Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Культуры клеток перевиваемых линий как тест-объект для биологической индикации ксенобиотиков в водной среде

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Культуры клеток перевиваемых линий как тест-объект для биологической индикации ксенобиотиков в водной среде"

РГб од

1 1 ОКТ £23

Не правах рукописи

Т К А Ч У К СЕРГЕЙ МИХАЙЛОВИЧ

КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ПЕРЕВИВАЕМЫХ ЛИШ1Й КАК ТЕСТ-ОБЪЕКТ ДЛЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ИНДИКАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ В ВОДНОЙ СРЕДЕ

03.00.16 - экология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Санкт-Петербург - 1999

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте

военной медицины МО РФ Научные консультанты: доктор медицинских наук профессор

С.А.Куценко

, Официальные оппоненты:

доктор медицинских•наук профессор Лопатин С.А. доктор, медицинских наук профессор Долго-Сабуров В.Б. доктор медицинских наук профессор Головко А.И.

Ведущря оргрнизяцич: I Центральный неучно-исследовительски

институт МО РФ

Защита состоится " 23 " сентября 1999 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д.106.05.01 в НИИ ЕМ МО РФ (195043, Санкт-Петербург, ул. Лесопарковая, 4).

С диссертацией мсжко ознакомиться в библиотеке института

Автореферат разослан. "¡¡¿иЧ июля 1999 г.

Ученый секретарь диссертационного соЕэта доктор медицинских наук

Р.Б.Гольдин

?1У,$10. о

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность пройдены. Сложиьшаяся система контроля качества воды по критерию химической безвредности, основанная на определении физико-химическими, химическими и биохимическими методами содержания отдельных веществ и сопоставление их уровня с предельно допустимыми концентрациями (ЦЦК) не обеспечивает в полной мере гарантии пригодности ее к употреблению в отношении Есего спектра токсикантов. К такому выводу подводят следующие соображения:

- разработка ЦЦК для всех загрязняющих окружающую среду поллютантов нереальна, т.к. в результате хозяйственной деятельности человека число их растет, намного опережая скорость совершенствование методов индикации (Беспамятной Г.П. с соавт., 1935; Крайнюкова А.И. 1988; Маршалл В. 1989; Сидорик В.П.'с соавт., 1989; Нежиховский P.A. 1990);

- многие из известных поллютантов, содержащихся" в воде, проявляют синергизм или антагонизм в действии на организм (Руссо P.C., 1986; Бингам Ф.Т. с соавт., 1989; Красовский Г.Н. с соавт. , 1992; Рахманик Ю.А. с соавт., 1992);

- наряду с химическим влиянием оказывают влияние на биологический объект и другие факторы среды (физические, биологические) . часто потенцируя неблагоприятное действие токсикантов на организм (Саватеев Н.В., Куценко С.А., 1982; Онищенко Г.Г., 1997);

- некоторые вещества могут превращаться во внешней среде в более токсичные, чем исходные (Жолдакова 3.11., 1975; Красовский Г.Н., 1992; Рахманин КЗ.А. с соавт., 1994).

В этой связи исключительно важным представляются исследования, направленные на совершенствование химико-токсикологической экспертизы (ХТЭ) еоды.

В течение последних 15-20 лет в интересах медицинской службы ВС РФ была завершена разработка системы ХТЭ воды.

■ в настоящее время система ХТЭ воды предусматривает проведение одновременно двух основных этапов (Куценко С.А. с соавт., 1995; Лопатин С.А. с соавт., 1997):

I. Физико-химические, химические и биохимические исследова-

ния, направленные на количественное определение конкретных токсикантов.

II. Биологическая индикация, основанная на оценке результатов действия яда: учете специфических реакции, характеризующих жизнеспособность Биообъектов, модификаций мишеней яда в организме, нарушений функциональных связей, поведения и т. д. При этом используются токсикологические, морфологические, биофизические и биохимические методы'исследования.

Чувствительность методов биологической индикации находится на границе допустимых влияний отравляющих и высокотоксичных веществ (ОВТВ) на человека, что позволяет получать интегральную характеристику опасности исследуемой среды, то есть оценку, учитывающую основные особенности токсикокпнетики и токсикодннамики яда, роль примесей, специальных добавок и др.

Наблюдаемое практически повсеместно массированное загрязнение воды природных-источников, а также угроза заражения воды в военное время широким спектром токсикантов СОВ, ОВТВ, пестициды, диверсионные агенты и т.д.) выдвигает перед медицинской службой ВС задачу совершенствования ХТЭ в целом и биологического тестирования в особенности, так как химико-аналитические методы исследований не удовлетворяют современным требованиям как по шпроте спектра выявляемых токсикантов, так и порогам чувствительности в отношении ряда из них (Кузьмекко М.И. с соавт., 1986; Красовский Г-Н. с соавт., 1992).

В связи с изложенным, представляется перспективным совершенствование второго этапа ХТЭ - постановки биологической пробы, которое должно включать расширение числа биообъектов-индикаторов, увеличение прецизионности оценки состояния тест-организмов и формирование на этой основе тест-систем, обеспечивающих минимальную вероятность "неопределения" вредных веществ в опасных для здоровья человека количествах. Речь,, в частности, идет об относительно простых биологических системах, позволяющих проводить исследования in vitro (Елизаров О.Н., 19S9; Тонкопий В.Д., 1993).

В литературе содержится много сведений, посвященных применен™ е токсикологии различных "инвитровых" систем: микроорганизмов, культур клеток животных и человека, органных культур, а также относительно простых одно- и многоклеточных организмов,

рыб Туманов A.A. с совет. . 19';8: Елизаров O.H., 19S9: сгаксва E.'i. с cgset. 1?:S Cibxton L.D. et я!.. 1595; Краговский Г.Н. с соавт. , 1991; Cinelli S., 1994). Весьма разнообразен и перечень ааалиэирунш функций у тест-объектов, ехужнвцк показателями токсического действия химических веществ. Рзгработка теоретических оское биопндпкаппи. базирующихся на знании взаимодействия среды :: уиёыу. органкгмов, развитие представлении с? органкг-мах-индикаторах, расширение числа им вкдое - все это представляется весьма пертпективкш для совершенствования ХТЭ.

Среди потенппальных тест-систем биологической индикации внимание прИЕлек?.<ос культуры клеток (КК). -так как е отличие от других объектов они поддается стандартизации, "менее капризны" г обращении, а для пх успешного пршенения в практике санитарно-эпидемиологических и лечебно-профилактических учре^лений медицинской службы ВС созданы все необходимые научно-методические и материально-технически? предпосылки (Елизаров D.H., 1989; Яр-гомский В.А., 1S94, 1996).

Все сказанное выне и определяет необходимость научного обоснования системы адекватной и, прежде всего, оперативной системы ХТЭ воды питьевого назначения с использованием культур клеток перевиваемых линии.

Целью настоящего исследования является экспериментальное обоснование возможности включения культур клеток перевиваемых линий в систему биологических тестов, предназначенных ллн химике- токсикологической экспертизы ксенобиотиков е еодной среде.

Для достижения указанной цели исследования, необходимо решить следующие задачи:

- оценить в сравнительном плане чувствительность биологических объектов (простейиие, беспозвоночные, КК перевиваемых линий) к воздействии токсических векеств в веде;

- изучить способы оптимизации условий для оценки токсичности вешестЕ с помощью культур клеток;

- определить информативные критерии морфгфункшюнальнего состояния клеток при действии модельных токсикантов;

- обосновать "набор" чувствительных биологически}: объектов длк оценки токсического действия веществ с различным механизмом действия;

- разработать алгоритм проведения ХТЭ по критерию биологи-

<*

■нзш поллктантов.

ПШЮЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Высокая ЧУЕСТЕИТеЛЬКОСТЬ КК. К ДЕЙСТВИЮ ЕещеСТЕ, нарушзю-ке пронесгь: биоэнергетики спнтега пластических компонентов е клетке позволяет осуществлять интегральную оценку качества воды и выявлять е ней наличие поллютантов с указанными механизмами цитотокспческого действия.

£. Дифференцированные КК (ЕНК-21, НеЬа, 1Л.С-МК2»

Нер-2, КТС, СПЗВ, ФЛЭЧзз5.'1з) обладает практически одинаковой чувствительностью к цптотоксикантэ«, содержащимся в воде, что позволяет использовать в практике сакнтарко-тсксикологпческой экспертизы любую ив указанных линии клеток.

