Кристаллизация мембранных белков методом in meso

Моисеева, Екатерина Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Кристаллизация мембранных белков методом in meso
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Кристаллизация мембранных белков методом in meso"

¡ 003493322

на правах рукописи

МОИСЕЕВА Екатерина Сергеевна

КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ МЕТОДОМ 1N MESO

03.01.03 Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

1 1 MAD ?íKfi

i л! t-i . L Ü 1 ¡.i

Москва-2010

003493322

Работа выполнена в Центре «Бионанофизики» Московского Физико-Технического Института (ГУ) в содружестве с Институтом Структурной Биологии Исследовательского центра г. Юлиха и Институтом Структурной Биологии г. Гренобля.

Научные руководители: кандидат физико-математических наук

В. И. Горделий

Официальные оппоненты: доктор химических наук

И. А. Василенко

кандидат физико-математических наук А. И. Куклин

Ведущая организация:

Институт физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского МГУ (г. Москва)

СС

Защита диссертации состоится 2010 г. в У/" часов на заседании

Диссертационного совета Д 002.235.01 при Учреждении Российской Академии Наук Института Молекулярной Биологии имени В. А. Энгельгардта по адресу 119991 г. Москва, В-334, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта РАН

Автореферат разослан _

2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук

А. М. Крицып

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Р - бактериородопсин

КМ - критическая концентрация мицеллообразования О - моноолеин

Г - п-октил-р-О-глюкопиранозид ТГ - л-октил-р-О-тиоглюкопиранозид М - пурпурные мембраны

G, 7G, 8G, 9G, 10G, 12G - и-алкил-Р-Л-глюкопиранозиды (гексил-, гептил-, октил-, нонил-, ецил-, додецил-)

YMAL — циклогексил-содержащие мальтопиранозиды

YMAL-5 - 5-циклогексил-1-пентил ß-D-мальтопиранозид

YMAL-7 - 7-циклогексил-1 -гептил ß-D-мальтопиранозид

HEGA - циклогексил-содержащие алканоил-А'-гидроксиэтилглюкоамиды

HEGA-9 - циклогексилпропаноил-Лг-гидроксиэтилглюкоамид

HEGA-10 - циклогексилбутаноил-Л'-гидроксиэтилглюкоамид

HEGA-11 - циклогексилпентаноил-ЛГ-гидроксиэтилглюкоамид

ХЕУ - алкиловые эфиры полиэтиленгликоля

вЕб - монооктиловый эфир гексаэтиленгликоля

10Е5 - монодециловый эфир пентаэтиленгликоля

шЕб - монодециловый эфир гексаэтиленгликоля

uEg — монододециловый эфир октаэтиленгликоля

SRF - Европейский Центр Спнхротронного Излучения

S-15 - п-пентадецилфосхолин PCR - рецепторы, сопряженные с G белком EGA - алканоил-М-гидроксиэтилглюкоамиды EGA-9 — нонаноил-ЛГ-гидроксиэтилглюкоамид EGA-10 - деканоил-Л'-гидроксиэтилглюкоамид EGA-11 - андеканоил-Л'-гидроксиэтилглюкоамид DAO - и-додецил-Л',Лг-диметиламид-Л''-оксид EGA - алканоил-ЛГ-метилглюкоамиды EGA-10 - деканоил-Л^-метилглюкоамид

г. - величина отношения максимума поглощения белка на длине волны 280 нм к ксимуму поглощения на длине волны 553 нм (А280/А553)

CSB - банк данных пространственных структур белков и нуклеиновых кислот

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Мембранные белки являются основными функциональным компонентами клеточных мембран и составляют примерно одну треть от общего числ белков, закодированных в геноме. Исследование мембран на молекулярном уровне имее огромное значение не только в расшифровке всех клеточных процессов, но и для понимани изменений, ведущих к аномальным трансформациям клеток, а также для создания лекарст Более того, 70% существующих в настоящее время лекарственных средств направлены н мембранные белки. Однако, хотя количество мембранных белков с известной структурой з последние годы возросло, оно не сравнимо пока с тем же показателем по водорастворимы белкам.

Согласно базе данных мембранных белков с известной структуро (http://blanco.biomol.uci.edu/Membrane Proteins xtal.html) и банку данных RCS (http://www.rcsb.org/pdb') на сегодняшний день лишь 218 из более 50000 зарегистрированны белковых структур высокого разрешения относятся к числу уникальных мембранных белко Данный факт объясняется, прежде всего, трудностью получения кристаллов белков этог класса вследствие их амфифильной природы и необходимостью использования детергенто на всех этапах работы, а также, как правило, их нестабильностью вне нативно мембранного окружения. Нестабильности можно избежать при возвращении белка обратно липидный бислой при кристаллизации методом в кубической фазе [1]. Новый подхо кристаллизации мембранных белков в липидной фазе (ш mesó) позволил преодоле сложности и получить структуры около восьми различных типов мембранных белков [2 Так, только с помощью метода in meso впервые после почти 30 лег неудачных попыток, пр которых использовались стандартные методы кристаллизации, удалось получить кристалл бактериородопсина (БР) кристаллографического качества. В настоящее время благода новому методу получены структуры основного и промежуточных состояний БР. Так впервые был закристаллизован комплекс двух мембранных белков и решена его структур Совсем недавнее достижение в структурной биологии - структура человеческих ß адренергического и А2Л-аденозинового GPCR (рецепторов, сопряженных с G белком Решенные структуры разных белков свидетельствуют о широком диапазоне применения высоком потенциале метода in meso. Повышение эффективности данного метода сдержива отсутствие систематических исследований механизма самой кристаллизации в системах meso. Несмотря на все перечисленные выше успехи этого метода, до сих пор остает неизвестной роль амфифильного окружения белка, а также механизм роста кристаллов липидной кубической фазе. Кристаллизация каждого следующего мембранного белка, к

равило, требует длительного и дорогостоящего перебора многочисленных параметров ристаллнзационной системы, что неминуемо приводит к повышению временных и шнансовых затрат. Развитие методов кристаллизации на базе мембранных систем для овышения эффективности производства высококачественных кристаллов мембранных елков для последующего структурного анализа является одной из самых приоритетных адач современной структурной биологии.

Цель и задачи исследования заключались в развитии метода кристаллизации /л meso, сновываясь на изучении механизма кристаллизации мембранных белков в липидной езофазе на примере модельного белка бактериородопсина. Получение высококачественных ристаллов БР для установления молекулярного механизма универсального и первого шага иоэнергетики векторного транспорта протона через мембрану клеток являлось омплементарной задачей работы.

Научная новизна. Разработан новый эффективный метод кристаллизации мембранных елков в липидной фазе непосредственно из мембран, содержащих белок, с добавлением етергента в кристаллизационную систему. Данный подход к кристаллизации позволяет бойти ряд принципиальных трудностей, в том числе неизбежные потери мембранных елков и снижение их качества, связанные с солюбилизацией и/или обменом детергента, и, ■ о не мало важно, позволяет существенно повысить эффективность работы.

Впервые проведены систематические исследования кристаллизации мембранного белка, режде всего, изучено влияние детергентов - влияние гидрофобных и гидрофильных аимодействий на кристаллизационный процесс в мезофазе. Эксперименты с рьированием концентраций детергентов, относящихся к различным семействам и меющих разное соотношение полярного и неполярного фрагментов, позволили выдвинуть едположение, что в успехе кристаллизации in meso значительную роль играет толщина шидного бислоя мезофазы, а не детали химического строения амфифильных молекул ипидов, детергентов). Данные исследования впервые показали возможность исталлизации мембранного белка в подавляющем большинстве типов детергентов, как в ротко-, так и в длинноцепочечных, и позволили определить количественные рактеристики, оптимальные для кристаллизации.

В процессе исследования механизма кристаллизации мембранных белков в липидной езофазе отработан в деталях метод кристаллизации БР из пурпурных мембран (ПМ) с бавлением различных типов детергентов. Данный метод позволил найти новые условия разования больших высококачественных кристаллов бактериородопсина, дифрагирующих

до 1,2 А, что дало возможность впервые установить ряд принципиальных элементе механизма транспорта протона.

Кроме того, в работе впервые был разработан метод повышения чистот солюбилизированного бактериородопсина с помощью замораживания белкового препарата последующего его ультрацентрифугирования. Данная процедура эффективно работает позволяет значительно улучшить качество белка и в случае других мембранных белко таких, как галородопсин, сенсорный родопсин II и его комплекс с трансдьюсером.

Практическая значимость работы. Полученные в работе результаты представляю собой огромный интерес для структурной биологии, в частности, для процедур очистки кристаллизации белков с целью последующего структурного анализа. Как показывае практика, результат кристаллизации и качество кристаллов зависят от чистоты исходног препарата белка. Разработанный новый метод дополнительной очистки ретинальных белко может быть использован для повышения качества и чистоты препарата как в случае други мембранных, так и в случае растворимых белков.

Результаты исследования механизма кристаллизации в липидной мезофазе разработанный новый подход к кристаллизации представляют интерес с точки зрени понимания механизма кристаллизации, что важно для дальнейшего развита экспериментальных методов кристаллизации мембранных белков. Приведенные в работ выводы и диаграммы кристаллизации БР в мезофазе с добавлением различных детергенте говорят о возможности получения кристаллов мембранных белков в любом детергент минуя стадию замены детергента на более подходящий для кристаллизации. Отраженные диаграммах оптимальные условия роста кристаллов БР (в частности, диапазон концентраци детергента) могут быть использованы в качестве отправной точки при поиске услови кристаллизации других белков. Разработанный метод кристаллизации уже позволи получить кристаллы бактериородопсина высокого качества дифракции, что в свою очере позволит улучшить структуру основного и промежуточных состояний БР и проясни молекулярный механизм первого и универсального шага биоэнергетики клетки.

Связь работы с научными программами. Работа выполнялась в соответствии с плано НИР по государственным контрактам № 02.740.11.0299 по теме: «Клеточная биология физические свойства мембранных белков», № 02.740.11.5010 по теме: «Определеш молекулярных механизмов первого шага трансформации энергии в клетке» и №П974 п теме: «Сверхчувствительные биосенсоры на основе наноматериалов».

Апробация работы. Основные положения работы и ее отдельные результат докладывались на международном симпозиуме "Retinal Proteins: Experiments And Theo

Бремен, Германия, 2007), 6-й национальной конференции по применению рентгеновского, инхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования материалов (Москва, оссия, 2007), 12-й международной конференции по кристаллизации биологических ткромолекул (Канкун, Мексика, 2008), 4-й международной конференции "Physics of Liquid after: Modern Problems" (Киев, Украина, 2008) и на научных семинарах в Институте труктурной Биологии Исследовательского центра г. Юлиха, Институте Структурной иологии г. Гренобля, в Центре Бионанофизики МФТИ (ГУ).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 4 глав, заключения

списка цитируемой литературы. Работа изложена на_страницах машинописного текста,

ключает_рисунков,_таблиц. Библиография содержит_наименований российских

зарубежных авторов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении рассмотрены актуальность и современное состояние исследуемой темы, ыделены основные проблемы и сформулированы цели данной работы, а также приведена труктура диссертации.

Первая глава посвящена обзору литературных данных. В обзоре рассмотрены основные ринципы и способы кристаллизации мембранных белков. Подробно описаны как лассический метод кристаллизации in surfo, так и способы кристаллизации белков из ативного мембранного окружения: в липидной кубической фазе, в губчатой £з-фазе, с спользованием бицелл и везикул. Особое внимание уделено наиболее успешному - методу ристаллизации в липидной кубической фазе - относительно новому и перспективному одходу в кристаллизации мембранных белков. Поскольку для рационального спользования это метода и оптимизации кристаллизационных условий необходимо знать еханизм кристаллизации белка в липидной системе, в литературном обзоре приведены спериментальные и теоретические исследования процесса кристаллизации белка в ипидной системе, показавшие, что рост кристаллов сопровождается локальным появлением амеллярной фазы. В данной главе подробно описано современное представление о потетическом механизме кристаллизации in meso и рассмотрена важная роль в металлизации сильно искривленной поверхности кубической фазы и вызванного ивизной гидрофобного несоответствия между толщиной липидного бислоя и неполярной ластью встроенного в него белка. Приведены данные по известным на сегодняшний день уктурам мембранных белков, закристаллизованных этим методом. Особое внимание

уделено детергентам, как основному инструменту при работе с мембранными белками, и влиянию на кристаллизационную систему при ш sur/o и in meso кристаллизации, литературный обзор также включено описание основных характеристик модельног мембранного белка, использованного в данной работе, бактериородопсина. Рассмотрен современное состояние вопроса о механизме функционирования БР, неопределенност которого оставляет этот белок в центре внимания многих исследований. Указано н противоречивость данных разных авторов о структуре этого белка в различных ег функциональных состояниях и необходимость выявления истинного механизма транспорт протона, что невозможно без кристаллов БР очень высокого дифракционного качества, получении которых состояла одна из задач диссертационной работы. В заключенш литературного обзора суммированы проблемы, возникающие на пути кристаллизацш мембранных белков, указывающие на необходимость развития методов кристаллизации дл дальнейшей более эффективной и рациональной работы, что явилось предмете исследования в данной работе.

Во второй главе приведены материалы и методы, использованные в работе. Подроби описаны шаги выделения и очистки белка, а также разработанная новая процедур улучшения качества солюбилизированного ретиналь-содержащего белка. Рассмотрены i surfo и in meso методы кристаллизации белка и дано их пошаговое описание. Подроби описан новый разработанный способ кристаллизации бактериородопсина непосредственн из пурпурных мембран с добавлением детергента в кристаллизационную систему. Здесь ж приведено описание кристаллографических измерений, обработки рентгеновских данных способа определения фактора двойникования кристаллов.

Третья глава. Целью данной работы явилось изучение механизма кристаллизаци мембранных белков в липидной мезофазе, исследование роли различных компоненте кристаллизационной системы, влияющих на успешный исход кристаллизации. Известно, чт одним из наиболее важных факторов для выращивания высококачественных кристалле является чистота белкового препарата. Повышая качество белка, и оптимизируя услови кристаллизации, можно значительно повысить качество дифракции, что имеет решающе значение для получения структур с высоким разрешением. Зачастую дополнительные мер по очистке требуют времени и дорогостоящих процедур, а в случае с мембранными белкам является более трудоемким процессом в связи с необходимостью использования при работ с этими белками детергентов. Разработанный новый метод улучшения чистоты белковое препарата позволяет обойти эти проблемы. Высокая чистота достигалась путем глубоког замораживания и последующего ультрацентрифугирования мембранного белка. Качеств

чистки определялось абсорбционной УФ/видимой спектроскопией из отношения А280/А553 р.г.) (рис. 1).

