Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

КУЛЬТУРА ПЫЛЬНИКОВ В СЕЛЕКЦИИ ЛЬНА-ДОЛГУНЦА НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ФУЗАРИОЗНОМУ УВЯДАНИЮ

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "КУЛЬТУРА ПЫЛЬНИКОВ В СЕЛЕКЦИИ ЛЬНА-ДОЛГУНЦА НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ФУЗАРИОЗНОМУ УВЯДАНИЮ"

' *

На правах рукописи

ПРОЛЕТОВА Наталья Викторовна

КУЛЬТУРА ПЫЛЬНИКОВ В СЕЛЕКЦИИ ЛЬНА-ДОЛГУНЦА НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ФУЗАРИОЗНОМУ УВЯДАНИЮ

03.00.23 — биотехнология 06.01.05 — селекция и семеноводство

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2003

Диссертационная работа выполнена в лабораториях биотехнологии и иммунитета Всероссийского научно-исследовательского института льна Научные руководители - доктор биологических наук,

Официальные оппоненты доктор биологических наук СЛ. Каранова, кандидат биологических наук Е.А. Калашникова

Ведущая организация ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии

на заседании диссертационного совета Д 220 043 10 в Московской сельскохозяйственной академии им К А.Тимирязева

Адрес 127550, Москва И-550, Тимирязевская ул , 49

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Московской сельскохозяйственной академии им К А Тимирязева

4

Автореферат разос- _ ' -V _2003 г.

старший научный сотрудник А.В.Поляков кандидат сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник Н.И. Лошакова

Защита состоится « ■5 » 1//0. 2003г. в

часов

Ученый секр диссертацио!

" Карлов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Фузариозное увядание — наиболее вредоносное заболевание льна-долгунца. Поражение этим патогеном только на 1% влечет за собой снижение урожая льноволокна на 0,6%, а льносемян - на 0,7% (Караджо-ва, 1967; Корнеева, 1972; Мусиенко, Карпунина, 1985; Лошакова, 1999).

Возбудитель болезни — пластичный почвенный гриб, поэтому основной, наиболее эффективный способ борьбы с этим патогеном — выведение новых высокоустойчивых к фузариозному увяданию сортов.

Успешное решение проблемы устойчивости к заболеваниям во многом определяется применением, наряду с традиционной, классической селекцией, новых методических подходов, позволяющих повысить эффективность селекционной работы. Перспективным является использование биотехнологических методов. Работы по клеточной селекции на устойчивость к различным неблагоприятным факторам, в том числе и на устойчивость к патогенам, проводились многими авторами на различных видах растений (Herman, McCoy, Knous, 1984; Toyoda, Tanaky, Hirai, 1984; Миллер, 1989; Давыдова, 1991; Рамжит, 1995; Безденежных и др., 1997; Трошина и др., 1998). В ряде случаев были отселектиро-ваны не только клеточные клоны, но и растения-регенеранты, устойчивые к тому или иному токсическому фактору (Fadel, Wenzel, 1993; Белянская; Хитрова, 2001). В том числе известны работы по клеточной селекции на льне (Курчатова, 1994; Teiklova; 1996; Гончарук, 2000).

Рядом авторов было высказано предположение, что по реакции пыльцы на токсин можно определять чувствительность растения к грибам рода Fusarium и отбирать устойчивые формы люцерны, кукурузы, сои (Mulchahy, Mul-chahy, 1975; Rowe, Stortz, Gillette, 1985; Простакова и др., 1991). Китайские ученые в 1986 г. сообщили об успешном использовании культуры пыльников для селекции на устойчивость к пирикуляриозу у риса (Zhongzhan et al., 1986). Поэтому вопрос использования культуры пыльников в селекции льна-долгунца на устойчивость к фузариозному увяданию является актуальным, а получение новых устойчивых к этому патогену форм льна-долгунца методом клеточной селекции - перспективным направлением.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы была разработка элементов биотехнологии получения линий льна-долгунца, устойчивых к фузариозному увяданию и имеющих комплекс хозяйственно ценных признаков, с использованием методов культуры пыльников и клеточной селекции in vitro.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• оптимизировать условия для повышения морфогенетической активности пыльников;

• исследовать культурально - морфологические признаки используемых штаммов возбудителя фузариозного увядания льна-долгунца и подобрать оптимальные условия культивирования гриба F. oxysporum с целью получения

ВЫСОКОТОКСИЧНОГО Kynt.Typani.Hnm фиш.трятя;---.

ЦНБ МСХА

• отселектировать из каллусных культур устойчивые к культуральному фильтрату патогена и фузариевой кислоте клеточные линии и получить из них растения-регенеранты, устойчивые к фузариозному увяданию,

• создать линии льна-долгунца, устойчивые к фузариозному увяданию и неуступающие по основным хозяйственно ценным признакам сорту-стандарту Алексим, представляющие интерес для селекционной практики.

Научная новизна. В результате проведенных исследований оптимизированы условия выращивания донорных растений льна-долгунца и состав питательных сред для культивирования пыльников с целью индукции каллусогенеза и морфогенеза m vitro

Впервые разработана и испытана селективная система с использованием фузариевой кислоты, позволяющая отбирать устойчивые к этому токсину клетки льна-долгунца m vitro, из которых с большей эффективностью можно получать растения-регенеранты, устойчивые к фузариозному увяданию Показаны различия по способности клеток формировать каллус на селективной среде, в зависимости от степени устойчивости генотипов к фузариозному увяданию

Данные исследования открывают новые возможности создания ценного исходного селекционного материала и перспективных линий льна-долгунца для практической селекции

Практическая значимость. Из восприимчивых к фузариозному увяданию сортов Славный 82, Behnka и линий Г 1351, Л-957-8-4 получено 37 расте-ний-регенерантов, устойчивых к фузариевой кислоте, 22 из которых, согласно проведенной оценке на инфекционно-провокационном фоне, характеризовались высокой устойчивостью к фузариозному увяданию. Эти линии по основным хозяйственно ценным признакам не уступали исходным формам и сорту-стандарту Алексим.

