-302.

146. Mislick K.A., Baldeschwieler J.D., Kayyem J.F., Meade T.J. Transfection of folate-polylysine DNA complexes: evidence for lysosomal delivery // Bioconjug Chem. 1995. - v.6, №5.-P512-515.

147. Mitchell D.J., Kim D.T., Steinman L., Fathman C.G., Rothbard J.B. Polyarginine enters cells more efficiently than other polycationic homopolymers // J Pept Res. 2000. - v.56, №5. -P.318-325.

148. Moffatt S., Wiehle S., Cristiano R.J. Tumor-specific gene delivery mediated by a novel peptide-polyethylenimine-DNA polyplex targeting aminopeptidase N/CD13 // Hum Gene Ther. -2005. — v.16(1). — P.57-67.

149. Мок H., Park T.G. Self-crosslinked and reducible fusogenic peptides for intracellular delivery of siRNA // Biopolymers. -2008. v.89(10). - P.881-8.

150. Montier Т., Benvegnu Т., Jaffres P.-A., Yaouanc J.-J., Lehn P. Progress in Cationic Lipid-Mediated Gene Transfection: A Series of Bio-Inspired Lipids as an Example // Current Gene Therapy. 2008. - v.8. - P.296-312.

151. Montini E., Held P.K., Noll M., Morcinek N., Al-Dhalimy M., Finegold M., Yant S.R., Kay M.A., Grompe M. In vivo correction of murine tyrosinemia type I by DNA-mediated transposition // Mol Ther. 2002. - v.6(6). - P.759-69.

152. Morgan D.M., Larvin V.L., Pearson J.D. Biochemical characterisation of polycation-induced cytotoxicity to human vascular endothelial cells // J Cell Sci. 1989. - v.94 ( Pt 3). -P.553-9.

153. Morris К.V., Chan S.W., Jacobsen S.E., Looney D.J. Small interfering RNA-induced transcriptional gene silencing in human cells // Science. 2004. - v.305(5688). - P. 1289-92.

154. Morris M., Vidal P., Chaloin L., Heitz F., Divita G. A new peptide vector for efficient delivery of oligonucleotides into mammalian cells // Nucleic Acids Research 1997. - v.25(14).- P.2730—2736.

155. Morris M.C., Chaloin L., Heitz F., Divita G. Translocating peptides and proteins and their use for gene delivery // Curr Opin Biotechnol. 2000. - v. 11. - P.461 -466.

156. Mounkes L.C., Zhong W., Cipres-Palacin G., Heath T. D., Debs R. J. Proteoglycans mediate cationic liposome-DNA complex-based gene delivery in vitro and in vivo // J. Biol. Chem. 1998. - v.273. - P.26164-26170.

157. Mountain A. Gene therapy: the first decade//Trends Biotechnol. 2000.-v. 18. - P.119-128.

158. Mousazadeh M., Palizban A., Salehi R., Salehi M. Gene delivery to brain cells with apoprotein E derived peptide conjugated to polylysine (apoEdp-PLL) // J Drug Target. 2007. -v. 15(3). — P.226-30.

159. Neu M., Fischer D., Kissel T. Recent advances in rational gene transfer vector design based on poly(ethylene imine) and its derivatives // J Gene Med. 2005. - v.7(8). - P.992-1009.

160. Newman C.M., Bettinger T. Gene therapy progress and prospects: ultrasound for gene transfer // Gene Ther. 2007. - v. 14(6). - P.465-75.

161. Niidome Т., Huang L. Gene therapy progress and prospects: nonviral vectors // Gene therapy. 2002. - v.9. - P. 1647-1652.

162. Nir S., Nicol F., Szoka F.C. Jr. Surface aggregation and membrane penetration by peptides: relation to pore formation and fusion // Mol Membr Biol. 1999. - v. 16, №1. - P.95-101.

163. Ohsaki M., Okuda Т., Wada A., Hirayama Т., Niidome Т., Aoyagi H. In vitro gene transfection using dendritic poly(L-lysine) // Bioconjug Chem. 2002. - v.13, №3. - P.510-517.

