Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Культивирование вирусов ядерного полиэдроза в перевиваемых клетках насековых. Выбор технологической системы культивирования

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Культивирование вирусов ядерного полиэдроза в перевиваемых клетках насековых. Выбор технологической системы культивирования"

РГ6 00

• * * Г)

',;''и '^АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ

ИНСТИТУТ МИКРОШОЛОГИИ И ВИРУСОЛОГИИ им. Д. К. Заболотного

На правах рукописи

ГЕРАСИМОВА Нина Глебовна

. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВИРУСОВ ЯДЕРНОГО П0ЛИЭДР03А В ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТКАХ НАСЕКОМЫХ. ВЫБОР ТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ 03.00.06 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Киев - 1992

Работа выполнена в лаборатории оредотв зашиты растений и экологии Всесоюзного научно-исследовательского института Молекулярной биологии

Научный руководитель - кандидат биологических наук.

старший научный сотрудник Вожко Н. А,

Официальные оппоненты - доктор медицинских наук,

профессор Васильева В. Л.

член-корр Международной академии информатизации, доктор биологических наук Вучацкий Л. П.

Ведущая организация - Институт молекулярной биологии

и генетики АН Украины,, Киев

Зашита диссертации состоится "/г" ¡-¿^Н1ш^г. в/<£_ часов на заседании специализированного совета Д 016.06.01 при Институте микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотного АН Украины по адресу: 252627, ГСП, Киев-143, ул. Заболотного, 154

О диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотного АН Украины

Автореферат разослан "_" _- 199_ г.

Ученый секретарь специализированного Совета кандидат биологических наук

Э. А. Коваленко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. В связи с обострением экологичеосой обстановки в регионах о интенсивным применением химических инсектицидов для борьбы с вредителями сельскохозяйственных культур. начинается интенсивный процесс внедрения биологических средств. Среди этих препаратов используются, в частности, и полученные на основе бакуловирусов. Вирусные препараты существенно отличаются от химических или основанных на действии токсинов (например. Bacillus thuringiensls) инсектицидов тем. что во-первых, бакуловирусы специфичны, то есть действие их избирательно. поэтому применение этих препаратов безопасно для нецелевой знтомофауны. теплокровных и человека, окружающей среды в целом, и. во-вторых, вируо является естественным природным регулятором численности вредителей в биоценозе, вызывая в популяции вредителей эпизоотии, устойчивые в течение ряда лет о передачей инфекции горизонтальным путем. В силу этого вирусные днтомопатогенные препараты были предложены ведущими специалистами ряда стран как надежные перспективные средства управления численностью вредителей [Ignoffо. 1968. Божко. 1980. Kelly. 1982. Oberlander. 19861.. К несомненным технологическим достоинствам бакуловирусов можно отнести также сочетаемость практически о любыми биологическими и химическими средствами, действие которых они усиливают, тем самым значительно уменьшая их концентрацию и удешевляя обработки.

До сих пор технология производства вирусных препаратов в нашей стране опирается на культивирование насекомых. При всей своей.очевидной проототе данная технология обладает рядом существенных недостатков, к которым следует отнести сезонность и неравномерность наработок, трудность получения препаратов с однородными свойствами, нетехнологичность и относительная ал-лергенность производства. На данном этапе в нашей стране указанная технология при всех ее недостатках является пока единственной. позволяющей решать практические задачи. В связи с этим весьма актуальной является разработка более современной технологии производства вирусных препаратов - в культуре клеток. Преимущества клеточной технологии заключается в чистоте и

стабильности свойств используемой культуры клеток, однородности получаемого продукта, уменьшении количества балластных белков. отсутствии внешних покровов насекомых, являющихся аллергенами для человека и. главное, в мобильности и технологичности производства. Качество и однородность полученной в культуре клеток вирусной биомассы определяет ее многоцелевое использование как для технологических, так и для исследовательских целей.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ Целью настоящего исследования является выбор системы культура клеток насекомых: вирус, превосходящей по технологическим характеристикам существовавшие ранее. способной продуцировать инфекционный вирусный материал и потенциально пригодной для последующего производства биопрепаратов. а также определение условий культивирования выбранной системы. Б соответствии с целью поставлены следующие задачи:

1. Охарактеризовать имеющиеся линии клеток насекомых по продуктивности, в случае необходимости получить новые, выбрать из них наиболее эффективные.

2. Определить рациональные условия репродукции ВЯЛ в клетках насекомых и изучить размножение вирусов в отобранных линиях клеток.