Наиболее изученные и практически ценные линии - БТЛ-10 и ПП-9, полученные в культуре пыльников и в результате клеточной селекции, используются в селекционном процессе ВНИИ льна, а семена этих линий переданы в «Национальную коллекцию русского льна»

Апробация результатов диссертации. Основные результаты докладывались на Fourth European Regional Workshop on Flax " Producing for the market" (Rouen, 1996), Втором международном симпозиуме "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования" (Пущино, 16-20 июня 1997), IV Международной конференции "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 24-26 июня 1997), Международной научно-практической конференции, посвященной 70-летию ВНИИ льна (Торжок, 16-18 ноября 2000 г )

Публикации По материалам диссертационной работы опубликовано 16 научных работ.

Структура и объем работы Диссертация изложена на 146 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, четырех глав экспериментальной части, общих выводов, предложений селекционной практике, списка использованной литературы, включающего 198 наименований, в том

числе 76 иностранных авторов. Работа содержит 38 таблиц, 10 рисунков и 3 приложения.

УСЛОВИЯ, МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работу проводили на льне - долгунце (Linum usitatissimum L.), который был представлен сортами и линиями отечественной и зарубежной селекции. Генотипы различались между собой по устойчивости к фузариозному увяданию: Славный 82, Beiinka, Г 1351, Л-957-8-4, Л-301-8-6 - восприимчивые к заболеванию, с комплексом хозяйственно ценных признаков; Оршанский 2, А-29, Nike, Агесо, ТЕ 93/13, Alba, БТЛ-13, Rod 646/4 - устойчивые к патогену, с высокими качественными показателями. Семена льна были получены из лабораторий селекции, семеноводства и биотехнологии ВНИИ льна. После проверки по потомствам, семена использовали в качестве исходного материала.

Изучение влияния площади питания донорного растения (25,0 смг и 6,25 см2), фона удобренности и декапитации соцветий проводили в вегетационном домике в сосудах Митчерлиха по общепринятой методике (Доспехов, 1979). В почву перед посевом вносили растворы минеральных удобрений (50 мл) из расчета на один сосуд: аммиачная селитра - 1,47 г, хлористый калий - 1,58 г, суперфосфат • 2,4 г. Схема исследований включала проведение в фазу «елочка» дополнительной подкормки донорных растений. Доза минеральных удобрений была снижена в 2 раза, из расчета от вносимой перед посевом. Внекорневая подкормка растворами микроэлементов - бор, марганец, цинк, медь (по 1 г/л раствора) была проведена с целью предотвращения физиологического угнетения растений. Декапитацию соцветий проводили в фазу первого бутона.

Устойчивость растений к фузариозному увяданию определяли на специализированных инфекционно-провокационных фонах в соответствии с "Методическими указаниями по селекции льна-долгунца" (1987) и "Методическим указаниям по фитопатологическим работам со льном-долгунцом" (1969, 2000). Для создания инфекционно-провокационного фона были использованы ^популяции гриба-возбудителя фузариозного увядания, состоящие из сильновирулентных штаммов 185, 198, 173, 235 (со степенью поражения сортов-стандартов 60-90%) и средневирулентных штаммов - 195, 193, 199, 188 (со степенью поражения - 25-55%), выделенных в различных регионах льносеяния. Возраст инфекции при посеве семян - 3 недели. В качестве стандартов использовали сорта льна-долгунца Алексим, А-29, Славный 82 и Belinka. ,,

Лабораторные исследования проводили в соответствии с «Методическими указаниями по культуре тканей и органов растений» (Лукьянюк, Игнатова, 1980), «Методическими указаниями по получению вариантных клеточных линий и растений у разных сортов картофеля» (Бутенко, Хромова, Седнина, 1984), методикой «Культивирования тканей на твердых питательных средах» (Урманцева, 1988). *"*

Бутоны с пыльниками льна стерилизовали при мягком режиме, используя этанол в концентрации 70% в течение 30 секунд Затем бутоны переносили в 1%-ный раствор хлорамина "Б" (продолжительность обработки 2,0-2,5 минуты) с последующей тщательной промывкой дистиллированной стерильной водой Асептически изолированные пыльники помещали в пробирки (по 5 шт ) на питательные среды Sh-2, Sh-2' 5/2, LMK-3 и селективные среды, содержащие фу-зариевую кислоту или культуральный фильтрат возбудителя фузариозного увядания льна Пыльники культивировали в течение трех недель в термостате с последующим переносом на свет, где их культивирование осуществляли при температуре 24°+1 °С, освещенности 4000 люкс, фотопериоде 16 часов день и 8 часов ночь В опыте использовали лампы дневного света ЛДЦ

Регенерацию побегов осуществляли на среде 1/2 Sh-2 со сниженной в пятьдесят раз концентрацией регуляторов роста (0,02 мг/л БА+- 0,0001 мг/л НУК) без фузариевой кислоты

Питательные среды готовили на основе концентратов Регуляторы роста, культуральный фильтрат гриба и раствор фузариевой кислоты вносили в среды в нужных объемах перед автоклавированием Реакцию pH среды (5,6 - 5,8) устанавливали перед автоклавированием 1N раствором NaoH

Клеточную селекцию на устойчивость клеток льна к фузариевой кислоте проводили согласно схеме (рис 1) Клеточный отбор на устойчивость включал в себя два основных этапа культивирование изолированных пыльников на модифицированной среде Sh-2, содержащей 0,5 мг/ч фузариевой кислоты, а затем перенос морфогенного каллуса вновь на среду с токсином (10,0 мг/л) Культивирование морфогенного каллуса на среде для регенерации осуществляли через 3 пассажа

Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с грниенениеы критериев Стьюдента и Фишера (Доспехов, 1979), а также методом дисперсионного анализа на ПЭВМ с использованием пакета программ « БИОСТАТ» и « Excel 5,0»

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Создание форм льна-долгунца на основе растений-регенерантов, полученных в культуре пыльников

1.1. Влияние условий выращивания донорных растений.