164. Okuda Т., Kawakami S., Akimoto N., Niidome Т., Yamashita F., Hashida M. PEGylated lysine dendrimers for tumor-selective targeting after intravenous injection in tumor-bearing mice // Journal of Controlled Release. 2006(6). - v. 116. - P.330-336.

165. Okuda Т., Kawakami S., Maeie Т., Niidome Т., Yamashita F., Hashida M. Biodistribution characteristics of amino acid dendrimers and their PEGylated derivatives after intravenous administration // J Control Release. 2006(a). - v. 114, № 1. - P.69-77.

166. Okuda Т., Sugiyama A., Niidome Т., Aoyagi H. Characters of dendritic poly(L-lysine) analogues with the terminal lysines replaced with arginines and histidines as gene carriers in vitro // Biomaterials. 2004. - v.25. - P.537-544.

167. Ostergaard H., Tachibana C., Winther J.R. Monitoring disulfide bond formation in the eukaryotic cytosol//J Cell Biol. -2004. -v. 166(3). -P.337-45.

168. Oupicky D., Parker A.L., Seymour L.W. Laterally Stabilized Complexes of DNA with Linear Reducible Polycations: Strategy for Triggered Intracellular Activation of DNA Delivery Vectors // J. Am. Chem. Soc. 2002. - v. 124, №.1. - P.8-9.

169. Pack D.W., Hoffman A.S., Pun S., Stayton P.S. Design and development of polymers for gene delivery // Nature. 2005. - v.4. - P.581-593.

170. Park I.-K., Lasiene J., Chou S.-H., Horner P.J., Pun S.H. Neuron-specific delivery of nucleic acids mediated by Tetl -modified poly(ethylenimine) // J'Gene Med. 2007. - v.9. -P.691-702.

171. Park T.G., Jeong J.H., Kim S.W. Current status.of polymeric gene delivery systems // Adv Drug Deliv Rev. 2006. - v.58, №4. - P.467-486.

172. Partridge T.A. Models of dystrophinopathy, pathological mechanisms and assessment of therapies // Cambridge University Press. — 1997. 310-324p.

173. Patel S., Zhang X., Collins L., Fabre J.W. A small, synthetic peptide for gene delivery via the serpin-enzyme complex receptor// J Gene Med. -2001. — v.3. — P.271-279.

174. Patil S.D., Rhodes D.G., Burgess D.J. DNA-based therapeutics and DNA delivery systems: a comprehensive review // AAPS J. 2005. - v.7( 1). - P.E61 -77.

175. Perales J.C., Ferkol Т., Beegen H., Ratnoff O.D.,R.W. Flanson. Gene transfer in vivo: sustained expression and regulation of genes introduced into the liver by receptor-targeted uptake // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994. - v.91. - P .4086-4090.

176. Pichon C, Goncalves C, Midoux P. Histidine-rich peptides and polymers for nucleic acids delivery // Adv Drug Deliv Rev. 2001'. - v.53, №1.- P.75-94.

177. Pierce E.A., Liu Q., Igoucheva O., Omarrudin R., Ma H., Diamond S.L., Yoon, K. Oligonucleotide-directed single-base DNA alterations in mouse embryonic stem cells // Gene Ther. 2003. - v. 10(1). - P.24-33.

178. Pollard H., Remy J.S., Loussouarn G., Demolombe S., Behr J.P., Escande D. Polyethylenimine but not cationic lipids promotes transgene delivery to the nucleus in mammalian cells // J Biol Chem. 1998. - v.273(13). - P.7507-11.

179. Pouton C.W., Seymour L.W. Key issues in non-viral gene delivery // Adv Drug Deliv Rev. 2001. - v.46, № 1 -3. - P.187-203.

180. Puebla I., Esseghir S., Mortlock A., Brown A., Crisanti A., Low W. A recombinant HI histone-based system for efficient delivery of nucleic acids // J. Biotechnol. 2003. - v. 105. -P.215-226.

181. Quinonez R., Sutton R.E. Lentiviral vectors for gene delivery into cells // DNA Cell Biol. -2002. v. 21. - P. 937-51.

