Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Криорезистентность и метаболизм спермиев карпа

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Криорезистентность и метаболизм спермиев карпа"

р г г-( Л П ) I о V > i

\ ï " Í Е "s ^

Национальна Лкадом i я Наук Украпн*

IÜCTHTVT проблем кршбшлоН ï тл кр1омедицини

на правах рукопису

Черепанов Валер i й Васильович

KPIОРЕЗICTEHTHIСТЬ ТА МЕТАБОЛI3M СПЕРМIIВ КОРОПА

03.00.02 - кршбшлшйя

АВТОРЕФЕРАТ дисертацП на здобуття вченого ступеня кандидата бшлоНчних наук

Харкав - 1996

Дисертащею е рукогшс.

Робота виконана в IncTrayri проблем Kpioöio^orii i кршмеди-цини Нац1онально1 Академii наук Украх'ни

HayKOBi KepiBHMKH: ст.н.с., к.б.н., Е.Ф.Коп1йко,

наук.консультант - академик HAH Укра'хни, доктор мед.-наук, професор, лауреат державних прем1й СРСР та Укра'1ни В.I.Грищенко 0фщ1йш опоненти: доктор üiojiorimirac наук, професор В.I.Луговой доктор бшлоНчних наук, А.I.Божков

Провщна установа: Харювський держун1 вереiтот

Захист в1дбудеться "2 ¡QHj^cMio »■ iggg року Q/3 годинi на aaciflaHHi спещал!зовано1 ради Д 50.21.01 при iHCTmyii проблем кршбшлогП та кр1омедищни HAH Укра'хни (310015, Харк1В-15, вул.Переясл1всьиа, 23).

3 дисертац1ею мота ознайомитися в бiблioтeцi Iпетитуту проблем кр1об1олагП та кршмедицини HAH Укра'йш.

Афтореферат розiслано _1996 року.

Вчеш1й секретар Спец1ал1зовано1 Ради,

доктор медичних наук, М^ професор А.М.Гольцев

ЗАГАЛЬИА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ. Антропогенний вплив на бтсферу, який все зростае, призводить до постШюго поНршен-ня умов ¡снування тварин та рослин 1, як насл1док, до зникнен-ня не -пльки окремих вид1в, але 1 щлих бшценоз1в.

Теоретично можлив1 дек1лька вар1ант!в збереження бшр1знома1йтност1. Одним з них е створення кршбанк1в заморо-жених гамет, ембр1он1в, ембршнальних та соматичних тканин, викорисгання яких в подальшому дасть можлгапсть в1дновити по-пуляцГх нав1ть вид!в, як1 вже зникли.

Однак, для створення банк1в, окр1м материально! бази, не-о6х!дна розробка метод1в отримання цих тканин в1д доноров та заморожування !х. Як показали досл1дження, сперм!1 риб мають дуже високу р1зницю в кр1ост1йкост1.

На Я1йсть заморожування суттевий вплив можуть чинити ба-гато Я1и (Нолог!ч1и £ ф1зич1й фактори, так1 як генетич1п та ф1з1олог!чн1 особливост1 пл1д1шк1в, умови нагулу, преднерестового утримання, час експозищ1, як!сть та (ильктть г!поф1зар-них !ндуктор!в дозр1вання, як1 вводяться, склад 1 температура кршзахисних середовищ, час екв1л1брацП з кршзахисними сере-довищами, форма 1 об'ем контейнер¡в для заморожування, режими заморожування-омдтаяння та способи оплщиення в1дталою спермою.

Однак, до нашого часу, немае пор1внювально1 ощнки впливу перел1чених фактор 1 в на кр!ост1йк1сть сперм Пв риб.

У да(йй робот! ми досл1джували вплив г1Поф1зарно! стиму-ляцП дозр1вання на кртст!йк!сть, основн1 ф1зшлог1чн! (рух-лив!сть 1 ошпднююча здатн1сть) та деяю б1ох1м!ч1П параметри сперми коропа (актив^сть фермент1в та вм1ст метабол1т!в енер-гетичного 1 пластичного обмппв), вивчали вм!ст метабол!т1в в

активованих сперм1ях до 1 гпсля екв!л1брацГ! та кршконсер-ващ1 I з метою з'ясування характеру кршпошкоджень 1 встанов-лення терка(пп отримания максимально ст1йких до заморожуван-ня-в1дтаяння спермНв коропа.

Для досягнення поставлено! в робот1 мети необх1дно було розв'язати наступи1 завдання:

Вивчити вплив гормонально! ¡шдукц!! дозр1вання на деяк1 6шх1м1ч1й параметри сперми коропа (актишисть фермент!в та вм1ст метаболгг1в енергетичного 1 пластичного обмппв), отри-мано! з р1зних д1лянок молок.

Вивчити ст!йк!сть сперм 1 '¿в, отриманих з р1знкх дхлянок молок 1 в р1зн1 строки п1сля гормонально! ЬщукцП дозр1вання, до фактор 1 в кршконсерацГ! .

Вивчити вплив еквШбрацП з кр!озахисним середовищем та кршконсервацГ! на енергетичний обм1н активованих сперм Пв коропа.