Уже после первого часа центрифугирования наблюдалось значительное улучшение истоты БР. Чистота белка первоначально низкого качества (Аг8о/А55з= 1,74-2,08) была начительно улучшена (А28о/А55з=1,64) после замораживания и центрифугирования в течение дного часа. Дополнительные два-три часа центрифугирования понижали величину оотношения А280/А553, но незначительно. Качество белка с первоначально промежуточным начением р.г. (А28о/А55з=1,67) значительно улучшалось (А28о/А55з=1,55) после первого часа (ентрифугирования на ультравысоких оборотах, дополнительные три часа ентрифугирования снизили величину А280/А553 только до 1,53.

ис. 1. А. Эволюция спектров поглощения еолюбилизированного БР в результате дополнительной очистки: БР о и после дополнительной очистки (штриховая и сплошная линии соответственно), осадок после льтрацентрифугирования (точечная линия). Б. Зависимость качества еолюбилизированного БР с различным ачальным соотношением А280/А55Э (р.г.) от продолжительности ультрацентрифугирования.

Разработанный метод активно используется для повышения качества олюбилизированного бактериородопсина, а также в случае таких рекомбинантных белков, ак галородопсин, сенсорный родопсин II и его комплекс с трансдьюсером. Результаты ходны с результатами очистки бактериородопсина. Огромное количество экспериментов с Р и другими ретиналь-содержащими белками показали высокую эффективность метода, [редложено следующее объяснение улучшения чистоты еолюбилизированного БР после оследовательного замораживания и ультрацентрифугирования. Процедура замораживания вредна» в первую очередь для белков, которые не достаточно стабильны (например, из-за тсутствия ретиналя), и может привести к частичной или полной деградации таких белков, оторые, как правило, агрегируют и выпадают в осадок при ультрацентрифугировании.

Были испробованы два разных способа замораживания белка: нормальный (в олодильнике при температуре - 80°С) и шоковый (в жидком азоте). Однако никаких щественных различий в результатах очистки не наблюдали. Следует также отметить, что

значение А280/А553 (результат очистки) не зависело от способа центрифугирования: непрерывно или с остановкой каждый час, а также не зависело от состава буфера.

Как показывает практика, результат кристаллизации БР in meso, а также качеств кристаллов зависят от чистоты исходного препарата белка. СолюбилизированньГ бактериородопсин не кристаллизуется вообще или кристаллизуется, но качество дифракци на таких кристаллах оставляется желать лучшего, если значение А280/А553 более 1,7. Обычн в результате стандартной процедуры солюбилизации БР и последующей очистки значени А280/А553 не лучше 1,65, таким образом, требуется дополнительная очистка белка дл получения кристаллов высокого качества. В данной работе предложен еще один мсто; улучшения качества кристаллов, открывающий новые возможности работы с мембранным! белками при их кристаллизации.

Разработан новый метод кристаллизаиии мембранных белков in meso непосредственн< ni лштдных мембран, минуя обычно необходимую стадию солюбилизации ч очистки базирующийся на развитой новой методике кристаллизации бактериородопсина в липидно! мезофазе непосредственно из пурпурных мембран. Данный метод позволяет избежат солюбилизации в случае БР и ресолюбилизации в случае других мембранных белков, а такж исключить зачастую необходимый этап обмена детергента непосредственно пере кристаллизацией и минимизировать неизбежные при этом потери и ухудшение качеств белка. Как правило, поиск оптимального солюбилизирующего и подходящего г кристаллизации агента требует перебора многих условий и типов детергентов, что приводи к росту временных и финансовых затрат.

Принципиальным отличием нового разработанного метода кристаллизаци бактериородопсина из пурпурных мембран в липидной кубической фазе от опубликованног ранее [3] является добавление детергента в кристаллизационную систему непосредственн на этапе кристаллизации. Кроме того, как известно, пурпурные мембраны, состоящие из 75° белка бактериородопсина и 25% липидов, выделяются из Halobacterium salinarum бе использования детергента. Непосредственно перед добавлением в различных соотношения к моноолеину (МО) пурпурные мембраны смешивались с кристаллизационным буферо1 содержащим различные концентрации п-октил-Р-О-глюкопиранозида (ОГ)- Кристаллизаци индуцировалась добавлением сухой смеси фосфатов калия и натрия. Результаты данно кристаллизации БР из ПМ, полученные через три месяца инкубации в темноте при 22° представлены на рис. 2 в виде диаграммы зависимости максимального размера кристаллов пробах от концентрации детергента и концентрации соли в пробе.

Представленные результаты, как и результаты эксперимента [3], свидетельствуют о том, ято бактериородопсин кристаллизуется из пурпурных мембран без предварительных ^олюбилизации и очистки. Однако добавление детергента в кристаллизационную систему принципиально - оно приводит к значительному увеличению размеров кристаллов (в ~10 раз) и существенному улучшению их дифракционного качества по сравнению с кристаллами, зыращенными без использования детергента. Так, кристаллы наибольших размеров 350-400 ¡йкм с качеством дифракции рентгеновского излучения до 1,26 А образовывались в течение |грех месяцев при 7-10% ОГ и при концентрации соли от 1,4 до 1,9 М. Как видно из Диаграммы, размер кристаллов существенно зависит от концентрации и-октил-(3-0-глюкопиранозида. При меньшей концентрации 3,5% ОГ вырастало много кристаллов размером 50-150 мкм. С увеличением концентрации детергента уменьшалось количество образующихся кристаллов, и увеличивался их размер. На диаграмме явно выделяется |>граниченная по концентрации я-октил-Р-£>-глюкопиранозида область кристаллизации, |олько внутри которой росли кристаллы бактериородопсина. В пробах с концентрацией меньшей ~1% и в пробах, приготовленных с концентрацией более 13% ОГ, кристаллов не иблюдалось вообще. Одна из гипотез возможного механизма кристаллизации

следующая: после добавления соли происходит трехмерная вследствие

диффузии мономеров БР вдоль

Рис. 2. Диаграмма кристаллизации БР из ПМ с добавлением

различных концентраций кристаллизация

с::: I зао и-октил-В-£>-

^за 350 т

8 10 12 14 16 18 20

С {ОГ}. %

^оо глюкопиранозида.

Цветом обозначен изогнутой мембраны,

размер кристаллов в

мкм- образовавшихся после

дезагрегации ПМ, индуцируемой МО [3]. Возможно, в случае ¡еньших ~1% и больших 13% концентраций детергента белку трудно встроиться в [ипидный бислой мезофазы. Такое отсутствие кристаллов можно объяснить несоответствием >ффективной толщины липидного бислоя МО с гидрофобной областью бактериородопсина. 1ри таких концентрациях толщина липидного бислоя изменяется настолько, что переход ■елка в бислой в этом случае невозможен. Вместе с тем, возможно также, что при больших онцентрациях детергента кубическая фаза исчезает и переходит в ламеллярную (исчезает юдходящая матрица для кристаллизации).

Детергент играет немаловажную роль в кристаллизации в липидной мезофазе. Сравнивая езультаты данной кристаллизации с ранними экспериментами зависимости кристаллизации олюбилизированного БР в кубической фазе от концентрации ОГ, можно отметить, что

размеры и качество образующихся кристаллов сопоставимы, однако наилучшие кристаллы в случае солюбилизированного БР образуются при более высоких концентрациях детергента и более низких концентрациях соли. Оба эксперимента выходят за рамки общепринятой парадигмы нежелательного присутствия высоких количеств солюбилизирующего агента. Бактериородопсин успешно кристаллизуется из ПМ именно при высоких концентрациях ОГ в пробе (п(ОГ)/п(МО)=0,1-0,24 моль/моль). По-видимому, кристаллизацию можно проводить в липидных фазах и необязательно работать именно с кубической фазой.

Новый метод позволил вырастить кристаллы БР значительных размеров и ультравысокого качества. На данный момент известна структура основного состояни бактериородопсина с разрешением 1,26 А. Выращенные таким способом кристаллы Б позволили улучшить разрешение структуры основного и промежуточных состояний БР i продвинуться в понимании механизма его функционирования.

С целью изучения поведения кристаллизационной системы в условиях успешно! кристаллизации БР (17 мг/мл, 10% ОГ, р.г. 1,60) было проварьированно объемно соотношение белковый раствор / липид МО от 1 до 70. В зависимости от этого соотношени первые кристаллы БР формировались в течение 2-3 недели и вплоть до 3 месяцев, a npi максимальных соотношениях - в течение года и больше. Также наблюдалась зависимост формы кристаллов от количества добавляемого к МО белкового раствора: при небольши значениях V(EP)/V(MO) в основном образовывались гексагональные пластинки, тогда ка при максимальных соотношениях появлялись кристаллы в виде розеток и иголок. Заметим что с ростом соотношения V(BP)/V(MO) в пробе увеличивается и соотношение п(ОГ)/п(МО и, таким образом, можно сказать, что белок при больших соотношениях кристаллизуется и раствора детергента с добавлением небольшого количества МО. Так, при кристаллизации Б из раствора детергента (стандартным методом диффузии паров) с добавлением молекул М в кристаллизационную систему были также получены кристаллы разнообразной формы, том числе пластинки (1,3 мм), иголки, розетки (280 мкм), кубики (20 мкм). Кристалль характеризовались плохим качеством дифракции рентгеновского излучения (~7 А), а некоторых случаях дифракция не наблюдалась вообще. Однако в результате этог исследования влияния молекул моноолеина на кристаллизационную систему не удалое выявить какой-либо зависимости образования тех или иных кристаллов БР от количеств добавляемого МО. Здесь же стоит упомянуть об эксперименте по кристаллизации Б1 (стандартным методом диффузии паров) из насыщенного раствора ОГ. Известно, что прт комнатной температуре и концентрациях в воде больше 50% (w/w) л-октил-(3-£> глюкопиранозида находится в ламеллярной La фазе, которая в свою очередь, ка

предполагается, играет существенную роль в процессе кристаллизации. В результате этого эксперимента также были получены кристаллы в форме пластинок и иголок (максимальным размером не более 70-150 мкм). К сожалению, эти кристаллы не обладали качеством дифракции, необходимым для получения структур высокого разрешения. Таким образом, все эти исследования еще раз опровергают общепринятую парадигму отрицательного влияния больших концентраций детергента на кристаллизацию мембранных белков, и говорят о том, что, по-видимому, именно образование липидной мезофазы МО является ключевым моментом в образовании высококачественных кристаллов БР. Данная гипотеза подтверждена успешными экспериментами, в которых кубическая фаза МО с БР была редварительно сформирована согласно протоколу ш meso кристаллизации, а затем помещена на мостики для дальнейшей кристаллизации стандартным методом диффузии паров.

Исследование влияния добавок на кристаллизацию БР в мезофазе МО. Одной из азновидностей мезофаз, которую может образовывать моноолеин, является губчатая Ly аза. В присутствии небольших водорастворимых добавок, таких как KSCN, бутандиол, ентаэритритол пропоксилат, t-бутанол, джеффамин М-600, 2-метил-2,4-пентандиол и юлиэтиленгликоль, наблюдается набухание кубической фазы и увеличение диаметра ее одного канала, а также рост параметра решетки кубической фазы [4]. На примере двух елков (BtuB и LH2) было продемонстрировано, что данная фаза пригодна для ристаллизации мембранных белков. Однако, как показала кристаллизация БР из ПМ в фазе О, образованной при добавлении небольших агентов в кристаллизационную систему, рактически во всех случаях наблюдалась полная или частичная деградация белка. В динственном случае добавления небольшого количества джеффамина (1,75-7%) в ристаллизационную пробу были получены гексагональные кристаллы БР. Данные езультаты говорят, что пока 1з-фаза, полученная с помощью малых добавок, не может ассматриваться как универсальный метод кристаллизации мембранных белков. По-идимому, небольшие амфифильные молекулы могут встраиваться в белок, нарушая его онформацию и приводя к его деградации.

Сравнительный аначиз куисталлизагши БР с использованием п-октил-fí-D-люкопиранозида и его аналога - п-октил-В-Р-тиоглюкотюанозида. п-Октил-p-D-люкопиранозид является одним из наиболее эффективных детергентов для работы с ембранными белками, существенным недостатком которого, кроме высокой цены, является го нестабильность. п-0ктил-(3-0-тиоглюкопиранозид (ОТГ) - относительно дешевый аналог Г, в котором атом кислорода заменен атомом серы, значительно стабильнее ОГ и обладает

сходными с ним свойствами. В силу этих причин была проведена кристаллизация бактериородорпсина в липидной фазе с добавлением аналога ОГ ОТГ. Из диаграмм на рис. 1 и рис. 3 видно, что хотя области образования кристаллов БР в ОГ и ОТГ совпадают и по концентрации детергента, и по концентрации преципитанта, размер кристаллов БР в ОГ в несколько раз превосходит размер кристаллов БР в ОТГ. Кристаллы бактериородопсина в п-\ октил-р-£)-тиоглюкопиранозиде не превышают 0,3 мм, тогда как в л-октил-р-й-глюкопиранозиде кристаллы БР могут достигать 0,6-0,7 мм. Другим существенным отличием является дополнительный пик на диаграмме для ОГ (6-7% ОГ, 1-1,2 М ЫаУК-Р1),| соответствующий большим размерам кристаллов БР. Данные условия предполагают медленный рост кристаллов, что способствует образованию высококачественных кристаллов

Таблица 1. Кристаллографические данные для кристаллов бактериородопсина, полученных в липидной фазе с добавлением я-октил-Р-О-глюкопиранозида и я-окгил-Р-£)-тиоглкжопиранозида.

7 8 9 10 С (ОТГ). %

Рис. 3. Диаграмма кристаллизации БР в липидной фазе с добавлением различных концентраций и-октил-р-£)-тиоглюкопиранозида. Цветом обозначен размер кристаллов в мкм.