182. Rahbek U.L., Howard K.A., Oupicky D., Manickam D.S., Dong M., Nielsen A.F., Hansen T.B., Besenbacher F., Kjems J. Intracellular siRNA and precursor miRNA trafficking using bioresponsive copolypeptides // J Gene Med. -2008. v. 10(1). - P.81-93.

183. Rando ТА, Disatnik MH, Zhou LZ. Rescue of dystrophin expression in mdx mouse muscle by RNA/DNA oligonucleotides.//Proc Natl Acad Sci USA. 2000. V.97(10).P.5363-8.

184. Rayburn E.R., Zhang R. Antisense, RNAi, and gene silencing strategies for therapy: mission possible or impossible? // Drug Discov Today. -2008. v. 13(11-12). - P.513-21.

185. Read M.L., Bremner K.H., Oupicky D., Green N.K., Searle P.F., Seymour L.W. Vectors based on reducible polycations facilitate intracellular release of nucleic acids // J Gene Med. — 2003. v.5(3). - P.232-45.

186. Remy-Kristensen A., Clamme J.P., Vuilleumier C., Kuhry J.G., Mely Y. Role of endocytosis in the transfection of L929 fibroblasts by polyethylenimine/DNA complexes // Biochim Biophys Acta. 2001. - v. 1514, №1. - P.21-32.

187. Richardson P.D., Augustin L.B., Kren B.T., Steer C.J. Gene repair and transposon-mediated gene therapy // Stem Cells. 2002. - v.20(2). - P. 105-18.

188. Rittner K., Benavente A., Bompard-Sorlet A., Heitz F., Divita G., Brasseur R., Jacobs E. New basic membrane-destabilizing peptides for plasmid-based gene delivery in vitro and in vivo // Mol Ther. 2002. - v.5, №2. - P. 104-114.

189. Rolland A. Nuclear gene delivery: the Trojan horse approach // Expert Opin Drug Deliv. -2006.-v.3, №1. P. 1-10.

190. Romano G., Micheli P., Pacilio C., Giordano A. Latest development in Gene transfer technology: achievements, perspectives, and controversies over therapeutic applications // Stem cells.-2000.-V. 18.-P. 19-39.

191. Romano G., Pacilio C., Giordano A. Gene transfer technology in Therapy: Current aplications and future goals // Stem cells. 1999. - v.17. - P.191-202.

192. Ruponen M., Honkakoski P., Tammi M., Urtti A. Cell-surface glycosaminoglycans inhibit cation-mediated gene transfer // J Gene Med. 2004. - v.6(4). - P.405-14.

193. Satkauskas S., Bureau M.F., Mahfoudi A., Mir L.M. Slow accumulation of plasmid in muscle cells: supporting evidence for a mechanism, of DNA uptake by receptor-mediated endocytosis // Mol Ther. -2001. v.4(4). - P.317-23.

194. Scanlon K.J. Anti-genes: siRNA, ribozymes and antisense // Curr Pharm Biotechnol. -2004. -v.5(5).-P.415-20.

195. Schaffer D.V., Lauffenburger D.A. Targeted synthetic gene delivery vectors // Curr Opin Mol Ther. 2000. - v.2. - P. 155-61.

196. Schaffner P., Dard M;M. Structure and function of RGD peptides involved in bone biology // Cell Mol Life Sci. 2003. - v.60, №1. - P. 119-132.

197. Schmidt-Wolf G.D., Schmidt-Wolf I.G. Non-viral and hybrid vectors in human gene therapy: an update // Trends Mol Med. 2003. - v.9, №2. - P.67-72.

198. Schnitzer J.E., Oh P., Albondin-mediated capillary permeability to albumin // J. Biol. Chem. 1994. - v. 269. - P.6072-6082.

199. Sebestyen M.G., Ludtke J.J., Bassik M.C., Zhang G., Budker V., Lukhtanov E.A., Hagstrom J.E., Wolff J.A. DNA vector chemistry: the covalent attachment of signal peptides to plasmid DNA //Nat Biotechnol. 1998. - v. 16(1). - P.80-5.

200. Sergeeva A., Kolonin M.G., Molldrem J.J., Pasqualini R., Arap W. Display technologies: application for the discovery of drug and gene delivery agents // Adv Drug Deliv Rev. 2006. -v.58(15).-P. 1622-54.