3. Эффективность процесса биотестирования о псмош^ю КК подвышается при пртлененпи морфологических, гистохимических п бпо-хемилюминесцентных методов исследования морфофункционадьного состояния клеток, а также, методических приемов по снижению их резистентности к дейстЕпю токсикантов.

4. Оснащение санитарно-эпидемиологических и лечебно-профилактически: учреждений медицинской службы ЕС га КК перевиваемых линий позволяет использовать их специалистами окружного звена армии (флота) е практике санитарно-токсикологической экспертизы. Включение КК в систему биологической индикации ксенобиотиков б водкой среде расширяет спектр определяемых веществ.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Е ходе проведения работы обоснованы и разработаны новые аспекты использования КК перевиваемых линий, наряду со ставшим уже традиционным их применением е вирусологии н биотехнологии, а именно, ъ качестве тест-системы для выявления микроколичеств токсичных вешестЕ, содержаться е воде. Произведен отбор и систематизация различных линии клеток и диплоидных '.птамиоЕ для изучения токсичности веществ. нарушающих процессы биоэнергетик! и синтеза пластических компонентов. Саткмизпрованы условия проведения экспериментов по определению токсичности вещестЕ с помощью

кул*тур клеток. Устзнсвлены информативные критерии яср+щгнк^л:-нальисто состоявля клеток при леиствпи токгпквктов. Пробелена щенка чувствительности различных линий клеток к токсиканта;;, содержащимся з воде. Проведена сравнительная сценка чувствительности КК и других биологических тест-систем к ряду токсикантов. Покагана принципиальная возможность использования хелатообравую-пих геп-еогв для групповой индикации тяжелых металлов в воде с помогаю КК перевиваемых линий. Обоснованы и с$сэмулированы eí лужи е направления соЕерЕенствованпл системы ХТЭ воды.

НАУЧНО-ЛРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ заключается в том, что по полученным в процессе ее выполнения результатам представляется возможным:

- повысить информативность и оперативность проведения сани-тврно-токсикологической экспертизы воды в условиях постоянно нараставшего ухудшения экологической обстановки в мирное и военное Бремя;

- повысить надежность контроля качества воды по критерию химической безвредности при реализации Концепции медицинского обеспечения процесса уничтожения химического оружия, а также при возникновении аварий и катастроф;

- совершенствовать систему исследования in vitro соединений с различными механизмами действия и сравнение их результатов с таковыми in vivo.

МАТЕРИАЛЫ РАБОТЫ РЕАЛИЗОВАНЫ при разработке:

Методических рекомендаций по применению культур клеток в санитарно-зш!демиолог:гчески>: и лечебно-диагностических учреждениях армии И флота.- М.: ГЕМУ МО F5, 1896.- 22 с.

Материалы исследований опубликованы в '25 научных работах, в т.ч. 2 монографии в соавторстве:

Гигиеническая диагностика водной среды.- СПб.: Наука. 1396.

- 247 С.;

Диагностика в профилактической медицине,- СПб.: í.ffiJlH. 1957.

- 516 с.

■Основные положения диссертационной работы внедрены в практику работы медицинской службы Ленинградского военного округа. Ленинградской военно-морской базы, в учебный процесс кафедры во-•b.fpir

еннои токсикологии :: мегшикскоп залдгть: Есенно-медпипнскоп академии.

Материалы диссертапиокнсй рабстк волод-ны и сбт-улденк на Всесоюзной научной конференции "Экологическая безопасность городов" (Саша-Петербург. 1992), научной конференции "Актуальные проблемы разработки медицинских средств п методов сохранения и восстановления боеспоспобности личного согтава Е'?" (Санкт-Петербург, 1534;, научно-практическои конференции "Роенная кедишие,. Проблемы профилактики, диагностики, лечения экстремальны:-: ситуаций" (Москва, 1994), на Всероссийской конференции " Актуальные проблемы теоретической и прикладной токсикологии" (Санкт-Петербург, 1995), на 6-й Всеармейской конференции 24-25 сентября 1996 (Санкт-Петербург), на международном симпозиуме "Biological Monitor ing1 in Occupations] and Environmental Health" (Helsinki, 1996), на городской научно-практической конференции воено-учебны/: и научных учреждений "Военная наука и образование - городу" (Санкт-Петербург, 1997).

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация содержит 215 страниц машинописного текста и состоит не сведения, пяти глав, заключения, выеодов, списка литературы и ? приложений. Список литературы включает 224 источника, не них 122 отечественных и 102 иностранных. Текст иллюстрирован 26 рисунками, 16 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В соответствии с целью исследования в качестве перспективного подхода для проведения Х73 и в частности, одного ив ее этапов - биологической индикации - нами изучалась возможность использования биологических объектов с различным уровнем организации для определения химической безвредности воды. С этой целью проводилась сравнительная оценка токсичности ряда модельных токсикантов на следующих бпообьектах; лростейшпе (Tetranyrnena piriformis) , беспозвоночные (Daphrus magna), культуры клетск перевиваемых линий (табл. 1).

Зля определен::;: чувствительности теет-сгганквмов ^ыл;: выбраны г?кства. стн: гясз:?ся к гр-шзгл с рврл::чны>: мгханнгмо!.' токсического действия: вещества, нарушающие процессы 'поскергетккп (афилонитрил. 2,4-дикптрофенол, цианистый калий, йедаиетет п фторзцетат натрия, г-хлорвшилякхлорарсин), генерации и проведения нервного импульса (ротор, фоефаксл, хлорофос), а также окн-т~га пластически:-: компонентов клетки (2.2"-дихлсргнэтклсульфпд. хлорид ртути, нлсрид кзлмпя, нитрат св:ш1:а, хлорид меди дигиг-рат, нитрат докгоурана, рицин).

Таблица 1

Материалы, объем и методы исследования

Ееше: :твз : ! I Тест-органиг.мы| 1 1 1 1 Методы оценки 1 Число пс- I следований |

Акр1:лонптрпл Культура Выживаемость и пло- 1245

Дпанид калия клеток переви- довитое Iь (Еизуаль-

2,4-ДНФ ваемых линий оценка под микроско-

йиизит ¡НеЬа, Кер-2, ' па.! е динамике)

Рогор НЮ, ¡-зад, Морфологические: 800

Сосфакол ЕЕС-МК-з, СП5В - прижизненная ок-

Хлорофос раска трияановш

Кприт синим

ртути Еарпта пад-па - гематоксилин-эозин

Хлорид кадмия - РЭМ

Нитрат свинца Те1гас.Ьутепа Г по т ох и> ли ч е с г л I е: 420

}'Лорид меди руг х: огггйз - ДНК, РНК

Риипн - гликоген - СДГ, ЛДГ Интенсивность ЕУ. 1350

3 исследованиях по оценке токсичности химических веществ с помс-еью простейших (инфузории) использовали Оегбактгриала кую культуру Те^а'пугпепа ругхГоггп1 = (шта'ш БЬ), культивируемую б стандартных условиях на зминопеятидней среде с дрожжевым ?кс-трактом без добавления солей при 28 °с.

31 в приготовленного ряда разведении (1:2, 1:4, 1:8. 1:16)

«гсслгдуекзй пр?5ы волк (опыт). ?од*рхааеп мо-ельные токгкканты, вногкяп по 5,0 ыл ка.+'дсгс «ведения ь S пробирки. Зате;.: добавляли е пробирки по 0,2 МЛ езьеси ¡1НфУ50рЛП с походкой плотностью (3,0-4,0).10® клеток-».и к инкубировали s термостате при +23 иС е течение 24 ч. Для контроля использовали среду Лозина-Лозинского. После указанного выше срока экспозиции инфузорий с исследуемой водой пробу фиксировали 4 % раствором формалина, перемешивай! и подсчитывали плотность клеток г камере Горяева, Параметры хронической (СП-is, С'1150, CI ¡S4',i токсичности компонентов исследуемой пробы определяли по степени задержки роста культуры £ сравнении с контролем. Для обозначения степени задержки роста культуры использовали рекомендованную рядом авторов (Этлин С.Х., Лахонина Г.М., Ирлина И.С. и соавт., 1Э87) аббревиатуру "СП" - concent-ratio inhiberе incrementurn.