С целью оптимизации условий формирования морфогенного каллуса изучено влияние условий выращивания донорных растений на каллусогенез в культуре изолированных пыльников Показано, что при увеличении площади питания растений с 6,25 см2 до 25,0 см2 возрастала интенсивность формирования каллуса у сорта А-29 с 14,0% до 26,0%, у Nike - с 12,0% до 28,0% У линии Г 1351 этот показатель несколько снизился, однако снижение не было значимым (рис 2)

Рис. 1. Схема клеточной селекции на устойчивость льна-долгунца к фузари-озному увяданию

Анализ результатов выращивания донорных растений на высоком и обычном агрофонах, позволил выявить зависимость интенсивности формирования морфогенной, хорошо пролиферирующей каллусной ткани от внесения дополнительной подкормки Чем выше был агрофон, тем эффективнее протекал каллусогенез у всех генотипов, включенных в исследования.

При декапитации соцветий, благодаря снятию «эффекта апикального доминирования», отмечена значительная индукция каллусогенеза Проведение декапитации позволило увеличить долю пыльников, сформировавших каллус, с 2,0 - 3,0% (в контроле) до 15,0 — 18,0% в вариантах опыта

Рис 1 Влияние ллошлди питания дополнительной подкормки и деклпитдцин донорных рдстений нл кмлусйгене! изолированных пыльников

Таким образом, для получения морфогенного каллуса на основе пыльников необходимо, чтобы донорные растения выращивались в условиях высокого агрофона, с повышенной площадью питания и проведением декапитации соцветий

П. Роль стадии развития микроспоры на индукцию каллусогенеза.

Среди условий, определяющих поведение репродуктивных клеток при культивировании пыльников, наиболее изучена роль стадии онтогенеза пыльцы, при которой проведена эксплантация (Nitsch, Nitsch, 1969, Sunderland, 1974, Дао, Шамина, 1978; Суханов, Тырнов, Лукьянова, 1979).

Сравнительный анализ результатов исследований показал, что способность изолированных пыльников льна-долгунца образовывать каллус и интенсивность его формирования находились в зависимости от стадии развития мик-

роспоры. Пыльцевые зерна, помещенные на питательную среду 5Ь-2 на стадии одноядерной вакуолизированной микроспоры, характеризовались наибольшей способностью к дедифференцировке по сравнению с пыльцевыми зернами, изолированными на стадиях зрелой пыльцы и тетрад (табл. 1).

Таблица 1

Влияние стадии развития пыльцы на каллусогенез льна _в культуре пыльников (п ~ 200)__

Стадия развития пыльцы Доля пыльников, сформировавших морфогенный каллус, 'Л ±

Оршанский 2 А1Ьа №ке

Тетрады 3,0 ± 1,2 2,0 ± 1,0 9,0 + 2,0

Одноядерная вакуолизированная микроспора 103 + 2,2 7,0+1,8 15,0 + 2,5

Зрелая пыльца 1,0 + 0,7 0,0 1,5 + 0,9

На стадии одноядерной вакуолизированной микроспоры количество изолированных пыльников, на основе которых формировался каллус, было на 5,0 — 7,0% больше, чем на стадии тетрад; и на 7,0 - 13,5% больше, чем на стадии зрелой пыльцы.

Каллусная ткань, полученная в вариантах «тетрады» и «зрелая пыльца» отличалась слабой пролиферирующей способностью. После трех субкультивирований на аналогичной среде, в этих вариантах не наблюдалась морфогенетическая активность, тогда как в варианте «одноядерная вакуолизированная микроспора» происходило сохранение морфо генетического потенциала. В связи с этим, предпочтительнее эксплантировать пыльники льна-долгунца на стадии одноядерной вакуолизированной микроспоры.

и. Влияние состава питательной среды на формирование морфо-генной каллусной ткани

Роль фитогормонов. Большое внимание исследователи уделяют подбору оптимальных условий культивирования пыльников. В литературных источниках описано большое количество сред с различным сочетанием фитогормонов и других компонентов. Однако известно, что для каждого вида растений необходимо индивидуально оптимизировать эти условия (Шамина, 1981; Загорска, 1995).

В своей работе мы особое внимание уделили первым этапам образования и культивирования каллуса. Оптимизация состава питательной среды позволила нам увеличить количество хорошо пролиферирующей каллусной ткани с 0,0% до 12,0% - 48,0%, в зависимости от генотипа льна-долгунца. Изменение соотношения между входящими в состав питательной среды цитокининами и ауксинами позволило выявить зависимость между концентрациями 6-бензиламинопурина (БА), ог-нафтилуксусной кислоты (НУК), индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) и дифференцирующей способностью изолированных

пыльников Использование одного цитокинина - БА в концентрации 2,0 мг/л приводило к образованию небольшого количества (0,0-2,0%) пыльников с мор-фогенным каллусом сортов А-29, Славный 82 и ВеИпка (табл 2) Добавление к Б А (2,0) ауксина НУ К в высокой (1,0 мг/л) и малой (0,05 мг/л) концентрациях позволяло получать пыльники, формирующие каллус, у сортов ВеЬпка до 6,012,0% и А-29 - 2,0-6,0% Под влиянием ауксинов ткани пыльников начинали неорганизованно делиться, формируя каллусную ткань, которая чаще всего была неоднородной и состояла из рыхлых, оводненных участков и более плотных структурированных тканей с выраженными меристематическими очагами Использование регуляторов роста в комбинации БА (1,0) + НУК (0,5) + ИУК (0,3) существенно, до 20,0 - 48,0% (в зависимости от генотипа), повышало пролифе-ративную способность клеток пыльников Однако в этом варианте не была достигнута индукция морфогенеза Лишь сочетание Б А (1,0) + НУК (0,05) на фоне высокой морфогенетической активности индуцировало формирование побегов и после трех субкультивирований на аналогичной среде были получены расте-ния-регенеранты

Таблица 2

Интенсивность морфогенеза в культуре пыльников в зависимости от комбинации регуляторов роста (п — 150)_

Регуляторы роста, мг/л Количество пыльников, сформировавших морфогенный каллус, % ± 2Sp

А-29 Славный 82 Belinka

Kin «(1.0) 0,0 0,0 0,0

БА(2,0) 0,0 2,0±0,9 2,0±1,1

БА (2,0)+НУК (1,0) 6,0±1,9 2,0±1,0 12.0±3,2

НА (2,0)+НУК (0,05) 2,0±1,1 4,0±2,1 6,0±0,3

БА( 1,0)+НУК(0,05) 16,0±2,1 12,0±0,3 24,0±3,1

БА (1,0)+НУК (0,5)+ИУК (0,3) 24,0±2,8 20,0±3,2 48,0+4,5

Примечание Kin* - кинетин

Таким образом, исходя из поставленных целей, предпочтительнее использовать среды, содержащие регуляторы роста БА и НУК в концентрациях 1,0 мг/л и 0,05 мг/л соответственно

Влияние углеводов. Многие авторы на различных видах культивируемых клеток растений выявили зависимость индукции морфогенеза не только от гормонального фактора, но и от источников углеводного питания и концентрации сахара в тканях (\Уе№юге, Богокт, 1955, Wetmore, 1Ъег, 1963, Бутенко, 1975; МтсЫ:ег1е1П ег а1, 1997)

В наших исследованиях было показано, что изменение состава и концентрации углеводов в питательной среде ЗЬ-2' 5/2 имеет значение для индукции морфогенного каллуса. Сахароза, а также комплекс «глюкоза-сахароза», были достаточно эффективны как источники энергии При концентрации сахарозы 30 г/л у сортов и ТЕ 93/13 формирование морфогенного каллуса из пыль-

ников происходило на уровне контрольного варианта (10,0% и 12,0% соответственно). Однако использование в питательной среде сахарозы в концентрации 50 г/л и 70 г/л, также позволяло получать морфогенный каллус этих генотипов (табл. 3). Тем не менее, после трех субкультивирований морфогенного каллуса на питательной среде, только в вариантах с сахарозой - 30 г/л и в контроле у сортов Viking и ТЕ 93/13 было отмечено формирование побегов в меристемати-ческих очагах. У генотипа БТЛ-12 во всех изученных вариантах побеги не были получены. Возможно такая специфичность связана с тем, что морфогенетиче-ский потенциал линии БТЛ-12 уступает сортам Viking и ТЕ 93/13.

Таблица 3

Влияние концентрации углеводов в питательной среде на каллусогенез

льна-долгунца в культуре пыльников (п = 150)

Наименование и концентрация углеводов, г/л Количество пылъников с<! вавших морфогенный калл' юрм и роге, % ± 2Sp Сформировано побегов после 3-х субкультивирований шт./1 каллус

Viking ТЕ 93/13 БТЛ-12 Vikmn ТЕ 93/13 БТЛ-12

Сахароза, 25 + глюкоза, 25 (контроль) 12,0±1Д 14,0±2,2 0,0 3 1 0

Сахароза, 30 10,0±!,7 12,0±2,3 0,0 2 4 0

Сахароза, 50 10,0±2,1 6,0±1,7 2,0±1,1 0 0 0

Сахароза, 70 4,0±2,2 8,0±0,3 4,0±1,3 0 0 0

Сахароза, 130 0,0 0,0 0,0 0 0 0

Мальтоза, 30 0,0 2,0±0,1 0,0 0 0 0

Мальтоза, 60 2,0±1,9 4,0±1,4 0,0 0 0 0

По результатам исследований была разработана питательная среда 8Ь-2, использование которой позволяет сформировать морфогенный каллус у 12,0 — 48,0% культивируемых пыльников. При культивировании пыльников на этой среде (патент на изобретение № 2120741) было получено 138 растений-регенерантов.

1,4. Характеристика растений-регенерантов, полученных в культуре пыльников по основным хозяйственно ценным признакам

Оценка растений второго-четвертого поколений в селекционных питомниках 2-го и 3-го годов селекции показала, что ряд регенерантов по одному и нескольким признакам существенно превосходит исходные генотипы и сорт-стандарт Алексим. Отмечено, что наиболее часто в культуре пыльников образуются растения-регенеранты, превосходящие исходные сорта по семенной продуктивности (28,3%), а также массе волокна (13,0%). Гораздо реже формировались регенеранты, превосходящие исходные генотипы по содержанию волокна и длине технической части стебля.

Ряд линий, в течение двух лет исследований в селекционном питомнике 3-го года селекции характеризовались комплексным проявлением основных хозяйственно ценных признаков - высоким урожаем волокна, семян и высокой устойчивостью к полеганию Проведенное изучение позволило создать тинию БТЛ-10 (00-244-п 2), которая на 42,4 - 58,5 % по урожаю соломы, на 51,758,2% по урожаю семян и на 54,8 - 58,2% по урожаю волокна превосходила стандартный сорт Алексии и была устойчива к полеганию и фузариозному увяданию (табл 5)

Таблица 5

Характеристика линии льна-долгунца БТЛ-Ю, полученной ___на основе сорта Славный 82 СП-3 г __

Генотип Масса с 1 г соломы | семян [ волокна Содержание волокна, % Высота растений см Устойчи- | Устойчи вость к фу- I вость к по-триозу, % 1 пег балл

1999 г

00-244-п 2 428 89,2 175,5 i 41,0 1 84 I 89,0 1 4,5

в % к ст. 1583 158,2 154,8 111,1 97,6 i

Алексим, ст. 270 56,4 I 113,4 42,0 72 89,7 4,5

Славный 82, контроль 401 66,3 167,2 40,3 80 4,1 4,5 1

2000 г

00-244-п 2 484 61,0 154,9 1 32.0 74 93,5 1 4,5

в % к ст.* 142,4 151,7 158,2 j 111,1 102,7

Алексим, ст. 340 40,2 97,9 ! 28,8 72 92,0 4,0

Славный 82, контроль 458 61,3 137,9 34,6 70 3,4 4,0 !

Оценка, проведенная на инфекционно-провокационном фоне, показала, что из 138 растений-регенерантов 6 - были устойчивы к фузариозному увяданию и сохраняли свою устойчивость в течение нескольких поколений При этом отмечено, что из высокоустойчивых генотипов можно было получить как высокоустойчивые формы - Агесо 631 апЗ R1 (99,0%), так и восприимчивые -Nike an 97 (46,0%) (табл. 6)

Эффективность получения устойчивых растений-регенерантов и линий из восприимчивых к фузариозному увяданию генотипов была низкой - менее 0,14% от общего числа культивируемых пыльников В связи с этим необходимо было провести исследования по оптимизации условий интенсификации выявления in vitro устойчивых к фузариозному увяданию клеточных структур для формирования ценного селекционного материала.

Таблица 6

Результаты оценки линий льна-долгунца, полученных в культуре пыльников _на инфекционно-провокационном фоне_

Генотип Количество пораженных растений, % X ср Устойчивость, % ± 2 Sp

2000 г 2001 г 2000 г 2001 г

F3 Д2хБ п3899 R103 0,0 6,5 100,0 95,6 ±1,0

( Fj Д2 х Б nl R80 0,0 2,3 100,0 94,2 ± 2,3

Fj Д2 х Б п2 R70 0,0 0,0 100,0 100,0

Fj Д2хБ п3899 R109 0,0 0,0 100,0 100,0

Fj Б х Д2 п20 R9 12.5 9,3 90,5 ± 3,3 93,4 ± 2,6

00-244-п 2 (БТЛ-10) 14,0 6,5 93,5 ±3,3 96,3 ± 1,8

Агесо 631 an 3 R1 0,0 - 99,0 ± 0,2 -

Агесо 631 0,0 - 99,0 ± 0,2 -

Nike an 97 87,5 - 46,0 ±2,6 -

Nike 13,0 - 87,8 ± 1,9 -

Алексим, ст. 14.3 9,3 94,0 ± 2,2 90,6 ±3,4

А-29, сг 7.1 6.1 93,3 ± 1,5 94,4 ± 1,5

Спавный 82, ст 94,8 98.3 5,6 - 0,8 3,5 ± 0,4

Belinka, ст 84,8 81,3 14,2 ± 1,6 14,7 ± 1,3

2. Роль возбудителя фузариозного увядания Fusarium oxysporumyf ü'ni и его метаболитов на прорастание семян льна

В результате исследований было установлено, что используемые штаммы патогена (234, 209, 180) обладали хорошей адаптивной способностью к изменениям условий культивирования на искусственных питательных средах Интенсивность спороношения зависела от структуры штамма Наибольшее количество спор в 1 см5 производили штаммы сильновирулентные 180 и 234, имеющие обильную ватообразную структуру (1565,0 - 1935,0 тыс спор) Однако токсичность культурального фильтрата зависела не от плотности спороношения, а от вирулентности и агрессивности штамма Наибольшей токсичностью обладал культуральный фильтрат популяции трех штаммов возбудителя заболевания (234, 209, 180) При проращивании семян льна в чашках Петри в течение 3 суток на субстрате из фильтровальной бумаги и культурального фильтрата популяции вышеуказанных штаммов патогена у восприимчивого к фузариозному увяданию сорта Славный 82 количество пораженных проростков составляло 96,0-96,1%, тогда как в других вариантах величина этого показателя была в пределах 38,0 - 92,3% (табл. 7)

Таблица 7

Плотность спороношения и токсичность культурального фильтрата на различ-_ ных питательных средах, (сорт Славный 82)_

Штамм патогена Плотность спороношения штаммов на 30-е сутки, шт. Число пораженных проростков, %

на среде CBI на среде Чапека к.ф. на основе среды CBI к.ф. на основе среды Чапека

180 1935,0 1890,0 88,0 88,0

234 1565,0 1600,0 92,3 90,1

209 950,0 740,0 38,0 42,1

Популяция 885,0 900,0 96,1 96,0

Анализ действия фузариевой кислоты - метаболита штаммов гриба Fusarium oxysporum, возбудителя фузариозного увядания льна-долгунца, на корешки льна показал, что симптомы поражения соответствуют проявлению заболевания в полевых условиях. Рост корешка прекращался, его кончик бурел и загнивал, корневые волоски не образовывались. Такое действие фузариевая кислота оказывала при концентрации ее в растворе 50-100 мг/л.

Проращивание семян на растворе фузариевой кислоты в концентрации 100 мг/л позволяет проводить оценку по устойчивости к фузариозу. Загнивание и гибель корешков устойчивых форм наблюдается у 40-60% проросших семян и длина корешков составляла 0,83-1,29 см (22-31% к контролю). У восприимчивых генотипов 85-100% семян либо не прорастали, либо длина корешков была 0,31 - 0,51 см ( 10-14% к контролю).

Таким образом, культурадьный фильтрат возбудителя и фузариевая кислота оказывали токсичное действие на прорастание семян льна. Поэтому при клеточной селекции на устойчивость к фузариозному увяданию эти селективные агенты можно было использовать.

3. Создание форм льна-долгунца, устойчивых к фузариозному увяданию, на основе растений-регенерантов, полученных в культуре пыльников

3.1. Характеристика селективной системы

На начальном этапе были проведены исследования возможности использования культурального фильтрата популяции трех штаммов (234, 209, 180) возбудителя фузариозного увядания Fusarium oxysporum для проведения работ по клеточной селекции. При внесении в питательную среду 25 мл/л культурального фильтрата было отмечено, что каллусная ткань восприимчивых к фузариозному увяданию генотипов Г 1351, Славный 82 характеризовалась низким уровнем выживаемости. Гибель составляла 73,9,- 85,7%. Некоторые устойчивые каллусы сохраняли способность к пролиферации, однако последующее их субкультивирование на неселективной среде не позволяло индуцировать мор-

фогенетическуто активность В последующем в качестве селективного агента была использована фузариевая кислота Ее добавляли в питательную среду в концентрациях 0,1," 0,5; 1,0, 5,0, 7,5, 10, 12,5, 50; 100, 1000 мг/л Анализ результатов показал, что летальными для первичного каллуса восприимчивого к фузариозному увяданию сорта ВеЬпка являлись концентрации 50 мг/л и более высокие (рис. 3) При постепенном повышении концентрации токсина с 5 мг/л до 50 мг/л возрастала гибель каллусов, и снижался морфогенетический потенциал устойчивых каллусных клеток Перенос их на неселективную среду позволял формировать меристематические очаги и побеги с частотой 0,08 шт./1 каллус Установлено, что для отбора устойчивых каллусов у этого сорта оптимальным являлся диапазон концентраций фузариевой кислоты от 5 до 10 мг/л В этих условиях выживало до 50% каллусных линий Оценка на выживаемость и способность к морфогенезу на селективной среде контрастных по устойчивости к фузариозному увяданию сортов льна-долгунца А-29 и Славный 82 в вышеуказанном диапазоне, показала, что концентрация фузариевой кислоты 10 мг/л является наиболее приемлемой для проведения работ по клеточной селекции