201. Shah D.S., Sakthivel Т., Toth I., Florence A.T., Wilderspin A.F. DNA transfection and transfected cell' viability using amphipathic asymmetric dendrimers // lnt J Pharm. 2000. -v.208, № 1 -2. - P.41 -48.

202. Simeoni F., Morris M.C., Heitz F., Divita G. Insight into the mechanism of the peptide-based gene delivery system MPG: implications for delivery of siRNA into mammalian cells // Nucleic Acids Res. 2003. — v.31(l 1). - P.2717-24.

203. Simoes S., Slepushkin V., Pires P., Gaspar R., de Lima M.P., Duzgunes N. Mechanisms of gene transfer mediated by lipoplexes associated with targeting ligands or pH-sensitive peptides //Gene ther. 1999. - v.6. - P. 1798-1807.

204. Simovic D., Isner J.M., Ropper A.H., Pieczek A., Weinberg D.H. Improvement in chronic ischemic neuropathy after intramuscular phVEGF165 gene transfer in patients with critical limb ischemia // Arch Neurol. 2001. - v.58(5). - P.761 -8.

205. Sloots A., Wels W.S. Recombinant derivatives of.the human high-mobility group protein HMGB2 mediate efficient nonviral gene delivery // FEBS J. 2005. - v.272(16). - P.4221-36.

206. Smith L.C., Duguid J., Wadhwa M.S., Logan M.J., Tung C., Edwards V.V., Sparrow J.T. Synthetic peptide-based DNA complexes for nonviral gene delivery // Adv Drug Deliv Rev. — 1998,-v.30,№ 1-3. P. 115-131.

207. Sosnowski B.A., Gonzalez A.M., Chandler L.A., Buechler. Y.J., Pierce G.F., Baird A. Targeting DNA to cells with basic fibroblast growth factor (FGF2) '// J Biol Chem. 1996. -v.271, №52. - P.33647-33653.

208. Stark G.R., Kerr I.M., Williams B.R., Silverman R.H., Schreiber R.D. How cells respond to interferons // Annu Rev Biochem. 1998. - v.67. - P.227-64.

209. Stevenson M., Ramos-Perez V., Singh S., Soliman M., Preece J.A., Briggs S.S., Read M.L., Seymour L.W. Delivery of siRNA mediated by histidine-containing reducible polycations // J Control Release. 2008. - v. 130(1). - P.46-56.

210. Stewart K.M., Horton K.L., Kelley S.O. Cell-penetrating peptides as delivery vehicles for biology and medicine // Org. Biomol. Chem. 2008. - v.6. - P.2242-2255.

211. Suh J., Wirtz D., Hanes J. Efficient active transport of gene nanocarriers to the cell nucleus // Proc Natl Acad Sci USA. 2003. - v. 100. - P.3878-38821

212. Takei K, Haucke V. Clathrin-mediated endocytosis: membrane factors pull the trigger // Trends Cell Biol. 2001. - v. 11 (9). - P.385-91.

213. Takeuchi Т., Kosuge M., Tadokoro A., Sugiura Y., Nishi M., Kawata M., Sakai N., Matile S., Futaki S. Direct and rapid cytosolic delivery using cell-penetrating peptides mediated by pyrenebutyrate // ACS Chem Biol. 2006. - v. 1 (5). - P.299-303.

214. Tang MX, Redemann CT, Szoka FC Jr. In vitro gene delivery by degraded polyamidoamine dendrimers // Bioconjug Chem. 1996. - v.7, №6. - P.703-714.

215. Torchilin V.P. Tat peptide-mediated intracellular delivery of pharmaceutical nanocarriers // Advanced Drug Delivery Reviews. 2008. - v.60. - P.548-558.

216. Tranchant I., Thompson В., Nicolazzi C., Mignet N., Scherman D;. Physicochemical optimisation of plasmid delivery by cationic lipids // J Gene Med. 2004. - Suppl 1. - P.S24-35.

217. Trentin D., Hubbell J., Hall H. Non-viral gene delivery for local and controlled DNA release // J Control Release. 2005. - v. 102(1). - P.263-75.