В исследованиях по оценке токсичности химических веществ с помощью ракообразных использовали дафний (Daphnia magna). Эксперимент длительностью 24-96 ч позволял выявить острое токсическое действие на дафний исследуемой воды или испытываемого ЕещестЕа. О наличии и степени такого действия судили по критерию выживаемости (ЛК1в» Жзо, Жв4) - среднему количеству особей, выжившему в тестируемой воде за указанное время.

При изучении токсичности модельных веществ на перевиваемых КК нами попользовались следующие паспортизованные л::нпп: ВНК-21, HeLa, L320» LLC-MKg, Нер-2, НТО, СПБ2, а также диплоидных штаммов 5ЛЭЧз85/13-

Клетки выращивали по общепринятой методике (Фрешни А., 1939), используя жидкие питательные среды Игла и 199 (производства Института полиомиелита и Епрусных энцефалитов РАМН) с добавлением 5-10» нативной или фетальной сывороток КРС.

Токсичность ксенобиотиков для КК оценивали общепринятой методикой прижизненной окраски клеток 0,25 X раствором трипанового синего.

Для оценки морфологических изменений КК при действии токсикантов клетки выращивали на стеклах-подложках. По окончании экспозиции токсиканта клетки фиксировали смесью Карнуа (абсолютный этиловый спирт, хлороформ и ледяная уксусная кислота в соотношении 3:2:1) и окрашивали гематоксилин-эозином, готовя тем самым постоянные препараты для микроскопии.

Раздельное- выявление ЛНК к РНК огуществляли с помощью смеси метилового зеленого с пнрокпном.

Гликоген КК е опытных л контрольных пробах определяли с помощью Шифф-йодной кислоты по методу Мак-Мануса.

Активность окислительных ферментов лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и сукцпкатдегидрогеназы (С'ДГ), играющих важную роль в метаболизме клеток, изучали с помощью тетразслиевсго метода.

Состояние нуклеиновых кислот после воздействия на клетки рицина, сернистого иприта изучали методом люминесцентной микроскопии с помошью акридинового оранжевого.

Изучение фиэпко-хпм;гческих процессов, происходящих в клетках, при воздействии токсикантов проводили с помощью бпохемплю-минесцентного анализа в основе которого, лежит регистрация квантов света, генерируемых в реакциях метаболизма.

Тонкие морфологические изменения е клетках, возникающие е стЕет на различные повреждающие воздействия, исследовали методом растровой электронной микроскопии (РЗМ).

При постановке лабораторных экспериментов оцениваемыми показателями являлись токспкометрическпе: среднесмертельные концентрации ¡1 их доверительные интервалы, которые рассчитывали методом пробит анализа по Литчфплду-Унлкоксону (Беленький М.Л., 1&ЕЗ) устанавливая достоверность различий в Еыборках по критерию Сгьюдента при уровне значимости Р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1.КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК, КАК МОДЕЛЬНЫЕ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ОЦЕНКИ ХИМИЧЕСКОЙ БЕЗВРЕДНОСТИ ВОДЫ

Для проведения токсикологических исследований на КК нами использовались следующие линии клеток: ВНК-21, КеЬа, Ьдгз, Нер-2, НТС. СПЕВ, ФЛВЧЗЭ5/13. Выбор данных КК был основан на том, что по данным литературы и результатам собственных наблюдений (Еасилоо А.Ф.. 1580; Трещни А., 1989). для указанных линий характерны обшие закономерности развития (продолжительность фаз клеточного пикла) и одинаковые услоеия культиЕпроЕа-ния. Учитывая сказанное, подбор и отработка условий проведения

Зз.тх

эксперимента ссуп-ествлялись не КК -".та: ИС-МК^. :-:=к наиболее достуднс:: в коллеы:::::' ШЖ Н'.'! МО

Оценку ккгнеепосоЬностк КК пр:: изучении влияния отд-льных физическим, физико-химических и химических факторов на клетки проводили с помощь» витального красителя трнпанового синего. Кс-пользование данного приема позволяет оценить проницаемость мембран и является косвенным признаком повреждения клеток.

Перед проведением экспериментов осуществляли контроль витальная окраска клеток) жизнеспособности пула КК. Е экспериментах жизнеспособность КК составляла не менее 55 *.

Е результате опенки влияния на КК отдельных факторов для выбора оптимальных условий проведения экспериментов нами установлены следующие параметры: использование КК в логарифмической фазе роста; температура инкубируемой смеси в пределах 55-2? -'О; рН исследуемых растворов токсикантов в диапазоне '',0-7.2: время трипспкизацпи неточного монослоя - 1-2 мин; экспозиция токсикантов с клетками - 3-4 ч; ионная сила раствора N301 1.1 - 2.5 %. Соблюдение указанных условий позволило избежать ошибок в проведении экспериментов по оценке токсичности Ееществ на КК.

Параметры токсичности химически:-: веществ для КК линии ИО-МКе, полученные методом витальной окраски тряпансЕШ синим, представлены в табл. 2.

Из результатов, приведенных е табл. 2. следует, что КК оказалась наиболее чувствительной в: веществам, нзрушащЕВ.: прсцессы пластического об;.!ена в клетке, в частности, соединениям тя;желых металлов - ртути, кадмию, свинцу, меди, а также к иприту и люизиту. Так, ЬС'о5 для указанных токсикантов составили, соответственно, 0,2+0,09; 0,04±0.01; 1,5±0,03; 0,68+0,01; 4,3±0,2 и 8,15±0,Б4 мг/л. Отмечалась избирательная, на уровне ПДК (1,0 мг/'л), чувствительность клеток к воздействию ионов меди. мСс5.-1б составили, соответственно, 0,68 + 0,01 и 1,6 + 0,05 мг-'л. 1.С50 соединений тяжелых металлов и влкилируюищх агентов для КК составили, соответственно, 5,2+ 0,07; 6,1+ 0,04; 17,Б± 0,05; 5,8+ 0,05; 60,2± 0,82 21,6+ 0,74 мг'л, что превышали их ПДК в 100-1000 раз. Полученные нами данные согласуются с результатами зарубежных авторов (ЗШоп С. е! а!., 1934; Зуепазеп 0., 1936), полученных ими в исследованиях на клетках нейрсбластомы и яичника китайского хомячка. В то же время КК. была мало чувствительной

iâtjniia. 2

Параметры токсичности химических веществ для культур клеток LLC-MKß

наевши*

вещества

j Число наблк?- j Iдений I -

- - Оь

Концентрация, мг.л-1

(х+п;

п-нитрофекилдив тплфосфат 10 90,00+2,71 615,00+11,40 1355,00;14,85

Тетраэтилсвинец 12 2,50+0,03 17,00; 0,42 РП --' : .СО- 1,04

2.4-динптрсфенол 10 12.40;0,09 39,50; 0,94 50. ,80+ 0,91

Йодацетат натрия 10 70,00±1,85 123,00± 5,10 173 : ,00± 3.50

KCN 10 45.00+0,72 67,20± 1,83 81. .50; 1.50

2,2' -дихлордпэтплсульфид 14 4,20+0,20 16,20+ 0,55 60, ,30+ 0,83

2-хлорвинилдихлорарсин 10 8,15;0,54 21,50+ 0,48 31, .60+ 0,74

Хлорид ртути (II)" 11 0,20=0,09 0,73± 0,05 С .20+ 0,07

Хлорид кадмия (И)*" 12 0,04+0.01 0,18; 0,01 .10± 0,04

Нитрат свинца fil)* 12 1,60+0,03 12,00; 0,28 ,50+ 0,05

Хлорид меди дигидрат" 10 0,б8;0,01 i,eo± 0,05 5, .80+ 0,05

Нитрат диоксоурана (VI)4 10 3,10+0,06 "23,80; 0,93 40 ; ,10± 1,21

Примечание. « - концентрации приведены по иону металла

£ 07Н0Б5КИЯ вешеств, нару^аош::;: проведение нервного импульса (фосфакол) к био?нергетпческ:ь' процессы (2,4-дпннтрофенол, йода-цетат, дпанпд калия). Так, например, да*е ЬС'об для планида калия превышала его ИД?; (0,1 мг'л) в 450 раз.