Рис 3 Выживаемость каллус* льиа долгунца на срсяе с фумрисаой кислотоЯ

[вицаи.рациоииа* .ей««* для со« . В.I~>а

При сравнении каллусных культур, полученных от контрастных по устойчивости к фузариозному увяданию сортов, наблюдали сохранение геноти-пической реакции на токсин в вышеуказанной концентрации Сорт А-29 в таких селективных условиях характеризовался высокой выживаемостью (91,3%) и хорошей регенерационной способностью (табл 8) Аналогичные результаты получены на устойчивых линиях Л-26-8-33, Л 141-8-23 У восприимчивого сорта Славный 82 в процессе культивирования на селективной среде каллус при-

обретал твердую консистенцию, некротизировал на 85,7% и, в большинстве случаев, терял способность к регенерации. Близкие результаты получены у восприимчивого сорта ВеНпка и линий Л 957-8-4, Л 301-8-6. Таким образом, концентрация фузариевой кислоты 10 мг/л дополнительно позволяет проводить дифференциацию генотипов по устойчивости каллусных культур.

Поскольку проведение клеточной селекции возможно с нулевого этапа, т.е. с момента культивирования изолированных пыльников на селективной среде, нами была изучена эффективность внесения фузариевой кислоты в среду для культивирования пыльников.

Таблица 8

Влияние фузариевой кислоты на морфогенез льна (п = 25)_

Концентрация фузариевой кислоты, мг/л - Количество пыльников, сформировавших морфо-ген-ный каллус, % ± 25р Выживаемость, % Сформировано побегов, шт./1 каллус

А-29* Славный 82** А-29 Славный 82 А-29 Славный 82

0 100,0 ±0,0 100,0 ±0.0 100,0 100,0 6 8

2,5 100,0 ±0.0 98,0 ±1,1 100,0 98,0 6 6

5,0 100,0 ±0,0 40,0 ± 5.9 100,0 40,0 3 6

7,5 98,0 ±1,3 65,2 ± 5,3 98,0 66,2 5 3

10,0 91,3 ±2,4 14,3 ±2,1 91,3 14,3 2 1

12,5 40,0 ±6.3 0,0 40,0 0,0 0 0

Примечание: * - устойчивый к фузариозу сорт; ** - восприимчивый к фузариозу сорт

На первом этапе на селективной среде проводили культивирование изолированных пыльников генотипов льна, характеризующихся необходимым комплексом признаков и контрастных по устойчивости к фузариозу. Проведение селективного отбора на этапе формирования первичного каллуса на модифицированной среде 8Ь-2, содержащей фузариевую кислоту в диапазоне концентраций 0,1 — 1,0 мг/л, привело к существенному снижению морфогенного потенциала пыльников и каллусной ткани, сформированной на их основе. При внесении в среду фузариевой кислоты в концентрации 0,5 мг/л, каллусная ткань образовывалась у устойчивого к фузариозному увяданию сорта А-29 в количестве 4,0%, у восприимчивых - Славный 82, ВеНпка - 2,0-6,0% (табл. 9). При этом у сформированных каллусов визуально фиксировали меристематические очаги.

На втором этапе осуществлялось культивирование первичного каллуса, сформированного в селективных условиях, на среде с фузариевой кислотой в концентрации 10 мг/л. Жесткий отбор позволил выявить каллусные культуры зеленого цвета с ярко выраженной пролиферативной способностью и меристе-матическими очагами. Выживаемость каллусных линий в селективных условиях даже восприимчивых к фузариозному увяданию генотипов составляла 35,0 -50,0% (рис. 4).

Таблица 9

Влияние фузариевой кислоты на каллусогенез льна-долгунца в культуре пыль__ников (n = 100)_

Концентрация фуча-рневой кислоты, мг/t Сформировано морфогенных каллусов, % ± 2Sp '

А-29 1 Ставный 82 Belinka

0 1 2,0 ± 0,6 0,0 0,0

0,1 4,0-1,3 0,0 2,0 ±0,3

0,5 4,0 ± 1.0 2,0 ±1,3 2,0 ±1,1 1

1.0 1 0,0 6,0 ± 2,3 2,0 ± 0.9

5,0 | 0,0 1 0,0 0,0

Двукратное воздействие токсина в концентрации 10 мг/л на каллусные культуры приводило к тому, что уровень выживания каллусов превышал предыдущий вариант на 20,0-50,0% В то же время регенерационная способность всех исследуемых генотипов после 3-5 субкультивирований полностью утрачивалась

Рмс Морфогенез льна долгуниа на селектнкной среде при «тором субкулатманроааиии

■ Пецкнчный к*ааус сформирован-*« нас«нгктаа.»>ас»еа«сф:

■ ПеранчныА сааус сформнроаааиыЯ на масеаектнамаА среае

Использование вышеприведенной схемы клеточной селекции на устойчивость льна-долгунца к фузариозному увяданию позволило получить из восприимчивых к патогену сортов и линий 37 растений-регенерантов, устойчивых к фузариевой кислоте в условиях т vitro

Таким образом, применение методов культуры пыльников и клеточной селекции позволяет проводить отбор устойчивых к фузариозному увяданию растений-регенерантов льна-долгунца и оценивать генотипы на устойчивость к этому патогену в культуре in vitro

3.2. Оценка растений-регенерантов, полученных с использованием методов культуры пыльников и клеточной селекции на инфекционио-провокационном фоне

Из 37 регенерантов, полученных из восприимчивых к фузариозному увяданию генотипов льна-долгунца Славный 82, ВеНпка, Л 957-8-4, Л 301-8-6, Г 1351, 22 были устойчивыми и высокоустойчивыми к заболеванию.

Линия ПП-9, полученная из Г 1351, была на 78,6% - 99,0% устойчива к патогену (табл. 10), в то время как устойчивость исходного генотипа Г 1351 была на уровне 16,2% - 21,3%.