ОГ ОТГ

Разрешение, А 1,35 1,45

Параметры 60,79; 60,79; 60,82;60,82;10

ячейки,А 110,14 9,77

(а, Ь, с, а, р, у) 90°;90°;120° 90°;90°;120°

Мозаичность,0 0,4 0,45

Количество

уникальных рефлексов Комплитность 50469 (5,1)33,7 100,0 40141 (3,3)27,0 98,7

В-фактор Вильсона, А2 15,2 15,9

Примечание. Длина волны синхротронного излучения -0,934 А.

Для лучших условий кристаллизации бактериородопсина в липидной мезофазе в ОГ и ОТГ (14 мг/мл БР, 7% ОГ или 7% ОТГ) был проведен скрининг по значению рЬ преципитанта. В обоих случаях кристаллы образовывались в одной и той же обласп| значений рН 5,2-5,7 и, как и при скрининге по концентрации детергентов, размер кристаллоЕ БР в ОГ в несколько раз превосходил размер кристаллов БР в ОТГ (рис. 4).

С лучшими кристаллами бактериородопсина, выращенными в и-октил-р-£>-глюкопиранозиде и и-октил-р-£>-тиоглюкопиранозиде, были проведены измерения нг синхротронном источнике ренгеновского излучения, кристаллографические данные которы; приведены в таблице 1. Кристаллы БР в ОГ обладали лучшим разрешением (до 1,35 А) пр! рентгеноструктурном анализе, чем кристаллы БР в ОТГ (до 1,48 А).

44 19 4,9 5.0 S2 5.4 5.3 52 5.3 5,4 55 5.6 5.7 4,2 44 4,3 4,3 5.0 52 5.4 53

PH INartt-PI) он |Na¡'K.r,ij pH{Naflí.Po

Рис. 4. Диаграммы для сравнительного анализа кристаллизации БР в липидной фазе с добавлением 7% н-октил-Р-£)-глюкопиранозида (А, Б - данные двух независимых экспериментов) и 7% и-октил-p-Z)-тиоглюкопиранозида (В) при различных значениях рН (Na/K-Pi). Цветом обозначен размер кристаллов в мкм.

Одной из интерпретаций такого отличия в качестве (размере) кристаллов бактериородопсина, закристаллизованного в ОГ, от кристаллов, полученных в ОТГ, может быть деградация п-октил-(3-0-глюкопиранозида в процессе кристаллизации. В результате разрушения глюкозидной связи образуются глюкоза и n-октанол. Известно, что различные спирты и сахара используются в качестве добавок при кристаллизации белков. В частности, 5% л-октанола, 100 мМ глюкозы, 20 мМ и-октил-р-£>-глюкопиранозида считаются добавками, которые способствуют кристаллизации белков. При условии полного разложения 10% ОГ в кристаллизационной пробе образуется 3,3% и-октанола и около 260 мМ глюкозы, данные значения сравнимы с приведенными выше цифрами, если учесть, что не весь ОГ деградирует. Также, возможно, что качество кристаллов БР в ОГ лучше именно в связи с постепенным высвобождением и увеличением концентрации продуктов деградации ОГ и уменьшением концентрации самого детергента в кристаллизационной пробе. Однако первые эксперименты по проверке справедливости этого предположения не дали однозначных результатов. Добавление небольших количеств глюкозы и n-октанола в кристаллизационную пробу, содержащую и-октил-р-£)-глюкопиранозид и/или и-октил-Р-£)-тиоглюкопиранозид, приводило к образованию и росту кристаллов БР, как небольших, так и крупных (до 0,3 мм). В данных опытах не было обнаружено явной зависимости размера и качества кристаллов бактериородопсина от количества добавляемых перечисленных выше молекул.

Исследование кристаллизации БР с добавлением детергентов из семейства глюкопиранозидов с различной длиной гидрофобных хвостов. С целью изучения механизма кристаллизации in meso, в частности, влияния гидрофобных и гидрофильных взаимодействий на кристаллизационный процесс была проведена серия кристаллизации в группе детергентов с разным соотношением полярного и неполярного фрагментов. Для первых экспериментов было выбрано семейство глюкопиранозидовых детергентов (семейство п-октил-р-.0-глюкопиранозида), насчитывающее шесть представителей,

отличающихся длиной гидрофобного хвоста (6-12 СНз-групп, обозначенные как бв, 70, 80, 90, 100 и 120). Как показывает анализ результатов кристаллизации бактериородопсина из пурпурных мембран с добавлением глюкопиранозидов, существует несколько зон роста кристаллов, характеризующихся ионной силой преципитанта и гидрофобной группой детергента (рис. 5). Для соединений 60, 70, 80 и 90 основной рост кристаллов бактериородопсина наблюдается в широком диапазоне концентраций осадителя при низких концентрациях детергента. В случае длинноцепочечных 100 и 12й детергентов замечается обратная зависимость: кристаллы образуются в широкой зоне варьирования концентрации детергента и относительно узкой зоне варьирования ионной силы. Как видно из диаграмм, кристаллизация БР во всех случаях идет в ограниченном диапазоне концентраций детергента, и оптимальные условия роста крупных кристаллов с увеличением длины гидрофобного хвоста смещаются в область больших концентраций ацилглюкопирнозида. Причем диапазон зоны кристаллизации по концентрации детергента расширяется, а по величине ионной силы соли сужается.

6С 7С 8С

2 4 О В 10 12 14 18 4 -з 6 7 8 О 10 8 10 12 14 16 18 20

С Ж! 44 Сд'_1. Ъ Слет, %

Рис. 5. Диаграммы кристаллизации БР с добавлением детергента из семейства глюкопиранозидов (60, 70. 80, 90, 10 О и 120). Для каждой диаграммы по вертикали и горизонтали отложены концентрации соли (М) и детергента (%) соответственно, цветом обозначен размер кристаллов в мкм.

Известно, что встраивание короткоцепочечных детергентов в мембрану приводит к разупорядочению углеводородных цепей липидов, вызывая, таким образом, уменьшение толщины гидрофобного ядра бислоя. Уменьшение эффективной толщины мембраны

моноолеина за счет добавления детергента с более короткой углеводородной цепочкой (с п числом углеродных атомов в хвосте) в первом приближении пропорционально концентрации добавляемого детергента Cdn: d^-d^ ~ Qet • (18 - л), где d0ь и dh - начальная и конечная толщина гидрофобной части монослоя соответственно. Для достижения одной и той же эффективной толщины мембраны, соответствующей наилучшим условиям кристаллизации БР, необходимо использовать меньшее количество короткоцепочечного детергента и большее количество детергента с длинным гидрофобным хвостом. С другой стороны добавление соли в кристаллизационную систему приводит к обратному эффекту по сравнению с воздействием детергента на толщину бислоя. Соль, дегидратируя полярные головы липидов, меняет площадь их поверхности в латеральном направлении, тем самым, утолщая бислой. Как видно из диаграмм, большие концентрации соли не столь эффективны при низких концентрациях детергента, а при больших концентрациях детергента малые концентрации преципитанта не работают. Это еще раз говорит в пользу высказанной гипотезы, что именно толщина бислоя липидной мезофазы, а не столько детали ее состава, прежде всего, определяют результат кристаллизации ш meso.

Данные этой кристаллизации ясно показывают саму возможность кристаллизации мембранных белков в липидной мезофазе, как в короткоцепочечных, так и в длинноцепочечных детергентах. При этом длина углеводородной цепи детергента не столь важна. По-видимому, оптимум кристаллизации определяется количеством детергента в кристаллизационной пробе, которое совместно с преципитантом задает эффективную толщину липидного бислоя.

Исследование кристаллизатш БР с добавлением детергентов из других семейств. В целом свойства липидной мембраны определяются как длиной углеводородного хвоста добавляемого детергента, так и структурой его полярной головы. Поэтому аналогичные эксперименты по исследованию влияния толщины липидного бислоя на образование и рост кристаллов in meso были проведены с детергентами из семейств с разнообразными полярными и неполярными группами. Для работы были выбраны серии детергентов, наиболее часто использующиеся при кристаллизации мембранных белков классическим методом: тиоглюкопиранозиды, фосхолины, мальтопиранозиды, ряды CYMAL, MEGA, HEGA, CHEGA, LDAO, СХЕУ (рис. 6). Для кристаллизации бактериородопсина ш meso с добавлением детергентов из этих семейств концентрации детергентов определялись из оценки конечной эффективной толщины бислоя МО, соответствующей оптимуму кристаллизации БР в случаи л-октил-р-О-глюкопиранозида (т. е. диапазону от 3,5 до 10% ОГ в пробе, рис. 2).

В результате объемные систематические исследования показали, что бактериородопсин кристаллизуется в подавляющем большинстве детергентов таких семейств, как тиоглюкопиранозиды, фосхолины, мальтопиранозиды, CYMAL, MEGA, HEGA, CHEGA. Тиоглюкопиранозиды. Кристаллы БР образовывались во всех детергентах из ряда тиоглюкопиранозидов. Максимальный размер кристаллов достигал 200 мкм. Как и в результатах эксперимента с детергентами из ряда глюкопиранозидов, с увеличением гидрофобности тиоглюкопиранозида наблюдалось расширение зоны кристаллизации из области высоких в область низких концентраций соли.

А. Глюкопиранозиды

НО--.

„□-,-4-4

но—, он

Г. Мальтопиранозиды

Б. Тиоглюкопиранозиды В. Фосхолины

Д. CYMAL

о-Ал

ноЛ---т—Л

он!

1 \

Е. MEGA

Ж. HEGA

3. CHEGA

„ ^ V

hJVk

ОЛ

\д

«R

Рис. 6. Семейства детергентов, использовавшиеся для кристаллизации БР в липидной мезофазе:

A. Глюкопиранозиды (п=1,2, 3,4,5,7);

Б. Тиоглюкопиранозиды (п= 2,3,4);

B. Фосхолины (п=1,2,3,4, 5,6,7, 8,9); Г. Мальтопиранозиды (п=1,2,3,4, 5,6,7, 8,9, И), Д. CYMAL (п=1,2,3,4,5,7);

Е. MEGA (п=1, 2, 3); Ж. HEGA (п=1, 2, 3,4); 3. CHEGA (п=1,2,3,4).

Мальтопиранозиды. В ряду мальтопиранозидов наилучшие результаты по кристаллизации бактериородопсина были получены с добавлением одного из наиболее популярных при работе с мембранными белками представителей этого семейства - п-додецил-Р-О-мальтопиранозидом. При этом кристаллы БР росли во всем использованном диапазоне концентраций детергента (10,2-29,1%), а кристаллы максимального размера предпочтительно формировались при средних значениях концентраций преципитанта.

Семейство детергентов СУМАЬ было специально разработано фирмой Апайже для эффективной работы с мембранными белками. При общей короткой длине гидрофобного хвоста гидрофобность этих детергентов увеличена за счет химически пришитого циклогексила на его конце, что, как считается, полезно для стабилизации белков в процессе кристаллизации. Для этой серии детергентов также наблюдалось смещение зоны кристаллизации в область высоких концентраций СУМАЬ с увеличением гидрофобности детергента. Однако в отличие от ряда глюкопиранозидов область оптимальной кристаллизации по концентрации соли была размыта. Для первых пяти членов этой серии БР

кристаллизовался во всем диапазоне концентраций Na/K.-P¡, и только в случае CYMAL-7 оптимум кристаллизации смещался в область низких концентраций преципитанта. Наилучшие результаты в серии этих детергентов были получены с кристаллами БР, выращенными в CYMAL-5. Кристаллы бактериородопсина при кристаллизации в CYMAL-5 растут в основном двойниковые и имеют характерную только для этих детергентов форму в виде двух сросшихся у меньшего основания усеченных пирамид (с сечением гексагональной формы). Кристаллы появляются уже на вторые сутки после добавления преципитанта, вырастают размером до 1 мм в диаметре и дают отличную дифракцию (1,3-1,4 А), а дефект двойникования в этом случае часто можно преодолеть механически.

Семейство MEGA. В серии неполярных детергентов MEGA кристаллы БР были получены во всех детергентах. Наиболее удачная кристаллизация БР в MEGA-10 наблюдалась при нагревании проб до 35°С в процессе смешивания всех компонентов системы (МО, ПМ, MEGA-10). Предполагается, что в этом случае температура способствует лучшей гомогенизации образуемой мезофазы и увеличению размера ее доменов, что приводит к росту больших кристаллов. Также влияние температурного эффекта наблюдалось при кристаллизации бактериородопсина с добавлением детергента из семейства HEGA. В этом случае кристаллы БР высокого качества были получены после замораживания (-20°С) кристаллизационных проб на этапе смешивания всех компонентов системы (МО, ПМ, HEGA-9) и нагревания до комнатной температуры перед последующим добавлением соли. По-видимому, в процессе такого замораживания-оттаивания также происходит улучшение качества фазы, которая, возможно, становится более монокристаллической.

Семейства HEGA и CHEGA. В серии кристаллизаций с использованием детергентов из семейства HEGA и циклического ряда его аналогов CHEGA наблюдалось существование постоянного оптимума кристаллизации БР для детергентов с разной длиной хвоста при определенном значении соли и в одинаковом диапазоне концентрации детергента (рис. 7). Положение этого оптимума кристаллизации, независящее от длины гидрофобного хвоста детергента, для циклического ряда CHEGA было сдвинуто по отношению к нециклическому ряду HEGA. Также в отличие от всех предыдущих серий детергентов в случае гомологов CHEGA было ярко выражено расщепление области кристаллизации по концентрации детергента, при этом средняя концентрация CHEGA работала во всех детергентах. Рост кристаллов при одних и тех же условиях в любом детергенте такого типа, но с различной длиной углеводородной цепи говорит о том, что кристаллизация не зависит от гидрофобное™ детергента (от длины его гидрофобного хвоста), а, по-видимому, в первую

очередь определяется полярной головой детергента. Отличное от других влияние этих детергентов на кристаллизацию БР in meso заслуживает отдельного исследования.

В данной работе наряду с неионными протестированы цвиттерионные детергенты. Семейство фосхолинов насчитывает 9 членов с полярной головой в виде фосфохолина, отличающихся линейным гидрофобным хвостом длиной от 8 до 16 СНг-групп. Внутри серии этих детергентов для оптимума кристаллизации наблюдался плавный рост концентрации детергента с увеличением длины гидрофобного хвоста. Для наиболее полярных членов ряда фосхолинов БР кристаллизовался во всем диапазоне концентраций соли, и только при переходе к F0S-15 область кристаллизации смещалась к более низким значениям преципитанта. При использовании других цвиттерионных детергентов из семейства LDAO в большинстве случаев наблюдалась деградация бактериородопсина уже на этапе смешивания пурпурных мембран с детергентом, которая регистрировалась по изменению цвета белка и выпадению осадка.

HEGA-9 HEGA-Í0 HEGAU

CHEGA-9 CHEGA-10 CHEGA-П

Сде(. % Сдет. % Сдет. %

Рис. 7. Диаграммы кристаллизации БР с добавлением детергента из семейств НЕСА и СНЕСА. Для каждой диаграммы по вертикали и горизонтали отложены концентрации соли (М) и детергента (%) соответственно, цветом обозначен размер кристаллов в мкм.

Семейство алкиловых эсЬиров полиэтиленгликоля СуЕу. В экспериментах по кристаллизации бактериородопсина в липидной мезофазе МО в присутствии четырех детергентов ряда СУЕХ: СвЕб, С10Е5, СюЕб, СпЕа, не удалось получить кристаллы БР. При

просмотре проб липидная фаза выглядела сухой с вкраплениями денатурированного (изменившего цвет или поблекшего) белка. В единственном случае больших концентраций СвЕб (больше 4,7%) образовывались мелкие кристаллы БР, но из-за небольшого их размера невозможно было определить форму кристалла.

В ходе данного систематического исследования отбирались наилучшие кристаллы, которые впоследствии использовались в кристаллографических измерениях на установке Ю14-1 (ЕБИР, Гренобль). Основные кристаллографические характеристики рентгеноструктурных данных для кристаллов БР, полученных новым методом при кристаллизации из пурпурных мембран с добавлением различных детергентов приведены в таблице 2. Дифракционное разрешение лучших кристаллов БР в подавляющем большинстве случаев было лучше 2 А.

Таблица 2. Основные кристаллографические характеристики кристаллов бактсриородопсина, полученных добавлением при кристаллизации различных детергентов. (Данные собраны на установке Ю14-1, ЕБЯР,

Гренобль.)

Детергент Разрешение, А Доля Лйойникования, 1/0(1) Ясим, % Мозанчность, Ком IUIH тн ость, % Кол-во рефексов Кол-во уникальных рефлексов 13-фактор Вильсона, AJ

ОГ 1,3.1 0 2,0(17,5 > 36,8(5,3) 0,38-0,48 97,9(99,6) 312859 52769 15,1

MEGA-10 1,55 36,7 1,^(9,5) 40,1(4,6) 0,35-0,59 100(100) 248126 33341 17.0

1.57 31,5 2.0(11,1) 39,6(4.9) 0.36-0.52 100(99,9) 245104 32200 17,4

HliGA-9 1,74 45,0 2,8(11,7) 27,6(4.5) 0.50-0.78 99,8(99,7) 130553 23636 20,7

1,83 38,7 2,4(12,9} 31.6(4,7) 0,6|-<),72 99(99,6) 169110 20250 21,6

CYMAL-5 1,43 22,1 2,1(9,1) 37,5(5.5) 0,2541,58 99,9(1 (И)) 331685 42494 16,7

1,45 2,0 2,0(6,«) 36,9(5,9) <1,44-0,48 100(100) 321446 40905 17,5

1.47 21,2 2,0(8,5) 39.1(6,1) 0,53-0,64 100(100) 289056 39339 17,3

1,48 36,9 2,3(7,8) 34,2(6,7) 0.59-0.74 96,7(99,3) 278773 38343 17.2

1,58 1,0 1.9(7,9) 39,5(5,8) 0,33-0,41 100(100) 259958 316Ц 18,1

»,5)4 12,4 1.9(8,3) 39,7(6,») 0,42-0,54 100(100) 297140 М66Й 19,2

1,63 40,1 2,0(11.0) 39,7(5,3) 0,47-0.57 100(1 <Ю) 248160 28900 18,3

1,67 1,0 2.1(9,4) 36,7(6,0) 0.49-0.61 99,9(99,9) 229569 26714 19,9

1,68 24,3 2,1(9,6) 37,5(6,0) 0,37-0,71 99,7(99,9) 220931 26395 18,4

1,70 33,2 2,0(9,5) 37,7(6,2) 0,50-0,60 100(100) 210847 25460 18,0

1,77 4,4 2,0(8,1) 38,2(6,6) 0,83-0,63 99,9(100) 175244 22590 19,9

FOS-8 1.72 5,6 2,6(9,9) 28,7(5,2) 0,33-0.38 100(99,8) 145940 16864 16,4

1,94 1.7 1,9(9,8) 37,8(7,0) 0,81-0,68 99,9(99,9) 85593 17069 16,6

1,95 47.0 2,3(8,3) 33,6(8,3) 0,45-0,53 100(100) 99069 16914 14,4

Четвертая глава посвящена результатам, касающимся особенностей кристаллизации бактериородопсина in meso. В процессе систематического исследования механизма кристаллизации в липидной мезофазе с помощью нового метода кристаллизации удалось получить высокоупорядоченные кристаллы бактериородопсина. К настоящему моменту получены данные и построены достоверные структуры основного состояния с разрешением 1,26 А, а также К, L и М переходных состояний с разрешением порядка 1,4 А. Полученная информация позволила выяснить неизвестные до этого детали структуры основного и его промежуточных состояний и воссоздать механизм создания электрохимического потенциала на мембране.

В процессе исследования влияния детергента на кристаллизационную систему удалось выяснить некоторые новые факты, относящиеся к образованию и росту кристаллов бактериородопсина в мезофазе. До сих пор ни методом кристаллографического анализа, ни масс-спектрометрией кристаллов не было установлено участие молекул детергента в образовании кристалла бактериородопсина при кристаллизации в липидной фазе моноолеина. Сравнительный анализ кристаллографических данных кристаллов БР, полученных с использованием различных детергентов, показал, что электронные плотности липидного окружения белка для всех кристаллов мало отличаются. По-видимому, детергент не входит в состав кристалла. Косвенно это подтверждает и тот факт, что форма кристаллов БР не менялась с использованием того или иного типа детергента (с различным сочетанием полярного и неполярного фрагментов). Во всех детергентах образующиеся кристаллы имели вид гексагональных пластинок или усеченных пирамид с гексагональным основанием, и имели одинаковую симметрию Р63. Полученные из рентгеноструктурных данных карты элекфонных плотностей показывают, что плотность между двумя тримерами бактериородопсина для всех использованных данных, может быть интерпретирована как молекула моноолеина, которая стабилизирует гексагональную упаковку белковых триммеров. В ходе анализа этих структурных данных было обнаружено, что в кристалле матричный липид МО не только связывает тримеры БР между собой, но и является стабилизирующим компонентом самих тримеров. Во всех полученных структурах кристаллов молекула МО встраивается между двумя соседними белками, связывая их водородными связями в одном тримере (рис. 8).

Рис. 8. Положение в кристалле молекул моноолеина, стабилизирующих бактериородопсин в тримере и

тримеры между собой.

Таким образом, молекулы моноолеина входят в состав кристалла бактериородопсина, и важны как для стабилизации тримера, так и гексагональной упаковки кристалла. Молекулы

же детергента, по-видимому, не входят в состав белкового кристалла и оказывают значительное влияние на кристаллизацию, воздействуя на липидную мезофазу.

Разработанный новый метод кристаллизации в мезофазе позволил найти условия образования кристаллов бактериородопсина больших размеров, обладающих высоким качеством дифракции. Известно, что кристаллы БР, полученные в мезофазе обладают двойникованием. Это влечет за собой существенную потерю информативности рентгеноструктурных данных. На сегодняшний день все данные решенных структур БР в ЯСБВ с разрешением лучше 1,9 А получены на кристаллах с идеальным двойникованием, т. е. с а близким к 50%. Исключениями являются структуры основного состояния бактериородопсина с разрешением 1,55 и 1,9 А, полученные на кристалле с 24% двойникованием [5] и на недвойниковом кристалле БР [6], соответственно. Как упоминалось выше, на данный момент существуют противоречивые данные о деталях механизма функционирования БР, что в первую очередь является следствием использования двойниковых кристаллов. Кристаллам бактериородопсина с пространственной группой Рбэ свойственно мероэдрическое двойникование, при котором кристалл состоит из доменов с двумя различными ориентациями, такими, что рефлексы Ш доменов с одной ориентацией накладываются на кЬ-1 доменов с другой.

В ходе исследования влияния добавления детергента на процесс кристаллизации были отобраны более 300 наилучших кристаллов БР с целью определения качества их дифракции и доли двойникования. Было замечено, что все кристаллы, сформировавшиеся до своего окончательного размера менее чем за 1,5 месяца, обладали двойниковой долей выше 20%. При этом кристаллы, достигшие своего окончательного размера за более длительный срок (до 6 месяцев), в большинстве своем оказывались мало- или, более того, недвойниковыми. Независимо от условий кристаллизации кристаллы с низкой долей двойникования (< 20%) появлялись в пробе через 2-3 недели и росли довольно медленно (в течение не менее 10 недель). На рис. 9 в виде диаграммы представлено распределение доли двойникования для кристаллов двух классов: сформировавшихся быстрее, чем за 1,5 месяца (83 кристалла) и росших более чем 1,5 месяца (227 кристаллов).

Видно, что медленный рост кристаллов второй группы сопровождался образованием до 11 % недвойниковых кристаллов. В первой же группе таких кристаллов без двойникования не наблюдалось вообще, и лишь небольшая часть кристаллов (~ 5%) обладала двойниковой долей в диапазоне от 10% до 20%. Эти наблюдения подтверждают, что чем медленнее рост кристалла, тем выше вероятность формирования его без дефекта двойникования [7].

£40 СО

о 35

с;

с; зо со

о 25 О. 20

2 15 Ш

0 10 ф

1 6

§ О

р ф ф

10 15 20 25 30 35 40 45 50

Доля двойникования (%)

Рис. 10.

Кристаллы БР (-200 мкм х 60 мкм), выращенные с добавлением СУМАЬ-5.

Рис. 9. Распределение доли двойникования среди двух групп кристаллов с характерными временами роста: менее 1,5 месяца (пустые колонки) и более 3 месяцев (заштрихованные колонки).

Говоря об эффекте двойникования, нельзя не остановиться еще раз на особой форме кристаллов, выращенных в присутствии детергента СУМАЬ-5. Эта форма в виде двух усеченных гексагональных пирамид, соединенных у их меньшего основания, позволяет на основании аккуратного просмотра проб под стереомикроскопом оценить долю двойникования кристалла (рис. 10). Относительный объем двух «склеенных» областей значительно варьирует внутри одной кристаллизационной пробы.

Было установлено, что доля двойникования этих кристаллов, определенная с помощью анализа статистики дифракционной интенсивности, соответствует оценочному соотношению объемов двух наблюдаемых областей при осмотре кристалла. Так при относительно равных пирамидальных фрагментах в кристалле наблюдался эффект идеального двойникования (а ~ 50%). При этом иногда удавалось разделить такой кристалл, и доля двойникования каждого из фрагментов была равна нулю. Для кристаллов же с разными объемами доменов доля двойникования соответствовала соотношению их объемов. Эти данные подтверждают представления о морфологии двойниковых кристаллов БР: двойниковый кристалл состоит лишь из нескольких крупных смежных областей (двойниковых доменов).

Таким образом, кристаллы, выращенные в присутствии СУМАЬ-5, позволяют сократить время на поиски кристаллов с низкой долей двойникования с помощью визуального исследования их формы без необходимости предварительного кристаллографического

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ РАБОТЫ

1. Разработан принципиально новый эффективный метод кристаллизации мембранных белков непосредственно из природных или искусственных мембран без использования стадии полной очистки белков. Найдены условия, которые позволяют повысить вероятность получения белковых кристаллов.

2. Впервые продемонстрирована возможность кристаллизации мембранного белка в присутствии значительного количества детергента (до 50% от массы липида), что опровергает общепринятое мнение об ингибировании кристаллизации мембранных белков при больших, чем ККМ концентрациях солюбилизирующего агента.

3. Предложенный подход к кристаллизации мембранных белков позволил улучшить статистическую информацию о зависимости фактора двойникования от скорости роста кристаллов: замедление роста приводит к существенному увеличению количества кристаллов с низкой и нулевой долей двойникования.

4. Новым методом кристаллизации в различных детергентах получены уникальные по качеству кристаллы бактериородопсина из ПМ (большого размера, с разрешением до 1,2 А и низким или нулевым двойникованием). Рентгеноструктурный анализ этих кристаллов позволил уточнить структуры основного и промежуточных (К, L и М) состояний БР, дающие принципиально новую информацию о механизме транспорта протона.

5. В результате систематических исследований влияния различных детергентов на кристаллизацию БР ш meso показано, что оптимум кристаллизации определяется не столько специфическими свойствами молекул детергента, сколько их влиянием на липидный бислой. Установлено, что ключевым параметром в кристаллизации т meso является толщина гидрофобной области липидного бислоя мезофазы.

6. Показано, что на образование высококачественных кристаллов оказывают влияние молекулы моноолеина, которые не только обладают характерными химическими свойствами, но и являются самоорганизующимися частицами, создающими необходимые условия для эффективной кристаллизации в виде бислойной мезофазы.

7. Предложен новый метод очистки мембранных белков с помощью глубокой заморозки и последующего ультрацентрифугирования. Метод позволяет значительно улучшить качество белка бактериородопсина с р. г. (AWA553) = 1,7 до 1,5, галородопсина - с 2,53 до 1,56, сенсорного родопсина II - с 1,5-1,6 до 1,16 и его комплекса с трансдьюсером - до 1,28.

Список публикаций

1. Borshchevskiy V., Efremov R., Moiseeva E., Biildt G., Gordeliy V. (2010) Overcoming Merohedral Twinning in Crystals of Bacteriorhodopsin Grown in Lipidic Cubic Phase. Acta Crystallographica Section D, 66, 26-32.

2. Gordeliy V.I., Moiseeva E.S. (2009) In meso Approaches to Membrane Protein Crystallization. In: "Molecules: Aggregation, Nucleation, Crystallization: Beyond Medical and Other Implications". World Scientific Publishing Co, Singapor, New Jersey, London, 259-281.

3. Моисеева E.C., Решетняк А.Б., Борщевский В.И., Баекен К., Бюлдт Г., Горделий В.И. (2009) Сравнительный анализ качества кристаллов мембранного белка бактериородопсина при кристаллизации в октилглюкозиде и октилтиоглюкозиде. Поверхность. Рентгеновские, синхротронные и нейтронные исследования, 1, 34-37.

4. Gordeliy V.I., Moiseeva E.S. (2008) Crystallization of membrane proteins. In Soft matter: From Synthetic to Biological Materials 2008, ed.: Dhont JKG, Gompper G, Nagele G, Richter D, Winkler RG, 1'Z-Juelich.

5. Решетняк А.Б., Борщевский В.И., Кларе И., Моисеева Е.С., Энгельгардт М., Бюлдт Г., Горделий В.И. (2008) Сравнительный анализ структур мембранного белка сенсорного родопсина II в комплексе с трансдюсером и без него. Поверхность. Рентгеновские, синхротронные и нейтронные исследования, 12, 78-84.

Цитируемая литература:

1. Landau Е.М., Rosenbusch J.P. (1996) Lipidic cubic phases: a novel concept for the crystallization of membrane proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 93, 14532-14535.

2. Caffrey M. (2009) Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination: Use of Lipidic Mesophases. Annual Review of Biophysics, 38,29-51.

3. Nollert P., Royant A., Pebay-Peyroula E., Landau E.M. (1999) Detergent-free membrane protein crystallization. Febs Letters, 457, 205-208.

4. Cherezov V., Clogston J., Papiz M.Z., Caffrey M. (2006) Room to move: crystallizing membrane proteins in swollen lipidic mesophases. J. Mol. Biol., 357, 1605-1618.

5. Luecke H., Schobert В., Richter H.T., Cartailler J.P., Lanyi J.K. (1999) Structure of bacteriorhodopsin at 1.55 angstrom resolution. Journal of Molecular Biology, 291, 899-911.

6. Belrhali H., Nollert P., Royant A., Menzel C., Rosenbusch J.P., Landau E.M., Pebay-Peyroula E. (1999) Protein, lipid and water organization in bacteriorhodopsin crystals: a molecular view of the purple membrana at 1.9 angstrom resolution. Structure, 7, 909-917.

7. Borshchevskiy V., Efremov R., Moiseeva E., Biildt G., Gordeliy V. (2010) Overcoming Merohedral Twinning in Crystals of Bacteriorhodopsin Grown in Lipidic Cubic Phase. Acta Crystallographica Section D, 66,26-32.

Моисеева Екатерина Сергеевна Кристаллизация мембранных белков методом in meso

Подписано в печати 11.02.10. Формат 60x84 '/и. Печать офсетная. Усл.печл. 1,0. Уч.-издл. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ № 249 Отпечатано в филиале ГУП МО "КТ" "Рамеиская типография"

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московский физико-технический институт (государственный университет) Отдел автоматизированных издательских систем "ФИЗТЕХ-ПОЛИГРАФ" 141700, Моск.обл., г.Долгопрудный, Институтский «ер.,9

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Моисеева, Екатерина Сергеевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Классический метод кристаллизации мембранных белков.

1.2 Кристаллизация in meso и фазовая диаграмма моноолеина.

1.3 Гипотетический молекулярный механизм кристаллизации мембранных белков в кубической фазе.

1.4 Теоретическое представление о кристаллизации in meso.

1.5 Классификация и свойства детергентов.

1.6 Влияние детергентов на липидную мембрану.

1.7 Влияние детергентов на фазовое поведение системы моноолеин/вода.

1.8 Структура и кристаллы, выращенные при кристаллизации in meso.

1.9 Zs-фаза.

1.10 Кристаллизация из бицелл.

1.11 Кристаллизация из везикул.

1.12 Бактериородопсин.

1.13 Двойникование кристаллов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Кристаллизация мембранных белков методом in meso"

Мембранные белки являются основными функциональными компонентами клеточных мембран и составляют примерно одну треть от общего числа белков, закодированных в геноме. Исследование мембран на молекулярном уровне имеет огромное значение не только в расшифровке всех клеточных процессов, но и для понимания изменений, ведущих к аномальным трансформациям клеток, а также для создания лекарств. Более того, 70% существующих в настоящее время лекарственных средств направлены на мембранные белки. Однако, хотя количество мембранных белков с известной структурой за последние годы возросло, оно не сравнимо пока с тем же показателем по водорастворимым белкам.

Актуальность. Согласно базе данных мембранных белков с известной структурой (http://blanco.bioinol.uci.edu/Meinbranc Proteins xtal.html) и банку данных RCSB (http://\vww.rcsb.оrg/pdb) на сегодняшний день лишь 218 из более 50000 зарегистрированных белковых структур высокого разрешения относятся к числу уникальных мембранных белков. Данный факт объясняется, прежде всего, трудностью получения кристаллов белков этого класса вследствие их амфифильной природы и необходимостью использования детергентов на всех этапах работы, а также, как правило, их нестабильностью вне нативного мембранного окружения. Нестабильности можно избежать при возвращении белка обратно в липидный бислой при кристаллизации методом в кубической фазе [1]. Несмотря на то, что этот сравнительно новый метод кристаллизации позволил сделать ряд принципиальных прорывов в области кристаллизации мембранных белков [2-6], механизм кристаллизации в липидной мезофзе (in meso) остается до конца неизвестным. Кристаллизация каждого следующего мембранного белка, как правило, требует длительного и дорогостоящего перебора многочисленных параметров кристаллизационной системы, что неминуемо приводит к повышению временных и финансовых затрат. Развитие методов кристаллизации на базе мембранных систем для повышения эффективности производства высококачественных кристаллов мембранных белков для последующего структурного анализа является одной из самых приоритетных задач современной структурной биологии.

Цель работы заключалась в развитии метода кристаллизации in meso, основываясь на изучении механизма кристаллизации мембранных белков в липидной мезофазе на примере модельного белка бактериородопсина. Получение высококачественных кристаллов бактериородопсина для установления молекулярного механизма универсального и первого шага биоэнергетики векторного транспорта протона через мембрану клеток являлось комплементарной задачей работы.

Состояние исследуемых проблем. Новый подход в кристаллизации мембранных белков из липидной кубической фазы позволил преодолеть сложности и получить структуры около восьми различных типов мембранных белков. Так, только с помощью метода in meso впервые после почти 30 лет неудачных попыток, при которых использовались стандартные методы кристаллизации, удалось получить кристаллы бактериородопсина (БР) кристаллографического качества [7], также впервые был закристаллизован комплекс двух белков и решена его структура [3;4]; совсем недавнее достижение в сфуктурной биологии — структура человеческих {За-адренергического и Агл-аденозинового GPCR (рецепторов, сопряженных с G белком) [5;6]. Следует отметить, что на сегодняшний день именно на GPCR белки направлено действие около 25-50% лекарств на рынке, а ежегодный объем их продаж составляет свыше 40 миллиардов долларов. [8-10]. Решенные структуры самых разнообразных белков свидетельствуют о широком диапазоне применения и высоком потенциале данного метода. Однако повышение эффективности этого метода сдерживает отсутствие систематических исследований самой кристаллизации. В результате до сих пор остается неизвестной роль амфифильного окружения, а также механизм роста кристаллов в данной системе [11-13].

Кристаллизация в липидной кубической фазе позволила получить структуру основного состояния бактериородопсина с разрешением 1,55 А. Благодаря новому методу получены некоторые данные о структурах промежуточных состояний белка, внесшие вклад в понимание молекулярных основ функционирования бактериородопсина и других светочувствительных белков этого класса [14]. Вместе с тем надо отметить, что отдельные сведения о механизме переноса остаются противоречивыми. Данные трёх групп авторов, опубликовавших структуры ранних промежуточных состояний, разняться между собой из-за относительно невысокого качества кристаллов, в том числе зачастую обладающих понижающим информативность дефектом двойникования.

Научная новизна работы. Разработан новый эффективный метод кристаллизации мембранных белков в липидной фазе непосредственно из мембран, содержащих белок, с добавлением детергента в кристаллизационную систему. Данный подход к кристаллизации позволяет обойти ряд принципиальных трудностей, в том числе неизбежные потери мембранных белков и снижение их качества, связанные с солюбилизацией и/или обменом детергента, и, что не мало важно, позволяет существенно повысить эффективность работы.

Впервые проведены систематические исследования кристаллизации мембранного белка. Прежде всего, изучено влияние детергентов - влияние гидрофобных и гидрофильных взаимодействий на кристаллизационный процесс в мезофазе. Эксперименты с варьированием концентраций детергентов, относящихся к различным семействам и имеющих разное соотношение полярного и неполярного фрагментов, позволили выдвинуть предположение, что в успехе кристаллизации in meso значительную роль играет толщина липидного бислоя мезофазы, а не детали химического строения амфифильных молекул (линидов, детергентов). Данные исследования впервые показали возможность кристаллизации мембранного белка в подавляющем большинстве типов детергентов, как в коротко-, так и в длинноцепочечных, и позволили определить количественные характеристики, оптимальные для кристаллизации.

В процессе исследования механизма кристаллизации мембранных белков в липидной мезофазе отработан в деталях метод кристаллизации БР из пурпурных мембран (ПМ) с добавлением различных типов детергентов. Данный метод позволил найти новые условия образования больших высококачественных кристаллов бактериородопсина, дифрагирующих до 1,2 А, что дало возможность впервые установить ряд принципиальных элементов механизма транспорта протона.

Кроме того, в работе впервые был разработан метод повышения чистоты солюбилизированного бактериородопсина с помощью замораживания белкового препарата и последующего его ультрацентрифугирования. Данная процедура эффективно работает и позволяет значительно улучшить качество белка и в случае других мембранных белков таких, как галородопсин, сенсорный родопсин II и его комплекс с трансдьюсером.

Практическая ценность работы. Полученные в работе результаты представляют собой огромный интерес для структурной биологии, в частности, для процедур очистки и кристаллизации белков с целью последующего структурного анализа. Как показывает практика, результат кристаллизации и качество кристаллов зависят от чистоты исходного препарата белка. Разработанный новый метод дополнительной очистки ретинальных белков может быть использован для повышения качества и чистоты препарата как в случае других мембранных, так и в случае растворимых белков.

Результаты исследования механизма кристаллизации в липидпой мезофазе и разработанный новый подход к кристаллизации представляют интерес с точки зрения понимания механизма кристаллизации, что важно для дальнейшего развития экспериментальных методов кристаллизации мембранных белков. Приведенные в работе выводы и диаграммы кристаллизации БР в мезофазе с добавлением различных детергентов говорят о возможности получения кристаллов мембранных белков в любом детергенте, минуя стадию замены детергента на более подходящий для кристаллизации. Отраженные в диаграммах оптимальные условия роста кристаллов БР (в частности, диапазон концентраций детергента) могут быть использованы в качестве отправной точки при поиске условий кристаллизации других белков. Разработанный метод кристаллизации уже позволил получить кристаллы бактериородопсина высокого качества дифракции, что в свою очередь позволит улучшить структуру основного и промежуточных состояний БР и прояснить молекулярный механизм первого и универсального шага биоэнергетики клетки.

Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав и заключения. Первая глава представляет литературный обзор современного состояния проблемы кристаллизации мембранных белков. Особое внимание уделено используемым в большинстве структурных исследований мембранных белков детергентам и их свойствам. Подробно описаны современные методы кристаллизации с акцентом на изложении различных аспектов кристаллизации мембранных белков новым методом -в липидной кубической фазе. Вторая глава включает в себя описание материалов, экспериментального оборудования, методов и процедур, использованных при выполнении диссертационной работы. Здесь подробно описан новый метод дополнительной очистки мембранных белков, а также новый подход по кристаллизации бактериородопсина из пурпурных мембран в липидной кубической фазе с добавлением детергента в кристаллизационную пробу. В третьей главе представлены экспериментальные результаты исследований влияния различных факторов на успех кристаллизации бактериородопсина в липидной кубической фазе. Данная глава начинается с описания результатов очистки новым методом солюбилизированного бактериородопсина и других ретинальсодержащих мембранных

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Моисеева, Екатерина Сергеевна

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ РАБОТЫ

5. В результате систематических исследований влияния различных детергентов на кристаллизацию БР in meso показано, что оптимум кристаллизации определяется не столько специфическими свойствами молекул детергента, сколько их влиянием на липидный бислой. Установлено, что ключевым параметром в кристаллизации in meso является толщина гидрофобной области липидного бислоя мезофазы.

7. Предложен новый метод очистки мембранных белков с помощью глубокой заморозки и последующего ультрацентрифугирования. Метод позволяет значительно улучшить качество белка бактериородопсина с р. г. (А280/А553) = 1,7 до 1,5, галородопсина - с 2,53 до 1,56, сенсорного родопсина II - с 1,5-1,6 до 1,16 и его комплекса с трансдьюсером - до 1,28.

БЛАГОДАРНОСТИ

В заключении хочу поблагодарить моего научного руководителя Горделия Валентина Ивановича за постановку научных задач, за продуктивное обсуждение результатов работы и новых идей, за постоянное внимание, личную поддержку и участие! Я глубоко признательна Георгу Бюлдту за предоставленную возможность выполнять часть данной работы в Институте Структурной Биологии Исследовательского Центра г. Юлиха, за доброе отношение и интересные научные беседы. Хочу выразить искренние слова благодарности Еве Пебай-Пероле за продуктивное сотрудничество с Институтом Структурной Биологии г Гренобля. За научные дисскуаш, критику и ценные замечания при написании работы я глубоко признательна Ягужинскоиу Льву Сергеевичу. Спасибо Валентину Борщевскому за постоянную помощь в проведении кристаллографических экспериментов и в обработке полученных данных, за консультации, обсуждение и участие в работе 1а техническую и дружескую поддержку я глубоко признательна Кристиану Бакену. Я искренне благодарю всех своих друзей и коллег из Центра Бионанофизики Московского Физико-Технического Института (ГУ) за помощь в работе: Абызова А., Андреева Г., Борщевскую Ю, Братанова Д., Волкова Д., Волкова О., Голощук В., Гущина И., Денисенко Е., Ерофеева И., Ерошенко Л., Иванову И., Ищенко А., Марышева П., Медведеву А., Моисееву В., Парилову Т., Полякова С., Проскурина М., Ремееву А., Решетняк А., Ромкину А., Силачеву М., Сиротинскую Е., Сквирского М., Соловьеву К., Червакова П., Чубукова П., Шаву А. Я очень признательна Эдельвейс Э. и Баландину Т. за неизменную поддержку, добрые советы и плодотворные научные беседы на протяжении всей моей научной деятельности. Я благодарю кафедру Молекулярной биологии и деканат ФМБФ за поддержку в течение обучения в МФТИ. Хочу выразить огромную благодарность кафедре Физики и технологии наноструктур и лично заведующему Лебедеву В. В., а также деканату ФОПФ, Центру Бионанофизики и его руководителю Трунину М. Р. за поддержку научных исследований.

Я сердечно благодарю моих родителей, родных и близкихI

1.14. Заключение

Известно, что одной из основных задач при кристаллизации мембранных белков является наработка необходимого количества чистого, гомогенного и стабильного препарата. Несмотря на все трудности работы с мембранными белками, за последнее время наблюдается значительный прогресс в расшифровке их структуры (рис. 1.17 А). Этот рост объясняется не только появлением новых и оригинальных способов кристаллизации мембранных белков, но и поиском новых условий и систем экспрессии генов этих белков в гетерогенных организмах, разработкой новых серий детергентов специально для эффективной солюбилизации и кристаллизации, улучшением методов очистки. Однако, тем не менее, почти половина из небольшого количества известных на сегодняшний день структур мембранных белков определена с относительно низким разрешением (более 3 А), и лишь небольшое их число с высоким [96].

Хотя большинство мембранных белков были закристаллизованы классическим способом in surfo (http://www.mpdb.ul.ie/), последние достижения в структурной биологии показали высокую эффективность работы новых подходов - методов кристаллизации мембранных белков «из мембран» (липидных бислоев). Диаграмма на рисунке 1.17 Б иллюстрирует рост количества решенных структур мембранных белков, закристаллизованных в липидной кубической фазе, в губчатой /.з-фазе и с помощью кристаллизации из бицелл. Основное достоинство этих методов заключается в том, что во время кристаллизации белок возвращается в нативное липидное окружение, что удерживает его в стабильном состоянии и предохраняет от агрегации. Образующиеся кристаллы типа I обладают плотной упаковкой. Характерная величина содержания растворителя в кристалле, выращенном в кубической фазе, составляет ~ 45-50%, в отличие от 60-70% для кристалла типа И, полученного стандартным методом кристаллизации [27]. При этом увеличивается дифрагирующая сила образца, что позволяет получать дифракционные картины хорошего качества, используя относительно небольшие по размерам кристаллы. В случае кристаллизации стандартным методом in surfo детергентная шуба, опоясывающая белок, достигает в ширину ~ 15-20 А и не позволяет образовывать прочные связи между белками внутри кристалла, что уменьшает плотность его упаковки и снижает дифракционное качество.

А.

Б.

6 8 10 12 14 16 года после первой структуры

18 '16 12 I 10

I • Бшдолы Ш 13~фааа Я Кубичвсх** фаза 11

II J f / # ^ ^ # /

Рис. 1.17. А. График, отражающий накопление всех новых структур белков с момента первой публикации кристаллографической структуры высокого разрешения [97]. Б. Диаграмма роста количества решенных структур мембранных белков, закристаллизованных в липидной кубической фазе, в губчатой Z-з-фазе и с помощью кристаллизации из бицелл [98].

С введением липидных мезофаз в кристаллизацию мембранных белков с целью последующего структурного анализа [43;99] совершен прорыв в области структурной биологии мембранных белков [2-6]. Несомненно, огромным успехом являются полученные недавно структуры высокого разрешения мембранных белков эукариотического происхождения [5;6;76;100]. Однако до сих пор данная система кристаллизации, состоящая в основном из белка и липида, остается плохо изученной. Не найдены ответы на вопросы о роли липидного окружения и механизм роста кристаллов в данной системе [11-13], а также является ли метод кристаллизации in meso достаточно общим эффективным методом для различных типов белков. В настоящее время огромные усилия направлены на исследование и развитие данной системы кристаллизации мембранных белков с целью последующего более рационального применения метода.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Выделение и очистка бактериородопсина

2.1.1. Материалы для культивирования бактерий и выделения бактериородопсина

В работе использовали штамм экстремальных галофильных бактерий Halobaclerium salinarum S9, любезно предоставленный профессором Г. Бюлдтом (Институт Структурной Биологии, г. Юлих, Германия).

Питательная среда для культивирования бактерий: 1% пептон (L37, Oxoid, Англия), 4,3 М NaCl, 80 мМ MgS04*7H20, 27 мМ КС1, 10 мМ дигидрат цитрата натрия, рН 6.5. Среду стерилизовали в течение 2 ч при 90°С.

Раствор базальтовой соли: 4.3 М NaCl, 80 мМ MgSOWH^O, 27 мМ КС1.

Буфер для солюбилизации БР: 3,75% (w/v) «-октил-)3-£>-глюкопиранозид, 20 мМ

NaHP04/KH2P04 (Na/K-Pi. рН 6,9).

Буфер для хранения БР: 368 мМ Na/K.-Pi рН 5,6 в тяжелой воде.

Буфер Лэмли: 25 мМ трис-HCl, рН 8.5, 192 мМ глицин, 0,1% ДДС-Na

4-кратпый буфер для нанесения проб: 0,25 М Трис-HCl, рН 6,8, 8% ДДС-Na, 40% глицерол, 20% |3-меркаптоэтанол, 0,016% бромфеноловый синий.

Разрешающий гель: 0,375 М трис-HCl, рН 8,8, 15% акриламид (акриламид : бис-акриламид - 29 : 1), 0,1% ДДС-Na, 0,06% персульфат аммония, 0,006% TEMED. Концентрирующий гель: 0,125 М трис-HCl, рН 6,8, 5% акриламид, 0,1% ДДС-Na, 0,08% персульфат аммония, 0,008% TEMED.

Окрашивающий раствор (Кумасси синий): 40% этанол, 5% уксусная кислота, 0,2% (w/v) Кумасси синий (G-250).

Раствор для отмывка гелей после окрашивания: 30% этанол, 7% уксусная кислота.

2.1.2. Культивирование бактерий. Для получения мембранного белка бактериородопсина 2-3 колонии Halobacterium salinarum штамма S9 засевали в 50 мл питательной среды (п. 2.1.1.) и инкубировали в течение 7-10 дней при 40°С, 130 об/мин и интенсивном освещении. Культуру переносили в 5 л питательной среды и выращивали в ферментере (INFOS, Швецария) при 40°С, 500 об/мин, интенсивном освещении и аэрации (5 л От в мин) до достижения оптической плотности культуры Абоо - 0,8 - 1,0. После этого поток кислорода и обороты перемешивания снижали (до

0,25 л От в мин и 200 об/мин соответственно) и продолжали ферментацию в течение 4 — 5 суток при температуре 40°С и интенсивном освещении. Клетки собирали центрифугированием при 9000 g и комнатной температуре, отмывали два раза от среды раствором базальтовой соли (п. 2.1.1.), пятикратно превышающем объем клеток. Средний выход клеточной массы составлял 7 г/л. Клеточный осадок хранили при -80°С.

2.1.3. Выделение пурпурных мембран. Halobacterium salinarum легко разрушаются под действием осмотического шока при переносе их в раствор с концентрацией соли меньше 1 М [101]. Для лизиса клеток на 1 г клеточного осадка добавляли 25 мл дистиллированной воды, содержащей ~1 мг ДНКазы (Sigma, Германия). Суспензию оставляли на ночь в темноте при непрерывном перемешивании при 4°С. Лизат осветляли центрифугированием 10 мин при 4300 g и охлаждении. Пурпурные мембраны выделяли и очищали серией последовательных центрифугирований при 4°С. Полученный супернатант откручивали дважды в течение 10 мин при 7600 g. Водную фракцию отделяли центрифугированием (55000 g, 1 ч), осадок обрабатывали дистиллированной водой с последующим ее отделением. Процедуру повторяли трижды до получения бесцветных промывных вод. Полученный осадок ПМ ресуспендировали в дистиллированной воде и центрифугировали в течение I ч при 60000 g. Полученный после двукратной промывки и центрифугирования осадок пурпурных мембран ресуспендировали в 0,02% NaN3 и хранили при -80°С. Содержание белка определяли спектрофотометрически (п. 2.2.5.). Выход фракции ПМ составлял ~8 мг/л.

2.1.4. Выделение и солюбилизация бактериородопсина. Бактериородопсин солюбилизировали добавлением по каплям при перемешивании буфера для солюбилизации (п. 2.1.1.) до конечной концентрации белка 2,5 мг/мл. Суспензию выдерживали в течение 2 суток при 4°С в темноте при непрерывном перемешивании. Солюбилизированную мембранную фракцию получали центрифугированием в течение 1 ч при 90000 g и 4°С. Надосадочную жидкость концентрировали в микроконцентраторах на 30 кДа (centricon YM-30, Millipore) в бакет-роторе при 5000 g 3 ч при 4°С, и затем сконцентрированный белок разбавляли 2,125 частями буфера для хранения белка (п. 2.1.1.) до конечной концентрации Na/K-Pi в растворе 250 мМ.

Солюбилизированный бактериородопсин в новом буфере концентрировали до нужной концентрации и хранили при -80°С. Выход фракции БР составлял ~8 мг/л.

2.1.5. Определение концентрации и качества бактериородоисина. Концентрацию и качество белкового препарата вычисляли из спектра поглощения, также степень чистоты мембранного белка определяли при помощи электрофоретического разделения образца в полиакриламидном геле. Спектр БР в УФ/видимом диапазоне (250 - 700 нм) имеет два максимума интенсивного поглощения: максимум на 280 нм, соответствующий поглощению ароматических аминокислот, и максимум в области —570 нм. соответствующий поглощению хромофора - ретиналя, и зависящий от окружения белка. Так, для свегоадаптированного БР в ПМ максимум поглощения находится на Ятах=568 нм с коэффициентом поглощения £568=62 700±700 !\Т'см"', тогда как для солюбилизированного в ОГ бактериородопсина - Дшах=553 нм и С55з=42000±700 M"'cm"' [102; 103]. Для вычисления концентрации белка использовали следующее соотношение: Сер = Лретиналь • MWbp / ( d • /:>.тах ), где СБр - концентрация бакгериродопсина (мг/мл), Аретш!ть - максимум поглощения линии ретиналя в белковом окружении, MWy,v - молярная масса бактериродопсина (26,8 кДа - в случае пурпурных мембран и 26,5 кДа - в случае солюбилизированного БР), d — длина оптического пути (см), exmax - коэффициент поглощения (М"'см''). Качество бактериородопсина (чистоту и долю нативного белка) определяли спектрофотометрически из отношения Агво/Аретиналь» величина которого для целей последующей кристаллизации не должна превышать 1,70. Если препарат не удовлетворял этому условию, белок подвергали процедуре дополнительной очистки (п. 2.1.8.).

2.1.6. Электрофоретическое разделение белков осуществляли в 15% полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (15% ДЦС-Ыа-ПААГ) в вертикальной камере (Amersham, США) при силе тока 22 мА в течение часа (по Лэмли, 1970). Визуализацию белковых пятен в геле после завершения электрофореза осуществляли методом окрашивания Кумасси синий и нитратом серебра. В первом случае гель от додецилсульфата натрия отмывали водой и выдерживали в растворе Кумасси синий (окрашивающий раствор в п. 2.1.1.) в течение 30 мин при постоянном перемешивании. Не связавшийся краситель отмывали в открашивающем растворе (п.

2.1.1.). В случае окрашивания нитратом серебра следовали инструкции производителя кита SilverSNAP Stain Kit II (PIERCE, США).

2.1.7. Определение концентрации детергента. Концентрацию детергента в растворе определяли методом взвешивания. После высушивания в течение не менее 2 ч под вакуумом каплю белкового раствора взвешивали, и из полученной массы вычитали массу соли и белка.

2.1.8. Дополнительная очистка солюбилизированного бактериородопсина. Метод повышения качества БР. Замороженный в жидком азоте или в морозильной камере при -80°С солюбилизированный бактериородопсин медленно опаивали на льду. Затем раствор белка дополнительно ультрацентрифугировали при 266000 g в течение I - 4 часов при 4°С (непрерывно или останавливая центрифугирование каждый час). За изменением качества белка следили спектрофотометрически, определяя величину

ОТНОШеНИЯ А28о/Аретиналь.

2.2. Кристаллизация бактериородопсина 2.2.1. Материалы для кристаллизации

Моноолеин (NU-Chek Prep, США) — моноглицерид с ненасыщенным углеводородным хвостом, водные суспензии которого формируют большое разнообразие мезофаз, при комнатной температуре образует биконтинуальные кубические фазы. Моноолеин гигроскопичен, хранили по 1 г в ампулах от производителя при -20°С. Детергенты: в работе использовали детергенты 10 семейств (Anatrace, США, за исключением и-октил-р-£>-глюкопиранозида (Sigma-AIdrich, Гермния)). Все детергенты высоко гигроскопичны и способны адсорбировать воду из атмосферы, а также светочувствительны, поэтому хранили их в темноте в закрытом виде под азотом при — 20°С. Свойства и используемые в работе при кристаллизации концентрации представлены в таблице 2.1.

Добавки: t-Бутанол (MERCK, Германия); 2-метил-2,4-пентадиол (MERCK, Германия); пентаэритритол пропоксилат (MERCK, Германия); Джеффамин М-600 (Sigma-AIdrich, Гермния); 1,4-бутандиол (MERCK, Германия); тиоцианат калия (MERCK, Германия).

Маточный раствор: 3 М Na/K-Pi, рН 5,6.

Кристаллизационный буфер (при кристаллизации in meso): 500 mM Na/K-Pi, рН 5,6. Буфер для растворения фазы моноолеина: 0,1% (w/v) и-октил-Р-Л-глюкопиранозид, 3 М Na/K-Pi, рН 5,6.

