Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ленгмюровские пленки оксидаз на основе амфифильных полиэлектролитов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Ленгмюровские пленки оксидаз на основе амфифильных полиэлектролитов"

3 Г К П Л ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР Г| Ь и/1 МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ

На правах рукописи УДК 577.3

БАРМИН Анатолий Вадимович

ЛЕНГМЮРОВСКИЕ ПЛЕНКИ ОКСИДАЗ НА ОСНОВЕ АМФИФИЛЬНЫХ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТОВ

03.00.04 — биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1994

Работа выполнена в департаменте физико-химической биологии Всероссийского Научного Центра Молекулярной Диагностики и Лечения (ВНЦМДЛ).

Научный руководитель — кандидат химических наук И. Н. Курочкин

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор А. Д. Рябов; доктор биологических наук П. Г. Свешников

Ведущая организация: Институт биохимии им. А. Н. Баха РАН.

Защита состоится ' 3 ^екл^^я 1994 г в /7 часов на заседании Специализированного Совета при Всероссийском Научном Центре Молекулярной Диагностики и Лечения по адресу: 113149, Москва, Симферопольский бульвар, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского Научного Центра Молекулярной Диагностики и Лечения.

Автореферат разослан 3 ноХ^Я 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета,

кандидат биологических наук В. В. Отраднова

А

ОЕЩДЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Интерес к мономолекулярным пленкам белков, получаемых с помощью ленгмюровской технологии, в последние годы непрерывно растет. Это связано, в первую очередь, с развитием биоэлектроники и биосенсорного приборостроения, где исключительно важную роль играют "напотехнологии", позволяющие воспроизводимо получать структуры, размеры которых соизмеримы с размерами молекул и молекулярных агрегатов. Создание стабильных наноструктур га биологических макромолекул с сохраненными функциональными свойствами - задача сложная и требует детальной проработки. Она затрагивает как теоретические, так и практические аспекта • применения ленгмюровской технологии. Можно ожидать, что свойства ферментов в ленгмгоровских пленках будут значительно отличаться от их характеристик, полученных В растворах или же При традиционных способах иммобилизации. С практической точки зрения одним из перспективных направлений использования ленгмюровской технологии является * иммобилизация биологически активных веществ при создании биосенсоров. Ленгмюровская технология формирования мокомолйкулярных слоев позволяет на несколько порядков снизить расход биологически активных и вспомогательных компонентов, обеспечивает при этом хорошую воспроизводимость при серийном изготовлении детектирующих элементов, высокую чувствительность, точность и быстроту анализа (несколько секунд). Благодаря этому она получает в последнее время все большее признание в биосенсорном приборостроении.

Формирование мономолекулярных пленок непосредственно из ферментов, антител и других белков часто приводит к потере их функциональной активности, кроме того, при перенесении таких монослоев на твердые поверхности наблюдается их разрушение. В случае использования лишвдов, многоатомных спиртов и их й производных ферментативная активность сохраняется, но в водных растворах имеет место быстрай диссоциация ферментов с таких матриц.

Одним го перспективны* направлений решения этих проблем является использование о ленгмюровской технологии амфифильных полиэлектролитов.

Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в исследовании ферментативной кинетики оксидаз в ленгмгоровских пленках, полученных с помощью амфифильных полиэлектролитов, на примере

глюкшооксидазы и моноаминоксидазы. При Этом были поставлены следующие зал"

1) И; процесс формирования ленгмюровских пленок глюкгоооксида, моноаминоксидазы с помощью амфифильных пол юл ein рол итов;

2) Исследовать кинетические характеристики получаемых таким образом ферментных электродов и гаучить зависимость биохимических свойств- иммобилизованных ферментов от физико-химических свойств амфифильных нолиэлектролитов;

3) Исследовать процесс формирования двухкомпонентных ленгмюровских пленок на основе амфифильных полюлектролятоа, состоящих из производных ферроцена и глюкшооксидазы, проанализировать электрохимическую и ферментативную активность получаемых бифункциональных пленок.

Научная новизна исследования. В данной работе предлагается новый метод формирования ЛБ-пленок биологически активных веществ на основе новых амфифильных полиэлектролитов. Впервые показана возможность иммобилизации в таких пленках ферментов глюкшооксидазы и моноаминоксидазы а также производных ферроцена с сохранением их каталитических и электрономедиаторных свойств. Показана возможность направленного изменения кинетических свойств ферментов в ленгмюровских пленках амфифильных полиэлектролитов.

Практическая значимость исследования. Результаты исследования могут служить основой для создания новых чувствительных биосенсоров.

Апробация работы: Основные результаты работы доложены на международной конференции "Biosensors'92" 20-22 мая 1992 г., Женева (Швейцария), на симпозиуме "Biosensorics in Central and Eastern Europe" 2223 марта 1993 г, Бохум (ФРГ), «а СНГ-германской рабочей встрече "Biosensors" 4-6 ноября 1993 г, Мюнстер (ФРГ) и на российско-германской научной школе "ßiosensing Materials" 7-13 июля 1994 г., Пущино (Россия).