Учитывая избирательную чувствительность КК к возбудителям инфекций, представляло интерес сравнить чувствительность КК перевиваемых линии и диплоидных штаммов к веществам о различным механизмом токсического действия.

Из числа линий клеток, находящихся в коллекции Центрального банка культур клеток ВС при НИИ военной медицины Минобороны РФ (г.Санкт-Петербург) для исследования нами были выбраны следуклцпе линии: ВНК-21, НеЬа, 1_део, 1Х->ЫКа, Кер-2, КТС, СПЭЕ, ФЛЭЧЭ85/13-

Выбор указанных линии КК обусловили следующие обстоятельства:

- сохранение походных свойств КК при пассировании;

- высокая пролиферативная активность, в частности, при мо-нослойном способе культивирования;

- сохранение жизнеспособности пула (не менее 50-60 % общего количества клеток) в течение 48 ч , в том числе при транспортировке е виде монослол или суспензии е диапазоне температур 1-25°С;

- способность к репродукции (культивированию) на синтетических питательных средах (среда Игла, среда 159 и др.) о добавлением сыворотки крупного рогатого окота (КРС) и антибиотиков.

Данные, характеризующие чувствительность указанных линий •клеток и диплоидных штаммов к действию токсикантов по показателю изменения проницаемости клеточных мембран к витальному красителю, полученные с помогаю прижизненной окраски трипановым синим, представлены на табл. 3.

Как следует из представленных данных, чувствительность различных КК к воздействию токсикантов практически одинакова. Так, например чувствительность КК линий Нер-2, НТС, ШГ-МКо и

ФЛЗЧэ85/13 к действию цианида калия была практически одинаковая и составила соответственно. 57,2+1,83; 66,45г1,45; 67,28±1,74; 64,51±2,17 и 67,1±1,2 мг/л. Различия недсстоверны р > 0,05. В то же время ив полученных результатов следовало, что КК лини:: 1,320 оказались более чувствительны к действию 2,2'-дихлордизтилсуль-

Таблица 3

Сравнительная чувствит&зь ность различных линий клеток и диплоидных

птамов к действие токсикантов в концентрации [.СЧе, п-8 -—---;

Название г-цес-тва ¡Летальные концентрации для КК и диплоидных штаммов, иг.л"1, (х±ш)

•-1---—1-1-1---

I Нер-2 \ нтс I 1.02У \ шт-мк^ ! шчдевю

_I-:_1_!___1-

п-нитрофекнлдиэтплфосфат 615,00±11,4С 620,00110.05 609,00+14,10 613,00*10.50 616,10+12.60

Тзтразтилсвикец 17,00= 0.42 17,54+ 0,30 13,20+ 0,76 16,35+ 0,71 17,03± 0,46

КОМ 67,20± 1,8? 65,45+ 1,43 67.28+ 1,74 64,51+ 2,17 57,10± 1,25

2,2'-гихлордпэтплсульфпд 16,20± 0.65 15.08+0,74 12,32± 0,28 16,30+0,14 16,20± 0,65

Е-хлорвиниллихлорарсин 21,50+ 0,43 20,06+ 0.88 16,01+ 0,50 21,10+ 0,19 21,50+ 0.48

Хлорид ртути (И)"' '0,73x 0,05 0.71+ 0,04 0,71+ 0,06 0,73+ 0,08 0,72± 0,03

Хлорид кадмия Ш)** 0,18+ 0,01 0,17± 0,04 0,17+ 0,02 0,18+ 0,02 0,17+ 0,01

примечания: л - аналогичные результаты получены для КК линий СНсВ, НеЬз;

** - кекцентрации приведены по иону металла.

о::да ¡иприта/. Так. пори?а длч КК линии составила

>.:г'л. з для друг::;: линии КК, ::í числа исследованных, от до i'f. 2 i.;? л. Е это;: сене;: лвльнепшпе исследования по

оценке- токсичности иприта и его метаболитов проводили на К К линии Lyog. Порог чувствительности изученных линии клеток к исследованным токсикантам превышал значения ЦДК в 100 и Солее рае. Данное обстоятельство обусловило с одной стороны, псигк применение различных методически:: приемов для повышения чуЕствитель-нооти биообгекта к токсикантам, а с другой - использование тонки;: критериев оценки морфсф-нкипонального состояния клеток..

С целью исследования возможности повышения чувствительности КК к воздействию модельных токсикантов е качестве которых были выбраны планид калил и сулема, изучено влияние различных физически:: и химическ::;: факторов средь: - рН; температура инкубационной среды; добавление е культурал!ную среду гормонов :инсулина или преднпзолока) и позацетата натрия.

Действие перечисленных факторов на клетки не вызывало достоверных различий е % 'р > 0,05) гибели клеточного пула в каждом отдельном случае (табл. 4). Число нежизнеспособных (окрашенных; клеток соответствовало естественной гибели при обычно:.: пассировании КК. При атом минимальное число ' окрашенных клеток наблюдалось при инкубировании КК е среде Игла при рН ''.2. а ¡максимальное значение 3,2 " - при добавлении в среду Кола преднизалона в концентрации 0,3 мг\чл. Е то же время значения LCos КО;! :: HjClg для КК линии LLC-íyIK'j на фоне действия факторов среды существенно различались.

Сдвиг рН среды Игла в кислую сторону с 7,2 до 6,8 не сопровождался существенным изменением чувствительности КК к действию токсикантов. Так, LCos цианида калия и сулемы для КК при рН среды 6,8 составили, соответственно, 35,50 и 0,17 ¡.:г'л, а при рН "',2 - 45,0 и 0,2 ыг-'л. Различил значений LCos исследованных токсикантов для КК при рН среды 5,3 и были недостоверны (р > 0.05).

Инкубирование КК с токсикантами при 40 1JC, а также предварительная обработка клеток преднизолснсм пли подецетатом натрия в концентрация;:, соответственно, 0,3 и 0,05 мг мл повышала чувствительность клеток к действ!» цианида калил и сулемы. Так. LCos цианида калия и сулемы для КК при предварительно?: обработке кле-

Ел::ян;:е ::г;лекен::я гкзгг- occzzbb спел;: ;: угл'ы;;:

на ^уЕГТЕПгелькс'-'гть Кг. лпч:;:: LL0-!,'1> к

Д<?ЙТ5130 70КСККЗНТС-В CKCN I! HgClß)

Вг'&лепггзие 'Ч;:"ло окраш-кны:-: ! LOe?, нг-л

ç.sKTCps п его глегон лрп д-и- ■--;----—

ьел;:ч::ка ;c-'e::i: фактора, О! КОК i KoOIq

-L

рЬ>6,8 е ,24 09 , 50 ,J Г j , ^ 1

т р , ,55} . 0Г: 4 4—. 50' . 08 + 0. 25 )

Р. . £0 - Г ,00 0 .20

ЕГ ■■ i . . 16'.' ; 45, 7*5' ; .15 4- Г: - ? 25)

Лолапетат На. •ч .25 - - : i .' ,51 п ,15

ó,05 мг.мл"* !" 5 .40 т £ , , 10) (1? . 02 + 17. -0 ; ¡.о .12 4- Г _ 20)

Предк::голсн:

- 0.03 >ч .05 56 П П ? - - ■5 ~ 1= , ¿ и

.11 + ?, . 00 : ' —'.О ,10 - 61 . 90) ; 0 , OB + 0. 42 )

- 0,00 :.:г.;.;л~- . 20 1 .*-- , 04

.с В - Í, ! I -С 1 - 4- V " .-_ , . Í0 , 'J.2 -4 Г, - • 05)

Кнгулпн, Т' — 5 i , 00 0,40

1,00 НГ. ЫЛ-'*' ■"_ 5. г _ ,ц ■45 .10 9 '0 ) ! Г' 0 1 ▼ 0 52)

Инкубирование

- т-ченпе:

- 1 -; лрп 40 °0 ; i « 1 ~> ! 90 0,' 10

О >'£ ; £ _ ,08) ; -J , 90 4 5, > '4) !'0 ,06 4 0, 14)

- 10 >:пн при ri \ 51 00 0,09

40 ;-0 + 50 Р, , 04 4 Ч — ? ,15) -¿с . с'0 4 5В. 20; со ,15 4- Г'. 53)

>лик при 07 °0

ч

ток предкпголгно!.' г кзкцентрацли 0,5 i.:r л состав;:ли, есответе-гненнс, i.? " О.О* мг'л,' на псряд^к пенызе пс срагнешк с кнтактнши клетками «инкубирование КК на среде Игла с добавлением токсиканта).