Наукова новизна одержаних результат1в. Проведен! досл1дження дозволили встановити, що: сперма коропа, отримана з р1зних Д1ляпок молок, в нерес-товий першд п!сля заморожування-в1дтаяння опл1днюе до 30% !кри хорошо! якост1;

сперм1!, отримаьп з молок коропа гпсля 24-годин впливу гормон1в Нпофгзу, мають б1льш високу кр1остШйсть;

глюкоза е одним з основних субстратов, який необхщний сперм1ям коропа для руху;

сперм1! коропа мають АТФ-регенеруючу систему, яка склада-еться з иреатинфосфокншзи I аден1латк1нази;

заморожування-в1дтаяння призводить до зменшення к1лькост1 активно-рухливих сперм!!в коропа, що пов'язано з порушенням

npoueciB метабол1зму глюкози, синтезу i г1дршпзу макро-ерНчних фосфатiв;

6Libiua к1льк1сть КФ i АТФ в cnepMinx коропа в 24-годинний порiод пшля rino$i3apHoi стимуляцП дозр1вання е одним з не-обх1дних (faKTopia, HKi забезпечують pyx i ошпднення нативних та високу опл]днююму здатн1сть шдтаяних спермПв.

Теоретична та практична значн1сть робот.

Теоретичне значения полягае у тому, що з'ясовлн! нов! аспекта енергетичного метабол!зму активованих, замороже-них-в1дтаяних спермПв коропа, встановлен! основн! енергетичн! субстрата, як1 необх1дн1 для забезпечення рухально! активност1 спермПв, вивчено ряд катабол1чних i анабол1чних 6ioxiMi4iinx реакщй в спермiflx i молоках коропа.

Теоретичне значения роботи полягае також в тому, що вста-новлена можлшпсть отримання як1сного потомства в1д замороже-них-в1дтаяних cnepMi'iB, як1 отриман! з молок коропа, i обгрун-тован1 теоретичн! посилки стосовно св1жих молок загиблих пл1д-mmiB цпших BHfliB риб з метой збереження ix генофонду.

Встановлено, що одним з найважлившнх енергетичних субстрат1в, необхщних сперм1ям для руху, е глюкоза, що потр1бно брати до уваги при створеннi нових кршзахисних i ак-тивуючих середовищ.

Використання модиф1кованих активуючих середовищ на Ли-манському рибгосп! Харк1всько1 облаетi в 1994 та 1995 роках при отримаши личинок KoponiB i рослино1Дних риб дало реальний прибуток у сумi, яка екв1валентна 40.000 долар!в США та позба-вило в1д необх1дност1 закупки личинок в iiiuinx perioHax та за-безпечила Харк1вську область посадковим матерiалом цьогор!чка-ми KoponiB i товстолобик1в на 1995 та 1996 роки.

- 6 -

Голов»i положения, hkî виносяться на захист.

1. Застосування гомологi4noro rinoiiiaapnoro препарату суттево впливае на як1сть спермПв коропа.

2. Енергозабезпечення рухально! активное^ спермПв коропа зд1йснюбться за участи крсатинк i назно'1-аден i латк i назно! системи.

3. Одним з осповних субстратîb окисления, hkî забезпечу-ють регенеращю макроертчних сполук спермПв в норм! i niсля KpioKOHcepBaiû ï е глюкоза.

Апробащя роботи. Матер 1али дисертащйно! робота до-noBiдались i обговорювались на М1жнародн1й конференцГ! "Достижения и перспективы развития криобиологии и криомедицины (1988 г. Харьков), 4-м Всесоюзном совещании по рыбохозяйственному использованию теплых вод (Курчатов, 1990 г.), Втором симпозиуме по экологической биохимии рыб (г.Ярославль, 1990 г.), 11-й Международной конференции "Успехи современной криобиологии", (Харьков, 1992), VIII научной конференции по экологической физиологии и биохимии рыб (Петрозаводск, 1992), Workshop on Eamete and embryo storage and cryopreservation in aquatic organisms (Marly le Roy, France, 1992) та на International symposium on sturgeons (Moskow-Kostroma-Moskow, 1993).

Публ!кащ!. Голов1п положения роботи викладонi у 15 дру-кованих роботах.

Обсяг та структура роботи.

Робота надрукована на 114 листах, мае традщ1йну структуру - введения, матер 1али i метода, три глави власних дослщ-жень з обговорюванням отриманих результатов, вивод1в, списку Л1тератури, що була використана в робот!, списку скоротчень та Пр1ДЗхКу.

- 7 -

Матер1зли та методи досл!дження.

Робота виконувалась на гаметах та гонадах безпородних самщв коропа з осен1 1986 по 1994 р!к. Восени 1986 року досл1дження 1 заготовка матер!алу проводилась на баз! екс-пер!ментального рибного господарства "Якоть", Загальносоюзного НД1 прудового рибного господарства, Дмитровський р-н, Мос-ковська обл. В 1988 роц1 в 1ПК I К АН УССР були проведен! екс-перименти по визначеннш активност! фермент!в ! вм!сту метабо-лит!в. В березн! 1989 року було проведено експерименти по виз-наченнга опл1дшоючо1 здатност! розмороженно! сперми. Щ роботи проводились на експерименталыпй баз! Т1НР0 в рибному госпо-дарств! Приморсько! ДРЕС, Пожарський р-н Приморського краю.

Впровадження в виробництво результат!в роб!т проводилось на Лиманському рибгосп!, ЗмПвський р-н Харк1всько! обл. в 1994 ! 1995 рощ.

В робот! використали !кру ! сперму, отриман! з гонад сазана за допомогою г1поф!зарно'! стимуляцП дозр!вання (ГСД).

Заморожування проводили в захистному середовищ!, запропо-нованому Коп!йкою Е.Ф. в 1986 р. за традгацйною трьохетапною програмою за допомогою стащонарного програмного пристрою УОП-6.

Розморожували сперму на водян!й бан1 при 37 °С.

Як!сть сперми до ! п!сля заморожування визначали в!зуаль-но п!д м1кроскопом при зб^ьшеши х200 ! виражали у высотках рухливих кл!тин, яки рухались прямолнпйно, поступально до за-гально! к!лькост! кл!тин у пол! зору м1кроскопу.

Для б!ох!м!чних досл!джень молоки, видобут! з самц!в, переносили на 0,25 М цукрозний л!д з 0,05 М тр!с-НС1, рН 7.0 ! д!лили на три частини: головну, серединку та анальну, видалю-

- а -

вали значн1 кровеносн1 судини, промивали в 0,25 М цукроз1, п1дсушували фIльтровальним папером 1 продавлювали через мель-ничний газ N64. Отриманий гомогенат Д1лили на три частини.

Вьист першо1 розливали в ампули, заморожували у р1дкому азот! I використовували для подальшого визначсння в них фер-ментативних активностей.

Другу частину приливали до такого ж об'ему охолодженно! 10% НСЬ04, перем1шували, швидко заморожували в р1дкому азот! 1 використовували для визначення вмхсту метабол!т!в в молоках.

Третю частину розбавляли в сн1ВВ1Дношенн1 1:1 кршзахис-ним середовищем, заморожували за програмою 1 використовували для визначення ошиднюючо! здатност1 молок коропа.

Сперму, отриману В1д шаднюйв, д1лили на д(й частини: першу розбавляли кршзахисним середовищем 1 ддлили на дв1 частини: одну лжубували 30 хвилик в холодильнику, а другу акти-вували 1 через певн1 1нтервали часу ал1квоту приливали до такого ж об'ему 10% НСЮ4 1 швидко заморожували в р1дкому азот!, а другу заморожували за програмою 1 використовували для визначення вм1сту метаболит!в в активованих сперм^ях п1сля екв1л!б-рацП з кршзахисним середовищем 1 заморожених-в1дтаяних; другу частину нативно! сперми активували г1потон1чним солевим середовищем 1 через певн1 1нтервали часу ал1квоту приливали до такого ж об'вму 10% НСЮ4 1 швидко заморожували в р!дкому азо-т1 та використовували для визначення вм!сту метаболит1в в на-тивн1й активован1й сперм1.

Активн1сть фермент!в вим1рювали за допомогою спряжених ферментативних реакщй, флуориметрично по швидкост! в1дновлен-ня або окисления п1ридиннуклеотид1в (ПН) ! виражали в нмоль ПН*мг б!лку~1*хвилину"1. Вм1ст метаболитов вим1рювали фермен-

тативним методом за допомогою спряжених ферментативних реак-цш, флуориметрично за гЛльк1сти в1диовлеиих або окислених п1-ридиннуклеотидхв 1 выражали в нмоль*мг Гилку"1.

Одержан! дан1 були оброблеи! статистично. Про достов1р-тсть судили при Р>0.05.

Результат й обговорення.

Глава 1. Бioxiмiчпi змпт в молоках коропа п1сля Нпоф!-зарно! стимуляцП дозр1вання.

Г11сля г!поф1зарно1 стимуляц11 дозр1вання (ГСД) в1дбува-еться зм1ма об'ему еякулята, який в1ддавався коропами-шпдни-ками. Максимальна к1льк1сть сперми, що в1ддавалась самцями припадала на 20-24 годину спостережень, пот!м вщбуваеться л1-н1йне пад!ння к1лькост1 в1ддаваемо'х сперми майже до повно! в1дсутност1 на 50-й годши. У зв'язку з отриманими даними було щкаво простежнти змшу вм!сту б1лка в молоках шсля ГСД. Дос-тов1рне зниження вм1сту загального б1лка спостер!галось на 24-й годшй д1 гормон1в Нпоф1зу у вс1х д1лянках молок. Най-б!льш низький вм!ст 61лка 1, як насл1док, максимальне напов-нення с1менник1в р1диною в контрол1 спостер1гаеться в анальному в1дд]л1. Через 12 годин п1сля введения гомогенату г!поф!зу в1дбуваеться незначне пад!ння вм!сту б1лка I т1льки через 24 години епостер1гаеться достов1рне зменшення цього показника. Через 36 годин результата не в1др1знялись шд таких для 24 годин.

Р1вень розчхиного б1лка на 12 годинний пер1од достов1рно знижуеться на вс!х дхлянках молок. На 24-й годит спостере-женнь в!дбувалось п!двищення вм!сту розч1нного б1лка, яке про-довжувалось наступи1 12 годин.

В БИД!ЛЯСм1п Схмённхп ПЛаЗм! 1 ОПОрмIЯХ, ОКр1м 61ЛК1В, ЯК

вщомо, знаходиться велика к1льюсть необхщних для життед1-яльност! спермИв низькомолекулярних сполук - вуглевод!в, орган ¡чних 1 неорган!чних кислот, солей, спирт1в та !и. Але 1з л1тератури, що мается в нашому роспорядженн!, не можно виявити однозначно! думки про те, яка !з цих сполук является основним постачалышком енерг11, необхщно! для руху сперм Ив риб. Дея-К1 автори висловлюють припущення про те, ¡до у риб в зв'язку з 301ш1шн1м ошпдненням у середовищ з високим, як правило, вмятом кисню, роль вуглевод!в як постачальник1в енорг!1 для руху, невелика. Але, в той же час е робот, як1 спростовують цю думку.

На малюнках 112 представлен! результата вим!р!в вм1сту глнжози (ГЛ), лактату (ЛАК), малату (МАЛ), АТФ 1 креатинфосфа-ту (Кф) в молоках коропа шсля ГСД.

Максимум вм!сту ГЛ в молоках ми спостер1гали у тварин в контроле При введен! г1поф1зар»ого препарату вм1ст ГЛ несут-тево знижуеться на вс1х д1лянках молок (Мал.1.) з одночасним достов1рним п1двищенням р1вня ЛАК.

Вмгст ЛАК в орган! зростае на 30% на вс!х д!лянках молок на 12 годинному !нтервал! часу ! не зм!нюеться до 36-'! години.

Значне п1дви1дення к!лькост! МАЛ вщбуваеться також через 12 годин п!сля гормонального впливу ! в подальшому п!дтриму-еться на тому ж р!вн1. В молоках контрольних тварин спостер!-гаеться достатньо високий р1вень вм!сту КФ (Мал.2) ! майже в три рази менший вм!ст АТФ. На 12-й годин! п!сля введения гор-мошв г!поф!зу вгдбуваеться р!зке зменшення к!лькост! КФ ! не-достов1рне зниження АТФ повторюе коливання р!вня КФ, хоча ц! коливання мають недостов!рний характер. На 24-й годин! вм!ст КФ в молоках достов!рно тдвищуеться ! на 36-годинному !нтер-

вал! часу знову достов!рмо знижуеться.

К 12 24 Эй ТЕРМШ (ГОДИН)

§ 50 40

с-,

^ ЭЭ

¿гг

ГТ

РТт"

К 12 24 ТКРМГН (ГОДИТ [)

КФ ЛТФ

Малинок 1. Вьйст глюкози, лак-тату 1 малату в молоках коропа п1сля 1чпоф!зарно1 стимуляцП дозр1вання (нмоль*мг 61лку-1).

К 12 24 36 ТЕРМ1Н (ГОДИН)

Малюнок 2. Вм1ст креатинфос-фату 1 АТФ в молоках коропа п!сля г1поф1зарно1 стимуляцП дозр1вання (нмоль*мг б1лку-1).

2500 2000 1500 1000 500 О

Р?

Тп

К 12 24 36 ТЕРМШ (ГОДИН)

ААТ ДЦГ

Малюнок 3. Аденхлаткпшзна 1 креатишйнлзна активност! в молоках коропа п!сля г1по-ф1зарно1 стимуляцП дозр1ваи-ня (нмоль АТФ*мг б1лку_1*хви-лину"1).

Малюнок 4.Аспартатам1нотранс-феразна та лактатдеНдрогеназ-на активност1 в молоках коропа п1сля г1по$1зарно'х стимуляц11 дозр1вання (нмоль НАД*мг боку" 1*хвилину1).

Динам¡ка активност1 фермент1в АТФ-регенерируючо1 систе-ми - креатинфос$ок1нази 1 аден!латк1нази, представлена на ма-

люнку 3. Активность обох фермент1в знаходиться на приблизно однаковому р!вн!, близько 750 нмоль АТФ*мг б1лка~1*хвилину~1 в контршй 1 у подальшому достов1рио гидвищуеться майже в три рази на 12-й годюа 1 зростае на 36-годинному першд! часу п!сля введения гормон¡в г!поф!зу.

Аналог!чну динам1ку активност! ми спостер1гали для деяких !нших фермент ¡в (ЛДГ та. ААТ) як! представлен! на малюнку 4. Достов1рн1 коливання активност! в1дбувались з ферментами НАДФ-редуктазно! системи - !зоцитратдег!дрогенази, глюко-зо-6-фосфатдег! дрогенази 1 НАДФ-залежно! малатдеНдрогенази (Мал. 5).

Глава 2. Вплив фактор1в иршкосервацП на функцшнальн 1

властивост1 сперм!!в, отриманих з молок коропа п1сля_г!поф!-

зарно! стимуляцИ дозр!вання.

Для вивчення впливу фактор!в кршконсервацП на спермП, як1 вид¡лен! з молок коропа через р1зн! пер!оди п!сля введения гомогенату г!поф!зу, нами було проведен! енсперименти по виз-наченни основних як!сних показник!в життед!яльност! сперм!!в -рухливост! ! ошйднюгачо! здатност!.

Статистично значимих зм!н в активност! сперматозодав, отриманих з р!зних д!лянок молок, в кожному з часових !нтерва-л!в п1сля введения гормон1в ! в контрол1, нами знайдено не було.

Найменш п!длягала д!! гормон¡в головна д!лянка, актив-н1сть сперм Пв з яко! у вс1 часов! пер!оди п1сля г!поф!зарно! стимуляц!!, знаходилась на р1вн1 70 - 80%. Активн!сть сперм!-!в, отриманих з двох !нших Д1лянок молок статистично достов¡р-но п1двищувалась на 12-й годин! д!!" гормон ¡в. На протяз! нас-тупних 12 годин залишалась на тому ж р!вн1 ! достов!рно знижу-

валась на 36-й годши 1нкубацП. Така динам ша активностг спермИв добре корелюе з отриманими нами 1 ¡ншими авторами (Кисильов) даними про змпюння об'ему вид1ляемого коропами еякуляту п1сля п"по?лзарно1 стмуляц!У дозр!вання. На малюнку 6 приведено дан1 про активн!сть сперм!1в та об'ем в1ддаваемого коропами еякуляту п1сля Нпофизарно! стимуляцП дозр1вання.

400 350 300 250 200 150 100

у У • I ! -,1.........1...... 1 '

П1

/

X

-н \

1ВДГ

Мдг

К 12 24 36 ТЕРМГИ (ГОДИН)

100 90 НО 70 60 50 40 30 20 10 О

рухл ИВ1СТЬ, % /

о 10 ¿ГаПо 50

ТЕРМ1Н (ЮДИН)

Малюнок 5. НАДФ - редуктазна актившсть в молоках коропа п1сля г!поф1зарно1 стимуляцП дозрйшния (нмоль НАДЯ! * мг (п лку~1*хвилину_1).

Об'ем в1ддаваемого самцями еякуляту такой, як I актившсть сперм Пв, зростае на 20-24 годинах дП гормон!в 1 знижу-еться на 40-50 годинах. К!льк1сть еякуляту, вгддаваемого самцями на початку 1 напртинц! експер1менту дор1вншвала майже нулю. Активн1сть спермИв в щ першди часу залишалась дос-татньо високои.

Незважакт на готовн!сть сперм!!в, як1 знаходяться на вс1х д1лянках молок, у вс! часов! першди до ошпднення, ф!з1-олоНчна як!сть цих сперм11в виявилась р!зною, що добре видно

Малюнок 6. Як1сть 1 1ильк1сть сперми, вид!лясмо1 самцями коропа пIсля Нпо^зарно! стиму-ляцП дозр1вання.

з результатов експериментхв по вивченню ст1йкост! сперм 1 '¿в до р1зпих фактор!в, як1 впливають на них при п!дготокц! 1 прове-денн1 кршконсервацП .

Представлен! на малюнку 7 дан! показують, що розбавлення суспензП сперматозодав, отриманих з молок, кр!озахистним се-редовищем та !нкубащя на протяз! 30 хвилин при 0-4 °С приводить до достов1рного зниження !х активност! в ионтрол! ! нез-начному зниженню через 24 години п!сля гормонального впливу. У

рухлипих спсрмнв

К 12 34 36 ТЕРМШ (ГОДИН)

К 12 34 ЗС ТЕРМШ (ГОДИН)

Малюнок 7. Рухлив!сть сперм1- Малюнок 8. Рухлив!сть ! оп-!в коропа п!сля екв!л!брац!! л!днююча здатн!сть сперм!!в з крюзахисним середовищем. коропа п!сля заморожуван-

ня-в!дтаювання.

двох !нших часових !нтервалах розбавлення сперми захисним середовищем та наступна !нкубац!я при 0-4 °С приводить до недос-тов!рного ¡йдвюдення активност! спермПв !з вс!х д!лянок молок.

Заморожування-в!дтаювання сперматозо!д!в, отриманих з молок коропа через р!зн! !нтервали п!сля г!поф!зарно! стимуляц!! приводило до значного зниження !х активност!. Найб!лыиу чутли-в!сть мали сперм!'!, отриман! з молок через 36 годин ! в конт-

рол!. БЬчыау стУнисть мали сперм! 1, отриман! через 12 ! 24 годики пхсля !ндукцГх дозр!вэння (близько 20% рухливих кл1-тин).

Основикм показником ф!з!олог1чно'х повнощнност! спермГхв е IX здат!исть до опл!днення яйцекл!тин. Експерименти з визна-чення здатност! заморожених-в1дтаяних сперм!!в проводились 1псля майже двор!чного збереження вивчаемого матер!алу в кр!о банку 1ПК 1 К АН УРСР.

На малюнку 8 представлен! результата проведених експери-ментхв. У контрол!, тобто у вхдтаянш сперм!, отриман!й з молок коропа, якому не було зроблено !н'екцш гомогенату г!поф1-за, оплхднюгача здатн!сть досягала 20°/.. Б1льш високу опл!днмючу властив!сть мали сперм!'!, отриман! з молок через 12 годин гйс-ля стимуляцИ дозр!вання. Б!льш як1сними по опл!днююч!й здат-ност!, незважаючи на найнижчу активн!сть - менше 5Х, виявились сперм!'!, отриман! з молок через 36 годин теля ст!муляцП доз-р!вання. Статистично значимим зб!льшенням загипднюючо! власти-вост1 пор!вняно до вс!х !нших !нтервал!в часу, характеризува-лись сперм!'!, отриман! з молок теля 24 годин гормонального впливу.

Запл!днююча здатнгсть спермГхв була в два рази внщою, н!ж при 12 ! 36-годинн!й експозщГх .

Глава 3. Д!я фактор!в кршконсерващ! на енергетичний об-м!н активованих сперм Л в коропа.

Для з'ясування впливу екв^брацП спермГхв з кршзахис-ним середовищем ! кр!оконсервацГх на енергетичн! параметри спермГхв, необх!дно було встановити, як! метабол!чн! шляхи або цикли перетворення ! накопичення енергГх у вигляд! макроерНч-них фосфатних сполучень являшться необх!дними для активного

руху сперм Пв коропа.

BiflOMO, що активний першд у житт1 спермПв коропа займае 1-2 хвилини. За такий короткий перiод часу енерНя для руху може здобуватися або с депо макроерНчних фосфатов, як! кл1ти-на запасла panime, або повинно бути включено потужне джерело перетворення енергП вуглевод1в або лигпд1в в енергш макроерНчних фосфатних зв'язк1в, яка витрачается дйкмповими АТФ-азами для руху спермГхв. Найбгльш значимими для сперм üb коропа джерелами енергП, мабуть, являються вуглеводи i л1п1-ди, а мехатзми перетворення eneprii - процеси аеробного i анаеробного окисления, KOTpi реал1зуються у гл1кол!з! та цикл1 трикарбонових кiслот i лопалi30Bani у цитоплазм! та м1тохонд-р!ях.

У доступн1й нам л1тератур1 немас даних про впл1в KpioKon-серкацП на енергетичний метабол1зм спермПв коропа, Я1и руха-ються.

3 результатiE проведених експеримеотв видно, що на мета-бол13м спермПв, як! активно рухаються, суттево впливас 30-хвилинна 1нкубац1Я свiжевiдцiжених cnepMiiB в холодильнику в нативному стан1, наступна 30-хвилинна екв1л1бращя розбавле-no'i кршзахисиим середовищем сперми i заморожування-в!дтаяння та за програмою, тобто Bei технологi4!ii операц!i , як! прово-дяться 3i спермою при заморожувашй.

Опис отриманих результатов почнемо з вм!сту глюко-зо-6-фосфату в активованих сперм1ях, першого фосфорiльного 1н-термед1ату, який стоить на перехрест! двох метаболi'innx шлях1в - гл1кол1зу i пентозофосфатного циклу.

Bei досл1джен1 нами впливи не приводять до змпш початко-вого вм!сту Г6Ф nopiBHHHQ до контроля. Активащя нативних

сперм!хв приводить до достогирного зростання майже в 4 рази, р!вня ГбФ на 15 секундах 1 в подальшому до достовхрного плдхн-ня вм1сту цього метабол1 ту.

1нкубац!я спорки 1в з кршзахнсним середовкщем приводила до достов1рного п!двищення б1льш Н1Ж в 5 раз!в початкового р!вня Г6Ф через 15 секунд п1сля початку руху, який не зм1ню-вався на протяз1 наступних 25 секунд 1 на 90 секунд! повертав-ся до початкового стану.

Активащя сперм!хв, як! були заморожен!-в!дтаян!, приводить до поступового п!двищення вм!сту Г6Ф ! на 40-й секунд! ишубац!! досягав максимуму, а на 90-й секунд! руху сперм!хв р!вень ГбФ знижуеться.

Вм!ст п!рувату в активованих нативних сперм!ях знаходить-ся на р!вн! 9.4 нмоль*мг бока-1, майже не змйноеться на 15-м секунд!, достов1рно зростае на 40-й секунд! ! збер!гаеться майже на тому ж р1вн! до зак!нчення нжубац!!' сперматозо!д!в.

Попередня екв!л!брац!я спермПв з кршзахисним середови-щем п!двищуе початковий р!вень п!рувату. Наступна активахия цих спермПв викликала подальше зб!льшення р!вня п!рувату, який вже через 15 секунд досягав максимуму, знижуючись подальше до кпщя !нкубац!'х.

Акт!вац!я заморожених-в!дтаяних спермПв не зм!нюе р!вня п!рувату в перш! досл!джен! нами !нтервали часу ! т!льки на 90 секунд! !нкубацГх сперм!хв к!лыасть п!рувату в них достов!рно знижуеться.

Вмхст лактату в активованих нативних спермхях коропа зростае на 15 секунд! ! поступово знижуеться по зак!нченнм !н-кубац!х .

Екв1л15рац!я спермин з кршзахисним середовищем приво-

дить до гйдвищення вкасту лактату. У процес! руху цих сперм ¡'¿к в!дбуваеться накопичення лактату з максимумом при 40 секундах 1 зниженням до початкового р1вня у подальшому.

Вм1ст лактату у заморожен1й-в!дтаян!й сперм! знаходиться на одному р1вн! у вс! вквчен1 нами 1нтервали часу.

П!сля активацП нативних сперм! !в коропа, на 15 секунд 1, р1вень АТФ п1двищуеться боьш н!ж у два рази. Подальша !нкуба-ц1я сперматозо!д1в приводить до монотонного зменшення к!лькос-т1 АТФ 1 на 90 секунд! '!! р!вень знижуеться до значения 11.7 нмоль*мг б1лка-1, що у два рази нижче початкового рхвня.

Гридцятихвилинна еквшбращя сперматзо'дов у кршзахис-ному середовицц п!двищуе початковий ргвень АТФ у сперм1 на 50% 1 через 15 секунд п!сля активацП к1льк!сть АТФ досягае свого максимуму. На 40-й секунд! активного руху в цих сперматозо!дах вщбуваеться падпшя к1лькост1 АТФ на 50%.

Разморожувапня-в!дтаяння сперматозо!д!в знижуе початковий, п1сляекв!л!брац!йний, рхвень АТФ в 2 рази, приближаючись до р1вня контролю. Подальша динамка зм!нення р!вня АТФ анало-г!чна попередн!й, але з б1льш низьким значениям ! мепыи вира-женим п1двищенням через 15 секунд лшубацП.

Динам!ка змпюння вм1сту креатинфосфату в нативн!й сперм! п1сля активащ!, повторншала таку для АТФ, т!льки р!зниця м!ж початковим вм!стом креатинфосфату 1 спостер!гаюч!мся через 15 секунд рухом сперм!!в складала 1400%, що св!дчить про включения потужних механ!зм!в накопичення енергП у вигляд! КФ, необ-х!дно! для руху сперматозо!д!в. Через 40 секунд п!сля початку руху к!льк1сть КФ знижуеться до початкового р!вня ! не зм!ню-еться у подальшому.

Тридцятихвилинна !нкубац!я сперматозо'!д!в з кршзахксним

середовищем п!двищуе початковий р1вень КФ в сперм 1 на 302 1 п!сля активацП, через 15 секунд, к1лыйсть КФ гпдвищуеться на 500%, 1 т!льки на 40-й секунд! досягае свого максимуму. На 90-й секунд! активного руху в цих сперм!ях в!дбуваеться пад!н-ня к!лышст! КФ до початкового р!вня у контроль Таким чином, екв^бращя сперм Пи з кр1озахисним середовищем приводить, очевидно, до значного зменшення швидкостг накопичення КФ I пастуший його утюнзацП для рухання, [до, мошною, приводить до зменшення юлькост! рухливих кл1тин I до зменшення часу рухання сперматозо!д1в.

Заморожування-в!дтаяння сперматозо'1д1в знижуе початковий р1вень КФ в два рази пор1вняно до попередн1х вар1ант1в досл1-ду. Лктиващя сперматозо"1Д1в не викликас п1двищення р1вня КФ 1 на 90-й секунд! його р!вень знижуеться до нуля.

Отриман! нами результата дозволяють припустити, що в пер-Ш1 секунди п!сля активацП спермПв в!дбуваеться включения гл1кол1тичного шляху обману вуглевод1в, основним початковим субстратом якого являеться глюкоза, про що свщчить накопичення Г6Ф 1 лактату - початкового i лицевого метабол1чних !нтер-мед!ат!в гл1кол!зу 1 в!дсутн!сть у молоках 1 сперм! фруктози.

В нативнШ сперм!, як було вже сказано, на 15 секунд! в1дбуваеться достов1рне накопичення Г6Ф, лактату, КФ, АТФ, а на 40-й секунд! ЬжубацП в!дбуваеться швидке зменшення к1ль-кост1 цих !нтермед!ат!в до р!вня контроля, що безумовно, пов*-язане з витратами енергП цих речовин на рух сперм Пв. ГНсля !нкубацН сперми з кршзахисним середовищем, динам¡ка вм!сту метаболии зм1нюеться. ГНдвищуеться початковий р1вень вс1х метабол!т1в, як! вим!рювались, окр!м Г6Ф.

Знайдене у представленЫ робот! значке накопичення КФ на

перших секундах п1сля активацП сперматозо'!д1в коропа 1 висо-кий р1вень креатинфосфокРазног активное^, разом з в1домими даними про в1дносно невеликий час рухально! активност1 скучать про те, що енергетичний обм!н цих ил1тин орган1зовано таким чином, щоб, використовуючи вел можливост1 гл1кол!зу 1 м1-тохонр1ального окисления, створити в найкоротший строк великий пул макроерг1Чних сполук. Адресне обслуговування саме рухаль-но! активност1 досягаеться креатинк1казною системою, яка лока-л]зокана> очевидно, в М1тохондр!ях 1 в хвостошй частши спер-мПв, под1бно до мшкзрдшфгНв ссавщв.

Сперматозо1ди, мабуть, належать до того типу кл1тин, в яких гл1кол!з орган1зовано так, щоб давати максимальний пот1к енергП, а не макс!мальну ефекттшпсть. В цьому вони дуже на-гадують м'язев! кл1тини, котр1 також слк;ц1алIзуються на тому, щоб перетворювати в1л?>ну енергш АТФ в меха!пчну роботу.

ВИСНОВКИ

1. Як1сть спермПв короп1в (рухлив1сть, опл1днююча здат-н!сть, енергозабезпечешисть 1 кршрезистенинсть) залежать в1д часу IX отримання п1сля г1поф1парно! стимуляцГ1 дозр!ван-ня.

2. СпермП, отриман1 з р!зних в!дд!л1в молок, б!ох1м!чно р!знояк1сн1.

3. Глюкоза являеться одним з основних енергетичних субс-трат!в, як1 використовуються сперм!ями коропа в процес1 активного руху.

4. Енергозабеспечення рухальнох активност1 спермПв коропа зд1йснюеться за участю креатинфосфок1назно! 1 адеюлатк!-назно! АТФ-регенеруючих систем.

5. Заморожування-в1дтаякня приводить до зменшення коь-

носtí акпганорухливих сперм i ib «opona, що пов'язано з нарушениям процесiв метаболизму глюкози, синтезу i ri дрол^зу макроер-Нчних фосфат!в.

СПИСОК Р0Б1Т, ЩО 0ПУБЛ1К0ВАНИ ПО TEMI ДИСЕРТАЦН 1. Копейка Е.Ф., Цветкова Л.И., Катасонов В.Я., Черепанов В.В., Очкур С.И., Бибенко О.В., Дрокин С.И. Формирование коллекции низкотемпературного банка спермы карпа 1989 г. Сбор-Н11К научных трудов. Вопроси селекции, генетики и племенного дела.с 66-68.

2. Дрокин С.И., Черепанов В.В., Копейка Е.Ф., Шилин Н.И. Криоконсервация спермы и возможность сохранения генофонда сахалинского осетра. М., Рыбное хозяйство, N7, 1991 г. с. 30-39.

3. Копейка Е.Ф., Черепанов В.В., Дрокин С.И., Чихачев A.C. Замораживание спермы осетровых рыб Азово - Черноморского региона. Криоконсервирование репродуктивных клеток и эмбрионов. Сб.научн.трудов. Харьков: Нн-т проблем криобиологии и криомедицины АН Украины, 1992 с. 66-75.

4. Катасонов В.Я., Пилиев С.А., Черепанов В.В. Первый опыт создания коллекционного низкотемпературного банка в товарном рыбоводстве. Международная конференция. Достижения и перспективы развития криобиологии и криомедицины. 10-12 февраля 1988 г. Харьков с. 68.

5. Цветкова Л.И., Копейка Е.Ф., Черепанов В.В., Очкур С.И. Формирование коллекции криоконсервированной спермы тепло-водных карпов. 4-е Всесоюзное совещание по рыбохозяйственному использованию теплых вод. 30.Х-2.Х1 1990 г.г.Курчатов, Курской обл. с. 144-145.

6. Копейка Е.Ф., Черепанов В.В, Агашин Б.Н., Рачек Е.И.

Использование криоконсервированной спермы карпов при получении товарных гибридов на теплых водах Приморской ГРЭС. 4-е Всесоюзное совещание по рыбохозяйственному использованию теплых вод 30.Х-2.Х1 1990 г. с. 145-146.

7. Черепанов В.В. НАДФ-редуктазная и некоторые другие ферментативные активности в молоках карпа после гормональной индукции созревания. Второй симпозиум по экологической биохимии рыб. г.Ярославль, 1990 г. с. 266.

8.Черепанов В.В., Копейка Е.Ф. АТФ-азная, пируваткиназная и буферние АТФ синтетазные активности в молоках карпа в процессе созревания. Второй симпозиум по экологической биохимии рыб. Ярославль, 1990. с.268.

9. Черепанов В.В..Цветкова Л.И. Динамика криоустойчлвости спермы карпа полученной на поздних этапах созревания молок. Второй симпозиум по экологической биохимии рыб. г.Ярославль, 1990. с. 269.

10. Черепанов В.В., Дзюба Б.Б. Метаболизм высокоэнергетических фосфатов и некоторых интермедиатов гликолиза в сперме карпа до и после криоконсервации. II международная конференция "Успехи современной криобиологии" 21-25 апреля, 1992 года. Харьков, с. 36.

11. Dzuba В.В., Cherepanov V.V. A content of some intermediates of energetic exchenge in activated carp sperm to and after cryopreservation. Workshop on gamete and embryo storage and cryopreservation in aquatic organisms, p. 51, 30.03-2.04.1992 Marly le Roy/ France.

12. Черепанов В. В., Белостоцкая Л.И., Дрокин С.И., Дзюба Б.Б. Дыхание сперматозоидов горбуши в активирующих и неактиви-румщих средах различного состава. VIII научная конференция по

экологической физиологии и биохимии рыб .т.2 тезисы докл. Петрозаводск, 1992. с. 156.

13. Черепанов В.В., Дзюба В.Б. Динамика содержания макро-эргических фосфатов и некоторых интермедиатов гликолиза в активированной сперме карпа. VIII научная конференция по экологической ф!гзиологии и биохимии рыб .т.2 тезиси докл. Петрозаводск, 1992. с. 155.

14. Дронин С.И., Черепанов В.В. Особенности жирнокислот-ного состава фосфолипидов спермиев осенненерестующих кеты (Oncorhynchiis keLa) и горбуши (Oncorhynchiis gorbusha). VIII научная конференция по экологической физиологии и биохимии рыб .т.2, тезисы докл. Петрозаводск, 1992. с. 91.

15. Cherepanov Y.V., Drokin S.I., OchkurS.I., Dzuba В.B., Chichachov A.S., Kopeika E.F. Freezing of sperm of Azov-Black Sea Acipenserids. International symposium on sturgeons. M-K-H, 1993. c. 63-64.

- 24 -

Черепанов В.В. Криоустойчивость и метаболизм спермиев карпа. Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.22. - криобиология. Институт проблем криобиологии и криомедицины Национальной Академии Наук Украины, Харьков, 1996.

Защищаются основные положения о влиянии гипофизарной стимуляции созревания на криоустойчивость и метаболизм спермиев карпа полученных из различных участков молок и влияние замораживания-оттаивания на энергетический обмен активированных спермиев карпа.

Cherepanov V.V..

Cryoresistance and metabolism of carp spermatozoa. Manuscript. Thesis for obtaining the degree of candidate of bilogical sceinces on the speciality 03.00.22. - cryobiology. Institute for Problems of Cryobiology & Cryomedicine of the Nat. Acd. Sci., Kharkov, 1996.

Main grounds on the effect of hypophysial maturation stimulation on cryoresistance and metabolism of carp spermatozoa obtained from different milt sites and effect of freeze-thawing on energetic metabolism of activated carp spermatozoa are under defence.

foiK)40Bi слова: короп, молоки, сперма, кр^консервування, глюкоза, фруктоза, глюкозо-6-фосфат, пируват, лактат, малат, креатинфосфат, АТФ, креатинфосфокиназа, аденилаткиназа, малат-дегидрогеназа, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, iзоцитратдегид-рогеназа, пируваткиназа, лактатдегидрогеназа, аспартатаминот-рансфераза, глутаматдегидрогеназа, АТФ-аза