Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Культура тканей и генетическая трансформация гибридов ореха и тополя

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Культура тканей и генетическая трансформация гибридов ореха и тополя"

воронежский ордена ленина государственный университет ¡шиш

ленинского комсомола

На правах рукописи кассаб ваши амар зеки

культура тканей и генетическая тракссормаш гибридов ореха и тополя

03.00.12 - гизиологая растений 03.00.15 - Гонзтяка

Автореферат диссертации на соаскгшэ ученой степона кандидата бзологачоских наук

Воронэз - 1ЭЭЗ

^ • - , - / ' с/ 1 -

Работа выполнена в группе генетической инженерии древесных растений Научно-исследовательского института лесной генетики и селекции. (ШЖГиС) Федеральной ат/жбы лесного хозяйства России, на. кафедре .ботаники и дендрологии Воронежского лесотехнического ин -ститута (ММ).

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор А.В.Веретенников; кандидат биологических наук В .М.Коле сниченко. Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор С.И.Машкин; кандидат биологических наук О.А.Евдокимова.

Ведущая организация: ' Воронежский технологический инсти-

тут.

Защита состойтся " " /) 1993 г. в ^ часов

на заседании специализированного совета К.063.48.05. по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук при Воронежском государственном университете (394693, Воронеж, Университетская пл., I, госуниверситет, биолого-почвенный факультет).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Воронежского государственного университета.

Автореферат разослан " " Сре6рО 1993 г.

Ученый секретарь специализированного

Совета ¡' »".'.I Г.И.Барабаш

- 3 -

общая характеристика работы

Актуальность темя. В настоящее время значительно возрос интерес к методам культуры тканей и клеток. Это связано как с увела -чением роли клеточных культур в фундаментальных исследованиях по генетике и Физиологии, молекулярной биологии и цитологии, так я возможностями практического применения клеточных технологий в сельском хозяйстве и промышленности.

Генетическая инженерия направлена на создание новых форм и сортов растений с наследственно закрепленными хозяйственно-ценными признаками, в результате сроки получения новых форм и сортов значительно сокращаются. 1

Методы микроулональиого размножения растений рошеют такие основные проблемы, ограничивающие программу генетического улучшения лесных древесных растений, как большой объем растения, наличие периода покоя, длительный цикл роста и генеративного развития. Несмотря на это, генетическая трансформация лесных древесных растений до настоящего времени недостаточно разработана.

В качестве модельной системы для генетической трансформации древесных растений обычно используют тополь. Это связано с ого небольшим геномом, высокой пластичностью в развитии и легкостью культивирования in vitro, а также возможностью сравнительно быстро получать растения-регенерантп чз трансформированных тканей. Это опреде-гсило наш выбор б пользу данной лесной культуры.

Весьма важной культурой в лесном хозяйстве и особенно в плодо--зодстбо яглявтея орэх. Традиционные методы вегетативного размножали сортов ореха очень трудоемки и малоэффективны. Кроме того, >рех часто псврездается насекомыми. Поэтому очень вагно было разра-!отать современные методы г.якроклонального размножения и ге нети чес-сой инженерии с целью более эффективного размножения ореха и выве-

дения форм, устойчивых к насекомым.

Цель и задачи исследования. Основной целью нашего исследования явилась'оптимизация условий микроклонального размножения гибридов тополя п ореха и разработка более совершенных способов генетической трансформации указанных объектов с помощью векторных систем агробактерий.

Для решения поставленной цели перед нами стояли следующие задачи:

1) Испытать применительно к объектам исследования различные среди и добавки к ним;

2) Выявить особенности культивирования гибридов ореха и тополя 1в rltro ;

3) Исследовать условия укоренения побегов-регенерантов указанных древесных пород в культуре in. vitro •

4) Отработать основные приемы генетической "трансформации на i примере онкогенных штаммов агробактерий;

5) Ввести в ге"ном исследованных древесных растений генетическую конструкцию ВТ л 12, содержащую ген эндотоксина и ген-маркор, кодирующий экспрессию фермента неомицинфосфотрансферазы.

6) Провести тестирование трансформированного материала;

7) Осуществить регенерацию растений из трансформированных тканей и провести их микроклональное размножение.

Научная новизна. Для гибридов тополя и ореха выявлены различия в их морфологическом ростовом потенциале в культуре тканей и органов, доказано повышение этого потенциала при повторном клонировании регенерантов. Установлена различная восприимчивость отдельных гибридов двух древесных пород к разным штаммам агробактерий и выявлены более и менее восприимчивые к патогенезу типы экс-плактов для гибридов ореха и тополя. Более высокая восприимчи-

эсть.к бактериальной инфекции связана, в частности, о более высо-им морфогенетическим потенциалом отдельных гибридов той или дру -эй породы. Получены трансгегаше растения тополя и ореха и прова -еко их микроююнальное размножение.

Впервые экспериментально показано положительное влияние преин-убации в темноте побегов-регенерантов на их укоренение, установ-ена возможность использовать в качестве эксплантов листовые диски части эш ко тиля проростков для трансгенного улучшения растений реха.

Практически ценность. Полученные положительные результаты ихроклонального размножения гибридов тополя и ореха послужат мв-одической основой для разработки промышленных технологий выращи-анвя высококачественного посадочного материала исследованных дре-есных пород, а генетической трансформации - для выведения новых юрм и сортов растений, отличающихся устойчивость!) к кана\сицину и [овреадению насекомыми, в частности , отряда

Оптимизация питательных сред а условий мькроклонрльного разложения будет способствовать более высокому йыходу посадочного гатериала трансгенных растений с хозяйственно ценньш признаками.

Результаты гловеденных исследований диссертанта используются фа чтении курса физиологии растений на кафедре ботаники и дендро-гогаи Воронежского лесотехнического института. В дальнейшем плана-:уется их широкое использование и при подготовке различного рода гчебных и учебно-методических разработок.

. Диссертационная работа является частью темы госбюджета Феда-)эяъной службы лесного хозяйства России, й гос.рогистрации Я.9.10 044R45.

Аптюбяцдя работы. Материалы диссертации представлены конферен-ПШ arortli Anarleaa: tforest ttLology wofcahop Sault S\.s.Harle, ontarlo

August 17-20, 1992; Ш.съезду ВОФР, С.-Петербург, 1993.

В законченном виде работа доложена и обсуждена на расширенном заседании кафедры ботаники и дендрологии Воронежского лесотехни -ческого института.

Структура диссертация. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, объектов и методов исследования и двух экспериментальных глав, выводов и списка литературы, включающего /<?7 наименования, в том числе иностранных. Работа излажена на

/«?/ страницах машинописи, содержит /¿'таблиц и у рисунка.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. Культура ткани и генетическая трансформация древесных растений.

В данной главе анализируется состояние вопроса по микрокло-нальному размножению древесных растений я культуре тканей в целом, начиная с первых работ Р.Готре ( oautbaret ,1940), К.Какью (j»c<mi • t ,1949,1955),'С.И.Машкина и А.В.Семенниковой (1959,1966), Э.А. Быченковой (1963,1967,1977) и других ученых и кончая исследованиями 1980-90-Х ГОДОВ (Bodxiqeaz ,1982; Durxea, Gupt» ,1987; Hataao, ▼on Arnold . ,1988; НсОгапяЬод, Tula eke, Ahmadl ,1988} Polito •t ai ,1989; Фелалиев,1990 и др.). Делается вывод о том, что несмотря на успехи, достигнутые в области минроклоналыюго размножения пока еще над достаточной информации для разработки промышленных технологий выращивания высококачественного посадочного материала основных лосообразувдих древесных пород мира.

Во второй части обзора рассматривается диалектика представления о способах и достижениях генетического улучшения древесных растений путем генетической трансформации с агробактериямч". В этом отношении упоминается работа с сосной ладанной ( sadororr, stooa, Ctiltoa, Mioi-e ,1934), затем ТОПОЛЯМИ ( HlcocJio at «1,1986;

Рагвоаа «V «1,1986¡ nilattl «t el, I987í Pithoud «t al, 1987 И др.),по

псевдотсуге ( Dandekar «t al ,1987) и некоторым другом породам («в кау tt al , 1987; vaehaiata et al ,1987 и др.). Здесь же указывается на трудности с проведением генно-инженерных работ с древесными растениями, на небольшой пока выход трансгенных растений при использовании существующих штаммов агробахтерий и на необходимость нроредения дальнейших исследований.

П. Объекты и методы исследования

В качестве исходного материала использовали гибрид тополя -01.05 (Populus suaveolena Flaetux P.berllnanala Dipp.;xP.auaT«olana riaefc. И 13.04 (полусибо Populua aaxlEowlzill Henrj. ) ИЗ ПОЩГЛвТума НИИЛГиС И четыре гибрида ореха ( Jagían» ragi» l. x J.a*a«hurlca имя, из питомника ВЛТИ.

Подготовка растительного материала для введения в культуру ritro включала ряд подготовительных этапов:

- для тополя: заготовку побегов текущего года длиной до 50 о» 'в. конце сентября и "выгонку" побегов из спящих почек в условиях искусственного климата;

- для рреха: заготовку 'здоровых семян, полученных от свободного опыления а разрушения эндокарпа без поврездения семени.

Стерилизацию исходного материала проводили следующим образом:

для тополя:

- дротирка побегов ватой, смоченной 7СЙ этанолом;

- промывка 0,005$ раствором Твин-60 в течение 15 мин;

- стерилизации 4,5$ раствором гяпохлорида кальция 25 мин;

- пятикратную отмывку стерильной дистиллироганной водой для ореха;

- стерилизацию £% раствором гипохлорида кальция, содержащим Q,OQñ% Твин-60, в точение 20 мин;

- 3 -

- пятикратную отмывку стерильной дистиллированной водой Все работы по изолирование апикальных меристем с 2-3 листов ми примордияма проводили в стерильных условиях, обеспечиваемых ламикар-боксом УО-БГ.

В исследованиях были использованы агаризованные среды Мурас ге и Скуга (Г.!С; нигмыв», гкоо* ,1962), Драйвера и Каниуки (ДКЕ; Вг1«г, ЬшЮгк! ,1984), Миллера (М; иш»г ,1967),

модифицированные в зависимости от целей конкретных опытов.

Культивирование первичных эксплантов (изолированных апикал! ных меристем для тополя и изолированных эмбрионов для ореха) щ водили в биологических пробирках диаметром 21 мм при 25°С и феи периоде 16 час, освещенности 2000 люкс, достигаемой лшшгесцеш ними лампами ЛД и ЛБ. В данных условиях проводились и последующие этапы микроклонального 'размножения. В отдельных опытах испс льаовали культивирование в темноте.

Индукция формирования адвентивных побегов на первичных экс-плант ах достигалась добавлением в среду культивирования 6-<5енз1 еминопурина (БАП) в концентрации 0,0-1,0 мг/л для тополя и 0,51,0 мг/л для ореха. В отдельных опытах был использован кинетин, Повторное черенкование проводили через 4 недели культлвировашу Индукция ризогенеза достигалась при понижении концентрации солей в культуралыгой сроде с применением индолил-масляной кис. ты (ИЫК) или без нее.

В экспериментах по генетической трансформации бшш использ< ваны лабораторные штаммы А£гоъ»с4ег1ив Ъиа*;*с1«ав дикого типа С 53 и С56С1 и гатамм 5^12, несущий искусственную генетическую конструкцию, кодирующую Д -ЭНДОТОКСИН ВасИХив тиг1Ев1»и»1с я нчсмицикфосфотрансферазу.

Культивирование бактерии проводили на среде ЛБ (Маниатис,

>рич, Сэмбрук, 1934).

Генетическую трансформацию проводили используя метод ко-куль-■ивирования эксплантов с культурой бактерии ( з»Пкг, иссото, !989).

Тестирование трансформированного материала проводили по общз-гринятым методам генетической инженерии растений (Лихтенштейн, рейпер, 1988).

Штаммы ЛггоЬас1вг1ив гишвГас1еаз получены из Института физиоло-ии и биохимия микроорганизмов РАН.

Все результаты получены но менее чем из 10-15 позторностей, орфометрические показатели учитывали через 4-5 недоль культивиро-анпя, и обработаны методами математической статистики по програм-зм к ЭВМ "Искра-ЮЗО.П".

Ш. Микроклокальное разложение и'генетическая трансформация ■ гибридов тополя.

Морфогенетические процессы в изолированных меристемах индуци-звата путем культивирования на агаризованной среде МС с возраста-цей от 0 до 1 мг/л концентрацией БАП в течение 4-х недель. Резуль-1ты показали достоверные различия между: изучаемыми гибридами то ->ля (Рис.1).

Меристемы гибрида 01.05 характеризовались более высокой способ-1стыэ к спонтанному образованию адвентивных побегов при отсутст-[И БАП в среде по сравнению с меристемами гибридов 13.04. Макси-игьноэ продуцирование побегов меристемами гибрида 01.05 имело ме-■0 при концентрации БАП 0,25 мг/л, а у гибрида 13.04 - при 0,5 /л. Дальнейшее повышение содержания БАП в среда вело к ингибпро-нию морфогенетических процессов у меристем обоих гибридоз. Полу-нныэ результаты не только подтвервдают данные о высоком морфоге-тическом потенциале тополя (капйл! ,1989;и др.), но и указывают

Рнс.1. Влияние БАП на формирование побегов-регенерантов гибридов тополя из апикальных меристем. г(Б=0,05)

па существенные различия морфоГенетического потенциала изучаемых гибридов.

Мультиплицирование побегов тополя осуществлялось их микрочеренкованием и культивированием в присутствии БАП от 0 до I мг/л. Сравнительный анализ индукции органогенеза меристемами побегов-регенерантов с исходными меристемами показал, что достоверные различия между гибридами сохраняются (Рис.2). Более того, характер зависимости продуцирования апикальных побегов меристемами от содержания БАП в среда остается типичным для каждого из изучаемых гибридов. В то яе время полученные данные указывают на то, что морфогенети-ческий потенциал меристем из побегов-регенерантов превышает потенциал исходных меристем. Это выражается достоверными различиями в количестве продуцируемых адвентивных побегов по всех вариантах опыта. Следовательно, в процессе клонирования побегов тополя 1а rt.trо происходит возрастание норфогенетического потенциала меристем у первого и второго поколения побегов-регенерантов, что, по-

0

N Ч.

1

п. 04

01.05

Ы5

Й5

0.15

1.0

мг о,5 1,0

т

Рис.2. Влияние БАП на индукции органогенеза в культуре апикальных меристем гибридов тополя, г(Р=0,05)

-- апикальные меристемы с поОегов-рэгенерантов;

... - апикальные меристемы изолированы от побегов после "выгонки" в условиях искусственного климата.

видимому, связано с процессом реювенилизациа б культуралытх условиях. "

Идентичный характер морфогенетического ответа на содержание БАП в среде исходными меристемами и меристемами побегов-регенвран-тов позволяет предположить, что при клонировании тополя по данной методике не происходят существенного нарушения исходного генотипа изучаемых гибридов.

Посла доращивания побегов-регенераетов до 4-5 см длиной их )тделяли и переносила на среды для индукции ризогенеза. Укорвно-щз побегов тополя не требовало экзогенных ауксинов. Ризогенез тдуцировалг, при культивировании на низкосолевнх средах. 82% уко-'вивтпа пибзгов гибрида 01,05 было получено на среде МС, разбав-енной в 4 раза, л 70%. укорененных побегов гибрида 13.04 получали

HQ той же среде, но разбавленной в 2 раза. Таким образом, были выявлены оптимальные условия для клонирования in vitro изучаемых гибридов тополя.

Следующий этап исследования составляло тестирование регенера-циошюй способности различных типов эксплантов с целко выбора наиболее эффективных из roix для проведения генетической трансформации.

Морфогенез сегментов меддоузлий побегов-регенерантов индуцировали на среде НС, дополненной БАЛ в концентрации 0,25-0,5 мг/л. Показано, что в течение 4 недель культивирования максимальное продуцирование побегов у гибрида 01.05 достигалось при 0.25 мг/л БАЛ в составляло 4-5 побегов на эксплант.

В опыте с сегментами листа было показано, что морфогенетичес-кие процессы более ярко выражены у гибрида 01.05, у которого при содержании 0,25 мг/л ВАЛ в среде 53% эксплантов показали способность к прямой регенераций побегов, тогда как для гибрида 13.04 максимальное количество эксплантов, регенерировавших побеги, составило 26,7$ при 0,5 мг/л БАЛ в течение 5 недель культивирования (Рио.З).

Полученные результаты показали, что лиственные сетаенты могут быть более эффективными для генетической трансформации изучаемых гибридов тополя по сравнению с междоузлиями, что согласуется с данными других авторов по. генетической инженерии тополя {«.liatti • t al , 1987).

Генетическую трансформацию изучаемкх гибридов тополя проводили путем ко-культивирования сегментов листа с культурой бактерии в течение 20-30 мин (s«iimer, несота ,1989).

Результаты по генетической трансформации лабораторными штаммами дикого типа С58 и C58CI через 4 недели после ко-культивирова-

5

3

01-05

ИМ

1

О <М5 0.5 /.О

О С.25 ав м

5/9/1, мг]п

Рис.3. Влияние БАП на индукцию органогенеза у листовых сегментов тополя, к (Р=0,05).

нля показали различия как по восприимчивости гибридов тополя к агробактериаяьной инфекции, так и по вирулентности лигах штаммов к тому или иному гибриду (Табл.1).

Таблица I

Генетическая трансформация листовых сетаюнтов гибридов ТОПОЛЯ онкогенными штаммами АПлтвгас1епв

гибрид 01.Оо

гибрид 13.04

Штамм ¡частота транс-:среднее коли-:частота транс-:среднее коли-5актерии¡формации, % :чество побе -¡формации, % ¡чество побе-: :гов-регенера-: ¡гов-регенера-:нтов. шт_:____:нтов. ит

¡58 86,7 1,39 + 0,21 73,3 1.17 + 0,17

158С1 56,7 1,48 + 0,27 46,7 1,23 + 0,16

;онтролъ 0 0 0 0

г (Р=0,05)

Выявлено, что экспланты гибрида 01.05, отличающегося более вы-окими морфогенетическими потенциалами, обладаот более высокой ча~ тотой трансформации, определяемой по количеству оксп антоз, пока-

завших способность к неопластичному росту. Получена регенерация побегов из опухолевых тканей при культивировании на безгормональных средах, что уже отмечено для тополя ранее ( ruiatti et ai, 1387). Подтверждение генетической трансформации показано в результате изучения способности трансформированных тканей к гормоннеза-висимому росту в течение нескольких месяцев культивирования и по присутствию в них оотопина, кодируемого и. плазмядачи данных штаммов.

На следующем этапе листовые сегменты ко-культивировали с культурой штамма Bt л 12. После ко-культивлрования аксгиганты помещали на среду МС, дополненную ЕАП в концентрации 0,25-0,5 мг/л для индукции в них морфогонеза и 60 мг/л каиамицина для селегдии трансформированных клеток, поскольку генетическая конструкцияst л 12 кодирует несмицинфосфотрансферазу, экспрессия которой выражается в устойчивости растительной ткани к кан?мищшу в течение 4-х недель культивирования. Получена регонориция побегов у 53,3$ эксплантов гибрида 01.05 а 40$ эксплантов гибрида 13.04 в присутствии каками-цана в среде, тогда как в контрольном варианте опыта.(ко-культиви-ровшше эксплгнтоз без бш'.тер^альной культуры) .100$ эксплантов погибли на среде, содержащей 60 мг/л какамицина (Табл.2к Результаты

Таблица 2

Трансформация листовых сешентов тополя неонкогенным штаммом A.tucafaclens (BtAliJ)

гибриды : частота тран^о рмации, : среднее количество побегов-

: % :регзнерантов, шт

13.04 40,0 3,33 + 0,62

01.05 53,3 5,88 + 0,99

г (Р=0,05)

дак>;сго эксперимента указывают на трансформацию клеток тополя гене-

тической конструкцией вг д. 12. Трансформированные побеги доращивали в присутствии канамицина в среде и укореняли на низкосолевых ере -дах в тех же условиях, что и нетранЬфоршровшпше побеги-регенера-нты.

Таким образом, в результате "проведенных исследований выявлены условия, обеспечивающие как массовое клонирование исходных генотипов, так и их эффективную генетическую трансформацию и получение грансгенных пробирочных растений тополя.

1У. Культура ткани и генетическая трансформация гибридов ореха.

Для клонирования исходных генотипов орзха проводили проращи-занке изолированных эмбрионов 1п iri.trо . Интенсивность процессов зоста и развития эмбрионов зависела от типа среды культивирования ! содержания в ней сахарозы. Сравнительный анализ минерального со-;тава среды, содержащей микроэлементы по Мурасиге и Скуга и микроцементы по Миллеру,' со средой ДКВ показал, что последняя дает [аилучшие результаты для всех изучаемых гибридов после 5 недель ¡уль'Гивирования. Дополнение среды ДКВ экзогенными фитегормонами 1вло к возрастанию интенсивности ростовых процессов (Рис.4).

Оптимальными для всех изучаемых гибридов явилось дополнение роды ДКВ БАЛ в концентрации I мг/л, кинетином - 2 мг/л, ИМК -1,01 мг/л и 250 мг/л ь -глутамина. 100^-яое нормальное развитие золированных эмбрионов в данных культуральных условиях било до-тигнуто только для свежесобраншпе семян. Хранение сеют: в тече-ие 3-х и 6 месяцев приводило к возрастанию гибели пли аномально-у развитию изоллрозанных эмбрионов ь культуре.

Мпрфогенетичьские процессы у проростков ореха ицгуцировали утем удаления корня и декапитации эпккотиля с последующим куль-явироЕанием эксплантсз на среде ДКВ, дополненной 0,5-1,0 мг/л

$¡£0 I

/7-3

7-1

16 -г-2£

с«

I

(±

¥

4-

4-

гЬ

+■

ч-

ЫРилты сиеды

ЕЗ среда ДКЕ;

§ среда ДКЗ.дополненная 1,0 мг/л БАП К 0,01 мг/л ИМК;

□ среда ЛКВ.дополненкая 1,0 мг/л БАП, 2 мг/л кинетина, 0,01 мг/л ИЖ и 250 мг/л ь -глу-тамина

Рис.4. Влияние экзогенных фитогормонов на прорастание изолированных эмбрионов ореха, г (Р=0,05).

БАП и 0,005-0,01 мг/л ИМК. Изучаемые гибриды4 ореха но показали''существенных различий в харшстере морфогенетического ответа на при. -сутствие экзогенных фитогормонон в среде. Максимальное цродуциро -вание адвентивных гобогов достигнуто на среде ДКВ через 4 недели культивирования, содержащей 1,0 мг/л БАП и 0,01 мг/л„ШК, где каждый эксплант образовывая 5-7 адвентивных побегов.

Клонирование генотипов ореха осуществляли используя изолированные апзкальныо меристемы побегов. Для оптимизации условий индукции морфогенеза у апикальных меристем было проведено сравнение трех типов срсд - МС, М и ДКВ, дополненых 1,0 мг/л БАП с 0,01 мг/л ИМК и 0,5 мг/л БАП с 0,005 мг/л ИМК. Результаты показали, что наибольшее количество морфологически нормальных побегов было образовано на среде ДКБ, содержащей 1,0 мг/л БАП и 0,01 мг/л ШК, что указывает на оптимальность минерального состава среды ДКВ для индукции морфогенеза у изолированных меристем ореха (Рис.,5). В то же' время, :

а

Z

Ss?

0,5нг/*Ш* C.OOSnrJi ЦИК

1.0нг/л 6ЛП * 00/"г/> UHK

гЬ

I

л

N нс 4*8

N НС АКВ

ВЛРИЯНТЫ С0СДЫ

Рис.5. Влияние минерального состава питательной среди ка индукцию морфогенеза у апикальных меристем гибрида опе-ха Л 2-26. т (Р=0,05). Показатели учитывали через 5 недель культивирования.

по данным ряда исследователей (Heiie-sudhoit *t «1 ,1966; Liu,ниц 1986) органогенез у эксплантов ореха индуцируется более высокой концентрацией экзогенных цитокининов в среде культивирования. Повышение концентрации экзогенных цитокининов в среде ДКВ путем дополнения 1,0 мг/л БАЛ .'и кикетином в Концентрзтг'и 2,0 мг/л привело к увеличению формирования адвентивных побегов до 4-х на ?ксилалт.

Мультиплицирование достигалось микрочеренкованием побегов и культивированием черенков с апикальной меристемой на среде аналогичного состава. Такая же среда была использована и дли дораэдва-ния побегов. В течение 4-:: недель основной побег достигал длины 4-5 см и имел 4-5 листьев. После дорациьания побеги были использованы в экспериментах по укоренению. ,,

Ризогенез индуцировали добавлением ИМК в среду культизирова-ния и путем предварительной обработки банальной части побега растворами ИМК в концентрация от 2,5 до 10 мг/л. Сравнительный анализ влияния различных концентраций ИМК на индукцию рьзогенеза у

Ч

побегов-регонерантоз ореха показал, что при обработке базальной ча ти побега раствором ИЖ в концентрации 5 мг/л образование корневых зачатков имело место у 30-605? побегов, тогда как при обработке раствором К.".К в концентрации 2,5 мг/л и 10 мг/л процент побегов с ко рневши зачатками бил значительно ниже. Способность к ризогенезу в ответ на обработку ИМК в значительной степени определялась генотипом. В то ко время корневые зачатки, образовавшиеся в результате обработки, на среде ДКВ не развивались в корни даже после 6 недель культивирования. Поэтому было проведено изучение влияния минерального состава среды на ризогенез у побегов ореха путем сравнения среды ДКВ с полной и разбавленной в 4 раза средой ЫС, содержащей 5 мг/л ИМК (Рис.6).

2-Х6

д*в не У* не

Рис.6. Влияние типа питательной среды на цндукцшз разоген«за у побогоз ореха в присутствии 5 мг/л ИМК.

ЭП - г обеги, вчятые из эксшгантов, выращенных в стандартных условиях освэщеная; (23 - побеги, взяткэ на эхсплантоз, выращенных без освещения.

Выявлено, что при использовании разбавленной среды кС ризогене индуцирован у 505? пссэгов, причем корнав«» зачатка в течение 4-:: недель раови^алшеь в мор^огенетически нормагьные корни. Процент ук

юнившихся побегов может быть увеличен до 65$ при использовании »тиолированных побегов ореха.

Таким образом, в ходе настоящих экспериментов били оптпмизк-юваны условия клонирования изучаемых гибридов ореха.

Генетически трансформацию глбридов ореха проводили путем ко-¡ультивирования листовых сегаентов пробирочных растений ореха или истей эпикотиля и мездоузлий побегов с культурой агробактерг.и в ■ечение 20-30 мин.

Результаты по генетической трансформации посредством лабора-орных штаммов дикого типа С58 и C58CI показали различия по всс-риимчивости гибридов ореха к агрсбактериальной инфекции и по ви-улеитнссти итачмов бактерий к данным гибридам (Табл.3).

Таблица 3

Генетическая трансформация листовых сегаентов ореха ОНКОГеННЫМИ ШТаммама A.tuaefaciene

таммы : гибшя 17-3 1 гкбшд 2-26

акте ш Я :частота трансформации. % : частота трансйогмпции. %

58 46,7 . 33,3

58CI ?3,3 66,7

онтроль 0 0

Наибольшая частота трансформации получена для гибрида 17-3 таммом C58CI- 73,3$. В отличие от опухолевых тканей тлюля опу-

олевые ткани ореха не'Обладала способностью к органогенезу. Нали-ие генетической трансформации подтверждают изучение способности пухолевой ткани к гормога-езавискмому росту в точение нескольких эсяцев культивирования и определение содержания октотша в тка-IX. Большое практическое значение для улучшения гибридов ореха леет введение з геном генетической конструкции еь..Л2, хг.дирую-э1 дс.тьта-5:щото::с:ш, оказывайся летальное действие на вродпте-2Й из отряда

В данном эксперименте бил расширен круг эксплантов для ко-куль-тивировшшя за счет использования сетаентов междоузлий и разрезанных вдоль частей эпикотиля. После ко-культивирозания с культурой штамма въ д 12 экспланты в течение 4 недель культивировали на среде ДЮЗ, дополненной 1,0 мг/л БАП, 2 мг/л кинетина, 0,01 кг/л ИМК и 250 мг/л ь -глутаяина в присутствии 75 мг/л каначицина для селекции трансформированных клеток. Контрольный вариант опыта при культивировании на данной среде полностью погиб, тогда как у опытных • вариантов наблюдали регенерацию побегов, что свидетельствует о произошедшей генетической трансформации тканей ореха генетической конструкцией т а 12, кодирующей ген неомицанфосфотрансферааы, которая придает устойчивость растительной тхяни к канамицину. Наибольшая частота трансформации, оцениваемая как жизнеспособность эксола-нтов на среде с канамиципом, била отмечена у сетаентов эпикотшш и достигала 60-100/5 (Табл.4). Побаги, образовавшиеся на эксплан^гах в присутствии какамицина, имели морфологически нормальный вид £

Таблица 4

у» ' •

Трансформация гибридов ороха неонкогенным штаммом

ДЛимГас1аиа (ВЪд.Х2)

Показатели ¡Частота трансфор-: :маоди, % : Среднее количество побегов-г рогенерантов, шт

1-28

мездоутлия 10 2 ± 0,0

эликотиль • 100 5,6± 1,3

2-25

моздоузлия 50 1,0* 0,0

¡»ТИКО^ШЬ 60 4,C¿ 0,8

г (Р=0,05)

гасла дорагивалия на аналогичной среде до 4-5 ем в длину укореня- ' ■ул с.ь на разбавленной в четырэ раза средо МСЧ дополненной о мг/л

К. В результате проведенных экспериментов выявлены условия, ооес-чивающне как массовое воспроизводство изучаемых генотипов ороха, к и способы получения трансгенных.пробирочных растений.

Результаты исследований по кндухщрованкому морфогенезу гибри-з тополя и ореха in vitro позволили оптимизировать условия их ми-оклонального размножения, что представляет собой основу для соз-гая биотехнологий размножения данных растений. Проведение сравнительные исследований морфогенетического отве-пзолпровашшх меристем тополя на воздействие экзогенных тщтокп-тав показачо гекотипическута обусловленность характера ответа, твленная идентичность характера морфогепетпческого ответа у ме-зтегл, изолированных из исходных побегов, н меристем из побегов-генерачтоз указывает на сохранение генотипа при клонировании Torn через культуру изолированных меристем. При этом показан эффект заенплизации растительного материала' при размножении in vitro.

Доказано, что индукция морфогенеза на эпикотилях ореха возрас-!т при удалении у проростка корня и апикальной почки.

Установлено, что ко-кулътивировшшв ли стог; тх сегментов тополя 'реха с культурой агробактернй является эффективным способом ге-'ической трансформации данных растений. Показана экспрессия териалышх генов в растениях тополя и ореха. Требуется проведение дальнейших исследований по акклиматиза-полученных трачегенных растений в условиях зшфытого грунта роведение испытаний на устойчивость к вредителям из отр. Lepi-

ВЫВОДЫ

I. Изучено влияние минерального состава сред культивирования, злены оптимальные концентрации экзогенных фитогормоноз, показа-зффективность использования изолированных апикальных меристем

для микроклонального размножения гибридов ореха и тополя.

2. Экспериментально преодолены трудности, связанные с индукцией ризогенеза у побегов-регенерантоз ореха, установлено, что для укоренения данных гибридов лучшие результаты дает разбавленная в

4 раза среда MC, дополненная 5 мг/л ИМК. Доказано положительное влияние преинкубации побегов в темноте на их последующее укоренение.

3. Установлено, что характер морфогенетического ответа изучаемых изолированных апикальных меристем гибридов тополя на присутствие экзогенного БАП в среде культивирования не только сохраняется в процессе повторного клонирования, но и усиливается, причем ростовой потенциал и при повторном клонировании зависит от генотипа исходного растения.

4. Проведена генетическая трансформация гибридов тополя и ореха посредством плазмид агробактерий. Исследования со штаммами дикого типа позволили выявить оптимальные условия проведения ко-кул: •гивированвя и типы эксплантов. Показана эффективность использования листовых сегментов для генетической трансформации гибридов то> поля и ореха.

5. Осуществлено введение генотической конструкции* Bt л 12 в клетки гибридов ореха и тополя, выявлены условия регенерации растений из трансформированных тканой, проведено их тестирование на устойчивость к какзиишшу и микроклоналъное размножение.

Публикации

1. КгшеаЪ ЕавЫ Аиаг Zokl, KolesnicJienko V.M., Veretenalkov i.V. Culture Ib. tri tro of hibrld walnut (Juglar regla x J.oaaehurlca). north Auerlcan Forest Bio;3gy Workshop. Sault Ste.Karls, Ontario. August 17-20 1992.

2. Колесничего Б» М., Кассаб Ваши Амар Зеки, А.В.Веретен-

тов. Клонирование гибридов ореха (Juglaaa regla х J.oanshuric») культуре la ti tro . Тезисы Ш съезда ВОФР, С.-Петербург, 1993 j печати).