Инсулин и преднизолон в концентрациях, соответственно, 1,0 и 0,03 мг/мл оказывали противоположное, защитное действие на КК. При этом LC'js исследуемых вешеств для клеток возрастали в 1,2-2 раза по сравнена с пнтаксными КК и составили, соответственно, 56 и £5 ыг-'л. Аналогичная, инсулину, тенденция наблюдалась при кратковременном (10 мин) нагреве клеток до 42 'JC ("тепловой шок") и последующим инкубированием КК с токсикантами при 37 с'С. При этом LC'ob для исследованных токсикантоЕ составили, 51 и 0,3& мг'л. Таким образом, проведенными исследованиями доказана принципиальная возможность повышения чувствительности клеток к действию токсикантов.

Среди исследованных методических приемов, повышающих чувствительность КК к токсикантам, наиболее значимыми оказались: инкубирование клеток с токсикантами при 40 °С; добавление в среду Игла преднизолона пли нолзпетзтэ в концентрациях, соответственно, 0,3 и 0,05 мг/мл.

Другим направлением повышения чувствительности тест-систем является применение прецизионных методов оценки морфофункцио-нального состояния биообъекта.

В качестве одного из таких методов было использование растровой электронной микроскопии (РЭМ) для исследования топографии клеточной поверхности при действии на КК различных физико-химических факторов.

С помощью РЭМ установлено, что ряд физических и химических факторов изменяют топографию клеточной мембраны. Самыми общими проявлениями были: бульбарные выпячивания цптоплазмагической мембраны, клазмзтозные пузыри в виде "четок" (bletbing-), глубокая складчатость, участки разрыЕов мембран. Указанные изменения топографии клеточной стенки являлись косвенными свидетелями нарушения проницаемости мембран и свидетельствовали о нежизнеспособности клеток. Использование РЭМ позволило также выявить изменения е топографии клеточной стенки КК при действии на них токсикантов (.КОМ, KgCi'2) в концентрациях, соответствующих уровню их ПДК. Так, в контроле определялись как распластанные клетки, так

- "id -

к клетки, нагдаядаеся в стздии прикрепления к стеклу (рис. 1,. гель б? клетки по мере распластывания жел усиливавшуюся склалчэ-тость гребневидного характера. Гребешки шириной 0.1-0,15 ыкм переходили у основания клетки в микроворс.пнкп. При повышении кратности увеличения объектива в 2 рвга (рис. 2) у находящихся на ранних стадиях прикрепления к субстрату клеток выявлялись кону-соЕплные стрсстхи-филсподии, предназначенные ллл формирования межклеточных контактов (Баепл-сс А.5.. 1&S0: Конев С'.Е. с соавт., IS8?).

Воздействие сулемы в концентрации 0,005 мг/л на КК линии LLC-jMKa (рис. 3) приводило к снижению плотности клеток на подложке из-за нарушения адгезивных свойств, при этом на поверхности клеток появлялись бульбарные выпячивания цитоплавматическоп мембраны и клазматозные пузыри в виде "четок" (blecbinf). Эти изменения необратимы и свидетельствуют о гибели клеток.

При действии на КК линии LLC-MK? цианида калия з концентрации 1,0 мг/л (рис. 4) отмечались выраженные изменения микрорельефа поверхности мембран в виде раффлоподсбной складчатости, участки разрывов мембран, что свидетельствовало об их дегидратации и гибели.

Кспользсванпе гистологических и гистохимических методов сценки мсрфсфункцпонального состояния клеток позволило обнаруживать с помсаью КК перевиваемы:-: линий иприт в воде в концентрации 0,05 мг-'л, что в 10 раз меньше его максимально допустимой концентрации. Однако сдерживающими факторами для их внедрения в практику проведения ХТЗ являются длительность получения результатов, необходимость высокой квалификации персонала, наличие на снабжении в сзнитарно-эпидемиологических учреждениях МО РФ дорогостоящего оборудования.

р этой связи актуален поиск экспрессных, высоко чувствительных, легко воспроизводимых, простых в аппаратурном оформлении методов оценки функционального состояния клеток для выявления мпк£околпт-.еств Еешестз в Е-оде. Таким, по результата}.-: наших исследований, оказался метод оценки интенсивности бпохемплюмп-несценипп.

Рис. 1 Нзтивная КК линии LLC-MK2. Электронная микроскопия. Уе. 5000.

Рис. 2 НатпЕкая КК линии LLC'-MKe. микроскопия. Ув. 20000.

Электронная

2. ОЦЕНКА МИЗНЕСЛОСОШОСТИ ОЕГОК С ПОМОЩЬ»! ЫЕ7ЩА РЕГИСТРАМИ* ИНТЕ!1СИБНОСТК БИОХШШШНЕСЦЕНЦШ!

Для изучения интенсивности лшинолаавискмоп 'БХ КК мы пс-пользевали следующие линии клеток: ЕНК-21, HeLa, Laae. LLC-MK«, Нер-2, ПТС, СП5Е, 5>ЛЭЧэв5/12.

Начальный этап исследований заключался в определении оптимальных концентрации лшпнола и кобальта, дающих максимальный хемилю^яшесценгшУ.'р.тв^т' клеток.

Проведенными 'исследованиями установлено, что оптимальные концентрации инициаторов БХ (люмпнола и кобальта)'е инкубируемой смеси составляют 0.14 и 0.004 мг/мл, соответственно. Эти значе-• ния концентраций реагентов нами использованы в дальнейших исследования х.

Опыты по изученно возможности использования метода регистрации интенспЕностн БХ для оценки мсрфофункшюнальксто состояния клеток при действии ка них токсикантов проводили на КК линии L929. Последние культивировались в стандартных условиях и находились в экспоненциальной фазе роста.

Критерием токсичности исследуемых вешеотв для КК являлось изменение интенсивности БХ '.возгорание пли гашение) по сравнению о контролем.

При использовании хемилюминесцентного анализа КК линии Lgjo оказалась наиболее чувствительной к веществам, нарушающим процессы энергетического и пластического обмена е клетке, е частности, к КС", хлорвинил-днхлорарсину, соединениям тяжелых металлов (Н<г2+, Cd2+, Pb2+ и 0ue+), а также к алкилирущему агенту - 2,2'- д,1-Е:лордиэтилсульф1щу (табл. 5). Отмечалась избирательная, ка уровне ЦЦК, чувствительность клеток к воздействию хлорида меди и КОМ, тогда как, напротив, по отношению к фосфаколу она оказалась слабой. Аналогичные данные были получены и для других линии КК: БНК-21, HeLa, LLC-MK*, Нер-2, НТО, СПЭЕ, ФЛЭЧзв5/13-

Как известно, часть из известных полл>отантов, содер.чалшхся в Еоде, действуя на "системы-мишени", проявляют коергпзм, поэтому покомпонентное обнаружение веществ на уровне ппк не позволяет делать еыеод о доброкачественности воды, ее пригодности для хозяйственно-питьевых нукд. Е этой связи нами было изучено 'влияние

Таблица 5

Параметры токсичности химических вещее тв для культур клеток ЬЬС-;/К2, п=12 (х±ш)

Название 1 I !Рремя | Концентрация, мг.л- 1 1 ¡Соотношение

вещества 1 деист- ! ! ! Нкснц. зффект.

|вия, ч | ! КС'о5 1 ЕС! 6 | ЕС 1$ (вк)" : | ЕС-1б(вк) ЕС 1ц |

1 3 4 5 д ;

