Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование механизма транспорта протона бактериородопсином: получение высококачественных рентгеноструктурных данных функциональных состояний
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование механизма транспорта протона бактериородопсином: получение высококачественных рентгеноструктурных данных функциональных состояний"

на правах рукописи

БОРЩЕВСКИЙ Валентин Иванович

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА ТРАНСПОРТА ПРОТОНА БАКТЕРИОРОДОПСИНОМ: ПОЛУЧЕНИЕ ВЫСОКОКАЧЕСТВЕННЫХ РЕНТГЕНОСТРУКТУРНЫХ ДАННЫХ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СОСТОЯНИЙ

03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

о 3 ОЕЗ 2011

Москва-20 И

4853790

Работа выполнена в Научно-образовательном центре «Бионанофизика» Московского физико-технического института (государственного университета) в сотрудничестве с Институтом структурной биологии и биофизики 2 Исследовательского центра г. Юлиха и Институтом структурной биологии г. Гренобля.

Научный руководитель:

кандидат физико-математических наук В. И. Горделий

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор химических наук В. В. Чупин

доктор физико-математических наук М. А. Мокульский

Институт физико-химической биологии, им. А. Н. Белозерского МГУ (г. Москва)

Защита диссертации состоится н ^ 2011 г. в часов на заседании

Диссертационного совета Д 002.235.011 при Учреждении Российской академии наук Институте молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта по адресу 119991 г. Москва, В-334, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта РАН

лЛ

Автореферат разослан _ 11 .ММ?_2011 г.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АТФ - аденозинтрифосфат; АК - аминокислота; БР - бактериородопсин; МО - моноолеин;

р-ХуЮС1б+4 -1-0-(3,7,11,15)-тетраметилгексадецил-р-0-ксилоза; ШО - Шиффово основание;

Гр -Грей

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Введение. Ключевым явлением в биоэнергетике клетки является синтез аденозинтрифосфата (АТФ). Создание АТФ требует наличия градиента электрохимического потенциала на мембранах клеток или органелл, его синтезирующих. Данный градиент создается посредством контролируемых ферментами окислительно-восстановительных или фотохимических реакций. Простейшим и наиболее изученным белком, преобразующим энергию света в электрохимический потенциал, является бактериородопсин (БР). Этот трансмембранный белок археи Halobacterium salinarum, поглощая свет, переносит протоны из цитоплазмы во внеклеточное пространство. БР, благодаря доступности в сравнительно больших количествах, простоте очистки и стабильности, в течение последних 30 лет остается одним из самых интенсивно изучаемых мембранных белков.

Актуальность и состояние исследуемых проблем. Для понимания молекулярного механизма работы БР необходимо знать структурные изменения, вызванные поглощением света ретиналем, которые сопровождают фотоцикл белка и приводят к направленному транспорту протона. Наиболее эффективным подходом к решению данной задачи в настоящее время является получение атомарных структур функциональных состояний рабочего цикла БР с помощью рентгеновской кристаллографии высокого разрешения. Использование данного метода требует наличия высокоупорядоченных трехмерных кристаллов белка с одной стороны и эффективных методов фиксирования промежуточных состояний с другой. Способы получения переходных состояний были исследованы ранее [1]. Кристаллы же могут быть получены при использовании нового метода кристаллизации /и meso, заключающегося в использовании липидной биконтинуальной мезофазы для кристаллизации мембранных белков [2]. Кристаллизация m meso остается в настоящее время недостаточно изученным методом, что существенно ограничивает его потенциальную применимость для мембранных белков. Несмотря на это, ш meso подход уже позволил получить структуру основного и некоторых промежуточных состояний БР. Однако, опубликованные структуры промежуточных состояний, полученные разными группами, сильно различаются, что ведет к противоречивым заключениям относительно механизмов переноса протона [3-7]. Причины этого в настоящее время остаются до конца невыясненными. Предположительно, отсутствие согласованности может быть связано с недостаточно высоким качеством дифракционных данных, моноэдрическим двойникованием кристаллов, радиационным повреждением кристаллов, а также возникновением новых состояний белка под действием рентгеновских квантов.

Целью исследования являлось выяснение причин, приводящих к возникновению противоречий в области рентгеноструктурного анализа функциональных состояний БР, и поиск путей преодоления сопряженных с ними проблем. Дополнительными задачами работы являлись исследование основного состояния БР с разрешением 1.26А, достигнутым для данного белка впервые, а также исследование липидного окружения молекулы белка в кристаллах, полученных в мезофазах моноолеина (МО) и 1-0-(3,7,11,15)-тетраметилгексадецил-Р-Р-ксилозы (Р-Ху10С1б+4) с участием детергентов различного типа.

Научная повита. В работе впервые найдены кристаллизационные условия, при которых фактор двойникования кристаллов БР симметрии Рбэ можно определить путем визуального изучения. Это позволило значительно упростить процедуру поиска недвойниковых кристаллов, необходимых для получения высококачественных рентгеноструктурных данных функциональных состояний БР. Впервые систематически исследована проблема специфического повреждения БР рентгеновскими квантами. В результате продемонстрировано, что специфическое радиационное разрушение, происходящее преимущественно в активном центре молекулы, может приводить к артефактам при анализе структур переходных состояний белка, а также впервые получена количественная зависимость доли белка с разрушенным активным центром от дозы радиации, поглощенной кристаллом белка. В данных расчетах была впервые использована методика оценки дозы, поглощенной белковым кристаллом, основанная на увеличении его В-фактора при радиационном повреждении кристалла.

Благодаря использованию высокоупорядоченных кристаллов, а также методике снятия структурных данных со смещением измерительного пучка вдоль кристалла БР, впервые оказалось возможным установить структуру оранжевой формы БР, образующейся при поглощении белком сверхмалых доз рентгеновского излучения. При этом кристалл поглощал около ОММГр при сборе одного набора данных, что на один-два прядка ниже, чем доза рентгеновского облучения, которую поглощали кристаллы БР при сборе рентгеноструктурных данных, опубликованных в литературе.

В работе обсуждается структура основного состояния БР с разрешением 1.2б А, которое впервые достигнуто для БР. Высокое разрешение модели позволило обнаружить новые структурные элементы, необходимые для понимания транспорта протона белком.

В рамках работы впервые проводится систематическое исследование роли детергента в стабилизации кристаллов БР симметрии Рбз, демонстрируется, что молекула детергента не входит в состав кристаллов.

Кроме этого, в работе впервые продемонстрирована возможность использования ß-XylOCi6+4 в качестве матричного липида для in meso кристаллизации, и показано, что молекулы матричных липидов (МО, ß-XylOCi6+4) входят в кристалл и стабилизируют белковый тример, образуя специфические контакты с аминокислотными (АК) остатками в цитоплазматических частях спиралей А-В и Тир157 в E-спирали соседней молекулы БР.

Практическая значимость работы. В ходе работы были решены основные противоречия в области рентгеноструктурного анализа функциональных состояний БР и показаны пути решения основных проблем. Разработанные подходы позволяют получить достоверные структуры основного и переходных состояний, что имеет важное фундаментальное значение, поскольку позволяет установить атомарные детали одного из наиболее общих процессов в жизни клетки - создание электрохимического потенциала на мембране.

Кроме этого, решение конкретных подзадач работы имеет собственное практическое значение. Так работа представляет интерес для белковой кристаллографии вообще. Новые подходы к решению проблемы двойникования могут быть использованы в других лабораториях для устранения данного дефекта кристаллов белка. Результаты исследования радиационного повреждения активного центра БР могут быть использованы при интерпретации рентгеноструктурных данных от кристаллов других белков. Методика оценки дозы, поглощенной кристаллом БР, основанная на увеличении B-фактора кристалла, может быть использована когда размер кристалла белка больше или сравним с размером измерительного пучка.

Исследования роли молекул детергента и матриксообразующего липида в кристаллизации белка важны для понимания механизма кристаллизации in meso и дальнейшего развития метода, поскольку дают представление о роли данных молекул в стабилизации кристалла.

Апробация работы. Основные положения работы и ее отдельные результаты докладывались на Международном симпозиуме "Retinal Proteins: Experiments And Theory" (Бремен, Германия, 2007), 6-й Национальной конференции по применению рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования материалов (Москва, Россия, 2007), 12-й Международной конференции по кристаллизации биологических макромолекул (Канкун, Мексика, 2008), 4-й Международной конференции "Physics of Liquid Matter: Modern Problems" (Киев, Украина, 2008), 52-й и 53-й Всероссийских молодёжных научных конференциях с международным участием «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук» (Долгопрудный, Россия, 2009, 2010), 14-ой

Интернациональной конференции по ретиналиевым белкам (Санта-Круз, Калифорния, США, 2010), 2-ой Международной научной школе «Современные фундаментальные, медицинские и биотехнологические аспекты исследования биологических мембран» (Долгопрудный, Россия, 2010) и на научных семинарах в Институте структурной биологии г. Гренобля, Институте структурной биологии и биофизики 2 Исследовательского центра г. Юлиха, в Институте кристаллографии Рейн-вестфальского технического университета и в НОЦ «Бионанофизика» МФТИ.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы в реферируемых издательствах.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 3 глав и заключения. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, включает 37 рисунков, 8 таблиц. Библиографический список содержит 213 наименований российских и зарубежных авторов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении рассмотрены актуальность и современное состояние исследуемой темы, выделены основные проблемы и сформулированы цели данной работы, а также описана структура диссертации.

Первая глава посвящена обзору литературных данных. Особое внимание уделяется рентгеноструктурным исследованиям БР: описываются все известные структуры белка как в основном, так и в переходных состояниях. Описываются отличия между моделями переходных состояний, полученных различными группами ученых, и противоречивые представления о механизме работы белка, к которым они приводят.

В главе формулируются причины, потенциально приводящие к противоречиям в структурах переходных состояний. В частности, подробно разбирается вопрос моноэдричесхого двойникования кристаллов белка, поясняется, каким образом этот дефект роста кристаллов может приводить к ошибкам в структуре переходных состояний белка.

Значительная часть первой главы посвящена обзору проблемы радиационного повреждения кристаллов белка. Описываются его глобальное и локальное проявления, обсуждаются возможные механизмы, анализируются различные подходы к описанию эффектов. Дается обзор известных данных о разрушении кристаллов БР в рентгеноструктурном эксперименте. Описывается опубликованная информация об изменении спектров белка при облучении малыми дозами рентгеновского излучения.

В конце главы формулируются основные задачи, которые необходимо решить для устранения противоречий в области рентгеноструктурного анализа функциональных состояний БР и выяснения механизма транспорта протона: получение не- и низкодвойниковых кристаллов БР симметрии Р63, исследования радиационного повреждения данных кристаллов и образования оранжевой формы белка.

Во второй главе приведены материалы и методы, использованные в работе. Описаны шаги по получению и кристаллизации БР, процесс отбора кристаллов, определение фактора их двойникования. Подробно описаны установки и процедуры рентгеноструктурного анализа: определение стратегии и сбор кристаллографических данных, интегрирование, шкалирование данных, решение фазовой проблемы, уточнение моделей, расчет заселенностей различных состояний белка, построение экспериментальных разностных Фурье-карт электронных плотностей. Также дано описание спектроскопических установок и методов, использованных в работе.

Третья глава состоит из трех подразделов. Первый подраздел третьей главы посвящен исследованию проблемы двойникования кристаллов БР. Двойникование - явление, при котором кристалл состоит из нескольких доменов, ориентированных таким образом, что их обратные решетки накладываются друг на друга, по крайней мере, в одном измерении -один из наиболее распространенных дефектов белковых кристаллов. Несмотря на это, не существует эффективных рациональных методик получения недвойниковых кристаллов. Также в литературе отсутствуют работы по систематическому исследованию зависимости образования двойникования от кристаллизационных условий. Описание явления двойникования еще более скудно для кристаллов мембранных белков, и совсем отсутствуют работы, посвященные явлению двойникования кристаллов, выращенных методом кристаллизации in meso.