3. Удешевить питательную среду для культивирования клеток насекомых и, по возможности, перевести ее на отечественное сырье.

4. Разработать технологичный способ суспензионного получения вирусной биомассы в культуре клеток насекомых.

5. Оценить биологическую активность вирусов, полученных i n vi tro.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые получена в нашей стране собственная система вакуловирус: клетка, продуцирующей инфекционный ВЯЛ и перспективная для наработки вирусной биомассы в суспензии.

Впервые получена новая культура клеток капустной совки линии МБ-К023-987. удовлетворяющая требованиям технологии.

Впервые получены перевиваемые линии клеток ШЗ-ХО-685 и МБ -0304-788. способные продуцировать вирусы ядерного полиэдроэа хлопковой и озимой совок соответственно. Все новые линии депонированы в ВОКК(Б). в ЙОГ (Москва) за NN А-26.А-27 и А-28.

Вцделен новый высокоэффективный бакуловирус - ВЯЛ КО-3 -•поражающий не менее 8 видов .значимых вредителей сельского-хо-

- з -

аяйотва. способный инфицировать большинство наследуемых линий клеток насекомых. Депонирован во Всесоюзной коллекции вирусов института вирусологии им. Ивановского АМН России за !) ГКБ 8155.

Описан инфекционный процесс ВЯЛ КО-3 в клетках МБ-КСйЗ-987. Показана высокая стабильность этого процесса

Оптимизирована наработка инфекционных полиэдров ВЯЛ в клетках насекомых. Выявлены условия рационального выращивания (подготовка клеток и вирусного инокулята. температурный режим, режим внесения вируса, сорбции и др.) бакуловируоов в клетках как в моноолое, так и в суспензии. Для каждой стадии инфекционного процесса разработаны лабораторные методики. Впервые предложено использовать для культивирования клеток насекомых и наработки в них бакуловируоов сыворотки плодов овец - отечественного сырья и отходов проиэводотва.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Разработан лабораторный регламент получения биомассы ВЯП капустной совки штамма ВЯП КО-3 в гомологичных клетках линии МБ-КС23-987.

Разработаны методы получения первичных культур клеток и получена серия новых, имеющих практическое значение, перевиваемых линий клеток насекомых.

' Полученный штамм ВЯП КС-3 обладает широким спектром действия и может служить основой для создания препарата.

' Замена импортной фетальной бычьей сыворотки на сыворотку крови плодов овец позволит перейти на отечественное сырье -отходы производства каракульчи, что существенно сократит затраты на культивирование клеток и наработку в них бакуловируоов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты исследования докладывались на Всесоюзной конференции "Пути совершенствования микробиологической борьбы о вредными насекомыми и болезнями растений" (Ве-легож. 1986 ). Всесоюзной научной конференции "Энтомопатоген-ные вирусы и их роль в защите растений" (Новосибирск. 1988). I -ом ■ болгаро-советском симпозиуме по микробным пестицидам (Пловдив. Болгария, 1988). II-ом Всесоюзном симпозиуме по проблемам интеграции в защите хлопчатника от вредителей (Ашхабад. 1988). отраслевом совещании по биологическим и технологическим проблемам создания вирусных препаратов для интегрированной защиты растений (п. Кольцове, Новосибирской обл.. 1989). II-ом и III-ем Всесоюзном рабочем совещании "Молекулярная биология ДНК-содержащих вирусов, имеющих практическое значение

для сельского хозяйства и в медицине" (Киев, 198V и 1990 ). Ш-ем Всесоюзном совещании по культивированию клеток животных и человека (Пущино, 1990), Всесоюзной конференции "Питательные среды и сыворотки для культивирования клеток" (Кольцово. Новосибирской обл., 1991).

ПУБЛИКАЦИИ. Основные положения диссертации изложены в 12 научных работах, защищены 2 патентами и 4 рационализаторскими предложениями.

СТРУКТУРА И' ОБ' ЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, шести глав, обсуждения полученных результатов, выводов, списка литературы из 138 источников. в том числе 104 иностранных авторов и книги приложений состоящей из 16 приложений. Работа изложена на 186 страницах машинописного текста, иллюстрирована 33 таблицами и 42 рисунками, в том числе 18 фотографиями.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре литературы приведены сведения о получении вирусных энтомопатогенных препаратов в культурах клеток насекомых. Дается анализ современного состояния вопросов о системах баку-ловирус: клетки, о получении и культивировании маточных линий клеток, о питательных средах, о безопасности полученных вирусов для животных и человека. Описана репродукция бакуловирусов в различных культурах и дан анализ устойчивости оиотемы. Особое внимание уделено изучению возможных путей решения проблемы крупномасштабного производства бакуловирусов in vitro, в том числе новой технологии продуцирования вирусов ядерного полиэд-роза, основанной на рекомбинантных ДНК.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования явилась система репродукции энтомопатогенных вирусов in vitro, включающая культуры клеток насекомых. вирусы . и питательные среды. Для этого использовали 9 перевиваемых линий клеток насекомых: непарного (SCLd-135. IPLB -Ld-652), тутового (SCBnt-Зб). дубового СМСАр-1) шелкопрядов.

- Б -

табачной совки (Eu. s). совки Spodoptera fruglperda (IPLB-SF-21). капустной (МБ-КС23-987), хлопковой (МБ-ХО-685) и озимой (МБ-0з04-788) совок, последние 3 линии клеток получены нами.

В качестве патогенов использовали вирусы ядерного полиэд-роза (ВЯЛ) непарного шелкопряда (ВЯЛ НИМ, ВЯЛ ЛНЬ2). капустной (ВЯЛ КО-1. . ВЯЛ КО-2, ВЯЛ КО-3.' ВЯЛ КО-10). хлопковой (ВЯЛ ХО-1), озимой (ВЯЛ ОзС) совок и калифорнийской желтушницы (ВЯЛ Ас).

Основные результаты получены на клетках.линии МЕ-К023-987; основной используемый патоген - ВЯЛ КС-3. Для основных стадий процесса продукции ВЯЛ in vit.ro нами разработаны методики.

Свободные вирионы для инфицирования получали из телец включений (по М 123.46.008-00); из гемолимфы (по М 123.46.00188); из гомогената больных насекомых, растирая их в ступке о солевым раствором Грейса. насыщенным фенилтиомочевиной: и из культуральной жидкости. Стерилизовали вирусный материал фильтрованием через Фильтры фирмы Ml 111 роге, титр вируса определяли методом конечных разведений (ПО М 123. 46. 013-90). Полиэдры из насекомых выделяли стандартным способом [Ильиных.19901. а из инфицированных клеток и культураьной жидкости по разработанной нами методике ТИ 123. 46.001-90.

В зависимости от условий эксперимента культуры клеток инфицировали тремя способами: в моноолое (по М 123.46.003-88). при этом для заражения брали суточные культуры, образовавшие сплошной монослой; в полусуспензионные культуры вирусный материал вносили при пересеве, а перед инфицированием суспензионных культур клетки осаждали центрифугированием и дальнейшие процедуры проводили так же как и в монослое (М 123.46.009-90).

Качественно степень инфицирования определяли по цитопати-ческому действию под световым микроокопом, количественно - по наличию полиэдров в ядрах инфицированных клеток, подсчитывая их число в 100 зараженных клетках в световом микроскопе в фазовом контрасте или используя окрашенные препараты СВейзер. 1972. Ильинский. Пронин, 1965) и модифицированный способ Похи-ла (М 123.46.010-90). Измеряли полиэдры при помощи окуляр-микрометра.

Урожайность и продуктивность клеток оценивали по доле зараженных клеток и по числу полиэдров в ядрах. Выход вируса рассчитывали по числу полиэдров, наработанных в единице объема

культуральной жидкости.

Ультраструктурное исследование тканей, органов насекомых и осадков культур клеток проводили при помощи электронного микроскопа JEOL 100S. Вирусные суспензии изучали, используя метод негативного контрастирования. Морфологию полиэдров анализировали при помощи сканирующего электронного микроскопа I Зайцев. Кандрушин. 1990].

Виоиспытания бакуловирусов проводили на гусеницах соответствующих насекомых, которых отбирали, используя метод случайных аде ел [Враунлй, 1983]. Объем выборки составлял не менее £5 особей на каждый вариант и в контроле.

Вирулентность полиэдров по отношению к насекомым оценивали по гибели гусениц соответствующего вида. Для этого личинок III возраста инфицировали методом дозированного заражения [Майоров. Спасова. 1988]. Величины ЛД50 - дозы вируса, вызывающей гибель 50% насекомых и ЛТ50 - времени гибели половины насекомых - определяли по методу Кербера [Ашмарин, Воробьев. 1962].

Инфекционность вирионов определяли внесением 10 мкл куль-туральной жидкости или другого вирусного инокулята в гемоцель гусениц предпоследнего возраста. Использовали 4-5 десятикратных разбавлений (М 123.46.012-90).

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью ЭВМ. при этом достоверность различий выборочных средних вычисляли при помощи t-критерия Стьюдента или непараметрических критериев [Ашмарин. Воробьев.1962, Холлендер. Вулф, 1983. Ликеш. Ляга. 1985].

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Анализ литературных данных и результатов собственных исследований позволили нам разработать схему клеточной технологии производства вирусных энтомопатогенных препаратов (рис. 1). На данном этапе часть задач решена, в том числе и нами. В основном это задачи первого и второго этапов.

ВЫБОР ЛИНИЙ КЛЕТОК

I этап - культивирование маточных линий клеток, выбор наиболее продуктивной культуры. • Показано, что ни одна из широко

ПРОИЗВОДСТВО ВИРУСНЫХ ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК НАСЕКОМЫХ

культивирование маточной линии

| задача

!

Получение высокоэффективной-, экономически це^еообравнсй системы вирус : клетка

I

| пути \ решения

Оптимизация' ' условий культивирования клеток Получение новых линий Клонирование имеющихся .линий клеток и вирусов Оптимизация, упрощение питательных сред

ИНФИЦИРОВАНИЕ КЛЕТОК

| задача

I

Разработка простого, надежного, обеспечивающего высокий выход вируса, способ инфицирования

I '

| пути | решения

I

Разработка способа подготовки клеток и вирусного материала Оптимизация условий заражения

Оптимизация условий хранения

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ЗАРАЖЕННЫХ КЛЕТОК

I задача I

Размножение высокопатогенных вирусов в отобранных линиях клеток насекомых

I

| пути

| решения |

Оптимизация условий культивирования клеток и питательных сред Разработка технологии культивирования Разработка заводского оборудования и методов производства

получение вирусной биомассы

' | задача I

Повышение урожайности вирусов

I -

I пути | решения

Оптимизация условий выделения и очистки Повышение вирулентности выделенных штаммов Оптимизация хранения Отработка способов идентификации

Получение рекомбинантных вирусов с заранее заданными свойствами

Рис

- ]8I -

используемых в нашей стране культур клеток насекомых не способна продуцировать необходимые для сельского и лесного хозяйств бакуловирусы в достаточных количествах, по этой причине нами начаты работы по получению новых линий клеток, гомологичных для этих бакуловирусов: подбору наиболее перспективных тканей и органов насекомых, удобных способов стерилизации и диссоциации, питательных сред. Наибольших усилий потребовало решение проблемы стерилизации легко- травмируемых и в то же время обладающих' сложной конфигурацией яиц насекомых. Нами предложен метод, нигде ранее не используемый, но дающий хорошие результаты для многих насекомых - метод обработки яиц 0.5%-ным раствором йода в 75'этиловом спирте.

Анализ результатов по выбору тканей и органов, содержащих наибольшее число малодифференцированных. быстроделящихся клеток. показал, что большое число миграций наблюдалось в экспериментах, где источником клеток служили эмбрионы, яичники и имагинальные диски куколок. В результате более чем £50 экспериментов отработаны методы получения первичных и перевиваемых культур клеток насекомых из яичников куколок и эмбрионов (М 123.42.037- 86 и М 123.46.001-88), используя которые получено и депонировано в ВОЩБ) института Общей генетики им. Н.Ф, Вавилова (Москва) четыре новых линии клеток.

Культура клеток МБ-ХС-685. деп. N ВСЩВ) А-26, получена из яйцевых трубок куколок хлоповой совки. Клетки могут быть использованы для наработки ВЯЛ ХО-1 и ВЯЛ КО-3 (табл.1), их клонирования и конструкции рекомбинантных вариантов вирусов в научных целях.

Культура клеток МБ-0э04-788. деп. N ВОЩБ) А-28. получена из двухдневных эмбрионов озимой совки. Клетки чувствительны к ВЯЛ озимой и капустной совок и ВЦП озимой совки (табл.1). Обе культуры в настоящее время представляют единственные системы in vitro для наработки, изучения и генно-инженерных преобразований соответствующих гомологичных ВЯЛ и ВЦП хлопковой и озимой совок.

Культура клеток МБ-К023-987. деп. N ВСКК(Б) А-27, получена из яичников куколок.капустной совки. Культура практически не зависит от субтрата, то есть клетки способны расти в суспензии, и гетерогенна по продуктивности по отношению к ВЯЛ (табл. ■ 1). Кроме того клетки этой линии высокопродуктивны, что подт-

Таблица 1

Продуцирование бакуловирусов вновь полученными линиями клеток

Линия IIíraMM Продуктивн. Доля зараженных Выход вируса

клеток ВЯП ГО/клетку клеток. % ГО/мл хЮ*

МВ-ХО-685 Х0-1 £4.8±1.6 95.0±3.0 10.6+2.1

КС-3 £5. 4±2. 3 65. 7+6.3 7. 5+1.9

НШ-2 4. 4+0. 7 32. 0+3. 0 0. 6+0.1

МБ-0304-788 ОзС 31. 7+9. 3 95. 2+4. 2 15.1+1.6

КС-3 7.1±1.1 82. 8±2. 4 2. 7±0. 6

_ и КС-10 б. 9±1. 0 59. 5+9. 8 2.1±0. 8

МБ-КС23-987 КС-3 80. 0±5. 6 21.410.7 7. 5±0. 6

11 КС-2 49. 3+1.'3 25. 0+0. 5 5.1+0.9

tt КС-1 80. 1+4. 2 10. 8+0. 5 4.3+0. 9

_ »!_ КС-10 51.0+2.5 19. 9i0. 4 5.1+0.6

_ М _ НШ-2 48. 8+5.3 24. 8+0. 4 6. 0+0.7

верждают данные по изучению числа наработанных в ядрах инфицированных клеток полиэдров различных бакуловирусов. Это позволило нам предположить перспективность данной линии клеток для наработки бакуловирусов и начать клонирование с целью .выделения клонов более или быстрее продуцирующих вирусы.

Клонирование проводила Колокольцова Т.Д. в отделе культивирования клеток. Получено более 50 клонов. Все они проверены на восприимчивость к вирусам. Из них выбрано 12 клонов, изучена инфекция, вызванная вирусом капустной совки штаммов ВЯЛ КС-3 и ВЯЛ КО-2 и непарного шелкопряда - ВЯЛ НШ-2. Результаты определили выбор трех наиболее продуктивных клонов 23. 25. 27, которые сравнили между собой по трем критериям - скорости протекания инфекционного процесса, продуктивности клеток и инфекци-оннооти наработанного в них ВЯЛ КС-3 и ВЯЛ НШ-2. Достоверно лучшие показатели у клона 23. его и использовали в последующих экспериментах. По сравнению с неклонированной культурой выявлено достоверное в (2.5+0.3) раза увеличение вируспродукции.

Проведенное изучение патологии, вызванной ВЯП Autógrafa cali fornica в исследуемой линии МБ-КС23-987 показало, что в этих клетках инфекционный процесс протекает стабильно, практически без нарушений морфогенеза на всех этапах развития инфек-

ции; полученнные полиэдры инфекционны для тест-насекомых. Таким образом, для масштабного суспензионного культивирования клеток и бакуловирусов наиболее целесообразно применять клетки линии МБ-КС23-987, а также использовать их для молекулярнобио-логических исследований и для получения рек-ДНК бакуловирусов.

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК НА0ЕК0ШХ.

ВЫБОР СЫВОРОТОК ОТЕЧЕСТВЕННОГО ПРОИЗВОДСТВА.

Последний пункт I этапа - упрощение питательных сред, переход на более доступное отечественное питательное сырье.

Вначале первичные, а затем и перевиваемые культуры клеток насекомых выращивали на средах с сыворотками крови различных животных производства ВНИИ МБ: - крупного рогатого скота (КРС), телят и плодов КРС. свиньи, лошади, северных оленей, телят северных оленей, морской свинки, овцы, суягной овцы и плодов овец (ЭОС). Пригодность оценивали по ростовым свойствам и жизнеспособности в процессе культивирования клеток линий МБ-ХС-685, БСЬсЗ-Зб, МБ-К023-987. Вначале отбраковали токсичные сыворотки, затем проверили достоверность полученных результатов для нескольких партий и, наконец, изучили вируспродукцию.

О точки эрения как клеточного роста, так и продуктивности наилучшие результаты получены для ЭОС. Для наработки ВЯП, кроме того, возможно использование сыворотки крови новорожденных телят КРО и ПРО, обработанной полиэтиленгликолем.

Заменой РВЗ на 900 мы значительно снизили затраты, причем особенно важно то. что удалось найти источник для сывороток не конкурирующий с пищевыми потребностями человека, поскольку плоды овец - отходы . производства каракульчи.

ПОВЫШЕНИЕ ПРОДУКТИВНОСТИ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР

Следующий этап разработки лаборатоного регламента - выбор оптимальных условий инфицирования клеток. В качестве тест-системы использовали клетки непарного шелкопряда моноолойной ¡ЗСЫ -135 и нолусуспензионной I РЬВ-Ь<3-65£ культур, для лабораторного регламента испытывали клетки суспензионной линии капустной совки МБ-К023-987.

Изучено влияние посадочной концентрации клеток в интерва-

ле (0.08 - 2. 0)xl0G кл/мл на качество клеток и продукцию ВЯЛ КС-3. Зависимость носит характер нормального распределения с пиком оптимума в области (5.5+0. б)х105кл/мл. Для субстрат-независимых клеток такой закономерности не отмечалось, вируспро-дукния растет пропорционально плотности культуры вплоть до достижения последней максимально возможного в условиях эксперимента значения.

В качестве инокулята использовали гемолимфу, гомогенат больных насекомых, суспензию вирионов. полученных из т^лец-включений и культуральную жидкость. Только не прошедшие никаких обработок гемолимфа и культуральная жидкость не позднее 72 часов после заражения содержат нормальные вирионы. Наибольшие нарушения отмечены при выделении из полиэдров, используя гидролиз поверхностных полиэдренных белков в щелочной среде [Bergold, 1947]. При помощи ЭМ мы показали, что при этом доля целых вирионов составляет всего 6-20% в зависимости от штамма вируса. Деформированные, не содержащие ДНК вирионы. естественно. не обладают инфекционностью. Впоследствии мы модифицировали ранее применявшуюся методику [bfclntosh, Ignoffo. 1988] и в результате добились того, что поверхность полиэдров не разрушается, доля деформированных вирионов не превышает 20Z и они инфекционны в культуре клеток (ТИ 123.46.001- 90).

Эксперименты по выбору способа инфицирования показали, что для монослойных клеток важным моментом является сорбция вирионов, а для этого необходима синхронизация клеточного роста и подготовка клеточной стенки к проникновению вируса

Выбор вариантов инфицирования суспензионных клеток линии МЕ-КС23-987 для отработки лабораторного регламента получения биомассы ВЯЛ КО-З полностью основывался на описанных выше результатах. ~ Наибольший выход вируса получен при заражении клеток при пересеве, осажденных центрифугированием для улучшения контакта с вирусом (рис. 2).

В результате использования всех перечисленных условий инфицирования урожайность системы ВЯЛ КО-З: клетки SCLd-135 повысилась в 3-5 раз, а ВЯЛ КО-З: клетки MG-KC23-987 - в 2-3 pasa.

РАЗРАБОТКА ЛАБОРАТОРНОГО РЕГЛАМЕНТА ПОЛУЧЕНИЯ ВЯЛ КАПУСТНОЙ СОВКИ В ГОМОЛОГИЧНОЙ СИСТЕМЕ КЛЕТОК ЛИНИИ МБ-КС23-907

Клетки ив монослоя

Клетки ив ферментера

3 -

1 -

Индекс

пролиферации

XI

XI

XI

XI

Продуктивность клеток, ИЭ/кл

п

XI

XI

8

3 4

8

Выход вируса ГО/ мл

25 20 1Б 10 5

х10

- 9

- 8

- 7

- 6

- 5

- А ~

-з I •—»

- 2 м

I

1- 1

Рис. 2.. Выбор способа варажения ВЯЛ клеток линии ЫБ-КС23-987, культивируемых в суспенвии. 1 - контроль, культивирование клеток в суспенвии;- 2 - контроль, культивирование клеток в монослое; 3 - заражение при пересева; 4 - в лог-фаве; Б - в лаг-фаве; 6 - в монослое с последующим культивированием в суспенвии; 7 - варажение осажденных клеток оо сменой среды; 8 - бев смены среды.

- 13 -

Итак, наиболее пригодны для получения вирусной биомассы клетки капустной совки линии МБ-КС23-987 и гомологичный вирус ВЯЛ КС-3, выбор которого обусловлен следующими соображениями: во-первых, этот штамм продуцируется практически всеми исследованными линиями клеток, во-вторых, он способен заражать гусениц нескольких видов - капустной, хлопковой, клеверной, озимой совок. оовки ни - вредителей сельскохозяйственных культур; в-третьих, в гистограммах распределения числа полиэдров в различных клетках присутствует несколько накладывающихся друг на друга пиков, причем для МБ-КС23-987 - вплоть до £00 полиэдров.

Исходя из результатов, описанных ранее, в качестве основы для разработки лабораторного регламента получения вирусной биомассы выбрана система клетки линии МВ-КС23-987: ВЯЛ КС-3.