п-нитрофенплдпзтилфссфат 2,0 4,70+0,100 7,50+0,240 615,00x11,40 82,0

2,4-динлтрофенол 2,0 0,41±0,030 1,'30+0,160 ЗЭ,50± 0,94 20,8

йодацетат натрия 2,0 4,20+0,150 18,80+0,540 123,00: 5.10 6,5

кем 0,5 0,15x0,020 0,23±0,050 67,20: 1.83 240,0

Фтсрацетат натрия 3,0 9,30+0,300 24,60+1,700 не провод. -

2,2'-дпхлордпзтилсулъфпд 4,0 о,ве+о,оео 2,74+0,300 16,20+ 0,65 5,9

2-хлорвпнплдпхлорарспн 2,0 0,24:0,020 3,76+0,140 21,50+ 0,48 5,7

Хлорид ртути (II)" 2,0 0,01±0,005 0,17+0,060 0,73± 0,05 4.3

Хлорид кадмия (IIЛ 2,0 0.03+0,005 0,43+0,030 0,18± 0,01 0,4

Нитрат евпнпа '11> ^ 2,0 0,18+0,010 1,40±0,080 12,00+ 0.28 3.6

Хлорид меди зигидрат* 1,0 0,12+0,050 0,42±0,024 1,60+ 0,05 3,8

Нитрат диоксоурана (VI)* 3,0 0,60+0,020 4,80:0,100 23,30± 0,93 4,9

Рицин 2,0 1,35±0,040 6,72+0,050 не проЕод. -

примечания: * - концентрации приведены по иону металла;

** - эффективная концентрация, полученная методом прижизненной окраски.

смеси ряда синергистсв на КК л::н:::: ^с-^г-: К 1 - С!,:егг СаС'1 ^. ССI £. Не-П^; .' : - смесь КСГ ;: '1'ъ - Конечная концентрация токсикантов в смеси составила: СиП« - 0,01 мг'л; С'сгПо - 0.005 иг'л: КдС1г - 0.005 мг/л и КОН - 0,1 мг л.

По регулыата.м опенки состояния клеток методом регистрации интенсивности бнояемплкмпнесценцпп установлено, что при действии ив КК по отдельности лакных веществ в указанных концентрация:-: каких-либо изменений в функционально].: состоянии клеток не выявлено. ■

При совместном же действии токсикантов, взятых в указанных концентрациях, наблюдалось гашение хемплюмпнесцениип на 35% по сравнению с контролем. Е данном варианте УЛ-ответ КК, который можно рассматривать как интегральную оценку токсичности исследуемой пробы воды.

Таким образом, использование КК перевиваемых линий для обнаружения мпкроколичеотв веществ можно рассматривать как зкс-пресс-метод интегральной оценки качества волы, содержащей вещества, нарушающие процессы биоэнергетики и синтеза пластических компонентов.

Существенное место в схеме проведения химике-токсикологической экспертизы воль: в настоящее время занимает групповое обнаружение токсикантов в исследуемых пробах. Е этой связи нами' была изучена возможность использования лпгандов для групповой индикации тяжелых металлов с помогаю КК.

В качестве лпгандов мы использовали следующие соединения: дигидротартрат калия; этилендиаминтетраапетат; тетраборат натрия; дигтилдптпокарбамат натрия; гексагидробромид -01,4-ли-Е(амп-ноэтил)аыпноэтилппперавпна 3>.

Выбор указанных лпгандов обусловлен их способностью образовывать прочные комплексы с металла.;;!, а также малой токсичностью.

Критерием токсичности последуемых веществ для КК являлось изменение интенсивности Б?-: (возгорание или- гаиенке) по сравнению с контролем.

О помощью Хл-отЕета изучена острая токсичность лпгандов на КК линии • Установлено, что наименее токсичным для клеток оказался диэтилдитиокарбамат натрия в концентрации 1;:10~- М.

Высокая эффективность КК. для проведения групповой индикации

тяжелых металлов лрсиллюстгигсвана результата.:;; их практически;'; annclaun::. Тек, на::: оиенпЕалась токсичность гелепрс-одной есды с пгЕестннм химическим составом, в которую дополнительно добавляли соединения тяжелых металлов и Hf**) в концентрация:-:, соответственно, 0,5 л 0,05 мг-'я. Контролем являлась водопроводная вода, соответствующая требованиям ОанПиН 2.1.4.553-95, с известным химическим составом. При этом в опытной пробе, содержащей дополнительно внесенные соединения тяжелы;-: металлов наблюдалось гашение хемилюмпнесиенинп. После добавления в опытную пробу лиганла У21-ответ КК приближался к контролю.

Полученные результаты свидетельствуют о принципиальной возможности использования KK для групповой индикаипп соединений тяжелых металлов. Использование данной методики (стандартность исследований, простота и воспроизводимость результатов) позволяет обнаруживать соединения тяжелых металлов в концентрациях 1x10"- - 5x10"" мг-мл, т.е. на уровне их биологической активности.

Результаты проведенных исследований послужили основанием для разработки методического приема групповой индикации тяжелых металлов в воде с помощью культур клеток перевиваемых линий, который заключается е регистрации ХЛ-ответа исследуемых двух проб, содержащей и не содержащей диэтилдитиокарбамат На.

Обобшая полученные результаты, можно оценить в обшей форме информативность критериев норфофункппонзльного состояния клеток при действии токсикантов. Суммарные данные об информативности критериев оценки жизнеспособности клеток приведены в табл. о.

Как еидно из данных табл. 6, наиболее информативными в опенке токсичности исследуемых веществ, содержапихся в воде, оказались гистохимические и бпохемилюмпнесцектные методы исследования морфофункппенадьнего состояния клеток.

Проведенная нами экспериментально сопоставительная опенка токсичности исследованных веществ для различных биологических тест-объектов показала, что КК перевиваемых линий наряду с другими биологическими объектами могут быть включены е тест-систему бпотестпровакил качества воды. Результаты испытаний на дафниях показали достаточно высокую чувствительность данного биообъекта к действие Ееществ, нарушающих генерацию и проведения нервного 2!мпудьса. Так. ЛКгв рогора, фосфакола, хлорофоса составили,

to w

о

И H

tj я:

0

01

in t-< о

ч

W К О

Ен U О О

О С-

Cl M

ni U! Cl

w

Ci H 11'

va m

H tri

-frita

Cl H

и

¿i a

И :к

" <!'

z: я

m о

x ai о

Д 2

I к

Ен О

Ol о

ч о

p.' q.

'ь

tr

га S

(Ч

о к

о, <п

Ег< Ж

П Д

СЙ О

IX Q.

CT-'

nJ ,,

Ж Л

"■i к

И ri

ffl CTJ

H CJ.

^ ilî

iTl о

w

ll<

« m

I- < о

tlï к

a.

p-l

та

-t

+ 4

+

Ь +

+ -i

ra

ru

ni m

и ai m C)

Г 1 H о O.

¿i H l£f

tí ^ :e

Cl о <ii E

Q. а:

U i); in Ë .л H

ПЗ m &

14 tr E а о & i

? ¡i; p H о

nj ц 'li G.

ai p tïî H ai e:

ч H ni II ni h]

с Çl Ы •11 H г i 'il д

Q ni m 1-1 41 â -

а Ci tr • r; H

i-i о ■е- Li 'Il œ IL i=r m n! tvi и ili u.

n ctj (Tj О 1 С p.' R

-M ■о m о 'Г— 3 m m H í-'ч

'il i i"î

Ж Пи G к

и a> M

о

s

п: 11

о

к

г i ■i'

Ih,

H ф

a

о,

CI)

с

ф Я"

ff о

H

I).

g

ÎK m о О,

(Т)

!«

i

nj t?

n3

D,

О

'li

il)

4 'Л

Cl Q.

О О

ÍVj н

ш о

D,

о a-

Cl О пз

v-t тч

Hi

14 m

í-u

g щ

t-i H ni

о

ft а (4

g § о

п.

1Ц сч

(Il (Il al

D. о.

С 13 1 гв i

1 1 4 _

n:

m

;r

ili

и,

G

ci H

C_i

соответственно, 0,00i25::0,cc0'5; 0.015Си0.004и П 0, OOi-iïO. 0002 l'T'Z, Ззвкый $экт объясняется наличием у беспогзоночньк хзлпк-р-гических механизмов спнаптической передачи нервного импульса, на которую мог;.'? сказывать влияние фосшорорганические соединения ;,Альберт А., 1989; Красовскии Г.Н. с ссавт. 1991). Параметры ЛК50. 5ЛЯ указанной группы веществ также не превышали их ДНК в воде.

Достаточная чувствительность наблюдалась у тетрахимен к веществам, нарушавши процессы биоэнергетики. Об этом свидетельствовал тот факт, что 01 lie цианида калия была близка к ПДК его в Еоде. Так, соотношение CI lie-''ПДК для цианида калия составило 1,0. Применительно к 2.4-ДНФ, акрплонитрплу чуЕОТВИтельнссть тетрахимен оказалась существенно ниже и составила соответственно, 0,32 и 1,3 мг-дм'-у, что превышало величины ¡к ПДК '0,03 и 0,1 мг-л; в 10-13 раз. CI 150 для акршганитрила, цианида капля, 2,4-ЛКФ составили, соответственно, 5,40±0,030; 1,51+0,030 и 4,22±0,006 мг-л, что превышало величины их ПДК в 50 и более раз.

В отношении группы веществ, нарушавших синтез пластических компонентов е клетке чувствительность простейших была толе неодинаковой. Так, достаточно высокая чувствительность тетрахпмен отмечалась при воздействие на них Ндт2, С'сГ2. Fb+~ и Ou'2. При этом соотношение CI lia'1ЩК составило соответственно, 4,0: 3,0; 1," и 0.2 раза. Применительно к иприту уровень чувствительности (CI lie) простейших превышал установленные нормативы максимально допустимых концентраций в воде (1 мг/л) Е 9,1 раз.

В отношении группы веществ, нарушающих процессы генерации и проведения нервного импульса (рогор, фосфнксл, хлорофос), данный тест-организм оказался малоинформатиЕ.чым. Даже параметр токсичности CI lie для указанной группы ЕещестЕ составил, соответственно, 14,£00±0,0220: 12,310+0,0600 и 12,250+0,0140 мг л, что превышало их ПДК в 200 и более раз.

В1 то не время, апробация данных биотестов на природных водах показала ряд сдерживающих моментов для практического применения при оценке мимической безвредности воды:

простейшие и беспозвоночные - типичные представители мезо-сапробных Еодоемов, которые содержат в себе большой перечень органических и неорганических веществ, что обусловливает высокую резистентность данного биологического объекта к действию много-

численных ксенобиотиков:

высокая зависимость получения резулюов тестирования исследуемы;: проб воды ос факторов среды 'i1-. рн". содержание рассво-реннсго кислорода е годе и др.?.

Е'ажкым является и тот факт, что в санитарно-эш:демпслоги-ческих учреждения;; ЕС PL нет необходимых и достаточны;: научно-методических и материал но-технических предпосылок для проведения исследовании на указанных выде биообтексах. особенно в современных социально-экономических условиях.

Наряду с изложенным особенно важно подчеркнуть. что разработка, и прежде всего. Енедренке КК перевиваемых линии е практику работы лабораторий медицинской службы для оценки химической безвредности водь: во многом стало возможной благодаря созданию коллекипп КК, храняйвйсся в Центральном банке культур клеток ЕС при НИ] военной медицины Минобороны РФ (г.Санкт-Петербург, который является довольствующим органом по снабжению КК в масштабах ЕС РФ для практических учреждений медицинской службы.

выкоды

1. Внадренпе КК в систему биологической индпкаппп позволяет совершенствовал алгоритм химико-токспколопгаеской экспертизы проб воды. Особенности информации, получаемой с помощью КК, состоит в интегрально:/; характере восприятия и отражения цптотокси-чееких воздействии, обусловленных совокупностью содержащихся в воде токсикантов, что существенно повышает надежность оценки степени опасности употребления личным составом еолы.

2. Оценка токсичности веществ, содержащихся е воде на культурах клеток предполагает соблюдение следующих условий: использование КК е логарифмической Фазе "роста клеток", температуры исследуемой пробы в пределах S5 - 39 сС, рК анализируемого раствора в диапазоне ",о - 7.2, время трппсинпзэцпп клеточного мо-кс'олоя 1-3 мин, минимальное время инкубации ЬХ с анализируемой пробой составляет 3-4 ч, ионная сила раствора 1,1 - 2,6

3. Гистохимические и бпсхемплюминесиентные методы исследования наиболее полно отражают морфофункипональное состояние клеток при действии на них токсикантов. Использование указанных ме-

голов псзооляет сбнаружиЕзть изменения ж клетка;: при воздействии на ни:- веществ в диапазоне концентр-пии Ю-'- - 10~:- мг л .

4. Чувствительность натиЕнын культур клеток и ДИПЛОИДНЫХ штатов (Нер-2. НТО, Нема, 1Д.С-МК2. СПсЕ, ал&4э85-'13) к веществам с различным механизмом токсического действии ( л-нит-рс'фенплдиэплфссфату, тзтразтилсвпниу, цианиду калия 2-хлорви-нплдихлорарсику. хлориду ртути'-1 и хлориду кадмия'- ,. практически одинакова, однако к действию алкилирующих агентов, например к 2,2'-дпллсрдиэтплсульфпду, Со лее чувствительны КК линии Кс^е-

5. Предварительное воздействие на КК ряда факторов среды рН), обработка преднпзолоном, иодапетатом натрия пли инсулином приводит к изменению их чувствительности к воздействию токсикантов (например, цианиду калия, сулеме). Среди исследованных методических приемов, повышающих чувствительность КК к токсикантам, наиболее значимыми оказались: инкубирование ¡-леток с токсикантами при 40 °0 в течение 1 часа, добавление в среду Игла преднизолона пли полацетата е концентрациях, соответственно, 0,3 и 0,05 мг1 мл.

5. Использование КК для групповой индикашш тяжелых металлов предполагает предварительное введение ь пробу воды лигандов, которые должны обладать избирательной чувствительностью и минимальной токсичностью. Из числа исследованных лигандов, наименее токсичным лля КК является диэтпллитпокарбамзт натрия в концентрации 1.10"4 М. В свободном состоянии он образует хелатные циклы с тяжелыми металлами (Си': + ,

Опенка токсичности исследованных веществ на инфузориях СТе^асЬупепа ругИ'оггШз) показала достаточно высокую, на уровне ПИК, чувствительность к группам веществ, нарушающих процессы биоэнергетики и синтеза пластических компонентов клетки. Так, 0112в зкр:1лонптрплз, планида калия, 2,4-ДНФ и люизита для инфузорий состэв:1лп, соответственно. 1,3±0,05; 0,13:0,01: 0,32±0,012 и 2,14±0,02 ,мг-''л. Указанный тест-организм можно рассматривать как один из перспективных биологических объектов для оценки безвредности воды.

5. Опенка токсичности исследованных веществ на беспозвоночных (РарЬта ггагпа) в лабораторных условиях показала высокую, ьз уровне 1ШК, чувствительность дафний к действию веществ, нарушавших процессы генерации и проведения нервного импульса. Так. ЛКье

crops.. фсгфзксла. хлорофоса к люизита для дафнии составили, соответственно, C'.CC^sO.COD?: О.С'1£гО,СО« и C.XliiO.OOC'S мг/д. Однако надежность результатов тестирования :-:а дафниях вовмо.чна только при кеоткси стандартизации условий проведения опытов. Апробация теот-органпзмз на природной воде показала высокую зависимость отклика тест-организма от факторов среды (рН, температура, общая минерализация, сезонность, содержание растворенного 0£ в воде, 'хлорирование), что ограничивает использование биобъекта в системе ХТЭ воды.

9. Сравнительная оценка токсичности вещестг к исследуемы!.; тест-организмам показала, что наиболее перспективными биологическими объектами в плане создания тест-системы биологической индикации ксенобиотиков, нарушавших процессы биоэнергетики к синтеза пластических компонентов в клетке являются простейшие СTetraehyroena pyriforrois) и КК перевиваемых линий, данные объекты обладают практически одинаковой, на уровне ЦПК чувствительностью к указанным группам веществ. Б то же время успешное применение КК перевиваемых линий в вирусологической практике и их наличие в санитарно-эпидемиологических и лечебно-профилактических учреждениях медицинской слукбы ЕС РФ дает возможность использования КК наряду с другими биотестами в практике химике- токонкологической экспертизы воды специалистами окружного звена армии (флоте).

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. К вопросу об оценке качества воды е полевых условия;-: '•'/'Материалы научн. конф. молодых ученых и специалистов академии. - Л.: Е'медА, 1990. - С. ISO.

