Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЕ И ОЦЕНКА СЕМЕНИ КРОЛИКОВ И ЗУБРОВ В СВЯЗИ С ТЕХНОЛОГИЧЕСКИМИ И ИММУННЫМИ ФАКТОРАМИ

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЕ И ОЦЕНКА СЕМЕНИ КРОЛИКОВ И ЗУБРОВ В СВЯЗИ С ТЕХНОЛОГИЧЕСКИМИ И ИММУННЫМИ ФАКТОРАМИ"

/\-3H36

На правая рукописи Комбароаа Ншаа Аж&тольевта

КРИОКОНСЕР ВИРОВА НИЕ И ОЦЕНКА СЕМЕНИ КРОЛИКОВ И ЗУБРОВ В СВЯЗИ С ТЕХНОЛОГИЧЕСКИМИ И ИММУННЫМИ ФАКТОРАМИ

ОЭ.ОО. 13 - физиология человека щ жімяма

А ВТ О Р Е*ЕРАТ

циссерташш на сонскакка учено* станет кандидата биологических каук

Дубровины - 1986;

Работе вшоиева в отделе оюжогия нспрашмцпп в искус* авешого осемененяя оельскаховяйствеяных животных всероссийского вушю*1а:ля)юе8теддсго института животноводства. ,

Научны* руководитель; доктор бнздогичесюя ваук,-профессор " '' К,М,ООК£ИЕВСКАЯ .

ошюненты: доктор Оиодагячесгак Еаук Н.Г.БУКАРСВ. мук В.К.ГАЛГ1. •

Ведущее учреижвпю: ВовроосяйскхА ваучвошосгедоватмьсжй .

Зшята дм-хх>ртацнм ооскштса * 1а0а г.'

в 40 часов ва заседании диссертационного Совета 2 020.10.02 мушо-яодедоватажьском институте*

Адрес: 14£01£. кос. Яувровиш рощсшлкото райояа ЫосковскЯ т^шшк * уд* т.

Учеяы* садфетвр* ' двооергадиоиного совета

П,А.Науметсо

- - 1 - •

, сдая ХАРАкгстстиа РАБТШ

Лїяуз.'а.исста В каЬтоядее рремя £ сеяви с скрски ...

лггюл-.зэвакие* крсдкков » еоотехннчесюй в лабораторной практике* особенно в свяви с получением траясгенных живстнш пут«м" лсаоїь- . асїаякя wyjcKK* нс^сзых «леток в качестве вектора для'чужеродной ZHK, вогяилга'настоятельная необходимость раерайэтвтъ надежный метод'долгосрочного хранения и использования пеыеки крзхяко» ва современном технологическое уровне.

Іивчикя различных видов животных по разному переносят техво-, логическую обработку (Вагіа К.Gran D.E.. 1088). Поэтому посів' оттаивания нельзя подходить с одинаковыми требования km к живчикам быка н крошка, но вместо с тем треоуется универсальный мздсдг опенки качества семени после оттаивазвк,

Параыелъно возникли вопроси о влиянии юшунных факторе»■ на технологическую обработку' * качество семени, ъолюжвостш испеяьвованкя адидидимадьвого семени редких вилов животных для его крноконсервации и применения пр.ч искусственном осеменение.

Цель и аадэш иосидадаи». Разработать метел нриоковсерва-ции семена кролика ж усовершенствовать метод оценки качества оттаянного семени седьснохозяйствеятых еивотньи.

Для выполнения 8той цели Оьии поставлены емдугвие еадьчи:

1. Разработать метод крноконсервации семени кроликов;

2. Уточнить время введення криоковсервированного семени в зависимости от овуляции самок;

3. Выяснить действие нмыушш факторов ва кркоуотойчквость и ошгопотворящув способность семени;, • .

4. Уточнить зависимость результатов осеменение самок от состояния Шфосоы жиечиков 0осле криоконсервают; '

6. Выяснить возможность использования аптоидимадьного семени дкких животных дія криоконсервашм* .

Взучвая вояизка рабом

1. Разработан к апробирован. метод криокэксорвааии cewemi кроликов, включаетий новый состав протектора, споообы разбавления. аквклибрацки» криоконеервацим ш оценки качества семени.

центральная

научная бчзгиотека | '

моск. СОЛЬi\ 1

Инв. *

2. ваяснеао, что травма семенниха и аутоиммунные нарушения ухуетают не только качество свежевэятого. во и ггморсжено-оттаяз- . ного семени, Осемевекие cswok крнсксвс*?вирсванным семенем ст самгов иммунизированных компонентами их эякулята сюяает процент

* офозд во сравнению сксятрслеы.

■3. Устазсвдено... что для о&ьектхзнсй сценки качества;семени 'помимо траиыиошй ыекаов^ необходимо ксгтэлъзоватъ ' кмыуноеэги-чесгае тесты- • - • . ;

, .4. Лсказало, что акроскесический метол определения качества семеня является универсальным дія . всех їилсв животныхгак до кркскснсервацда семени. так и после нее.

Врзгажяоскзм иезаоаю,. Предложен и ис.тытгл ноеуй метод крко- . консервации семеня кроликов для научных,к практических работ ь ■ . - іфоливсвсдетве.

Доказана возможность t использования ахроскэштгесюго метода" определения качества живчиков до и после криокснсервзуии семеня, полученного различными способами (естественным и хирургическим).

• Показано,.что этот метод дает более псляуп характеристику качества живчиков. '

£ля определения наличия антител к живчикам,- наряду с траги-. шовно используемыми тестами (Rao-и . желательно использо-

вать кымуноферыентныЯ анализ, как наиболее перспективний метод. -; ДлроЛашя работ. Материалы диссертации доложены на научных конференциях отдела биологии воспроизведения (1583-1934 гг), на Ымоаановских чтениях КОа (1902-1933 гг), на III Всесссзном симпозиума по иммунологии воспроизведения с международным участи- * ем (Киев, 1990 г), на конференциях мододдо учених к аспирантов ВИЖа (1933-1989 ГГ).

По материалам диссертации сгуСіиковано 5 работ. * Находится в оформлении авторское свидетельство. C»vcm рдйодм. Диссертация изложена яа страницах-,

машинописного теиста, содержит .^Утайдки. фотографий.

X.

графиков. Состоит из введения; обзора литературы, и аадач ,

исследования, материалов и методов, результатов исследований и их обсуждения,' выводов и практических продлтлений.-Списск литературы . содержит ^/"наименованийв том числе ¿í^ííа иностранном яеыке,-

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Ватерож л меоди Есееедсюша

Работа проведена в Отделе Околэшж »оспротавадекил Е5Ед. 198&-1С95 гг согласно схеме 1." Огаты so" разработке крколротектора • гыпогаекы в вкварии отгела с исзсисьвованкем 23 самцов; £00 саюк .я вавэктоыироваиннс сзиззв кродтов порезы рт»""«^ в.воврасге

1-4 ЛЄТ. . - - „'-*"""''■'' '-'""Л-'

' Самцов вазэкгоыиргфЕЯИ sa дза ыесяда до опатов в хирурпгівс-ксы Ооксе Отдела Сзсдагии воспроивведення под руководством

к. с.-я. в, а. в і Вронской ,

Аутоиммунное« у.сашов (чхшков вызвали травмой семенника, иыиункэацией СДГИ и экстрактом живчиков.

Влияние аутоиимуняоети к «тчюсеи на устойчивость семеня К крисковсервации квучали на быках ДОЮ, проанализировав кш^гнный ответ, качество семена к его устойчивость к криоконсервация у 200 животных.

. наличие антител к живчикам устанавливали в реакциях РИЮ.

рым, рал-э. т.. ■ •

В опытах по криоковсервацки эшшявмальвого сбивай использовал* б оубров. .

Эшгдидималънсл семя вуСра выделяли кэ семенников- воотных Приоксмо-7ерраснсго и Окского заповедников Uockdsokoä и Рягеиской областей соответственно. Этот раедег работы бил вшпшен совместно с сотрудникам KHK Охраны природы.

Лзюдасз KpuafaxxxpsauAi сексаа *рмияз. Up« разработке протекторе семя брал» оч 12 самцов кроликов в соотвествия о мето-Дїооа опнеанаой у Сакзлсвсксй Н.И.в Консяога S.U. (1971).

Качество сг*«ки ссеяквала по внепаему виду, лодвихнэстн, сохранности акросо« дгагчккоа (Соколовская и др. 1CGI) нді иэтедом врдамэяекяого окрашкшгея (Хороаов И.О.. 1СЗЭ).

Концеятрзциг хи&яяш подештоалк - в камгре Горяева .сря уеввпезяи Х200. .'■ * '

СХЕМА ИССЛЕДОВАНИЙ

Разработать метод - криско^серваши. семени кроликов и усовершенствовать метал осекки качества оттаянного семена сельскохозяйственных животных

Сазбор животных аналогов

Метод »фкоконсервацхи .семени кролика

разработка новой среды

Корректировка времени ст овуляции 20 введения крио-коясврвироэакного семени

Действие различных Факторов ва криоконсервацк» сем« ей

¡Травма

Аутоиммуни (аас, С5Ш)

иэашя

Кетозы выявления аутоишуквасти (Ж-МЛ, Э-РСЛ. 1ЮА)

Показатели семени: объем,, .подвижность, концентрация, сохранность шросед

Результат осеменения: " стельность, окрол К),' число крольчат на сайку (X)

Сравнительные оценки качества семени до к после «Фиоконсерваши ~

С

Подвижность, X

Сохранность а'сросом, I

Прижизненное окраздтание по Морозову, X ■. . *

В эякудятах

* 0 I

Кролик

В эпндиди-иглънои семени -1-

Варая

Зубр

Связь между качеством семени, Ч спонтанной аутоиммунностью результатом осемеяения

6- . . .,. .,. Использовали эякулята споквижиосгью живчиков и сохранностью сбросом не мгнее 601, концентрация семенных каетск бша не меие®. 100-140 tus/us. ■ •

Разбавляли эякулята до 14-20 шш живчякоа г лове.' Прототипом криопротектора послужила среда БЭКС (ійиоваггов В.К. в др,>' 1982)..; ■; -..:, ".■ . *■ .*.-

В качестве антиоксиданте иссольэовали гомогенат моркови - в глицерине 8 соотношении 1:1 (Зайцев В.В., 1ÍS9)»"' ', V/ ./ •

Разбавленное семя выдерживали при теилерзтуре+4сС для вкви-лкбраши, ааморажквали в гранулах по 0,2 ил в течение6 мин на пластинах сухого льда. Гранулы помещали в жиякий ваот и . хралиля ' до использования. Всего еаготовкли 1000 доа семени пригодного ддя'.-кскусственвого осеменения. *." .-.-* V ^Ч.;

Семя оттаивали в стерильюи стеклянных.фюконах содержащих';'.; 0,3 нл 2,9Х цитрата натрия аа водяной Оанэ при +40°С» ватем: оценивали по подвижности, сохралности акрооом как опвсеяо Соколовской И.И. и др. tlS81). а также по количеству живьи и кертвых живчиков (Морозов И.О.. 1923). ^

Самок в охоте выбирали визуально. Дивотных находящихся в нападе я конце охоты (вульва розовая и теино-фиолетовая соответственно) хэ опыта исключат.

Овуляцию вызывали с помощью хориоякчесного говаяотротша (ХГЧ) согласно рекомендациям ЮШШик, или используя вааэктомкро-ванных самцов.

Самок осеменяли однократно вводя семя в глубокий участок' влагалища специально изогнутым стеклянным етрицем-катетером... (Соколовская И.й., Кононов В.П., 1971). в контроле самок осеменяли свежеразбавлешшм семенем.

Рее у ль таг осеменения учитывали по числу окролившихся самок и новорожденных крольчат в гнезде.

всего осеменши lid самок, из них 134 - іфиоксасервированішн семенем, . • • /

¡bwymaaifM кролик». В опытах использовали по 4 самца

кроликов породы шампань (аналогов по возрасту и характеристикам эякулята). Эксдеримектальнуп аутоиммунное» к живчикам вызывали наиунизаяией экстракта! аутюгичных живчиков (01). В другой груше в качестве антигена использовали аллогенные секреты доба-

вечных соловых желев or ваззісгошфо ванного самца (СШД). Травму иодедирсвахк точечным прсиаю* . левого семенника ингекцаоваой вглой К 15 (Авилов А.Н., lfl8i). .■'.'"■'.'"

: : весь антигенный материм центрифугировали ори 3000 оС/мкн в течение S икнут, оценивали во количеству Селкз спектрофотсыетря-честя, доводили до Ю кг/нж к хранит до использования.при -20°С.

Яшуннвировалн самвдв, вводя по о.Э ил СЯШ иди 31 внутримышечно с сохвш адьювантск їрейнга одяоїфатно (Karlcw ft Lane, 1088). ватем с трехдневный интервалом по 0.1 ил антигена в

кояноктиву глаза (ЗуОипгай &DL, 1W0).

¡¿шужхжесам «enow. Периферическую кровь у самцов Ррага из упвой веды перед к после экспериментов. Лимфоциты виселяли как саквво у К-*.ооюю®сио4 я др. (1Є65)'.

Клеточный иммунный ответ (популяции Т-лиыфсодгов) определяли методами спонтанного „рогеткообразоваяия с эритроцитами барана (РМ-Э) их собственными живчиками подопытного животного СМД-Х)..

Гуморальный иммунный ответ (антитела к поверхностным аяткге-пш *ивчиков) определяли в микрореакции ПОа (Соколовская Я. И. и др. 1090), а такта в пряши к нецряые« твердофазной иммунофер-мевтном анализе (ИМ).

ОРршЗссяд г™" ' Все вычисления и статистическую обработку данных проводили б моишчтеряой программе Statgraphics с использованием t-критгрюї.Стыадента дія цзлія чисел к долей).

: РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ' 1. , Цраюкоистувдря сеюви кролика

Предварительный анализ вативаого семени самцов кроликов показал, что животные . находятся в . нормальном физиологическом состоянии и их эякуляты вполне пригодны для экспериментов по іфяоковсервацки подовых клеток.

При разработке нового /протектора руководствовались теорией, разбавления семени, еффмухнроваяков ' В.К.Цодозздовш (1Є6г). Испытывал* протекторы, . предлохешаї© в разное время для разбавления ж замораживания семени сегьскохозяйственшк животных: БА2ІАСТ0 (Иклованов В.К. в др.. 1081) - для семени барана; Глнюжол-

' - 7 ■ .. гатратзый (Соколовская И.к.,; 1957) - лея сеиекх кролика; БЭКС (Кялованов В.К.*и др.,-1084) - ддз семеии быка.

Сйнты Ошш проведены при одной и' той же <1:3) степени' разбавления (таблица 1).

Таблица 1

Влияние различных протекторов иа качество семени кроликов £0 и после замораживания

Протекторы Подвижных живчиков в семени, X Сохранность ¿кросом ЖИВЧИКОВ '

свежевзятом оттаянном

Всего подсчет. ЖИВЧИКОВ иэ них (X) с цэлой акросомсй '

При взятии После разб. Перед замор. Сразу Черев г ч

ВАШДСТО 78 40 40 0 0 еоо £1,0+1.66

ГЛИКОИЗЛ- 80 39 39 0 0 600 31,33+1.88

нитратный

БЭКС 80 ■ те 79 ' 23 17 400 53,3+1,08*'*

•"'ммюі.

Лучшую выживаемость, семени кредакг, э средег:ЕЭКС

содержащей сахара-рафиаада (ГОСТ 22-73) - 101,2 г; индексной соли ИагСа-ЗИТА - 6,0 г; желтка курккогс ¡йцг - £0.-0 глицерина (ГОСТ £2-59) - 75 ыл; зхикохро^а - 5,0 и-Т; гзнмдллина и .стрептомицина по 300000 ед: воды дисткмкрозггхоЯ - до 1 л.

После разбавления и . эквилибраши . под2^!остъ оттаянного семени в этом разбавителе составила 231, а акросомы сохранились почти у 4СІ живчиков. Остальные испытуемые протекторы отрицательно влияли иа жизнеспособность живчиков уже сразу после рзэбавле-игя эякулятов. так как гликокол-нитратный разбавитель рассчитан на хранение семени.кролика при температуре не иихе -1Е°С, а среда эдпасто сбалансирована для живчиков барана. •

.Эти данные позволили использовать протектор БЭКС в качестве' основного.- В дальнейших опытах ■ испытывали различные варианты степени разбаглекяя семени (таблица 2). '

. Из. тайлиш £ видно, что пэдвюкностъ живчиков и сохранность их ахрсссм не зависела от степени разбааленяя свелевэятого семени, тогда как после крноконс'ервацки эти' показатели уменьшались по м^ре увеличения степени разбавления эякулята.' Лучшие результаты получены при соотношении семени и среды равном 1:3, когда подвид-

: . - а,-

ность после оттаивания практичесга не менялась (23Z) в течение 2-х чазов. .

Таблица 2

Качественные показатели семени кроликов . в еависимости от степени разбавления эякулятов

Степень Подвижных ЖИВЧИКОВ.-X Живчиков с целой акросомой, X

ления семени в свеж.семени в оттаянном в свезг-вгятом семени в оттаянном семени

После равб. Перед замер. Сразу Черев í £ ч

4 80 80 23 23 61.9+2,5? 51.7+2.04" 8 60 80 18 17 81,9+2.57 44,3+2.02 16 . 80 еО 15 13 81,9+2,67 43.0+2,03

*)Р<0,С5. '

8 следующем эксперименте разбавленное в 4 раза семя поделили на четыре равные порции- Каждую из них заморозили отдельно после различных режимов зквклхбрации. Наибольшее количество живчиков с целыми акроссиаин било после 4-часового режима эквклибрации (23$), когда семя в течение 2 часов находилось при комнатной температуре, а затем 2 часа - при +4°С. -

Учитывая вышеизложенное, попытались вшснить действие различных этапов криоконсервацки на качество семени кроликов. Для этого провели сери» опытов (n-15J. где изучали подвижность и сохранность акросом после каждого этапа криококсервации. Установили, что потери полноценных живчиков после аквилибрации составили всего 101. а после оттаивания глубокозаыораженного семени - 32Х СР<0»001).

Известно, что для повышения устойчивости мембран ЖИВЧИКОВ традиционно используют фосфолкпкды (Шловаяоз В.К., Селиванова . О,, 1332), в частности выделенные из яичного желтка. .. .... ¿¡¿я выяснения оптимального количества яичного желтка в состав среды его вводили в различных концентрациях (таблица 3).

По мере нарастания в среде концентрации желтка, улучвается подвижность живчиков и сохранность их акроссм в оттаянном семени.-Увеличение концентрации желтка до 2QX повысило , подвижность живчиков в 2 раза, а сохранность их акросом возросла на статистически достоверную^ величину (Р<0.001).

Таблица З

Влияние различных концентраций яичного делтка ва качество оттаянного семени кроликов

Іедтка в среде. [Подвижных живчиков Б семени, X Сохранность акроссы живчиков . •

[ свежевзягом оттаянном

Всего подсчит. живчиков нэних(Х) сцелой '* акрссомой

После |разОав. Перед замор. Сразу ,Через 2 ч ■

5 83 76 10 . 5 600 29,5+1,86

10 83 80 12 - ■ 3 . 600 : 35,5+1,95 Ч

15 83 80 12 - 6 • ■ ■ 600. 40,3+2,00 '

: 20 81 78 20 15 600 . 45,6+2,03"* ;

••оР<0.001. ' .... ■ л.':

Поскольку отрицательных осмотических явлений ори разбавлении, семени кролика средой БЭКС не наблюдалось. концентрацию сахара-рафинада оставили без изменения/- . 101.2г/л" с допустимыми отклонениями в пределах 0,1 г/л.

Для уменьшения потерь ионов Иа+, К+, Са+ и Р под ' влиянием низких температур и повышения криоустойчивости живчиков в ^состав среды вводили СаИаг-ЭДТА,

Установили, что оптимум натрий-кальциевой комплексной соли ЭДТА довольно четко ограничен к составляет 7,0 Г/л при допуске вариаций не более 0,05 г/л. Изменение, концентрации ЭДТА на 0.5 г/л в ту иди другую сторону резко ухудшало качество семени. Особенно эти колебания отражались на сохранности акрссом после оттаивания. ,"

Сравнительно с другими природными антиоксидантами (токоферолом и эхинохрбыом), лучше действовала на семя надосадочная жидкость гомогената моркови в глицерине (1:1). Семя, заморожениое и оттаянное в протекторе, содержащем этот антиоксидант, имело лучшую подвижность как перед замораживанием после эквклибрации, так и после оттаивания. Сохранность акроссм живчиков била выше на статистически достоверную величину (Р<0,001) и составила 541.' Это согласуется с данными других авторов, исполь&овавших растительные антиоксиданти при криоконсервации семени барана (Лизунков А.Ф., 1989; Зайцев В.В., 1989).

Наряду с другими кркоконеервантами, такими как сахар и желток куриного яйца, в состав крнопротектора вводили глицерин, как

веоаство аюооОиое увеличивать морсзозтойкссть живых бяокогиче» Кжх объектов включая сеыенЕые таеткя Шоддж и др., 165S). На основе анализа литературных данных о алиягаи глицерина аа живчики -Ярохвка (Hanada A.4. Kagase ' Н.-> 1080). ограничились испытанием ишюнтраий глишрнЕа в пределах от 4 до 81.

Дзяше опыта показали, что сохранность шфосом живчиков^. в , средах с тают< содержанием глкцерква остается без изменения в течение двух часов после оттаивания. . ■'

Таким ооразси. ш уставовио слгдуицее оптимальное соотноое-ввв йшгговевтоа среды (р+*-б,8)для (фвсконсервашя сеыени кролика: .■ ■ у.-' '.'...■'..-■'"■_■■....' ■ ; •

. > • 1. Сахар рафинад (га7Т-22-7В) - 101,2 г

•' .2. Желток куриного яйвз , - 200.0 ЫХ '/-/••'

3. Кашексвая сохъ КааСа-ЗЯПА . - . 7,0 г

, 4*. Гомогеват. гляцерива с морковы) (1;1) - . ЧС,О мд :*

б. ГлнаерИВ СГОСТ-62-50) .. . . 40.0 ut .

■ б. Вода бядистиллироваява«- . " ' " 1000: кд. Среда зтогосостаьа использовалась во всех дальнейших опытах по »фвжоасервааив семени крсшоса. : V'

■" '■■ :•. \Л• • Реэул-а» освмооояхя крольчих • - '-;•• -

Для сираяадеяЕв сождотаорявдей способности живчюсм,; самок осеыеш* * ■ свехеваятым ; разбаалеюии, к «аиорожеяно-оттаяннш секевем. . ' "г;'' •. .'Л' . .V.; -ч.:-. • v ' ^ ■

Результативность осеменения крольчих оттаянным -'семенем составила СО,« ' при срсднем вькоде 4.0 крольчат на сексу с варь-„врованиеи в ' пределах от 1 ко ю; Таким образом, использование предлахеиного криопротектсра позволяет подучить процент сукроль-вости практически; . вдвое болъвнй чем в аналогичных опытах других авторов - 33.0Z о рангом'от 4 до 10 (Oublel А. ,• 1«ьб).

В природе у крсипьчих . е^ про«ассщит-ие спонтанно. а провоцируема коитусом. Поэтому при искусственном осеменении , требуется внеаыий стимул вызывающий овуляции. Факторами стимула-рушод выгод яйцеклетки vcryr быть спарквгиот с вазэктомирозаз-

кым самцом, введение говадотропных препаратов и пр. Подготовка: ваззктоккровакнык самцов сопряжена с определенными трудностями, а их Оодывое количество .в стаде связано с непроизводительными затратами. Поэтому 'необходимо увеличить нагрузку на одного вавзк-томированного самид путей сокращения времени от овуляции до' введения семени, либо применять гормональные препарат.

Сроки осеменения самок (сразу или спустя 5 часов) после стимуляции ваззктомированными самцами не повлияли на количество окролившдася самок (53 и 562 соответственно) и на число крольчат (5 н 6) в гнезде. Увеличение срока от стимуляции ХГЧ до введения; семени на 5 часов также не повлияло на размер гнезда (по 4 кроль- * чонка). а его влияние на результаты окрола (58,3 и 71,41) било статистически недостоверным, 1

. Средние показатели окролов после применения двух способов вызывания овуляции показаны в таблице 4.

Таблица 4

Влияние способов вызывания овуляции у крольчих

на результативность осеменения с

Способы Осеменено самок * Долучено крольчат

Всего ив них окрод. I окрола всего на окрояквиуюся ■ самку ■

Вазэктомированный самец 48 27 65,0+5,1 140 6,2+0,6

Хорионический гонадотропна га 17 65,0+6,6 66 4.0+0,7

Из таблицы видно, что эффективность стимуляции вазэктсшро-вакним самцом и ХГЧ практически равноценна. Если использование зазэктоыированного самца позволило увеличить выход крольчат на самку, то применение ХГЧ - повысить процент окрола.. При этом увеличение срока между стимуляцией и осеменением, т.е. уменьшение срока между овуляцией и введением семени до 5 часов не влияло на результаты осеменением криоконсервированнш семенем.

- 12 - ■■.■.■' ' '

3. Действ»» различна* факторов ва характеристику семеня

.к результаты осекеиекхя

•

В дроизволствеЕЯЫх условиях довольно часты случая тразмиро-. Ванаа половых органов производителе4. Так например, в 1083 г из - 191 быка ЦСИО. 312 животных перевесах заболевания,органов размно-жевкя. . - ■'; ..... ;.■:■■.'":..'■

Наш оша сделана попытка, выяснить влияние травмы семенника на технологические свойства семеня, количественные и качественные характеристики свевеваятого я ааыерсяеяно-оттаявного семени, также действие нарушения целостности гемато тестккуляраого барьера ва оплсдотворяадув способность кркоконсервирсванного семени.

Точечный продол семенника оказал-существенное влияние на все показатели семени.. Наиболее значительные изменения вафиксировал* в первый месяц после травш. Так, через.15 суток после проколу семенника объем эякулята и концентрация живчиков в нем снизили^ ва 42%, ' а сохранность а»фоссм - на 15Х, Обсее число живчиков | эякуляте и их подвижность сократилось в три раза.

Однако уже через 30 суток эти показатели приблизились (с контрольным величинам (до опыта), а через 45 суток практически отличались от них/. Это объясняется тем, что сперматогенез у животных продолжается в течение 45-60 суток. За это время проке» ходит частичное к/или полное восстаковлекке функций семенника.

Количество ¿пролившихся самок после осеменения (фиокоясерви-рованным семенем от травмированных животных сократилось на 192 пс сравнение с контролем (41 и 60Х соответственно). Однако выход крольчат на самку до опыта и после него практически не меняле« (5,3 и 5,0). Вероятно это связано с ранней эмбриональной смерт* КОСТЬ С после оплодотворения НеПОЕНОаенЖй« живчиками.

4. ' Действие различных факторов вадемуивмй ответ

и харахтврмстжу соыекм

Клеточный и' • гуморальный кммушшй ответ организма самцов д ; и после травмы семенника -изучали в реакциях веспецк^ического специфического розеткоформироваккя и с помедьо иммупо^рментно] анализа (твйлада 5), "

Действие односторонней травмы семенника на иммунный ответ организма самиэв

Таблица 5

Группы " {'вм-ж СхГ

РОЛ-Э «)

ИМ. (ел. погл.)

Контроль (до опыта)

Опыт

Разница

12,3+0,72 28.0+1.11.. + 16.7""

6.25+0,5 31.0 +1,18 + 24,75"'

- 26Э+12 , ЭОб+14 + 33е

*)Р<0,05; *">Р<0.001. '

„.Как видно из таблкш 5. травма семенника вызывала значительное увеличение содержания т-лимфоцитов\в крови самцов свяванное с активацией клеточного звена 1« иммунной системы. Это подтверждает реакции специфического (РЭЛ-1) и неспецифического розетксфоркиро-вания (РФЯ-Э). Иммунофермектный анализ показал достоверное (Р<0.05) наличие спермоангител к поверхностным антигенам живчиков . в крови травмированных самцов. . '

Несмотря на то. что количественные и качественные показатели семени через 45 суток после травмы семенника практически вернулись к норме, иммунный ответ организма самцов оставался вьюжим. Таким образом снижение результативности осеменения самок криоконсервкрованным семенем было вызвано иммунными причинами.

Так как эякулят состоит их двух основных компонентов, плазмы семени и живчиков. важно знать который из них больше влияет на воспроизведение. Подобные эксперименты проводили ранее, но с дальнейшим изучением свелсеваятого семени (Соколовская И.И. и др.. 1982; Авилов А.К.. 1604).

' В таблице б показано влияние иммунизации РЯ и СЩ на иммунный ответ организма самцов кроликов. Видно, что иммунизация самцов антигенами обоих групп вызывает значительную активацию клеточного звена их иммунной системы (ГЧЯ-Ж и ЯФЛ-Э). 'Однако, циркулируете антитела достоверно выявлены (МФА) только в крови самцов иммунизированных СЕТИ, что связано с большей иммуноген-ностьо антигенов этого происхождения сравнительно с собственными антигенами живчиков. .....

. ТаДдив б -Действие иммунизации сгмоэв эх и OSES - на иммунный ответ'кх организма

Группы - ІЧД-Х (I) РСЛ-Э (I) К5А (ед. погл.ї

до после Раз- до после Раз- после* Раз-

им. вммув ность им. иммун ность иммув. ность

Контроль - 9,8 12,2 +2.4 8 12.2 +4.2 263

+12

ЗЗЕ 8,8 20.7 +16.7"" 10 38.5 +28.5"" 292 +20*

+13

СШВ 10,3 16.7+6.4**" 7,125.2+18.1*" ЗЗЭ +65"

+25 —

Ж)Р<0.05: в,,,Рсо.01: "^Pio.ooi.

Наличке в tqposK самцов антител к компонентам собственного эякулята приводит к значительному снижению качества семени, и мажет служить причиной выбраковки свехевзятых эякулятов высокоценных производителей (Абилов А.И., 1991). Выяснено, что антитела к антигенам тестикулярво-этаждимагьного происхождения, но не йягягеазм СШХ. вызывает эмбриональную смертность ва предимлаята-шюнной'стадии (Кочетков A.A., 1888),

В таблице 7 показаны качественные и количественные характеристики свежевзятого и ^^консервированного семени полученного от самцов иммунизированных-различными компонентами эякулята.