Публикации. Но теме диссертации опубликовано 6 научных работ в отечественных н зарубежных изданиях.

Структура и сС-ьсм работы. Диссертационная работа состоит ш введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 118 страницах машинописного текста и включает 8 таблиц и 20 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Ленгмюровские пленки глюкозооксидазы

Для выяснения роли амфифильных полиэлектролитов (АПЭ) в проявлении ферментативной активности сформированного методом Лепгмюра-Шефера мономолекулярного слоя глюкозооксидазы было проведено сравнение активностей глюкозооксидазы в мембранах, на которых1 иммобилизация фермента проводилась без АПЭ, с помощью сополимера (9:1) лаурилметакриловой и метакриловой кислот (ЛМК/ММК) и с помощью разветвленного, алкилированного в 12 % звеньев лаурилбромидом полиэтиленимина (ПЭИ-12разв). Результаты измерения активности в этих случаях приведены на рис. 1. Как видно из этого рисунка, на мембранах, покрытых мономолекулярной пленкой глюкозооксидазы без полиэлектролита, активность фермента практически отсутствовала. Активность глюкозооксидазы в пленках, сформированных на основе ЛМК/ММК, была относительно низкой. Наилучшие результаты были получены при использовании в качестве полиэлектролита ПЭИ-12разв. Пленки глюкозооксидазы, полученные с исполкзованием ПЭИ-12разв были взяты для последующего анализа кинетических свойств иммобилизованного фермента.

Начальная скорость, мкМ/с

Рис. 1. Начальная скорость реакции (у0), катализируемой ГОД в ленгмюровских пленках, полученных без полиэлектролита (а), с ЛМК/ММК (б) и с ПЭЙ-12разв (в). Концентрация глюкоты 10 мМ.

На рис. 2 представлены р-А-изотермы фермента (кривая а), ПЭИ-12разв (кривая б) и их комплекса (кривая в), образующегося на границе

раздела фаз. Как видно из этого рисунка, глкжозооксидаза в чистом виде образует лишь сильно разряженные ленгмгаровские пленки. Эго объясняется ее сильной гидрофилыюстью ("водорастворимый фермент"). Амфифильный полиэтилешшин, напротив, образует плотные ленгмюровские пленки и способствует адсорбции ГОД из водной субфазы. Результирующая изотерма не является однако простым суммированием изотерм фермента и пол »электролита. При исходных низких: значениях поверхностного давления полиэлектролита {правая часть рисунка) адсорбция фермента ведет к значительному увеличению давления. По мере сжатия поверхностного слоя (левая часть рисунка) давление на изотерме белок-полиэлектролитного комплекса. становится меньше давления, на изотерме чистого полиэлектролита. Эго позволяет предложить следующую модель взаимодействия полиЭлектролита и фермента. На первом этапе за счет электростатических и гидрофобных взаимодействий происходит концентрирование фермента в поверхностном слое. Па поверхности образуется Сел ок-п о л гол ектрол итньш комплекс. На этой стадии в поверхностном слое кроме этого комплекса присутствуют и собственно молекулы фермента. В процессе сжатия состав поверхностного слоя изменяется." гидрофильные молекулы фермента вытесняются в раствор и на поверхности остается только истинный белок-полиэлектролитный комплекс, поверхностное давление которого за счет гидрофильное™ фермента ■ меньше давления чистого полиэлектролита.

Давление, мН/ч

Рис. 2. р-А-изотермы ГОД (а), ПЭИ-12разв (б) и их комплекса (в). (Площадь поверхности не

нормирована на звено цепи полиэлсктролита или молекулу фермента из-за неопределенности количественного состава комплекса.).

Для выявления максимальной степени эффективного заполнения поверхности полипропиленовых мембран ферментом был проведен сравнительный анализ его активности в однослойных и многослойных пленках, полученных путем последовательного нанесения различного числа мономолекулярных слоев (рис. 3).

Как показывают полученные данные, трехслойные пленки демонстрируют в 13 раза большую активность фермента, чем однослойные. Большее число слоев не увеличивало достоверно проявляемой ферментативной активности. Это указывает на достижение максимальной степени заполнения мембраны активной формой глгокозооксидазы при последовательном нанесении трех монослоев фермента.

Начальная скорость, мкМ/с »г

И ■

Количество слоев

Анализ изменений кинетически характеристик многослойных мономолекулярных пленок глюкагаоксидазы, полученных методом Ленгмюра-Шефера, был проведен с помощью двух методов оценки кинетических констант фермента по глюкозе и кислороду. Используя зависимость начальной скорости ферментативной реакции от концентрации глюкозы, была расчитана эффективная константа Михаэлиса по этому субстрату, а методом анализа интегральной кинетической кривой убыли кислорода - "истинные" константы Михаэлиса как по глюкозе, так и по кислороду. Для получения значений "истинных" констант Михаэлиса анализ интегральной кинетической кривой проводился при разных концентрациях глюкозы.

12

Рис. 3. Начальная скорость реакции (у0), катализируемой ГОД, в зависимости от числа мономолекулярных слоев фермента. Концентрация глюкозы 20 мМ.

о

Для подтверждения корректности оценки биохимических параметров была проверена степень влияния на измеряемый процесс эффектов внешней и внутренней диффузии, которые характеризуются соответственно числом Дамкохлера и модулем Тиле. Проведенная оценка этих параметров показала, что их значения значительно меньше единицы, то есть диффузионные ограничения в системе измерения практически отсутствуют. Кроме того, чтобы убедиться в том, что полиэлектролнтно-белковый спой на мембране сам по себе не влияет на транспорт О2 к электроду и не искажает тем самым получаемые кинетические параметры, были измерены активности растворенной глшкшоокеидазы с использованием мембраны, на которую с соблюдением обычных условий были нанесены 4 слоя индифферентного белка БСА с помощью анкетированного полиэтиленимина. При этом, однако, не произошло достоверного изменения измеряемых констант, что свидетельствует о том, что полимер-белковые пленки не препятствуют транспорту О2 через мембрану.

На рис. 4 представлены полученные нами экспериментальные данные зависимости скорости реакции от концентрации глюкозы для растворенной (кривая а) и иммобилизованной (кривая б) форм фермента.

Начальная скорость, мкН/с

20

б

Flic. 4. Начальная скорость изменения концентраций кислорода (v0) для ферментативной реакции, катализируемой растворенной (а)' и иммобилизованной (б) ГОД при различной концентрации глюкозы.

Qi.

о

20 40 00 00 ¡00 120 Концентраций глюкозы, мМ

Найденные истинные константы Михаэлиса по глюкозе и кислороду приведены в таблице 1. Расчеты, проведенные с помощью нелинейной регрессии присели к практически таким же результатам.

Таблица 1

Измеренные значения констант Михаэлиса для растворенной и иммобилизованной в мономолекулярных пленках глюкозооксндазы

Константы Михаэлиса

Глюкозооксидаза По глюкозе По кислороду

К(3, мМ К0х, мкМ

Растворенная 30,5 ± 1,0 350 1 40

Иммобилизованная 8,2 ±0,3 7,8 ±

Как видно из полученных данных, в результате формирования мономолекулярных пленок глюкозооксндазы произошло достоверное уменьшение констант Михаэлиса фермента по соотетствующим субстратам. Этот факт отличается от многочисленных данных по иммобилизации глюкозооксндазы традиционными способами (заключение фермента в гель, ковалентная пришивка глутаровым альдегидом, адсорбция), при которых наблюдается обычно увеличение констант Михаэлиса или же их сохранение на прежнем уровне, и является важной особенностью предлагаемых пленок, позволяющей направленно изменять кинетические параметры ферментов.

Оценка важных для биосенсорного конструирования аналитических возможностей электрода со сформированной на его поверхности многослойной пленкой глюказооксидазы показал, что минимальная концентрация глюкозы, определяемая с' его помощью, составляет при оптимальных условиях 1 мМ конечной концентрации в ячейке, т.е. чувствительность такого электрода не уступает ранее созданным моделям. Линейная зависимость для растворенной и иммобилизованной глюказооксидазы наблюдалась в диапазоне 1-10 мМ глюкозы.

Воспроизводимость данных, получаемых для растворенной формы глюказооксидазы, составляла ± 5%, а для иммобилизованной - ± 15%. Пленки выдерживали без потери активности не менее 100 поэторных измерений величины концентрации глюкозы. Активность мембран иммобилизованной глюкозооксндазы через. 2 мес. хранения в воздушной среде при комнатной температуре составляла 100%, а через 3 мес. - 50% от первоначальной. В то же время при постоянном нахождении мембран в буферном растворе активность снижалась вдвое уже через неделю.

Таким образом, использованая в данной работе новая технология нанесения ГОД на твердую поверхность показывает возможность изменять кинетические характеристики фермента, повышая в частности его аффинность по отношению к субстратам. Взаимодействие фермента с полиэлектролитом ведет к образованию на границе раздела фаз белок-полимерного комплекса с новыми физико-химическими и каталитическими свойствами. Последующее сжатие и перенесение этого комплекса на твердые поверхности обеспечивает сохранение и стабилизацию высокой ферметгтативной активности.

2. Ленгмюровские пленки моноаминоксидазы

В опытах по формированию ленгмюрозских пленох МАО было обнаружено увеличение концентрации фермента в поверхностном слое как в присутствии, так и в отсутствие лолиэлехтролитов. При перенесении образующихся пленок на полипропиленовую мембрану ферментативная активность сохраняется. Сравнительный анализ величины этой активности в зависимости от числа переносимых слоев показал достижение максимальной эффективной степени заполнения мембраны ферментом при последовательном нанесении шести монослоев фермента. Поэтому далее использовались шестислойные образцы.

