Лектины в исследовании гликоконъюгатов

Лахтин, Владимир Михайлович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Лектины в исследовании гликоконъюгатов
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Лектины в исследовании гликоконъюгатов"

$3%

Всесоюзный научно-исследовательский проектно-конструкторский институт прикладной биохимии

На правах рукописи

ЛАХТИН ВЛАДИМИР МИХАЙЛОВИЧ

ЛЕНТИНЫ В ИОСЛЕДОВАНИИ ГМКОИОНЫОГАТОВ

03.00.23 — Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соисканне ученой степени доктора биологических наук .

Москва — 1991

Диссертационная работа выполнена в Институте биохимии им. А. Н. Баха АН СССР и Институте пигЦёвых веществ АН СССР.

Официальные оппопенты: д. б. н. Позмогова И. Н.; д. б. н. Егоров А. М.; д. т. н., проф. Мо-сичев М. С.

Ведущая организация — Институт физиологии растений им. К- А; Тимирязева АН СССР.

Защита диссертации состоится 44 января 1992 г. в АО_ часов на заседании специализированного совета Д 098.09.01 во Всесоюзном научно-исследовательском проектно-копструкторском институте прикладной биохимии (125299, Москва, ул. Клары Цеткин, 4/6).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного научно-исследовательского про-ектно-конструкторского института прикладной биохимии.

Автореферат разослан «1Ф» декабря 1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

И. И. ГУСЕВА

К ....', I

' Г, ч { ОБЩЛЛ ХАРЛКТЕРИСТта РАБОЙ

! Актуальность рроблеш. Последнее десятилетие отмечено рюко " вЪз'росиш интересом исследователей к проблемам биоузнавания на различных уровнях организации всего живого. Первостепенное значение в сложных механизмах биоузнавания отводится взаимодействиям между уг-ловодсвязивающиш бедш/ш (лектииаш, ферментами углеводного обмена» иммуноглобулина™) и природными глпкоконыэгатами - углеводсодераздо-мн веществами (глшеопротенналш, гллколиггадами и другими) в состава илоточшгг'СТРуктур," внеклеточного иатрнкса и биологических нидкостей. Особенно выралви интерес исследователей к лестинам: ежегодно по лок-тшюзой тематике публикуется около 2000

работ; (Ыепог ей аХ*, 1926). С 1970 по 1991 года было проведено 13 Международных конференций по легдчшш, а с 1364 года по настоящее время - II Мелдуяародних сгашо-зиушз по глпкокопъюгатси - потенцлашшм шшеням лзктннов.

К лектинаи относятся (глшео) протеины лошлуноглобулпновой природа, способше к специфическому узнавали» углотодсв (глшоэзнлышх групп) и обратимому связывала с пш,ш без нарушения ковалентпой структур" у2ладслз:шх глккозкшшх лшпндов (Косоигек, Но£э4й1, 1931, 1933! Косоигек, 1989 ). Как правило, лектшш проявляют свойства оли-гокср:шх белков, вклгзчащих но крайней мэре один участок связывания углеводов. К яектинам не относятся ферменты углеводного обмена, хотя глшссзилгрансферази при огтределегатх условиях могут проявлять лзкти-ноподобшю свойства. Кроме того, некоторые глпкозвдази и гллкозше-окс! дозк с незгвпешшми ст каталитического центра эпитопаш, доменами или суб'ьедклгадгш связывания углеводов следует относить к настоящим (не ло.?н^.м) лектинам. Многие лвяшш способны избирательно про-цппитировать гликоюиъюгап! к агглиткпировать клетки с определешшы набором углеводнкх дехзр.пшант, экспонированных на клеточной поверхности в составе глякоконъюгатов.

Лектики участвуют в тагах ва-ших биологических процессах, как эндо-, пино- ъ пагоцитоз; компартментализадия гликоконъюгатов на уровне оргалэлл, типов клеток, тканей и органов; очистка биологачес-ких жидкостей от аномальных собственных и чужеродних гликоконъюгатов, клеток и частвд; хоминг меток, колонизация тканеЯ и органов хозяина микроорганизмами, морфогенез тканей и органов, оплодотворение и т.д. Лектшш и их комплексы с эндогенными и зкзогешшмн гликоконгюгатаия обладают широким спектром биологических активностей, представлящкх интерес дяя медицины, агробиологии и биотехнологии.

Таким образом, изучение лектшюв является актуальным. У пас в стране вопроса: очястхш лекгкнов, глазным образом га растительных источников сырья, уделяется повышенное шгшанпе (Лунин М.Д. и соавт,, 1981; Хомутовский и соавг. , 1986; Луцик А.Д. и соавт.1, 1989). Разработана высокочувствительные методы микроанализа глштокопьюгатов лш-Бч/тшхх и человека с помощью меченых лектшюв (Луцик А.Д.; 1989; Луцка М.Д., 1989; Луцик А.Д. и соавт., 1989).

Однако в настояцео время отсутствуют обзоры по бкотехнолога-чсскш аспектам лектшов, но проведена систематизация таких аспектов п не дана оценка перспектив использования лектшов в биотехнологии. Малоизученными остаются лектаны шкробов п морских организмов, являющихся новыми перспективными сырьевыми источниками. Малолсслодовап-ше.ш остаэтся вопроси использовали гг.аобшшзовашшх лектшов для разделения близких по фиэкко-химнчееккл свойствам глжоконьэгатов п шхнрисс-оцешщ особелносте!'; их углеводной части. Отсутствуют дашше о гликоконшгатах поверхности большинства видов н штаммов микроорганизмов.

Работа баяа начата в 1981 год-, когда у пас в стране ко было налажено производство лектиновых препаратов, но бил разработан шео-мчуготштвльпнЁ анализ глшеоконмягатов микроорганизмов с гепользо-сгавк: яагшшх ле^ь-гов, огсутсгвовичс: дсигшовне сорбенты г котода ш. ксаольаоьанш да ^зшатографии гяш»:о1п>огатоа.

Ца'ц, рз,боун ~ зкстрп,:еятальнос обоснование оффоетпвпостЕ использования, лектшов в биотехнологии и микробиологии,

задааи^аагвдаЕШШ!:

I. Исследование взаимодействия лектинэв с различными препаратам:: глшюх:онв5агатоЕ, гошшравашвш ют в состава поверхности мзеробла :;лзток, а такте изолированными гликоконхлгатаглз растптолъкого и глистного прог;схоэденшх, Лия этого:

а) нсцучоаао п характер^сипш. препаратов даягсков, «зккяохгк сорбоа-тгв, антител к лехтипам;

б) получений и характеристика препаратов глш:око1п«яратов;

а) разработка нош;: мэгодов лектзшошГ; здесздодрс^зг гикокош-згатов;

г) 11"ге:;очзгссп.гтехх!ылс петого:-. ГЛЧ-ЗСТЙОНШГ:1 п ьоталгог-

¿.ш^СоИх^п К';;.-.: ^^гл-.^лгг, с г.^.гг::-1.''::-;'^:—

тишг;

;;} Жмзойх-жио сяэдфгшоста лмдааао к «жгедзрят зхзягодок, и ™тспкг.г тест-сгзтог:;«

_ 3 -

е) использование натишшх локтинов в исследовании ранее не изученных глшсоконъюгатов, очщешшх или связашшх с клеточной поверхностью.

Научная новизна. Дана классификация и оценка перспектив биотехнологических аспектов лектинов, особое внимание уделено исследованию гликогаэнъюгатов. С помощью разработанного микроанализа с использованием нативных лсктшюв и ишушюго "сэндвича" к каздону из лекти-нов исследованы микроорганизмы, в том числе штамш-диагностикуш возбудителей болезней человека и сельскохозяйственных швотшх. Продемонстрировано высокое сродство лектина фасоли к риккотсияц coxiella bernetii И секрету фИТОПаТОгеННОГО гриба Helainthoaporium sativum, лектина шеншщ - к спирохетам, энторобактерюм, бруцеляам, капсулъ-ным формам микроорганизмов, зонам интенсивного метаболизма меток низших растений. Выявлены внугриродовые различия (на примере родов Rhizobiuüi, Candida, Chlorella ) И ВНутрИВВДОВНО раЗЛИЧИЯ МШфООр-ганнзмов (на нрпглэре бактерий Kbizobium phaseoli, R. lcguminoearum, гликромицета и. reosei) с помощью лектшов пшэшшн, фасоли, чечевицы и конканавалина A. Показана зйЛоктивность использования набора из 9 лектинов с различной олигосахаридноП специфичность» (главным образом в виде лекткновнх сорбоятоз) для очлетгл гидролаз, разделения близких но фиинко-хпшгьзекш свойствам в.ерпюнтов и их множествешш: тор.!, а такта оценил особенностей ояигосахаридшх структур углеводной части ферментов (в сочетании с донншш об углеводном составе очвдешшх препаратов ферментов), Получены акткЕиие имкобилпзовашше на лекти-HOEUX сорбентах нрзнарати ферментов с одновременной их очисткой. Определена специфичность к углеводам, гликсконъюгатам и клеткам новпх лектинов из новых перспективных источников сирья.

Практическое значение работь'. Опублшсовашне в научных изданиях материалы диссертации попользуется ь учебном процессе и научно-исследовательской работе МГУ, ШЕШ ¿Ш СССР, ЦКВИ Ш СССР, НПО БИОЖР (Латвия), 1Ш ВА.СШИД, 1Ш-т биохимии Ml Украпш, К.Ш All Укра-шш, ТИБОХ ДВЩ AJi СССР, 1ШиБ АН Казахстана, 1ШХ All Узбекистана, Львовский медицинский т-т, Дисирол'ixpov.ci'iiii ун-т, Тартусс'кий ун-т (Эстония). К таким материалам относятся л:отода получения лектинов н Лермонтов, приготовления iJopuüHTm: биокатализаторов па основе ^пользования лектиношх сорбентов, проиедсти аф£шшой хроматографии гли-коконъ'лгатов на ле ктаиоио: сорбентах, тестирования аггдал'ннкрутадй и гфецшштируищеи активностей локтписв, использования латясних г.т-типов в анализе гликоконьвгатоп докфиглста miicpooptvijiij).»?!.

Дпробада работа;. Результат работы были представлены на Всесоюзной конферанцш по медицинскому микроанализу (Москва, 1984), Всесоюзной конференции "Морфологические исследования в практике здравоохранения и животноводства" (Москва, IS83), 4-и Ыездународиом симпозиуме социалистических стран по биотехнологии (Варна, 1986), 17-й Конференции ФЕЕО (Берлин, 1986), 4-м Всесоюзном симпозиуме по молеку-лгфной хадцсостной хротгограТлш (Алма-Ата, 1967), 5-й Всесоюзной конференции по методам получения и анализа биохимических реактивов (Юрмала, 1967), 8-й Всесоюзной конференции по химии и биохимии углеводов (Тбилиси, IS87), 1-й Республиканской конференции по лектинам (Таюхинн-Тарту, 1988), 10-й Международной конференции по лектинам (Прага, 1988), Всесоюзном совещании по гликоконъюгатам (Дилижан, 1983), 11-й Международной конференции по лектинам (Таяланн-Тарту, 1989), 5-й Европейской конференции по углевода!,: (Прага, 1989), 17-гл Мездунарсдном симпозиуме по химии природных продуктов (Деля, I9S0), 20-й Конференции ФЕБО (Будапешт, 1990), 12-й Международной конференции по лектинам (Дэвяе, 1990), lis:. Мездукаро/даом симпозиуме да таш-коконыэгатам (Торонто, 1991), Всесоюзной хшнферс10дгах "Совреглешше катода выделения, otectwi и ццентификащш микробных метаболитов" (Пудао-на-Оке, 1991), 13-й Матдународной конференции по лектинам (Берлин, 1991).

Пу&шкаште. OcHODinte результата диссертации пзлогзпк в монографии:, 33 статьях и 3 авторские свидетельствах на изобретения.

Ofee'-l "и с'тктгоа диссертации. Работа потачает 409 страниц машинописного текста, в том числе 40 таблиц и 82 рисунка (43 рисунка представлены в виде фотографий микроорганизмов). Диссертация состоит ез гвэдешш, обзора литературы, разделов Материалы и метода, Резу.яь-laai и обсуждение, заглэтенля:, выводов, щшожеппя и списка «итлро-вшшой литература. Приложение содержит докуиентслхпбе подтверждение внедрения материалов диссертации в учеб:тГ: процесс и практику научите исследований. Список литературы включает 576 пюстражпгс источников и 112 источников на русском язшее.

if г.'етог-j исследования

Сарьс^. очвсзу.и локтгдов слзсле секгна ссльсгсохозяйствапшаг

.'¿'VtMypi отхода мукомольного прэязгодезг?. • л пгогзгодотга прг\"~'ктсг.

питания из моллюсков, кулисуралыше жидкости микроорганизмов. Локтей фасоли очищали из белых бобов сорта Красноградская-15 (Дахтпн, Роман-тепко, 1983, 1984), пзолектшш фасоли получали по методу Нага et al., ,1985), .лектин гаташщн шделили из зародышейотходов нроизтюдст-¡а (Лахтин и соавт., 1984, 1985; Лахгшт, Мосолов, 1988), лектшш Ешещавшш и сои - аффинной хроматографией па обработанной соляной кислотой агарозс (Allen, Johnson, 197S ); Для очистки растителышх X9ETKH0B использовали такие набор гликозгоюферонов, синтезированию: сак описало в работе Березина и соавт. (1989), Лектин со свойствами фермента был очищен из культуральной жидкости продуцента *,-галакто-зпдазы Cephalosporin acreaoniua 237, как описало в работах (Запро-збтова и соавт., 1985; Лапин, Залромйтова, 1988). Лектин из культу-зальной аидкости бактерий - продуцента зластолитических ферментов Bacillus subtilis 316Г5 (прежнее название В» meseataricus ) бил №H, irait описано в работе Simoaenko et al. (IS2I). Лектин со свойствами адгезша, был стащса m тканевой яидкости прошслошх мидий Япоп-;кого моря, "ЖЪшюаио в работе Ovodov et ai. (1991). Использовали •акте коммерческие препарат лектиюв производства Cöonapol (ЧССР).

Иммобилизации лектинов проводили на активированной бромциаяом лгарозо в присутствии углеводов пли без них; ёмкость лектиновых сор-ентов определяли по связыванию стандартных гликопротешов, а хрома-ографив исследуем х гликокоиъюгатов на лектшовнх сорбентах проводи-и, как описано ранее (Лахтин, Г985; Запрометова и соавт., I98&J ахтин и соавт., 1989).

Сырьём дая очистки гликоконъюгатов служили сок полыни, латекс апа&и, культуральные жидкости микромщетов acremoniuto 23? и ïtchoderma reesei (промышленный шташ - продуцент целлилаз ), бак~ ерий В. subtilis 316М и Kiizobiuffl leguminoаагшв (набор Штаммов ИЗ сесоюзной коллекции ВНИИСХМ, Ленинград, Пушкин). В качестве глико-онъюгатов служили /î-глякозидазы полыни Arcemieia onnua ъ. Magaaova et al., 1985 ), лизоцим со свойствами хвтиназц из отечест-енной папайи Carica papaya L. (Лаетш, Костанова, 1985), <<-галак~ эз ид ал а и /3.-я -ацетилглюкозаминвдаза гриба с. aeremoniua Я37 Запромйтова и соавт;, 1385, 1986), набор форм зпдо-^-1,4-глвканазц риба T. reesei (Тихомиров и соавт., IS87), гемагглатинш бацилл . subtilis 316М (Simonenko et al», 1991 ), экзолояасахарвдц клу-эньковых бактерий к. i<-suninoearum (Косенко и соавт,, 1909). Исход-' для препаратами гликоконъюгатов млекопитающих слунлли щелочная фос-

| (гятала ттаашх_(ШО Бгадар, Латвия), НШаза быка (Eeanal, Венграм), набор стандартных гдгганрстеияов (sigca, США). Набор высокоочкцешшх препаратов глшсоцротешов из курглох якц был дпбезяо продо ставлен В.ЕЛпскарёвкы (Ин-т шщевнх веществ Ail СССР, Москва).