В качестве аппаратной основы был взят термостатируемый шейкер фирмы "New Brunswick", производство США, обеспечивающий надежное вращательное движение культуральной жидкости.. Путем пробных экспериментов подобраны условия для успешного роста клеток СТИ 123.46.002-90). Скорость вращения, обеспечивающая равномерное распределение клеток в объеме - 120-130 об/мин, объем заполнения сосудов 1/6. Система пригодна для длительного культивирования клеток без видимых изменений клеточной популяции и ее ростовых характеристик и использовалась для изучения инфекционного процесса, подбора условий заражения и культивирования инфицированных клеток в суспензии в 3-х системах - ВЯЛ R0-3 : клетки МВ-КС23-987; ВЯЛ Ас : клетки МБ-КО 23-987; ВЯЛ Ао : клетки IPLB-SF-21.

В результате создана простая и эффективная лабораторная система для суспензионного культивирования клеток насекомых в шейкере, опробованная на клетках линий МВ-КС23-987 и IPLB-SF-21 (ТИ 123.46.002-90).

Все выявленные и описанные закономерности легли в основу лабораторного регламента на получение суспензии ВЯЛ КС-3 капустной совки (Mamestra brasslcae L.) в гомологичной суспензионной культуре клеток линии МБ-КС23-987. ЛР 123.021-90.

БИОИСШТАЛИЯ ВИРУСНОГО МАТЕРИАЛА, ПОЛУЧЕННОГО В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК НАСЕКОМЫХ

IY этап - получение вирусной биомассы. Серьезная проблема

наработки бакуловирусов l n vi tro - сохранность биологической активности и стабильности как вирионов. так и полиэдров. В процессе исследования различных систем было показано, что вирусы. полученные в культурах клеток сохраняют свою биологическую активность для насекомых.

Образующиеся в культуре клеток ЫБ-К023-987 полиэдры ВЯЛ КО-3 морфологически не отличаются от полученных в гусеницах, большинство полиэдров имеет форму трехгранной пирамиды со сглаженными вершинами, хотя они несколько мельче - соответственно (1.9+0.3) и (2.8+0.4) мкм. Рестрикционный анализ ДНК ВЯЛ КО -3, полученного в клетках МБ-К023-987 и гусеницах, ферментами Pvul I, Xhol. Hi ndl 11 и EcoRI не выявил различий в количестве и электрофоретической подвижности фрагментов ДНК, что четко доказывает идентичность ВЯЛ КО-3, наработанного in vitro и in vivo. В последующем, в клетках МБ-К023-987 было наработано 12 мл суспензии ВЯЛ КО-3 с титром ЕхЮ9 ПЭ/мл, приготовлен лиофильно высушенный о добавлением бактопептона в соотношении 1:1 препарат и определена его биологическая активность при хранении в сравнении о водной суспензией того же вируса. Наибольшая потеря активности, равная 31.8%. выявлена для водной суспензии, хранившейся в холодильнике. Вирулентность лиофильно высушенного препарата снижалась за 3 года не более чем на 40%.

Отмечена высокая продуктивность ВЯЛ. наработанного in vi tro. причем наиболее эффективен лиофильно высушенный препарат. Впоть до 6 мес хранения при минус £0'0 выход вируса в 1.7 раза выше, чем в контроле, при этом тот же вирус, но не подвергнутый лиофилизации теряет свою продуктивность на 38%.

В целом, вирус ядерного полиэдроза "в клетках продуцируется без значительных отличий от продукции в насекомых и может быть использован для любых биотехнологических целей как для сельского хозяйства, так и для наработки медицинских препаратов.

ВЫВОДЫ

1. Получена новая суспензионная система ВЯЛ КО-3 - клетки ЫБ-К023 -987, продуцирующая около 10у ПЭ/мл инфекционных полиэдров, перспективная как для научных, так и для технологических целей.

2. Полечена серия новых перевиваемых культур клеток насекомых: МБ-ХО-685. МБ-0304-78В, МБ-0зС5-688.МВ-КС23-987. Ироду-

пирующих как гомологичные, так и гетерологичные бакуловирусы.

3. Охарактеризована продуктивность 9 линий (меток: SCLD-135. SCBm-Зб, Ей. 3, MO-Ap-I. IPLB-Ld-G52, МБ-Х0-680, МБ-КСЯЗ-987, МБ-0з04-788. IPLB-3F-21 по отношению к 9 штаммам бакуло-вирусов: ВЯПКС-1. КО-8, КО-3. КС-10. НПЫ. НШ-2, ХО. ОзО. Ас.

