Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЕ СЕМЕНИ БЫКОВ В ЛИТОВСКИХ СОЛОМИНКАХ

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЕ СЕМЕНИ БЫКОВ В ЛИТОВСКИХ СОЛОМИНКАХ"

у/ - ///^У

всесоюзный ордена трудового красного знамени

научно-исследовательский институт животноводства

(виж)

На правах рукописи

ПИЛЯЦКАС Видмантас Ионович

УДК 636. 082. 453. 53

КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЕ СЕМЕНИ БЫКОВ В ЛИТОВСКИХ СОЛОМИНКАХ

03.00.13 — физиология человека и животных (физиология сельскохозяйственных животных)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

дубровицы московской области 1090 год

Работа выполнена в Лаборатории технологии осеменения животных Литовского и а у чп о - и сел едов а тельс кого института животноводства и ветеринарии. •

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор П. П. ПАКСПДС

Официальные оплоненш:

доктор биол. наук В, П, КОНОНОВ, кандидат биол. наук В, А. Д1АЛИНОВСКАЯ.

Ведущее учреждение

Белорусский научно-исследовательский институт животноводства

З.Шнта диссертации состоится «У^ » ......... 1990 года

на заседании Специализированного совета Д 020.16.02 при Всесоюзном ордена Трудового Красного знамени научно-исследовательском институте животноводства.

Адрес; 142012, Дубровины Подольского района Московской области.

Автореферат разослан » ....... 1990 года.

С :чож«.- ' ':сч'.тьсл в библиотеке института.

Специ-г^ совета, кандидат V..-__* «ческих наук

И. И. ШМЫГНИ

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1, Актуальность темы. Ускорение экономического и социального развития страны во многом зависит от селекции и воспроизводства крупного рогатого скота путем осеменения глубокоза.мороженным семенем высокоценных производителей.

В настоящее время в СССР применяют несколько технологи Л криоконсервнровання семени в облицованных и необ-лнцованых гранулах, соломинках.

Наиболее широкое распространение получил француз-скин способ замораживания семени в соломинках, разработанный 1?. Сайзои (1950). Другие варианты замораживания семени в синтетических соломинках разработаны .Топс1еп1

(1972), Ь. Этпж^ (1972), I. МаБрЬсгит (1972), I. Almquist

(1973), А. И. Успенским (1965), В. Ф. Турбиным (1966), И. X. Хабибулиным (1972), А. Д. Бугровым (1976).

Криконсервнрование в тонких соломинках позволяет равномерно замораживать весь объем семени, обеспечить лучшее сохранение санитарной и биологической полноценности сперматозоидов, более экономичное использование дорогих сосудов н хладоагептов при хранении в жидком азоте и более удобное идентифицирование замороженного семени.

П. Пакенас в 1973—1976 гг. разработал литовскую технологию криоконсервнровання семени быков в тонкостенных полипропиленовых соломинках, состоящую из 39 устройств, автоматов, ипструментов, включающую также кормление, содержание, подготовку быков к взятию семени п ее замораживание.

Пластмассовые рамки для криоконсервнровання семени в соломинках, применяемые в указанной технологии, при замораживании изгибаются, и в результате этого создастся неодинаковый температурный режим в отдельных соломинках замораживаемого семени. Кроме этого, пластмассовые рамки непрочные, часто ломаются. Для охлаждения семени рамки помещаются в коробку, что влечет за собой дополнительные затраты времени и труда. Для разбавления семени используются три водяных термостата: для синтетической среды, для одноразовые. поли этил ожюьи■ 'есотирисмников и для охлаждения разб

ч пилу ^I I1I.1L миим 1 и..и /II )Л1и.ИПШШЦ Н

Мооч. „у,-. . чадвмки ' „ > ¡/ /*,*)

... ,; ■ . . > - У С Ус)

И

Инв ну ....

поддерживать различную температуру. Возникла необходимость и в разработке более эффективной среды для разбавления семенн быков при заморажлваннн его в соломинках, так как ЛГЖ среда предназначена для замораживания в гранулах, в ЛФРМГЖ среде применяются дорогостоющие компоненты.

В связис вышесказанным о недостатках литовской технологии крпоконсервирования семени быков в соломинках стало необходимым усовершенствование отдельных технологических ее приемов.

1.2. Цель и задачи исследований. Цель работы — повысить биологическую полноценность оттаянных сперматозоидов путем усовершенствования отдельных технологических процессов криоконсервировання семени быков в тонкостенных соломинках.

При выполнении работы были поставлены следующие задачи:

]. Разработать среду для замораживания семенн быков в соломинках,

2. Исследовать влияние режимов разбавления на физиологические показатели сперматозоидов после замораживания-оттаивания.

3. Разработать универсальные рамки для замораживания семенн в соломинках.

4. Изучить влияние скорости н продолжительности охлаждения на физиологические показатели семени.

5. Разработать замораживающее устройство и способ замораживания семени в хранилище ХБ-0,5.

6. Определить оптимальный режим замораживания семени.

7. Результаты исследований и разработанные устройства проверить в производственных условиях.

1.3. Научная новизна. Исследовано влияние различного количества лактозы, натрия цитрата и санирующего препарата спсрмосана ППК, в среде для разбавления на качество семени после оттаивания при замораживании в соломинках. Разработаны новые рамки (а. с,- № 1370008), позволяющие замораживать семя в соломинках, расположенных как вертикально, так и горизонтально к поверхности жидкого азота. Сконструировано замораживающее устройство УЗС-12 для работы совместно с биохранилищем ХБ-0,5 и цистерной типа ЦТК взамен устройства УЗС-8, вмонтируемого в биохранилище КВ 6202, производство которого прекращено. Исследовано влияние режимов разбавления, охлаждения и замораживания на физиологические показатели семени,

1.4. Практическая значимость работы состоит в том, что разработанные технологические приемы и устройства для замораживания семени в соломинках на 30,8% повышают физиологические показатели сперматозоидов после замораживания-оттаивания, производительность труда и на 4,5и/о стельность коров, что способствует повышений эффективности использования крноконсервнрованного семени.

1.5. Апробация работы. По материалам исследованпГ! опубликовано 6 печатных работ, оформлено 2 рационализаторских предложения и получено 1 авторское свидетельство.

Материалы диссертации были доложены на научной конференции «Молодых ученых и научно-исследовательскнх учреждений сельского хозяйства республики», посвященной 70-летию Октябрьской . социалистической революции (Каунас. 1987 г,), а также на научных конференциях «Вклад молодых ученых и специалистов при интенсификации животноводства в республике» (Байсогала, 1988 г.), «Научно-исследовательская работа молодых ученых в животноводстве» (Байсогала, 1989 г.). Материалы диссертации экспонировались на Всесоюзной конференции «Физиология продуктивных животных» (Тарту, 1989 г.).

1.6. Объем работы. Диссертация изложена на 1)7 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзор 1 литературы, методики н результатов исследований, выводов, практических предложений и списка литературы, который включает 183 работы, в том числе 101 — иностранных авторов. Диссертация иллюстрированна 24 таблицами, 17 фотографиями и 5 рисунками.

2, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Исследования проведены в Лаборатории технологии осеменения животных Литовского научно-исследовательского института животноводства и ветеринарии, на Капсукском межрайонном племпредприятии Литовской ССР, Щучинском госплемпредпрнятин Белорусской ССР.

Для исследований использовалось семя быков с подвижностью сперматозоидов не менее 7 баллов и их концентрацией не менее 0,8 млрд. в 1 мл.

В научно-производственном опыте искусственно осеменено 380 коров семенем быков, разбавленным ЛГЦЖ и ЛГЖ средами с добавлением комплексного санирующего препарата спермосана-ППК и* замороженным по разработанной методике.

Кормление и содержание животных соответствовало «Инструкции по организации и технологии работы станции

и предприятий по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных» МСХ СССР, 1981 г.

Семя по подвижности оценивали под микроскопом на электрическом обогревательном столике и выражали ее в баллах (10 баллов—100% сперматозоидов с прямолинейно-поступательным движением — ГОСТ 20909.4-75). В опытах применяли смешанные и разделенные эякуляты.

Концентрацию сперматозоидов определяли методом подсчета в счетной камере Горяева либо при помощи фотоэлек-троколориметра (ГОСТ 20909.5-75).

Показатель абсолютной выживаемости (5) и выживаемости сперматозоидов в часах (ч) определяли по ускоренной методике при 38±0,5 °С.

При сравнительном исследовании сред применял» препараты одной серии, отвечающие требованиям Государственной фармакопеи X издания н требованиям, отвечающим НТД.

В опытах по разработке среды количество легкогндролн-зуемого фосфора АТФ + АДФ в замороженном-оттаянном семени определяли по ГОСТ 20909.6-75.

Физиологическую резистентность семени определяли по устойчивости сперматозоидов к гипотоническим растворам хлорида натрия; устойчивость к холодовому шоку — по выживаемости сперматозоидов после их быстрого охлаждения до температуры 1—3 °С, дегидрогеназную активность — по скорости обесцвечивания метиленовой сини, добавленной к семени по ГОСТ 20909.4-75.

Количество живых сперматозоидов определяли методом дифференциального окрашивания (ГОСТ 20909.3-75). Число, сперматозоидов с поврежденной акросомой оценивали с помощью акроскопического метода (И. И. Соколовская и др., 1981).

Температуру в хранилищах и соломинках в процессе замораживания измеряли электронными термометрами ТЭ-200М н БТ-200.

Оплодотворяющую способность семени, криоконсервиро-ваниого в оптимальных режимах с применением разработанной среды, проверяли в производственных условиях при осеменении коров.

Оценку оплодотворяющей способности семени проводили по фактической стельности, которую устанавливали при ректальном исследовании животных через 3 месяца после осеменения.

Результаты исследований обрабатывали биометрически по Н. А. Плохинскому (1961),

\

3!. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1, Влияние методов разбавления на физиологические показатели семени

Свежеполучснное семя разбавляли однократно средой 32± I °С и двухкратно: после взятия в соотношении 1:1 средой 32±1°С, затем после выдержки в течение .5 минут при комнатной температуре проводили окончательное разбавление средой 19± I °С.

Физиологические показатели замороженного-оттаянного семени после однократного разбавления: ППД — 3,3±0,1 < балла, ППД после 5-часовой выдержки при 38±0,5 °С — 0,4±0,1 балла, Б— 10,1 ±0,8 усл. ед., ч — 5,3±0,2, После двухкратного разбавления показатели семени были соответственно выше на 45,4%, в 2,5 раза, на 81,2% и 18,9% (Р< 0,001).

В этом опыте доказано преимущество двхукратного разбавления семени по сравнению с однократным, так как упрощается процесс разбавления и повышаются качественные показатели семени.

3.2. Разработка среды для замораживания семени быков в соломинках

В связи с тем, что применяемая в настоящее время лак-тозо- гл и цер и но-желточная (ЛГЖ) среда предназначена для замораживания семени в гранулах, провели исследования ,по се усовершенствованию.

В опытах изучено влняние различных количеств лактозы: 8, 9, 10, 10,5, 11,5 (контроль) и 12 г на 100 см3 бндн-стиллированной воды на физиологические показатели семени, Во все среды с различным количеством лактозы добавляли по 5 мл глнцернна и 20 мл желтка куриного яйца.

Лучшие биологические показатели сперматозоидов после замораживания семени в соломинках были при использовании сред с 10 и 10,5 г лактозы: соответственно подвижность сперматозоидов (ППД)—5,3±0,8 и 5,4±0,7 балла; эози-нотрицательных сперматозоидов было 56,5±2,8 и 57,2± 1,9%; с неповрежденной акросомой — 53,4± 12,0 и 55,0±7,8%. После 5-часовон выдержки при 38±0,5°С ППД было 2,8±1,6 и 2,9±1,2 балла, эозинотрицательных сперматозоидов— 33,8±3,9 и 36,3±4,2%, показатель абсолютной выживаемости (Э)—25,3±0,1 и 28,6±0,1 усл. ед., выживаемость в часах (ч)—7,3±0,3 н 7,5±0,6. Эти показатели были выше по сравнению с контролем соответственно на 3,9 — 5,9,

1,4—2,7 3,1—6,2, 21,7—26,1, 27,5—37,0, 21,6—37,5, 5,8-9,7% (Р>0,5ч-Р<0,001).

Увеличение количества лактозы до 12 г или же снижение его до 9 и 8 г/100 см3 воды ведет к снижению биологических показателей семени.

В последующих опытах изучено влияние разных доз натрия цитрата на биологические показатели замороженно-от-таяннсго семени. К 100 см3 среды оптимального варианта {с 10,5 г лактозы) добавляли 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 н 400 мг натрия цитрата. Контролем служила среда без натрия цитрата.

Лучшие биологические показатели семени после оттаивания были при использовании среды с 200 мг натрия цитрата. По сравнению с контролем {при использовании среды без натрия цитрата) ППД было выше на 35,7% (Р<0,001), эозинотрицательных сперматозоидов было больше на 12,6% (Р<0,005), с неповрежденной акросомой— на 1.1% (Р>0,5). После 5-часовон выдержки при 38±0,5°С ППД было выше в 2 раза, эозинотрицательных сперматозоидов было больше на 12,1% (Р<0,005), S —на 82,3% и ч — на 49,3% (Р<0,001).

На основании результатов проведенных исследовании была предложена лактозо-глицерино-цитратно-желточная среда (ЛГЦЖ), для замораживания семени быков в соломинках следующего состава: лактоза—10,5 г, цитрат натрия — 0,2 г, глицерин — 5,0 ем3, желток куриных яиц — 20 см2, вода бидистиллированая— 100 см3. Как санирующий препарат применяли спермосаи ППК в дозе 50,0 тыс, ЕД/ 100 см3 среды. В дальнейших опытах применяли ЛГЦЖ. среду.

3.3. Влияние температур среды для разбавления семени на его физиологические показатели

После взятия и оценки качества семени его разбавляли первично средой 32±1, 27±1, 25±1 и 20± 1 °С (1-ый, 2-ой, 3-ий, 4-ый варианты). Разбавленное семя выдерживали в течение 5,. 10, 15 и 20 минут при комнатной температуре (19±1°С), затем проводили вторичное (окончательное) разбавление семени средой 19± 1 °С,

Методом дифференциального окрашивания установлено, что в свсжеполученных эякулятах живых (эозинотрицательных) сперматозоидов в среднем 84,2 + 0,9%. Оптимальные температуры сред для первичного разбавления семени — 32± I °С и 27± 1 ®С. В семени, разбавленном средой указанных температур в среднем обнаружено соответственно 75,5±0,7% и 78,2±3,1% живых сперматозоидов. Снижение

Температуры разбавления до 25—20°С снизило число эозинотрицательных сперматозоидов. После вторичного разбавления число эозинотрицательных сперматозоидов снизилось в 1-ом варианте до 70,6±1,1%, во 2-ом—до 77,6±0,5%, в 3-ем —до 69,8±2,5% и 4-ом —до 64,8±0,9%. После 4-часового охлаждения число эозинотрицательных сперматозоидов в соответствующих вариантах снизилось до 64,2±1,7%, 71,6±0,8%, 62,2±0,9% » 56,8±0,9%.

При первичном разбавлении ссменн средой 27±1°С (II вариант) после его замораживания-оттаивания большинство исследованных .показателей были лучшими: ППД составляло 5,3±0,1 балла, эозинотрицательных сперматозоидов было 59,6 ± 1,8%, неповрежденных акросом — 60,6± 0,67а; после 5-часовой выдержки при температуре 38±0,5°С — ППД составляло 2,6±0,1 былла, эозинотрицательных сперматозоидов было 28,5 ±5,2%, неповрежденных а просом — 32,3±0,7%, Б — 25,2±0,1% усл. ед. п ч — 7,1 ±0,1. После первичного разбавления семени средой 32± 1 °С {1-ый вариант) биологические показатели замороженного-оттаянного семени были соответственно на 6,0, 8,2, 3,2, 44,4, 0,2, 1,0, 31,9, 7,6% ниже, чем во 2-ом варианте. После первичного разбавления семени средой 25 и 20СС (3-ий и 4-ый варианты) биологические показатели замороженно-оттаянного семени были также ниже по сравнению с 2-ым вариантом, за исключением числа эозинотрицательных сперматозоидов,' которое составляло 32,3±4,3% и 35,0±2,3% или после 5-часовой выдержки при 38±0,5°С было на 13,3% и 22,8% больше, чем во 2-ом варианте.

Из приведенных результатов исследований установлено, что оптимальной температурой среды для первичного разбавления при замораживании семени в соломинках является 27±1°С, которая способствует меньшей интенсивности снижения физиологических показателей семени после вторичного разбавления, 4-часового охлаждения и заморажп-вания-оттаиванля.

После первичного разбавления семя выдерживали при комнатной температуре (19±1°С) в течение 5, 10, 15 и 20 минут, затем разбавляли средой 19±1°С до окончательной концентрации сперматозоидов. Лучшие показатели заморо-женно-оттаянного семени были получены в том случае, когда окончательное разбавление семени проводили после выдержки 10—15 минут: подвижность сперматозоидов был л 4,5±0,1 —4,7±0,1 балла, эозинотрицательных сперматозоидов было 49,4± 1,3 — 50,3±0,8%, неповрежденных акросом — 40,1±0,9 — 47,6±0,7%; после 5-часовой .выдержки при температуре 38±0,5°С подвижность сперматозоидов

составляла 1,5 + 0,1 — 1,9±0,1 балла, эозпнотрицательных сперматозоидов было 19,3 + 1,4 — 23,7± 1,3%, неповрежден-' иых акросом — 22,1 ±0,5 — 28,7 + 0,5%, Э — 18,8+0,5 — 19,3 + 0,7 усл. ед., ч —6,2 + 0,16 — 6,4±0,12. Увеличение продолжительности выдержки до 20 минут вызывало снижение соответствующих показателей: семени на 6,4, 8,4, 18,7, 28,0. 30,8, 24,7, 12,0 и 7,2% (Р>0,1~Р<0,001) по сравнению с лучшими показателями семени, выдержанного при комнатной температуре до вторичного разбавления в течение 10—15 минут. Снижение показателей семени установлено и при выдержке семени в течение 5 минут.

Таким образом, выдержка разбавленного семенп в течение 10—15 минут при комнатной температуре до окончательного разбавления способствует лучшему сохранению фи- 4 экологических показателей сперматозоидов, благодаря выравниванию величин температур после первичного разбавления средой 27±1°С и вторичного разбавления средой 19+ 1 °С.

3.4. Распределение количества сперматозоидов в соломинках после расфасовки

После расфасовки в соломинки семени, неразмешанного после вторичного разбавления, в верхней, средней и нижней частях стакана установлена неодинаковая концентрация сперматозоидов {соответственно 17,0+0,1, 21,6 + 0,3 п 19,5+ 0,4 млн, в 0,25 см3 разбавленного семени). После тщательного размешивания в дозах в среднсм обнаружено по 18,8±0,2 млн. сперматозоидов и не установлено различий в их конце-трации в отдельных слоях стакана.

Таким образом, во избежание неодинакового количества сперматозоидов в отдельных соломинках необходимо разбавленное семя перед расфасовкой размешивать в течение 10— 15 секунд погруженным в него стерильным наконечником, соединенным с полпвшшлхлорпдной трубкой или стерильной палочкой.

3,5. Влияние охлаждения на физиологические показатели семени

Семя охлаждали в течение 60. 120, 180 и 240 минут. Лучшие биологические показатели сперматозоидов в замороженном-оттаянном семени установлены после охлаждения в течение 240 минут: подвижность сперматозоидов — 5,2±0,1 балла, эозпнотрицательных сперматозоидов — 54,9±1,2%; после 5-часовоп выдержки при температуре 38±0,5°С

ППД — 3,0±0,2 балла, эозпнотрнцательных сперматозоидов—37,0± 1,6%, S — 32,1 ± 1,0 усл. сд. и ч-8,7±0,2.

В замороженном семени, охлажденном в течение 180 минут, вышеуказанные показатели были соответственно ниже на 10,6, 4,8, 23,4, 7,4, 21,5 и 14,9.% (Р.<0,1-^0,005) по сравнению с семенем, охлажденным в течение 240 мннут. Количество неповрежденых акросом в оттаянном семени после 5-часовой выдержки при температуре 38±0,5 °С было практически одинаковым в обоих вариантах (35,4 ±0,8 н 35,3± 1,3%). Число неповрежденных акросом после оттаивания было несколько выше в семени, охлажденном в течение 180 мннут (57,0±0,7%) по сравнению с семенем, охлажденным в течение 240 минут (51,9±0,2%). Все показатели замороженного-оттаянного семени, охлажденного в течение 120 и 60 мннут, были ниже соответственно на 9,6—41,1% н 0,3— 33,7|% по сравнению с показателями семени, охлажденного в течение 240 минут.

После разбавления семейи, расфасовки и раскладки а рамки, его охлаждали в холодильнике до 4±2"С. Скорость снижения температуры зависила от количества рамок и доз семени в коробке. Наивысшая скорость охлаждения семени (0,5 °С/мнн.) установлена при наличии в коробке одной рамки с соломинками (143 дозами).

Увеличение количества рамок в коробках, тем самым н доз семени, ведет к снижению скорости охлаждения. В коробке с двумя рамками (286 дозами), с тремя рамками (429 дозами) и с четырьмя рамками (572 дозами) с открытой крышкой коробки средняя скорость падения температуры достигала соответственно 0,29, 0,23 и 0,34°С/мнн.

В за мороженно-отта янном семени лучшие показатели установлены в семени, охлажденном со скоростью 0,5 °С в минуту: эозинотрпцатсльных сперматозоидов было 57,8± 1,9%, неповрежденных акросом — 52,9±4,2%; после 5-часо-Boii выдержки при температуре 38±0,5 °С подвижность сперматозоидов составляла 2,9±0,2 балла, эозинотрпцатсльных сперматозоидов было 39,5±4,3%, S — 22,5±0,1 усл. ед. и ч — 7,2±0,2. Падение скорости'охлаждения до 0,29°С/мнн. вело к снижению показателей семени соответственно на 9,3, 3,3, 4,7, 37,9, 6,0, 25,0 п 9,7% (Р>0,5-ьР<0,001), а до 0,23°С в минуту — к еще большему снижению биологических показателей семени после замораживания. При выдержке семени в холодильнике без коробок средняя скорость падения ее температуры составляла 1,6сС/мпн., и при этом получены лучшие биологические показатели после замора-жнвання-оттаивания семени: подвижность сперматозоидов была на 10,4% (Р<0,025); после 5-часовоЛ выдержки при

38±0,5°С ППД —45,3%' (Р<0,001), S - на 37,4% (Р< 0,001) и ч —на 20,7% (Р<0,005) выше по сравнению с аналогичными показателями семени, охлажденного в коробке со скоростью 0,29°С/мин.

Таким образом, все показатели семени были лучшие в варианте, где семя охлаждалось со скоростью 1,6°С/мин. Видимо, это связано с формой расфасовки, температурами разбавления, а также зависит от среды, использованной длп криоконсервнрования.

3.6. Замораживание семени в горизонтальном положении

Семя замораживали в хранилище типа КВ 6202 на щите замораживающего устройства УЗС-8 в пластмассовых рамках. Для замораживания в хранилище размещали по 750 соломинок, начальная температура замораживания —150± 5°С.

После загрузки рамок отмечалось начальное повышение температуры в хранилище, которая через 1, 2, 3, 4, 5, 6 минут была соответственно —91,1, —87,7, —88,0, —89,0, —91,5 и —94,4 °С, температура в соломинках — соответственно -27, -36, -62, -76, -80, —86°С,

Для стабилизации температуры охлаждающей среды в хранилище и улучшения передачи тепла семени азоту применили щит из органического стекла, благодаря которому удалось достичь более стабильной температуры охлаждения, чем при замораживании семени без щита.

Применение щита снизило ¡температуру в хранилище КВ 6202 при замораживании семени в первую минуту на 9,9 °С и на 8,3°С, 4,3 °С, 2,5 °С, 5,5 °С, 15,2°С в последующие промежутки замораживания семени. Понизилась также температура в соломинках соответственно на 3,5°С, 4,0 12,3 °С, 1,5 X, 0,8 °С, 6,8 °С.

Замораживание семени с применением щита повысило биологические показатели замороженного ссменн после оттаивания: подвижность сперматозоидов — на 8,9% (Р <0,025), содержание эозин отри нательных сперматозоидов—на 5,6%, S — на 17,2% <Р<0,005) и ч —на 6,8% (Р<0,05) по сравнению с замораживанием семени без щита,

Разработанные нами металлические рамки позволили замораживать семя в вертикальном н горизонтальном положениях, обеспечить более низкую п стабильную температуру в хранилище (без применения щита — от —99 до —123°С, со щитом — от —109 до — 126 °С), что способствовало улучшению качества семени после замораживания-оттаивания.

Однако применение Новых металлических рамок для замораживания семени не сократило продолжительности замораживания. Так, при замораживании в течение 2, 4, 5 и 6 минут лучшие биологические показатели семени после оттаивания получены после замораживания семени в течение б минут: подвижность сперматозоидов была 4,9±0,1 балла, эози-нотрицатсльных сперматозоидов — 52,7± 1,0%, неповрежденных акросом — 61,3±0,9.%; после 5-часовой выдержки при 38±0,5°С подвижность сперматозоидов была 2,9±0,1 балла, эозинотрицательных сперматозоидов — 31,5±1,0%, нопо-врежденых акросом — 36,8±0,6%, Б — 31,7±0,7 усл. ед. и ч в часах — 9,8±0,1. Эти показатели после замораживания в течение 5 минут были ниже соответственно на 11,4, 6,3, 8,7, 20,8, 3,3, 2,0, 26,8, 25,6% (Р>0,1-ьР<0,001). Замораживание семени в течение 4 и 2 мннут еще более снизило физиологические показатели сперматозоидов после оттаивания.

Для поддерживания стабильной температуры на всем щите замораживающего устройства УЗС-12, достижения необходимой скорости замораживания семени, быстрого восстановления температуры на щите после загрузки рамок с семенем использовали транспортную цистерну ЦТК.-0,5/0,25 для подачи газообразного азота в хранилище ХБ-0,5 с замораживающим устройством. С вентиля газосброса транспортной цистерны пар жидкого азота поступал через шланг и распределитель (суть действия которого состоит в том, что пар жидкого азота через отверстия приспособления подается в несколько, а не в одну точку хранилища), обеспечивая равномерную температуру на всей площади щита замораживающего устройства. Применение транспортных цистерн позволило снизить температуру до требуемой величины, необходимой при замораживании семени в соломинках и обеспечить ее стабильность.

При изучении влияния различных, величин температуры замораживания ( —140±5, - 150±5, - 160±5, - 170±5, —180±5 °С) на биологические показатели замороженного-оттаянного семени, установлено, что оптимальной температурой замораживания семени в соломинках является — 150±5°С. При этой температуре большинство исследованных показателей семени были выше, чем в других вариантах: после замораживания-оттаивания подвижность сперматозоидов была 5,1 ±0,1 балла, эозннотрицательных сперматозоидов было 53,7± 1,3%, неповрежденных акросом — 64,4± 0,7%; после 5-часовой выдержки при температуре 38 + 0,5 "С подвижность сперматозоидов была 3,0±0,2 балла, эозннотрицательных сперматозоидов было 33,1 ±2,2%, неповрежденных акросом — 35,7±0,2%, выживаемость (Э и ч) —

34,4±1,4 усл. ед. н 10,0±0,2 часа. По подвижности после оттаивания превосходило семя, замороженное при температуре — ]70±5°С (5,1±0,1) —5,5±0,1 балла. Прямой связи между физнлогическнмп показателями сперматозоидов после оттаивания и после 5-часовой выдержки мы не обнаружили.

Из полученных данных следует вывод, что оптимальная температура для замораживания семени с учетом индивидуальных особенностей каждого быка — в интервале от — [50±5 "С до -180±5С<1

3.7. Замораживание семени в вертикальном положении

Конструкция новых металлических рамок позволяет замораживать семья н в вертикальном положении. Для этой цели сконструирован специальный штатив, вмещающий до 20 рамок. Рамки с семенем в штативе охлаждали в течение 240 минут. После замораживания семени в вертикальном положении подвижность сперматозоидов и Э при 38±0,5°С были 5,2±0,1 балла и 32±1,1 усл. сд„ выживаемость в часах составляла 9,0±0,2. Эти показатели были соответственно ниже на 5,5%, 5,9% (разница недостоверная) и 10,0% (Р<0,01) по сравнению с оптимальным вариантом семени, замороженного в горизонтальном положении. Подвижности сперматозоидов после 5-часовой выдержки при температуре 38±0,5°С была практически одиннаковая (3,0±0,2 и 3,2±0,2 балла.) Оптимальная температура замораживания семени в вертикальном положении — в интервале от —170 "С до — 180 °С.

Преимущество метода замораживания семени в вертикальном положении соломинок заключается в том, что за один цикл можно заморозить до 2860 доз.

ЗД Биохимические показатели семени, замороженного по усовершенствованной литовской технологии

Семя разбавляли ЛГЖ средой (контроль) со спермоса-ном-3 в дозе 50 тыс. ЕД/100 см3 и без санирующих препаратов и новой ЛГЦЖ средой со спермосаном-ППК в дозах по 50 и 100 тыс. ЕД/100 смя, спермосаном-3 в дозе 50 тыс. ЕД/100 см2 и без санирующих препаратов.

Определяли количество лабильного фосфора (АТФ + АДФ), физиологическую резистентность, коэффициент дегид-рогеназион активности и устойчивость к холодовому шоку, представленные в таблице 1.

Таблица К Биохимические показатели семени, замороженного по усовершенствованной литовской технологии (п=7)

Показатели семенн

№ пл. Среда Санирующий препарат, тыс. ЕД/100 см1 наличие фосфора, мкг/млрд. сперматозоидов физиологическая резистентность, усл. ед. коэффициент дегндрогенлз-ной активности, усл. ед. устойчивость к холодному шоку, усл. сд.

Семя эквилибрированное

I ЛГЖ (кон-

троль) Спермосаи-3, 50 —

2 ЛГЖ Спермосан-ППК, 50 —

3 ЛГЖ Без санирующих веществ' —

4 ЛГЦЖ Спермосап-З, 50 —

5 ЛГЦЖ Сперм оса п ПП К, 50 —

6 лшж Слермосап-ППК, 100 -

7 ЛГЦЖ. Без санирующих веществ —

Семя замороженное-оттаянное

I ЛГЖ (кон- 3,48±0,1

троль) Спсрмосан-3, 50

2 ЛГД Спермосан-ППК, 50 3,55+0,1

3 ЛГЖ Без санирующих веществ 2,81±0,1

4 ЛГЦЖ Спермосап-З, 50 4,14±0,1

Б лшж Спермосан-ППК, 50 4,62 ±0,1

0 ' ЛГЦЖ Спермосан-ППК, 100 4,65 ±0,1

7 ЛГЦЖ Без санирующих веществ 3,09 ±0,1

0,31+0,02 0,32 ±0,03 0,26 ±0,02 0,36 ±0,04 0,40+0,04 0,38 ±0,03 0,3 0,03

.20+0,01 .21 ±0,01 ,18+0,01 23+0,01 25 ±0,01 23+0,01 22 ±0,01

0,36+0,02 0,38 ±0,02 0,31 ±0,02 0,42+0,02 0,49 ±0,02 0,47±0,02 0,39 ±0,03

0,21+0,02 0,22 ±0,02 0,18 ±0,02 0,22 ±0,2 0,25 ±0,02 0,24+0,03 0.23+0,02

0,43 ±0,02 0,47+0,02 0,39+0,03 0,49 ±0,02 0,53 ±0,03 0,55 ±0,03 0,49 ±0,02

0,29 ±0,01 0,32 ±0,01 0.23 ±0,01 0,3 7 ±0,01 0,38 ±0,02 0,38 ±0,02 0,33+0,02

Как видно из приведенных результатов, самые низкие показатели семени были в нсеаинрованном семени с применением ЛГЖ среды.

Показатели охлаждепого семени, разбавленного контроль- ■ ной ЛГЖ средой со спермосаном-З в лозе 50 тыс. ЕД/100 см'1 были следующие: физиологическая резистентность — 0,31 ± 0,02 усл. ед., дегидрогеназная активность — 0,3б±0,02 усл. ед. и устойчивость к холодовому шоку ^0,43 ±0,02 усл. ед. Примениние ЛГЦЖ среды со спермосаном-З в той же дозе способствовало повышению этих показателей на 16,1 %, 16,7% и 13,9% (Р< 0,001). Санация спермасаном-ППК в дозах 100 н 50 тыс. ЕД/100 см3 повысила эти показатели ' на 22,6—29,0%, 30,6—36,1,% и на 23,3—27,9% <Р<0,001) по сравнению с ЛГЖ средой со спермосаном-З.

В замороженном-оттаянном семени самые низкие показатели семени также были при использовании ЛГЖ среды без санирующих веществ.

Показатели замороженного-оттаянного семни, разбавлен* ного контрольной ЛГЖ средой со спермосаном-З в дозе 50 тыс. ЕД/1003, были такие: наличие фосфора АТФ + АДФ— 3,48±0,13 мкг/млрд. сперматозоидов, физиологическая резистентность— 0,2±0,01 усл. ед., дегндрогеназная активность— 0,21 ±0,02 усл.. ед„ устойчивость к холодовому шоку—0,29±0,01 усл. ед. В новой (ЛГЦЖ) среде с такой же дозой спермосана-3 эти показатели были выше контроля на 19,0, 15,0, 4,8 и 27,6% (Р>0,1:Р<0,001) (1-ый и 4-ый варианты).

3.9. Эффективность действия ЛГЦЖ среды со спермосаном ППК на стельность коров Результаты осеменения показали, что семя, криоконсер-вированное ЛГЦЖ средой по усовершествованной литовской технологии, способствовало более высокой (4,5%) стельности коров по сравнению с контрольной ЛГЖ средой при применении спермосана-ПП1\ в дозе 50 тыс. ЕД/100 см1 (табл. 2).

.3.10. Сравнительные исследования семени, криоконсервированного по усовершенствованной литовской и французской технологиям Замораживание проводили согласно требованиям соответствующих технологий.' Для разбавления семени по литовской технологии применяли ЛГЦЖ среду со спермоса-ном-ППК, по французской технологии — среду Лецифос 478 с пенициллиндегидрострсптоцндом.

При применении французской технологии ППД сперматозоидов было 4,3±0,1 бала, выживаемость 5 и ч при 38±

н

Таблица 2. Стельность коров в зависимости от применения ЛГЦЖ _и ЛГЖ сред {от пер в ого осеменения)__

Среда Санирующий препарат Концентрация санирующих препаратов, тис, ЕД/100 см3 Осеменено коррв Из них стали стельными;

число животных

ЛГЖ (контроль) ЛГЦЖ . (опыт) Спермосан-ППК. Спермосан-ППК 50,0 50,0 202 178 83 £1 41,0 45.5

0,5 °С составляли 2£>,4±1,0 усл. ед. и 9,3±0,4, а при использовании литовской технологии эти показатели были выше соответственно на 10,5, 14,8 и 9,7% (ППД — Р<0,01, 5 — Р<0,025, ч — Р>0,1).

ВЫВОДЫ

1. Усовершенствованная литовская технология криокон-сервнровання семени упрощает его подготовку к криоконсер-внрованию н способствует повышению биологической полноценности и оплодотворяющей способности сперматозоидов.

2. Установлено преимущество двукратного разбавления семени по сохранению биологических свойств сперматозоидов в сравнении с однократным разбавлением. Оптимальной температурой разбавления семени является 27± 1 "С. Семя следует разбавлять в соотношении 1:1, выдерживать в теченне 15 миКут при температуре 19±I°С, после чего проводить окончательное разбавление средой 19±1°С.

3. Разработанная нами лактозо-глнцерпно-цнтратно-жел-точная (ЛГЦЖ) среда' со спермосаном-ППК в дозе 50 тыс. ЕД/100 см3 способствует лучшему сохранению биологических показателей сперматозоидов после замораживания-оттаивания: лабильного фосфора АТФ + АДФ — на 32,8%, физиологической резистентности — на 25,0%, дегндрогеназной активности— на 19,0%, устойчивости к холодовому шоку — на 31,0% по сравнению с ЛГЖ средой со спермосаном-3.

4. Разработанные нами рамки (а. с. 1370008) для замораживания биологических суспензий позволяют замораживать семя как в вертикальном, так и в горизонтальном положениях, поддерживать более стабильную температуру замораживания и получать семя высокого биологического качества.

5. Транспортные цистерны ЦТК-0,5/0,25 при помощи сконструированного нами приспособления позволяют снизить температуру в хранилище до требуемой величины, необходимой при замораживании семени в соломинках. Оптимальная температура замораживания — от — 150±5 до — 180±5 °С. Цикл замораживания — б минут, с последующей выдержкой в течение 2 минут,

6. Усовершенствованная литовская технология позволяет получить семя с более высокими биологическими показателями подвижности, выживаемости (S н ч) на 10,5, 14,8, 9,7% по сравнению с французской технологией.

7. Применение предлагаемой ЛГЦЖ среды со спермо-саном-ППК в дозе 50 тыс. ЕД/100 см1 по усовершенствованной литовской технологии позволяет повысить стельность коров на 4,5% по сравнению с применением ЛГЖ среды со спермосаном-ППК в той же дозе.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Рекомендовать для племпредпрянтнй усовершенстван-ную литовскую технологию крноконсервировання семени быков с применением двухкратного разбавления семени (при этом применяется только одни водяной термостат).

2. Для разбавления п замораживания семени быков-производителей в соломинках использовать ЛГЦЖ среду.

3. Заморажнвание семени проводить в интервале от —150±5 X до — 180±5°С с применением разработанных памп рамок.

4. Заморажнвание проводин, в течение 6. минут с дополнительной выдержкой 2-е минуты.

публикация результатов исследовании

Основные положения диссертации опубликован« в следующих научных статьях:

!, Пнляцкас В. Микробиологические исследования компонентов и приготовление среды для семени быков // Тезисы докладов конференции молодых ученых научно-нсследоватсльскнх учреждении сельского хозяйства республики, посвященной 70-летию Октябрьской социалистической революции. — Каунас. — 1987. — С. 65—66.

2. Пакенас П., Жуида ГГ., Илгунас Б,, Лянкутнс В., Кашепнс П., Пнляцкас В., Турбин В., Урбшпс А. Методические рекомендации по литовской технологии кормления, содержании, подготовки быков к взятию семени, его криоконсервнровання и использования, — Вильнюс, 1987.

3. Пнляикас В., Урбшпс А, Влияние первичного разбавления на качество семени быков // Тезисы докладов конференции «Вклад молодых ученых и специалистов при интенсификации животноводства в республике». — БаПсогала. — 19S8. — С. 26—28.

4. Урбшпс А., Пнляцкас В. Физиологические показатели семени, крно-консервнрованного в соломинах, зависимо от положения соломинок при замораживании // Тезисы докладов конференции «Вклад молодых ученых и специалистов при интенсификации животноводства в республике», — Бансогала. — 1988. — С. 29—31,

5. Pakênas P., IIgüilas В., Lenkiilis V., Piled;as V„ Turbin V., Urbsys A. ami 2uiida P. The Lithuanian technology о! feeding, management and preparation of bulls for semen collection, its cryopreservation and usage.— Vilnius. 1988.

6. Пнляцкас В., Урбшнс A„ Kapocac П. Влияние продолжительности охлаждения на физиологические показатели семени // Тезисы докладов конференции «Научно-нсследовательская работа молодых ученых в животноводстве». — Бансогала, — 1989, — С. 17—18.

Отпечатано б типографии «Аушра», Каунас, пр, Вптауто, 23. Заказ № 567. 1990 г. Ответственный редактор А. Гаучене Тираж 100 экз.