Таблица 10

Результаты оценки линий на инфекционно-провокационном фоне

Генотип Количество пораженных растений, %, X ср. Устойчивость, % ± 2 Бр

1999 г. 2000 г. 2001 г. 1999 г. 2000 г. 2001 г.

Г 1351 п9 (ПП-9) 25,0 0,0 12,0 78,6 ±2,9 99,0 ± 0,3 93,3 ± 1,6

Г 1351 84,6 81,0 86,0 16,2 ± 2,3 16,7 ± 1,1 21,3 ± 1,3

Славный 82 (ПС-7) - - 133 - - 87,7± 3,3

ВеНпка (ПБ-4) - - 5,4 - - 96,5± 2,5

Л 957-8-4 (ПЛ 95-5) - - 6,5 - - 78,7± 3,1

Л 301-8-6 (ПЛ 30-4) - - 3,3 - 77,7± 2,2

ст. Алексим 12,4 14,3 9,3 90,5 ± 3,5 94,0 ± 2,2 90,6 ±3,4

ст. А-29 10,1 7,1 6,1 91,0 ±2,8 93,3 ± 1,5 94,4 ± 1,5

ст. Славный 82 100,0 94,8 98,3 3,4 ± 1,1 5,6 ±0,8 3,5 ± 0,4

ст. ВеНпка 86,6 84,8 81,3 13,3 ±2,0 14,2 ± 1,6 14,7 ± 1,3

Также отмечалось, что полученные в результате отбора растения-регенеранты были не только устойчивы к фузариозному увяданию, но и харакТеризовались проявлением хозяйственно ценных признаков на уровне родительских форм и стандарта. Наиболее изученная нами в течение трех лет линия ■ПП-9, полученная на основе Г 1351 при испытаниях по типу селекционного питомника 2-го года по основным хозяйственно ценным признакам не уступала сорту-стандарту Алексим (табл. 11). Показатели «масса семян с 1 м2», «высота растений», «устойчивость к полеганию» были на 2,9 - 22,8% выше, чем у сорта-стандарта Алексим. Однако содержание волокна у этой линии было снижено на 10,5- 13,3%.

Оценка эффективности клеточной селекции льна-долгунца на устойчивость к фузариозному увяданию с использованием метода культуры пыльников показала, что создание селективного фона способствует выявлению генотипи-ческих изменений, возникающих в клетках льна-долгунца (табл. 12). Частота появления устойчивых к фузариевой кислоте растений-регенерантов составляла у восприимчивых генотипов от 0,0 до 7,3% в расчете на общее число культивируемых пыльников.

Таким образом, разработанная нами сечективная система с использованием фузариевой кислоты позволяет повысить эффективность селекции льна-долгунца на устойчивость к фузариозному увяданию и получать ценный исходный селекционный материал

Таблица 11

Характеристика линии чьна-долгунца (ПП-9) СП-2 г._

Название линий Масса с 1 ч*, г Содержание волокна,0/» Высота растений, см Длина ве-гетац периода, CVT Устойчивость к полеганию, балл

соломы | семян | волокна

1999 г

ПП-9 498 91,4 110,6 2 68 89 4,5

в % к ст. 90,9 122,8 78,8 86,7 102,9 + 1 112,5

Апексим, ст 548 74,4 140,3 , 25,6 70 88 4.0

2000 г

ПП-9 419 78,6 108.5 25,1 75 78 4,5

в % к ст 91,5 114,2 83.7 88,7 107,1 -9 112,5

Алексим, ст 458 68,8 129,6 28,3 70 87 4.0

2001 г

ПП-9 456 83,3 110,5 23,1 72 76 | 4.5

в % к ст. 92,7 106,1 74,4 | 89,5 101,4 -4 112,5

Алексим. ст 492 78.5 148,5 | 25,8 71 80 4,0

ВЫВОДЫ

1 Разработана и предложена система in vitro с использованием культуры пыльников, позволяющая проводить клеточную селекцию льна-долгунца на устойчивость к фузариевой кислоте и фузариозному увяданию

2 Для повышения морфогенетической активности изолированных пыльников с целью создания линий с комтексом хозяйственно ценных признаков предложено - выращивать донорные растения в условиях увеличенной до 25 см' площади питания, на высоком агрофоне,

- проводить декапитацию соцветий в фазу первого бутона,

- эксплантировать пыльники на стадии одноядерной вакуолизи-рованной микроспоры,

- культивировать их на питательной среде Sh-2, содержащей БА в концентрации 1,0 мг/л +- НУК - 0,05 мг/л и сахарозу - 30 г/л или комплекс сахароза 25,0 г/л + глюкоза 25,0 г/л

Это позволяет получать морфогенный калпус у 12,0 - 48,0% пыльников

3 Выявлены ус-ювия проведения оценки льна-долгунца на устойчивость к фузариозному увяданию, включающие

- проращивание семян на субстрате из филыровальной бумаги, увлажненной раствором фузариевой кислоты в концентрации 100 мг/л.

Таблица 12

Эффективность клеточной селекции льна-долгунца на устойчивость к фузариозному увяданию

Генотип Среда для культивирования пыльников Количество культивируемых пыльников, шт. Количество первичных каллусов, шт Сформировано после 3-х субку.тьгивкрований Частота появления устойчивых регенератов, %

морфо1«нных каллусов, % побегов, устойчивых к ф.к., шт. растений- реге-яер., устойч. к ф.у., шт.