Содержите углеводов и углеводный состав гомогенных препаратов гликокопшгатов определяли методом с использованием фенола и cepnoli ккодоти (Dubois et al., 1956$ Захарова, Косенко, 1982), газо-®вд-костаой хроматографией мояосахариядах ирсизводтсс в виде триметялсп-лгшшх зфпров (Ал&аша к соавг,', I984)-, на аминокислотном анализаторе в случае оцродатеяия алаюоахаров. Балок определяли по Лоури ейя но оптической плотности в ультрафиолетовой области спектра (Xalcfcnx, 1Wi Wolf, 1983 ).

¿ятшкадахноЕне кролк-гък гкмуногдобулшш g получали, iicac описано ь работа~(Лаггш п coasv., 1985). Использовали такке антнкроличьи осушшо гкмуноглобуяшш G шчеяшо фдуоресцешизотиохдошатоа (йЯТЦем), производства ШВШ ш. Гшакоа АМН СССР, Москва,

В ксследовалгях иодсльзошни зрстэдагты животных, а тшшэ гнетет шщюорганиздоз; i^rxJor.. gjlfeoflTj^Hgo^opQ^g^, клубеньковых CiuvZGSfJTn других Гоёнталой ¡юре:?::!-, г/лкрооргангтзмов указан з табл. 8,

Лекткяогую ахгавногть препаратов определяли по их способности аггх^тиНЕровать клетки и прехцтшкирзвать глшеокопъэтаты в планшетах дах £;гду11ологетсоглх реги-пдй с пг^лодошшми луш'.алш хпш по дагошм турбглдаотряческого аналгеа» кап описаю в работах (Лахтпн, Запромё-тот, 1288; Ластил, Мрсолоз, 1988; Лахтгн и соавт., 1989; Eaproaofcovc et al., 1990} Orodav et al,, 1991; Нуцубкдзе ж соавт.', 1991). Углеводную специфичность лектинов определяли по способности набора углеводов ннгибщюсать агглютинацтз клеток и полисахаридньп •часгиц ига преципитации гликоконъюгатов лектином.

Активность гддркшз определяли с использованием п-нитрофешш-содерзэдих субстратов или веско зиметрическш методом в случае эндо-/3.-1,4-глыхцшазц (Клзсов и соавт., IS80).

Связавшиеся с мшдюорганизмаш лекгшш проявляли последователь-лой обработкой мазков на предметных стёклах антилектхшовыми хфоличь-нив шцуноглобулина1.ш и актикроличызлл мечешшми ФИТЦем иммуноглобул» наш осла» как описано в работах (Лахтпн, Гусева, 1984; Дахтин и соавт,, 1985; Лахтш, Яковлева, 1988). Интенсивность непршлой иммуно-блуорзсцсицш! 1шсроорга1шзмов измеряли на приборе Дшам-И-3 со све-гофшатргли C3C-34-i, &-I-4, БС-8-3 к ЕС-8.

Отатясгтеск}7) обработку гг-оультатоз проводили яо Кску/тпу S375) для гксюро:-: о гхбохтя -чгслоч noriepe;nif.

- 7 -

СОДЕГНАШ23 РЛЕОШ

Г. сн? К угу сто л?■;,ШШШ-^1!"".-.

Поиск полых локтшюв й упн;;?лх.ш.'И сЕязнпавдггт углевода, г~г-кокояъпгатн и клетки свойства».::, а саг.тв облэд^'дтк варьирующим спектром бкос^фжгорпшс актишостсй, т-дреэгйг.у ос:лотсп актуальной гада-чей. л связи с шшшируснш!, аатибшсгерга-гатат, фунггагодпал и другим действием лз1.".шюв. К оцркст:.: улточипглч локтгпот> отга-

дует отизс?1г з порвут, очередь культууашшс л'дкостп кт-рюсргаггесмоз и отводы паевой промышленности. К таким нстсчцш.лм гакраз и относятся куаьтурадыао жидкости саарофнтшдс оактериНВаеШил аиЬЫЦо ЗШ.1, шгкрг.'.дцета ОорЬа?. \sporius3 лсгетсп1иа 207, .я 2ацУЭ отгщу. при получении шея промыслсжг дачьнепосточншс мидзй С^.'аозтйНиз егоуапиа. Глобепгшй шг.-врес тсслидпватолей в последнее вп.гч» с^зг^усироваи но по слодовашш сиялоспегсСг-с»-гч л;г.тинов~ порог,";ишг-у реагентов на сгзяо-г.ч1н:ох;ош;:.аг;, в ов^ап - ;т:: использования а кедацаха

Г. воторг.плр1Ц1 ( Бз11сие:.-,1930; Слагоз, 1539; Г1з.п<3а1, 1!аш1д'1,' "1Г1С30П, 19Й6, 1591).

С учетом Ешес;.дзаш:ого сита вибраны для исследования три потах лектигл из човнх ьирсиОЕтпших источав сирья: очэденшо о'елг.оша иррпарати микроорганизмов а. гтЬпШя 3161,1, 0. асгваюп1иа 23? и шдай о. егпуализ «' Результаты взаимодействия этих .«шяшов со стандартнга'л роагентеш (орцтроидтарни'ш тест-систсмщ.ш, гликопротеншами с известной олигосач аридной структур. V угловошой части, когжорчэсхши углеводами) сопоставлены с дан№;,.л> о спсцйфячггостл других лектинов в табл. 1-3.

Известно, что углеводимй сосгаз орптредител человека характеризуется вцракненность» остатков ИзиАс п ссалилпараглобозидо, причем полкости отсутствум остатки .т<;г.11 в случао эритроцитов бнка дсм:?.~ иирут остатгш 1ГаиС1 в гаиглпо?'0>. СИЗ и в сиалилиараглобоаадо (гигика«а иЬ 1980 ). 5ритгзцктн человека, овец и осла лшени 0-а^етюнфованшх .ортятт-,- гттат/п-ро^ гда'Ю'.'ы^ остатки 4-0-ацетилировагшоЦ сшйбьойкислоты присутствуют в эритроцитах лошади» а остатки 9-0-ацо тилировашюй сналовой кислота - г, зритрсидтах мшш, крша, кролика и КУР (аЬп5<1, Gabi.ua, 1989; Легг1аг е£ а1«, 1с>3? ). Ь случай-ДЦЩЩШИЗа-цш эритроцитов происходит частичное удаление с^алог^пиа^г отешюв (з '" том числе глшгофорнПд А), хотя общее снижение сст:-?коз сиаловой кислоты на поверхности клеток меньше по сравнению с сиалидазнсЛ обработкой

Табл. I. Гекагглютжщррздая активность лектикоз (татрн, мкг/мн)

Источники эритроцитов (Эц)

Лектшы человек кролик ШИЬ крцса морская свинка баран лошадь бык осёл курица

Лектин 6-10 X 0,5 12 (чел.) + ыакс.+ макс + _ (чел.)+

ИШ6НЕЦЫ 0,?(Тр) 3(Тр)" 2(Тр) - - - - - - -

Лектин йасоли 8 8(Си) 3 2++ - ■ - - - нет'1"

ЗГекгин КЛЗЩ9ВЕНЫ 0,6 0,03 - - - - - - - -

Рицин 5 0.5 - - - - - - - -

Лектин сои 2(Тр) 20 - - - - - - - -

Гемагглютинш ■С. аогевоп1ит" ОД есть - - - - - - - -

Адгезии мидий 15 - - - - (чел.) - - - -

Лектин бацилл В. виЪЪШз нет 0,4 2'Си) 0,8 З1си) >2 нет - - - - -

В скобках - обработка Эц трипсином (Тр) шш сиалвдазой (Си), или сходство титров агглютинации; макс. - максимальные титры- для набора Эц; + данные по ,0,1984; ++ Нага Аа.1. ,1985.

_ 3 -

( fSsííla oí?" al., 1590} I.'ehta ct д!., 1SS3 ).

13 селоii с киссгазсинкм представляет интерес aparara ь прсздз есого с1ш0с1кгр:|гню10 докмпгп ягсошзш* бздита я модай (доказататастга схатаспмрфггпостя локтшоз ra бацилл п кядк!1 прадстаплспн в табл. 2¿ 3 и pro, I) по способности 1паи:одо£сгвог:,!1та с разлтдали зрптрсц::га~ f.nr, как показало в табл. 1 „ Дгглтага пгонкцч к пдагй били сходни в том, что по разлит-TJT эритрсцпги чедсзока а барана. Лектгаш плени;!: н с'яцетз бпл'.с ?ai™o сходта шзду собаЗ, цоейжку обработка клеток форгсопго.ч пригодпга к сниетяио сродства доктнноз к ерптровдтам, В то со врага л&кткн шяшя» отлгггадбя от гндг-Д по нол:пес?Епнпо:.:у показа.»

тогл (íi:';r?M агкЕштадяг "Гстрсц-ггов человека и барана), а с? лег.г*-на блц-лл - более пкэкой йгбяз.лтальисстга орлтрехфткл (аталгл-'-Шглг.*-Ол зрщ-сгцтсй чсгавогса !т кэдокоЛ с*::пг:гл)» Тшятм образец, уг-»э д^гггго по r^irípo?iTrv2U'iBK?BJv3ü лзг/пгиов указтягкг? на то, "гго ло"--

n.re::rrr-u к пдгозлп пго.'галалт сгоЛст i'su-'.s- епецг^пглге

коз, а лз:;г»н бадиля - сезЛо-ггл rcoGl- споггТтгткого tf-v^n. Пр;: a¿t.M локт1;л геггетты, та-ввдп'о,\-у., jt^'i-í о по с^пги-^'г 7 о

Б ;.:э врз.'п логтпч jorecsníin £37 лгрпктср;'-

ЗСШ'О/Т Г пГЛ-ЛГгУГЬНШ СГОДСТЬСМ К í;nr:rrrr "Т ^рУРГЗЦЧТГП ЧОДОЕСГЛ ГО

oporactix;) о /тугпл! лс;тжга-,:л, яр? л С;? в кхчщоосэ «гшехэт! яоккигл гл)яр,-схалаг сяосо-'хгсть лэктт/а mvi5K32rx«.s:m> ••¿¿íípciurra: пз:'от:-та, возйЕ-дс;г.к> от типа гртши кровя. I» игягч, тихри .ч-стл'.этпнг-ц:гл opnxjmv топ чолоюка лоагюша гриба и С.'тл одггткого ггрггошпи.

Взапдодзйствие модашшх тшгопротетю» с ясктатаиа naraosao п табл. 2 . В случаз сиадосшяофпшас лзктшгов дессвлировапто глякоарогз-iuob oóií^nio щ?кводит к сшсх-ню реакционной спосс víocth лектиаоз растений а глшетшх (табл. 2). BtvTv", таксе, что внратошше сиалогликощ^-тоиш (глшю^орлн А, мтдии пэдчольч/игоЗ xe&emi блка и трапсфоррви человека) характеризуется повшепмкм сродство:;! я лектичом бактерггЗ. Jira-нко табл. 2 íaiose демонстрируют значительное сходмво леетшюп шопг.»,.1 п бузгяш, а таите лектглов пяэтща и фасоли, адрооин шщпй отличался отсутствием взшядодвйствия с глкгадпротоннама с свя^ашпаа с аспарггпг-' ном глшшпагля (»¿.^-кпелшл глккопротешгом человека и овомукоидом), однако адгезии реагировал с скалоиуцинани со овязанш.ш с сершюм/трао-ннно:.! глишналга (муцинсм подчелюстной жолэзц бнш ч 1СЛ-/а~овоглущшом, содерс^ащтан 36 и ЬЗ^ сиаловоП глслотп соответствошю), ноглз г>хо

чн м

См*

шз

в?"

СО §

I ш!

r-t Г-»

I I 1 о ! 1 I I i,

о ш

0Q 1Л 0>

» »а

Ь Ь Е* frl H f+ M I ШФОШФЮФО

Ю ! I § I I О I %

OJ *

» I

m «

со

( I 1 + 1 I + §

+ &

со N ц см

+c\j ci со см сосм .оа I + (M I СО4-' ' —»

M COCO CVfc"- U7

t-ttO О} » « 4\J »

чч со л оо о^ о

в«

•я

о к н а

•о ■ 1

« §

а и

Зш

и« ай

р* а> нет

«В

й!

2В и Вф

I loo I I I I

Si» * Í g

-lina рис. i. Лекгин бадгал такав проявлял сродство к муцину быка и фо-?y¡mj бука- (0.7Í сиаловой кислотц), что отличало его от прочих бактериальных лекткков.

Возрастшие стопегш взаимодействия локтина пшеницы о гликолро-т оплата обусловлено увеяглештем числа связашшх с ссрином/треонкног? сиадоцепсй (яри таких оиялогликаиа у фетутюа и 15 ~ у глигаТзорина А)< В случае гликодротеипов с полжштеннЕки связанными с аспараганом глз-шшамз когютксного типа дог взаимодействия с лектииом пшеницу ипзно присутствие па концш: антенн остатков опаловой кпелоты Hau5Ac-cí2,3(6i (Bhevaa«ndaot Ustlie» 1979). Реагирует® с адгезшом мидий к яавташи бгцк;: ijirijí тдчслис'.'лсй «олозе каз известно^ шеег cocían хгзодак «kcwts irwlev 30? И«гп9Лз п 17$ íreuol's njroyr-ciayo? 'ллзз кебодыгоэ кейщоеио &гау(а}&» л Гз\Мс (ít-гр r,t twaj ¿tosd, С:Ь5иг., C-tvlr.istV; «5 ni«, 1935).

0 f;aicii,n}:"r.c1r4jiinuc глио дуапг-: О ¿iCKin:^; <:■--

tíopy розулгтап: га тссазда.'«*«! вдегя&в&л-гсб x-í:.vú"¿r:í

с? Í»,T*lms3£ гсдагояЕсгсгшт укгтег^пт ¡r¿ су:;естп"л!пн X'"'1—--" '-'■•л-» -rccrtc'.n.^z-.iiocík 71^'rí счг^бйлгю: «фззахоаз дагаигов ргстгт.чз",- шлгло» Х'дг с ¿ru.'mpiül. Ta:t9 .техяпя глзвщ» ртагглята? сзойсл^а k-.s¿«jj/¡?cí¿5CS)..*q

6é*.of пдгсгпгч вэдат ссбя ГХ 'KouAcC^JCJjüUtíü

яеютя, г, доягкз dcarroi - кзк Гз«й1~спвщфпшгй репгент»

Ъ ra'jjt, 3- веккиш» гагзшпэ набора пзолтфоз^икк углеводов iu ' щгоаоонь прэпзратою л'зкхглоз8 обьодшйкшк в групш по сходству ещаша: зхочшяз <Р2С1!пгмеш>гс»8 грибного, бйктэряашюго прасв«-хогдашгк пет ез copeles бэеЕЗЗЕовочатх}, Из табл. 3 видно, что грзгтаргт яоктнга харягтпризуетоя -упщкшьлш спексрогл

актпвяоеть ухягзеодоз л ушашагт порлдком (рагшгрогапгам) иабогл уяяезод!» по тпе с„'яос!ггсдш>3 шгЕбирунцей ойадиисво«;*» Sro указываете одной стороэг па способность лектинов а вылвлешм toiccix различий углеводов н состава углеводсодзржздих мишепей разлзпшп: типов (что подтвох-адается дашшма о взаимодействии лектинов о модельными глнкоиротоннаш и эритроцита!®, приведёнными вше), а с другой стороны является основанием для использования комбинаций например скало-специфичных лектинов в исследовании близких по структура ' . саалогли-жошшагатов, Tai?, лечшш слизня, мечехвоста, краба и яшеющв т:-;:ю использовать а качество Ие«Ао/и?и5Ас-узнащего зонда, а лактинц улст-ки, бодаш, фаийрвй К99 и ОзЭ ккьечпой палочки - в качестве KeuSi/' ir«u5®." опэцифетного зовда< Ревхелтсп «я остатки Кюьаа imrm служак

Рис, !» Взаимодействие ол^езсиа шдай Crnaocytrilua егауьааз с глшюконъйгаташ по данным турбидгндетрпеекого анализа (опытная tsmovai 0,7 ыл адгозина с концентрацией 2 мг/мл + микробъ&з глг-кзцротоша, pli 6). A^qq= оппнаскат плотность раствора при 400 ш. Л - сродство гдгозкиа к набор/ стандартных гликопротеппов: 2- куцин подчодэстной жшэзк бака, 2- КМ-^-озсмуцкн кур» 3- фе-туш норови, 4- о5зо;,г/г.озд кур. Б « иншбкрозизю образования комплекса мегцу ад~ гозивом и «утешом иода&кзохяой яелсзц бшса: 1- шесь едгезгаа в цшш без углевода, 2- сиесь сдгез;^;а ir {$цкг«ч в присутствия 0,1 И й^лцетидяейра'лшовои кпслотп .

Рио. 2, Агглютинация гранул крахмала лектином микромицета CaphaloGporiua acrcmoaiun 257 по дгннш турбидиметрлческого анализа (оа-ггших Ivjbgtî-.: 0,7 мл оуспеязш кргдагла с А450=1,7 . Шшо. M';î4.;oo6î,Uvn декгяна» pli 7,4 ). оптическая плотность суспензия

¿¿»де кра;а.;:ла с лекгккш без угазьода (1) глп с логпгш в прп-c/ïûïbiH О,'2 ÎI ^чеж-тотасхирвнозда (2).

Табл.3. Углеводная специфичность лектотов (шгшЗцровакЕэ углеводами, ¿1)

Источники лектинов

¡Я

о и

€ 0

1 £

си

S s

? s

M s

° о

. о с с Й » а ^ ^

Ш сок\ со с>

«ч <ч<>Г пГ оГ

TS * * V *

о о с о о

5 3 1 % ё && & & 3

г-|

я о

в £

« л

р. о

гН

1 I

д.

s S Kl г

я о

о сз

ПшеницаФ • 25 200 - - - - - - -125 12 0,1 - 200 - - - - - - - 200 330 -

Зуздаа (2) 60 30 - -0,2 0,01- - _____ g - _

Ыааяк (3)- нет - - - 2 8и - - — нет - - нет нет- нет - - - - нет -

Фасоль (4) -нет 25 - 12 3 12лет 12 -t- -. - кет -

3 0,2 - - 0,4 - - - - 25 - -- - I - 40 - - 0,1 0,2- - +

4 О.Шет - 0,6-9 3 - - 3 пет -

Фузариуы(5) - -- -- -- ---- -

, Цефалоспо- __________

риум • -.— -- _- -_ - -

Разоктония(б)- ------- -нет нет-

03 I

Улитка

_ 4 2 - ■-

Слизень(8) 0,2 I - - - - -Мадии Ю0 -----Краб (9) 9 нет - - 6.6'-Креветкз(10) 50 50 - - 12 12 -Омар (II)

Лшулгос(12) 150 150нет- - - -Тахиплеус(13)0,2- - - - - -

25 0,4 - + — - - нет - нет - нет - - - - -

_ - - _ -нет иет- нет нет пот нет нет нет нот кет -

- -нет нет нет нет нет нет лет яет нет нет нет hst-

6 -- 24 - 'нет 24-- - -- -- - кет -

+-- 50 - -50 -- - -- -- - - -

+ 2+ - - -- -нет 0,4-

-0,4 нет нет нет- 50

К 99 (14) 12 ■ 7 4 3 3 3 0,6 - 0,3- -0,2 - - 0,1 - 0,2 - - - - -

Cs2 ' . (15) .33 17 - 6 .6 - -- -- - - - - нет - кет нет нет- - - - -У 17 (16) нет ------- -нет 100- нет нет нет иет нет нет нет нет нет

Бацшш " 4 2- -- -- -- ?- - 7-- - - -- -- - 75 -

1979;2-a-.it>uya e.a.-!9a?;3~fcns е.а.1928;4~ Portai е..

14-Lindsbl e.e.193?;15-3Jobers е.аЛ9С8;16-7ал Brie;

бактеркаяышй лектш К9Э в парс с ли,длиной в качестве контроля, а реагенте?,! па остатки НсиЭХс - гемагглатгнш! вируса гршша гругаш С И Л0КТШ1 краба Салсег nnbeimarivis (Еоцегп efc ol.,19Q6; Ravindrairnth et al., 1935 ). Дяя узнавачия в антеннах связанных с асларагзшом оля-госахарздов гликопротешюв концевше остатков сяаловнх кислот типа 1Г»и5лс-^2,з и ¡íeu5Ac-o(2,6 можно пркмеиятв комбинацию лектша каакил с лектшом бузшш и лектшюм йасолн (в случае лектина tto-

солц присутствие во 2-й антонне 4-х антенного олигосахарида концевого остатка Нои5Ас-ц2,б приводит к волной утрате способности. Л-ФГА реагировать О олигосахаридамл, Bierhuizen et al., 1988 )• Лектин пшеницы несколько лучие реагирует с Ifeu5¿c-ct2,3 по сравнению с цСи5Лс-«2,б . что c6jassaoT его с лектшюгл маакшг в большей степени, чем с лектином бузшш. Наоборот, коклюшный токсин обнаруживает сходство с лектшом бувтша по способности преимущественно реагировать с Иви5лс-м2,б в состава гликонротеинов { пеегзо, /irmti-ons, 1990). Однако в отношении цс-шх колокол гянкояротеинов с известной структурой глекшюв уда-иг ел улавливать тонкие различия меязду суотцгши гликопротеккамп с использованием например пары тазах еиатоспещ'^ичнъ'х лектинов кок лвктга бузит и коюгзшяий токсин С Уэвгго, Arnstrons, 1990 ). С педзгеиалопяги капсулам! бактерий избирательно реагируют многие лекаж® лдарскиг беспозвоночных, причём 'гомэполижрн лучше реагяру»? с лгзфллнеV, по сравнению с гетерополксахаридами, особенно в случае 0-аЦОТГЛКрОЕаЛГШХ ГОМУПОЛИсахардцов ( KcSweogsm, ilutóle, '1932 ).

Прэимуществом лектина бацилл как сватоспецифичного реагента является ого высокая чувствительность к остаткам опаловых кислот, осо-бэщо в отношении остатков NsuGi ; возможность получения лектина из непатогенных для человегл бактерий простым осакдонием белка из куль-туралыюй жвдкосги продуцента лектша. Преимуществом адгезина мидий íísk сЕалоспецгфгаяого зонда является его высокая избирательность к ейалоглпканем в составе гллкоконшгатов, поскольку изолированные мопо-и днеагоридн, а такае некоторые гликопротешш (см. игле) не влияли на леглиповуи активность адгезина. Не исключено, что адгезия мидий будет, подобно спалоспециФичлому лектину из моллюсков с«реа hortensia , специфически взаимодействовать со стрептококками группы "В" (togaer, 1932 ), а лектия бацилл будет, подобно KeuGl/NeuAc-специфично;.^* карцшюокорнииу, взаимодействовать с лшгополксахарвдами Грач~ стргц:-;телыцс:г бинераЯ (йэЬт efc al.» 19S2 ). Дашно по способности мддки н?,бдрагелыю щтлй®шировать Гги^отрицатйлзяшэ (по не

Гра?«~полоянтелыше) бактерии указивают на участие в связывании лектн-на бактериалышх лшюполисахаридов, нак и в случае взаимодействия лектина пз морских гребешков с бактерия!,я (Gill, Brown, 1986 ), Такш образом, препарата дэктинов бацилл и мидий в комбинации с другими сиалоспецифичяши реагентами могут использоваться для выявления тонких различий между углеводсодеряащими мигаеняг.а! (глпкопротепнамщ липополисахаридамз, полисахаридами, клетками и изолированными гликана-ми).

Кроме того, следует отметить, что лектин бацилл Bacillus aubtilia 316M является первнм очшденншл лектином из бактерий рода Bacillua , а адгезш кидай - первнм очинённым из двухстворчатых моллюсков лектином со сложной специфичностью ш специ|ткоотыо к целый молекулам гликоконъюгатов - гликопротеии&ч муцинового типа,

В табл.З сопоставлены также данные по углеводной специфичности гемагглвтинплов грибов, относящихся к фитопатогенншл ^лкрооргшшзмам. Несмотря т обгодипящую эти белки способность реагировать на присутствие галактозы, этот углевод занимает различное полояешго в ряду ингибирующей эффективности тестированных углеводов. Лектин микротщета, Cephalosporin acrenoniun 237 бнл сходон о препаратом лектнна из Rhizoctonia solani по способности агглютинировать эритроциты кролика и человека, но отличался от геглагглюгшшна гриба iFusariun ар. >; которой не атглютш.ировал эритроцита кролика (vraiüccn et al.,l93?j Köllens st а1,1989 ; Захарова и соавт., 1986). Лектин о. acremoniun 237 также отличался от леютшов базидаошщетов и ряда других грибов со сложной (олигосахаридаой) специфичностью (Musilek et в1., 1990; Лах-ОТ, 1987).

К особенностям гоглагютэтинша из кулътуралъной жидкости слизевого микромицета с. acromemium 237 относятся его способность специфично взаимодействовать с разветвлённым с<-1,4-глюканом - картофель-галл крахмалом (рис. 2) и бп'оункциональная" природа его гемагглютширу-щей. активности (рис. 3). Из рис. 2 видно, что связывание лектина гриба предотвращаюсь в присутствии 0,2 М «¿-метил-глюкозида примерно на 2/3 от исходного уровня агглютинации гранул крахмала лектином. Оказалось, что гомогеягкй по ряду критериев препарат лектина гриба характеризуется присутствием в одной молекуле не только гемагглютипи-рующей, но и '¿-галактозидазной активностей (рис. 3). Более того, как видно из рио. 3, лектин с. acremonium 237 следует рассматривать' гак поли'1;уякцповалышй оелок с различными £Й-зависи.".остя:лл в отношения

ферментативной активности по, даянам гидролиза растворит «¿-гсла»-гоэвдшсс субстратов, рассасывающей агглютшатп меток активности ir гсмагтлятшшруйцей активности. Использование широкого ряда стандарг-ншс морю-, ди- к трисахарвдоп в исследовании рх вяияшп ira всэ трл указашше вше активности лзстина гриба позволило предполоялть различную локализация участков на поверхности молекулы лектша, отвегствен-ек за проявление <-гадактозвдазной и гзмагтлзотширующей активное-аай (рис. 3). Лекгин ю культуральиой явдкостк с. acreacniua 237 является первнм описашшм в литературе микробным лектшюы с -ч-галакто-зццаолой активность». Лшз в случае висит растений был дденифаццро-ван сЬ-гдшсозо-спецнфичнкй лекткн с ¿^-галактозидазной активность^, на примере белка, из сешн кэриовнх бобов Vicia faba (Doy et al, 1932, I9G6). Следует такте отметить, что лектин ышеромяцета с. acrenoniun 33" является шрвш очпцеютш ¿-глшозо-чшецкфоттш лэктшом из не-яоворшеннпх грибов. Указошшй газо новый лектик шкрошщет-а монет иыть вереншегившм в исследовании <-гликозо-содер.?лщих г.здзкой (гликопротепиов, лппополксахарвдов, тейхоевых кислот, полисахаридов), в том числе гликоконзягатов козлиное этого гриба (растений и насоко-ышс).

Такта образом, црттдёшше выше данше о взаимодействия яовнх легл-шов из новве перспэктквищ: имочников сырья с набором модельних реагентов о известной структурой позволяют судить не только о слеця-фяадостн лектинов ¿< простым углеводам (ионо- к дисахарач, а также Гфоиэводнш коноСахаров), но и выявить особенности тонкой и сверхтонкой специфичности этих лектинов в отношении целых молекул гликоконъ-югатов (на примере стандартных глнкопротеинов) и эритроцитов разних типов иивотшх, в том числе модифицированию! ферментами клеток. Именно такой комплексный анализ специфичности лектинов к углеводам, гли-коххнаигатам и клеткам позволяет внявить различия не только мезду оходшаи лектшапи (например, относящимися к группе сналоспецифичинх), по и мездг лектинами, которые продуцируют близкородственные в таксономическом отношении вида организмов (гатактозоспециричнке лектшш грибов, сиалоспецийяшше лекткнн моллюсков или бактерий). Вашим следствием уникальности" набора углеводсодер::<а>цях мишеней для каждого из исследованиих лектинов является возможность их использования в ка-^аокзз взгашодояолчкощях зысокочувствителышх реагентов на глшеокояь-ика® (например, в отношении содершцгос сиаловые кислоты мишеней).

2. Прд^иеппо лектияовщс порбрнгол для; очистки, Разделения-Готко-

В прэдндуцем разделе было показано, что набор лектннов шкет служить оффоктквнш инструментом в исследовании тонких различай в различных утловодсодерзацях природных шшенях. В данном раздело ш использовали преимущества набора яоктшгових сорбентов для одновременного решения нескольких задач; очистки, разделения и сценки углеводной части гликоконъюгатов, главным образом па примере малоизученных угле-водсодержадпх ферментов микроорганизмов, растений и млекопитающих.

Иммсбилизозашше лектинн (лектлновне сорбентн) шеют следующие преимущества по сравнению со свободными (не иммобилизованными) и ме~ ченши лектинами в изучении гликоконъвгатов: а) возможность очистки или к'мобилизации иссладуешх гликоконшгатов с ецсокой селективностью та смеси биополимеров с различной степенью очистки, б) возможное?!, применим комбшагоовянгттч хроматографии гллшлаэншгатов на лектянових сорбентах для получения разделённых гликошгоагатов с со::-радением их биологической активности и в доходных количествах* в) возможность разделения близких по (¿изико-химическим свойствам гдикокспъ-штатов, г) возможность изучения слабых аффиштх взаимодействий глйко-конштатоз с лектшшш по дашшм задернкн элвдии исследуемых гликокон-ъюгатоз без использования углеводов в элвлррзщем буфере, д) возмом-ность модулировать активность гликоконъвгатов путём избирательного удаления из смеси ингибиторов или активаторов п процессе лектдновой хроматографии глнкоконшгатов, е) возмошгасть многократного использования п глпкоконъюгатов, и лектиновнх сорбентов. Кроме того, лектшо-вая хроматография в вариантах мини-колонок или ВЭ1Х во многих случаях не уступает моченым локтпншл по времени проведения экспресс-анализа глпкоконъюгатов п по чувствительности анализа (например при работе с ферментами).

2.1.содбедхов дтщ очдехкд и 22азделендя_щтщо- -

йонъвгатав.

Исследовали препараты глпкоконъюгатов, частично очищенных из культуралыюй жидкости бактерий и микроскопических грибов, сока полыни и плодов папайи, тканевой жидкости млекопитающих, как показало в табл. 4,

Препарата глпкозидаз полыни и грибов не разделялись гель-фильтрацией и ионообменной хроматографией, что указывало либо на близкие

Табл, 4. Очготка и разделение гликоконъюгатов на шшобилизовапных лектшах

Препараты Лектины Разделение (Р),

глакоконыэгатов выход {%), очистка (раз)

I, о£-Галактозццаза (I) Кон А Р: I и П, I и Ш,

+уЭ-г.товозидаза (П) 1а(5ВД и 1б(38<?)

+/ь- н-адетилглэкозами- I: 88$, 2 раза

нидааа (Ш) полыни ЛЧ Р: 11 п I, Г и П

АгЬет1в1а аппиа X. лп 1,П,Ш: 100$, 2 раза

2. Хитина-за/лизоцим (I) Кон А Р: 1а( 100$) и 16(41$)

ПалаЯП Саг.гса рарауа Ь. 1а: 6 раз; 16: 4 раза

3.л-Галактозвдаза (I) Кон А Р: II п I

+уь- и-ацет1кглгокоз£!мн- лп П: 100$, 33 раза

нвдаоа Ш) гриба с^рЬаХо- I: 5 раз

срог1иш есгешопАип 237 ФГА 1,11: 4 раза

4. Гемагглюткнин ^актериЕ Кон Л Удаление 60$ примесного

• ВасШиз бчШИз 316М белка

5. Экзополисахарт1ди (I) Кон А Р: 1а, 16, 1в, 1г

бактерий йМаоМит

1вБчт1позагиш

6» ЕНКаза (I) поджелудочной Кон А Р: 1а(62$) и 16(38$)

яэлезы бнка (ВЭЫХ)

7. Щелочная фосфатаза (I) Кон Л Р: 1а и 16

тюленя 16: 60$, 58 раз

лг, ЛП Р: форьф 1а

и Ж

ртсгтание Носителя,';: лектгпов слулгош агароза, г'шгозтис'-ерон иди Со^-С'^грои в случае ВЭЕХ. '¿юрка гликоконкогатов попсгпатеш: в почтдко олотш с сорбента, Смотри так:::?

••„.бв., б:, & л сгисой сок?кп:г. 1й,

ге^аилютанин

45 5,5

Рио.З. Л. Завксгаюсгь от рЗГ «¿-галактозидазной гг.тт;:;'.,стп (Аллк.Щ^лая I), рассаыг^хцей агглсишаяи активности (РАА,лж>тгвая 2 ) и Г!5!.'агг.татйк;:р7зог,ой актдшооти (ГА,кгагоая 3) локтгла чпкро.'лщоза С;.рЬа1озрог1 иЬ асггчюпЛц'л 237 I 13

Б. С-с~лп ргг/л/лви га:агтлкги1щгущей ^юяь'Лсч:: ¿остяка с. асгс^.оп1и'и 237 углоподами. ]1ушстнрпо11 ляппсГ обозначена оЗ-лс.сгь кг„тмет:г1эского целтеа .¿-юлачтазиляяг «ч?! .•¿глсгксйта.

Рис, 4 . Хрокатогра^ш . с*1 -галактозидазц (-.-.,А^ц^) ц ^-п -эдо-тидрлюкозаьшндцазц (:—«Л^) на лехегшю чочевшщ-ссфарозс.Препарат (0,3 мг) с актгвкостяш ферментов 116 п 2,3 Ед/нт соответственно. ¿280^-^: профш> элюции белка, ступенчатая элвция <■

углеводом (моляркоезь справа). Элюент: 20 гМ. На-фосфатный буфер рН 6,3 с 0,2 11 Наса.

23 зо ю

сль^а-Ш"

" - Ы1)

физико-химические свойства фармонгов (молекулярные массы, изоэлектри-ческие точки), либо ¡»а локализации активностей в одной молекуле. Ее$ сложнее разделить множественные формы одного и того ко фермента.

Препарат № I (табл. '1 ) после очистки на КМЦ и тойоперле-ни -55 включал все активности ферментов в одном пике по дашшм ВЭЖХ на ионо-обие^шике ЬЪпо Q (ррьс, Швеция), характеризовался одной белковой полосой при ЭФ в ПААГ и близкими значениями изоэлектрических точек в области рН 4,2-4,4 ( KaБгзovn. еь а1., 1985; Лахткн и соавт., 1988). р,-Глнкозидазы с близкими мол. массами (100-120 кД) и изоэлектрнчесшши •точками бистро и просто разделялись в результате аффинной хроматографии кз иммобилизованных Коя А и лектине чечетпхы (табл. 4 ). Суммарный выход активности какдой из ^-гликозидазы (кроме случая прочного связывания /!>-глюкозидазц с Кон А, смотри ниже) составлял около 100%, в том числе при хроматографии на иммобилизованном лектине пшеницы, причём доколнптельная степень очистки /Ъ-гликозидаз на этапе лектино-вого сорбента составляла 2 раза (табл.4 ). В результате хроматографии на Коя А-сорбенте ^-глюкозвдаза не только прочно с&чзыв&дась (не десорбировалась в присутствии 0,3-0,6 М .¿-метил-машюзида), но и сохраняла активность. Более того, полученный таким образом шшбшшзован-шй на лектиновом сорбенте фермент характеризовался повышенной термо-и '^-стабильностью, а его срок хранения увеличивался в 7-8 раз. Кроме того, с помощью Кон А и лектииа гороха в реащии преципитации были выявлены по две фор:и ^-галактезидазн и к-ацетилглюкозаглинидазы. По данным лактиновоЯ хроматографии обе формы /ъ-гатактозцдазн присутствуют в равных количествах (по активности). Отмечена активации и -оцетилглюкозам;шидазы в присутствии таких не осаждающих фермент лектинов как лектшы сои, арахиса и пшеницы.

Препарат № 2 (табл.4 ) после хроматографии:: на 8р -сефадексе и лдофшшзации использовали для лекишовой хроматографии. В процессе фильтрации через Кон А-сорбонг. наблюдалась активация не связывающейся о лектином формы хитиназы и достигалась 6-кратная степень её очистки. Во всех вариантах хроматографии лизоцнмиая и хитиназпая активности папайи ' очищались вместе. Связывающаяся с Ко» А-сорбентом форма лизоцима/хит лназн как и вслучае р-галактозидазн полыни десорбировалась специфичным к Кон А углеводом, что указывало на присутсвие в ферментах утлеводов (табл. 6 ).

Препарат Л 3 представлял собой ультрафильтрат культуральной здд~ коси. микромицета или предварительно очищенную на ДЭАЭ-сефадексе бел-

ковую фракции, однако характер разделения гликозндоз в зависимости от их сродсва к леетсту бил сходнш. ¿-Галактозидаза и /ъ- ^-лз;етплгл>-козашшидаза гриба о. acrcnonium 237 характеризовались близкими г:о-локулярнили массами (240-290 кД) и практически одинаковой :по-

электрнческой точкой при рЯ 4,96 (Залромётова и соавт., I9ßS), IIa Коп А-сорбенте удалось отделив р.- К-ацетилглпкозаиишщазу от г<-га-лактозидазц, на .дюгобилизованном лекткне шдеигащ - достичь 32-кратно iL очистки /5- 1кгцетилтлюкоззлшидазн на фоне активации фермента, а на иммобилизованном лектшге фасоли - 4-х-кратной очистки за очйт удаления неактивных белков (табл. 4). В случае тядобшшзованпого локтина чочеви* цц картина взаимодействия обоих ферментов гриба бшга сложной (рис. 4), Оба фермента связывались с огим лектшом, а элацин ступенчатым градиентом специфичного для этого лектина углевода шявила шюяествешшо форта ферментов, Основная часть активности ß - Н -оцетилглккозашншда-зн элюировалась в присутсттпг 40 углевода, а дти десорбции ,<-гл~ лактозидазц грпба ухе требовалась на порядок болео высокая концентрация углевода. Оба фермента в комплексе с лектином сохраняли свси ферментативную активность, причём стабильность <~гаяактозидасщ в комплексе с Кон Л значительно возрастала.

Препаратн И 4-7 представляет собой высокоочищешше форки ондо-А -1,4-глюканазы микромвцета Txiohodertaa reeaoi 0 моле1суляр1ПУ.П1 массами 56-60 кД и а? ~> ал ектрпч е с гасли точками 4,0-4,6 (табл. 5). С помсщы? хроматографии на Кон А-сорбенте разделённых гидрофобной хроматографией форм фермента удаюсь выявить дополнительную микрогатерогенпооть очищенных препаратов множественных форм фермента (рио, 5). Ступенчатая элнцвя углеводом позволила выявить в каждой из 4-х форм эндогло-каназы гриба 8-II пиков активности, причём подавляющая часть активности в виде нескольких варьирующих в зависимости от формы фермента пиков элюировалась > . присутствии 20-50 мМ углевода.

Исследовали также взаимодействие бактериальных гликоконшгатов с лектиновым сорбентом (табл. 4). В процессе хроматографии па Кон А-

сорбенте осавдёншго сульфатом аммония из культуральной жидкости в. oubtilis 316М препарата гемагглютинина (препарат Гп 4, табл. 4) удаляется значительное количество белковых примесей, в том число содержащих углевода (рис. 6). Специфическое взаимодействие гемагглвти-яика с Кон А', зависящее от присутствия углевода, указывает на глико-прогенновую природу этого бактериального гликоконъзогата. . •

Табл. 5. Углеводный состав ощдаших глзкояэягэгатов

" .тлошяютат M.t!. КД Pî Углевода, % ПО ESC7 Углеводный состав, % от суммы Сахаров

Хк-лпаза/лязоцЕМ папайи Cat"Lea papaya Ь. 28 И.О. 2,8 M (3), Гл (83), Г (9), А (I), К (4)

Гек'згглготанж фасоли сорта "Красноградояая-15Н f 'r.asecùis ' vui.3a.ri5 124 5,5 9,4 M (71), Г (3,3), К (6,6), ® (7,6), Ар (6,2), А (5,5)

^-Галактозидаза гриба 23? 240 4,55 27 И (33), Г (15), Гл (40), А (12) I го ÎO 1

'Згар-уз -1,4-гляканаза гриба TricWoJijvy«, ; форйа I форма 2 форма 3 форма 4 56 : 58 59 60 4,6 4,5 4,3 4,0 11,0 10,5 12,1 18,8 M (84), Гл (16), А (+) M (76), Гл (24), А (+) M (67), Гл (33), А (+) Ï.1 (80), Гл (20), А (+)

Гоаапазяинйк бактерий Г'-.'-ае^ь su.étciii, 316 tt ISG н.о. 10,2 M (3,9), Г (60), Гл (34), Ар (2,1)

"SnsrapBî Ir SUC бактерий "Piio&ikw^ -êgA^i-Mi-irus-n 252% !-;.ег.оч1?ая фосфатаза твденя: ff.op.va 16 50-110 260 н.о. 6 н.о. 23 M (8,8), Гл (68), Г (8,2), X (15) . M (48), Г (12), Гл (6,3), « (1,3), -д (26), Аг (6,3)

Е&ЖШй - И^мпяноза, Гл=глвкоэа, Г=гаяактоза, К=ксилоза, Ap=apa6mosa, Ф=фукоза, " ._песп.тглйкозал:;н, Аг^эдетилгалактозамгггг, Х-пеядентЕфзщгфоваппкй сахар, ЭПС=экзополи-к.о.= но определяет.

Табл. 6. БзашгадеГютвие гликоканъюгатов о ишобилизовашшми лектглшш

Глпкогсопъотаты Кон А да/лг ш ФГЛ/ЯС/Л7

Хитшаза/лтюоцгал папаИи 50 - -

у^-Галактозпдаза полшш 10 33 33 нет(М.ЛУ)

уз-Гл5зкозидаза иоянии >500 >100 нет нет(ЛК.ЛУ)

/3- №~Ацетилглю1'яза}лглидаза полши >500 зэ нет нпт(Ж,ЛУ)

д- гьЛцетилг.такоз амшидаза гриба С. асгесогЛши 237 КО 30 ззы кет С®ГА)

с^-Галактозпдаза гриба 200 200 зэ(2+; ) 33(+)(еГЛ)

С. асгегаопаип 23?

Эядо-д -1,4-глюкапаза гриба

I. гееаед.: -Герма! 30

е-Т!М 2,3 30-40

'1 40

Щелоикл фосфатаза тшекя

форма 1аа нет

форма Габ нот

форма 16 50

ЭПСЗ бактерий Н.1аЕиш1повагис:

шташ 2526 33(3+)

шташ 250а 33(2+)

штамм 2496 33 (±, )

штапм 2486 наг

шташ 2-506 33 (+ )

КО - нег(ФГА,Л7)

нет (КО) (КО с Ж) нет(ФГА,ЛУ)

Примечание Типы взаимодействий: задержка элнцпи глтпюконъюгата (33, указана степень задергай), компяе^сообразоваииа (КО) глпиоаопъ-югата о пектином, ппярнвашгв и последующая элюция глшсоконтлгата углеводом (1.Й, цнфрн в таблице), Смотри так*з табл. и список еог.-рощений.

Рис. 5. Аффинная хроматография форм эндо-/з1,4-тлгаканазк Trichoderna rcosoi на Кон А-сефарозе 4В. А= форма с pl 4,6 ,м.ы.56 кЛ; Б=

форма о pl 4,5 ,м.м.58 кД; В= форма с 4,2 ,н.м.59 кД; 3> фор?,га с pl 4,0 ,м.ы.60 кД. Э.таенг: ступенчатый градиент о^-мегил-глиношграноэпда (ояьфа-ЫГ) в 0,1 М ацетатном буфере pH 5,8 с 0,16 Мл/аС1, 2 Щ хлори-дама Ca, Ма и Мп.

------------------У ... .. AgQQ------------

12 3 1/Г

0,6 о,«, о,г

I' !.

I М

\ I 2.0

\ \

Sil us

■ - // • \ - г "w'^'böWäisbia

Рис. 6. Аффинная хроматография гемагглютиняяа Bacillus subtiiis 316М на Кон А-глякозклсферояе Б-IDOO. AggQ= оптическая плотность белка при 280 ям {—о—•) j 1/Т= разбавление Фракции, всё еще агглютинирующее зрит-1 роцити 1фолика (величина, обратная титру гомаггшотгшика) (— * —). Злэепт: трис-HCI буфер pH 8,2 с ионной силой 0,3 М с 10 м!.1 —IЛГ (i), тот же буфер с 50 Ш IT (2), буфер с 100 t.« ¿-аГ (3).

Препараты экзсполпсахаридов клубеньковых бактерий гороха КЫг,оЪ1ит 1ееил1позагиш 5 штаммов, предварительно осаэдённые пз ^суль-туралышх жидкостей сульфатом аммония (50$), характеризовались различным соотношением 4-х полисахарпдных фракций в результате хроматографии экзополисахаридов на Кон А-сорбенте (табл. 4). Наиболее высокое содер-г^гчте маннози отмечено во фракции 1г, характеризующейся максимальной задержкой элгации в процессе лектиновой хроматографии. При сравнении фракции 1г различных штаммов максимальное содержание мштозы обнаруяе-но в случае штамма 2526. Опыты по влиянию экзополисахаридов на гемаг-глютинирующую активность Кон А подтвердили максимальную ингибирутощую эффективность экзополисахаридов ытамиа 2526, причём степень ингибпро-ванпя была прямо пропорциональна относительному содер-канию мапнозы в экзополисахаридах 5 'штаэдов.