£. Перспективы оценки качества еоды е полевых условиях с помощью биотестирования /'Материалы XVI научн.-прзкт. конф. врачей.- Чита, 1390. - С.42-43 (соавт. Куиенко С.А., Терентьев Л. П.).

2. Ьпотестированпе качества водь: на гидрсбионта: -/Профи-лактичегкая медицина. Состояние и перспективы: Материалы научн. конф. - Л.: ЕМедА, 1991.- С.90 (соавт. Куценко С.А., Терентьев

Л.П. ; .

4. Опенка качества ведь: в экстремаль ных сктуахгах с лошзью хем;о:минеспентксго метода ' Токсикологические лроС-л*кк химических катастроф. - Л., 1591.- 0.115 i соавт. Куценко О.А., Геренть-ев Л.П.).

5. Опенка качества воды с помощью тест-организма Tetrahyme-na pyriíorrr-is Цитология. - 1992. - ;-¡9. - С.418 (соавт. Куиенко С. А. . Ирлпна Ji. С.',>.

5. Аналитическая система для тс.ксико-гигиенической опенки качества воды в полевых условиях /-'Опыт советской медицины в Афганистане. - М., 1282. - С.189 (соавт. Нзрыков В.И.).

". Методические подходы к опенке и прогнозированию опасности загрязнителей водной среды '•■'Экологическая безопасность городов. - CííG.: ЕО'едА, 1933. - 0.205 (соавт. Куценко С. А. , Теренть-ев Л.П.).

8. К вопросу -об использовании культур клеток перевиваемых линий в опенке токсичности вешеств '-''Актуальные проблемы разработки медицинских средств и методов сохранения и восстановления боеспособности личного состава ЕС. - СПб., 1994. - С.144-145 (соавт. Раевский К.К., Яргомский Б.А.).

9. Основные направления совершенствования гигиенического контроля за водоснабжением войск в полевых условиях /.-Актуальные проблемы разработки медицинских средств и методов сохранения и восстановления боеспособности личного состава ЕС. - СПб., 1994. - С.111-112 (соавт. Нзрыков В.К., Еовтюшко В.Г.).

10. Метод культур клеток и разработка аспектов его применения в практике медицинской службы армии и флота //Военная мели-пина. Проблемы профилактики, диагностики, лечения экстремальны:-: ситуаций: Материалы научн. конф. - М., 1994. - С.229-225.

11. Информативность методик биотестирования и хемплюминес-ценции в оценке качества питьевой воды - -'Воен.-мед, журн. 1994. - Ni. - С.52-54 (соавт. Куценко С.А., Терентьев Л.П.).

12. Гигиеническая диагностика качества воды на основе хеми-лшкнесцентного анализа -'Проблемы санитарно-эпидемиологического благополучия. - СПб., 1994. - 4.1. - 0.129-122 (соавт. Захаочен-ко ы.П., Гайдамака Е.В., Романов П.Г.).

13. Гигиеническая диагностика качества воды с помошью еодо-рослеи Sc-enedesri'ius c;uadricaudus -'/Проблемы санитарнсэпидемиоло-

гичегкого благополучия. ■- СПб.. i- 4.1. - С. 125-128 (соавт. Захарченко ).',.П. , Гайдамака Е.Е. , Романов П.Г.;.

14. Гигиеническая зкгпреее-впагнсстика токсичности дез::кфек-тантов питьевой волы с помощью бит-тестирования '''Гигиена и санитария. - 1994. - N9. - С. 3-4 (соавт. Захарченко М.П., Яковлева Л.Е. .Гайдамака Е.Е. . Ромашов. Б.Г. :.

15. Зколого-гпгиенпчеокал опенка трансформации веществ питьевой воды при обработке ее препаратом ACO'.-К '.-'Гигиена ;; санитария. - 19S4. - N4. - С. 18-20 (соавт. Захарченко М.П., Яковлева Л.Е.,Гайдамака Е.Е., Ромашов П.Г.>.

16. Обоснование, апробапия и внедрение системы снабжения санитарно-эпидемиологических и лечебных учреждении армии и флота культурами клеток: Отчет о НИ? (итоговый) /HJ£I Е?.' МО Р1<: -Руководитель К.К. Раевский. - Шифр "Еанк-2". - СПБ, 1994. - 152 с.

17. йспсяьеование культур клеток перевиваемых линий в качестве тес.тсксте)/гы для оценки качества воды, загрязненной ЕТЕ /.' Актуальные проблемы теоретической и прикладной токсикологии . СПб., 1995. - Т.3. - 0.65 ■ (соавт. Куыенко С.А., Раевский К.К., Яргомский В.А.).

18. Обоснование концепции развития полевого водоснабжения войск: Отчет о НИР (промежуточный) /НИИ ЕМ МО PS; Руководитель К.К. Раевский. - Шифр "Жажда", Ина. ¡i Р-"5-:. - СНЕ, 1995. - 49

г м

19. The study oi metal aalts toxicity m water samples ir: cell cultures by biocherr-iluminescence •'/International Simposimn on Biological Monitoring' in Occupational and Environmental Health. - Helsinki: Finnish Institute of Occupational Health, 1996. - P. 91-92.

20. Разработка метода ускоренного обоснования !-.ЩК высокотоксичных вевеств в питьевой воле для экстремальных ситуации Л'Фун-даментальные и прикладные проблемы современной военной токсикологии: Материалы научн. кокф. - СПб., 1996.- С. 13 (со,авт. Борп-сс-е Е.М. . ЬогданоЕ С.Н., Каменко И.П.).

21. Еиохемплюмпнес-центкый аналпг культур клеток перевиваемых линии, как метод выявления мпкроколичеств токсикантов в воде '■'К. прикладная химия, 1997. - Т.70. - ¡-Í5. - С.802-805 (соавт. Купенко С.А., ЕоробьеЕ-десятовскпи Н.Е.}.

22. Изучение токсичности веществ, нарушавших пластический

обмен. на культурах клеток перевиваемых линий о помошьк: биолюминесценции ¿укламентальные и прикладные проблемы современной Еоенной токсикологии: Материалы научн. конф. - СПб.. 1996.-С.НЕ :'гоагт. Нарыков Б.И. , Богданов С.К.'1.

23. Гигиеническая диагностика качества воды с помощью бпо-тесгировакия и хемилюмпнесценцпп ... Гигиеническая диагностика водной среды. - СПб.: Наука, 1995. - 'Г. 143-161 (соавт. Эахарчен-кс ILL.).

24. Исследование путей совершенствования оснащенности сани-тарнс-эпидемиологических учреждений ЕС Fi средствами сохранения и восстановления боеспособности при поражении факторами радиационной, химической и биологической природы: Отчет о КИР (итоговый; 'НИИ ЕМ МО РФ; Руководитель К. Раевский. - Шифр "Перспектива-!;'". - СПБ, 1995. - 155 с.

25. Обоснование предложений по со-вершенстЕОваноо оснащенности сангларно-эпидемиологических учреждений РА и EMS средствами сохранения и Еоссганозленкя боеспособности при поражении фактора;«: радиационной, химической и биологической природы: Отчет о НИР (итоговый) 'ЛУГА ЕМ 1,Ю Fi; Руководитель К.К. РаеЕский, - Шифр "Испаряемость". - СПБ, 1S96. - 222 с.

25. методические рекомендации по применен-по культур клеток в оанптзрно-зппдемпологетескпх и лечебно-диагностических учреждениях армии и флота. - : ГЕНУ МО РЬ, 1995. - 19 с. (соавт. =а-евокии К.К., Яргомский S.A.:.

£"'. Гигиеническая диагностика методов улучшения качества воды '-Гигиеническая диагностика водной среды. - СПб.: Наука, 1995. - С.201-209 (ссавт. Эахарченко М.П.).

28. Гигиеническая диагностика факторсЕ окружающей среды ''Диагностика в профилактической »медицине. - СПб.: Ш51Н, 1997. -515 с. ¡еоавт. Захарченко М.П., Каймулов Р.Г.).

29. медицинские аспекты обеспечения безопасности и жизнедеятельности человека при химических авариях ''Роенная наука и образование городу: Материалы городской научи, практ. конф. воен.-учеб. и научн. учреждений. - СПб.. 199''. - 4.2. - С. 157 (сонет. Борисов Е.Ь!., лопатпн O.A.).