А-29* обычная 150 23 91,3 - -

селективная 150 9 100,0 1 1 0,67

Славный 82** обычная 150 21 143 0 0 -

селективная 150 6 66,7 13 и 7,3

Beiinka** обычная 150 25 28,0 3 2 1,33

селективная 150 12 75,0 21 8 5,3

Л 26-8-33* обычная 100 50 96,0 . - -

селективная 100 50 100,0 1 0 0,0

Л 141-8-23* обычная 100 50 86,0 - 1 -

селективная 100 50 94,0 5 t 5 5,0

Л 957-8-4** обычная 100 50 0,0 0 0 0,0

селективная 100 50 36,0 2 2 2,0

Л 301-8-6** обычная 100' 50 0,0 0 0 0,0

селективная 100 50 40,0 2 0 0,0

Примечание: * - генотипы, устойчивые к фузариозному увяданию

** - генотипы, восприимчивые к фузариозному увяданию ф.к. - фузариевая кислота ф.у. - фузариозное увядание

- культивирование первичных каллусов на модифицированной селективной среде Sh-2, содержащей фузариевую кислоту в концентрации 10 мг/л

4 Разработана селективная система, позволяющая получать растения-регенеранты, устойчивые к фузариевой кислоте. Клепочную селекцию на устойчивость следует проводить путем ступенчатого отбора культивировать пыльники на модифицированной среде Sh-2, содержащей 0,5 мг/л фузариевой кислоты, а затем первичный и пересадочный морфогенный каллус - на среде Sh-2, содержащей 10 мг/т токсина

5 Впервые с использованием метода культуры изолированных пыльников из восприимчивых к фузариозному увяданию генотипов получены устойчивые растения-регенеранты льна-долгунца и линии, не уступающие исходным формам и сорту-стандарту Алексим по основным хозяйственно ценным признакам Наиболее изученные линии (БТЛ-10, ПП-9) используются в селекционном процессе в качестве исходного селекционного материала, и их семена переданы в Национальную коллекцию русского льна (ВНИИЛ, г Торжок)

Предложения для селекционной практики. В качестве исходного .материала при создании новых, устойчивых к фузариозному увяданию сортов, рекомендуется использовать формы льна-долгунца (БТЛ-10, ПП-9), созданные с использованием методов культуры пыльников и клеточной селекции

Для создания генетического разнообразия льна-долгунца рекомендуется использовать разработанный метод клеточной селекции на устойчивость к фузариозному увяданию

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Poliakov А V , Prohotova N V , Rutkowska-Krause I. Some aspects of flax anther culture (Lmum usitatissimum L ) Cytology and pretreatment - Natural Fibres -Wiykna Naturalne, 1995, V 39, p 21-28

2 Rutkowska-Krause I, Mankowska G , Poliakov A V , Prohotova N.V Plant regen-erational through anther culture of flax (Linum usitatissimum L ) - Proc. 3-rd meeting International Flax Breeding Res Group Saint-Valery-en-Caux, 1995, - p 83-90

3 Poliakov A V , Prohotova N V , Egorova E G, Rutkowska-Krause I The influence of some factors on rooting of flax shoots obtained m vitro culture - Natural Fibres, 1996, R XL, p 75-80

4 Поляков А В .Чикризова О Ф , Егорова Е Г , Пролетова Н В Влияние регуляторов роста на морфогенез и генетические изменения льна при культивировании изолированных тканей и органов in vitro В кн Регуляторы роста, развития и продуктивности растений Тез докл - М МСХА, 1997, с. 310-311

5. Poliakov А V , Prohotova N.V , Rutkowska-Krause I., Mankowska G., Tejklova E. Screening of genotypic pecuharties and the effect of donor plants growth conditions on callus production in anther culture of flax (Linum usitatissimum L ) - Natural Fibres, R XLI, 1997, p 5-11.

6. Поляков A.B., Пролетова H.B. Питательная среда для культивирования пыльников льна. - Патент на изобретение. № 2120741 от 27 октября 1998 г. - Москва. - 1998.

7. Пролетова Н.В., Поляков A.B., Лошакова Н.И., Чикризова О.Ф. Влияние фуза-риновой кислоты и культуральной жидкости штаммов возбудителя фузариоза (Fusarium oxysporum f.sp. lint) на длину первичных корешков проростков семян льна. — М-лы Международн. научн. конф. — Минск, 1999, с. 212-213

8. Пролетова Н.В. Влияние концентрации регуляторов роста, аминокислот и фу-зариновой кислоты в питательной среде при культивировании пыльников льна-долгунца. (Linum usitatissimum L..). - М-лы Международн. научно-практич. конф., поев. 70-летию ВНИИ льна. - Торжок, 2000, с. 46-48.

9. Поляков A.B., Пролетова Н.В. Культура пыльников jeax"способ создания высокопродуктивных геноисточников льна (Linum usitatissimum L.) методами биотехнологии. В кн.: Материалы научно-производств. конф. по льну (Вологда, 26 марта 2000 г.). Вологда, 2000, с. 354.

10. Поляков A.B.,Чикризова О.Ф., Пролетова Н.В. Создание конкурентоспособного селекционного материала льна (Linum usitatissimum L.) методами биотехнологии. В кн.: II Съезд ВОГИС (1 - 5 февраля 2000 г.). С.-П.: НИИХ СПб ГУ, 2000, т. 1, с. 197-198

11. Поляков A.B., Пролетова Н.В., Чикризова О.Ф., Лошакова Н.И. Культура пыльников как способ создания высокопродуктивных геноисточников льна (Linum usitatissimum L.). - Научно-практическая конференция «Лен - на пороге XXI века», Вологда, 2000, с. 157-159.

12. Поляков A.B.,Чикризова О.Ф., Егорова Е.Г., Пролетова Н.В. Применение методов биотехнологии для решения селекционно-генетических проблем льноводства. В кн.: Материалы научно-производств. конф. по льну. - Вологда, 2000, с. 353.

13. Пролетова Н.В., Поляков A.B. Реакция льна-долгунца (Linum usitatissimum L.) в культуре пыльников на концентрацию в питательной среде регуляторов роста и аминокислот. - В сб. материалов научно-практической конференция "Современные проблемы льноводства на Северо-Западе России". - Псков: РАСХН, 2000.- С. 32-33

14. Поляков A.B., Чикризова О.Ф., Пролетова Н.В. Размножение льна-долгунца in vitro,: В кн. Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии ( М-лы II Международной научной конференции).- МлВНИИСБ, 2000.- С. 169170.

15. Пролетова Н.В., Поляков A.B., Лошакова Н.И. К методике оценки льна-долгунца на устойчивость к фузариозному увяданию в условиях in vitro. - М-лы IV Международн. симпозиума. - М.: Пущино, 2001, т.Н, с.270-272.

16. Пролетова Н.В. Повышение устойчивости растений льна-долгунца к фузариозному увяданию методами клеточной селекции. - I Съезд микологов. М., 2002, с. 134.

Объем 1,25 п i

Зак 292

Тир 50экз

AHO «Издательство МСХА» 127550, Москва, ул Тимирязевская, 44