Проблема двойникования кристаллов БР симметрии Р63 стоит особенно остро. Несмотря на то, что БР был закристаллизован в различных симметриях, кристаллы Р63 единственные, которые дают дифракцию до -1.4 А. Вместе с этим в симметрии Р63 возможно образование двойникования. Из 28 структур БР, решенных с использованием кристаллов симметрии Р63, 19 получены от кристаллов с совершенным двойникованием [7]. Все структуры с разрешением лучше 1.9 А были получены от кристаллов с совершенным двойникованием, единственное исключение составляет структура с разрешением 1.55 Á, полученная от кристалла с 25 % двойникованием.

Поскольку БР является протонной помпой, механизм его работы представляет большой интерес для биоэнергетики. Структурные изменения, происходящие во время его

рабочего цикла, относительно малы [4,8-15]. По этой причине для получения структур переходных состояний требуются рентгеноструктурные данные достаточно высокого качества. В частности, это подразумевает, что кристаллы должны быть недвойниковыми, поскольку двойникование понижает качество карт электронных плотностей и снижает достоверность получаемой структуры белка. Кроме этого, наиболее объективный метод обнаружения небольших структурных изменений в рентгеновских моделях -экспериментальные разностные Фурье-карты электронных плотностей - оказывается в случае совершенного двойникования неприменимым.

Все опубликованные в настоящее время кристаллографические работы, посвященные переходным К-, I,- и М-состояниям, имеют либо относительно низкое разрешение (>2.1 А) [4,8,12-16], либо совершенное двойникование [9-11,17-19]. Модели переходных состояний, построенные на основе этих данных, противоречат друг другу [3,4,16]. Наряду с низкой заселенностью переходных состояний, радиационным повреждением кристаллов и различиями, вызванными кристаллической упаковкой и условиями кристаллизаций, проблема двойникования является причиной этих противоречий. По этой причине для выяснения молекулярного механизма транспорта протона БР, необходимо научиться получать высокоупорядоченные кристаллы БР, не имеющие двойникования.

В ходе данной работы были установлены условия, позволяющие существенно упростить процедуру получения недвойниковых кристаллов. В ходе работы исследовались кристаллы БР, полученные с использованием различных типов детергентов. При кристаллизации в детергенте 5-циклогексил-1-пентил-(}-0-мальтопиранозид при концентрациях около 10 % было обнаружено, что кристаллы имеют форму двух усеченных пирамид, слипшихся друг с другом вдоль меньшей из гексагональных сторон (рис.1).

Кристаллы в одной пробе имели все возможные величины относительных объемов доменов (от 0, когда один из доменов отсутствует, до 0.5, когда их объемы равны). С данных кристаллов были измерены картины дифракции и определен их фактор двойникования.

7

кристаллографических осей кристаллов и схематическое представление упаковки молекул БР в кристаллах, показанных на рисунке (а).

Оказалось, что фактор двойникования кристаллов коррелирует с относительными объемами доменов: т.е. фактор двойникования был близок к 0 % для кристаллов, у которых один из доменов значительно меньше второго, и был близок к 50 % для кристаллов с примерно равными частями. Кроме этого, некоторые из кристаллов распадались на домены при отделении от липидной фазы, каждый из которых не имел двойникования. Следовательно, можно заключить, что части кристалла, имеющие форму усеченных пирамид, представляют собой двойниковые домены, расположенные в кристалле как показано на рис.1б. Таким образом, оказалось возможным отбирать недвойниковые кристаллы (или низкодвойниковые кристаллы) путем внимательного изучения формы кристаллов при помощи стереомикроскопа и существенно улучшить трудо- и ресурсоемкую процедуру отбора подходящих для рентгеноструктурного анализа кристаллов.

Статистическое исследование распределения фактора двойникования среди кристаллов, выращенных в течение различных временных промежутков, позволило подобрать кристаллизационные условия. способствующие увеличению выхода низкодвойниковых кристаллов при кристаллизации белка. В ходе работы исследовались кристаллы БР, полученые в широком диапазоне кристаллизационных условий при различных концентрациях соли, белка, типах и концентрациях детергентов. Кристаллы были протестированы на лабораторном источнике рентгеновского излучения. Для тех из них, которые давали дифракцию до достаточно высокого разрешения, был определен фактор двойникования.

Было обнаружено, что независимо от конкретных условий кристаллизации, кристаллы с низким фактором двойникования (< 20 %) чаще встречались в пробах, в которых первые кристаллы появлялись относительно поздно (спустя 2-3 недели после приготовления пробы), и рост продолжался в течение более длительного периода времени (порядка 10 недель). Если же кристаллы появлялись в пробе относительно рано (спустя 2-3 дня), и рост их происходил быстро (менее 6 недель), то все кристаллы имели высокий фактор двойникования. Фактор двойникования был определен для 83 кристаллов, выросших менее чем за 1.5 месяца, и для 227 кристаллов, рост которых длился более 3 месяцев. Распределения факторов двойникования для двух классов кристаллов показаны на ркс.2. Хорошо видно, что среди медленно растущих кристаллов около 10 % имеют фактор двойникования ниже 10 %. В то время как среди быстро растущих кристаллов нет ни одного с фактором двойникования ниже 10 %, и только 5 % имеют фактор двойникования между 10 % и 20 %. Таким образом, для увеличения выхода недвойниковых кристаллов в кристаллизации БР необходимо подбирать условия, при которых кристаллический рост продолжается в течение более 3 месяцев.

СО О 40.

U

35-

t-

30-

СО 25-

b 70-

S

■у о 15-

10-

5-

о

0

Р-ГЬ ф ф

Рисунок 2. Распределение факторов двойникования среди двух групп кристаллов с характерными временами роста менее 1.5 месяца (87 кристалла) и более 3 месяцев (227 кристалла), показанные пустыми и заштрихованными колонками, соответственно.

10 15 20 25 30 35 40 45 50 Фактор двойникования (%)

Результатом исследований, описанных в первом подразделе третьей главы, являются методики, позволяющие относительно быстро получать достаточные количества низко- и недвойниковых кристаллов, которые были использованы на всех дальнейших этапах работы.

Во втором подразделе третьей главы описаны исследования изменений, которые происходят в структуре БР при поглощении кристаллами белка симметрии Рбз различных доз рентгеновского излучения.

Значительная часть подраздела посвящена систематическому изучению радиаиионного повреждения кристаллов БР симметрии Рбз. При использовании ионизирующего рентгеновского излучения для получения картин дифракции невозможно избежать поглощения энергии измерительного пучка за счет эффектов полного поглощения или неупругого рассеяния, что приводит к радиационному разрушению биологических кристаллов [20]. Поглощение кристаллом дозы облучения имеет два следствия: глобальное (или физическое) и специфическое (или химическое) радиационное повреждение. Первым из этих терминов обозначают падение качества дифракции кристалла при увеличении дозы облучения, поглощенной кристаллом, что чаще всего описывают увеличением В-фактора кристалла. Второй относится к тому факту, что некоторые ковалентные связи в белковой молекуле распадаются под действием рентгеновского излучения. Этот аспект радиационного повреждения более тесно связан с интерпретацией биологической функции молекулы. Различные типы связей восприимчивы к специфическому радиационному повреждению в разной степени. При этом данный тип радиационного повреждения невозможно наблюдать во время съема данных, поскольку для этого необходимо иметь уточненную структуру белка. Однако, хорошо известно, что описанные структурные изменения происходят при дозах, малых настолько, что никаких изменений глобальных характеристик еще не наблюдается. Одними из наиболее чувствительных групп являются остатки карбоновых кислот, для которых наблюдается декарбоксилирование под действием рентгеновского излучения.

Активный центр БР, представляющий собой Шиффово основание (ШО) ретиналя и его окружение, содержит два остатка аспарагиновой кислоты и три молекулы воды, которые, как известно, также разлагаются под действием рентгеновского излучения. По этой причине он подвержен сильному специфическому радиационному повреждению.

Для того, чтобы исследовать данное явление, был снят ряд наборов рентгеноструктурных данных друг за другом с одного и того же кристалла. Для подтверждения воспроизводимости такие измерения проводили с двух различных кристаллов-, были измерены 8 наборов данных с разрешением 1.78 А и 6 наборов данных с разрешением 1.65 А.

Исследуя изменения электронной плотности при увеличении дозы облучения,

поглощенной кристаллами, были обнаружены структурные изменения, наиболее важные из

которых можно суммировать следующим образом: (1) исчезновение молекул воды в

активном центре, в том числе ключевой молекулы В402, соединенной водородной связью с

ШО; (2) декарбоксилирование Асп85 и появление новой электронной плотности поблизости;

(3) радиолиз Асп212; (4) смещение молекулярного остова Арг82, Тир83, Ала84, Асп85 в С-

спирали и Лиз216. Эти изменения в структуре активного центра приводят к полностью-

транс—>13-цис изомеризации ретиналя, продемонстрированной на рис.3.

Рисунок 3. Сравнение рентгеноструктурных моделей и карт электронных плотностей в активном центре БР до (а) и после (6) специфического радиационного повреждения активного центра рентгеновским излучением. Уровень карт 1.4с. Модели белка и структурные данные содержатся в рубанке ('http://www.rcsb.org') под номерами ЗИБО и 3№В.

Такая изомеризация ретиналя является событием, запускающим фотоцикл белка, и не раз наблюдалась ранее при изучении рентгеноструктурных моделей К- и Ь-состояний БР [4,10-15]. Согласно опубликованным данным, изомеризация ретиналя во время фотоцикла приводит к ряду структурных изменений в активном центре, которые можно суммировать следующих образом: (1) реорганизация (исчезновение и перемещение) молекул воды в активном центре белка [10,12-15]; (2) смещение боковой цепи Асп85 и Арг82; (3) движение белкового остова в области Лйз216 и Ала215 и в районе 82-87 АК остатков [13,14]. Часть из этих изменений, как описано выше, наблюдается при радиационном повреждении активного

10

центра БР. Таким образом, радиолиз активного центра может приводить к артефактам при интерпретации переходных состояний БР.

При исследовании переходных состояний важно иметь возможность оценить, какая доля белковых молекул имеет модифицированный активный центр. Для этого необходимо правильно оценить дозу излучения, поглощенную кристаллом, что нетривиально в случае использованных кристаллов БР. Обычно дозу относительно легко рассчитать теоретически, зная состав кристалла и параметры измерительного рентгеновского пучка. Однако в случае кристаллов, размер которых сравним с размером пучка (как в случае кристаллов БР симметрии Р63), прямое применение такого метода невозможно. Дело в том, что интенсивность пучка существенно затухает к краям, это приводит к неравномерному распределению рентгеновского потока на кристалле, и доза излучения, поглощенная участком кристалла, зависит от его близости к центру пучка. К тому же, при вращении кристалла, размер которого больше размера пучка, во время сбора данных ранее не облученные (или слабо облученные) участки кристалла постепенно вводятся в пучок, что еще более усложняет задачу. Кроме этого, поток излучения рентгеновской установки не всегда известен (или известен только примерно), размер пучка также часто оценен примерно и может зависеть от деталей конкретного эксперимента. Все описанные выше обстоятельства делают корректную оценку дозы в случае больших кристаллов сложной задачей.

Для преодоления описанных трудностей в данной работе предложена методика оценки поглощенной дозы по изменению В-фактора кристалла при его глобальном радиационном повреждении. В-фактор кристалла был выбран в качестве характеристики, описывающей глобальное радиационное повреждение, поскольку его рост имеет наиболее воспроизводимый характер [21]. Идея заключается в том, что увеличение В-фактора кристалла с увеличением поглощенной дозы промеряется отдельно на рентгеновской макрокристаллографической установке с хорошо откалиброванньгм потоком, существенно обрезанным сечением пучка (это необходимо для того, чтобы исключить «крылья» распределения потока) и без значительного вращения кристалла. При такой постановке можно корректно рассчитать дозу, поглощенную кристаллом, и получить калибровочную прямую роста В-фактора от дозы излучения, поглощенной кристаллом (показанную окружностями на рнс.4). Рассчитав зависимости роста В-фактора кристалла в ряду кристаллографических данных, измеренных с одного кристалла, для которых надо определить поглощенную дозу, и наложив её на калибровочную прямую, можно рассчитать, какую дозу поглощал кристалл при сборе данных (рис.4).

¿3-

га 2т 1-

о

4-

5-

Рисунок 4. Рост В-фактора в зависимости от дозы, поглощенной кристаллами БР. Для калибровки использована зависимость, показанная окружностями. Сплошной линией показана её линейная аппроксимация. Данные, соответствующие двум кристаллам (треугольниками для 8 наборов данных с разрешением 1.78 А и квадратами для 6 наборов данных с разрешением 1.65 А), использовались для изучения

специфического повреждения активного центра.

0-

0 1 2 3 4 5 Поглощенная доза, МГр

6

Используя описанный подход, было определено, что при измерении каждого из восьми наборов данных с разрешением 1.78 А, использованных для исследования специфического радиационного повреждения активного центра БР, кристалл поглощал около 0.4МГр, при измерении каждого из шести наборов данных с разрешением 1.65 А кристалл поглощал 0.3МГр.

Для количественной оценки зависимости доли белка с поврежденным активным иентром от поглощенной дозы были рассчитаны заселенности групп, наиболее подверженных радиолизу: боковой группы Асп85 и молекул воды В402, В403 и В406 - при различных дозах поглощенного рентгеновского излучения для двух исследованных кристаллов, продемонстрированные на рис.5.

Заселенности карбоксильной группы Асп85 и молекул воды падают линейно с увеличением дозы. Наклоны прямых для двух кристаллов находятся в хорошем соответствии друг с другом. Из полученных зависимостей следует, что поглощение кристаллом 1 МГр рентгеновского излучения приводит к повреждению активного иентра у ~10 % белковых молекул.

Часть второго подраздела третьей главы посвящена изучению образования оранжевой формы БР. Известно, что воздействие на кристаллы БР небольших доз облучения (менее 105 Гр, согласно [4]) приводит к изменениям его спектра и образованию оранжевой формы белка. Эта доза примерно на порядок меньше дозы, необходимой для сбора дифракционных данных с кристаллов БР [4]. По этой причине структурные изменения, сопровождающие образование оранжевой формы, до настоящего времени оставались невыясненными.

ч

0,7

Рисунок 5. Зависимость заселенности карбоксильной группы Асп85 (квадраты) и молекул воды В401, В402 и В406 (треугольники) от дозы рентгеновского излучения, поглощенной кристаллом, (а) и (б) данные для двух кристаллов, дифрагировавших до 1.78 А и 1.65 А, соответственно. Наклон линейной аппроксимации равен (а) 0.12 МГр~' и (6) 0.15 МГр'\

0.0 0,5 1,0 1,5 2.0 2,5 3,0 _Поглощенная доза, МГр_

(6),

л 0,9 8

0.7

0,5 1,0

Поглощенная доза, МГр

В данной работе, благодаря использованию высокоупорядоченных кристаллов БР и применению процедуры измерения структурных данных со смещением измерительного пучка вдоль кристалла БР, удалось установить данные структурные изменения. Для минимизации дозы, поглощаемой кристаллом во время сбора одного набора данных, кристалл делился на три равные части, с правой части кристалла измерялась только треть набора данных, затем пучок смещался в центральную часть кристалла, и измерялась вторая треть набора, после этого проводился сбор последней трети данных с левой части кристалла. Благодаря такой процедуре кристалл поглощал около 0.04 МГр рентгеновского излучения при измерении одного набора данных, что на один-два порядка меньше, чем при накоплении данных в стандартном макромолекулярном эксперименте. Для исследования образования оранжевой формы белка с одного кристалла были последовательно измерены 8 наборов данных с разрешением 1.73 А и, для проверки воспроизводимости, со второго кристалла было измерено 7 наборов данных с разрешением 1.78 А.

В результате исследования полученных наборов данных была построена модель оранжевого состояния белка. часть которой продемонстрирована на рис.6. Было обнаружено, что образованию оранжевой формы белка соответствуют изменения в активном центре: смещение ШО ретиналя, молекулы воды В402 и изменение конформации Мет209. Сопоставление заселенностей нового состояния белка, рассчитанные независимо из спектральных и рентгеновских данных (рис.7), подтверждает, что обнаруженные структурные изменения действительно соответствуют спектрально наблюдаемому ранее образованию оранжевой формы БР.

Рисунок 6. Структурные изменения в активном центре белка, соответствующие образованию оранжевой формы белка: темным показана модель основного состояния, светлым модель оранжевого состояния.

Показаны разностные Фурье-карты между оранжевым и основным состоянием белка: темной сеткой показана отрицательная плотность, светлой - положительная.

/ &

Обнаруженные изменения достаточно малы, однако, они затрагивают активный центр белка и могут быть важны для интерпретации переходных состояний, особенно тех, в которых структурные изменения малы (К-состояние). 35

о.

о

■е-

30

25

ш

| 20

2.15

о

о

¡5 ю

0

О)

1 5 с;

о ь;

Рисунок 7. Сопоставление увеличения количества оранжевой формы, рассчитанной из спектроскопических данных, с ростом заселенности нового состояния, полученного кристаллографическим методом.

Спектроскопические и Рентгеноструктурные данные

0,05 0,10 0,15 0,20 0,25

Поглощенная доза, МГр Третий подраздел третьей главы работы посвящен изучению основного состояния БР и исследованию липидной оболочки молекулы белка в кристалле.

В частности, в данном подразделе описывается исследование ряда структур основного состояния с разрешениями 1.26 А, 1.33 А. и 1.38 А, полученных от низко- и недвойниковых

кристаллов. Важно отметить, что разрешение 1.26 Á впервые достигнуто для кристалла, полученного методом in meso, и является наилучшим среди всех опубликованных моделей БР. Оказалось, что, несмотря на то, что существует 11 моделей основного состояния дикого типа БР, полученных различными группами, ряд важных для понимания работы белка структурных особенностей не были обнаружена ранее.

Так в цитоплазматической части белка была обнаружена новая молекула воды В503. Молекула воды подвижна и имеет большой относительно окружения В-фактор. В кристаллографической работе, посвященной изучению L-состояния БР [12], авторы наблюдают поворот боковой цепи Лей93, при этом АК остаток занимает пространство в описанной выше части белка. Авторы данной работы описывают одновременное появление молекул воды в месте прежнего положения боковой цепи АК остатка и трактуют одну из них как, пришедшую из активного центра, молекулу В402. На основании этого авторы выдвигают гипотезу о том, что одновременно с транспортом протона БР переносит одну молекулу воды из внеклеточной части в клетку. Поэтому, согласно гипотезе авторов, БР эффективно перекачивает гидроксил, а не ион водорода. Если же исходить из новой модели основного состояния, то более естественной интерпретацией структурных изменений в L-состоянии является смещение в новое положение именно молекулы В503, которую выталкивает боковая цепь Лей93 при повороте. В этом случае прямых свидетельств в пользу транспорта молекулы воды через БР нет.

В данной работе показано, что одна из важнейших частей БР - «карман», где в основном состоянии содержится протон, и откуда он высвобождается во внеклеточное пространство при работе белка - имеет строение, отличное от того, которое было принято ранее. В работе, описывающей структуру основного состояния с разрешением 1.55 Á, авторы отмечают, что плотности в области Глю194 и Глю204 слабые, и боковые группы остатков подвижны, однако качество электронных плотностей не позволяло разделить различные конформации АК остатков [22]. При изучении карт электронных плотностей, полученных с использованием новых рентгеноструктурных данных, в этой области были обнаружены двойные конформации Глю204, Сер193, Глю194 (рис.8). Карбоксильная группа Глю194 в одной из конформаций расположена практически параллельно бислою, во второй изгибается в стороны цитоплазмы и образует водородную связь с боковой группой Тир83. Электронная плотность в области Глю204 допускает движение группы перпендикулярно плоскости карбоксильной группы.

Рисунок 8. Область БР, запасающая протон в основном состоянии белка. - Я карты показаны при уровне электронной плотности 1.2о

Такая плотность была промоделирована как двойная конформация АК остатка со сдвинутой на -0.6 Á карбоксильной группой. Плотность, соответствующая Сер193, также свидетельствует о присутствии двух конформаций АК: Св - Ос связь одной из них направлена в сторону пары Глю194-Глю204, второй - во внеклеточное пространство. В модели с разрешение 1.55 Á полость около пары Глю 194-Глю204 содержит три молекулы воды: В403, В404 и В405. При разрешении 1.38 Á и выше на месте этих молекул электронные плотности имеют удлиненную форму и могут быть интерпретированы как двойные конформации. Обнаруженные конформации по всей вероятности не являются независимыми, а вся область синхронно принимает одну из двух конформаций. При этом в одной из них молекула воды В408 находится на расстоянии 3.5 Á от молекулы В404 в области Глю194/Глю204 и способна образовать водородные связи с молекулами воды на гидрофильной поверхности белка. Благодаря этому возможно образование цепочки водородных связей, которая задает вероятный путь выхода протона из белка во время фотоцикла.

В рамках работы был проведен анализ липидного окружения молекулы БР в кристалле. Молекула белка в кристалле окружена молекулами липидов. Изучение этой оболочки может дать информацию для понимания как функционирования белка, так и процесса ш meso кристаллизации частного случая БР и мембранных белков в целом. Одной из важнейших составных частей пробы при in meso кристаллизации является детергент. Он оказывают двоякое влияние на кристаллизацию. Во-первых, он влияет на свойства кристаллизационной матрицы, во-вторых, способен входить в состав кристалла белка и

стабилизировать его. В рамках данной работы проводилось исследование кристаллов БР, полученных ¡n meso кристаллизацией с участием различных детергентов. Изучались 20 наборов данных с разрешением 1.26-1.9 А от кристаллов, полученных в кристаллизациях с б различными детергентами: и-октил-Р-О-глюкопиранозид, деканоил-Л'-метилглюкоамид, нонаноил-А'-гидроксиэтилглюкоамид, 5-циклогексил-1-пентил p-D-мальтопиранозид, п-октилфосхолин, л-октил-Р-Б-тиоглюкопиранозид. Сравнение экспериментальных разностных карт между различными парами наборов данных показало, что в липидной оболочке белков нет заметных различий. По-видимому, молекулы детергента изменяют свойства кристаллизационного матрикса и за счет этого влияют на кристаллизацию белка. Однако в состав белкового кристалла молекулы детергента не входят и не участвуют в его стабилизации.

Количество детергентов, используемых в настоящее время для солюбилизации, очистки и кристаллизации мембранных белков, различающихся как строением растворимой части, так и длиной гидрофобного хвоста, очень велико. Благодаря этому для каждого конкретного мембранного белка возможно подобрать наиболее подходящий детергент, что существенно увеличило количество закристаллизованных мембранных белков. Ситуация с липидами для создания кубической фазы противоположная. Обычно для создания кристаллизационной матрицы для in meso кристаллизации используют молекулы МО. Также существуют сообщения в литературе о кристаллизации мембранных белков в трех других моноглицеролах: монопальмитоиле, моноваценине, 2,3-дигидроксипропил-(72)-гексадек-7-еноате. Количество липидов, которые можно использовать для создания липидной кристаллизационной матрицы, необходимо увеличивать для успешного развития метода кристаллизации. В данной работе впервые была продемонстрирована возможность использования fi-XylOCií+4 в качестве липида. формирующего липиЬную матрицу кристаллизации [23]. Данный липид образует кубическую фазу примерно в тех же условиях, что и МО. Используя эту фазу, удалось закристаллизовать БР с применением стандартной процедуры кристаллизации' в МО. В результате были получены несколько десятков кристаллов симметрии Рбз, три нз которых оказались достаточно хорошего качества. Для них были собраны кристаллографические данные: два кристалла дифрагировали до разрешения 2 Á и один до 2.7 А.

Важно, что все три исследованных кристалла имели низкое двойникование. Для двух кристаллов (дифрагировавших до 2 А) фактор двойникования равнялся 25 % и 34 %, один кристалл (2.7 Á) не имел двойникования. Только 28 % кристаллов БР, получаемых из липидной фазы МО, имеют долю двойникования ниже 34 % [7]. Таким образом, вероятность

обнаружить в одной кристаллизационной пробе три кристалла с долей двойникования ниже 34 % достаточно мала и составляет около 2 %. Вероятно, тот факт, что все три кристалла низкодвойниковые не является просто совпадением, и использование Р-ХуЮС16+4 в качестве кристаллизационной матрицы может препятствовать образованию двойникования.