4. Разработан лабораторный регламент получения вируса ядерного полиэдроза капустной совки штамма ВЯЛ КО-3 в клепсах капустной совки линии МБ-КС23-987.

5. Показано, что бакуловирусы, полученные in vitro, сохраняют свою биологическую активность. Используя условия разработанного регламента, наработана партия ВЯЛ КС-3, приготовлен лиофильно высушенный препарат и показано, что в таком виде препарат способен храниться более 3-х лет с минимальной (не более 40%) потерей биологической активности.

6. Показана возможность использования сыворотки эмбрионов овец - отходов производства каракульчи - как для культивирования маточных культур, так и для продукции вирусной биомассы.

7. Разработаны способы подготовки клеток и вирусного материала к заражению и способы инфицирования в зависимости от состояния клеток и способа ведения клеточных линий. Утверждены для всех стадий еответотвуюшие лабораторные методики.

Основное содержание диссертационной работы Герасимовой Н.Г. отражено в следующих публикациях:

Герасимова Е Г., Полякова ЕЕ и др. рекомендации по борьбе о луговым мотыльком в Новосибирсокй области. Новосибирск, 1987. - 25 0.

Вожко Е А. . Герасимова Н. Г. , Колокольцова Т. Д.. Царева А. А. Перспективы применения культур клеток насекомых в производстве энтомопатогенных препаратов. В сб.: энтопопатогенные вирусы и их роль в защите растений. Новосибирск. 1988.0.80-81.

Герасимова Е Г., Вожко Н. А. Возможности использования культур клеток для крупномасштабного производства энтомопатогенных препаратов. В сб.: Биологические и технологические проблемы создания вирусных препаратов для интегрированной запиты растений. Новосибирск, 1989. - С. 47-48.

Герасимова Е Г., Колокольцова Т. Д.. Царева А. А. Первичные и перевиваемые культуры клеток насекомых, перспективные для по-

лучения энтомопатогенных препаратов, В об. : Биологические и технологические проблемы создания вирусных препаратов для интегрированной вапиты растений. Новосибирск. 1989. - С. 49.

Пантелеева Е Г.. Герасимова Н. Г. и др. Поиск сывороток -важнейший этап разработки клеточной технологии производства вирусных препаратов. В сб. : Биологические и технологические проблемы создания вирусных препаратов для интегрированной защиты растений. Новосибирск. 1989. - 0.60-51.

Герасимова Е Г.. Окишева К. 3. Получение вирусных энтомопа-тогенных препаратов в культурах клеток насекомых. Проблемы и перспективы. Обз. информация. ВНИИ СОНТИ. Москва. 1989. - 73 0.

Колокольцова Т. Л.. Герасимова Е Г.. Костина Г. А. Использование различных сывороток для культивирования перевиваемых культур клеток насекомых. В сб. : Культивирование клеток животных и человека. Москва 1690, 0.105-106.

Герасимова Е Г.. Оутугина Л, Е и др. Сравнительное изучение биологической активности и рестрикционный анализ ДНК ВЯЛ капустной совки, культивируемого в культурах клеток я на насекомых. В Респ. межведомств, сб. : Вирусы и вирусные заболевания. Киев. 1990. - вып. 18. - 0.63-65.

Ананько Г. Г.. Герасимова Е Г. Пути адаптации культуры клеток насекомых к новой сыворотке. В сб. ; Питательные среды и сыворотки для культивирования клеток. Новосибирск. 1991. - С. 34.

Ананько Г. Г.. Герасимова Е Г.. Костина Г. А. Адаптация клеток чешуекрылых к сывороткам крови взрослых животных. В сб. : Питательные среды и сыворотки для культивирования клеток. Новосибирск. 1991. - С. 35.

Колокольцова Т. Д., Герасимова Е Г. Выбор сред и сывороток для культивирования первичных культур клеток насекомых. В сб. : Питательные среды и сыворотки для культивирования меток. Новосибирск. 1991. - 0.36.

Колокольцова Т. Д. . Герасимова II. Г.. Парева А. А. Штамм перевиваемых клеток яичников куколок хлопковой совки. Hel lot hi s armígera (Hubn. ). МБ-Х0-685 - продуцент ВЯП. Заявка N 5007580/13 от 03.09.91. Патент от 30.01. 92.

Колокольцова Т. Д., Герасимова Е Г.. Царева А. А. Штамм перевиваемых клеток эмбрионов озимой совки Agrotls seget.um (Schiff.), МБ-Os04-788 - продуцент энтомопатогенных вирусов. Заявка N Г007Г79 от 03.09.91. Патент от 30.01.92.