218. Tung Ch-H., Mueller S., Weissleder R. Novel branching membrane translocational peptide as gene delivery vector // Bioorganic and medicinal chemistry. 2002. - v. 10. - P.3609-3614.

219. Veldhoen S., Laufer S.D., Restle T. Recent Developments in Peptide-Based Nucleic Acid Delivery // Int. J. Mol. Sci. -2008. v.9. - P. 1276-1320.

220. Verma I.M., Weitzman M.D. Gene therapy: twenty-first century medicine // Annu Rev Biochem. 2005. - v.74. - P.711 -38.

221. Vives E., Schmidt J., Pelegrin A. Cell-penetrating and cell-targeting peptides in drug delivery // Biochim Biophys Acta. -2008. v. 1786(2). - P.126-38.

222. Wadhwa M.S., Collard W.T., Adami R.C., McKenzie D.L., Rice K.G. Peptide-mediated gene delivery: influence of peptide structure on gene expression // Bioconjug Chem. 1997. -v.8, №1. P.81-88.

223. Wagner E., Zenke M., Cotton M., Beug H., Birnstiel M.L. Transferrin-polycation conjugates as carriers for DNA uptake into cells // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1990. - v.87(9). -P.3410-3414.

224. Walther W., Stein U. Viral vectors for gene transfer: a review of their use in the treatment of human disease // Drugs. 2000. - v.60. - P.249-271.

225. Wang S., Joshi S., Lu S. Delivery of DNA to skin by particle bombardment // Methods Mol Biol. 2004. - v.245. - P. 185-96.

226. Wells D.J. Gene therapy progress and prospects: electroporation and other physical methods // Gene Ther. 2004. - v. 11 (18). - P. 1363-9.

227. Wiethoff C.M., Middaugh C.R. Barriers to nonviral gene delivery // J Pharm Sci. 2003. - v.92, №2. - P.203-217.

228. Wilson J.M., Grossman M., Raper S.E., Baker J.R. Jr., Newton R.S., Thoene J.G. Ex vivo gene therapy of familial hypercholesterolemia // Hum Gene Ther. 1992. - v.3(2). - P. 179-222.

229. Wolff J.A., Malone R.W., Williams P., Chong W., Acsadi G., Jani A., Feigner P.L. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo//Science. 1990. - v. 247. - P.1465-1468.

230. Wong S.Y., Pelet J.M., Putnam D. Polymer systems for gene delivery—Past, present, and future // Prog. Polym. Sci. 2007. - v.32. - P.799-837.

231. Wood K.C., Azarin S.M., Arap W., Pasqualini R., Langer R., Hammond P.T. Tumor-targeted gene delivery using molecularly engineered hybrid polymers functionalized with a tumor-homing peptide // Bioconjug Chem. 2008. - v. 19(2). - P.403-5.

232. Wu С. H., Walton С. M., Wu G. Targeted inhibition of type I procollagen synthesis by antisense DNA oligonucleotides//Gene therapy and regulation. 2000.- v.l, N2.- P. 193-205.

233. Wu C., Lo S.L., Boulaire J., Hong M.L., Beh H.M., Leung D.S., Wang S. A peptide-based carrier for intracellular delivery of proteins into malignant glial cells in vitro // J Control Release.-2008.-v.l 30(2).-P. 140-5.

234. Wu C.H., Sapozhnikov E., Wu G.Y. Evaluation of multicomponent non-viral vectors for liver directed gene delivery // Journal of drug targerting. 2002,- v. 10, №2. - P. 105-111.

235. Wu G.Y., Wu C.H. Receptor-mediated gene delivery and expression in vivo // J Biol Chem. 1988. - v.263, №29. - p. 14621-14624.

236. Wyman T.B., Nicol F., Zelphati O., Scaria P.V., Plank C., Szoka F.C. Jr. Design, synthesis, and characterization of a cationic peptide that binds to nucleic acids and permeabilizes bilayers // Biochemistry. 1997. - v.36(10). - P.3008-17.

237. Xavier J., Singh S., Dean D.A., Rao N.M., Gopal V. Designed multi-domain protein as a carrier of nucleic acids into cells // J Control Release. 2009. - v. 133(2). - P. 154-60.