В случае гликоконъюгатов шюкспнтаюцих исследовали препараты эстераз: ИПСазу ' быка и щелочную фосфатазу (препараты й 6 и 7 в табл. 4). Хроматография на Кон А-сорбентв в варианте ВЭЕХ позволяет отделить термостабттыгло г гакозплированнуп форму-РПКазу В от неглпкозилирован-ных форм фермента. Присутствие в РНКазе В гликана олигоманнозилного ти::а обусловливало прочное связывание гликозилировашгой формы с лек-типом, дая элпции которой требовалось .-присутствие 0,1 II уксусной кислоты. Взаимодойствло щелочной фосфатазы о Кол А-сорбентом било менее с:ишгкм по сравнению с РНКазои В, поскольку дая элюцпи фермента било достаточно 50 (.¿.1 «¿-метил-ыаннозида. При этом только на этапе лектиновой хроматографии достигалась степень очистки щелочной фосфатазы в 50-60 раз. Не связцваюс шея с Кон А-сорбентом фракция щелочной фосфатазы, включала форш фермента, взаимодействующие с другими лектинами (табл. 6).

Таким образом, применение лектиновой хроматографии оказалось весьма полезным для очистки и разделений гликоконъюгатов бактер-ш, грибов, рлстений н млекопитающих. Степень очистки фермонтов в результате лектиновой хроматографии может увеличиваться в 30-60 раз, та; в случае р - н -ацетллглвкезаллнпдазы микромицета и щелочной фосфат» тазы тюленя. Набор локтиновкх сорбентов позволил разделить близкиз ко свойствам р -гжжозлдазы полыни иди гликозддазн микромицета с. асгепопхип 237 . Лектиновая хроматография позволила разделить множественные формн ферментов, как в случае гликозидаз растений (полыни и папайи), микром1;детов (с. асгетопЛит и Т. гзезэх- ), а такяе ще-

щелочкой фосфатазк галаня. Во всех случаях взаимодействия гликокопыь гатов мшсрооргаяпгиов, растений и животных с лвктщювыии сорбентами определяющим яветэтся присутствие углеводов в глшсоконмэгвтах, что подтверждается дашли по углеводному составу гликоконъюгатов (табл,

5). Результата локтдаовой хроматографии доказываю'»' не только прпсут-. СТВ1Ш углеводов в глвиоконъюгатах (например в ^-глшюзздазах полыни и гемазтлотднине в» aubtllin 516Н ), но и позволяют судить-оо' особенностях Структуры гликанов. в гллкокон'ысгатах.

дектдаозйй^хнумадо^афм.

Исследование содержания углеводов и ^¿ладвч'шого состава очищенных препаратов гликокотакгатов микроэрг&'шзшв, т/лстсний и животного (табл.5 ), дашше.декшговой жроыатографкп глшгокоятягатоа (табл.4 ,

6), знание специфичности лектинов а слошшм по структуре глькшам

й анализ, литера-эдадо: данных: о структуре глихаков гликоконь-югатов ийхроорганпзмов, растений z шгоотншс позволили предпшккигаь присутствие в исследованных наш гликокошиет-тах р.;-,а углеводных структур, указанных в табл. 7 .

С труктурцолпго мак позади ого типа.

Относительно высокое содержанка шянозы в препаратах фэргл зндо--1,4-гдюканагы т• reesei, «¡.-галакгозгщази о, aoreœoaiuji 237 , щелочной фосфадазы тюленя и дентина фасоли - мар{сбрногэ белка с известным набором олигосахаридов (табл. 5 ) указывает на крвсутомше гликанов олигомарноэддиого типа. Брочкое связывание РЖазы В - маркерного белка с единственным гллкадш олигоманнозиднсго тша, ^-глюкозвдазы и ft - и-ацотилглшозашнвдазц полыни, ес-галактозидазн о. acremoaium 23? (табл.6 ) подтверждает присутствие в гликопротеянах доступных для лектила гликапоз блигоманнозидного типа. Известно, что глюкозшщрова-нио гликанов этого типа не устраняет связывание с лектиноы, а включение бисектированного остатка м-аг.етшготкоз&мина приводах к ослаблению связывания с Кон А, как'ото было описано в случае глико-протеиков слизевика Hctyostelium diacoideum и бобового растения Caaavalia enaiformio (Van Halbaek et si., 1937} Sturm, ChriapaslE, 1987). Возможно, последнее обстоятельство объясняет относительно .низкое сродство гликанов олитоманиозпдного типа эндо-у«,-1,4-глшаназы т. reesei.. Кроме того, структуры олигоыаннозндного тша могут быть экранированы расположенными рядом глшшами комплексного типа, Прксут-, сгвие дополнительных гликанов комплексного типа приводит к возрастанию

Табл. 7. Структура углеводной части гликоконъпгатсв

Структуры

Исследованные гликоконтюгаты

"А -А«

С-Г-Ач^ 3; А'-А- -А.-АС1Г

гР?ТАЫ {Ь)

ЭндО-уъ-1,4-глшаназа гриба т. гвево!, ос-галактозидаза гриба о. осго»ои1шп 237, гемагглютннин йзасоля, ^-глпкозидаза и /} - и-ацетилглакоза1Яшгагаза полыни, щелочная фосфатаза тюленя, РНКаза быка

Щелочная фосфатаз& тюленя Щелочная фосфатаза тюленя

(С-Г-А У

С-Т-А ДК

ЬУ"]

1.1-А -А\-Асн Щелочная Фосйатаза.трлеия

Ъ)

5- [Ш^ -^-ЛСН («) ф

-А^-Асн

(Г-А )-!

-А^-Асн

ДГЙ Ф

8- (Н -лгАсн

10. [(С) -Г-Аг-С ер/Трс|„

11, Разветвлённый «к-глпкаи

Срязашт'о с аспараги-ном хмпкгни

Галактоу.алнани с то «-г.анпоппралозидпи:.?!! • остатками в точках ветвления

^_и-Ацот5щглюкозшя1Н55даза и с<-галакто~ зидаза гриба о. асгетоп1ит 237

ос-ГалактоэпдЕза и и -адетилглгжозамд-шдаза гриба с. асгецопхип 237

Гемагглвт'даш фасоли

/3--Галактоз ддаз а и л-а -ацэтилглшюзами-нидаза полили

Хитиназа/лизоцим папайи

Щелочная фосфатаза толеня : Хитиназз/лизоцим папайи

Гемагглютипш бактерий в. виЪ«Из 316И

0П2 бактерий 1оеипЛпо oai-.ua 2.525

1ЕШ£ШШ£ В скобках указана углевода, которые могут отсутствовать а глнкак.и-% Об с? начеши! углеводов как-в табл. 5 , С» сягловат г''сло':'эг Асн- асчратин, Сор/Трс-= сери?/

степени тликозшшровании гликопротеша и моает служить причиной снн-некия сродства к Коя А (связывание биантеняых гликанов комплексного типа с лектшюи менее прочно, чем связывание гликанов олигокашозцц-кого типа) или устранения связывания с Кон А (в случае полиантенных гликанов комплексного типа). Экранирование гликанов олщюманнозодного типа биантенными гликанами комплексного типа продемонстрировано в случав лектина фасоли (Paye et al., 198S; Sfcura, Chriapeela, 1935 ). Эмалирование глпкаков олигомашгозидного типа гликанаии комплексного типа, по-видимому, имеет место и в случае щелочной фосфатазы тюленя (см. ниже). В целом, присутствие доступных лектину гликанов олигоман-нозпдного типа приводит к спевшею выхода гликопротоинов в условиях кх десорбции углеводом, однако способствует прочной иммобилизации формекта па Кон А-сорбенте.

Структуры комплексного типа.

Глнкаш гликоиротеинов с низким сродством к Кон А-сорбенгу (случаи десорбции гликоиротеинов при концентрациях углевода 100 м!Л и менее, см. табл. G) представляют собой бнантенные структуры типов 2 и 5 или редуцировашшс биантешше структуры типов 7 и 8, независимо от присутствия или отсутствия фукозн, а Tárate независимо от тпиа углеводных остатков на концах обоих антенн (табл. 7). На присутствие гликанов комплексного типа в исследованных гликопроге-инах указывают также данные по их углеводному составу, включающему маннозу, галактозу; ( N-ацетил)глюкозами!! и ксилозу (в случае растительных гликоиротеинов); как показано в табл. 5. Редукция части антенн-©структурах типов 5-9 (табл. 7) возможна из-за присутствия эндогенных yj'-галактозидазы и /ь-н-ацетилглюкозаминидазы, например в препаратах № 1-4 (табл. 4j. Фукозюшрование остатков н -ецетилгликозамина, примыкающего к аспарагину, и остатков Н-ацетилглюкозамина в составе антенн гликанов комплексного, типа является важшф! условием их взаимодействия с лектинами чечевицы и гороха (Та^еЬа е.а..Д<Б1"). В то же время йуко-зилировшше остатков H -ацетилглшкозамина в антеннах должно препятствовать редукции антенн за счёт действия эндогенной /$ - n-ацетилглп-козаминидазы. Таким образом, фукозшированные гликаны комплексного типа,'как показано"втабл.7, могут присутствовать в исследованных гли-копротеинах животного, грибного и растительного происхождения, В то же время прямое определение некоторых минорных компонентов гликанов (в том числе фукозы) и сиаловой хсислоты в антеннах гликанов газо-жид-

костной хроматографией затруднено из-за их разрушения в процессе гидролиза в условиях кислой средн (Евтушенко, Оводов, 1984). Лек-тшовий анализ не только позволяет учитывать вклад определенных утле-еодных остатков в гликанах комплексного типа глпкопротеияов во взапто-дойствие с набором лектиновых зондов, но и"указывает на локализацию углеводов в глшеанах л тип связи углеводных остатков (например фугазы или сиаловой кислоты).

Если фукозшшрование гликанов следуот го данных по взаимодействии гликопротеинов с лектинами чечевицы и гороха, то взаимодействую гликопротеинов с другими лектинами приводит к дополнительным ограничениям, накладываемым на структура гликанов комплексного типа.

Так, реагирующая с Кон А (Кон А+) форма щелочной фосфатазы кп-шечкика тюленя и десорбирующаяся с Кен А-сорбента при относительно низких концентрациях углевода (50 ыМ) включает биантешше гликага/, а не связывающиеся о лектином (Кон А") формы щелочной фосфатазы включают три- и тетраантенные гликаны (структуры 2 и 3, табл. 7). Выраженная способность к связыванию форм Кон А"1" и Кон А" с лектином пшеницы указывает на сжишрование структур 2 и 3. Экранирование остатков галактозы в поляантенных гликанах сиаловой кислотой подтверждается отсутствием взаимодействия щелочной фосфатазы с лейкоагглютишрующей формой лектина фасоли, а также слабо выраженной взаимодействие глика-протеина с лектином клещевины. По данным углеводного состава субьеди-ница фермента (70 кД) содержала 4-6 связанных с аспарагином гликанов, причём бисектировагшые остатки н -здетилглюкозамина в гликанах, по-видимому, отсутствуют. Вероятная высокая степень сиалировашюсти гликанов комплексного типа и выраженное фукозшшрование гликанов щелочной фосфатазы из тонкого киаечника тюленей месячного возраста объясняется, видимо, распространённостью сиалированных и фукозилированных гликопротеинов в развивающихся тканях,. ' а такте сходством

щелочной фосфатазы с сиалоформаш щелочной фосфатазы плаценты человека или матки беременных мышей (Murdoch et га.,1986). Кроме того, присутствие фукозы в гликанах щелочной фосфатазы вакно для попадания . тканевых форм фермента в кровь (Konoda,Kltnsato, 1988). Взаимодействие изолированных гликанов комплексного типа и форм щелочной фосфатами ткани млекопитающего с набором лектиновых сорбентов было сходпым и отражало доступность гликанов с определённой структурой на поверх-_ ности молекул фермента дая связывания с лектинаиЬ (Zhao Xi, Chen Hui-11, 1990).

Малоисследованными остаются в настоящее время гликаны низших и висаих раотеггш^ в «ад-число в составе раотигельншс гликопротеинов ( Гсуо ot el., I98S| Ltrler, 1991). Отличительной чертой гликанов комплексного типа гликопротеинов растений является присутствие бизсло-тцрованкпА остатков ксшюзы вместо бисектировачных остатке» К-ацетпл-глюкозамша в случае гликопротеинов млекопитающих. При этом ксилоза хорошо выявляется по дашшм газо-шуц;остной хроматографии (табл. 5). йукоззгёироЕаккые глшсапы комплексного типа (см. табл.7 ) с выраженным о родством к лектинам чечеышд и гороха обнарунеяы не только в глико-протоппах млекопитающих, по и в гликопротекпах растений, хотя в последнем случае ошгоагд.лгшь аспалпроваяняо глпшни шт маканы с частично радуцпрсванпшя антеннами ( Tfje et al., 1989), Таким образен, ооть все основания щжлешть лэктшовий анализ п душ выявления особеияосто:; олпгоссхарпдпой структуры связаишк с аспарагшом гликанов гликопротеинов растит ольной природы (из шенпгс и низпкх растений).

В случае /¿-гатактозкдазы полыни в реакции количественной преципитации лекткп гороха осаждал фермент вдвое» менее эффективно по сравнении с Кон A. So г.: Коп А примерно в одинаковой степени осаздал д-Х'ашктозцдазу и д- и-ацетилглюкозаминвдазу полыни, однако осадочный комплекс локтина гороха с го- К-оцетклглюкозамппидазой характеризовался вдвое большей активностью но сравнению с действием Коп А на отот фериелг с примерно в 4 раза более высокой активностью по сгавне-юи' с осадочным комплексом лектшш гороха с ^j-галактозидазой. Другие способные реагировать с аспарапш-евязашшш гликанамк лектшш (из шеншш и клещевпиы) практически не образовывали активных процшш-татов с обоими ферментами. В экспериментах с локтиновыш сорбентами наблюдалось непрочное связывание ^-гагактозидазы с Кон А одной формы (десорбция в присутствии 0,01 Ы углевода) или задержка элюции другой форш (Кон А-). При хроматографии на иммобилизованном лектшю чечевицы наблюдалась отчетливая задорака элпцип гёж # -гаж' .-.тозпдоуи, так и у4- и-ацетилглюкозамшшдазы. Следует подчеркнуть, что задержка £|Люцпч растительных глнкопротешюв в процессе хроматографии на сорбел--тй с лектюшм чечевицы шш лектином гороха обусловлена фукопллирова--шгсм гликанов комплексного типа ( Faye eb ol., 1986), Таким образом, данные по взаимодействия лектинов с гликозпдазами полыни указывают на присутствие в ню: биактешшх фукозилированных гликанов или гликанов о редуцированными антеннами (структуры типа 0, табл. 7).

Присутствия в углеводном составе гомогенного препарата лизоци-ма/хитиназы из латекса плодов папайя ксилозн, галактозы, магнгозц и и -ацотилглюкозашша указывает па присутствие глнкаяа комплексного типа (структура 9 табл. 7), сходного с глшаноы бромелакпа - фермента из сока ананаса (i3hihnra et al., 1979). Углеводная часть лл-зоцша/хитиназы папайи нами исследована впервне.

Данные углеводпого состава лектина фасоли сорта "Краскоградская-15" такхе указывают на присутствие гликанов комплексного типа (табл. 5), обусловливающих взаимодействие с Кон A-сорбентом л мсздпх структуру типа 7 (табл. 7), сходную с описанными ранее глпканами лектшов фасоли других сортов (Poje et al., IS86; SturaJ Chricpeela, 1986).

Лектиновый анализ был применен татае и для оцошу структуры гля-канов комплексного 'типа гликопротешюв из культуральной жидкости-мшс-ромицета 0. ocrenonium 237. «¿-Галактозвдаза н д- Н -ацетияглю-козампыздаза гриба проявляли высокое сродство к сорбечту с локтином чечевицы (рис. 4;. Сложный характер элицни обоих ферментов указывает но только на присутсвиэ фукозилироваяных глшеанов, но и на их мпкро-готсрогояпость по содержанию фукозы в глякачах и по локализации останов фукозы в бп- и поллантешшх гликанах (структуры типов 5 и 6, табл. 7). На присутствие гликанов хюг^плексного типа в £<-галактози-дазе гриба указывает и анализ углеводного состага фермента (табл. 3), На присутствие аспарагин-связанннх гликанов в ферментах указывает также данные по взаимодействию с лектинсм пшеницы, лектипом фасоли и Кон А. На полиантеняый характер гликанов указывают задоряка элюции o¿-галактозидазн на иммобилизованном лектине фасоли (антешщ с концевыми остатками галактозы) и задержка элвдпи обоих ферментов на йммобд-ли^ованпом лектине пшеницы. Возможно, что молекулы ^-галактозпдззи с биантошшми доступными для Коя А гликаяамн элшруятся в первую очередь с Кои A-сорбента в присутствии углевода, а часть молекул фермента с доступными дая Кок А глнкаяа',га олигоманкозвдного типа остаптсл иммобилизованными на лектиновом сорбеяте, что приводит к частотному снижении выхода «^-галактозидазы в процессе лектиновой хроматографии.' Хотя структура гликанов гликопротепнов микромицетов прак-

тически не исследована, данные углеводного состава указывает На присутствие гликанов комплексного типа в ¿-галактозидазо Blctycctjlivr 'iiocoideiia и Acpergillus tanarii ( Kilpsfcrlel:, Stirlins, 19705 1204), а ТСХГ.С 3 p-ií-'ггз^'т-^опа'сгттгг-э „rtaioilliun Г ^С^ЩУО 'lí-cr ^ «Х* -"

Jfosaan, 19SO).

Прочие г л и-к а н ы в гликонро теинах.

' Аспарагнн-связанные глшсаны полилактозаминного типа со сродством к лектинам обычно обнаруживаются лишь в аномальных гликопро-

тепнах гшвотноых, нацршор при злокачественных заболеваниях. Б составе щелочной фосфатазы из различных нормальных тканей млекопитающих глика-пы полилактозаминного типа не выявлены. Однако аспарагш-связанные глнкаш гибридного типа со сродством к-лшсмту пшеницы ыогу^

встречаться в щелочной фоофатазе, как это имеет место в случае некоторых форм фермента человека (Konodr.,»'.ttat.iito, IS83). Одинаково высокгй процент свстыванин активности суммарного препарата щелочной фосфатазы юшочника тюленя и формн фердэнта Кон А" с иммобилизованным лектшгам пшеницы' (75-77J?) указывает на присутствие в суммарном препарате, помимо скопированных гликанов комплексного типа, ещё других' гликанов с высоким сродство;.", к ялхтану шенпцы. Еозмохсно4 что это структуры гибридного типа (структуры й 4, таб.т, 7).

Связанные , с серином или треонином через остатки И -ацетилгалак-. тозамина глшсаны, по-видимому, присутствуют в составе щелочной фосфатазы кишечника тюленя, поскольку (и -ацетил)галактозамин выявляется по данным углеводного состава фермента (табл.5 ). Однако остатки и -ацетилгалактозамкка в таких глшкнах, видимо, маскированы друтыли углеводами (отсутствие связывания фермента с иммобилизованным лектшо; улитки), причём концевыми остатками в тликанах могут быть остатки галактозы (частичное связывание фермента с иммобилизованным лектином ion щевины) пли сналовой кислоты (структуры типа 10, табл.7 ).

Помимо вероятного присутствия в хитиназе/лизоциме nanai'ni глика-. на комплексного типа (табл. 7), в составе ферлента присутствует также глюкан (табл. 5 ). Обратимое связывание формы фермента Кон ¡& с Кон А-сорбентом (десорбция в присутствии 50 мМ углевода) указывает па разве1 влШшую природу (¿-глюкана nanaiin в составе фермента, поскольку лине: ные «с-глюканы 'плохо взаимодействуют с • Кон А

(Kennedy, Rosevear, 1973; Colonna et al., 19S5; Goldstein, Hayes,1986

Специфическое взаимодействие гемагглютинина из культуральной жидкости в. subtilis 316М с Кон А-сорбентом (рис. 6) указыв;

ет на участие во взаимодействии бактериальных гликанов с углеводным составом, отличающимся от состава прочих исследовшшых гликопрот шюв (табл. 5). Есть основание полагать, что бактериальные гликшш

свлзаш с аспараишом б&тша, глк эхо имеет моста d случао глнкопротси-На бацилл другого вида Ercillun ct»arotl\*rœop!iiluu (T-fann-natic! ot al, 198?). В последнем случае бил обнаруяон нглбычнь'З глякан, связанный с остапсага асгаратта черта оллгосахарвд рамнозк.

Кроме описанных илле вероятных структур гликопротеилов млекопп-такщигг, низших л тпсших pacremii, бактерий, лектиновю} анализ был пс-пользован для оценка структура поллсахарядсодераздах фракций гллпоконг-лгатов клубеньковых бактерий. В работо использовали сочотаиио свободного (не вя.'.обилизовапкого) Кон А и Кон Л-еорбента в качество машгозо-специфичных реагентов. Содертлию машози в очигдегагых из культуркшюй жидкости Ehizobiun legu-ninosarun экзополпсахарвдап составляло 3,7% (шт. 2526), 1,6-1,3;? (штшя.и 2406 и-250а), 0,5-0,3;? (пггамш 2496 и 2486), Степень задзршш элизии экзополнсахаридоз в процессе их хроматографии на Кон А-сорбспте возрастала пар?ллелъяо с ростом содержания мгянози в них (табл. б), а наиболее сильно задерзшсаюп;аяся фракция эпзополисахарнда i:t. 2536 (фракция Ir иди 4-я фргладат по ходу элгадал, 7:16л. 4) лклэтала мокоичалзлоо количество гачпезн (8,8$), Зйяктшззссть зкзолслисахаридоз указанию: сшяе гатаммоэ клубеньковых бактерий в реакции ингибирования гоиагглотншгрунщей с-ктазпсстн Кен !• возрастала параллольно с возрастанием содержания.мишозн в полтоахарздеодеркащчх гликоконыогатах. Исходя пз специфичности Кон А можно заклинить, что остатки oi-маннозн расположены в местах вежепич fc'.neft глг:шноа багг-терий.

Приведенные выше результаты по применению набора лектпговых сорбентов в исследовании г.тикоконъигатов микроорганизмов (бактерий и грп-бов), высших растений и млекопитающих демонстрируют принципиальную ' возможность одновременного достижения нескольких целей в процессе лек-TiiHOBOii хроматографии: выбор лектина, -дающаго максимальную степень очистки гликоконъигага; выбор лектила, позвоапгщ/iro разделить близкие по свойства!.! глпямгонкогага; по.чучошгэ активного иммобилизованного на лектиноком сорбенте (фермента с одновременной ого очлеткей;тстаддартя-зацш препарата гликоконшгата по числу ого форм с варьирующим сродством к набору лектинов (получение термостабплышх устойчивых к протвозам форм с различной способностью реагировать с роцепторннмй лектинами кяп-ренса, хоминга или кишаридентализащш в оргайеллн), что является веяным дта последующего структурного анализа гяихаиов; окспресс-оценка особенностеЛ стру! rjpu глканов тестируемого глжокогг-т>тагп.

3. Исолеловирге глпкоконмогатов поветщоотп миктоопганизг.'ов с по-fiOi'JbP нативннх лектинов. -

• В предыдущих разделах работы была обосновала возможность использования лектинов в исследовании слошшх гликанов в составе различных типов природных углеводсодеркащих мишеней, а также был применён набор лектинов в исследовании изолированных гликоконъюгатов различного происхождения, в том числе из микроорганизмов.

В данном разделе лектины были использованы в исследовании связанных с поверхностью микроорганизмов гликоконъюгатов. Как известно, меченые лектины уже давно нашли широкое применение в изучении грибов И бактерий (Королёв , 197В; Pistole, -1981 j Boyle, Keller, 198%; Антошк и соавт,1937; Slifkin, Doyle, 1990). Однако модификация лектинов метками может приводить не только к снижению биологической активности лектинов, но и к появлению неспецифического связывания лекти-яа. С другой стороны, нативпые (не тчзные) лектины зарекомендовали себя как высокочувствительные к клеткам реагенты, например для идентификации и разделения клоток 1фови. Однако используемые методы агглютинации- клеток-■ лектинами являются полуколичественными и требуют какого-либо цветного индикатора для учёта реакции (например распространенный метод гемагглютинации в планшетах ддя иммунологических реакций). Лишь в последнее время появились количественные высокочувствительные методы применения лектинов; проявляемых в сложных схемах обработок исследуемых клеток и мембран не микробной природа, в планшетах для иммуноферментного анализа ( Kartiiiod, 1985? Gaveriaux, boor, 1987; Hendriks et al., 1937).

В исследовании микроорганизмов с помощью нативкых лектинов ш разработали и апробировати два высокочувствительных метода микроанализа, включающих: I) регистрацию и сравнение кинетики агглютинащш клеток лектином по данным турбвдшдетрил в видимо^ области спектра, 2) Визуализацию и регистрацию интенсивности флуоресценции микроорганизмов на предметных стеклах в результате проявления связавшихся с клетками лектинов с помощью иммуного "сэндвича", юченного фяуорохромом. Оба метода экспресс-анализа гликоконъюгатов поверхности микроорганизмов позволяют исследовать сродство лектинов (до 'I ыМ в качестве рабочей концентрации) к клеткам в суспензиях или мазках, а такке выявлять зоны поваленного сродства к лектияам на глоточной потюрхяостп.

3.1.

допью декгднового ттзх5ЕД1?.©гдтг2ескогй Д^ДДНЗд.

Как видно из прододудих разделов, использование турбидкметрпчес-того анализа взаимодействия лектииов с иолпсахарцщшмп частицами (гра--1уламп крахмала) пли изолированными глккояротеиначи позволяет уне в точение 5-15 минут регистрации'кинетики агглютинации частиц или преципитации гликокоиыогатов в видимой области спектра обнаруяить-количественно различия, в зависимости от условий эксперимента (рис. I, 2). Гурбвдиметряческпй анализ агглютинации стенок микрококка лектином. является внеокопнфоркативннм процессом (Жулин и соавт., 1984), причем ■летод позволяет выявлять бифазныи характер (стадию агглютинации и последующее расщепление) взаимодействия растительного лизоцима с бактериальным; стенками (Лахт;га, Костанова, 1985). Хотя турбидиметр'лческий метод анализа бил оптимизирован в случае изучения взаимодействия растительных лектгаюв со стафиллококоми, аэосшгриллачл (Еулин, Щоголев, 1289) и дроааамя родов ЕассЬаготусеа, Упгге»/1а (Пеяя1й8 еЬ о1., 1935; Р1олш1пс I.,?1езгатв С., 1938 , <390, дашшо в отношении клеток мив-рсмицотоз отсутствуют.

Объектом исследования служили суспензии .'.гифокедэтов разных видов. Конидии, взятые в стационарной фазе роста грибов, образовывали устойчивые суспензии по данным турбидп\:етр;ш при 573 нм. В качество агглютинина был выбран лэктин чечевицы, характеризуемся высоким сродством к глякопротешам шкромицета (см. предыдущий раздел работа) и троявлящни специфичность к фукозияировачным гликанач (см. табл. 7.). Зстатки ;?е фукозы но только входят в состав гликоконъюгатов поверхности грибов в качество шторного гомионента, но и могут быть экспонированы 1а поверхности клеток мпкремицетов ( виЛИоЬ оЬ аХ., 1Ь30).

Результаты сравнения кинетики агглютинация локтпюм чечевицы ко-зцдий трех штаммов рода 'ГгШю^гша по дашш гурЬидплетрического ытг-1иза при 578 нм в стандартных условиях эксперимента (суспензии клеток з оптической плотностью 0,75 щл'. 578 ни, тсрмостатированпе оптической :иветы при 25°С, 0,1 ?,1 фос^атнкП буферу концентрация лектина - 2,5 х М) показаны на рис. 7. Видно, что регистрация кинетики агглюти-1ации глоток микромицетов позволяет различать вида грибов в пределах ?ода (?. и т. 1опв1Ъгас)|1^1И1) и итаммц гриба в пределах вида

¡0?. г'- - гг дн 9<ич- и т. гвез;! щ ). Очевидно, что более вгзокая спел/. ;ц чтятотабелык л-и ».четок микремтаетов об/слов'гона более высокой

степенью экспошфоешшост»: (доступности швшга агентам) спещфкесхш реагирующих с лектнеом чечгвпш глпглкопъюгатоь, поскольку присутствие 20 кМ углевода устраняло шлтатшкруюцую активность ллктша. в отношенш: любого ш указанных вше штаммов шшромщетсз, относящееся к несовершенным грибам. Тахкди эксионироватшкли структурами могут бить глнканы комплексного тпка с одпш или несколькими остатками фукозы со связями (.{-1,6(3), присоодпнэшшмл к остаткам И-ацетилглюкозамшш в антеннах и примыкающей к оспарагпну области олигосахар^дсв глпкопротешов песо-сершэннохх) гриба (структур! Б ц 6 в табл.7). ЭкраньтюЕгшие таких фу-козшшровашшх гликанов структурами клеточкой стенка наименее должно быть выракеяо в случае г. З-опвПэгасЬггиЬил , дефектного в отношении присутствия нормальной клеточной стенки.

Рио.' 7. Кинетика агглютинации конидий ышеромицетов рода Гг3.сЬо<1епаа лектином чечевицы} I - Л. мозе! <1М , 2 - Т. геезе! И7 3 - т. 1опе1ЪгасЫаЪ\ш . Условия опыта: суспензии клеток с оптической плотностью А^уц=0,75 (длина оптического пути - I см)1 терлбетатирование суспензий в 0,1 М фосфатном буфере при 25°С (саморегистрирующий спектрофотометр Ввсктаа у США), конечная концентрация лектнна в суспензии клеток - 2,5 х 10~' 1,1 (исходный раствор лектнна о концентрацией 5 мг/мл).

Из приведённых на рис, 7 данных видно, что отчётливые различия агглютинабелъности' конидий микромицета лектином наблюдаются уже через I мин после добавления лектина в суспензию (при сравнении разных видоз гриба) или через .5 глин (при сравнении штаммов одного и того ке вида). Поскольку результаты хорошо воспроизводились, данный экспресс-анализ является перспективным для выявления таксономических различий грибов.

/ г з ч .1 ми»

ИЗЖЗЬН ДОВГягаРд. ПВЗРШРПК Е^датаЛРШгЕс:!",* ««Шли ЗЙЕЧ»-

Работа по разработке гысокочувст]?!;"' .-итого простого экспресс-метода лсктпнового анализа микроорганизмов, позволяющего локализовать миста связывания лэктпксв с глипоконьгагатами микробных клеток, была начата в 1982 году. В работе были использованы собственные- препараты лектинов пшеницы и фасоли (см. Материалы п методы), а такие высоко-очищенный прзпарат Кон А, лзбсзно предоставлекшй профессором Орапцом (Горлш). Для проявления свяяапзпхсл с казкамп микроорганизмов на предметных стоглах лектинов использовали полученные наг,я антилектлно-г:-;о кролггчьи з.'мтксгс.обуллнн G , а тате универсальный проявитель -мочопые 'Л^уоресцвЕКкзотпоцпанатш (СИТИгм) антияролитаи пммуноглобу-лкнн G осла производства Н1ЕШ Л."И СССР (Москва).

Выбранные ркЗочио концентрата; лектгаюв (1 х 10"^ М) в фосфатпо-с~лст)с:я буфэре (СХ) с pit 7,2-7,4 были достаточны дтя получения itap— т:л связывания лонтн::оз. наблюдаемых и при более высоких копцснтрацп-я: лектинов. Обработки,мазков в последовательности: лекгин, кроличьи антитела, оелинт антлтела-проводили по 30 минут для кадцого этапа поме предварительного оказания несвязщпегося реагента с помощью ICB при комнатной температуре. Коятрояями служили варианты обработок мазков, указанные в табл. 9 . В качестве ингибиторов связывания Кон А, лектина пшеницы и локтина Засоли использовали 0,2 М к-метилманнозвд, К -ацетилглюкозамин и Я -ацотилгалактозамют соответственно.

Основные результаты по визуализации микроорганизмов с помощью нативных лектинов показаны в табл. 8. Видно, что перечень исследованных микроорганизмов включает как сильно различающиеся в таксономическом плане' микробы, так и близкородственные группы, виды и штаммы микроорганизмов. '

Кая видно лз табл. 8, с помощью лектинов была достигнута визуализация ряккетсий, спирохет, пнтеробактерий, клубеньковых бактерий, .Bacillus anfrhracia, Brucella abortus, Helmlnthosporiun aativum, видов родов Candida и Chlorella. Однако перечисленные микроорганизмы различались как пс сродству к каядому та лектинов,, так и по локализации (¡¡луоресцояцгьг, особенно в скучав зуглпиотов. Реккотсия Cbxiella burnetii обладали высоки:,! сродстве?? к локтягу •Saoo.'ni, а клетки £higalia soansi, Eaolllna глГитес1с„ Тг^г.с-лс:-,-. pollldun, Етисе11г>.

Tadч, 8. СвяЕдагшга лектияов о шкрооргализшлк во даниш иепрядай шлунофлуоресдепцзш

Шифо.органш^'

ТЫ-) ЛП ФГА Кок ¿

дарено ProcorjotiSj отдел Гаcteribpfcjtai

Ш>ХУда>Х! Piciötfcaialss, семейство Riciiattsiacsao

CosioHs buraotii Ii-t'A « 3-:- 4:- 3*

ПОГАДОК Crílt'0úi!cet'ax¿ss oeuofissso Cjlrcckzcteoaae Егородесз. pallidea I.ldiole « Я* ...

B0Í«W>K Subaetocialee, СК£ЗйСД>0 EabsKotücteriaccr. Ealaoaolla tjpUl - 3+ -t S-£

le. pasa-bynht t„ 210 » 3+

SiiluoauHa pEi'atreiii 3* 3+

b^icclla oormoi 5035 - 4+ 4+

оелзззтао FMicbiacaao

Chizabiuia phasaoli 632 - 2 t- 2i

PJiizobiun pfcacsoli 6S9 ... ■r £+ Zi-

Hii sshiua рЬалеоИ 639-i' ■ 3-s- 2*

Hiteabiun ceiiloti 35' KJceEKi" - 2+ 3+ -f

ШЮуй! „ 4 t-' + 2+

Rhizobiun japonic um _ ■f 2+ 2 t-

бактерпл с неясным таксономическим положением

Eruoella sbärtus 19 К. - 2+ -t- +

семейство Baoillaceae CS

Bacillus antliracis C'TIi ■fr -! 4+

царево Eiicaryotae, ОТДЗЛ fö-ccta ЩШ.СОjiEConjcQtres, порядок Endomjcetales семейство Scccharomycofcaceae

~ 39 U

Птигол-чочиа т?бл. Я

Candida maltсва, ШБ-774: ,fii ' ¿od £

зрелые почкп + капсулы 2+ 3+ 3+-

шлодые почки + капсулы 2+' 2+ 2+

контакты меяду почками 4+ + +

Candida, salmonicola» Э2&-779;.

зрелые почка + капсулы 3+ 3+ 4t

молодые почки + капсулы 2+ 2+ 2+ •

контакты мепду почками 2+ 2+

класс Fuagi iaperfeofci, ПОРЯДОК Ityphomyc stales.

Helmlnthosporium sativum !

верхушки и перегородки гиф 4+ - -

боковые стенки гиф и 3+

слизевые капсулы . - 4t 3+

споры - - ,

отдал ' Chlorophyta, класс Protoeoccophjcaisa

порядок Chlcrococoales

Chlorella pyrenoidasa 82

капсула + зрелые клетки - 3+

капсулы + шлодые клетки - + +

Chlorella vulgaris С-457

капсулы + зрелые клетки - . 4*

капсулы + молодые клетки - ' + +

Интенсивпость флуоресценции (по 4-х гфестовой шкале) сопоставлена с окраской Но Граму (Г+/Г-) в случае прокариотов. В таблицу не включены микроорганизмы, которые не визуализируются указанными лвктянами. Таксономическое положение прокариотов - по Определи-, телп Берги (!.!.: Мир, 1980), а эукариотов - в соответствии' с изданием 2иэнь растений, Т.2 и Т.З (М, $ Проо-зещэнкз,' 1976 И 19 77 годы).

Табл. 5

Количественная оценка интонспвпости п.:муяойлуоресцеЕциз: исцелит гриба, обработанного локтином хагапздн

Варианты ■ Интенсивность глуоресденцпи

обработок _ Е0 Р2.3К0СТИ мапду по разности мо^ду

мазков _ объектом и фонол варизяжвя обработок

А 650 + Кб

Б 150 + 57 А-Б: 500 + 175 (+)

3 ПО - 51 /-Б: 550 ^ 173 (+)

• Г 47 ^ 23 А-Г: 603 + 16В (+)

|Го??.«счзрчз Последовательность обработок кзцеяйп А- лектгп, кролгчьа *» антитела к лзктпку, аятгяролячзи оашше тздуногяобуашнн (меченппе ФИТЦсм); Б- локтип с углеводом, далее как в "А"; В- как в "Б", по бзз .тэктпка с углеводом; Г- как в "В", но без пролечые антител. (+) отатпстгчеет доатоверкгэ различия (р <0,01).

abortus - повышенным сродством к лекткну пшеницы. Слпзевыо капсулы клубеньковых бактерий Rhizobiun melilota характеризовались максимальным сродством к лектину теттцц, в то время кал саг,ni клетки лучше связывались с лектином фасоли, Лектин фасоли хорошо реагировал и с клубеньковыми бактериями л. phnseoli , однако в случае капсульного штамма 689-Т наблюдалось такяе связывание и с лектином пшеницы. Кон Л менее дифференцированно по сравнению с другими лектнпами взаимодействовал с прокариотами, что видимо обусловлено распространенностью «t-мачнозо/ «/-глокозо-содерскадих гликоконыогатов на поверхности микроорганизмов (pistole, Ï98I). Наоборот, использование лектинов пшеницы п фасоли позволяет еыявлять штавдовые различия бактерий в пределах вида, как это тлеет место при сравнении капсульного штамма 689-Т с не капсулышми штамнаглп 689 и 682 клубеньковых бактерий фасоли Bhizobium phaoooli (табл. 8 ). Отсутствие связывания лектинов наблюдалось в случав Ricfcefctaic prowazekii, Fransieella tularénelo , в ТО время как Ттеропвиа pallldua И Brucella abortus . проявляли отноептель-ную устойчивость в визуализации набором лектинов,

В случае эукарлогов наблюдался более дифферекцпрованянй характер связывания лектинов с клеточной поверхностью. Tait, контакты между почками дрояяей рода Candida и перегородки меяду клетками мицелия микро-мицета, относящегося к несоверйенннгл грибам^ Helclnthosporlum eatlvua обладали максимальным сродством к лектину пшеницы (тебл. 8 ). Зрелые почки дрокяей Candida eel-nonloola 779 несколько лучше связывались с Кон А по сравнению с с. maltosa 7?4 -, что видшо било обусловлено более выраженным капсульнш материалом в случав штадаа 779. В целей, зрелые почки дрожжей обоих видов лучше реагировали с набором лектинов по сравнению с молодыми почками. Картины флуоресценции :ящелпя микро-мицета н. satlvua i обработанного лектином пшеницы ют лектином фасоли, дополняли друг друга, поскольку наблюдалась визуализация различных областей гриба (рис; 8). Особенно сильные различия были видны в области окончаний растущего мицелия гриба. Интересно^ что оба лэктина проявляли высокое сродство к областям с высокой метаболической активностью гриба - перэгородкагл ме:вду клетками мицелия и окончаниям мице-лиалышх гиф (рис. 8). По-видимоглу, не только лектин пшеницы способен к'Лйунгицвдяогщг действию ( Mireluan, 1975), но и лектин фасоли о высоким сродством к секрету гриба Helninthoeporium sativum ;г Очевидно, что применение обоих лектинов позволит достичь максимальной визуализации гриба. Лектины пшеницы и фасоли также связывались с местами прораста-

шш спор гриба н. aativua . Локтппы не реагировали с' покоящимися спорами гриба - баЗЕдИОШЩвта r-ucsinia graaiuio f. tsp. tritici Paro Erika et Hean. В случае зелёных мпкроводорослей наблюдалось отсутствие взаимодействия с лектшом шюницы на $ояо выроненного сродства к Коп А и лектпну фасоли. При этсм калсулообразуюсгцй П'-аш C-I57 характера овал сяп повышенным сродством к обоим лектшам. Клетки опио-зелоных водорослаЦ (циапобактерпй) проявляй устойчивость f. связыванию лектиноз. .....

;•„. '■•Ii" VVÍ , с-'" .

tta&v/bP

, у Л'?

•</»" ./■>',.Л i-'.',',: U-i-^i- > i

, i' '" ■!;

А Б

Рис, 8. Обработанный лскгшюм пшеницы (А) л лекшюи фасоли (Б)

мицелий гриба Не1а1пЫюарог1ил •¡а^гшапрслвяепио лектшюв иммунным "сэндвичем", моченым ФИЩем. Ув. 90 х 3.

Поскольку в реакции непрямой ишунофдуоресценции могут иметь место неспецЕфичоские взаимодействия, обусловленные участием иммуноглобулинов, была проведена оценка флуоресценции контролышх обработок мазков микроорганизмов, как показало в табл.2 ■ на примере мицелия гриба Я. еаЫгиа . Ввдно', что опытная обработка^микроорганизма (вариант А) характеризуется интенсивностью флуоресценции, статистически достоверно провосходящей интенсивность флуоресценции в случае любой из контрольных обработок. Интенсивность флуоресценции в опытном варианте была в 13 раз вше, чем в случае обработки микроорганизма только мечеными (ШТЦем ослшшьп иммуноглобулинами (вариант Г), Присутствие ингибпрутищего лектин углевода статистически достоверно снижало интенсивность флуоресценции мазка (вариант Е). При этом остаточная интенсивность флуоресценции составляла лезь 23% от интенсивности в варианте

оштлой обработал, в том числе 17$ - за сиог использованет иммунного "сэндвича".

Из приведённых вшо данных видно, что разработанный эксггросс-метод с использованием дативных лектинов и ионного "сэндвича", ме-. ченого флуорохромом, позволяет не только визуализировать микрооргапиз-мн, но п различать близкородственные про- и эукариоты, клетки на разных этапах развития. Кроме того, метод даёт возможность, оценивать вклад интенсиплости флуоресценции капсул, стенок, мембран и секрета микроорганизмов, а такяе зон повышенного метаболизма мккробоз в общую интенсивность флуоресценции микроорганизма. ]?арактер картины флуоресценции мшсрс организмов но менялся при хранении препаратов в течение нескольких лет.

Структура глйкоконъвгатов. поверхности исследованных микроорганизмов, проявляется: сродство к лекттлам, в настоящее время нэ известна. В случае Грам-отрицательных бактерий (см. табл.8 ) такими структурами могут быть глгкаЕы липополисахаридов энтеробактерий и клубеньковых бактерий (Носенко и соавт., 1989), зкзополисахарпдн в составе капсул микроорганизмов, гиалуроповая кислота и хондроитпнеуль-. фат в качество кислых глукополисахаридов, 3 случае Гр^л-положительши бактерий, в частности бсцлзл, на поверхности клеток идентифицирован полисахарид, построенный из остатков галактози п з-ацетгагглюкозами-тл (ВзззИ с с е!.. 1990). Еозмотло с эти ! связана показанная недавно способность лектияа ппеияцы реагировать со щопгаи Грэлмтолояительнн-ми бактерия:.:,! (Шггаог» о1- а1., 1990), что согласуется и с штамп данными. По-видимому, па поверхности бацилл могут располагаться концозпэ остатки галактозы в видо кластеров (полиаптэнных структур), реагирующих с лектшом фасоли (табл. ?) ' иди лектином соп (ОгеЛая а!., 1984). В случае цианобаятеряй и покоящихся спор иикроорганизмов, способные связываться Ь лектинами гликоконъ-югаты поверхности клеток, по-впдамому, Шфанированн или защищены ка-киш-лз:бо инертными в отношении лектинов структурами.

Б целом, однако, т приведённых вше данных видно, что набор ' лектинов мояот быть использован для изучения.таксономического пояснения микроорганизмов, в том числе для выявления внутриродовых и внутривидовых различий микробов (как бактерий - прокариотов; так и грибов - эуклрлотол). Кроме того, приведённые в габл. 3 результаты могут быть использовали в диагностике инфекционных. болезней человека, сельскохозяйственных животных и .растений, •. '

• - 44 -ВЫВОДИ

I', Разработаны качественный и колнчеответили варианты лектшюнмиушюго микроанализ а гликокошьюгатов поверхности микроорганизмов с использованием нативннх лектинов и иммунного "сэндвича" к лектинал, меченного фчуоресцешизотиоциалатон. Метод позволяет получать дифференцированную картину iiiyopeсдещт.гш различных клеточных структур с высокой интенсивность!) свечения. и высокой стабильностью характера распределения солуоресценцни па поверхности микроорганизмов. Преимуществом метода является использование высокоактивных начинивх ' препаратов лектинов и универсального проявителя - ангикролпчыа меченных флуорохромом иммуноглобулинов осла,

2, С помоцья нативнкх лектинов шязленн различия распределения глико-коньюгатов на поверхности микроорганизмов, относящихся к прокариотам и эукариотам, Среди прокарпотпчсскпх микроорганизмов ei-явлено различное сродство к набору лектинов у риккетсии, спирохет, энтеро-бактерий, бруцелл, бацилл и клубеньковых бактерий. Выявлены тагао различил ыеяду эукариотическшд микроорганизмами, относящимися к дрошсам рода Candida, грибам родов Helminthosporium и Trichoderma, водорослям рода Chlorella, в том числа внутриродовые и внутривпдо-вые различш.Показаны изменения распределения гликоконъагатов в онтогенезе гриба Helninthosporium ¡sativum И дрожкей рода Candida. Дана оценка вклада в общую картину флуоресценции микроорганизмов сродства лектинов к капсулам п мембранам, отдельным клеткам (молодым и старым)^ се1фету и поверхности мицелия гриба, спорам и местам прорастания спор, зонам интенсивного метаболизма микробов.

3. С помощью набора лектшовых сорбептов разделены близкие по физико-химическим свойствам гидродазы п их формы с варьирующей углеводной частью, определены особенности олшосахаридпо": структуры гликоконь-пгатов животного, растительного, пивного п бактериального происхождения, В процессе очистки фермента путег*ого связывания с лектн-новым сорбентом получен активный иммобилизовании:;' tSopyem? - биокатализ ст op.

■1. Исследована специфичность к углеводам, глшгокошпгатал и клеткам препаратов новых, лектинов из новых перспективных источников сырья: ку.пьтураяьшк ящкосте?. юверавщета Cephalosporin ecreoooium 237 и бактсркГ. Bacillus Bubtilis 316И, тюлевой жидкости нцциГ,, Выявлена екмзексчиТтчпость дектпп— г.пдиГ. ц Зацглл и ^-тгоуог0~сгк!г.г~ кчкостъ легтгна u"K]\4nirviri.

5; Проводсн многоплановый анатаз достижений в области изучения локти-яову что позволило; привести п соответствие опрэдолеппэ тор;,сии а "легаты" с современными доншлц предложить новый подход к классификация локтшов, в зависимости от типов угловодсо дорказдех мишеней* учитозащзй специфичность лектинов к целим молекулам гликоконъ-югатов?; дать рабочую классификация аспектов получения и применения локтиков в биотехнологии, прикладной бпохшии н мэдецпнру оценить перспективы п приоритетность направлений изучения лектинов в бли-яаЖшем будущей.

По матордалва диссертации опубликованы следующие работы:

I, Лзхтш В.М. Лекткш в исследовании белков .•: утлогодов.//Итоги науки п техники. Осрпя'биотехнология. Том 2. Li.: ЕЛШШ1, 193?,- 290 с.

2; Лахтян В.М. Очистка йер^здтов с поменяю яезтвпов.//Биотехнология, 1965. T.I. ß 5. С.11^7.

3i Лагтин В.М. Лотаппн - регулятора метаболиз;?а.//Там хе, 1986. Т.2. Л 6. С.66-79,

4. Ластил D.M. Бис технология .тектинзз.//Там еэ, 1909. Т.5. И 6. С.676-691,

5. Ластил В.М. Блогохнологическло попок-щ получения л применения лектл-Еоз.//Учёные записки Ттетусгкого унтш^рсптета. Выпуск 869. Изучение л .тоятяпвэ. T.I, Тарту;'Кзд-тви Тоэтусского ул~та, 1989.

0. 7-аятш В.М. Фзрмзяты углеводного обмена с лентиловшга до.чеишлл сор-бцяз на поллсахарцдах.//Там ез. С .128-131.

7. .iiXTX'j B.I.I. Лектшп; п аспекты их изучеяяя./Д^якробиологическлй яурнад (Кеэв), 1989. Т.51. № 3. С.69-74.

6. fernn B.U., Ямскоз И.А. Лзкттш в исследоз&чш роцепторов.//Успехи хвяш. I9SI. Т.60. J& 8. С.1777-1816.

9, ЛВГГЕЯ D.H. Сгмцифччнос-гь^вктик^з Врикл. блох; и шздробиол. 1992. T.2d.

.сГ^тглВ.Й'.ГРогланчепко А.1Т. Внделепиз я характеристика фитогеи-агглзтагака га сс:ш фасол?г.//До;:л. ВДвЯШ. ЙШ, Ä V, (/,46-47.

1. Лаг.тг:! В.М., Роман*, еико А.И. Новкй котод шдтчепгя $итогема1т;ттк-нг.на./Да-л 1э. 1У84. В 12. 0.38-39.

2. Sbxtc.1 В.М., Будникова A.B., Ро.«апзсл:» А.И., Шуятлюа А.И. Полу- ■ чекле (йгаогеьштлюмшияа (мтлолектияа) из семги фасолл.//Лзт» Олдд. й 2I3I5C6. Вюлл. moöp. Ii'ö4. 48» 0.7.

:з. Дгстпп В.М., Ио со лов В,В.. Маслова Н,П„ Способ получения агглстляп-яа./Дзт.стлд. Л ШИП. Билл, язобр, ISÜ5. ß 22. С.34.

■4 "еж В.М,; туеев.% Н.И., Фадуокжа-Н.Б., "IzsJrsOsa З.А., ¡Лататгла КД. ^ф^реадгрованнсо сродоясо essci-riar. rxzo-э raiwopranw.'ws к .набору Л8КТГГГ0В, проявляемых "сэидркч"~га£Одо;д а участием С'^Ц-"*. //д. шщроб. эгаяоазсл. я icoiyHodsai. 1935. й I. 0.30-3^.

15. Дахгкн Б.М., Яковлева З.М. Связывание лектина из зародышей пшеницы с поверхностью мицелия и спор Helminthoeporium sativuo. //Изв.

АН СССР, сер. биол, 1987. Jf Б. С.792-795.

16. Лахтин ВЛ.!., Мосолов В.В. Но,пучение кристаллического лектина из зародаей^пшенц^//Практические методы современной биохимии. IJ.j

17. Лахтин В.М., Яковлева З.М. Связывание меченых лектинов с Helointhosporium sativum /Дам же, C.IS5-20I.

IG. Лахтин B.U., Запромётова 0.Ü, w-Галш'^озвдаза Cephalosporin aoromoniua 257 и её лзктияовие свойства.//Биохимия. 1988. Т.53. Л 8. С,1270-1277.

19. Лахтин Б.Н., Мага-зова Н.С., Мосолоь В.В., ¿^наева P.M. Применение лехстшшвой хроматографии для разделения /s-гликозидаз, близких по фпзико-хшйческш свойства1Д.//Биотехнология и биотехника (Болгария). ISS8. Ä3. С.40-41,

20. Лахтип В.Ы., Магазова И.О., Кунаева P.M., Мосолов В.Б. Применение лектинов для разделения л-гликозвдаз полн£Ш.//Прикл. биох. и микроб. 1869. Т.25. ü I. C.5G-6I.

21. Бапромэгова 0.;,!,, Лахтин В.М., Улезло 11,13. Исследование взаимодействия cL-галактозвдазы и р- К-ацетитжкозамшшдазы Coohalosporiura acremoniua гЬ7 с локтинами.//Биотехнология. ISS6. Т.2. J5 3. С.57-61.

22. Магазова Н.С., Лахтш В.М., Кунаева P.M., Мосолов В.В„ Способ иммобилизации Р-глокозцдазы.У/Лвт. сгад. & 1472504. Билл, изобр,

■ т909„ JI 14. С .117.

23. Березки Б.Б., Лахтин В.г.1., Геворкян Р.Г., Даьачков В.А., Ямсков H.A. Хроматографичес-кие методы получения лектинов на сорбентах па основе сферона.//Учёные записки Тартусского университета. Выпуск 869. Получснио и применение локтянов. T.I. Тарту: Изд-тво Тартус-ского ун-та, 1989. C.I0I-I05.

24. Пискарев В.Е., Лахтш В.М. Препаративное получение изолектинов из зародышей пшеницы с покоцыо ВЗЮГ./Д'ам зг.е. C.II3-II8.

25. Сахаров К.Ю., Лахтин В.М. Применение иммобилизованных лектинов для выделения и изучения изоформеитов цолочпой фосфатазн тюленя.// тагл яе. Выпуск 870. Изучение и применение лектинов. Т.2. С. 134-139

26.- Нуцубядае H.H., Лахтин В.М., Дёмпна В.А., Образцова H.H., МаршюЕа Д.Н. О возможней вдонтиГ,икац:га микроорганизмов по скорости их агглютинации лектиншли./ДТрига, биох. и микроб. 1991. Т.27. К 2. С.274-278. ?

27. Тихомиров Д.Ф., Нуцубвдзе H.H., Лахтш В.М., Клёсов A.A. Выделоние четырёх множественных йорц зндо-1,4- ^-глсканази с цовшенной гид-

■ рофобиостью из Trlchodertra reeaei. //Биохимия. 1987. Т.5?.. К 7. C.I097-II07.

20. Сахаров H.iu., ¡„laicajona И.Ii., Лахтин Б.Л., Арбатский H.II. Аминокислотный, углеводный и ппо^ешоитный состав щелочной фосфатазн из тонкого кшпкнка 1иленг.;//"Гам не. ГЖ-. Т.54. '¿. С.250-255.

29. Косенко Л.В., Панова П.А., Лаггш В.М. Использоюшге понкаяаваляза Л дая изучения полиса7аркдов клубеньковых бактергЛ.//Учез:ше запис-1Ш Гартусского университета. Выпуск. 870. Изучение и применение лекгапов. Т.2. Тарту: 1!эд-тво Таргусского ун-та, IS89. C.II3-II8.

30. Xakhtin V.M. Affinity -of cnzyncs to levins.//Proe. 7th Int. lectin licet. (Aug. 18-23, 1935, Вшпзе1). Book of abstracts. P.52.

31. Lafchtin V.H., Yakovleva Z.I1. Eie bijjding of labeled lectins to Helainthosporiua sati .-urn.//Ibid. P.53.

32. I-akhtin V.M., Zopromstova P.M. Xsetin properties of Cephaloaporiun aorenoniua <*-5alacfco3idass.//Ibid. P. 5'}.

33. balchfrin V.tJ. BiotechaoloGiool acpactn of iuolation and application of lsctin3,//Pro3. 9th Int. Lectin Hsot. (July 27-31, 1937,' Cambridge).-Book of abstracts. У.6.

34. Laihtin 7.II. Insobilized lootiac in inolation-tachniq:uear//I'roa. 5th Sioteohaol. Цупр» Soc. Couatrioa (Sept. 4-8, Bnlatoi-szeplefc, Hungary). Book of abstracts. Vol. '¿. Budapest, 1939» Р.Ч-3.

35. L&khbin V.II. Bioteohnolcgical aspects of lcctino. //iioccurclc J. , -Sreed D., eric, lectins: Eiolcgy, Biocheniatry, and Clinical Bio— chc^isfcry. Vo?. 7. Ct Lauia: tiisma Gheaical Соисапу, 1990. Г.Ч-17-42S.

36. Lskhtin V.I!. Xocfci-пз for investigation of (;ly с о с on j u ¡ja t о з . // Saililcsrn Л., Bf/g-Hinsea Т.е.. edo. Lectins: Biology, Biochcnintry, and Clinical Biochcnistry. 7ol. 3. Et Louiss Sie^i Che=ice.l Company, 1991. P.

37. Lskhtin Т.Н. Ioctinn for investigation of clycoprobeinn.// Glyooccajugate J. 1991. 7.8.!?о 3-' P.235.

33. IsElilitin T.i:. Cuperfiae specificity cf lcctln.qs apocificity to-whole glyccscnjusate3.//feree« 17fch Int. Lectin'Meet. (Лиз. 11-17( 1991, Berlin). Abstractbook. P. 26.

39. ]>Mitln 7,H., Tcmskov I.A. Receptor ioolation proceeduroa including lectin chromatography.//Prcc. 12th Int. Lsctin fiiet. (¡Sept. 9-1'S 1990, ^r-.vio, USA), Book of abstracts.J?. 34.

40. bebhfcia V.'I., Koatanova. Е.Л... Arbafcsfcy N.Г, Lcc1:in-llke interactioR fcstwm pi»pe"ft lyso^yne/chitinaeo and micrococci.//JProc. 5th ¿¡ur. Oonf. o.i Car'bobytlr. (Aug. 21-25, 1909, Pracuo). Boob of afcatrrtcta. P. 0-2%.

u. Xakhtin 7.П., Sodaaor П.У"., S£uMn 7.Y., Мчксгэт V.E., Ymxakor ItA. tfhe.-t ninileritiea_na4 differences .

/Anllik'ora A.", B^g-Hsnoen'Ci.C., eda. ¿¿ctinii Biology, Tioch',-:'.^;-try, and Clinical Biochcciefcry. 7ol. 8. St Louis: Sis^a Chenioaj. ( C^npory, 1991.

r-^fc'-tb T. I-jkhtin 7.1!. Tcaction of fun»i with Joctinn cS ths r"■«! of ai.f;liind srout, ГаЬет eairdaeri nioh./Afcid. I', i . aui-'вта Я.г... b-iobii.t-rablo". эГ

3orbeiit'3.//Proc. 11th Int. .Lectin ISeet. (Jaao 4-9, Г.-rbj). Bool: of abstracts,

— -nj -

Vi-, Koaena.» i. t., J.akhtin V.M.. Dubovenko H. A., Zaîcharova 1«Га., Mosolov V. V, Che possible involvement of marinóse, the ci in or component of Rliizobium leguminosarura exopolysaccharides, in the interaction with lectins.//Proc. 9th Int. lectin Meet.(July 27-31, 19З7, Canbridge). Boole ot abstracts. P.5?.

4-5. Zapronetova О.И., Ulezlo I. V., Lakhtin V.M. Glycoprotein origin of Cephalosporin® acrenonium t¡-galactosidase.//Biol.' Cheœ. Eoppe-Seyler. 198Ó. V.367. Suppl. P.195.

46. Zaproaetova O.H., Ule^lo X.V., lakhtin V.M. Structure and. properties of Cephalosporin acremonium <*~galact03idase. //GlycoconJugate S. 1990. V.?. li 4-. Г.287-300.

47. Simonenko I.A., Kovalenlro Е.Л., Lakhtin V.M. Characterization

of the Bacillus masentericus extracellular lectin./ДСвШкогп k., Bi^g-Hansen Î.O., eda.Lectins: Biology, Biochemistry, and Clinical Biochemistry. Vol.a. St Louiss Sigaa Chemical Coapany, 1991« P.

4B. Berézin B.B,, Gavorkyc.n K.G., Lakhtin V.M., Yaaskov I.A, Affinity sorbent containing Co.n A innobilized via cobalt (5 + ) complex. //Ibid. P.

4-9. Ovodov ïu.S,, Glt,3Ù-ova V,E., Ovodcva R.G., Artyukov A.A., Xoyenko ïu. if., tîikhaylov V.V., Lakhtin V.II. Isolation and characterisation of lectins from the nussel, Cxenoaytilus grayanus.//Ibid. P.

Список сокращений • (в скобках - коммсрчесхсие обозначения лектшюв)

Кон А(Соп а) коккалавалин А из семян Canavalia ensiformis

ЛА(рнх) лекгив из саман арахиса Arachis hypogaea

ЛГ(рза) лешш из семян гороха Pisuni sativum

JIK(RCA-I) лехсгин из семян клещевины Ricinus communis

JDI(wga) лекткя из зародпией пшенкци Sriticum vulgars

IC(SBA) лекткн из семян сои Glycine шах

лу(нра) лвктии из белковой нелези улитки Helix pomatia

Jïï(loa) лектин из семян чечевицы tens culinaria

Д—5ГА(Ь~рна) лейкоагглютшпш из семян фасоли Hiaseolus vulgaris

ФГА(рна-р) легаш из се:ин фасоли Pha^coius vulgaris ФКГЦ флуоресцеинизотиоцианат ira арабиноза Fus фукоза Gal галактоза Gal и галактозашхн OalKAc н-ацетилгалактозамин

Ис

01сЫ

С1сЫАс

Мап

Ьас

Ме-а-01ср Ме-а-Мапр ЫеиАс Ыеив!

глюкоза

глюкозамин

М-ацетилглюкозамин

нанноза

лактоза

а-метил-глюкопнранозид а-.метнл-маннопиранозид М-ацетилнейраминовая кислота М-гликолнлнейрашшовая кислота