Для выявления влияния природы амфифильных полиэлектролитов на ферментативную активность МАО в ленгмюровских пленках была изучена зависимость начальных скоростей реакции от концентраций тирамина при нанесении МАО без АПЭ и с 5 различными полиэлеетролитами: ПЭИ-]2разв; полютиленимином линейным, алкилированном в 70 % звеньев лаурилбромидом (ПЭИ-70лин); полютиленимином разветвленным, алкилированном в 70 % звеньев лаурилбромидом (ПЭИ-70разв); полиэтилешшином линейным, алкилированном в 35 % звеньев лаурилбромидом (ПЭИ-35лин) и с поли-4-вишшпиридинием, алкилированным в 90 % звеньев лаурилбромидом (ПВП). Результаты этих измерений представлены на рис. 5.

Как видно из этого рисунка, все использованные полиалектролиты, кроме ЛЭИ-12разв, увеличивают в разной степени активность иммобилизованного на них фермента при сохранении кинетической модели Михаэлиса-Меитен. При использовании ПЭИ-12разб наблюдается картина аллостерического ингибирования избытком субстрата. Для количественного сравнения характеристик фермента в ЛБ-пленках амфифильных пол-.олектролитов была проведена оценка кинетических параметров

методом нелинейной регрессии. В случае ПЭИ-12разз для этого была использована модель образования тройного неактивного комплекса SES (ингибирование субстратом). Для остальных кривых расчет производился по обычной модели Михаэлиса-Ментен. Полученные таким образом кинетические константы представлены я табл. 2.

Рис. 5. Скорость

ферментативной реакции при разной концентрации субстрата для различных способов иммобилизации МАО: а - без полиэлектролита, б - с ПЭИ-12разв, в - с ПЭИ-70лин, г - с ПЭИ-70разв, д - с ПЭИ-35лин, е - с ПВП.

а «оо 400 «оо еоо юоа иоо

Концентрация тирамина, мкМ Таблица 2

Эффективные кинетические константы иммобилизованной моноаминооксидазы при формировании мономолекулярных пленок с различными полимерами

Тип vm. Код. мкМ Vm/KM,

АПЭ мхМ/мин по тирамину • МИН"1

без АПЭ 7,8 ±0,2 15,2 ±2,4 04

ПЭИ-12разв 12,0 ± 36,0 ± 12,0 03

ПЭИ-70лин 16,1 ±0,7 60,0 ± 5,3 од

ПЭИ-70разв 17,8 ± 0^ 55,0 ± 5,8 03

ПЭИ-35лин 20,6 ± 2,1 774 ±2,1 ОД

ПВП 24,4 ± 1,4 893 -18,6 ОД

Истинная концентрация фермента на мембране была недоступна для определения, поэтому в качестве критерия для сравнения различных

Начальная скорость, мкМ/мин

ферментных пленок мы рассматривали величины Ут (максимальная скорость реакции), а также применяемую в таких случаях величину отношения наблюдаемой максимальной скорости к эффективной константе Михаэлиса - Уш/Км-

Анализируя эти данные можно выделить четыре существенных момента:

1. Величина кажущейся константы Михаэлиса для фермента, иммобилизованного без полиэлектролитов, значительно меньше величины К}^, определенной для МАО в растворе (70 мкМ).

2. Минимальное значение константы Михаэлиса и максимальное отношение "Ущ/Кэд наблюдается при иммобилизации моноаминоксидазы без полиэлектролитов. При иммобилизации фермента с помощью амфифильных полюлектролитов величина К^ увеличивается по сравнению с МАО, иммобилизованной без них, за счет чего в целом имеет место уменьшение отношения Ут/Км. Однако, при использовании ПЭИ-12разв эффективная величина Кдд тем не менее остается почти в два раза меньше чем Км для МАО в растворе.

3. При нанесении фермента со всеми пшмолектршштами, кроме ПЭИ-12рззв, наблюдается увеличение максимальной скорости (рис. 5, кривые в-е; табл. 2), наиболее выраженное при использовании поли-4-винилпиридиния (рис. 5, кривая е; табл. 2). Это свидетельствует об увеличении концентрации фермента в пленках при использовании полюлектролитов.

4. При использовании в качестве амфифилыюго полиэлектролита Г1ЭИ-12разв (рис. 5, кривая б) наблюдается резкое отклонение от кинетики Михаэдиса-Мснтена, связанное с инглбированием субстратом.

В этой связи следует отмстить, что ранее в литературе описывалось субстратное ингибирование МАО серотонином при изменении, в частности, агрегатного состояния фермента или в присутствии определенного количества лшшдов, в связи с чем было высказано предположение о возможности аллоетерической регуляции МАО серотонином, но не тирамином. В данной работа впервые наблюдается появление аллоетерической регуляции активности МАО тирамином. Объяснение этому феномену может быть найдено ю рассмотрения рис. 6. Как видно га представленных на нем р-А-изотерм амфяфилышх полиэлектролитов, плотность расположения звеньев цепей увеличивается в среднем в три раза при переходе от ПЭИ-70лин и ПЭИ-70разв к ПЭИ-35лин и далее к Г1ВП. Зго "уплотнение" (уменьшение площади на одно звено) коррелирует с

увеличением наблюдаемой активности при адсорбции моноаминоксидазы. В случае ПЭИ-12разв достигается максимальная теоретически возможная плотность расположения звеньев полиэлектролита в 6-7 А^/субьедииицу. Вероятнее всего, это ведет и к резкому увеличению поверхностной концентрации фермента, способствующей его агрегации и появлению наблюдаемой аллосгерии.

Поверхностное давление, "мК/'м

Рис. 6. р-А-изотермы разных полиэлектролитов в пересчете на звено цепи: а - ПЭИ-12разв; б -ПВП; в - ПЭИ-35лин; г - ПЭИ-70лин; д - и ПЭИ-70разв.

На рис. 7 представлены р-А-изоггермы полиэлектролита (кривая а), фермента (кривая б) и их комплекса (кривая в), образующегося на границе раздела фаз. Как видно из этого рисунка, нативное липидное окружение моноаминооксидазы обеспечивает образование этим ферментом ленгмюровской пленки, которая затем может быть перенесена на твердую гидрофобную поверхность. Добавление на поверхность ленгмюровской установки со сформированной пленкой фермента полиэлектролита видоизменяет форму р-А-изотерм обоих компонентов. Это изменение более выражено по отношению к изотерме чистого полюлектролита. Присутствие на 1ранице раздела фаз липофильного фермента МАО значительно влияет на процесс образования мономолекулярных пленок. Также, как и при образовании комплексов ГОД/АПЭ, результирующая изотерма не является простым суммированием исходных изотерм их компонентов. Во первых, величина давления комплекса МАО/АПЭ на всем протяжении изотермы

меньше суммы парциальных величин давления отдельных компонентов. Во вторых, увеличение поверхностного давления по сравнению с р-А-изотермой полиэлектролита наблюдается только в правой части диаграммы.

Поверхностное давление, иН/м

интегральная кинетика моноаминооксндазы в ленгмгорооских пленках, полученных без амфифильных полиэлектролитов и с ПЭИ-12разв, при концентрациях субстрата, обеспечивающих максимальную активность фермента. Полученные результаты, представленные в табл. 3, отражают некоторое снижение аффинности фермента к кислороду при использовании этого амфифильного полиэлектролита, что согласуется с изложенными выше результатами аяализа кинетических констант по тирамнну и кислороду.

то

Рис. 7. р-А-изотермы ПЭИ-35лин (а), моноаминоксидазы (б) и моноаминоксидазы, адсорбированной на ПЭИ-35лин (в).

о

О <0 30 <0 40 00 м го

Площадь поверхности, си'

Для анализа изменений характеристик фермента была расчитана

Таблица 3

Кинетические константы моноаминооксндазы, полученные «а аналпа интегральной кинетики

О) особ нанесения

Ут,

мкМ/мин

Км, мкМ по кислороду

Без полимера 8,5 ± 0,2 6,0 ± 0,6 1,4

с ПЭП-12разв 6,0 ± 0,5 15,1 + ОД 0,4

С целью определения стабильности получаемых пленок фермента было проведено повторное измерение их активности при насыщающей концентрации субстрата 280 мкМ, дающей наиболее воспроизводимые данные (1 5 %), через один и семь дней после нанесения (см. рис. 8). Активность, определявшаяся на следующий день после нанесения, сохраняется на уровне 95-100 % как для МАО в ленгмюровских пленках, полученных без амфифильного полиэлектролита, так и с использованием ПЭИ-70разв. Однако через неделю после перенесения мономолекулярных пленок на полипропиленовую мембрану электрода в случае фермента, иммобилизованного без АПЭ, обнаруживается только 20-25 % остаточной активности, а иммобилизация МАО с помощью ПЭИ-70разв приводит к повышению стабильности фермента: остаточная активность составляет 8085%.

Начальна« скор оста, мкМ/мин а I 6

Рис. 8. Данные, по стабильности ферментативной активности МАО в ленгмюровских пленках, полученных без полизлектролита (А) и с ПЭИ-70разв (Б), а - начальная активность, б - активность через сутки, в -активность через неделю. Концентрация тирамина - 280 мкМ.

Таким образом, эффективная иммобилизация моноаминооксидазы возможна и без участия полимера. В свете известных данных о липофильном характере моноаминооксидазы это легко объяснимо. Однако присутствие на границе раздела фаз амфлфильных полголектролитов значительно увеличивает, как и в случае ГОД, поверхностную концентрацию фермента, изменяет его кинетические характеристики и повышает стабильность сформированных пленок.

3. Бифункциональные лентмюровские пленки ПФ и ГОД Для количественного сравнения медиаторной активности ПФ было использовано отношение величины тока при потенциале полуволны в присутствии фермента и избытка субстрата к величине тока без фермента -коэффициент усиления. Найденные значения этого коэффициента представлены в таблице 4, из которой видно, что согласно этому коэффициенту ПФ по их медиаторной активности распологаются в ряд: ФКК > ЭФКК > БФКК. В контрольных опытах при отсутствии ПФ буферные растворы ГОД и глюкозы в рассматриваемом диапазоне

потенциалов не дают сколько-нибудь значимого тока.

д

Таблица 4

Электрономедиаторные свойства растворов ПФ (200 мкМ) при концентрации глюкозы 100 мМ

Производные El/2 Плотность тока при Вт, мкА/мм^

ферроцена мВ без после добавления КУ

ГОД 10 мкМ ГОД

ФКК 340 1,75 4,88 и

ЭФКК 290 0,85 1,75 2,1

БФКК 280 0,78 1.41 W

Нами была исследована возможность получения ленгмюровских пленок непосредственно из ФКК, для чего были измерены р-А-юотермы этого медиатора и одного из полиэлектролитов (см. рис. 9). Вид р-А-изотермы ФКК (кривая а) свидетельствует о том, что этот ПФ почти не образует пленки на поверхности водной субфазы. Перенесение их на поверхность графитового электрода • приводило лишь к незначительным изменениям фоновых циклических вольт-амлерограмм (ДВА), полностью исчезающим после промытая электрода.

При адсорбции ФКК на монослое полиэлектролита на' р-А-изотерме наблюдается увеличение эффективной площади, приходящейся на одно звено субьединицу полиэлектролита (кривая в на рис. 9). Это указывает на образование комплекса АПЭ/ФКК очевидно за счет электростатического взаимодействия.

Поверхностное давление, мН/м

Рис. 9. р-А-изагермы: а - чистая ФКК, б - ПЭИ-12разв, в - ПЭИ-12разв после адсорбции ФКК, г - ФКК в смеси с ПЭИ-12разв,' д - ФКК в смеси с ПЭИ-12разв после адсорбции ГОД. Для изотермы чнстой ФКК изотерма рассчитана на одну молекулу, для всех других изотерм -на одно звено полиэтиленимина.

В связи с этим были исследованы пленки ФКК, полученные с использованием гита различных амфифильных поликатионов на поверхности водной субфазы. После перенесения таких пленок на поверхность электрода снимались циклические вольт-амперные кривые, на которых во всех пяти случаях при анодном токе сохранялась "ферроцеловая" волна с Е}|2 " 285 мВ. Количественное сопоставление различий, оцененное по плотности тока представлено в табл. 5. Как видно ш этой таблицы, амплитуда полуволны окисления и .степень увеличения сигнала после добавления ГОД заметно различаются в зависимости от типа использованного полиэлектролита. Максимальный эффект наблюдается в случае ПЭИ-35лин.

Для оценки возможного изменения медиаторных свойств в результате иммобилизации были измерены КУ для двух других ПФ. Результаты этих измерений представлены в табл. 6. Как видно из этой таблицы, при иммобилизации замещенных производных ферроцена значения этого коэффициента были, как и при использовании их растворов (см. табл. 4), ниже, чем для ФКК.

Таблица 5

Электрономедиаторные свойства ФКК, адсорбированной на монослоях АПЭ, после перенесения 30 слоев на графитовый электрод

Плотность тока при Еу2> мкА/мм^

Тип в присутствие 100 мМ глюкозы

полиэлектролита до добавления после добавления КУ

год 10 мкМ ГОД

ПЭИ-35лин 0,55 + 0,08 1,53 ± 0,09 2,8

ПЭИ-12раза 0,43 ± 0,06 1,08 ± 0,16 2,5

ПЭИ-70лин. 0,25 ± 0,08 0,61 ± 0,07 23

ПЭИ-70разв 0,42 ± 0,14 0,94 ± 0Д1 2Д

ПВП 039 ± 0,15 0,81 ± 0,14 2,1

Таблица 6

Электрономедиаторные свойства ПФ, адсорбированных на монослоях ПЭИ-35лин, после перенесения 30 слоев на графитовый электрод

Производные ферроцена Плотность тока в присутствие до добавления год при Е}/2' мкА/мм^ 100 мМ глюкозы после добавления 10 мкМГОД Коэффициент усиления (КУ)

ФКК 0,55 1 0,08 - 153 ± 0,09 . 2,8

ЭФКК 0^5 + 0,01 1,25 1 0.01 23

БФКК 0,49 ± 0,01 0Д7 ± 0,01

Для выявления максимальной степени влияния количества эффективного заполнения поверхности электрода производным ферроцена были измерены • величины тока при различном количестве слоев ферроценкарбоновой кислоты. Результаты этих измерений представлены на рис. 10. Они показывают, что абсолютная величина плотности тока постоянно увеличивается с увеличением числа слоев, но КУ достигает своей предельной величины уже при 30 слоях. Поэтому далее в работе использовались 30-слойные образцы.

Плотность ^гока, мхА/нм1

Коэффициент усиления

3.5

0,6

2

1

2.6

3

1,6

Рис. 10. Элсктроио-мсдиаторные свойства ФКК в зависимости ог числа иммобилизованных с помощью Г1ЭИ-12разв слоев, а -плотность тока до добавления глюкозы; б - плотность тока после добавления 100 мМ глюкозы; в - КУ.

о

о

о 10 20 30 40 60 60

Количество слоев

Для оптимизации процесса иммобилизации произгэдных ферроцена были получены ленгмюровскис пленки из смеси ФКК с полиэлсктролитом Для этого 3 мг ФКК было растворено в 200 мкл раствора ПЭИ-12разв в хлороформе (1 мг/мл). Изотерма (см. рис. 9, кривая г) сжатия имеет в этом случае ецраженнух» двухфазпость и проходит ниже изотермы сжатия чистого полиэлеетролмта (рис. 9, б). Это указывает на зависимость ориентации ферроцен-полимерных комплексов в ЛБ-пленках от способа их формирования. После перенесения таких пленок на электрод в буферный раствор ячейки были добавлены ГОД и глюкоза и измерены циклические вольт-амперные кривые. В этом случае наблюдало» еще большее увеличение сигнала: от 0,43 1 0,13 мкА/мм^ до 1,27 1 0,27 мкА/мм^ в отсутствие и в присутствии фермента соответственно, КУ=2,9. На ряс. И представлена зависимость увеличения 'плотности тока ¿1 при £¡/2 от концентрации глюкозы.

Для выявления преимуществ иммобилизации ПФ с помощью лсчшюровской технологии была проведена серия опытов по иммобилизации ПФ посредством их простой адсорбции на поверхности графитового электрода. В результате 15-.\шнутного нахождения электродов в 2,4 мМ мсгаполыюм растворе ФКК па ДВА при первом сканировании наблюдалась характерная ферроценовзя волна с плотностью тока (при Е]д) 1,47—0,02 мкА/мм2. При добавлении 10 мкМ ГОД и 100 мМ пиокчзы

Рис. 11. Зависимость увеличения плотности тока от концентрации глюкюы при иммобилизации на электроде ленгмгоровских пленок из смеси ФКК с ПЭИ-35лин, концентрация ГОД в растворе 10 мкМ.

величина тока увеличивалась до 2,741^0,05 мкА/мм^, то есть КУ составлял 1,9. Однако, в течении последующих трех циклов сканирования величина тока снижалась ниже исходного уровня. Если же ГОД и глюкоза не добавлялись, выраженная ферроценовая волна наблюдалась только при первом сканйрованиия. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что производные ФКК сохраняют свои медиаторные свойства в ленгмюровских пленках, полученных различными способами с помощью положительно заряженных АПЭ, значительно лучше чем при простой адсорбции.

Для создания биосенсоров большой интерес представляет возможность непосредственного объединения на электроде с помощью ленгмюровской технологии фермента и медиатора. С этой целью в субфазе ленгмюровской установки была растворена ГОД и на поверхности сформирован ленгмюровский слой из смеси ФКК с ПЭИ-12разв. Через 15 минут, после адсорбции фермента, была измерена р-А-изотерма образовавшегося комплекса. Она • представлена кривой д на рис. 9. Увеличение поверхностного давления по сравнению с кривой г (ФКК в смеси с ПЭИ-12разв) говорит . об эффективной адсорбции . фермента. Исчезновение двухфазное™ указывает на изменение поверхностной структуры ферроцен-полиэлектролитной пленки. Поэтому можно говорить об образовании белок-ферроцен-полиэлектролитного комплекса. Рассматриваемая р-А-изотерма этого тройного комплекса выражение отличается и от изотермы чистого полиэлектролита (кривая б). В правой части рисунка наблюдается

Увеличение плотности тока, мхА/мм*

увеличение поверхностного давления. По мере сжатия комплекса давление увеличивается в меньшей степени чем при сжатии пленки чистого полиэлектролита. Па основании этого можно сделать вывод о встраивании фермента в поверхностный медиаторно-полимерный слой. Перенесение таких пленок на поверхность электрода дает величину КУ, равную 15 (при 100 мМ глюкозы). На рис. 12 представлена зависимость увеличения плотности тока л I при Е\/2 от концентрации глюкозы.

Увеличение плотности тока, мкА/мм*

Таким образом, разработанный новый подход в использовании ленгмюровской технологии позволяет проводить эффективную иммобилизацию как низкомолекулярных (ферроцен), так и высокомолекулярных (ГОД и МАО) соединений с помощью синтетических амфифильиых полюлектролитов. В этом случае используется тот факт, что амфифильные производные полютиленимина и поливинилпиридиния с длинными алкильными цепями и разветвленные в разной степени образуют на водной поверхности мономолекулярные слои. Присутствующие в растворе молекулы фермента или иных веществ вступают в электростатическое и гидрофобное взаимодействие с амфнфильными полтолектролнтами, образуя в поверхностном слое стабульпые комплексы, которые затем могут быть перенесены на твердую поверхность.

Полученные результаты доказывают, что с помощью амфифильиых полиэлектролитов возможно получение каталитически активных лешмюровскнх пленок ферментов и медиаторов электронного переноса. Иммобилизуемая таким способом ферроценкарбоновая кислота сохраняет

,, ОУ ил» юи

Концентрация глюкозы, им

Рис. 12. Зависимость увеличения плотности тока от концентрации глюкозы при иммобилизации на электроде ленгмюровских

пленок ФКК/ПЭИ-

12разв/ГОД.

пленок

свою медиаториущ функцию в отношении фермента глюкозоксидазы. Таким образом, показана принципиальная возможность непосредственного взаимодействия фермента, медиатора и электрода в мультислойных пленках, сформированных с помощью ленгмюровской технологии с использованием амфифильных полиэлектролитов.

ВЫВОДЫ

1) Разработан новый метод формирования ленгмюровских пленок оксидаз на основе амфифильных полиэлектролитов. Предложена молекулярная модель формирования белок-полиэлектролитных слоев.

2) Впервые показана возможность изменения кинетических свойств ферментов при их иммобилизации в ленгмюровских пленках с помощью амфифильных полиэлектролитов. При иммобилизации ГОД с помощью ПЭИ-12разв наблюдается уменьшение константы Михаэлиса. Иммобилизация с помощью ПЭИ-12разв моноаминоксидазы ведет к появлению аллостерического ингибирования ферментативной активности избытком субстрата. . л

3) Доказана возможность иммобилизации с помощью новых амфифильных полиэлектролитов ленгмюровских пленок производных ферроцена. После перенесения этих пленок на поверхность графитового электрода электрояомедиаторные свойства производных ферроцена сохраняются.

4) Предложен новый метод получения с помощью амфифильных пешиэлектролитов бифункциональных ленгмюровских пленок, состоящих из фермента и медиатора электронного переноса. При иммобилизации таких пленок на поверхности электрода ферментативная и электрономедиаторная активности сохраняются. Это может служить основой для создания высокочувствительного биосенсора на глюкшу.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1) Eremenko A.V, Barmin A.V, Sokolovsky AA, Kurochkin Ш.

A biosensor based on monomolecular films of glucose oxydase. - In:

Biosensors '92. Proceedings. An international conference held on 20-22 May in Geneva, Switzerland. Oxford, Elsevier Advanced Technology, 1992, p.227.

2) Бармин AJ3, Еременко A.B, Соколовский А А, Чернов С.Ф, Курочкин И.Н, Кинетический анализ мономолекулярных пленок глюкшооксидазы. - Биологические мембраны, 1993, т.10, с.438-446.

3) Бармйн А В, Еременко А .В, Москвитина ТА, Курочкин ИЛ. Ленгмюровские пленки моноаминоксидазы с амфифильными полиэлектролитами. Изучение каталитических свойств фермента. Биологические мембраны, 1993, т. 10, с.647-654.

4) Barmin A.V, Eremenko A.V, Sokolovsky AA, Chernov S.F, Kurochkin Ш. New catalytic properties of glucose oxidase in monomolecular films. Biotechnol-Appl.Biochem, 1993, v.18, ррЗб9-376.

5) Barmin A.V, Eremenko A.V, Kurochkin I.N, Sokolovsky AA. Cyclic voltammctry of ferrocenecarboxylic acid monomolecular films and their reaction with glucose oxidase. - Electroanalysis, 1994, v.6, pp.107-112.

6) Бармин А .В., Еременко AJB, Курочкин ИЛ. Ленгмюровские пленки ферроценкарбоновой кислоты и глюкозооксидазы на основе амфифильных полиэлектролитов. - Биологические мембраны, 1994, т.11. Принято в печать.

7) Barmin A.V, Eremenko A.V, Kurochkin I.N, Moskvitina ТА. New catalytic properties of monoamine oxidase immobilized in Langmuir-BIodgett films with amphiphilic polyelectrolytes. - Biotechnology and Bioengineering, 1994, v.44. In print.

Список сокращений

АПЭ - амфифильные полиэлектролиты БСА - бычий сывороточный альбумин БФКК - бутилферроценкарбоновая кислота ГОД - глюкозооксидаза КУ - коэффициент усиления

ЛБ-пленки - ленгшоровские пленки (пленки Ленгмюра-Блоджетг) ЛМК/ММК - сополимер лаурилметакриловой и метакриловой кислот МАО - моноаминоксидаза

ПВП - поли-4-винилпиридиний, алкилированный в 90 % звеньев

лаурилбромидом ПФ - производные ферроцена

ПЭИ-12разв - полиэтиленимин разветвленный, алкилированный в 12 %

звеньев лаурилбромидом ПЭИ-35лин - полиэтилешшин линейный, алкилированный в 35 % звеньев лаурилбромидом

ПЭИ-70лин - полиэтиленимин линейный, алкилированный в 70 % звеньев лаурилбромидом

ПЭИ-70разв - полиэтиленимин разветвленный, алкилированный в 70 %

звеньев лаурилбромидом ЦВА - циклическая вольтамперограмма ФКК - ферроценкарбоновая кислота ЭФКК - этилферроценкарбоновая кислота