238. Xu Y., Szoka F.C. Jr. Mechanism of DNA release from cationic liposome/DNA complexes used in cell transfection // Biochemistry. 1996. - v.35, №18. - P.5616-5623.

239. Yamagata M., Kawano Т., Shiba K., Mori Т., Katayamaa Y., Niidome T. Structural advantage of dendritic poly(L-lysine) for gene delivery into cells // Bioorganic & Medicinal Chemistry. 2007. - v. 15. - P.526-532.

240. Yew N.S., Scheule R.K. Toxicity of cationic lipid-DNA complexes // Adv Genet. 2005. -v.53.- P. 189-214.

241. Yoon K, Cole-Strauss A, Kmiec EB. Targeted gene correction of episomal DNA in mammalian cells mediated by a chimeric RNA.DNA oligonucleotide.//Proc Natl Acad Sci USA.- 1996. v.93(5). - P.2071-6.

242. Young J. L., Zimmer W. E., Dean D. A. Smooth Muscle-Specific Gene Delivery in the Vasculature Based on Restriction of DNA Nuclear Import// Experimental Biology and Medicine.- 2008. v.233. - P.840-848.

243. Young L.S., Searle P.F., Onion D., Mautner V. Viral gene therapy strategies: from basic science to clinical application // J Pathol. 2006. - v.208(2). - P.299-318.

244. Zabner J., Couture L.A., Gregory R.J., Graham S.M., Smith A.E., Welsh M.J. Adenovirus-mediated gene transfer transiently corrects the chloride transport defect in nasal epithelia of patients with cystic fibrosis // Cell. 1993. - v.75(2). - P.207-16.

245. Zanta M.A., Belguise-Valladier P., Behr J.P. Gene delivery: a single nuclear localization signal peptide is sufficient to carry DNA to the cell nucleus // Proc Natl Acad Sci USA.- 1999.v.96(l). — P.91-6.

246. Zauner W., Kichler A., Schmidt W., Sinski A., Wagner E. Glycerol enhancement of ligand-polylysine/DNA transfection // Biotechniques. 1996. - v.20, №5. - P.905-913.

247. Zauner W., Wagner E., Ogris M. Polylysine-based transfection systems utilizing receptor-mediated delivery // Adv Drug Deliv Rev. 1998. - v.30, №1-3. - P.97-113.

248. Zeng J., Too H.P., Ma Y., Luo E.S., Wang S. A synthetic peptide containing loop 4 of nerve growth factor for targeted gene delivery // J Gene Med. 2004. - v.6(11). - P. 1247-56.

249. Zhang G, Gao X, Song YK, Vollmer R, Stolz DB, Gasiorowski JZ, Dean DA, Liu D. Hydroporation as the mechanism of hydrodynamic delivery // Gene Ther. 2004. - v.l 1, №8. -P.675-682.

250. Zhang G., Budker V., Williams P., Subbotin V., Wolff J.A. Efficient expression of naked DNA delivered intraarterially to limb muscles of nonhuman primates // Human gene therapy. -2001.-v. 12, N4.- P .427-438.

251. Zhang X., Godbey W.T. Viral vectors for gene delivery in tissue engineering // Adv Drug Deliv Rev. 2006. - v.58(4). - P.515-34.

252. Zinselmeyer B.H., Mackay S.P., Schatzlein A.G., Uchegbu l.F. The lower-generation polypropylenimine dendrimers are effective gene-transfer agents // Pharm Res. 2002. - v. 19(7).- P.960-7.

253. Zuhorn I.S., Kalicharan R., Hoekstra D. Lipoplex-mediated transfection of mammalian cells occurs through the cholesterol-dependent clathrin-mediated pathway of endocytosis // J Biol Chem. 2002. - v.277. - P. 18021-28.

Информация о работе

Егорова, Анна Алексеевна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2009
ВАК 03.00.15

Диссертация

Линейные и разветвленные поли- и олигопептиды на основе лизинга как средства доставки генных конструкций в клетки млекопитающих - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Линейные и разветвленные поли- и олигопептиды на основе лизинга как средства доставки генных конструкций в клетки млекопитающих - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы