Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Культура тканей и генетическая трансформация гибридов ореха и тополя

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Культура тканей и генетическая трансформация гибридов ореха и тополя"

о П

о г Г] ь "

ВОРОНЕЖСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ

ЛЕНИНСКОГО КОМСОМОЛА

На правах рукописи

КАССАБ ВАШИ АМАР ЗЕКИ

КУЛЬТУРА ТКАНЕЙ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ТРАНСООШАЦИЯ ГИБРИДОВ ОРЕХА И ТОПОЛЯ

03.00.12 - Физиология растений 03.00.15 - Генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Воронеж - 1993

Работа выполнена в группе генетической инженерии древесных растений Научно-исследовательского института лесной генетики и селекции. (НИИЛГиС) Федеральной службы лесного хозяйства России, нй. кафедре ботаники и дендрологии Воронежского лесотехнического ин -статута (ВЛТИ).

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Защита состойтся " Ш " мЯ/этУ 1993 г. в № часов на заседании специализированного совета К.063.48.05. по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук при Воронежском государственном университете (394693, Воронеж, Университетская пл., I, госуниверситет, биолого-почвенный факультет).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Воронежского государственного университета.

Автореферат разослан " 2,6 " & 1993 г.

Ученый секретарь специализированного

Совета ' Г.И.Барабаш

доктор биологических наук, профессор А.В.Веретенников; кандидат биологических наук

В.М.Коле сниченко. доктор биологических наук, профессор О.И.Машкин; кандидат биологических наук О.А.Евдокимова.

' Воронежский технологический институт.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность тема. В настоящее время значительно возрос интерес к методам культуры тканей и клеток. Это связано как с увела -чением роли клеточных культур в фундаментальных исследованиях по генетике и физиологии, молекулярной биологии и цитологии, так и возможностями практического применения клеточных технологий в сельском хозяйстве и промышленности.

Генетическая инженерия направлена на создание новых форм и сортов растений с наследственно закрепленными хозяйственно-ценнн-ми признаками, в результате сроки получения новых форм и сортов значительно сокращаются. ■

Методы микроклонального размножения растений рзшают такие основные проблемы, ограничивающие программу генетического улучшения лесних древесных растений, как большой объем растения, наличие периода покоя, длительный цикл роста и генеративного развития. Несмотря на это, генетическая трансформация лесных древесных растений до настоящего времени недостаточно разработана.

В качестве модельной системы для генетической трансформации древесных растений обычно используют тополь. Это связано с ого небольшим геномом, высокой пластичностью в развитии и легкостью культивирования 1ь а также возможностью сравнительно быстро получать растеная-регонеранга чз трансформированных тканей. Это определило наш выбор б пользу данной лесной культуры.

. Весьма ватаой культурой в лесном хозяйстве и особенно в плодоводстве ягляется орзх. Традиционные методы вегетативного размножения сортов ореха очень трудоемки и малоэффективны. Кроме того, орех часто псврездается насекомыми. Поэтому очень важно было разработать современные методы микроклонального размножения и генетической инженерии с целью более эффективного размножения ореха и выве-

дения форм, устойчивых к насекомым.

Цель и задачи исследования. Основной целью нашего исследования явилась'оптимизация условий микроклонального размножения гибридов тополя и ореха и разработка более совершенных способов генетической трансформации указанных объектов с помощью векторных систем агробактерий.

Для решения поставленной цели перед нами стояли следующие задачи:

1) Испытать применительно к объектам исследования различные среды и добавки к ним;

2) Выявить особенности культивирования гибридов ореха и тополя 1а тИго ;

3) Исследовать условия укоренения побегов-регенерантов указанных древесных пород в культуре ш. »«го ;

4) Отработать основные приемы генетической "трансформации на., примере онкогенных штаммов агробактерий;

5) Ввести в ге"ном исследованных древесных растений генетическую конструкцию ВТ л 12, содержащую ген эндотоксина и ген-маркер, кодирующий экспрессию фермента неомицинфосфотрансферазы.

6) Провести тестирование трансформированного материала;

7) Осуществить регенерацию растений из трансформированных тканей и провести их микроклональное размножение.

Научная новизна. Для гибридов тополя и ореха выявлены различия в их морфологическом ростовом потенциале в культуре тканей и органов, доказано повышение этого потенциала при повторном клонировании регенерантов. Установлена различная восприимчивость отдельных гибридов двух древесных пород к разным штаммам агробактерий и выявлены более и менее восприимчивые к патогенезу типы экс-плантов для гибридов ореха и тополя. Более высокая восприимчи-

вость.к бактериальной инфекции связана, в частности, с более высоким морфогенетическим потенциалом отдельных гибридов той или дру -гой породы. Получены трансгеннш растения тополя и ореха и провв -дено их микроклональное размножение.

Впервые экспериментально показано положительное влияние преин-кубации в темноте побегов-регенерантов на их укоренение, установлена возможность использовать в качестве эксплантов листоЕые диска и части эшкотяля проростков для трансгенного улучшения растений ореха.

Практическая ценность. Полученные положительные результаты микроклонального размножения гибридов тополя и ореха послужат методической основой для разработки промышленных технологий выращивания высококачественного посадочного материала исследованных древесных пород, а генетической трансформации - для выведения новых форм и сортов растений, отличающихся устойчивостью к каламицину и повреждении насекомыми, в частно ста , отряда lepidortam.

Оптимизация питательных сред а условий микроклонального размножения будет способствовать более высокому йыходу посадочного . .материала трансгенных растений с хозяйственно ценными признаками.

Результаты проведенных исследований диссертанта используются при чтении курса физиологии растений на хайедре ботаники и дендро-. логии Воронежского лесотехнического института. В дальнейшем планируется их широкое использование и при подготовке различного рода учебных и учебно-методических разработок.

. Диссертационная работа является частью темы госбюджета Федеральной службы лесного хозяйства России, й гос.регистрации 01.9.10 044R45.

' / Аптобч1шя работы. Материалы диссертации представлены конферзн-ЦИИ tfcrth. toorîcaa: jforeet Hioloey wofcehop Suait Svs.Harie, oatwrio

Aucuat 17-20, 1992; Ш.съезду ВОФР, С.-Петербург, 1993.

В законченном виде работа доложена и обсуждена на расширенном заседании кафедры ботаники и дендрологии Воронежского лесотехни -ческого института.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, объектов и методов исследования и двух экспериментальных глав, выводов и списка литературы, включающего ? наименования, в том числе Qfy иностранных. Работа изложена на •/<? / страницах машинописи, содержит//таблиц и рисунка.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. Культура ткани и генетическая трансформация древесных растений.

В данной главе анализируется состояние вопроса по микрохло-нальному размножению древесных растений и культуре тканей в целом, начиная с первых работ Р.Готре ( oauUwret ,1940), К.Жакью. (J»cqui-et ,1949,1955),'С.И.Машкина и А.В.Семенниковой (1959,1966), Э.А. Быченковой (1963,1967,1977) и других ученых и кончая исследованиями 1980-90-Х годов (fiodalquez ,1982; Гигхап, Gupta Д937; и»кши», топ Arnold . ,1988; HcOrenahen, Tul«cke, АЬта<Ц ,1988; •t «1 ,1989; Фелалиев,1990 и др.). Делается вывод о том, что несмотря на успехи, достигнутые в области мшфоклонального размножения пока еще над достаточной информации для разработки промышленных технологий выращивания высококачественного посадочного материала основных ло сообразующих древесных пород мира.

Во второй части обзора рассматривается диалектика представлений о способах и достижениях тенетического улучшения древесных растений путем генетической трансформации с агробактериямчВ этом отношении упоминается работа с сосной ладанной ( sederorr, stona, Ctlltoi, Hnore ,1984), затем ТОПОЛЯМИ { НШОСйд et al,I9S6;

Ратвоав «1,1986; Г111*т ^ «1, 1937; ПЪЪоиЛ Ч «1, Г937 и Др.),ПО псевдотсугв ( вмйвклг «ь «1 ,1987) и некоторым другим породам (не клт ш1 , 1987; «ь «а ,1987 и др.). Здесь же ука-

зывается на трудности с проведением генно-инженерных работ с древесными растениями, ка небольшой пока выход трансгенных растений при использовании существующих птаммов агробагстерий и на необходимость проведения дальнейших исследований.