2.2.2. Кристаллизация в мостиках методом диффузии паров воды. Для кристаллизации стандартным методом использовали 24- и 96-луночные планшеты (Falcon, США). Необходимый объем маточного раствора разливали в резервуары планшетов и на полипропиленовые микромостики (Hampton Research, США) или в отведенную лунку (в случае 24- и 96-луночных плашек соответственно) раскапывали соответствующее количество предварительно приготовленной кристаллизационной смеси. Пробы герметизировали и оставляли в темноте при 22°С. Первые кристаллы наблюдали через 2-3 недели. Для эксперимента с добавлением липида в кристаллизационную смесь расплавленный при 42°С моноолеин смешивали с буфером в пропорции: 1 к 10, 16, 25 , 27, 32, 50, 64, 81, 100, 125, 250, 500, 103, 104, 105 и в получившуюся суспензию при 35°С добавляли белок. Объем маточного раствора в этом опыте составлял 400 и 600 мкл, объем капли - от 7 до 15 мкл. В случае кристаллизации из насыщенного раствора ю-октил-р-£)-глюкопиранозида детергент растворяли в буфере для кристаллизации и смешивали с белком. Соотношение объемов капле к маточному раствору изменяли от 0,0055 до 0,045. Исходные концентрации компонентов в кристаллизационной смеси варьировали в диапазоне: для белка 6-15 мг/мл, детергента 7,3 - 55,3%, Na/K-Pi в кристаллизационном буфере: 250, 600, 800 мМ.

2.2.3. Кристаллизация бактериородопсина из пурпурных мембран в мезофазе моноолеина. Кристаллизацию бактериородопсина в кубической фазе моноолеина проводили в ПЦР пробирках (Biozym, Германия). Для этого расплавленный при 42°С моноглицерид (п. 2.2.1.) раскапывали по 4 — 6 мг и осаждали центрифугированием на дно пробирки (10000 об/мин (13000 g) 10 мин). Пурпурные мембраны наилучшего качества (А280/А568 < 1,7), сконцентрированные до конечной концентрации 28 мг/мл осаждением при 20000 g (4°С), смешивали в соотношении 1:1 с удвоенной концентрацией детергента в буфере для кристаллизации (п. 2.2.1.). В итоге получали раствор пурпурных мембран (14 мг/мл) с требуемой концентрацией детергента (табл. 2.1) в 250 мМ Na/K-Pi буфере (рН 5,6), который немедленно раскапывали в предварительно приготовленные пробы с расплавленным моноолеином в соотношении 1 : 2 (МО : препарат белка). В некоторых экспериментах конечная концентрация пурпурных мембран, а также соли в пробе и соотношение моноолеин / белковый раствор варьировались, что указано непосредственно в тексте. Кристаллизационную смесь центрифугировали (1500 об/мин, 5 мин, Тком„) и выдерживали для уравновешивания системы в темноте 48 ч при 22°С. В качестве осадителя использовали сухую соль Na/K-Pi рН 5,6 (рН определяли для 100 мг/мл раствора соли) с конечной концентрацией в образце: 0,7; 0,9; 1,1; 1,2; 1,3; 1,4; 1,5; 1,6; 1,7; 1,9 М. Соль после добавления в пробу осаждали центрифугированием (1500 об/мин, 5 мин, TKOmii), и кристаллизационные пробы выдерживались сутки перед заключительным этапом гомогонезации. Для равномерного распределения белка внутри кристаллизационной пробы и быстрейшего формирования кубической фазы смесь гомогонезировали последовательным центрифугированием при 24°С, начиная с 5000 об/мин и постепенно увеличивая до 10000 об/мин (2700 - 10600 g) с шагом 1000 об/мин. Длительность каждого центрифугирования составляла 10 мин. Между центрифугированиями образцы поворачивали на 90°. Кристаллы выращивали в темноте при 22°С в течение 2-6 месяцев в зависимости от условий кристаллизации.

2.2.4. Отбор и подготовка кристаллов для кристаллографических экспериментов.

За ростом кристаллов следили при помощи стереомикроскопа (OLYMPUS, Япония). Кристаллизационные пробы с лучшими кристаллами (большого размера и правильной формой) отбирали с целью последующего использования в кристаллографических экспериментах. Для отделения кристаллов от кубической фазы содержимое кристаллизационной пробы с помощью микрошпателя переносили в 2,5 мл буфера для растворения фазы (п. 2.2.1) и выдерживали в темноте при 22°С в течение 1 - 2 недель. Из растворенных проб кристаллы помещали в криопетли (Hampton Research, США), замораживали до 100 К в криоструе (Cryostream 700 series, Oxford cryosystems, Англия) и тестировали на рентгеновской установке с вращающимся анодом (Brueker-Nonius FR571).

2.3. Кристаллографические измерения и обработка рентгеновских данных 2.3.1. Тестовые измерения и определение фактора двойникования кристаллов проводили на генераторе рентгеновского излучения с вращающимся анодом для оценки дифракционного качества белковых кристаллов перед основными измерениями. Используемый генератор оснащен двумерным Image Plate детектором (MAR Research, Гамбург, Германия) и одноосевым гониометром с горизонтальной осью вращения перпендикулярной рентгеновскому пучку. Измерения проводили при напряжение на аноде 50 кВ, силе тока 70 мА и с длиной волны рентгеновского излучения Х.= 1,5418 А (характеристическое излучение Ка линии меди). Во время дифракционных экспериментов диаметр рентгеновского пучка выставляли размером 300 мкм. Для каждого кристалла снимали 3-5 картин дифракции со временем экспозиции 300 -1800 с на одну дифракционную картину и с разрешением в диапазоне 2,0 - 30 А. Данные интегрировали в программе MOSFLM и масштабировали в программе SCALA [104]. Для каждого кристалла определяли долю двойникования. используя программу DETW1N [104], а также ресурс (www.doe-mbi.ucla.edu/Services/Tvvinning/. Yeates).

2.3.2. Установка для рентгеновской кристаллографии белков. Измерения картин рентгеновской дифракции проводили на установке ID14-EH1 ESRF (European Synchrotron Radiation Facility), которая предназначена для белковой кристаллографии. На данной установке используется монохроматичное синхротронное излучение с фиксированной длиной волны 0,934 А с размером сечения пучка 50 - 200 мкм (с расходимостью пучка 1/180°). Характерная интенсивность около 1012 фотон-мм"2^"1. Установка оборудована азотной криоструей (Cryostream 700 series, Oxford cryosystems, Англия). Для регистрации дифракционной картины на установке используется детектор рентгеновского излучения ADSC Q210 CCD (размер активной области 210 мм х 210 мм, 4096 х 4096 ячеек, время считывания 0,9 с) (Poway, США).

2.3.3. Выбор стратегии измерений. Для выбора стратегии измерений снимали две дифракционные картины, расположенные под углом 90°, по которым, используя программу MOSFLM [105], определяли разрешение (обычно 1,3 А - 1,5 А), симметрию (Р63), постоянные решетки (около 61 А х 61 Ах 110 А), мозаичность (0,2° - 0.6°), время экспозиции, угол осцилляции, начальный и конечный вращательный угол измерений. Затем снимали полный набор дифракционных данных, соответствующий для симметрии Р63 повороту кристалла на 90° с типичным углом осцилляции 0,4° и временем экспозиции 4 с на один дифракционный снимок. В случаях превышения интенсивности рефлексов в центральной части детектора его динамического диапазона снимали второй набор дифракционных данных с осцилляцией —1° и временем экспозиции 1 с на одну дифракционную картину с уменьшенной до 37,7% интенсивностью пучка и с разрешением ~2 А.

2.3.4. Обработка рентгеновских данных. [106] Данные интегрировали в программе MOSFLM [105] и масштабировали в программе SCALA [104]. Для построения моделей по данным с малой долей двойникования использовали пакет программ CCP4I [104]. Для решения фазовой проблемы использовали метод молекулярного замещения, реализованный в MOLREP [104]. В качестве начальной использовали полиаланиновую модель, построенную на основе опубликованной структуры основного состояния бактериородопсина с разрешением 1,55 А [2]. Для первичного построения модели использовали автоматизированную систему уточнения модели ARP/wARP [107]. Для дальнейшего уточнения модели использовали REFMAC5 [108]. Данные с совершенным двойникованием обрабатывали, используя специальные процедуры в CNS [109]. Карты 2Fo 1с, а также разностные карты Fo—Fc были построены как часть стандартных процедур в REFMAC5. Взвешенные экспериментальные разностные карты Fc-Fc были построены с использованием доработанных стандартных процедур в CNS. Карты электронной плотности изучались в программе Coot [110].

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Моисеева, Екатерина Сергеевна, Москва

1. Landau ЕМ & Rosenbusch JP (1996) Lipidic cubic phases: a novel concept for the crystallization of membrane proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 93, 14532-14535.

2. Moukhametzianov R, Klare JP, Efremov R, Baeken C, Goppner A, Labahn J, Engelhard M, Buldt G, & Gordeliy VI (2006) Development of the signal in sensory rhodopsin and its transfer to the cognate transducer. Nature, 440, 115-119.

3. Jaakola VP, Griffith MT, Hanson MA, Cherezov V, Chien EYT, Lane JR, IJzerman AP, & Stevens RC (2008) The 2.6 Angstrom Crystal Structure of a Human А2л Adenosine Receptor Bound to an Antagonist. Science, 322, 1211-1217.

4. Pebay-Peyroula E, Rummel G, Rosenbusch JP, & Landau EM (1997) X-ray structure of bacteriorhodopsin at 2.5 angstroms from microcrystals grown in lipidic cubic phases. Science, 277, 1676-1681.

5. Overington JP, Al-Lazikani B, & Hopkins AL (2006) Opinion How many drug targets are there? Nature Reviews Drug Discovery, 5, 993-996.

6. Parrill AL (2008) Crystal structures of a second G protein-coupled receptor: Triumphs and implications. Chemmedchem, 3, 1021-1023.

7. Caffrey M (2003) Membrane protein crystallization. Journal of Structural Biology, 142, 108-132.

8. Caffrey M (2009) Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination: Use of Lipidic Mesophases. Annual Review of Biophysics, 38, 29-51.

9. Lanyi JK & Schobert В (2004) Local-global conformational coupling in a heptahelical membrane protein: Transport mechanism from crystal structures of the nine states in the bacteriorhodopsin photocycle. Biochemistry, 43, 3-8.

10. Rivna AW, Sager G, Dahl SG, Sylte I (2009) Membrane Transporters: Structure, Function and Targets for Drug Design. Top Med Chem, 4, 15-51.

11. Michel H (2006) Crystallization of membrane proteins. International Tables for Crystallography F, 94-99.

12. Ostermeier C, Michel H (1997) Crystallization of membrane proteins. Current Opinion in Structural Biology, 7, 697-701.

13. Garavito RM, Ferguson-Miller S (2001) Detergents as tools in membrane biochemistry. J. Biol. Chem., 276, 32403-32406.

14. Anatrace (2006) Catalogue Anatrace. www.anatrace.com.

15. Reiss-Husson F, Ducruix A, Giege R (1999) Crystallization of membrane proteins. Picot, D. Crystallization of nucleic acids and proteins. A practical approach. Oxford University Press.

16. Deisenhofer J, Epp O, Miki K, Huber R, Michel I I (1985) Structure of the Protein Subunits in the Photosynthetic Reaction Center of Rhodopseudomonas-Viridis at ЗА Resolution. Nature, 318, 618-624.

17. Cowan SW, Schirmer T, Rummel G, Steiert M, Ghosh R, Pauptit RA, Jansonius JN, Rosenbusch JP (1992) Crystal-Structures Explain Functional-Properties of 2 Escherichia-Coli Porins. Nature, 358, 727-733.

18. Michel H. Crystallization of Membrane Proteins. CRC Press, Boca Raton . 1991.

19. Iwata S. Methods and Results in Crystallization of Membrane Proteins. 2003. International Unversity Line.

20. Prive GG (2007) Detergents for the stabilization and crystallization of membrane proteins. Methods, 41, 388-397.

21. Cherezov V, Clogston J, Papiz MZ, Caffrey M (2006) Room to move: crystallizing membrane proteins in swollen lipidic mesophases. J. Mol. Biol., 357, 1605-1618.

22. Zhou YF, Morais-Cabral JH, Kaufman A, MacKinnon R (2001) Chemistry of ion coordination and hydration revealed by a K+ channel-Fab complex at 2.0 angstrom resolution. Nature, 414,43-48.

23. Dutzler R, Campbell EB, MacKinnon R (2003) Gating the selectivity filter in C1C chloride channels. Science, 300, 108-112.

24. Dale GE, Oefner C, D'Arcy A (2003) The protein as a variable in protein crystallization. J. Struct. Biol. 142, 88-97.

25. Pebay-Peyroula E, Dahout-Gonzalez C, Kahn R, Trezeguet V, Lauquin GJM, Brandolin R (2003) Structure of mitochondrial ADP/ATP carrier in complex with carboxyatractyloside. Nature, 426, 39-44.

26. Abramson J, Smirnova I, Kasho V, Vemer G, Kaback HR, Iwata S (2003) Structure and mechanism of the lactose permease of Escherichia coli. Science, 301, 610-615.

27. Dahout-Gonzalez C, Brandolin G, Pebay-Peyroula E (2003) Crystallization of the bovine ADP/ATP carrier is critically dependent upon the detergent-to-protein ratio. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography, 59, 2353-2355.

28. Long SB, Tao X, Campbell EB, MacKinnon R (2007) Atomic structure of a voltage-dependent K+ channel in a lipid membrane-like environment. Nature, 450, 376-382.

29. Katona G, Andreasson U, Landau EM, Andreasson LE. Neutze R (2003) Lipidic cubic phase crystal structure of the photosynthetic reaction centre from Rhodobacter sphaeroides at 2.35A resolution. J. Mol. Biol., 331, 681-692.

30. Shearman GC, Ces O, Templer RH, Seddon JM (2006) Inverse lyotropic phases of lipids and membrane curvature. Journal of Physics-Condensed Matter, 18, SI 105-S1124.

31. Qiu H, Caffrey M (2000) The phase diagram of the monoolein/water system: metastability and equilibrium aspects. Biomaterials, 21, 223-234.

32. Cherezov V, Fersi H, Caffrey M (2001) Ciystallization screens: compatibility with the lipidic cubic phase for in meso crystallization of membrane proteins. Biophys. ./., 81, 225-242.

33. Chung H, Caffrey M (1994) The Curvature Elastic-Energy Function of the Lipid-Water Cubic Mesophase. Nature, 368, 224-226.

34. Chung Ii, Caffrey M (1994) The Neutral Area Surface of the Cubic Mesophase -Location and Properties. Biophysical Journal, 66, 377-381.

35. Nollert P, Qiu H, Caffrey M, Rosenbusch JP, Landau EM (2001) Molecular mechanism for the crystallization of bacteriorhodopsin in lipidic cubic phases. Febs Letters, 504, 179-186.

