Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Кристаллизация и предварительные кристаллографические исследования 70S рибосом THERMUS THERMOPHILUS
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология
Автореферат диссертации по теме "Кристаллизация и предварительные кристаллографические исследования 70S рибосом THERMUS THERMOPHILUS"
РГ5 Oft
МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА. ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА
Биологический факультет
На правах рукописи УДК 547.963.3
ШИРОКОВ ВЛАДИМИР АНАТОЛЬЕВИЧ
КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ И ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ КРИСТАЛЛОГРАФИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 70S РИБОСОМ THERMUS THERMOPHILUS
ОЗ.00.03.-молекулярная биология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва - 1994
Работа выполнена в Институте белка РЛН
Научный руководитель:
доктор биологических наук, академик А.С.Спирин
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук E.H.Доброе доктор физико-математических наук И. Н. Сердюк
Ведущая организация:
Институт кристаллографии им. А. В. Шубникова
Защита диссертации состоится 1994 Г.
в /Ч час мин на заседании специализированного совета Д 053.05.70 при Московской Государственном Университете им. М.В.Ломоносова.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им.М. В. Ломоносова.
Автореферат
Ученый секретарь Специализированного совет! кандидат химических наук
В. Н. Каграманов
I.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. За последние два десятилетия накоплен огромный экспериментальный материал по структурным свойствам рибосом. Определены общая морфология частицы, первичные структуры рибосомных РНК и белков, предложены модели трехмерной организации прокариотической рйбосомы и расположения функциональных центров. Однако вся совокугаюсть имеющихся данных не позволяет однозначно решить проблему точного взаиморасположения структурных элементов рибосомной частицы и построить ее молекулярную модель, которая необходима для полного понимания механизма биосинтеза бежа.
Причина заключается в том, что большинство структурных данных получены более или менее косвенными методами и, следовательно, содержат известную неоднозначность. Перспективы построения достаточно точной молекулярной модели связаны с рентгеноструктурными исследованиями, проведение которых требует, в первую очередь, получения трехмерных кристаллов рибосомных частиц. 30S и 50S рибосомные субчастицы закристаллизованы и ведутся их исследования.
Целью настоящей работы являлось получение кристаллов 70S рибосом, пригодных для рентгеноструктурного анализа /'и их кристаллографические исследования в рентгеновском пучке и методами электронной микроскопии.
Основные задачи исследования. Разработка метода получения кристаллизуемых препаратов рибосом. Получение кристаллов 70S рибосом и выращивание крупных кристаллов для рентгеновских исследований. Определение кристаллографических параметров, электронно-микроскопические исследования кристаллов и определение упаковки рибосомных частиц. Синтез тяжелоатомных лигандов для получения изоморфных производных.
Научная новизна и практическая ценность работы. Разработана методика очистки препаратов рибосом Thermus thermophilus и получены несколько кристаллических форм рибосом. Бипирамидальные кристаллы 7QS рибосом выращены до размеров, пригодных для рентгеноструктурного анализа. Определены кристаллографические
параметры бипирамидальных кристаллов. Другая кристаллическая модификация - пластинчатые микрокристаллы, исследованы методами электронной микроскопии. Определена упаковка рибосом в микрокристалле. Данные об упаковке могут быть использованы при решении фазовой задачи в рентгеноструктурных исследованиях прямоугольных кристаллов - третьего типа кристаллов 70S рибосом. Для решения фазовой задачи более классическим методом -методом изоморфных замещений получен тяжелоатомный лиганд -
Phe
тРНК , модифицированная золотым кластером AUj i. Модифицированная тРНК сохраняет все функциональные свойства и пригодна для широкого спектра исследований в рентгеноструктурном анализе и электронной микроскопии.
Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликовано II работ (7 статей и 4 тезисов конференций). Материалы диссертации были представлены на Международном симпозиуме "Молекулярная организация биологических структур" (Москва, 1989), Третьей Международной конференции "Кристаллизация биологических макромолекул" (Вашингтон, 1989), 12-м Европейском кристаллографическом съезде (Москва, 1989), Международной конференции "Биосинтез белка" (Пущино, 1991), на ежегодных конференциях и конкурсах научных работ Института бежа (1988,1989)
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы ( /¿^"ссылок). Работа изложена на //4 страницах машинописного текста и содержит рисунков и 2. таблицы.
Основное содержание работы.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ посвящен структурным исследованиям рибосом кристаллографическими методами. Дана общая характеристика структуры рибосом. Описаны электронно-микроскопические исследования двумерных кристаллов (монослоев) рибосом и рибосомных субчастиц, обнаруженных in vivo и полученных in vitro. Приведены условия кристаллизации и характеристики
трехмерных кристаллов рибосомшй субчастиц. Обсуждается современное состояние проблемы.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ представлены в пяти разделах.
1. Получение кристаллизуемых препаратов рибосом.
Рибосома, имеющая молекулярную массу 2,35'I06 дальтон и не обладающая внутренней симметрией, представляет собой весьма трудный объект для кристаллизации. Сложный 'состав (три разных РНК и 52 различных белка) и известная подвижность частицы предъявляют высокие требования к препарату рибосом для получения качественных кристаллов.
Важной предпосылкой успеха было использование в качестве источника рибосом экстремально термофильного микроорганизма Tftermus tftermophi lus. Высокая температура среды его обитания (75°С) предполагает повышенную жесткость и стабильность макромолекул, что существенно для кристаллизации.
Высокая чистота и гомогенность препаратов имеют решавшее значение для успешной кристаллизации. Стандартные способы очистки рибосом с использованием переосаждения из высокой соли дают, в случае T.thermophilus, препараты, сильно загрязненные фрагментами мембран. Для удаления мембранных загрязнения мы использовали метод центрифугирования через CsCl-сахарозную подушку, предложенный З.Гогия (Гогия и др.,1985) Высокая плотность подушки препятствует вхождению в нее мембранных компонентов; как показывает электрофоретический анализ, одновременно удаляется большая часть примесных белков.
Для дальнейшей очистки рибосом нами была применена оригинальная процедура - гидрофобная хроматография на Butyl-Toyopearl 650S в диссоциирующем буфере с обратным градиентом сульфата аммония С Рис.X). Присутствие 400 мМ NaCl вызывает частичную диссоциацию рибосом. Предполагается, что, аналогично процедуре получения "tight couples", в первую очередь диссоциируют дефектные рибосомы. Хроматография позволяет разделить препарат на несколько компонентов.- Недиссоциированные
Рис.1 Хроматография рибосом на Ви"1у1-Тоуореаг1 65С6. Колонка 200 мл, фракции 18 мл, скорость 170 мл/ч. Образец 1,6 г. Градиент 1-0,3 М сульфата аммония в 20мМ трис-НС1, рН 7.5, ЮмМ МеС12, 400шМ ИаС1. Объем градиента 2л.
70S рибосомы составляют главный пик (3), 50S субчастицы разделяются на два компонента (пики I и 2), 30S субчастицы частично перекрываются с 70S рибосомами на правом склоне главного пика. Мы полагаем, что кроме отделения диссоциированных субчастиц, может происходить распределение самих рибосом в главном пике в соответствии с тонкими структурными особенностями, влияющими на сродство к носителю. Так рибосомы из левого склона главного пика воспроизводимо проявляют значительно меньшую способность к кристаллизации. Косвенным подтверждением
разделение свободных SOS
Рис.2 Мв2+-зависимость диссоциации рибосом. I - рибосомы, полученные очисткой в сахарозном градиенте, 2 - рибосомы, прошедшие очистку в CsCl-сахарозной подушке и хроматографию на ВТР. Диссоциация определяялась по светорассеянию при 400 нм.
эффекта фракционирования является субчастиц на два компонента.
Полученные препараты были охарактеризованы рядом методов. Рибосомы гомогенны по коэффициенту седиментации, не содержат примесных белков и имеют полный набор рибосомных белков (электрофорез) и целостные рРНК (седиментация), активны в бесклеточной системе трансляции. Важным показателем гомогенности препарата рибосом является зависимость диссоциации субчастиц от концентрации ионов Mg , представленная на Рис. 2. Узкий диапазон перехода от полной ассоциации к _полной диссоциации субчастиц, что характерно для полученного нами препарата (кривая 2), свидетельствует о его высокой структурной гомогенности.
2. Кристаллизация рибосом.
Образование кристаллов происходит при постепенном достижении состояния перенасыщенного раствора путем введения осадителей, снижающих растворимость, и/или повышения концентрации кристаллизуемого вещества. Выбор осадителя и ионные условия играют важную роль в процессе кристаллизации. В качестве осадителя в работе использовали 2-метил-2,4-пентандиол (МПД). Полиэтиленгликоль (ПЭГ 6000) оказался менее эффективным, а сульфат аммония не вызывал образования кристаллов. Буферный раствор для кристаллизации (буфер А) содержал 20 мМ Трис-HCl рН 7,5, 25 мм MgCl2, необходимые для поддержания ассоциированного состояния рибосом, а также 75 мМ Ш4С1 и 20О мМ КС1. Увеличение концентрации MgCl2 (до 100 мМ) не влияло существенно на процесс кристаллизации', а изменение концентрации одновалентного катиона вызывало соответственное изменение растворимости.
В начальных экспериментах по кристаллизации рибосом С.Д.Трахановым и М.М.Юсуповым были получены кристаллы бжи$рамидальноЯ формы. Кристаллы были небольших размеров, недостаточных для рентгеновских измерений. В данной работе процесс кристаллизации был усовершенствован для получения крупных кристаллов. Существенным отличием было использование препаративной кристаллизации с последующей перекристаллизацией и контролируемые условия роста одиночных кристаллов. При этом была получена также -другая кристаллическая форма - пластинчатые
микрокристаллы и, образующиеся при повышенной температуре -"прямоугольные" кристаллы.
Процесс кристаллизации заключался в следующем. В препарат рибосом (10 мг/мл, буфер А) диализом вводили МПД до конечной концентрации 10%. Это вызывало образование в течение 2-3 дней при 4°С взвеси пластинчатых микрокристаллов. В электронном микроскопе они выглядели как пластинки неопределенной формы размером 1-2 мкм и толщиной в несколько слоев рибосом. Выход этой кристаллической формы составлял несколько процентов от общей массы рибосом. После их удаления центрифугированием концентрацию) МПД повышали диализом до 13% и в течение 1-3 недель происходило образование большого числа мелких кристаллов бипирамидальной или яйцевидной формы. Их промывали 10% МПД и растворяли в буфере А. Рибосомная природа кристаллов была подтверждена аналитической седиментацией рибосом и рРНК, двумерным и ДДС-На-электрофорезом, электронно-микроскопическим анализом.
При выращивания крупных одиночных кристаллов важно обеспечить малое число центров кристаллизации в пробе. Для уменьшения количества таких центров при перекристаллизации МПД из растворенных кристаллов рибосом удаляли длительным диализом. Перекристаллизацию вели при 4°С методом "висящей капли", добавляя контролируемое количество МЦД в каплю, от I до 4% для разных препаратов рибосом, Противораствор содержал 10-13% МПД в буфере А. При оптимальных условиях в капле объемом 10 мкл за 2-4 недели вырастало несколько кристаллов размером до О,6*0,6*0,3 мм и более (рис.3).
Рис.3 Бипирамидальные кристаллы 70S рибосом Therms thermophilus. Масштабная метка 100 мкм.
Фракция пластинчатых микрокристаллов также использовалась для перекристаллизации. В этом случае форма получаемых кристаллов зависела от концентраций рибосом, МПД и температуры кристаллизации.
При 4°С и концентрации рибосом 1-2 мг/мл диализом против 12% МПД в буфере А получали тонкие пластинки прямоугольной формы (рис.4). С повышением температуры и исходной концентрации рибосом толщина пластинок увеличивалась. Увеличение концентрации ионов Не++ оказывало аналогичное действие. При температуре 37°С и начальной концентрации рибосом 50-60 мг/мл и МПД 25-30% в противорастворе. с использованием метода "висящей капли", были получены трехмерные кристаллы прямоугольной формы (рис.5).
Рис.4 Тонкие пластинчатые микрокристаллы 70S рибосом. Электронная микрофотография, негативный контраст. Масштабная метка 500нм.
Рис.5 Прямоугольные кристаллы 70S рибосом. Масштабная метка 100 мкм.
При сравнении рибосом из равных форм кристаллов оказалось, что активность рибосом из бипирамидальных кристаллов в трансляции поли(и) выше, чем рибосом из маточного раствора и пластинчатых микрокристаллов. В то же время, различий между рибосомами из растворенных бипирамидальных и пластинчатых микрокристаллов по седиментации частиц и рРНК. и составу рибосомных белков не обнаружено. Интересно отметить , что из' фракции пластинчатых микрокристаллов в некоторых случаях могли
быть получены бипирамидальные кристаллы. Однако обратный эффект, рост пластинчатых кристаллов из 1 фракции бипирамидальных кристаллов - не наблюдался. Это может объясняться существованием нескольких структурных состояний рибосомы, не отличающихся по составу и имеющих предпочтение к той или иной кристаллической форме.
3. Предварительные рентгеновские исследования бипирамидальных кристаллов.
Крупные кристаллы с хорошей огранкой использовали для измерений на синхротроне IURE (Орсей, Франция). Измерения проводились М.М.Юсуповым с участием лаборатории проф. Д.Мораса (Институт молекулярной и клеточной биологии, Страсбург). По отражениям от плоскостей (Ohl) и (hkO) были определены пространственная груша (или P432j3) и параметры
элементарной ячейки a=b=5I0 Ä, с=378 8. Кристаллы отражали с разрешением до 1вЯ.
Плотность кристаллов, определенная в градиенте концентрации перколла (Percoll), оказалась равной 1,12 г/см? Это означает, что в объеме элементарной ячейки содержится 8 рибосом, и, следовательно, I рибосома в независимой части элементарной ячейки. При молекулярной массе рибосомы 2,35*Ю6 дальтон параметр Мэтьюа VM равен 3,2 83/дальтон. Эта величина выходит за обычный диапазон и свидетельствует о том, что большая доля (около 60%) объема кристалла занята растворителем. Впрочем, это не удивительно для частиц такого размера. Кристаллы обладали, однако, хорошей механической прочностью и радиационной .стабильностью.
В дальнейшем кристаллы были использованы для, сбора рентгеновский дифракционных данных на синхротроне в Гамбурге и нейтронных наборов на реакторе ILL в Гренобле.
Подходы к решению фазовой задачи
Фазовая ""задача является одной из главных проблем, стоящих на пути решения кристаллической структуры рибосом. Большая молекулярная масса рибосомы накладывает дополнительные требования на использование классического метода изоморфных производных. Поверхность рибосом содержит множество потенциальных мест связывания для тяжелоатомных соединений, поэтому необходимо разрабатывать специальные подходы для адресной модификации, которые позволили бы ограничить число мест посадки. Кроме того, из-за большого объема элементарной ячейки для модификации должны быть использованы соединения с большим числом тяжелых атомов (кластеры). В данной работе разработан подход для адресной модификации рибосом тяжелоатомным кластером Аип через специфический лиганд - тРНК. Работа выполнена совместно с лабораторией проф. М.Шпринцля, Университет Байройта, ФРГ.
С другой стороны, размеры рибосомы достаточно велики для исследования кристаллов методами электронной микроскопии. Расположение рибосомных частиц в элементарной ячейке может быть реконструировано по изображениям ультратонких срезов кристалла и тонким (двумерным) кристаллическим слоям с разрешением достаточным для начального фазирования. Разумеется, структура анализируемых кристаллов должна быть идентична.При реконструкции могут быть использованы как существующие модели рибосомы так и полученные в результате анализа кристалла. Для реализации этого подхода в работе был проведен электронно-микроскопический анализ тонких пластинчатых микрокристаллов. Работа проводилась совместно с группой электронной микроскопии Института белка (В.Д.Васильев. С.Н.Рязанцев, Н.Н.Кальнин).
4. Электронно-микроскопические исследования тонких пластинчатых микрокристаллов.
Пластинчатые микрокристаллы, обнаруженные на первой стадии препаративной кристаллизации, оказались весьма перспективными
для электронно-микроскопических исследований. Подбор условий подготовки образца, а именно, ограниченное растворение верхних слоев микрокристалла, сорбированного на формваровой подложке, позволил получить изображения тонких слоев микрокристалла и оценить их качество. Расчетная картина дифракции с таких изображений простирается до разрешения около 3 нм.
Рисгб-Усредненные изображения негативно-контрастированных пластинчатых микрокристаллов разной толщины, (а)- монослой, (Ъ) - тонкий и С с) - толстый кристаллы. Вверху - фрагменты исходного изображения. Масштабная метка 100 нм. Квадратом показана элементарная ячейка 50x50 нм. Разрешение 7 нм.
Тонкие пластинчатые микрокристаллы, полученные
перекристализацией, имели вид тонких пластинок прямоугольной формы размерами 1-э микрон и толщиной в несколько слоев рибосом. На изображении негативно-контрастированных микрокристаллов (Рис. 4) виден характерный "решетчатый" рисунок расположения рибосом, организованных в тетрамеры. Двумерная элементарная ячейка изображения имеет размеры 50x50 нм, как показано на усредненных с разрешением 7 нм изображениях кристаллов различной толщины (Рис. 6). Подобный вид имеют и изображения ультратонких срезов,
параллельных плоскости кристалла (Рис. 7а). На изображениях, соответствующих монослою рибосом (Рис.ба и 7а-"М"). хорошо видно расположение тетрамеров друг относительно друга. Тетрамеры развернуты под углом в 17° к направлению решетки, причем наблюдается разворот в обе стороны и, соответственно, правая и левая конфигурации решетки. Аналогичную структуру имеет поверхность кристалла, как было показано методом оттенения ("Ка1п1п ег аг.,1993). Поперечные срезы различной ориентации (Рис. 7Ь,с,й) демонстрируют слоистую структуру кристалла. Видна зеркальная ориентация соседних слоев и сдвиг на пол-шага по обоим направлениям каждой пары слоев (бислоя). Совокупность всех
Рис.7 Электронно-микроскопические изображения ультратонких срезов пластинчатых микрокристаллов. (а)- срез в плоскости слоя, (Ь.с.й)- поперечные срезы разных ориентация. Толщина среза 50 нм. "М"- участок, соответствующий монослою рибосом. Масштабная метка 500 нм. Позитивный контраст.
электронно-микроскопических данных позволила смоделировать упаковку кристалла из рибосом, апроксимированных сферами диаметром 18 нм, представленную на Рис. 8. Предложенная упаковка относится к группе Р42,2 и имеет элементарную ячейку с размерами 50x50x76 нм.
Рис,8 Схема упаковки рибосом в пластинчатых микрокристаллах. Рибосомы представлены сферами диаметром 18 нм.
Таким образом, упаковка пластинчатых микрокристаллов отличается от таковой бипирамидальных кристаллов и, следовательно, не может быть прямо использована при решении их структуры. Однако, есть основания предполагать, что идентичную с пластинчатыми кристаллами структуру имеют прямоугольные кристаллы, выращенные при высокой температуре. Первая попытка провести их рентгеновские измерения показала, к сожалению, отсутствие дифракции, что может быть связано с нарушением структуры при понижении температуры для проведения измерений СБоибпа е{ а1..1993).
Работа по установлению структуры пластинчатых кристаллов продолжается в направлении повышения разрешения изображений ■ негативно-контрастированных микрокристаллов и построении модели организации рибосом в тетрамере.
5. Получение тяжелоатомного лиганда - тРНК,
модифицированной золотым кластером Аи1Г
Для использования в качестве тяжелоатомного лиганда для получения изоморфных производных кристаллов рибосом проведена
Phe
модификация тРНК Е.соИ золотым кластером и изучены свойства такой тРНК.
Водорастворимый одинадцатиатомный золотой кластер, содержащий малеимидную группу С Jahn,1989), имеет золотое 'ядро
диаметром 0,8 нм, внешнюю оболочку диаметром около 2 нм и молекулярную массу 6200 Да. Модификацию проводили по аминогруппе минорного нуклеотида 3-(3-амино-3-карбоксипропил)уридина в
Phe
положении 47 тРНК . На первой стадии аминогруппа этого нуклеотида реагировала с 2-иминотиоланом с образованием SH-группы. Малеимидная группа кластера ковалентно сшивалась с тРНК по SH-rpyrme на второй стадии. Реакцию вели в триэтаноламин-HCl буфере pH 7,5 с 10 мМ MgCl2 и 100 мМ NH4C1 при концентрации тРНК 0,5 мМ и 10-кратном избытке обоих реагентов. Выход реакции составил 20-30Ж в расчете на т.РНК. Было показано, что низкий выход обусловлен соответствующим содержанием минорного нуклеотида в тРНК. Непрореагировавшую тРНК удаляли хроматографией на обратно-фазовой колонке (RP-304, Bio-Rad) в градиенте метанола в ацетатном буфере pH 5,5 (Рис. 9). Модифицированная тРНК выходила с колонки при значительно более высокой концентрации метанола. Близкое к 100% обогащение модифицированной тРНК 'подтверждено гель-электрофорезом в 7М мочевине (на врезке) и по поглощению при 420 нм в спектре полученной тРНК-Au...
Php
Рис.9 Очистка тРНК -Aun на колонке RP-304 4.6x250 (BioRad).
Php
Образец: 10 о.е. тРНК после модификации. Буфер А: 50мМ ацетат натрия рн 5,5; буфер В: А + 50% метанол. Элюция градиентом от О до 100% буфера В. Скорость 0,5 мл/мин На врезке: электрофореграммы в 7М мочевине из пиков 1-3 и исходной смеси (RM).
Php
Функциональная активность тРНК -Au,, была исследована
Php
в реакции аминоацилирования, взаимодействии Фен-тРНК "-Аип с фактором элонгации Tu-GTP, в трансляции поли(Ш, а также в парциальных реакциях элонгации. Модификация по основанию, находящемуся в дополнительной петле тРНК., как и ожидалось, не повлияла на функциональные свойства тРНК, .активности остались практически • неизменными. Специально была подтверждена
Php
способность Ацетил-Фен-тРНК -Аии образовывать
•сайт-специфический комплекс с 70S рибосомами Г.thermophilus.
Php
Поскольку показано, что комплекс 70S-omro(U) ■ Ацетил-Фен-тРНК ' образует кристаллы той же формы, что и свободные рибосомы (Yusupova et al.,1991), это открывает путь к получению тяжелоатомных производных кристаллов рибосом для решения Фазовой задачи.
ВЫВОДЫ
1.Разработана методика очистки 70S рибосом îhermus thermphilus для получения кристаллизуемых препаратов рибосом.
2.Получены три кристаллические формы 70S рибосом îftermus thermophilus:
а) трехмерные бипирамидальные кристаллы. Найдены условия выращивания крупных кристаллов, пригодных для рентгеноструктурного анализа.
б) тонкие пластинчатые микрокристаллы, пригодные для электронно-микроскопических исследований.
в) трехмерные прямоугольные кристаллы предположительно с той же упаковкой, что и пластинчатые микрокристаллы; получены при 37°С.
3.Проведены предварительные рентгенографические исследования бипирамидальных кристаллов. Определена пространственная группа P4j2t2 (или энантиоморфная P432j2), параметры элементарной ячейки а=Ь=5Ю Я. с=378 Я, в независимой части элементарной ячейки содержится одна рибосома ; предельное разрешение 18 Я.
4.Тонкие пластинчатые микрокристаллы исследованы методами негативного контрастирования, ультратонких срезов и оттенения. Из совокупности электронно-микроскопических данных определены параметры и построена модель упаковки микрокристалла из монослоев рибосомных частиц. Элементарная ячейка пространственной группы P42j2 с размерами 50x50x76 нм содержит 16 рибосом, организованных в тетрамеры. Предполагается, что эти данные могут быть использованы при решении фазовой задачи в рентгеноструктурном исследовании прямоугольных кристаллов.
5.Для получения изоморфных производных кристаллов рибосом с помощью тяжелоатомного лиганда проведена модификация фенилаланиновой тРНК Е. сои одинадцатиатомным золотым кластером Auu Показано полное сохранение функциональных свойств модифицированной тРНК в процессах аминоацилирования и трансляции и способность к образованию комплекса с рибосомами Т. thermophi lus.
Материалы диссертации представлены в следующих публикациях
1.Trakhanov S.D., Yusupov М.М.. Agalarov S.C., Garber М.В.. Ryazantsev S.N., Tischenko S.V., and Shlrokov 7.A. Crystallization of 70S ribosones and 30S ribosomal submits irom Tftermus ttiermophi lus. - PEBS Lett., 1987. v.220. No 2, p.319-322.
2.Shlrokov V.A..Trakhanov S.D.. Yusupov M.M. "Tischenko S.V., Ryazantsev S.N., Sergeev Yu.V., Garber M.B.. Vasiliev V.D., Mitschler A.. Ruff M.. Thierry J.-C., and Moras D. Crystallization and preliminary X-ray investigation of ribosomes from Therms t hemophilus. - Abstracts of Internet. Symp. "Molecular organization of biological structures", June 19-24, 1989, Moscow, p.248..
3.Trakhanov S.D., Yusupov M.M.. Shlrokov V.A., Garber M.B., Mitschler A., Ruff M.. Thierry J.-C.. and Moras D. Preliminary X-ray investigation of 70S ribosome crystals from Thermits thernophilus. - J.Mol.Biol., 1989. v.209, p.327-328.
4.Shlrokov V.A., Yusupov M.M. Trakhanov S.D., Ryazantsev S.N., Sergeev Yu.V., Tischenko S.V.. Garber M.B., and Vasiliev
V.D. Hew crystalline forma of 70S rlbosomes and 30S rlbosomal submits from Therms thermophilus. - Abstracts oi the 3rd Internat. Conf. on Crystallization of Biological Macromolecules, August 13-19, 1989, Washington, D.C., p.102.
5.Sergeev Yu.V.. Shirokov V.A.. Ryazantsev S.U., Vasiliev V.D., Trakhanov S.D., Yusupov M.M, Tischenko S.V., and Garber M.B. Electron microscopy analysis oi crystals of 70S ribosomes and 30S rlbosomal subunits from Thermus thermophilus. Abstracts of 12th European Crystallographic Meeting. August 20-29, 1989, Moscow, p.401.
6.Shirokov V.A., Ryazantsev S.N., Sergeev Yu.V., Garber M.B., and Vasiliev V.D. Thin laminar nicrocryetals of 70S riboeomes from Therms tftermophUus. - FEBS Lett., 1989, v.258, Nor. 1, p. 147-149.
7.Широков В.А., Гарбер М.Б. Кристаллизация рибосом и перспективы структурных исследований. Успехи биол.химии, 1991, т.ХХХП, с,50-62.
8.Garber М.В.. Agalarov S.Ch., Eliseikina I.A.. Sedelnikova S.E., Tischenko S.V.. Shirokov V.A., Yusupov M.M., Reshetnikova I.S., Trakhanov S.D., Tukalo M.A., and Yaremchuk A.D. Purification and crystallization of components of the protein-synthesizing system from Therms thermophi I us.
J.Cry St.Growth, 1991, v.110. p.228-236.
9.Ryazantsev S.N., Kalnln N.N., Shirokov V.A., Agalarov S.Ch., Yusupov M.M.. Sergeev Yu.V., and Vasiliev V.D. Electron microscopy of Thermus thermophilus 70S ribosome ralcrocryetale. 2.Low resolution crystal packing derived from plane projections. - J.Struct.Biol.. 1993, v.110, p.167-175.
10.Shirokov V.A., Ott G., Heiland G.. and Sprinzl M.
Php
Functionally active gold cluster modified tKHA from E.coli. -Abstracts of Internat.Conf."Protein Biosynthesis", Aug 26-Sep 3, 1991. Pushchino.
11.Blechschmidt В., Shirokov V.A., and Sprinzl M.
Phe
Undocagöld cluster modified tRNA from Escherichia coli and its activity in the protein elongation cycle. - Eur.J.Biochem..
)
- Широков, Владимир Анатольевич
- кандидата биологических наук
- Москва, 1994
- ВАК 03.00.03
- Выделение, кристаллизация и структурные исследования компонентов аппарата трансляции
- Кристаллизация и исследование структуры фактора терминации трансляции RF1 и фактора рециклинга рибосом RRF из Thermus thermophilus
- Выделение, исследование и кристаллизация РНК-связывающих рибосомных белков из THERMUS THERMOPHILUS
- Рибосомные белки Thermus thermophilus. Выделение, физико-химические свойства и кристаллизация
- 5S pPHK-белковый комплекс THERMUS THERMOPHILUS: участки связывания белков L5 и L18 на 5S pPHK и пространственная структура комплекса белка L5 со специфическим фрагментом PHK