П. Объекты и методы исследования В качестве исходного материала использовали гибрид тополя -01.05 (Рора1иа ви«т»о1ва» ПлсЬ.х Р.Ьвг11папа1а В1рр.;хР.аиат«о1«вв Паек, и 13.04 (голусибс Роршив аах1во¥1гхА1 Нвпг?. ) из популетума НИИЛГиС и четыре гибрида ореха ( ¿в«1аш1 г»ц» ь. х ^шшаьяпса ни« из питомника ВЕТИ.

П9дготовка растительного материала для введения в культуру и» т11го вклвчала ряд подготовительных этапов:

- для тополя: заготовку побегов текущего года длиной до 50 см в. конце сентября и "выгонку" побегов из спящих почек в условиях искусственного климата; ^ -для рреха: заготовку'здоровых семян, отлученных от свободного опыления и разрушения экдокарпа без доврездения семени.

Стерилизацию исходного материала проводили следующим образом: для тополя:

- лротирка побигов ватой, смоченной 7С$ этанолом;

- яромззка 0,005% раствором Твин-60 в течение 15 мин;

- стерилизацию 4,5%' раствором гипохлорида кальция 25 мин;

- штикраануд отмывку стерильной дистиллированной водой ■ для ореха; 1

~ стерилизацтэ 6% раствором гипохлорида кальция, содержащим 0,0055? Твин-60, в точение 20 мин;

- а -

- пятикратную отмывку стерильной дистиллированной водой.

Все работы по изолированию апикальных меристем с 2-3 листовыми примордиящ проводили в стерильных условиях, обеспечиваемых ламикар-боксом УО-ЕГ.

В исследованиях били использованы агаризованные среды Мураси-ге и Скуга (МС; нигмЫв», Бкоов ,1962), Драйвера и Каниуки (ДКЕ; Миг, Капигы. ,1984), Миллера (М; ШШр ,1967),

модифицированные в зависимости от целей конфетных опытов.

Культивирование первичных эксплантов (изолированных апикальных меристем для тополя и изолированных эмбрионов для ореха) проводили в биологических пробирках диаметром 21 мм при 25°С и фотопериоде 16 час, освещенности 2000 люкс, достигаемой люминесцентными лампами ДЦ и ДБ. В данных условиях проводились и последующие этапы микроклонального 'размножения. В отдельных опытах использовали культивирование в темноте.

Индукция формирования адвентивных побегов на первичных экс-плантах достигалась добавлением в среду культивирования 6-бензил-еминопурина (БАП) в концентрации 0,6-1,0 мг/л для тополя и 0,51,0 мг/л для ореха. В отдельных опытах был использован кинетин. Повторное черенкование проводили через 4 недели культивирования.

Индукция ризогенеза достигалась при понижении концентрации солей в культуральной сроде с применением ивдолил-масляной кислоты (ИМК) или без нее.

В экспериментах по генетической трансформации были использованы лабораторные штаммы А8Г0Ъас1ег1\ш ги«еГас1йПв дикого типа С 53 и С58С1 и штамм несущий искусственную генетическую

конструкцию, кодирующую д -ЭНДОТОКСИН Вас111иа в нчсмицинфосфотрансферазу.

Культивирование бактерии проводили на среде ЛБ (Маниатис,

Фрич, Сэмбрук, 1934).

Генетическую трансформацию проводили используя метод ко-куль-тивирования эксплантов с культурой бактерии ( звИизг, мсСота, 1989).

Тестирование трансформированного материала проводили по общепринятым методам генетической инженерии растений (Лихтенштейн, Дрейпер, 1938).

Штаммы л,згоЬзсгвг1иа 1ит.9Гас1е!з получены из Института физиологии и оиохшпи микроорганизмов РАН.

Все результаты получены но менее чем из 10-15 повторпостэй, морфометрпческие показатели учпткзали черзз 4-5 недель культивирования, и обработаны методами математической статистики по программам к ЭВМ "Кскра-ЮЗО.П",

Ш. Макроклоналыгов размножение а генетическая трансформация • гибридов тополя.

Морфогзнстическиэ процесса в изолированных меристемах индуцировала путем культивирования на агаризоватюй. среде ЫС с возраставшей от 0 до 1 мг/л концентрацией ЕАП в течение 4-х недель. Результаты показали достоверные различия мелсду. изучаемыми гибридами то -поля (Рис.1).

Мзристзмы гибрида 01.05 характеризовались более высокой способностью к спонтанному образованию адвентивных побегов при отсутствии БАЛ в среде по сравнению с меристемами гибридов 13.04. Максимальное продуцирование побегов меристемами гибрида 01.05 имоло место при концентрации ЕАП 0,25 мг/л, а у гибрида 13.04 - при 0,5 лг/л. Дальнэйпвв повыязниэ содержания Б4П в срэдэ лзло к шггибиро-ваниа морфогенетичэских процессов у мэрастэм обоях габрядов. Получению рэзульгаты из только подтвэрздаот яшпшз о высоком корфоге-нетачзском потенциале тополя ( капОа! ,193Э' а др.), ной указывают

на существенные различия морфоГенетического потенциала изучаемых гибридов.

Мультиплицирование побегов тополя осуществлялось их микрочеренкованием и культивированием в присутствии БАЛ от 0 до I мг/л. Сравнительный анализ индукции органогенеза меристемами побегов-реге-нерантов с исходными меристемами показал, что достоверные различия между гибридами сохраняются (Рис.2). Более того, характер зависимости продуцирования апикальных побегов меристемами от содержания БАП в средэ остается типичным для каждого из изучаемых гибридов. В то яе время полученные данные указывают на то, что морфогенетн-ческий потенциал меристем из побегов-регенерантов превышает потенциал исходных меристем. Это выражается достоверными различиями в количестве продуцируемых адвентивных побегов по всех вариантах от/га. Следовательно, в процессе клонирования побегов тополя 1». т11го происходит возрастание морфогенетического потенциала меристем у первого и второго поколения побегов-регенерантов, что, по-

П.Ок

01.05

ем

й!

аи

10

0.7$ 0,5 0,4! 4,0

6й% лг/я

Рис.2. Влияние БАЛ на индукция органогенеза в культуре кальных меристем гибридов тополя, т (Р=0,05)

апя-

видимому, яовиях.

-- апикальные меристемы с побегов-регенерантов;

... - апикальные меристемы изолированы от побегов после "выгонки" в условиях искусственного климата.

связано с процессом реювенилизацип в культуральннх уо-

Идентичный характер мор£огенетического ответа на содержание БАЛ в среде исходными меристемами и меристемами побегов-регенерантов позволяет предположить, что при клонировании тополя по данной методике не происходит существенного нарушения исходного генотипа изучаемых гибридов.

Посла доращивания побегов-регенерантов до 4-5 см длиной их отделяли и переносили ни среди для индукции ризогенеза. Укоренение побегов тополя не требоэало экзогенных ауксинов. Ризогенез индуцировали при культивировании на низкосолевых средах. Ъ2% укорененных гюбогов гибрида 01.05 бшго получено на среде МС, разбавленной в 4 раза, я 7055. укорененных побегов гибрида 13.04 получили

на той ж среде, но разбавленной в 2 раза. Таким образом, были выявлены оптимальные условия для клонирования и» vitro изучаемых гибридов тополя.

Следующий этап исследования составляло тестирование регенера-ционной способности различных типов эксплантов с целью выбора наиболее эффективных из mix для проведения генетической трансформации.

Морфогенез сегментов междоузлий псбегов-регенерантов индуцировали на среде МС, дополненной БАП в концентрации 0,25-0,5 мг/л. Показано, что в течение 4 недель культивирования максимальное продуцирование побегов у гибрида 01.05 достигалось при 0.25 мг/л БАП р. составляло 4-5 побегов на эксплант.

В опыте с сегментами листа было показано, что морфогенетичес-кие процессы более ярко выражены у гибрида 01.05, у которого при содержании 0,25 мг/л ЕАП в среде 53% эксплантов показали способность к прямой регенераций побегов, тогда как для гибрида 13.04 максимальное количество эксплантов, рагакрровавших побеги, составило 26,7$ при 0,5 мг/л БАП в течение 5 недель культивирования (Рис.з).

Полученные результаты показали, что лиственные сепленты могут быть более эффективными для генетической трансформации изучаемых гибридов тополя по сравнению с междоузлиями, что согласуется с данными других авторов по генетической инженерии тополя <eiilatti •t ai , 1987).

Генетическую трансформацию изучаемых гибридов тополя проводили путем ко-культивирования сегментов листа с культурой бактерии в течение 20-30 мин (stlimer, месою ,1989).

Результаты по генетической трансформации лабораторными штаммами дикого типа С58 и C58CI через 4 недели после ко-культивирэва-

s §

?

I 1

4

otos

13.011

I

i

1

0 0-25 0.5 I'.0

о c-is as m

6fin, Mrjn

Рис.З. Влияние ЕЛП на индукцию органогенеза у листовых сегментов тополя.у (Р=0,05).

ппя показали различия как по восприимчивости гибридов тополя к агробактериальной инфекции, так и по вирулентности диких штаммов к тому или иному гибриду (Табл.1).

Таблица I

Генетическая трансформация листовых сегментов гибридов тополя онкогеиными штаммами а^ипегалвпа

гибрид 01

гибрид J.3.CJ4

Штазял :частота транс-:среднее коли-:частота транс-:среднее коли-бактерии:формации, % :чество побе -:формации, % :чество побе-: :гов-регекера~:

:гов-рогонора-

С58 86,7 1,39 + 0,21 73,3 I.I7 + 0,17

С58С1 66,7 1,48 + 0,27 46,7 1,23 + 0,16

контроль 0 0 0 0

у (Р=0,05)

Выявлено, что экспланты гибрида 01.05, отличающегося более высокими морфогенетическими потенциалами, обладают более высокой частотой трансформации, определяемой по количеству иксп антоз, пока-

завагих способность к неопластичному росту. Получена регенерация побегов из опухолевых тканей при культивировании на безгормональных средах, что уже отмечено для тополя ранее ( FjLiiatu et ai, 1987). Подтверждение генетической трансформации показано в результате изучения способности трансформированных тканей к гормоннеза-висимслу росту в течение нескольких месяцев культивирования и по присутствию в них огаопина, кодируемого и плазюдами данных штаммов.

На следующем этапе листовые сегменты ко-культивировали с культурой штеыма et л 12. После ко-культивярования вксплантн помещали на среду МС, дополненную БАП в концентрации 0,25-0,5 мг/л для индукции в них морфогенеза и 60 мг/л канамицика для селекции трансформированных клеток, поскольку генетическая конструкцияBt ¿ 12 кодирует несмицинфоефотрансферазу, экспрессия которой выражается в устойчивости растительной ткани к кан?мицину в течение 4-х недель культивирования. Получена регенерация побегов у 53,3$ эксплантов гибрида 01.05 и 40$ эксплантов гибрида 13.04 в присутствии канаш-цана в среде, тогда как в 'контрольном варианте опыта.(ко-культивя-рование эксплгнтов без бактериальной культуры) 100$ эксплантов погибли на среде, содержащей 60 мг/л канамицина (Табл.2). Результаты

Таблица 2

Трансформация листовых сетенгов тополя неонкогеншм ШТамМОМ A.tuaefaciens (BtAjg)

гибридч : частота транофомации, :среднее количество побегов-

% :рчгзнерантов, шт

13.04 40,0 3,33 + 0,62

01.05 53,3 5,88 + 0,99

г (Р=0,05)

данчсго эксперимента указывают на трансформацию клеток тополя гене-

тической конструкцией В1 л 12. Трансформированные побеги доращивали в присутствии канамицина в среде и укореняли на низкосолевых сро -дах в тех же условиях, что и нетран&формированные побега-регенера-нты.

Таким образом, в результате"проведенных исследований выявлены условия, обеспечивающие как массовое клонирование исходных генотипов, так и их эффективную генетическую трансформацию и получение трансгенных пробирочных растений тополя.

1У. Культура ткани и генетическая трансформация гибридов ореха.

Для клонирования исходных генотипоз орзха проводили проращивание изолированных эмбрионов 1п ri.tr о . Интенсивность процессов роста и развития эмбрионов зависела от типа среды культивирования и содержания в ней сахарозы. Сравнительный анализ минерального состава среды, содержащей микроэлементы по Мурасиге и Скуга и микроэлементы по Миллеру,' со средой ДКВ показал, что последняя дает наилучшие результаты для всех изучаемых гибридов после 5 недель культивирования. Дополнение среды ДКВ экзогенными сритогормонами вело к возрастанию интенсивности ростовых процессов (Рис.4).

Оптимальными для всех изучаемых гибридов явилось дополнение среды ДКВ БАЛ в концентрации I мг/л, кинетином - 2 мг/.ч, ГОЖ -0,01 мг/л и 250 мг/л ь -глутамияа. ЮСЙ-ное нормальное развитие изолированных эмбрионов в данных культур альных условиях былл достигнуто только для свежесобранных; семян. Хранение семян в течение 3-х и 6 месяцев приводило к возрастанию гибели ели аномальному развитию изоллрозанных эмбрионов ь культуре.

Морфогенетичьскаа процессы у проростков ореха шь-уцировали путем удаления корня и декапитации эпикотиля с последующим куль-тивироЕанием эксплантсз на среде ДКВ, дополненной 0,5- Г,0 мг/л

I

С i<>

£

I

hW ?

I-

17-3

nh

dt

r-i

rfi

J-2S

16 -г-26

ч-

LP

rb

4r

"J

rh

ШШН1Ы

среды

Ш среда ДКБ;

gl среда ДКЗ.дополненная 1,0 мг/л Б/Л к 0,01 мг/л КЖ;

□ среда ЖВ.дополненная 1,0 мг/л БАЛ. 2 мг/л кккеткиа, 0,01 мг/л ШК и 250 мг/л X. -глу-тамииа

Рис.4. Влияние экзогенных фитогормопов на прорастание изолированных эмбрионов ореха, f (Р=0,05).

БАЛ и 0,005-0,01 мг/л ЕЖ. Изучаемые гибриды* ореха не показ ami существенных различий в характере морфогзнетического ответа на при. -сутствие экзогенных фитогормонов в среде. Максимальное цродуциро -вание адвентивных юбегов достигало на среде ДКВ через 4 недоли культивирования, содержащей 1,0 мг/л БАЛ и 0,01 мг/л.ШК, где каждый экешгант образовывал 5-7 адвентивных побегов.

Клонирование генотипов ореха осуществляли используя изолированные апикальные меристемы побегов. Для оптимизации условий индукции морфогенеза у апикальных меристем было проведено сравнение трах типов сред - МС, М и ДКВ, дополнение 1,0 мг/л НАЛ с 0,01 мг/л ИМК и 0,5 мг/л БАЛ с 0,005 мг/л И,Ж. Результаты показали, что наибольшее количество морфологически нормальных побегов было образовано на среде ДКБ, содержащей 1,0 мг/л БАЛ и 0,01 мг/л 1ЫК, что указывает на оптимальность минерального состава среды ДКВ для индукции морфогенеза у изолированных меристем орэха (Рис.,5). В то se' время, ,

3

5>

§

г

>5

И 2* И'

0,5иг(*Ш* МОЗнг/к ЦИК

/.оиг/А елп' ам»г1' инк

сЬ

I

±1

н нс дка

М мс лив

ВАРИАНТЫ

среды

Рис.5. Влияние минерального состава питательной среды на индукцию морфогенеза у апикальных меристем гибрида о тюха й 2-26. г (Р=0,05). Показатели учитывали через 5 недель культивирования.

по дш-;ным ряда исследователей (нвИв-БийЬои а1 ,1956; ии.нлв, 1986) органогенез у эксплантов ореха индуцируется более высокой концентрацией экзогенных цитокининов в сроде культивирования. Повышение концентрации экзогенных цитокининов в среде ДКВ путем дополнения 1,0 мг/л БАП.'и кикетином в Концентрэгс'и 2,0 мг/л привело к увеличению формирования адвентивных побегов до 4-х на ?ксплалт.

Мультиплицирование достигалось микрочеренкованием побегов и культивированием черенков с апикальной меристемой на среде аналогичного состава. Такая же среда была использована и дли доращива-ния побегов. В течение 4-х недель основной побег достигал длины 4-5 см и имел 4-5 листьев. После доращиьания побеги были использованы в экспериментах по укоренению.

Ризогенез индуцировали добавлением ИМК в среду культивирования и путем предварительной обработки банальной части побега растворами ИМК в концентрации от 2,5 до 10 мг/л. Сравнительный анализ влияния различных концентраций ИМК на индукцию рьзогенеза у

побегов-рогенерантоз ореха показал, что при обработке базалъной части побега раствором ИМК в концентрации 5 мг/л образование корневые зачатков имело место у 30-60$ побегов, тогда как цри обработке ра- . створом ИМК в концентрации 2,5 мг/л и 10 мг/л процент побегов с корпевши зачатками был значительно ниже. Способность к ризогенезу в ответ на обработку ИМК в значительной степени определялась генотипом. В то же время корневые зачатки, образовавшиеся в результате обработки, на среде да не развивались в корни даже после 6 недель культивирования. Поэтому было проведено изучение влияния минерального состава среды на разогенез у побегов ореха путем сравнения среды ДКВ с полной и разбавленной в 4 раза средой ЫС, содержащей 5 мг/л ИМК (Рис.6).

2-Х6

А» НС

Рис.6. Влияние типа питательной среды на индукцию ризогенъаа . у пзбогоз ореха в присутствии 5 мг/л КМК. ^ □ - гобеги, взятые из эксплантов, выращенных в стандартных условиях освещения; Щ - побеги, вгятые из эксплантов, выращенных без освещения.

Выявлено, что при использовании разбавленной среды кС ризагенез индуцировал у о®? пссегов, причем коршв^е зачатка в течение 4-:: Н8П6.1Т) разнизались в мор*огекетически .нормальные корне. Процент уко-

ренивиихся побегов может быть увеличен до 65$ при использовании этиолированных побегов ореха.

Таким образом, в ходе настоящих экспериментов били оптимизированы условия клонирования изучаемых гибридов ореха.

Генетическую трансформацию габридов ореха проводили путем ко-культпвировачия листовых сешентов пробирочных растений ореха или частей эпикотиля и междоузлий побегов с культурой агробактерки в течение 20-30 мин.

Результаты по генетической трансформации посредством лабора-. торных штаммов дикого типа С58 и C58CI показали различия по восприимчивости гибридов ореха к агрсбактериальной инфекции и по вирулентности штаммов бактерий к данным гибридам (Табл.З).

Таблица 3

Генетическая трансформация листовых сеп/.ентов ореха онкогекнши птажаци A.tuaer»eiom»

Штаммы ! табтад 17-3 : гкбшд 2-26

бактевий •частота тоансТютаации. % ¡частота тпансйоочании. %

С58 46,7 „ 33,3

C58CI 66,7

контроль 0 0

Наибольшая частота трансформации получена для гибрида 17-3 штаммом С58С1- 73,3$. В отличие от опусолевых тканей тополя опухолевые ткани ореха не-обладала способностью к органогенезу. Наличие генетической трансформации подтверждают изучение способности опухолевой ткаии к гормош.е зависимому росту в течение нескольких месяцев кулыивпрованая и определение содержания октопина в тканях. Большое праютческоэ значение для улучшения гибридов ореха имеет введение з геном генетической конструкции ш;-12, кодирующей дельта-ыздототхин, оказцваыцлй легальное дейстьне на пре-дите— лей из отряда Гв^ас^ега.

В данном эксперименте был расширен круг эксплантов для ко-куль-тивировакия за счет использования сетаентов междоузлие и разрезанных вдоль частей эпикотиля. После ко-культнвирозания с культурой штамма' въ д 12 экспланты в течение 4 недель культивировали на среде ДКЗ, дополненной 1,0 мг/л БАП, 2 мг/л кинетина, 0,01 мг/л ИМК и 250 мг/л ь -глутамина в присутствии 75 мг/л канамицина для селекции трансформированных клеток. Контрольный вариант опыта при культивировании на данной среде полностью погиб, тогда как у опытных • вариантов наблюдали регенерацию побегов, что свидетельствует о произошедшей генетической трансформации тканей ореха генетической конструкцией вь д 12, кодирующей ген неомицанфосфотрансферазы, которая придает устойчивость растительной ткани к канамицину. Наибольшая частота трансформации, оцениваемая как жизнеспособность эксплантов на среде с канамицином, была отмечена у сегментов эпикотиля и достигала 80-10055 (Табл.,4). Побеги, образовавшиеся на эксплантах в присутствии канамицина, имели морфологически нормальный вид е

Таблица 4

Трансформация гибридов ореха неонкогенным штаммом

Показатели ¡Частота трансфор-: Среднее количество побегов-г

;мации, ъ регенератов, шт _ *_,__ *

1-28

уендоузлия 10 2 ± 0,0

эликотиль ■ 100 ' " 5,61 1,3

2-25

междоузлия 30 1.010,0

Р'ШКО'пиЛЬ 80 - 4,01 0,8

г (Р=0,05)

после дорасивалия на аналогичной среде до 4-5 ш в длину укорена- ' умь на разбавленной б четырэ раза средо МО..1 дополненной о' мг/л

ИМК. В результате проведенных экспериментов выявлены условия, обеспечивающие как массовое воспроизводство изучаемых генотипов ореха, так и способы получения трансгенных.пробирочных растений.

Результаты исследований по индуцированному морфогенезу гибридов тополя и ореха 1п тШго позволили оптимизировать условия их ми-кроклонального размножения, что представляет собой основу для создания биотехнологий размножения данных растений.

Проведение сравнительных исследований морфогенетического ответа изолированных меристем тополя на воздействие экзогенных цитоки-нинов показало гекотипическута обусловленность характера ответа. Выявленная идентичность характера морфогенетического ответа у меристем, изолированных из исходных побегов, и меристем из побегов-регенерантоз указывает на сохранение генотипа при клонировании тополя через культуру изолированных меристем. При этом показан эффект реювенилйзации растительного материала' при размножении ш

Доказано, что индукция морфогенеза на эпикотилях ореха возрастает при удалении у проростка корня и апикальной почки.

Установлено, что ко-культивирование листов;ос сегментов тополя и ореха с культурой агробактерий является эффективным способом генетической трансформации данных растений. Показана экспрессия бактериальных генов в растениях тополя и ореха.

Требуется проведение дальнейших исследований по акклиматизации полученных трансгенных растений в условиях забытого грунта и проведение испытаний на устойчивость к вредителям из отр. Ьвр1-

ВЫВОДЫ

I. Изучено влияние минерального состава сред культивирования, выявлены оптимальные концентрации экзогенных фитогормонов, показана эффективность использования изолированных апикальных меристем

для микроклонального размножения гибридов ореха и тополя.

2. Экспериментально преодолены трудности, связанные с индукцией ризогенеза у побегов-регенерантов ореха, установлено, что для укоренёния данных гибридов лучшие результаты дает разбавленная в

4 раза среда MC, дополненная 5 мг/л ИМК. Доказано положительное влияние преишсубации побегов в темноте на их последующее укорене- ■ ние.

3. Установлено, что характер морфогенетического ответа изучаемых изолированных апикальных меристем гибридов тополя на присутствие экзогенного БАП в среде культивирования не только сохраняется в процессе повторного клонирования, но и усиливается, причем ростовой потенциал и при повторном клонировании зависит от генотипа исходного растения.

4. Проведена генетическая трансформация гибридов тополя и ореха посредством плазмид агробактерий. Исследования со штаммами дикого типа позволили выявить оптимальные условия проведения ко-куль-тивироиания и типы эксплантов. Показана эффективность использования листовых сегментов .для генетической трансформации гибридов тополя и ореха.

5. Осуществлено введение генетической конструкции* Bt л 12 в клетки гибридов ореха и тополя, выявлены условия регенерации растений из трансформированных тканой, проведено их тестирование на устойчивость к канзлшшну и микроклоналънов размножение.

Публикации

1. Калеali е&бЫ Amar 2ekl, Kolesniehanio V.M., Veretennlkov A.V. Culture la vi tro oí hlbrld walnut (Jugl«u»a regla x J.oaashurica). Borth Auerlcan Forest Bio: 3gy Workshop. Sault Ste.Harle, Ontario. August 17-30, 1992. ч

2. Коле они чешсо З.М., Кассаб Ваши Амар Зеки, А.В.Веретен-

НИКОВ. Клонирование гибридов орехд (Juglano regla X J.manaburica) в культуре in Titro . Тезисы Ш съезда ВОФР, С.-Петербург, 1993 (в печати).