36. Grabe M, Neu J, Oster G, Nollert P (2003) Protein interactions and membrane geometry. Biophys. J., 84, 854-868.

37. Andersen OS, Koeppe RE (2007) Bilayer thickness and membrane protein function: An energetic perspective. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure, 36, 107-130.

38. Jensen MO, Mouritsen OG (2004) Lipids do influence protein function the hydrophobic matching hypothesis revisited. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes, 1666, 205-226.

39. Валиахметов АЯ (2008) Геометрия мембраны и функции белка. Биологические мембраны, 25, 83-96.

40. Tanford С (1978) The hydrophobic effect and the organization of living matter. Science, 200, 1012-1018.

41. Seddon AA, Curnow P, Booth PJ (2004) Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes, 1666, 105-117.

42. Prive GG (2009) Lipopeptide detergents for membrane protein studies. Curr. Opin. Struct. Biol., 19, 379-385.

43. Heerklotz H, Seelig J (2000) Correlation of membrane/water partition coefficients of detergents with the critical micelle concentration. Biophys. J., 78, 2435-2440.

44. Heerklotz H (2008) Interactions of surfactants with lipid membranes. Q. Rev. Biophys., 41, 205-264.

45. Lantzch G, Binder H, Heerklotz H, Wendling M, Klose G (1996) Surface areas and packing constraints in РОРС С (12)EO (n) membranes. A time-resolved fluorescence study. Biophys. Chem., 58, 289-302.

46. Angelov B, Ollivon M, Angelova A (1999) X-ray diffraction study of the effect of the detergent octyl glucoside on the structure of lamellar and nonlamellar lipid/water phases of use for membrane protein reconstitution. Langmuir, 15, 8225-8234.

47. Ai X, Caffrey M (2000) Membrane protein crystallization in lipidic mesophases: detergent effects. Biophys. J., 79, 394-405.

48. Misquitta Y, Caffrey M (2003) Detergents destabilize the cubic phase of monoolein: implications for membrane protein crystallization. Biophys. J., 85, 3084-3096.

49. Anderson DM, Gruner SM, Leibler S (1988) Geometrical Aspects of the Frustration in the Cubic Phases of Lyotropic Liquid-Crystals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 85, 5364-5368.

50. Caffrey M, Lyons J, Smyth T, Hart DJ (2009) Monoacylglycerols: The Workhorse Lipids for Crystallizing Membrane Proteins in Mesophases. Membrane Protein Crystallization, 63, 83-108.

51. Raman P, Cherezov V, Caffrey M (2006) The Membrane Protein Data Bank. Cell Mol. Life Set, 63, 36-51.

52. Lanyi JK (2004) X-ray diffraction of bacteriorhodopsin photocycle intermediates. Mol. Membr. Biol., 21, 143-150.

53. Cherezov V, Yamashita E, Liu W, Zhalnina M, Cramer WA, Caffrey M (2006) In meso structure of the cobalamin transporter, BtuB, at 1.95 A resolution. J. Mol. Biol., 364,716-734.

54. Cherezov V, Liu W, Derrick JP, Luan B, Aksimentiev A, Katritch V, Caffrey M (2008) In meso crystal structure and docking simulations suggest an alternative proteoglycan binding site in the OpcA outer membrane adhesin. Proteins, 71, 24-34.

55. Hanson MA, Cherezov V, Griffith MT, Roth CB, Jaakola VP, Chien EY, Velasquez J, Kuhn P, Stevens RC (2008) A specific cholesterol binding site is established by the 2.8 A structure of the human ^-adrenergic receptor. Structure, 16, 897-905.

56. Ridell A, Ekelund K, Evertsson H, Engstrom S (2003) On the water content of the solvent/monoolein/water sponge (£3) phase. Colloids and Surfaces A-Physicochemical and Engineering Aspects, 228, 17-24.

57. Engstrom S, Alfons K, Rasmusson M, Ljusberg-Wahren H (1998) Solvent-induccd sponge (Li) phases in the solvent-monoolein-water system. Progress in Colloid and Polymer Science, 108. 93-98.

58. Faham S, Bowie JU (2002) Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure. J. Mol. Biol., 316, 1-6.

59. Faham S, Boulting GL, Massey EA, Yohannan S, Yang D, Bowie JU (2005) Crystallization of bacteriorhodopsin from bicelle formulations at room temperature. Protein Sci., 14, 836-840.

60. Faham S, Uj'wal R, Abramson J, Bowie JU (2009) Practical Aspects of Membrane Proteins Crystallization in Bicelles. Current Topics in Membranes, 63, 109-125.

61. Sanders CR, Prestegard JH (1990) Magnetically orientable phospholipid bilayers containing small amounts of a bile salt analogue, CHAPSO. Biophys. J., 58, 447-460.

62. Sanders CR, Schwonek JP (1992) Characterization of magnetically orientable bilayers in mixtures of dihexanoylphosphatidylcholine and dimyristoylphosphatidylcholine by solid-state NMR. Biochemistry, 31, 8898-8905.

63. Sanders CR, Landis GC (1995) Reconstitution of membrane proteins into lipid-rich bilayered mixed micelles for NMR studies. Biochemistry, 34, 4030-4040.

64. Sanders CR, Prosser RS (1998) Bicelles: a model membrane system for all seasons? Structure, 6, 1227-1234.

65. Ujwal R, Cascio D, Colletier JP, Faham S, Zhang J, Того L, Ping P, Abramson J (2008) The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 A resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 105, 17742-17747.

66. Kouyama T, Yamamoto M, Kamiya N, Iwasaki H, Ueki T, Sakurai I (1994) Polyhedral assembly of a membrane protein in its three-dimensional crystal. J. Mol. Biol., 236, 990-994.

67. Takeda K, Sato H, Hino T, Kono M, Fukuda K, Sakurai I, Okada T, Kouyama T (1998) A novel three-dimensional crystal of bacteriorhodopsin obtained by successive fusion of the vesicular assemblies. J. Mol. Biol., 283, 463-474.

68. Denkov ND, Yoshimura H, Kouyama T, Walz J, Nagayama К (1998) Electron cryomicroscopy of bacteriorhodopsin vesicles: mechanism of vesicle formation. Biophys. J., 74, 1409-1420.

69. Gordeliy VI, Moiseeva ES (2008) Crystallization of membrane proteins. In Soft matter: From Synthetic to Biological Materials 2008, ed.: Dhont JKG, Gompper G, Nagele G, Richter D, Winkler RG, FZ-Juelich.

70. Oesterhelt D, Stoeckenius W (1971) Rhodopsin-Like Protein from Purple Membrane of Halobacterium-Halobium. Nature-New Biology, 233, 149-152.

71. Henderson R (1975) The structure of the purple membrane from Halobacterium hallobium: analysis of the X-ray diffraction pattern. J. Mol. Biol., 93, 123-138.

72. Kates M (1992) Archaebacterial lipids: structure, biosynthesis and function. Biochem. Soc. Symp., 58, 51-72.

73. Kates M. Kushwaha SC, Sprott GD (1982) Lipids of purple membrane from extreme halophiles and of methanogenic bacteria. Methods Enzymol, 88, 98-111.

74. Sass HJ, Buldt G, Gessenich R, Hehn D, NeflTD, Schlesinger R, Berendzen J, Ormos P (2000) Structural alterations for proton translocation in the M state of wild-type bacteriorhodopsin. Nature, 406, 649-653.

75. Facciotti MT, Rouhani S, Burkard FT, Betancourt FM, Downing KH, Rose RB. McDennott G, Glaeser RM (2001) Structure of an early intermediate in the M-state phase of the bacteriorhodopsin photocyclc. Biophys. J., 81, 3442-3455.

76. Luecke H, Richter HT, Lanyi JK (1998) Proton transfer pathways in bacteriorhodopsin at 2.3 angstrom resolution. Science, 280, 1934-1937.

77. Parsons S (2003) Introduction to twinning. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 59, 1995-2003.

78. Dauter Z (2003) Twinned crystals and anomalous phasing. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 59, 2004-2016.

79. Efremov R, Moukhametzianov R, Buldt G, Gordeliy V (2004) Physical detwinning of hemihedrally twinned hexagonal crystals of bacteriorhodopsin. Biophys. J., 87, 36083613.

80. Yeates TO (1997) Detecting and overcoming crystal twinning. Methods Enzymol., 276, 344-358.

81. Edman K, Royant A, Larsson G, Jacobson F, Taylor T, van der Spoel D, Landau EM, Pebay-Peyroula E, Neutze R (2004) Deformation of helix С in the low temperature L-intermediate of bacteriorhodopsin. J. Biol. Chem, 279,2147-2158.

82. Sauter С, Ng JD, Lorber B, Keith G, Brion P, Hosseini MW, Lehn JM, Giege R (1999) Additives for the crystallization of proteins and nucleic acids. Journal of Crystal Growth, 196, 365-376.

83. Borshchevskiy V, Efremov R, Moiseeva E, Buldt G, Gordeliy V (2010) Overcoming merohedral twinning in crystals of bacteriorhodopsin grown in lipidic mesophase. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr66, 26-32.

84. Ivetac A, Sansom MS (2008) Molecular dynamics simulations and membrane protein structure quality. Eur. Biophys. J., 37, 403-409.

85. White SH (2004) The progress of membrane protein structure determination. Protein Science, 13, 1948-1949.

86. Johansson LC, Wohri AB, Katona G, Engstrom S, Neutze R (2009) Membrane protein crystallization from lipidic phases. Curr. Opin. Struct. Biol., 19, 372-378.

87. Rummel G. Hardmeyer A, Widmer G, Chiu ML, Nollert P, Locher KP, Pedruzzi I, I, Landau EM, Rosenbusch JP (1998) Lipidic Cubic Phases: New Matrices for the Three-Dimensional Crystallization of Membrane Proteins. J. Struct. Biol., 121, 82-91.

88. Cherezov V, Peddi A, Muthusubramaniam L, Zheng YF, Caffrey M (2004) A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 60, 1795-1807.

89. Oesterhelt D, Stoeckenius W (1973) Functions of a new photoreceptor membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 70, 2853-2857.

90. Dencher NA, Heyn MP (1978) Formation and properties of bacteriorhodopsin monomers in the non-ionic detergents octyl-beta-D-glucoside and Triton X-100. FEBS Lett., 96, 322-326.

91. Tatulian SA (2003) Attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy: a method of choice for studying membrane proteins and lipids. Biochemistry, 42, 11898-11907.

92. The CCP4 suite: programs for protein crystallography. (1994) Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr50, 760-763.

93. Leslie AG (2006) The integration of macromolecular diffraction data. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 62, 48-57.

94. Борщевская Ю.А. (2009) Рентгеноструктурное исследование влияние полярного окружения на кристаллизацию мембранных белков. Московский Физико-Технический Институт (ГУ) .

95. Perrakis A, Morris R, Lamzin VS (1999) Automated protein model building combined with iterative structure refinement. Nat. Struct. Biol., 6, 458-463.

96. Murshudov GN, Vagin AA, Dodson EJ (1997) Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 53, 240-255.

97. Emsley P, Cowtan К (2004) Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 60, 2126-2132.

98. Duschl A, Lanyi JK, Zimanyi L (1990) Properties and photochemistry of a halorhodopsin from the haloalkalophile, Natronobacterium pharaonis. J. Biol. Chem, 265, 1261-1267.

99. Caffrey M, Cherezov V (2009) Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases. Nat. Protoc., 4, 706-731.

100. Решстняк А.Б., Борщевский В.И., Кларе Й., Моисеева Е.С., Энгельгардт М., Бюлдт Г., Горделий В.И. (2008) Поверхность. Рентгеновские, синхротронные и нейтронные исследования, 12, 78-84.

101. Nollert Р, Royant A, Pebay-Peyroula Е, Landau ЕМ (1999) Detergent-free membrane protein crystallization. Febs Letters, 457, 205-208.

102. Ефремов Р.Г. (2005) Исследование структуры и механизма функционирования ретиналь-содержащих мембранных белков: кристаллизация и фиксация промежуточных состояний белков в кристаллах. Московский Физико-Технический Институт (ГУ) .

103. Michel Н, Oesterhelt D (1980) Three-dimensional crystals of membrane proteins: bacteriorhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 77, 1283-1285.

104. Силачева M.A. (2008) Роль неламеллярных липидов (моноолеина) в кристаллизации мембранных белков. Московский Физико-Технический Институт (ГУ) .

105. Tsuchiya Т, Saito S (1984) Use of n-octyl-beta-D-thioglucoside, a new nonionic detergent, for solubilization and reconstitution of membrane proteins. J. Biochem., 96, 1593-1597.

106. Saito S, Tsuchiya T (1984) Characteristics of n-octyl beta-D-thioglucopyranoside, a new non-ionic detergent useful for membrane biochemistry. Biochem. J., 222, 829832.

107. Lorber B, Bishop JB, DeLucas LJ (1990) Purification of octyl beta-D-glucopyranoside and re-estimation of its micellar size. Biochim. Biophys. Acta, 1023, 254-265.

108. Newstead S, Ferrandon S, Iwata S (2008) Rationalizing alpha-helical membrane protein crystallization. Protein Sci., 17, 466-472.

109. Lantzch G, Binder H, Heerklotz H, Wendling M, Klose G (1996) Surface areas and packing constraints in POPC C^EOn membranes. A time-resolved fluorescence study. Biophys. Chem, 58,289-302.

110. Фукс H. (1935) О зарождении кристаллов. Успехи Физических Наук, XV, 496521.

111. Anatrace. www.anatrace.com. Catalogue Anatrace Inc. 2010 ed. 2010.

112. Iverson TM, Luna-Chavez C, Cecchini G, Rees DC (1999) Structure of the Escherichia coli fumarate reductase respiratory complex. Science, 284, 1961-1966.

113. Dawson RJ, Locher KP (2006) Structure of a bacterial multidrug ABC transporter. Nature, 443, 180-185.

114. Cartailler JP, Luecke H (2003) X-ray crystallographic analysis of lipid-protein interactions in the bacteriorhodopsin purple membrane. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 32, 285-310.

115. Redinbo MR, Cascio D. Choukair MK, Rice D, Merchant S, Yeates TO (1993) The 1.5-A crystal structure of plastocyanin from the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Biochemistry, 32, 10560-10567.

Информация о работе

Моисеева, Екатерина Сергеевна
кандидата физико-математических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.03

Диссертация

Кристаллизация мембранных белков методом in meso - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы