Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кристаллизация и рентгеноструктурное исследование олигонуклеотида GGCC: новый принцип упаковки дуплексов В-ДНК в кристаллах, учитывающий геометрию спирали

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Кристаллизация и рентгеноструктурное исследование олигонуклеотида GGCC: новый принцип упаковки дуплексов В-ДНК в кристаллах, учитывающий геометрию спирали"

6 о

3 МЛР ЮЗ7» грузинская академия наук

институт молекулярной биологии и биологической физики

На правах рукописи

м и и А с о в георгий абрамович

удк 377.322.5

кристаллизация и рентгенострухтурное исследование олигонуклеотида восс: новый принцип упаковки дуплексов в-днк в кристаллах. учитывавши геомггрию спирали

03.02.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой 'степени кандитата биологических наук

• Тбилиси - 1993

Работа выполнена в Ордена Трудового Красного Знамени Институте кристаллографии ни. А.В.Шубникова РАН

Научные руководители: действительный член АН Груэии,

академик Ц. М. Эаалиатили

кандидат физико-математических наук , Л. В. Калинина

Официальное оппоненты! доктор биологических наук ■ В. В. Герасимов

кандидат физико-математических наук К.К.Пирцхалава

Зашита состоится "Т^Г" ¡££¿£¡¡¡¡¿{2 1994 г. в часов

на заседании Научно-аттестаиионного Совета В 03.02 С N0.3-3 при Институте молекулярной биологии и биофизики АН Груэии ро адресу: 380060 Тбилиси, ул.Готуа 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии и биофизики АН Грузии

Автореферат разослан

Ученый секретарь • ;

Научно-аттестационного Совета .,

! '' - ;' '/ уЛ? ^¿¿¿'У ((- . ^ „ кандидат биологических наук: Л.Г.Донидэе

.'' '" . - г г < ■ . " 1 ' ~ • - '

V ■ ^ * .. -'-

Чу-' . V г' ' •.....■

- 3 -

общая характеристика работы

Актуальность темы. Одной из центральных задач современной биологии является объяснение механизмов различных процессов, происходящих в клетке с участием ДНК. Для исследований такого рода необходимо иметь детальное представление о структуре двойной спирали. В качестве основного метода структурных исследований ДНК с конца 70-х активно используется рентгеноструктуркый анализ олмгонуклеотидов (коротких синтетических фрагментов ДНК). За прошедшие полтора десятилетня, благодаря исследованиям такого рода, скопилось огромное количество структурной инфорнации, послужившей основой многих обзоров (например, 11.2]). В качестве наиболее интересных результатов ножно перечислить следующие! открытие г-форны ДНК (3,41. данные о строении гидратной оболочки различных ферм двойной спирали (5.61. данные о зигзагообразной системе водородных связей в главном желобке олиго(<1А)-олиго((1Т)-трекоа (7,8] и др.

Однако, несмотря на большое число исследованных структур, к концу 90-ых было изучено более ста кристаллических структур (9]. данных недостаточно чтобы ответить на вопрос о тон, как зависят параметры двойной спирали от нуклеотидной последовательности и как. влияет различное окружение на ее структуру. В связи с этим, в области кристаллизации исследования ведутся по двум направлениям -это получение изоморфных кристаллов для олнгонуклеотидов различных последовательностей и получение различных кристаллических форм для олнгонуклеотидов заданной последовательности. Необходимость таких .исследований делает актуальными работы по изучении кристаллизационных свойств олнгонуклеотидов. К числу та*.их работ можно отнести предложенный в работах (10-12] метод кристаллизации олнгонуклеотидов, основанный на экспериментальных фазовых диаграммах. Успешное использование данного метода позволило получить шесть кристаллических модификаций гексанера сКрСрСрСрОрСрО). в которых дуплексы образуют двойные спирали различных конформаиий (13, 141.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы является использование метода фазовых диаграмм для проведения кристаллографического исследования олигонуклеотпда (1 (ОрОрСрС)

В связи с этим были поставлены следующие задачи: ,

1. Получить набор фазовых диаграмм для систеЬы "дуплекс +■ спермин" при ра4личных концентрациях НПД и солей. .

2. Провести кристаллизационный эксперимент с целью получения кристаллов различных комплексов дуплекса со спермином. '

3. Провести предварительный рентгеноструктурный анализ полученных кристаллов и собрать набор интексивностей дифракционных отражений в сфере до максимального разрешения.

4. На основе кристаллографических рассчетов получить дополнительную информации о тон. к какому семейству двойных спиралей относятся дуплексы» и провести анализ упаковки дуплексов в кристаллах.

Научная новизна!

- на основе метода фазовых диаграмм изучена кристаллизационная система "вОСС + спермин")

- получены две кристаллические модификации данного тетране-ра, характеризующиеся сходством упаковки;

-дополнительная информация о конфорнации двойной спирали и. об ориентации молекул ДНК а ячейке получена с понощью рассчета функции ^ращения.

- построены карты электронной плотности низкого разрешения, в которых использованы фазы структурных факторов поделай сплошных цилиндров.

Практическая ценность работы состоит в возможности применения полученных данных н кристаллографических рассчетов при расшифровке атонной структуры тетраиера <1(0р0рСрС).

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на IV Европейской конференции по росту кристаллов бионакромолекул (Фрайбург. Германия, август 1991), на секинарах отдела структуры биокристал/ют Института кристаллографии РАН н группы рентгеноструктурного анализа Института нолекулярной генетики РАН (Москва, февраль 1992).

Публикации. По материален диссертации опубликовано 3 работы. Список публикаций приведен в конце автореферата.

Структура и обьем работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, результатов и обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа

содержит _ машинописных страниц, включая 29 рисунков, _£_

таблицы и список литературы из . 62 наименования.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение. Обоснован« актуальность тени, содержится постановка задачи, сфорнулиравана цель работы и кратко изложено содержание диссертационной работы.

Литературный обзор состоит из двух разделов.

В первой разделе приведены данные о строении двойной спирали ДНК. полученные а результате ренгеноструктурного исследования волокон ДНК и кристаллов олигонуклеотидов. Показано сходство и различие двойных спиралей основных представителей трех различных сенейств ДНК.

Во второй разделе проведен анализ условий кристаллизации олигонуклеотидов, структуры которых расшифрованы, и описана обычная кристаллизационная среда, используемая для данного типа нолекул. Описана предложеная в работах (10, 11] нодель кристаллизационной системы "дуплекс + спермин" а присутствии катионов при различных концентрациях осадителя. Расснотрена нодель двухкомпо-нентной Системы для олигонуклеотидного дуплекса длиной 2п (2п -число фосфатов в цепи) и проведение математические рассчеты для такой системы. Рассмотрены условия, при которых экспериментальные данные согласуется с теоретическими рассчетаии.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Препараты. В работе использовали сакоконплементарный олигонуклеотид й(ОрСрСрС). синтезированный фосфотриэфирным методом в растворе. Синтез осуществлен Б. К. Черновым в Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН (г. 'Москва), по методике, описанной в работе [131. Лиофильио высуоенкыЯ. олигонуклеотид растворяли в 30 мП Нв-какодилатноп буфер» (рН 6,0). При кристаллизации пользовались спермином [НН>(СН1)(СНж)в(Шд (СН^)и N1^1 » 4НС1 и МПД (2-нетил-2,4-пентандиол) г фирмы "Зегуа", США.

Методика получения Фазовых диаграмм описана в работах МалиниМой и соавт. [10, 111. В каплв. содержав?» раствор дуплекса (или спермина), добавляли яикропорцияни раствор спермина (или дуплекса) и наблюдали в поляризационный микроскоп. При

определенной соотношении концентраций дуплекса и спермина а капле } появлялся характерный светящийся осадок. Значениям концентраций' дуплекса и спермина в момент появления осадка соответствуют точки, по которым строили фазовую диагранну.

Кристаллизацию проводили при комнатной температуре методом диффузии паров осадителя (КПД) в висящие капли. Каплю раствора обьенон 20-25 нкл. содержащую дуплекс, спермин и около МИД, приводили в равновесие с противорастворон КПД а воде. Концентрацию КПД в противорастворе в ходе кристаллизационного зкеперинента постепенно повышали от Юзе до 33-40Х.

Прецессионные рентгенограммы получали на камере Бургера с расстоянием от кристалла до пленки 60 кк. Использовали отфильтрованное Си К^-излучение от генератора GX-20 с вращающимся анодом фирмы "Elliott" (Англия). Основной режим работы рентгеновской трубки 40 кВ • 40 нА.

Набор интенсианостей дифракционных отражений . с кристаллов гексагональной модификации (форма 1) в сфере с разрешением до 3,2* измеряли на четырехкружном одноканальнои дифрактометре Syntax Р2^ (США) ы-методон на нонохронатизированном Си Ка-излучении (монохро-матор - пиролити.ческнй графит). Использовали конлекс управляющих програнм для проведения дифрактометрических экспериментов на кристаллах белков, разработанный в отделе структуры биокристаллов Института кристаллографии РАН Ю.В.Некрасовым. С кристаллов триго-нальной модификации (форма 2) набор дифракционных отражений в сфере с разрешением до 5,5* измеряли на дифрактометре CAD-4 фирмы "ENRAF NOM?US" (Англия). В ходе обработки экспериментальных данных вводили поправки на поглощение, фактор Лорентца, поляризацию и радиационное разрушение кристаллов. Массив измеренных отражений приводили к независимой части обратного пространства с одновременным усреднениен повторяющихся и эквивалентных отражений.

Рассчеты, выполненные в работе, в основнон проводили по програнкак комплекса "BLANC", написанным А.А.Вагинын в Институте кристаллографии РАН. Данный конплекс програмн поставлен на ЭВМ NORD-560, а позднее и на конпютерах типа IBM PC/AT. Конплекс включает програнны первичной обработки экспериментальных данных, програмны для рассчетов методами ■ изоморфных производных и ■ молекулярного замещения, пакет графических и сервисных программ. В работе были использованы также оригинальные програмны. написанные И поставленные на ЭВМ NORD-560 Г.Н. Муршудовым.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Фазовые диаграмм» для система "СЮСС ♦ спермин"

На рис.1 приведена фазовая диаграмма для системы "ОрврСрС + спермин" в координатах [31о. [Шо. где [3]о и Ш]'в концентрации спермина и дуплекса в системе. Фазовая диаграмма для брОрСрС в целом похожа на диаграммы, полученные ранее для других систем "дуплекс ♦ спернин" [10-121. Область А (внутри кривой) отвечает наличию в системе осадка, области В и С - отсутствию осадка. Нижняя ветвь фазовой диаграммы проходит почти параллельно оси (3] , а верхняя достаточно хорошо описывается пряной линией с наклоном близким к 2. Экстраполяция верхней н нижней ветвей к осям [3] и [01 . соответственно, приводит к близким значениям ав и а^ растваримостей комплексов, образующихся у верхней и у нижней ветви фазовой диагранны. В терминах модели "дуплекс + спермин", предложенной в [10-12], вид фазовой диагранны для ОрОрСрС (рис.1) ножно объяснить осаждением вдоль всей границы фазовой диаграммы комплекса, а котором дуплекс полностью нейтрализован спермином. Наклон верхней ветвн к, согласно формуле к"1/ТК/'4-11 (1), где N -число нейтрализованных фосфатов в дуплексе, свидетельствует об осаждении комплекса в котором ма дуплекс приходится в

среднем 1,5 молекулы спермина. Хотя в работе 110) при выводе формулы к»1✓СN✓4-1Э предполагалось, что дуплекс связывает целое число молекул спернина, эту формулу можно формально распространить и на более общий случай. Близкие значения величин растворимости ав и ан указывают на то, что вдоль верхней и нижней ветвей диагранны осаждается один и тот же комплекс И

I,9

Влияние КПД на вид фазовой диаграммы показано на рис. 2а. При повышении концентрации МПД до 104 ■ системе происходят незначительные изненения, вид фазовой диаграммы почти не меняется. При дальнейшем повышении концентрации МПД вид .диаграммы существенно меняется - верхняя ветвь сдвигается влево и меняет наклон, а нижняя ветвь заметно опускается. Изменение наклона верхней ветви при повышении концентрации МПД (рис.2а), ножно связать, как и в других случаях [10]. с изменением типа осаждающегося комплекса. В данном случае вдоль верхней ветви начинает выгадать в осадок комплекс [01 ^. т.е. дуплекс с одной присоединенной молекулой спермина.

Добавление в кристаллизационную систему солей N»01^ N МаС1 приводит к изменению области «»паления кристаллического осадка

Рис.1. Фазовая диаграмма для системы "ОрОрСрОспернин". 131 и Ю) концентрации спермина и дуплекса. Область А соответствует наличию осадка, области В и С - его отсутствию, а^ и ан значения растворимости

конплексов, образующихся вдоль верхней и нижней ветвей фазовой диагранны, соответственно.

Условия) 30 нМ Иа-какодилатный буфер, рН 6.0, 3« КПД.

О г 4 О 8 |51о, пМ

(рис.2б). Как видно из рисунка, введение ионов Мя** и Ыа* влияет только на область перехода с нижней ветви на верхнюю, клин становится более тупым, тогда как наклон верхней и положение нижней ветви практически не меняется. В рамках теории предложенной в работе (10). это ножно объяснить увеличением раствориности комплекса В

Кристаллизация олигонужлеотида РОСС

В ходе кристаллизационного эксперинента было поставлено 'несколько серий кристаллизационных проб, показанных на рис.2а в виде.кружков. Указанные точки соответствуют начальным условиям в поставленных кристаллизационных пробах. В ходе кристаллизационного эксперинента в резервуар с противорастворон добавляли новые порции МПД. добиваясь постепенного повышения концентрации МПД в капле. Начальные концентрации спермина (Э]о и дуплекса (1)1^ выбирали таким образом. чтобы точка ((31^.(01^) лежала на диаграмме вне области осадкообразования (рис.2а). При повышении концентрации КПД в кристаллизационной среде граница диагранны смешалась, и в тот нонент, когда она пересекала точку ( [Э] ,(0)' )»

!Ш о.иМ

о) при различным* концентрациях НПД| * - 3*. о - 10*, х - 20*. и • - 50*. Точки 1 и 2. обведенные кружхамм. соответствуют кристаллизационным пробам 1 и 2.

6) в присутствии КПД и различных катионов; ♦ - 4 иК МзС1 ^ и * - 20тМ ИаС1. вазовые диаграммы получены в присутствии 10* МПД, для сравнения приведена соответствующая' фазовая дивгракна.

наблюдалось осадкообразование. При этон дуплекс осаждался в комплексе со сперникон. Тип выпадаооего в осадок комплекса» как уз» отмечалось, эависил от того, в какой области фазовой диаграммы находилась точка {[Э! ,[Щ ). Первая серия Ъроб была поставлена в

о о

области верхней ветви, дв* другие у нижней ветви. Путея изменения соотношения 131 /№1 велся поиск условий, при которых кристаллы достигали магсимальных размеров. Во всех поставленных пробах были получены кристаллы. В большинстве случаев кристаллы достигали небольших' разнеров или росли друзами. Условиям, при которых-были получены наиболее качественные кристаллы, на рис.2а соответствует точки 1 ' и 2. фотографии моиокристаллбв показаны на рис.3. • условия более подробно приведены в таблице 1. Г .

Рис.3. Фотографии кристалла». «) кристаллическая форма 1 и б) кристаллическая форма 2.

I Таблица 1.

Условия кристаллизации тетрамера ОрОрСрС.

Номер пробы КОНЦЕНТРАЦИЯ

ДУПЛЕКСА (Б)*, шИ СПЕРМИНА [3)о, ИМ ППЛ а капле, ' ' * КПД в противо-раствора, \

г 1,1 1.0 6.0 22

2 .'< 0,8 4, 3 '' 4.3 10

Получанные кристаллы были использованы для дальнейшего ' рентгеноструктурного анализа. Кристаллы • каплях появлялись через неделю с мояеита кристаллизации, к достигали своих максимальных раэиероа, 0,25 им в поперечнике, в течении Двух - трёх недель.

Предварительны» реитгеноструктуриы« авалю кристаллов (ЖСС На рис.« представлены . Прецессионные рентгенограммы, полученные с кристаллов 1 (а,б) й с кристаллов 2 (в). Пространственные группы синметрии, параметры элементарных ячеек и характе-I ристики полученных кристалле» приведены в -табл.2. На рентгено-

Рис.4. Прецессионные рентгеногранны эоИ ЬУ.О, Ь01 (»4-18в) кристаллов 1 (в,б) к воин МсО (^13°) кристаллов 2 (в). Стрелкакк показами области сильных рефлексов, отвечающие нев-плоскостмому расстоянию 3,38 А.

гранках зоны ЪкО в обоих случаях (рис.* а,в) видны группы сильных рефлексов, отвечают»« иежллоскостиоиу расстоянию 3,38 А, которое соответствует расстоянию нему парами оснований рдоль оси спираля в В-ДНК. ..■.".-

Расположение сильных рефлексов на рентгеногранмах указывает на то. что осьДНК лежите плоскости перпендикулярной осям 6(

случае кристаллов 1 дуплексы располагаются

и 3.

(3^), причем

вдоль крйсталЛографических осей а, Ь и диггоиади а+Ь, а в случае кристаллов 2 - вдоль направлений «*гь и £»-»Ь. На трансляций

вдоль оси спирали в кристаллической форме 1 приходите« 20 пар оснований (67.7. А/3,38 А)'йлм З дуплексов. а • случае кристаллов 2 - 203 А/З.ЭЭЖй 60 пар оснований или 13 дуплексов 00СС. Кристаллы йНеют слоистую структуру, причем слом раополошены перпендикулярно кристаллографической оси с. Ячейк* формируется мэ 6 слое», каждый

Таблица 2.

Характеристика кристаллических topa таранера GpQpCpC.

Форма Параметры ячейки. (А) V ячейки Z V ее. ч. Тет£. ас. ч. _v_ тетр. V П. ос.

с-Ъ с (А*) (А*) (А*)

1 67.7 IOS.6 419200 12 34930 3 6986 1747

2 116,9 116.4 1378000 6 229500 30 7637 1914

Форма 11 гексагональная сикгония. группа Рб(22 или P6^22 с {2 эквивалентный» лоэицняки в ячейке (Z).

форма 2: тригональная сиигония. группа Р3(12 или Р3(12 с 6 эквивалентными позициями в ячейке (Z). V/ac. ч. - обьем асимметричной части ячейки - Уяч./Z-Тетр./ас\ ч.- число дуплексов GpGpCpC » асимметричной части ячейки. V/тетр.- объем, занимаемый дуплексом GpGpCpC. V/n. ос. - объем, занимаемый парой оснований.

слой повернут относительно предыдущего на угол 60° (120°). Расстояние между слоями ■ кристаллической форме 1 составляет 17.6А (105.б А/6), тогда как а кристаллах формы 2 это расстояние равно 116,4 А/6-19.4 А.

Гексагональная форма 1

На рис.5а приведена схема упаковки дуплексов в ячейке кристаллической формы 1. Показаны кристаллографические оси а. Ь. "винтовые оси и 3f и простыв поворотные оси второго порядка, параллельные оси с, которая направлена перпендикулярно плоскости рисунка. Молекулы IHK изображены в виде цилиндров. Параллельно уложенные цилиндры образуют слой {иа рисунке показаны только три слоя. следующие три повторяют тот se упаковочный мотив). Расстояние между слоями. 17.6 А, меньше диаметра спирали В-ЯНК (19-20 А), из чего можно предположить: что молекулы слоя погружены в желобки соседних слоев. Тогда требуемый для данной группы симметрии угол поворота между соседними слоями молекул (60 / 120 ) будет налагать определенные требования иа .геометрию спирали, а

Рис.3. Схематическое изображение упаковки дуплексов ввСС в " элементарной ячейке кристаллов 1. Ось с перпендикулярна плоскости рисунка.

яУ Показана взаимная ориентация трех слоев, образующих половину ячейки. Псевдонепрерывная спираль ДНК изображена в виде цилиндра, приведены также винтовые оси 6^. Э^ и простые поворотные оси второго порядка, перпендикулярные плоскости рисунка.

В> Показана ориентация желобков в молекулах двух соседних слоев, а также расположенные на вмготе х-1/Зс простые поворотные и винтовые оси второго порядка, которые переводят молекулы двух соседних слоев друг в друга.

иненно на угол, который образует ось спирали с направлением желобков. Рассчет показал, что только в случае В-ДНК значение данного угла составляет 60е (120°). и удовлетворяет треЗуеному условию. Учитывая вьшеуказанные требования, была построена упаковка спиралей В-форны в ячейке кристаллов 1. Взаимное расположение нолекул двух соседних слоев представлено на рис.56. Показаны также элементы синметрии (простые поворотные и винтовые оси второго порядка), которыми связяны молекулы этих двух соседних слоев. Очевидно. что такая упаковка ножет сушествовать, если желобки предыдущего слоя расположены в определенных нестах (рис. 36) или. что то же самое, псевдонепрерывкая молекула ДНК в этон слое повернута на определенный угол вокруг своей оси. Только в этом случае желобки данного слоя будут задавать нужные направления, ориентирука»? молекулы следующего слоя. Учитывая то, что спираль В-фсртт является правой, из двух знантиоморфных групп Р6г22 и была вьбрана пространственная группа Р5г22.

' f" - 14 -

Отметим. что внутри слоя, расстояние между соседними цилиндрами составляет ЗОЛ. что примерно в 1,3 рам больше диаметр* В-ДНК. Следоаательмо, прочность упаковки обеспечивается благодаря стэкинг-взаннодействию между дуплексами, образующими один и тот т цилиндр, а такие благодаря вандерваальсовыи взаимодействиям нёаду молекулами соседних слоев. 8 результате такой упаковки полученные кристаллы оказались боле* "рыхлыми", чем обычные кристаллы В-ДНК. Если рассчитать средний объем ячейки, приходящийся на пару оснований, то для кристаллов 1 эта величина составит 1747 А. Это заметно болы», чем обычные 1200 - 1400 А для кристаллов олнго-иуклеотидов В-ДНК (9]. Ев» одним следствием описанной упаковки является наличие обширных каналов с растворителем, проходящих через.всю ячейку параллельно кристаллографической оси с. Подобий* каналы довольно часто образуются в кристаллах данной пространственной группы. . .

Тригональяая форы* г

Принцип упаковки дуплексов в кристаллах трнгональной формы совпадает с описанным выше для'гексагональной формы. Однакокак ута отмечалось ранее, в данной форме дуплексы расположены вдоль направлений а-Ь, а+гь и 2а*Ь элементарной ячейки. Связь между элементарными ячейками, гексагональной и трнгональной форм иллюстрирует рис.6. Ячейка кристаллов Трнгональной форны может быть получена из ячейки кристаллов гексагональной форны поворотом плоскости Ca^.t^J на угол 30° н соответствующим выбором осей м Ь( (см. рис.6), Параметр с ячейки кристаллов формы 2 болы», чем у кристаллов формы ' 1 (см. табл.2), в результате чего упаковка оказалась ene более рыхлой. Средний обьен ячейки на пару оснований в данном случае составляет 1914 А, больше чем в случае гексагональной форны. Это вызвано увеличеннен расстояния между слоями, возможно из-за некоторых нарушений в.ориентации дуплексов. Как и в случае гексагойальной формы, исходя из знака-спирали, из двух энантиоиорфных групп P3J12 и P3t12 была вьврана группа (>3^2.г

Рассчет функции вращения для кристаллов гексагональной форех . , Били измерены наборы интенсивностей дифракционных отражений в сфере с разрешением до 3.2 А; для кристаллов гексагональной -. модификации 'и в сфере с разрешением до '5,5 А для .кристаллов.

Рис.6. Схема, иллюстрирующая связь между элементарней ячейками кристаллов формы' 1 (а',Ьй)' и кристаллов формы 2 («1<Ь||). Вид вдоль оси с. Тонкими линиями показаны весть соседних ячеек [ кристаллов формы 1, . киркой линией изображена ячейка кристаллов формы 2, точками показано расположение осей двойных спиралей в слоях, формирующих ячейки.

тригональной модификации. Проведена первичная обработка данных с введением поправок на факторы Лорентца и поляризации, а также с учетом поглощения и радиационного разрушения кристаллов. Для кристаллов гексагональной формы были расчитанн функции враовния по алгоритму Кроузера (16). В работе (17) отмечалось, что подобный расчет для кристаллов ДНК и ДНК-белковых конпяексов в ряде случаев позволяет получить дополнительную информацию об ориентации ДНК в ячейке й о конформации двойной спирали.

В данном случае расчёт был проведен для того, чтобы проверить правильность предложенной упаковки дуплексов в кристаллах и подтвердить принадлежность дуплексов В-семейству спиралей.

Одной из характерных особенностей спирали ДНК является наличие в ее структуре двух типов псевдодиад, связывающих антипараллельные цепи ДНК друг с другом. Псевдодиады первого типа лежат в плоскости пар, псеадодиады второго типа располагаются

Рис.7. Стереографическая проекция Л(*>,»/.180о) собственной функции вращения, рассчитанная для кристаллов фориы 1 по даннип в зоне 15-5 А и радиусон интегрирования 20 А.

иежду соседнмни парами оснований. Все псевдодиады перпендикулярны оси ДНК, поэтому на стереографической проекции Жр.рЛВО0) собственной функции вращения в плоскости, перпендикулярной оси ДНК, часто удается наблюдать систему периодически расположенных пиков, соответствующих данным псевдодиадам. По угловому интервалу между ними ножно судить о порядке спирали и соответственно о форме ДНК [17]. Например, в случае В-ДНК угол спирального вращения равен 36°. Следовательно. угол нежду двумя соседними псевдодиадани составляет 36°/2-18°. В случае же г-ДНК этот угол должен быть равен 15°.

На рис.7 представлена стереографической проекция Н1р,у.180°) собственной функции вращения, рассчитанная для кристаллов формы 1 по данный в зоне с разрешением 15-5 Д г радиусом интегрирования 20 А. Распределение максинумов на проекции П(р.у.180°) позволяет судить об орнентации осей (псевдоосей) симметрии второго порядка. Самые сильные пики, расположенные по "экватору" и в центре, соответствуй! кристаллографическим осяп второго порядка. Система пиков в плоскостях, перепенлиг.улярных направлениям а. Ь и диагонали а+Ь. связана с наличием псевдодиад в структуре двойной спирали. Расположение "псевдодиадных" ~пнков на -п ереографичесгой проекции И(|£>, у. 180° | функции вращения подтверждает предложенную нами. Модель упаковки (рис. 5а). при которой ось ДНК.в первом слое (г-1/12 с)

Рис.в. Участок синтеза электронной плотности кристаллов бОСС гексагональной формы с разрешением 7А. Синтез построен по фазан, расчитаннын от моделей сплошних цилиндров. Показами лее соседние молекулы одного слоя.

совпадает с направлением а+Ь, во второй (2-3/12 с) - с направлением * и а третьем (г-5/12 с) - с направлением Ь. Угловой интервал между соседними пиками составляет 18° (90°/3), что соответствует симметрии В-ЛНК.

Синтез электронной плотности кристаллов СЮСС формы 1

На рис.8 представлен синтез карты электронной плотности для кристаллов гексагональной формы, расчитанный по фазам от сплошных цилиндров. Цилиндры располагали в элементарной ячейке согласно предложенной модели упаковки дуплексов в кристаллах формы 1 (рис.5а). Электронная плотность внутри цилиндров была принята за единицу, вне цилиндров значение ее приравняли к нулю. Из полученной таким образом модели с помощью обратного Фурье-преобразования были вычислены модельные амплитуды и фазы структурных факторов. Затем модельные фазы скомбинировали с амплитудами эксперименных структурных факторов и построили трехмерную карту распределения электронной плотности. В расчетах были использованы только 50 из 300 структурных факторов в зоне с разрешением до 7 А. так как ренгеновские лучи от объектов с цилиндрической симметрией рассенраются в дискретных направлениях. На представленном рисунг.е

отчетливо видны желобки, хотя фазы от цилиндрической модели не содержат информации о них. Размеры, расположение желобков и геонетрия самой спирали указывают на принадлежность молекул ДНК к В-форме двойных спиралей.

Таким образом, на основании построенного синтеза электронной плотности для . кристаллов гексагональной фориы, была получена объективная информация как о геометрии самой спирали так и упаковки дуплексов в кристаллах. Эта информация подтверждает каши предположения о принадлежности дуплексов к В-форме спиралей и правильность предложенной упаковки молекул в кристаллах (рис.^а).

Сравнительны* анализ упаковки дуплексов СЮСС в кристаллах

Как известно, все разнообразие кристаллических структур олигонуклеотидов определяется геометрией молекул (формой спирали) и типом взаимодействия между дуплексами. образующими регулярный мотив. Среди изученных кристаллических структур олигонуклеотидов В-типа, как отнечает 0. Кеннард в работе (21. имеется всего пять типов различных кристаллических структур. Эти пять типов кристаллических структур представлены додеканером <5 (ССССААТТОЗСО) (181 и нножествон его изоморфных вариантов, гексамерон сКСрЗСрСрЗСрСрЗС) (191. деканером (1 (ССААСАТТОС) (201. содержащим дни неконпленентар-ные пары, и двумя последовательностями с неспаренныни аденинами. тридекамером а(СОСАОАССТСССО) [211 и пентадекамером с1 (СОСеАААТТТА-СвСО 122). Во всех перечисленных крнсталли'и'с* их структурах дуплексы образуют спирали В-типа, однако вен они различаются по типу взаимодействия между молекулами, что, в конечном счете, приводит к различию в упаковке молекул в кристаллах.

Упаковка дуплексов СССС в кристаллах обеих кристаллических форм• существенно отличается от перечисленных выше пяти типов кристаллических структур. Регулярное расположение желобков на синтезе электронной плотности (рис.8.) свидетельствует о том, что дуплексы образуют бесконечные геометрически правильные спирали В-ДНК Р случае декамера дуплексы также образуют бесконечные спирали В ДНК, однако ни в одной из перечисленных структур не встречается такого типа вэаинодейотвия между соседними молекулами. Принцип упаковки, при которой контакт между соседними молекулами Ьсушеггв.'!Яг Iгя в области желобков, для кристаллов В-форны спиралей не характерен, и встречается впервые.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Получен набор фазовых диаграмм для систены "СОСС+спермин" при различных концентрациях МПД. Диаграмма в координатах [91 ,

имеет клинообразный вид, характерный для систен "дуплекс + спермин".

2. На основе полученных экспериментальных фазовых диаграмм были выделены две области условий кристаллизации олигонуклеотида СрбрСрС. Проведен кристаллизационный эксперимент, и получены кристаллы двух различных форм. Предварительный рентгеноструктурный

• анализ показал принадлежность кристаллов двум различным пространственным группан: Р6г22/Р6^22 (гексагональная сингония) с параметрами ячейки а»Ь-67,7 А, е-103.6 а (кристаллическая форна 1) и РЗ 12/РЗ 12 (тригокадьная сингоння) с параметрами ячейки а-Ь-11б,9 А, с«11б,4 А (кристаллическая форма 2). Присутствие сильных рефлексов в области с разрешениен З.ЗЭ А свидетельствеут о том, что дуплексы в кристаллах образуют спирали В-ДНК. Исходя из этого была предложена нодель упаковки дуплексов в кристаллах.

3. Собраны наборы интенсивностей дифракционных отражений для кристаллов гексагональной нодификации до разрешения 3.2 а и для кристаллов тригональной модификации до разрешения А. Проведена первичная обработка данных с введениен поправок на факторы Лорентца и поляризации, а также с учетом поглощения и радиационного разрушения кристаллов. На основании данных, полученных для кристаллов гексагональной кодификации была расчитана собственная функция вращения. Информация, полученная с помощью стереографической проекции 180°) функции вращения, подтвердила принадлежность дуплексов В-спирали ДНК и правильность предложенной модели упаковки дуплексов в кристаллах.

4. Для кристаллов гексагональной нодификации построена карта распределения электронной плотности низкого разрешения, с помотыо которой получена объективная информация подтверждающая принадлежность дуплексов В-форне двойных спиралей и правильность предложенной нодели упаковки дуплексов в кристаллах. Проведен сравнительный анализ упаковки дуплексов ввСС с изученными ранее типами упаковки В-ДНК в кристаллах. Упаковка, которая так тесно связана с геометрией спирали В-ДНК, встречается впервые.

CRYSTALLIZATION AND X-RAY INVESTIGATION OF GGCC OLIGONUCLEOTIDE: A NEW PRINCIPLE OF B-DNA DUPLEXES CRYSTAL PACKING TO ALLOW FOR HELIX GEOMETRY ANNOTATION. The crystallization system "GGCC + spermine" hay® been etuded by the phase diagram technique (10-121, To obtain» crystals of different duplex-spermihe complexes two subregiona of the multiparamoter crystallization space have been separated: high - spermine and high-DNA eubregions. Some crystallization trials have been run in these subregions using the vapor diffusion against a reservoir containig' precipitant solution (HPD). We obtained two different crystal forms: hexagonal form 1 - P6t22 (P6422) with a-b-67.7A, C-103.6A in the high-spermine subregion, and trigonal form 2 - PS^ (P3i12) with a-b-116.9A, C-116.4A in the high-DNA one.

The strong reflections at Bragg spacing of 3.38A in (a.b) plane suggest that GGCC tetramers adopt B-DNA double helix. Allowing for results of preliminary X-ray analysis we proposed the packing scheme for both crystal forms. Crystals diffract at least up to 3.2A, and wa collected data up to 3.2A resolution for hexagonal form, and up to 5.5A resolution for trigonal one. To check our assumption about DNA conformation we used rotation function search for hexagonal crystals 116,171. The set of paeudodyad peaks at 18° intervals on the stereographic projection R(f>,\c.lB0°) of the self-rotation function, as axpected for Ii-DNA. proved our assumption about DNA conformation.

To test proposed scheme of crystal packing we used the next computational strategem. We calculated phases from Bolid cilinders disposed in the unit cell as in suggested packing scheme for hexagonal form 1. Phases thus abtamed then ware combined with observed X-ray Intensities to calculate the Fourier electron density map. The major grooves of the B-DNA are seen quite clearly, aligned such that the helices of the next layer can be fitted into grooves of this layer. These results wore unexpectedly clear,: inasmuch aa no assumption about, cylinders fitting into grooves was made in the phasing model.

The comparison with known types of the B-DNA crystal packing 121 showed that GGCC tetramer crystallized by new unknown, but may be quite popular for B-DNA duplexes pa^ying scheme to a 1 low for helix geometry.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. G.Minaaov. V.Tereshko. B.Chernov and L.Mallnina. "Crystal packing helps to determine DNA conformation". Abstracts of the FEBS Advanaed Lecture Course in Crystal Growth of Biologycal Macromolecules, August 1991, Freiburg (Germany), L-14.

2. G.Minasov, V.Tereshko, B.Chernov and L.Mallnina. "An efficient and possibly general packing mode for crystals of B-DNA oligonucleotide". Journal of Crystal Crowth, 1992, V.122, 136143.

3. Г. А.Пинасов. В. А.Терешхо. Б.К.Чернов, Л.В.Калинина. "Новая упаковка В-ДНК в кристаллах", Молекулярная Биология, 1992. Т.26. (Вып.3). 573-582.

Цитируемая литература:

1. Dickerson R.E. // Unusual DNA Structures // Walle R.E.and Harvej S.C., eds. Springer-Verlag. New-York. 1987.

2. Olga Kennard and. William N.Hunter // Quart. Rev, of Bioph. 1989. V.22. P.327-379.

3. Wang A.H.-J., Quigley G.J.. Kolpak F.J., Crawford J.L., van Boom J.H.. van der Magel G. and Rich A. // Nature. 1979. V.282. P.680-686.

4. Drew N.R.. Takano Т., Tanaka 9.. Itakura K., and Dickereon R.E. // Nature. 1989. V.286. P.367-573.

5. Drew N.R., Dickerson R.E., //J. Mol. Biol. 1981. V.131. P.535-536.

6. Conner B.N., Takano Т.. Tanaka 3.. Itakura K.. Dickerson R.E. // Nature. 1982. V.293. P.294-299.

7. Nelson N.R.. Finch J.Т.. Luisi B.F. and Klug A. // Natur». 1987. V.330. P.221-226.

8. Coll M.. Frederik C.A. , Wang A.H.-J. and Rich A. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1987. V.84. P.8385-8389.

9. Richard E. Dickerson. in: "Structure and Methods". Vol. .3. Eds. R.H.Sarma and M.N.Sarma (Adenine, New York. 1990) pp.1-38.

10. Малинина Л. В., Терешхо В. А. , Махалдмани В. В. , Зарытова B.J.. -Иванова Е.М. // Молекуляр. биология. 1987. Т.21. С.529-342.

U. Malinina L.V.. Makhaldlani V.V.. Tereehko V.A.. Zarytove V.F. and Ivanovo E.M. // J. BJomol. Str. Dynam. 1987. V.3. P.403-433.

12. Терешко В.А., Малиннна Л.В. // Молекуляр. биология. 1989. 'Т.23. С. 1163—1170.

13. Teraahko Valya. and Malinina Lucy. // J. Biomol. Str. Dynam. 1990. V.7. P.027-836.

14. Hallnina Lucy. Tereehko Valya, Ivanova Zhanya & Borovik Tolya. // J. of Cry«. Grow. 1991. V.110/(1-2). P.231-237.

13. Hirose Т.. Crea H.. Itakura K. // Tetrahedron Letter. 1978. 'P.2449-2432.

16. Crowther R.A. // Molecular Replacement Method./ Roesman M.G., ad. N.Y.! Gordon and Breach. 1972. P.173-177.

17. Малиннна Л. В. , Терешко В. А.. Вагин А. А., Иванова Е. М. . Скрябин К.Г.. Кирпичников М.П. // Молекуляр. биология. 1987. Т. 21. С.1142-1147

18. R.M.Wing, H.R.Drew. T.Takano. С. Broka, S.Tanaka. К.Itakura and R.E.Dickereon. // Nature. 1980. V.287. P.733-738.

19. W.B.T.Cruse, S.A.SatiBbury. T.Brown, R.Coestick. F.Eckstein and O.Kennard. // J. Hoi. Biol. 1986. V.192, P.891-903.

20. G.G.Prive. U.Heinemann, S.Candraaegaran. L.-S.Kan, M.L.Kopka and R.E.Dickerson. // Science. 1987. V.238. P.489-304.

21. L.Joshua-Tor, D.Rablnovlch. H.Hope. F.Frolow, E.Appella and J.L.Suaeman (1988). // Nature. 1988. V.334. P.82-84.

22. H.Miller. R.W.Harrison, A.Wlodawer, E.Appella and J.L.Sussman. // Nature. 1988. V.334. P.83-66.