Используя полученные структурные данные, была решена структура БР. При сравнении с полученными ранее структурами БР от кристаллов, выращенных в кубической фазе МО, существенных различий в белковой молекуле обнаружено не было. Однако были замечены различия в липидном окружении белка. При исследовании основного состояния БР с разрешением выше 1.38 А была найдена молекула МО, которая находится в «желобке», образованном А-В спиралями одного белка и Б-Е другого белка, входящего в состав того же тримера. Данная молекула не была обнаружена ни в одной из опубликованных кристалло1р>афических структур БР, масс-спектрометрический анализ состава кристаллов белка также не обнаружил присутствия молекул данного типа. При исследовании электронных плотностей, полученных от кристаллов, выращенных в кубической фазы Р-Ху10С1б+4, было обнаружено, что данное место занято молекулой нового матричного липида

(рис.9).

Рисунок 9. Положение молекулы Р-Ху10С|6м между двумя молекулами БР в одном тримере. Уровень 2 ^ - Р карт (черная сетка) - 0.9а, черными пунктирами показаны возможные водородные связи. Модель белка и структурные данные содержатся в рёЬ-банке [ЪнрУАулууу.гсзЬ.ог^! под номером ЗМВУ.

Таким образом, независимо от конкретного лит/да. использованного в кристаллизации (МО или 3-XvIQCim). его молекулы входят в белковый кристалл и стабилизируют белковый тример. образуя специфические контакты с АК остатками в цитотазматических частях спиралей Л-В и Тир!57 в E-спирали соседней молекулы белка.

В заключении приводятся выводы и список используемой в работе литературы.

выводы

I) Исследованы основные проблемы, препятствующие получению высококачественных рентгеноструктурных данных функциональных состояний БР:

1) Впервые найдены кристаллизационные условия, при которых фактор двойникования кристаллов БР симметрии Р63 можно определить путем визуального изучения. Это позволило значительно упростить процедуру поиска недвойниковых кристаллов, необходимых для получения высококачественных рентгеноструктурных данных функциональных состояний БР.

2) Путем статистического анализа показано, что замедленный рост кристаллов БР (в течение более 3 месяцев) благоприятствует образованию кристаллов с низким и нулевым фактором двойникования. Этот результат позволил увеличить выход низко- и недвойниковых кристаллов при кристаллизации БР.

3) Показано, что активный центр БР подвержен радиационному повреждению при дозах, порядка которых поглощали кристаллы при получении опубликованных рентгеноструктурных моделей белка. Впервые продемонстрировано, что радиолиз активного центра может быть ошибочно истолкован как функциональные К- и ^состояние белка.

4) Получена количественная оценка зависимости доли белка с поврежденным активным центром от поглощенной дозы. Показано, что поглощение кристаллом 1 МГр рентгеновского излучения приводит к повреждению активного центра у -10% белковых молекул. Для этого разработана методика количественной оценки дозы рентгеновского излучения, поглощенной кристаллом, основанная на изменении его глобальных характеристик при радиационном повреждении кристалла. Данная информация необходима при планировании эксперимента для получения достоверных моделей переходных состояний БР.

5) Установлены структурные изменения, сопровождающие образование оранжевой формы БР. Использование высокоупорядоченных кристаллов, а также методики снятия структурных данных со смещением измерительного пучка вдоль кристалла БР позволили уменьшить дозу, поглощенную кристаллом во время измерения набора до ~ 0.04 МГр. Данная информация необходима для корректной интерпретации структурных данных переходных состояний БР.

И) Исследован ряд моделей основного состояния белка с разрешением, достигающим 1.26А. Показаны новые структурные элементы, необходимые для понимания транспорта протона белком.

III) Исследованы рентгеноструктурные данные от кристаллов БР с разрешением 1.26—1.94Á, выращенных in meso с использование 6 различных детергентов. Молекулы детергента не обнаружены в составе белковых кристаллов.

IV) Показано, что 1-0-(3,7,11,15)-тетраметилгексадецил-р-П-ксилоза может быть использована в качестве матричного липида для in meso кристаллизации. Исследование рентгеноструктурных данных от кристаллов, полученных в кубических фазах моноолеина и 1-0-(3,7,11,15)-тетраметилгексадецил-Р-0-ксилозы, показало, что молекулы матричных липидов входят в белковый кристалл в обоих случаях и стабилизируют белковый тример, образуя специфические контакты с АК остатками в цитоплазматических частях спиралей А-В и Тир 157 в E-спирали соседней молекулы белка.

Список публикаций по теме диссертации

1) Решетняк, А. Б., Борщевский, В. П., Кларе, Й., Моисеева, Е. С., Энгельгардг, М., Бюлдт, Г., & Горделий, В. И. (2008). Сравнительный анализ структур мембранного белка сенсорного родопсина II в комплексе с трансдюсером и без него. Поверхность. Рентгеновские, Синхротроныые и Нейтронные Исследования 12, 78-84.

2) Моисеева, Е. С., Решетняк, А. Б., Борщевский, В. И., Баекен, К., Бюлдт, Г., & Горделий, В. И. (2009). Сравнительный анализ качества кристаллов мембранного белка бактериородопсина при кристаллизации в октилглюкозиде и октилтиоглюкозиде. Поверхность. Рентгеновские, Синхротронные и Нейтронные Исследования I, 34-37.

3) Borshchevskiy, V., Efremov, R., Moiseeva, E., Biildt, G. & Gordeliy, V. (2010). Overcoming merohedral twinning in crystals of bacteriorhodopsin grown in lipidic mesophase. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 66, 26-32.

4) Borshchevskiy, V., Moiseeva, E., Kuklin, A., Biildt, G., Hato, M., Gordeliy, V. (2010). Isoprenoid-chained lipid P-XylOCi6+4—A novel molecule for in meso membrane protein crystallization. Journal of Crystal Growth 312, 3326-3330.

Использованная литература

[1] R.Efremov, V.I.Gordeliy, J.Heberle, G.Buldt, Time-resolved microspectroscopy on a single crystal of

bacteriorhodopsin reveals lattice-induced differences in the photocycle kinetics, BiophysJ. 91 (2006) 1441-1451.

[2] V.I.Gordeliy, R.Schlesinger, R.Efremov, G.Buldt, J.Heberle, Crystallization in lipidic cubic phases: A case

study with Bacteriorhodopsin, в : B.Selinsky (ред.), Membrane Protein Protocols: Expression, Purification, and Crystallization, Humana Press, Totowa NJ, (2003) 305-316.

[3] J.K.Lanyi, What is the real crystallographic structure of the L photointermediate of bacteriorhodopsin?,

Bioehim.Biophys.Acta 1658(2004) 14-22.

[4] Y.Matsui, K.Sakai, M.Murakami, Y.Shiro, S.Adachi, H.Okumura, T.Kouyama, Specific damage induced by

X-ray radiation and structural changes in the primary photoreaction of bacteriorhodopsin, J.Mol.Biol. 324 (2002)469-481.

[5] M.Yamamoto, N.Hayakawa, M.Murakami, T.Kouyama, Crystal structures of different substates of

bacteriorhodopsin's M intermediate at various pH levels, J.Mol.Biol. 393 (2009) 559-573. [61 T.Hirai, S.Subramaniam, J.K.Lanyi, Structural snapshots of conformational changes in a seven-helix membrane protein: lessons from bacteriorhodopsin, Current Opinion in Structural Biology 19 (2009) 433-439.

[7] V.Borshchevskiy, R.Efremov, E.Moiseeva, G.Buldt, V.Gordeliy, Overcoming merohedral twinning in crystals

of bacteriorhodopsin grown in lipidic mesophase, Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr. 66 (2010) 2632-

[8] H.J.Sass, G.Buldt, R.Gessenich, D.Hehn, D.Neff, R.Schlesinger, J.Berendzen, P.Ormos, Structural alterations

for proton translocation in the M state of wild-type bacteriorhodopsin, Nature 406 (2000) 649-653.

[9] B.Schobert, J.Cupp-Vickery, V.Hornak, S.O.Smith, J.K.Lanyi, Crystallographic structure of the К

intermediate of bacteriorhodopsin: Conservation of free energy after photoisomerization of the retinal, J.Mol.Biol. 321 (2002) 715-726.

[10] J.K.Lanyi, B.Schobert, Mechanism of proton transport in bacteriorhodopsin from crystallographic structures of

the K, L, M-l, M-2, and M-2 ' intermediates of the photocycle, J.Mol.Biol. 328 (2003) 439-450.

[11] J.K.Lanyi, B.Schobert, Structural changes in the L photointermediate of bacteriorhodopsin, J.Mol.Biol. 365

(2007) 1379-1392.

[12] T.Kouyama, T.Nishikawa, T.Tokuhisa, H.Okumura, Crystal structure of the L intermediate of

bacteriorhodopsin: Evidence for vertical translocation of a water molecule during the proton pumping cycle, J.Mol.Biol. 335 (2004) 531-546.

[13] K.Edman, A.Royant, G.Larsson, F.Jacobson, T.Taylor, D.van der Spoel, E.M.Landau, E.Pebay-Peyroula,

R.Neutze, Deformation of helix C in the low temperature L-intermediate of bacteriorhodopsin, J.Biol.Chem. 279 (2004) 2147-2158.

[14] A.Royant, K.Edman, T.Ursby, E.Pebay-Peyroula, E.M.Landau, R.Neutze, Helix deformation is coupled to

vectorial proton transport in the photocycle of bacteriorhodopsin, Nature 406 (2000) 645-648.

[15] K.Edman, P.Nollert, A.Royant, H.Belrhali, E.Pebay-Peyroula, J.Hajdu, R.Neutze, E.M.Landau, High-

resolution X-ray structure of an early intermediate in the bacteriorhodopsin photocycle, Nature 401 (1999) 822-826.

[16] K.Takeda, Y.Matsui, N.Kamiya, S.Adachi, H.Okumura, T.Kouyama, Crystal structure of the M intermediate

of bacteriorhodopsin: allosteric structural changes mediated by sliding movement of a transmembrane helix, J.Mol.Biol. 341 (2004) 1023-1037.

[17] J.Lanyi, B.Schobert, Crystallographic structure of the retinal and the protein after deprotonation of the Schiff

base: the switch in the bacteriorhodopsin photocycle, J.Mol.Biol. 321 (2002) 727-737.

[18] B.Schobert, L.S.Brown, J.K.Lanyi, Crystal lographic structures of the M and N intermediates of

bacteriorhodopsin: assembly of a hydro gen-bonded chain of water molecules between Asp-96 and the retinal Schiffbase, J.Mol.Biol. 330 (2003) 553-570.

[19] M.T.Facciotti, S.Rouhani, F.T.Burkard, F.M.Betancourt, K.H.Downing, R.B.Rose, G.McDcrmott,

R.M.Glaeser, Structure of an early intermediate in the M-state phase of the bacteriorhodopsin photocycle, BiophysJ. 81 (2001) 3442-3455.

[20] E.Garman, Radiation damage in macromolecular crystallography: what is it and why should we care?, Acta

Crystallographica Section D 66 (2010) 339-351.

[21] J.Kmetko, N.S.Husseini, M.Naides, Y.Kalinin, R.E.Tborne, Quantifying X-ray radiation damage in protein

crystals at cryogenic temperatures, Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr. 62 (2006) 1030-1038.

[22] H.Luecke, B.Schobert, H.T.Richter, J.P.Cartailler, J.K.Lanyi, Structure of bacteriorhodopsin at 1.55 angstrom

resolution, J.Mol.Biol. 291 (1999) 899-911.

[23] V.Borshchevskiy, E.Moiseeva, A.Kuklin, G.Buldt, M.Hato, V.Gordeliy, Isoprenoid-chaincd lipid p-

XylOCie-n-A novel molecule for in meso membrane protein crystallization, Journal of Crystal.Growth 312(2010) 3326-3330.

Связь работы с научными программами. Работа выполнялась в соответствш! с планом НИР по государственным контрактам № 02.740.11.0299 по теме: «Клеточная биология и физические свойства мембранных белков», № 02.740.11.5010 по теме: «Определение молекулярных механизмов первого шага трансформации энергии в клетке», №П974 по теме: «Сверхчувствительные биосенсоры на основе наноматериалов» и №П211 по теме «Исследование молекулярного механизма создания электрохимического потенциала в биоэнергетике клетки» Федеральной Целевой Программы "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009-2013 годы. Работа поддержана программой "Chaires d'excellence" 2008 года Национального Исследователького Агенства Франции, специальным соглашением 5.1 CEA(IBS) - HGF(FZJ) и грантом Марии Кюри для поддержки и карьерного развития исследователей (FP7-PEOPLE-2007-1-1-ITN), а также грантом ЕС FP7 консорциума EDICT (HEALTH-201924).

Борщевский Валентин Иванович

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА ТРАНСПОРТА ПРОТОНА БАКТЕРИОРОДОПСИНОМ: ПОЛУЧЕНИЕ ВЫСОКОКАЧЕСТВЕННЫХ РЕНТГЕНОСТРУКТУРНЫХ ДАННЫХ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СОСТОЯНИЙ

Подписано® печать27.12.10. Формат 60x84 1/16 . Усл.псч.л.1,0. Уч.-изд.л.1,0. Тираж 100 экз. Заказ № ф-204

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Мосховсхий физихо-технический институт (государственный университет)» Отдел автоматизированных издательских систем «ФИЗТЕХ-ПОЛИГРАФ» 141700, Моск.обл., г.Долгопрудный, Институтский пср.,9

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Борщевский, Валентин Иванович

СОДЕРЖАНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Бактериородопсин.

1.1.1. Научная значимость и общая характеристика.

1.1.2. Фотоцикл.

1.1.3. Методы кристаллизации.

1.1.4. Моноэдрическое двойникование кристаллов.

1.1.5. Кристаллографические структуры основного состояния.

1.1.6. Кристаллографические структуры переходных состояний.

1.2. Радиационное повреждение белковых кристаллов.

1.2.1. Исторический обзор.

1.2.2. Глобальные и специфические проявления.

1.2.3. Механизмы возникновения.

1.2.4. Исследования кристаллов бактериородопсина.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Получение и кристаллизация бактериородопсина.

2.2. Тестирование качества дифракции кристаллов.

2.3. Определение фактора двойникования.

2.4. Зависимость роста В-фактора от дозы рентгеновского излучения, поглощенной кристаллом белка.

2.5. Экспериментальные разностные Фурье-карты электронных плотностей.

2.6. Исследование радиационного повреждения кристаллов бактериородопсина.

2.6.1. Сбор, интегрирование и шкалирование кристаллографических данных.

2.6.2. Построение и уточнение моделей.

2.6.3. Построение карт электронных плотностей.

2.7. Исследование образования оранжевой формы бактериородопсина.

2.7.1. Сбор, интегрирование и шкалирование кристаллографических данных.

2.7.2. Построение и уточнение моделей.

2.7.3. Спектроскопические методы исследования.

2.8. Исследование структуры основного состояния бактериородопсина.

2.8.1. Сбор, интегрирование и шкалирование кристаллографических данных.

2.8.2. Построение и уточнение моделей.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ.

3.1. Двойникование кристаллов бактериородопсина.

3.1.1. Прямое наблюдение двойниковых доменов.

3.1.2. Связь скорости роста и фактора двойникования.

3.1.3. Механизмы образования двойникования.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование механизма транспорта протона бактериородопсином: получение высококачественных рентгеноструктурных данных функциональных состояний"

Ключевым явлением в биоэнергетике клетки является синтез аденозинтрифосфата (АТФ). Создание АТФ требует наличия градиента электрохимического потенциала на мембранах клеток или органелл, его синтезирующих. Данный градиент создается посредством контролируемых ферментами окислительно-восстановительных или фотохимических реакций. Простейшим и наиболее изученным белком, преобразующим энергию света в электрохимический потенциал, является бактериородопсин (БР). Этот трансмембранный белок археи Halobacterium salinarum, поглощая свет, переносит протоны из цитоплазмы во внеклеточное (ВК) пространство. БР, благодаря доступности в сравнительно больших количествах, простоте очистки и стабильности, в течение последних 30 лет остается одним из самых интенсивно изучаемых мембранных белков.

Актуальность и состояние исследуемых проблем. Для понимания молекулярного механизма работы БР необходимо знать структурные изменения, вызванные поглощением света ретиналем, которые сопровождают фотоцикл белка и приводят к направленному транспорту протона. Наиболее эффективным подходом к решению данной задачи в настоящее время является получение атомарных структур функциональных состояний рабочего цикла БР с помощью рентгеновской кристаллографии высокого разрешения. Использование данного метода требует наличия высокоупорядоченных трехмерных кристаллов белка с одной стороны и эффективных методов фиксирования промежуточных состояний с другой. Способы получения переходных состояний были исследованы ранее [1]. Кристаллы же могут быть получены при использований нового метода кристаллизации in meso, заключающегося в использовании липидной биконтинуальной мезофазы для кристаллизации мембранных белков [2]. Кристаллизация in meso остается в настоящее время недостаточно изученным методом, что существенно ограничивает его потенциальную применимость для мембранных белков. Несмотря на это, in meso подход уже позволил получить структуру .основного и некоторых промежуточных состояний БР. Однако, опубликованные структуры промежуточных состояний, полученные разными группами, сильно различаются, что ведет к противоречивым заключениям относительно механизмов переноса протона [3-7]. Причины этого в настоящее время остаются до конца невыясненными. Предположительно, отсутствие согласованности может быть связано с недостаточно высоким качеством дифракционных данных, моноэдрическим двойникованием и радиационным повреждением кристаллов, а также возникновением новых состояний белка под действием рентгеновских квантов.

Целью исследования являлось выяснение причин, приводящих к возникновению противоречий в области рентгеноструктурного анализа функциональных состояний БР, и поиск путей преодоления сопряженных с ними проблем. Дополнительными задачами работы являлись исследование основного состояния БР с разрешением 1.26 А, достигнутым для данного белка впервые, а также исследование липидного окружения молекулы белка в кристаллах, полученных в мезофазах моноолеина (МО) и 1-0-(3,7,11,15)-тетраметилгексадецил-Р-0-ксилозы (Р-Ху10С1б+4) с участием детергентов различного типа.

Научная новизна. В работе впервые найдены кристаллизационные условия, при которых фактор двойникования кристаллов БР симметрии Р63 можно определить путем визуального изучения. Это позволило значительно упростить процедуру поиска недвойниковых кристаллов, необходимых для получения высококачественных ренттеноструктурных данных функциональных состояний БР. Впервые систематически исследована проблема специфического повреждения БР рентгеновскими квантами. В результате продемонстрировано, что специфическое радиационное разрушение, происходящее преимущественно в активном центре молекулы, может приводить к артефактам при анализе структур переходных состояний белка, а также впервые получена количественная зависимость доли белка с разрушенным активным центром от дозы радиации, поглощенной кристаллом белка. В данных расчетах была впервые использована методика оценки дозы, поглощенной белковым кристаллом, основанная на увеличении его В-фактора при радиационном повреждении кристалла.

Благодаря использованию высокоупорядоченных кристаллов, а также методике снятия структурных данных со смещением измерительного пучка вдоль кристалла БР, впервые оказалось возможным установить структуру оранжевой формы БР, образующейся при поглощении белком сверхмалых доз рентгеновского излучения. При этом кристалл поглощал около О.ОАМГр при сборе одного набора данных, что на один-два порядка ниже, чем доза рентгеновского облучения, которую поглощали кристаллы БР при сборе рентгеноструктурных данных, опубликованных в литературе.

В работе обсуждается структура основного состояния БР с разрешением 1.26А, которое впервые достигнуто для БР. Высокое разрешение модели позволило обнаружить новые структурные элементы, необходимые для понимания транспорта протона белком.

В рамках работы впервые проводится систематическое исследование роли детергента в стабилизации кристаллов БР симметрии Р63, демонстрируется, что молекула детергента не входит в состав кристаллов.

Кроме этого, в работе впервые продемонстрирована возможность использования р-ХуЮС]б+4 в качестве матричного липида для in meso кристаллизации, и показано, что молекулы матричных липидов (МО, p-XylOCi6+4) входят в кристалл и стабилизируют белковый тример, образуя специфические контакты с аминокислотными (АК) остатками в цитоплазматических (ЦП) частях спиралей А-В и Тир 157 в E-спирали соседней молекулы БР.

Практическая значимость работы. В ходе работы были решены основные противоречия в области рентгеноструктурного анализа функциональных состояний БР и показаны пути решения основных проблем. Разработанные подходы позволяют получить достоверные структуры основного и переходных состояний, что имеет важное фундаментальное значение, поскольку позволяет установить атомарные детали одного из наиболее общих процессов в жизни клетки - создание электрохимического потенциала на мембране.

Кроме этого, решение конкретных подзадач работы имеет собственное практическое значение. Так работа представляет интерес для белковой кристаллографии вообще. Новые подходы к решению проблемы двойникования могут быть использованы в • других лабораториях для устранения данного дефекта кристаллов белка. Результаты исследования радиационного повреждения активного центра БР могут быть использованы при интерпретации рентгеноструктурных данных кристаллов других белков. Методика оценки дозы, поглощенной кристаллом БР, основанная на увеличении В-фактора кристалла, может быть использована, когда размер кристалла белка больше или сравним с размером измерительного пучка.

Исследования роли молекул детергента и матриксообразующего липида в кристаллизации белка важны для понимания механизма кристаллизации in meso и дальнейшего развития метода, поскольку дают представление о роли данных молекул в стабилизации кристалла.

Диссертационная работа состоит из введения, трех глав и заключения. Во введении рассмотрены актуальность и современное состояние исследуемой темы, выделены основные проблемы и сформулированы цели данной работы, а также описана структура диссертации. Первая глава представляет собой литературный обзор. Особое внимание уделено опубликованным рентгеновским структурам основного состояния и переходных состояний БР, отличиям между существующими моделями переходных состояний и радиационному повреждению белковых кристаллов рентгеновским излучением при криогенных температурах. Во второй главе описаны материалы, экспериментальные процедуры, оборудование и рентгеноструктурные методы,

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Борщевский, Валентин Иванович

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ РАБОТЫ

I) Исследованы основные проблемы, препятствующие получению высококачественных рентгеноструктурных данных функциональных состояний БР:

1) Впервые найдены кристаллизационные условия, при которых фактор двойникования кристаллов БР симметрии Р63 можно определить путем визуального изучения. Это позволило значительно упростить процедуру поиска недвойниковых кристаллов, необходимых для получения высококачественных рентгеноструктурных данных функциональных состояний БР.

2) Путем статистического анализа показано, что замедленный рост кристаллов БР (в течение более 3 месяцев) благоприятствует образованию кристаллов с низким и нулевым фактором двойникования. Этот результат позволил увеличить выход низко- и недвойниковых кристаллов при кристаллизации БР.

3) Показано, что активный центр БР подвержен-радиационному повреждению при дозах, порядка которых поглощали кристаллы при получении опубликованных рентгеноструктурных моделей белка. Впервые продемонстрировано, что радиолиз активного центра может быть ошибочно истолкован как функциональные К- и Ь-состояние белка.

4) Получена количественная оценка зависимости доли белка с поврежденным активным центром от поглощенной дозы. Показано, что поглощение кристаллом \МГр рентгеновского излучения приводит к повреждению активного центра у -10% белковых молекул. Для этого разработана методика количественной оценки дозы рентгеновского излучения, поглощенной кристаллом, основанная на изменении его глобальных характеристик при радиационном повреждении кристалла. Данная информация необходима при планировании эксперимента для получения достоверных моделей переходных состояний БР.

5) Установлены структурные изменения, сопровождающие образование оранжевой формы БР. Использование высокоупорядоченных кристаллов, а также методики снятия структурных данных со смещением измерительного пучка вдоль кристалла БР позволили уменьшить дозу, поглощенную кристаллом во время измерения набора до -0.04 МГр. Данная информация необходима для корректной интерпретации структурных данных переходных состояний БР.

II) Исследован ряд моделей основного состояния белка с разрешением, достигающим 1.26Á. Показаны новые структурные элементы, необходимые для понимания транспорта протона белком.

III) Исследованы рентгеноструктурные данные от кристаллов БР с разрешением 1.26-1.94Á, выращенных in meso с использование 6 различных детергентов. Молекулы детергента не обнаружены в составе белковых кристаллов.

IV) Показано, что 1Ю-(3,7,11,15)-тетраметилгексадецил-[3-0-ксилоза может быть использована в качестве матричного липида для in meso кристаллизации. Исследование рентгеноструктурных данных от кристаллов, полученных в кубических фазах моноолеина и 1-0-(3,7,11,15)-тетраметилгексадецил-р-0-ксилозы, показало, что молекулы матричных липидов входят в белковый кристалл в обоих случаях и стабилизируют белковый тример, образуя специфические контакты с АК остатками в ЦП частях спиралей А-В и Тир157 в E-спирали соседней молекулы белка.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Борщевский, Валентин Иванович, Москва

1. Efremov R. et al., Time-resolved microspectroscopy on a single crystal ofbacteriorhodopsin reveals lattice-induced differences in the photocycle kinetics, BiophysJ. 91 (2006) 1441-1451.

2. V.I.Gordeliy et al., Crystallization in lipidic cubic phases: A case study with

3. Bacteriorhodopsin, в: Membrane Protein Protocols: Expression, Purification, and Crystallization, под ред. B.Selinsky, изд.: Humana Press, Totowa NJ, (2003) 305-316.

4. Lanyi J.K., What is the real crystallographic structure of the L photointermediate ofbacteriorhodopsin?, Biochim.Biophys.Acta 1658 (2004) 14-22.

5. Matsui Y. et al., Specific damage induced by X-ray radiation and structural changes inthe primary photoreaction of bacteriorhodopsin, J.Mol.Biol. 324 (2002) 469-481.

6. Yamamoto M. et al., Crystal structures of different substates of bacteriorhodopsin's Mintermediate at various pH levels, J.Mol.Biol. 393 (2009) 559-573.

7. Hirai T. et al., Structural snapshots of conformational changes in a seven-helix membraneprotein: lessons from bacteriorhodopsin, Current Opinion in Structural Biology 19 (2009) 433-439.

8. Borshchevskiy V. et al., Overcoming merohedral twinning in crystals ofbacteriorhodopsin grown in lipidic mesophase, Acta Crystallogr.D.Biol. Crystallogr. 66 (2010) 26-32.

9. Oesterhelt D. et Stoeckenius W., Rhodopsin-like protein from the purple membrane of

10. Halobacterium halobium, Nat.New Biol. 233 (1971) 149-152.

11. Henderson R., The structure of the purple membrane from Halobacterium hallobium:analysis of the X-ray diffraction pattern, J.Mol.Biol. 93 (1975) 123-138.

12. Spudich J.L., The multitalented microbial sensory rhodopsins, Trends Microbiol. 142006) 480-487.

13. Cherezov V. et al., High-resolution crystal structure of an engineered human beta2adrenergic G protein-coupled receptor, Science 318 (2007) 1258-1265.

14. Hanson M.A. et al., A specific cholesterol binding site is established by the 2.8 angstromstructure of the human beta(2)-adrenergic receptor, Structure 16 (2008) 897-905.

15. Wacker D. et al., Conserved Binding Mode of Human beta(2) Adrenergic Receptor1.verse Agonists and Antagonist Revealed by X-ray Crystallography, Journal of the American Chemical Society 132 (2010) 11443-11445.

16. Jaakola V.P. et al., The 2.6 angstrom crystal structure of a human A2A adenosinereceptor bound to an antagonist, Science 322 (2008) 1211-1217.

17. Wu B. et al., Structures of the CXCR4 Chemokine GPCR with Small-Molecule and

18. Cyclic Peptide Antagonists, Science (2010)

19. Sprang S.R., Structural biology: a receptor unlocked, Nature 450 (2007) 355-356.

20. Lefkowitz R.J. et al., A crystal clear view of the beta2-adrenergic receptor,

21. Nat.Biotechnol. 26 (2008) 189-191.

22. Schobert В. et al., Crystallographic structure of the К intermediate of bacteriorhodopsin:

23. Conservation of free energy after photoisomerization of the retinal, J.Mol.Biol. 321 (2002)715-726.

24. Kolbe M. et al., Structure of the light-driven chloride pump halorhodopsin at 1.8 Aresolution, Science 288 (2000) 1390-1396.

25. Luecke H. et al., Crystal structure of sensory rhodopsin II at 2.4 angstroms: insights intocolor tuning and transducer interaction, Science 293 (2001) 1499-1503.

26. Luecke H. et al., Crystallographic structure of xanthorhodopsin, the light-driven protonpump with a dual chromophore, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 105 (2008) 1656116565.

27. Okada T. et al., The retinal conformation and its environment in rhodopsin in light of anew 2.2 A crystal structure, J.Mol.Biol. 342 (2004) 571-583.

28. Murakami M. et Kouyama T., Crystal structure of squid rhodopsin, Nature 453 (2008)363.367.

29. Warne T. et al., Structure of a beta 1-adrenergic G-protein-coupled receptor, Nature 4542008)486-491.

30. Ефремов Р.Г., Исследование структуры и механизма функционирования ретинальсодержащих мембранных белков: кристаллизация и фиксация промежуточных состояний белков в кристаллах, Московский физико-технический институт (ГУ) (2005).

31. Neutze R. et al., Bacteriorhodopsin: a high-resolution structural view of vectorial protontransport, Biochim.Biophys.Acta 1565 (2002) 144-167.

32. Cao Y. et al., Relationship of proton release at the extracellular surface to deprotonationof the schiff base in the bacteriorhodopsin photocycle, Biophys.J. 68 (1995) 15181530.

33. Brown L.S. et al., Glutamic acid 204 is the terminal proton release group at theextracellular surface of bacteriorhodopsin, J.Biol. Chem. 270 (1995) 27122-27126.

34. Balashov S.P. et al., Glutamate-194 to cysteine mutation inhibits fast light-inducedproton release in bacteriorhodopsin, Biochemistry 36 (1997) 8671-8676.

35. Henderson R. et Unwin P.N., Three-dimensional model of purple membrane obtained byelectron microscopy, Nature 257 (1975) 28-32.

36. Henderson R. et al., Model for the structure of bacteriorhodopsin based on highresolution electron cryo-microscopy, J.Mol.Biol. 213 (1990) 899-929.

37. Grigorieff N. et al., Electron-crystallographic refinement of the structure ofbacteriorhodopsin, J.Mol.Biol. 259 (1996) 393-421.

38. Kimura Y. et al., Surface of bacteriorhodopsin revealed by high-resolution electroncrystallography, Nature 389 (1997) 206-211.

39. Mitsuoka K. et al., The structure of bacteriorhodopsin at 3.0 A resolution based onelectron crystallography: implication of the charge distribution, J.Mol.Biol. 286 (1999) 861-882.

40. Michel H. et Oesterhelt D., Three-dimensional crystals of membrane proteins:bacteriorhodopsin, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A 77 (1980) 1283-1285.

41. Landau E.M. et Rosenbusch J.P., Lipidie cubic phases: A novel concept for thecrystallization of membrane proteins, Proc.Natl.Acacl.Sci.USA 93 (1996) 1453214535.

42. Pebay-Peyroula E. et al., X-ray structure of bacteriorhodopsin at 2.5 angstroms frommicrocrystals grown in lipidic cubic phases, Science 277 (1997) 1676-1681.

43. Caffrey M. et Cherezov V., Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases,

44. Nature Protocols 4 (2009) 706-731.

45. Scriven L.E., Equilibrium Bicontinuous Structure, Nature 263 (1976) 123-125.

46. Cherezov V. et al., Crystallization screens: compatibility with the lipidic cubic phase forin meso crystallization of membrane proteins, Biophys.J. 81 (2001) 225-242.

47. Chung H. et Caffrey M., The curvature elastic-energy function of the lipid-water cubicmesophase, Nature 368 (1994) 224-226.

48. Chung H. et Caffrey M., The neutral area surface of the cubic mesophase: location andproperties, Biophys.J. 66 (1994) 377-381.

49. Nollert P. et al., Molecular mechanism for the crystallization of bacteriorhodopsin inlipidic cubic phases, FEBSLett. 504 (2001) 179-186.

50. Caffrey M., Membrane protein crystallization, J.Struct.Biol. 142 (2003) 108-132.

51. Моисеева E.C., Кристаллизация мембранных белков методом in meso, Московскийфизико-технический институт (ГУ) (2010).

52. Luecke H. et al., Structure of bacteriorhodopsin at 1.55 angstrom résolution, J.Mol.Biol.291 (1999)899-911.

53. Royant A. et al., X-ray structure of sensory rhodopsin II at 2.1-angstrom resolution,

54. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98 (2001) 10131-10136.

55. Vogeley L. et al., Anabaena sensory rhodopsin: A photochromic color 0 sensor at 2.0angstrom, Science 306 (2004) 1390-1393.

56. Gordeliy V.I. et al., Molecular basis of transmembrane signalling by sensory rhodopsin1.-transducer complex, Nature 419 (2002) 484-487/

57. Cherezov V. et al., In meso structure of the cobalamin transporter, BtuB, at 1.95 Aresolution, J.Mol.Biol. 364 (2006) 716-734.

58. Cherezov V. et al., In meso crystal structure and docking simulations suggest analternative proteoglycan binding site in the OpcA outer membrane adhesin, Proteins 71 (2008) 24-34.

59. Wadsten P. et al., Lipidic sponge phase crystallization of membrane proteins, J.Mol.Biol.364 (2006) 44-53.

60. Cherezov V. et al., Room to move: crystallizing membrane proteins in swollen lipidicmesophases, J.Mol.Biol. 357(2006) 1605-1618.

61. Hofer N. et al., Crystallizing Transmembrane Peptides in Lipidic Mesophases, Biophys.J.99 (2010) L23-L25.

62. Kouyama T. et al., Polyhedral assembly of a membrane protein in its three-dimensionalcrystal, J.Mol.Biol. 236 (1994) 990-994.

63. Takeda K. et al., A novel three-dimensional crystal of bacteriorhodopsin obtained bysuccessive fusion of the vesicular assemblies, J.Mol.Biol. 283 (1998) 463-474.

64. Denkov N.D. et al., Electron cryomicroscopy of bacteriorhodopsin vesicles: mechanismof vesicle formation, Biophys.J. 74 (1998) 1409-1420.

65. Deniaud A. et al., Crystallography of membrane proteins: from crystallization tostructure, Methods Mol.Biol. 654 (2010) 79-103.

66. Faham S. et Bowie J.U., Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membraneproteins yields a monomelic bacteriorhodopsin structure, J.Mol.Biol 316 (2002) 1-6.

67. Schertler G.F. et al., Orthorhombic crystal form of bacteriorhodopsin nucleated onbenzamidine diffracting to 3.6 A resolution, J.Mol.Biol. 234 (1993) 156-164.

68. Essen L. et al., Lipid patches in membrane protein oligomers: crystal structure of thebacteriorhodopsin-hpid complex, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 95 (1998) 1167311678.

69. V.Gordeliy et E.Moiseeva, Crystallization of membrane proteins, в: Soft matter: From

70. Synthetic to Biological Materials , под ред. J.K.G.Dhont et al., изд.: FZ-Juelich , Juelich, (2008)

71. Michel H., Crystallization of Membrane Proteins, (1991)

72. Parsons S., Introduction to twinning, Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr. 59 (2003)1995-2003.

73. Dauter Z., Twinned crystals and anomalous phasing, Acta Cryst.D 59 (2003) 2004-2016.

74. Efremov R. et al., Physical detwinning of hemihedrally twinned hexagonal crystals ofbacteriorhodopsin, Biophys.J. 87 (2004) 3608-3613.

75. Yeates Т.О., Detecting and overcoming crystal twinning, Methods Enzymol. 276 (1997)344.358.

76. Royant A. et al., Detection and characterization of merohedral twinning in two proteincrystals: bacteriorhodopsin and p67(phox), Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr. 58 (2002)784-791.

77. Redinbo M.R. et al., The 1.5-A crystal structure of plastocyanin from the green alga

78. Chlamydomonas reinhardtii, Biochemistry 32 (1993) 10560-10567.

79. Henderson R. et Moffat J.K., The difference Fourier technique in protein crystallography:errors and their treatment, Acta Cryst.B 27 (1971) 1414-1420.

80. Schlichting I. et al., Crystal-Structure of Photolyzed Carbonmonoxy-Myoglobin, Nature371 (1994) 808-812.

81. Srajer V. et al., Photolysis of the carbon monoxide complex of myoglobin: nanosecondtime-resolved crystallography, Science 274 (1996) 1726-1729.

82. Srajer V. et al., Protein conformational relaxation and ligand migration in myoglobin: ananosecond to millisecond molecular movie from time-resolved Laue X-ray diffraction, Biochemistry 40 (2001) 13802-13815.

83. Schotte F. et al., Watching a protein as it functions with 150-ps time-resolved x-raycrystallography, Science 300 (2003) 1944-1947.

84. Genick U.K. et al., Structure of a protein photocycle intermediate by millisecond timeresolved crystallography, Science 275 (1997) 1471-1475.

85. Genick U.K. et al., Structure at 0.85 A resolution of an early protein photocycleintermediate, Nature 392 (1998) 206-209.

86. Perman B. et al., Energy transduction on the nanosecond time scale: early structuralevents in a xanthopsin photocycle, Science 279 (1998) 1946-1950.

87. Ren Z. et al., A molecular movie at 1.8 A resolution displays the photocycle ofphotoactive yellow protein, a eubacterial blue-light receptor, from nanoseconds to seconds, Biochemistry 40 (2001) 13788-13801.

88. Moukhametzianov R. et al., Development of the signal in sensory rhodopsin and itstransfer to the cognate transducer, Nature 440 (2006) 115-119.

89. Edman K. et al., High-resolution X-ray structure of an early intermediate in thebacteriorhodopsin photocycle, Nature 401 (1999) 822-826.

90. Sass H.J. et al., Structural alterations for proton translocation in the M state of wild-typebacteriorhodopsin, Nature 406 (2000) 649-653.

91. Royant A. et al., Helix deformation is coupled to vectorial proton transport in thephotocycle of bacteriorhodopsin, Nature 406 (2000) 645-648.

92. Kouyama T. et al., Crystal structure of the L intermediate of bacteriorhodopsin: Evidencefor vertical translocation of a water molecule during the proton pumping cycle, J.Mol.Biol. 335 (2004) 531-546.

93. Edman K. et al., Deformation of helix C in the low temperature L-intermediate ofbacteriorhodopsin, J.Biol.Chem. 279 (2004) 2147-2158.

94. Takeda K. et al., Crystal structure of the M intermediate of bacteriorhodopsin: allostericstructural changes mediated by sliding movement of a transmembrane helix, J.Mol.Biol. 341 (2004) 1023-1037.

95. Lanyi J. et Schobert B., Crystallographic structure of the retinal and the protein afterdeprotonation of the Schiff base: the switch in the bacteriorhodopsin photocycle, J.Mol.Biol. 321-(2002) 727-737.

96. Lanyi J.K. et Schobert B., Mechanism of proton transport in bacteriorhodopsin fromcrystallographic structures of the K, L, M-l,' M-2, and M-2 ' intermediates of the photocycle, J.Mol.Biol. 328 (2003) 439-450.

97. Schobert B. et al., Crystallographic structures of the M and N intermediates ofbacteriorhodopsin: assembly of a hydrogen-bonded chain of water molecules between Asp-96 and the retinal Schiff base, J.Mol.Biol. 330 (2003) 553-570.

98. Lanyi J.K. et Schobert B., Structural changes in the L photointermediate ofbacteriorhodopsin, J.Mol.Biol. 365 (2007) 1379-1392.

99. Facciotti M.T. et al., Structure of an early intermediate in the M-state phase of thebacteriorhodopsin photocycle, Biophys.J. 81 (2001) 3442-3455.

100. Belrhali H. et al., Protein, lipid and water organization in bacteriorhodopsin crystals: amolecular view of the purple membrane at 1.9 A resolution, Structure. 7 (1999) 909-917.

101. Luecke H. et al., Proton transfer pathways in bacteriorhodopsin at 2.3 angstromresolution, Science 280 (1998) 1934-1937.

102. Kandori H., Role of internal water molecules in bacteriorhodopsin, Biochim.Biophys.Acta1460(2000) 177-191.

103. Maeda A. et al., Water as a cofactor in the unidirectional light-driven proton transfersteps in bacteriorhodopsin, Photochem.Photobiol. 82 (2006) 1398-1405.

104. Hatanaka M. et al., Trp86 —> Phe replacement in bacteriorhodopsin affects a watermolecule near Asp85 and light adaptation, Biochemistry 36 (1997) 5493-5498.

105. Marti T. et al., The retinylidene Schiff base counterion in bacteriorhodopsin,

106. J.Biol.Chem. 266 (1991) 18674-18683.

107. Ihara K. et al., Met-145 is a key residue in the dark adaptation of bacteriorhodopsinhomologs, BiophysJ. 61 (1994) 1187-1191.

108. Weidlich O. et al., Steric interaction between the 9-methyl group of the retinal andtryptophan 182 controls 13-cis to all-trans reisomerization and proton uptake in the bacteriorhodopsin photocycle, Biochemistry 35 (1996) 10807-10814.

109. Sonar S. et al., A redirected proton pathway in the bacteriorhodopsin mutant Tyr-57-

110. Asp. Evidence for proton translocation without Schiff base deprotonation, J.Biol.Chem. 269 (1994) 28851-28858.

111. Delaney J.K. et al., Molecular mechanism of protein-retinal coupling inbacteriorhodopsin, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A 92 (1995) 11120-11124.

112. Earnest T.N. et al., Orientation of the Bacteriorhodopsin Chromophore Probed by

113. Polarized Fourier-Transform Infrared Difference Spectroscopy, Biochemistry 25 (1986) 7793-7798.

114. Luecke H. et al., Coupling photoisomerization of retinal to directional transport inbacteriorhodopsin, J.MolBiol. 300 (2000) 1237-1255.

115. Luecke H. et al., Structural changes in bacteriorhodopsin during ion transport at 2angstrom resolution, Science 286 (1999) 255-261.

116. Rouhani S. et al., Crystal structure of the D85S mutant of bacteriorhodopsin: Model of an

117. O-like photocycle intermediate, Journal of Molecular Biology 313 (2001) 615628.

118. Okumura H. et al., Crystal structures of acid blue and alkaline purple forms ofbacteriorhodopsin, Journal of Molecular Biology 351 (2005) 481-495.

119. Facciotti M.T. et al., Crystal structure of the bromide-bound D85S mutant ofbacteriorhodopsin: Principles of ion pumping, Biophys.J. 85 (2003) 451-458.

120. Facciotti M.T. et al., Specificity of anion binding in the substrate pocket ofbacteriorhodopsin, Biochemistry 43 (2004) 4934-4943.

121. Facciotti M.T. et al., Crystal structures of bR(D85S) favor a model of bacteriorhodopsinas a hydroxyl-ion pump, Febs Letters 564 (2004) 301-306.

122. Maeda A. et al., Interaction of aspartate-85 with a water molecule and the protonated

123. Schiff base in the L intermediate of bacteriorhodopsin: a Fourier-transform infrared spectroscopic study, Biochemistry 33 (1994) 1713-1717.

124. Liu K. et al., Far-infrared VRT spectroscopy of two water trimer isotopomers:vibrationally averaged structures and rearrangement dynamics, Mol.Phys. 89 (1996) 1373-1396.

125. Garczarek F. et Gerwert K., Functional waters in intraprotein proton transfer monitoredby FTIR difference spectroscopy, Nature 439 (2006) 109-112.

126. Eigen M., Proton transfer, acid-base catalysis, and. enzymatic hydrolysis. Part I:

127. Elementary processes., Angew.Chem.Int.Edn Engl. 3 (1964) 1-19.

128. G.Zundel, в: The Hydrogen Bond—Recent Developments in Theoiy and Experiments,под ред. C.Sandoriy, изд.: Nort-Holland, Amsterdam, (1976) 683-766.114.115.116.117.118.119.120.121.122.123.124.125.126.127.128.129.130.131.132.

129. Keefe LJ. et al., The alpha aneurism: a structural motif revealed in an insertion mutant of staphylococcal nuclease, Proc.Natl.Acacl.Sci.U.S.A 90 (1993) 3275-3279.

130. Joshi M.K. et al., Importance of specific native lipids in controlling the photocycle of bacteriorhodopsin, Biochemistry 37 (1998) 14463-14470.

131. Subramaniam S. et Henderson R., Molecular mechanism of vectorial proton translocation by bacteriorhodopsin, Nature 406 (2000) 653-657.

132. Dracheva S. et al., Specific lipid requirements for normal function of bacteriorhodopsin (BR) photocycle, Biophys.J. 70 (1996) SU442-SU442.

133. Moukhametzianov R., X-ray Crystallographic Study on the Mechanisms of Bacteriorhodopsin and the Sensory Rhodopsin/Transducer Complex, FZ-Juelich (2006).

134. Zscherp C. et Heberle J., Infrared difference spectra of the intermediates L, M, N, and O of the bacteriorhodopsin photoreaction obtained by time-resolved attenuated total reflection spectroscopy, Journal of Physical Chemistry B 101 (1997) 1054210547.

135. Garman E., Radiation damage in macromolecular crystallography: what is it and why should we care?, Acta Crystallographica Section D 66 (2010) 339-351.

136. Blake C.C.F. et Phillips D.C., Effects of X-irradiation on single crystals of myoglobin, Proc.Symp.Biol.Effectrs Ionizing Mol.Level (1962) 183-191.

137. Helliwell J.R., Protein Crystal Perfection and the Nature of Radiation-Damage, J. Cryst. Growth 90 (1988) 259-272.

138. Augenstein L.G., Symposium on Information Theory in Biology, (1958) 287-292.

139. Hendrickson W.A., Radiation damage in protein crystallography, J.Mol.Biol. 106 (1976) 889-893.

140. Hendrickson W.A., Structural effects accompanying ligand change in crystalline lamprey hemoglobin, Biochim.Biophys.Acta 310 (1973) 32-38.

141. Fletterick R.J. et al., Low-resolution structure of the glycogen phosphorylase alpha monomer and comparison with phosphorylase beta, J.Mol.Biol. 103 (1976) 1-13.

142. Southworth-Davies R.J. et al., Observation of decreased radiation damage at higher dose rates in room temperature protein crystallography, Structure. 15 (2007) 15311541.

143. Sygusch J. et Allaire M., Sequential radiation damage in protein crystallography, Acta Crystallogr.A 44 ( Pt 4) (1988) 443-448.

144. Blundell T.L. et Johnson L., Protein Crystallography, ( 1976)

145. King M.V., Improved Resolution of X-Ray Diffraction Patterns of Protein Crystals at Low Temperature, Nature 181 (1958) 263-264.

146. Haas DJ. et Rossmann M.G., Crystallographic Studies on Lactate Dehydrogenase At-75 Degrees C, Acta Crystallographica Section B-Striictural Crystallography and Crystal Chemistry B 26 (1970) 998-&.

147. Hope H., Cryocrystallography of Biological Macromolecules A Generally Applicable Method, Acta Crystallographica Section B-Stnictural Science 44 (1988) 22-26.

148. Teng T.Y., Mounting of Crystals for Macromolecular Crystallography in A Freestanding Thin-Film, Journal of Applied Crystallography 23 (1990) 387-391.

149. Cosier J. et Glazer A.M., A Nitrogen-Gas-Stream Cryostat for General X-Ray-Diffraction Studies, Journal of Applied Crystallography 19 (1986) 105-107.

150. Rodgers D.W., Practical cryocrystallography, Macromolecular Crystallography, Pt A 276(1997) 183-203.

151. Garman E., Cool data: quantity AND quality, Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography 55 (1999) 1641-1653.

152. Garman E.F. et Schneider T.R., Macromolecular cryocrystallography, Journal of Applied Crystallography 30 (1997) 211-237.

153. Pflugrath J.W., Macromolecular cryocrystallography methods for cooling and mounting protein crystals at cryogenic temperatures, Methods 34 (2004) 415-423.

154. Garman E.F. et Nave C., Radiation damage in protein crystals examined under various conditions by different methods, J.Synchrotron.Radiat. 16 (2009) 129-132.

155. Nave C. et Garman E.F., Towards an understanding of radiation damage in cryocooled macromolecular crystals, Journal of Synchrotron Radiation 12 (2005) 257-260.

156. Diederichs K., Some aspects of quantitative analysis and correction of radiation damage, Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr. 62 (2006) 96-101.

157. Murray J. et Garman E., Investigation of possible free-radical scavengers and metrics for radiation damage in protein cryocrystallography, Journal of Synchrotron Radiation 9 (2002) 347-354.

158. Ravelli R.B.G. et al., Unit-cell volume change as a metric of radiation damage in crystals of macromolecules, Journal of Synchrotron Radiation 9 (2002) 355-360.

159. Kmetko J. et al., Quantifying X-ray radiation damage in protein crystals at cryogenic temperatures, Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr. 62 (2006) 1030-1038.

160. Weik M. et al., Specific chemical and structural damage to proteins produced by synchrotron radiation, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 97 (2000) 623-628.

161. Burmeister W.P., Structural changes in a cryo-cooled protein crystal owing to radiation damage, Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography 56 (2000) 328-341.

162. Ravelli R.B.G. et McSweeney S.M., The 'fingerprint' that X-rays can leave on structures, Structure 8 (2000) 315-328.

163. Weik M. et al., Evidence for the formation of disulfide radicals in protein crystals upon X-ray irradiation, Journal of Synchrotron Radiation 9 (2002) 342-346.

164. Holton J.M., A beginner's guide to radiation damage, Journal of Synchrotron Radiation 16 (2009) 133-142.

165. Leiros H.K.S. et al., Atomic resolution structures of trypsin provide insight into structural radiation damage, Acta Ciystallographica Section D-Biological Crystallography 57 (2001)488-497.

166. O'Neill P. et al., Physical and chemical considerations of damage induced in proteincrystals by synchrotron radiation: a radiation chemical perspective, Journal of Synchrotron Radiation 9 (2002) 329-332.

167. Nukaga M. et al., Ultrahigh resolution structure of a class A beta-lactamase: On themechanism and specificity of the extended-spectrum SHV-2 enzyme, Journal of Molecular Biology 328 (2003) 289-301.

168. Fuhrmann C.N. et al., The 0.83 A resolution crystal structure of alpha-lytic proteasereveals the detailed structure of the active site and identifies a source of conformational strain, J.Mol.Biol. 338 (2004) 999-1013.

169. Carugo O. et Carugo K.D., When X-rays modify the protein structure: radiation damageat work, Trends in Biochemical Sciences 30 (2005) 213-219.

170. Dubnovitsky A.P. et al., Strain relief at the active site of phosphoserine aminotransferaseinduced by radiation damage, Protein Science 14 (2005) 1498-1507.

171. Roberts B.R. et al., Oxidized and synchrotron cleaved structures of the disulfide redoxcenter in the N-terminal domain of Salmonella typhimurium AhpF, Protein Science 14 (2005) 2414-2420.

172. Yano J. et al., X-ray damage to the Mn4Ca complex in single crystals of photosystem II:

173. A case study for metalloprotein crystallography, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102 (2005) 12047-12052.

174. Leiros H.K. et al., Is radiation damage dependent on the dose rate used duringmacromolecular crystallography data collection?, Acta Crystallogr.D Biol. Crystallogr. 62 (2006) 125-132.

175. Fioravanti E. et al., Specific radiation damage to acidic residues and its relation to theirchemical and structural environment, Journal of Synchrotron Radiation 14 (2007) 84-91.

176. Schiltz M. et Bricogne G., Modelling and refining site-specific radiation damage in

177. SAD/MAD phasing, J.Synchrotron Radiat. 14 (2007) 34-42.

178. Sliz P. et al., How does radiation damage in protein crystals depend on X-ray dose?,

179. Structure. 11 (2003) 13-19.

180. Ward J.F., DNA damage produced by ionizing radiation in mammalian cells: identities,mechanisms of formation, and reparability, Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol. 35 (1988) 95-125.

181. Jones G.D. et al., Structure and mobility of electron gain and loss centres in proteins,

182. Nature 330 (1987) 772-773.

183. Symons M.C.R., Electron-Spin-Resonance Studies of Radiation-Damage to Dna and to

184. Proteins, Radiation Physics and Chemistry 45 (1995) 837-845.

185. Dick L.A. et al., Cryogenic electron tunneling within mixed-metal hemoglobin hybrids:

186. Protein glassing and electron-transfer energetics, Journal of the American Chemical Society 120 (1998) 11401-11407.

187. Mroczka N.E. et al., The effects of lattice water on free radical yields in x-irradiatedcrystalline pyrimidines and purines: A low-temperature electron paramagnetic resonance investigation, Radiation Research 147 (1997) 560-568.

188. Sevilla M.D. et al., Electron-Spin Resonance Study of Gamma-Irradiated Frozen

189. Aqueous-Solutions Containing Dipeptides Mechanisms of Radical Reaction, Journal of Physical Chemistry 83 (1979) 2887-2892.

190. Meents A. et al., Origin and temperature dependence of radiation damage in biological samples at cryogenic temperatures, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 107 (2010) 10941099.

191. Ravelli R.B. et Garman E.F., Radiation damage in macromolecular cryocrystallography, Curr. Opin.Struct.Biol. 16 (2006) 624-629.

192. Oesterhelt D. et Stoeckenius W., Isolation of the cell membrane of Halobacteriumhalobium and its fractionation into red and purple membrane, Methods Enzymol. 31 (1974) 667-678.

193. Oesterhelt D. et Stoeckenius W., Functions of a new photoreceptor membrane, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A 70 (1973) 2853-2857.

194. Collaborative Computational Project N.4., The CCP4 suite: programs for protein crystallography, Acta Cryst.D 50 (1994) 760-763.

195. Fisher R.G. et Sweet R.M., Treatment of Diffraction Data from Protein Crystals Twinned by Merohedry, Acta Crystallographica Section A 36 (1980) 755-760.

196. Kabsch W., Automatic Processing of Rotation Diffraction Data from Crystals of Initially

197. Unknown Symmetry and Cell Constants, Journal of Applied Crystallography 26 (1993)795-800.

198. Bourenkov G.P. et Popov A.N., A quantitative approach to data-collection strategies, Acta Crystallogr.DBiol.Crystallogr. 62 (2006) 58-64.

199. Murray J.W. et al., X-ray absorption by macromolecular crystals: the effects ofwavelength and crystal composition on absorbed dose, Journal of Applied Crystallography 37 (2004) 513-522.

200. Nanao M.H. et al., Improving radiation-damage substructures for RIP, Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr. 61 (2005) 1227-1237.

201. Brunger A.T. et al., Crystallography & NMR system: A new software suite formacromolecular structure determination, Acta Crystallogr.D Biol. Crystallogr. 541998) 905-921.

202. Adams P.D. et al., PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecularstructure solution, Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr. 66 (2010) 213-221.

203. Bourgeois D., New processing tools for weak and/or spatially overlappedmacromolecular diffraction patterns, Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr. 551999)1733-1741.

204. Perrakis A. et al., Automated protein model building combined with iterative structure refinement, Nat.Struct.Biol. 6 (1999) 458-463.

205. Murshudov G.N. et al., Refinement of macromolecular structures by the maximumlikelihood method, Acta Crystallogr.D Biol. Crystallogr. 53 (1997) 240-255.

206. McGeehan J. et al., Colouring cryo-cooled crystals: online microspectrophotometry,

207. J.Synchrotron.Radiai. 16 (2009) 163-172.

208. Ерофеев И., Микроспектроскопическое исследование состоянийбактериородопсина, Московский физико-технический институт (ГУ) (2009).

209. Bourenkov G.P. et Popov A.N., Optimization of data collection taking radiation damage into account, Acta 66 (2010) 409-419.

210. Leslie A.G., The integration of macromolecular diffraction data, Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr. 62 (2006) 48-57.

211. Emsley P. et Cowtan K., Coot: model-building tools for molecular graphics, Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr. 60 (2004) 2126-2132.

212. DeLano W.L., The PyMOL Molecular Graphics System, (2008)

213. Pettersen E.F. et al., UCSF Chimera—a visualization system for exploratory research andanalysis, J.Comput.Chem. 25 (2004) 1605-1612.

214. Markov I.V., Crystal growth for the begginers: Fundamentals of Nucleation, Crystal

215. Growth and Epitaxy, second (2003)

216. Grabe M. et al., Protein interactions and membrane geometry, BiophysJ 84 (2003) 854868.

217. Box H.C. et al., Magnetic Resonance Studies of Oxidation and Reduction of Organic

218. Molecules by Ionizing Radiations, Journal of Physical Chemistry 74 (1970) 40&.

219. Rahman A. et Stilling F.H., Hydrogen-Bond Patterns in Liquid Water, Journal of the

220. American Chemical Society 95 (1973) 7943-7948.

221. Speedy R.J. et al., Network Topology in Simulated Water, Journal of Physical Chemistry91 (1987) 909-913.

222. Corongiu G. et Clemeni E., Molecular-Dynamics Simulations with A Flexible and

223. Polarizable Potential Density of States for Liquid Water at Different Temperatures., Journal of Chemical Physics 98 (1993) 4984-4990.

224. Teeter M.M., Water structure of a hydrophobic protein at atomic resolution: Pentagonrings of water molecules in crystals of crambin, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 81 (1984)6014-6018.

225. Karplus P.A. et Schulz G.E., Refined structure of glutathione reductase at 1.54 Aresolution, J.MolBiol. 195 (1987) 701-729.

226. Jeffrey G.A. et Saengler W., Hydrogen Bonding in Biological Structures, (1991)

227. Chaumont A. et al., Potential proton-release channels in bacteriorhodopsin,

228. Chemphyschem. 9 (2008) 2751-2758.

229. Tanimoto T. et al., Altered hydrogen bonding of Arg82 during the proton pump cycle ofbacteriorhodopsin: a low-temperature polarized FTIR spectroscopic study, Biochemistry 43 (2004) 9439-9447.

230. Sobolewski A.J. et Domcke W., Ab Initio Investigation of the Structure and

231. Spectroscopy of Hydronium Water Clusters, J.Phys.Chem.A 106 (2002) 41584167.

232. Grudinin S. et al., Water molecules and hydrogen-bonded networks in bacteriorhodopsin-molecular dynamics simulations of the ground state and the M-intermediate, BiophysJ. 88 (2005) 3252-3261.

233. Tsuchiya T. et Saito S., Use of n-octyl-beta-D-thioglucoside, a new nonionic detergent,for solubilization and reconstitution of membrane proteins, J.Biochetn. 96 (1984) 1593-1597.

234. Борщевская Ю.А., Рентгеноструктурное исследование влияния полярногоокружения на кристаллизацию мембранных белков, Московский физико-технический институт (ГУ) (2009).

235. Cartailler J.P. et Luecke H., X-ray crystallographic analysis of lipid-protein interactionsin the bacteriorhodopsin purple membrane, Annu.Rev.Biophys.Biomol. Struct. 32 (2003)285-310.

236. Seddon A.M. et al., Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera,

237. Biochim.Biophys.Acta 1666 (2004) 105-117.

238. Misquitta Y. et al., Rational design of lipid for membrane protein crystallization,

239. J.Struct.Biol. 148 (2004) 169-175.

240. Hato M. et al., Alkylglycosides with an lsoprenoid-type hydrophobic chain can affordgreater control of aqueous phase structures at low temperatures, Langmuir 18 (2002) 3425-3429.

241. Hato M. et al., Aqueous phase behavior of lipids with isoprenoid type hydrophobicchains, J.Phys. Chem.B 113 (2009) 10196-10209.

242. Borshchevskiy V. et al., Isoprenoid-chained lipid beta]-XylOC16+4—A novel moleculefor in meso membrane protein crystallization, Journal of Crystal.Growth 312 (2010) 3326-3330.M