Таблица 7.

Действие иммунизации самцов на характеристики , , эякулированного и и кркоковсервировалного семени

Группы'.. . Объем, : Концентрация, млн/мл Подвижность, Z Целых акросом. 2

■ до гамо-ражизан. после оттаиз. до замораживая. после оттаив.

■ Контроль '-■"'..

0.61+0.05 231.5+22.6 71.0+2.0 18,0+2.0 82.0+2.1 57.8+2,0

KtecfMb 0.51+0.04 287.5+48.8 73.0+2.0 21.0+1.0 78.4+1.8 52.2+2.8

31 0.Є8+0.10 230.5*31*7 60.0+3*0 U.O+lTo 71.5+2.7 42.0+2.2 СЗШ 0.69*0.09 235.5+25.0 бЗ.О+З.О 14,Q+1.0 67.5+2.5 40.&+2.2

***)Р<0.001.

. .... 15 -

Иэ таСлида 7 ваднэ,- что 8 обоих ю.тгрслях качественные і количественные характеристики семени Сили одинаковыми. їімиуни&а-см СДПХ достоверно ве повлияла на качественные показатели рїку-лятов, хота иммунный ответ организма саьцов па введение даваотс антигена был вначитехьннм. Иммунизация SO приводила к ввачктехь-нсму (Р<0,001) снижения подвижности хивчиков : в Лсввтеввятш семеня, а после процедуры замораживания-оттаиванияэта тенденция сохранялась. '. - • .'•'• ' * ..

После осеменения крольчих криококсервированным семенем от самцов, иммунизированных ЗА, количество окролившихся самок достоверно (Р<0,05) снизилось до 18Х по сравнением с обоими' юятролями (64.5 и 62,02). Иммунизация сашов СДСЖ еначитехьно не повлияла на результативность осеменения (БОХ окрооа).

Таким образом, сшгеение результатов воспроизведенияпод действием антител к антигенам живчиков, ранее выявленное дія све-, жевзятого семеня, сохраняется и после криококсервации эякулятов.

■ S. Аухаюшувпссхя Сіжав-прскзжуотювсЯ « * резужмаяшюсп. освшвоюа '

. - Известно, что каждый сык ЦСИО имеет високую племенную ценность, я поэтому важно своевременно выяснять не является ЛИ он носителем аутоантшел к собственным живчикам. :

С этоА целью 200 быков ПСИ9 исследовали в гуморальное реакции иммобилизация живчиков в аутосыворотко крови. Полученные донные сопоставили с результатами стельности коров. У 22.6Х обследованных производителей : была выявлена аутоиммунное», во высокий титр антител (8-16) к собственным живчикам обнаружили лип. у 14.2ЄХ быков. . ■. .

подвижность свежеввятых живчиков у быков,■ проявляющих ауто-иммунность в титрах 4-6, не отличалась от таковой (в среднем 601) у производителей без спериоантител в крови. Общее количество .жиачиков в эякулята* /аутоиммунных быков было Ra 400 или меньше, чем у нормальних животных, Ссия, полученное от таких производителей хуже переносило технологические этапы криокояссрвацна, что выразилось в снижения наода доз семени пригодного к , исшиьзова-нио (рисунок 1),

0 J«"1 ^

Ш ' } s J 4 J. , - : ...

, --1

{ мі **■ ..Л. - - ■

• • Я «

• . Trip* « « uni СРИМЖ)

Ріісуііок І. Связь аутоиммунное л і с устойчивостью живчиков с криоконссриации. * . -

Рисунок 2. Влияние аутшіммуішости бмкои (НІМЖ) it;i результат * . oceMfHum« к<ч*»н.

В Сплм шийьиыш*

Рисунок 5. Влияние аутоиммунное!к быков на эффективность оссмекемня коров. • ,

/■ - ' -18 -Из рисунка 2 видео, что, даже после жесткой выбраковки зяку-латов со традиционным параметрам, процент стельвости снижаете» (F40.0S) при осеменении {фиоковсервироааянш семенем быкез Пско, проявляю®« аутоиммунность в различных титрах. .. .

. Данные по выяыеЕКю сенсибилизированных Т-лнм£оцито8 в клеточных реакциях РЬЛ-Э в В2Л-Х согласуются с титрами спермой*-мобнлизирутекх антител, выявленных з гуморальной реакция рюа. Применение оттаянного семени быков, одновременно имеющих высокие (4-16) титры спермоаатител я значительное (6-Í2X) количество Т-лимфоцитов. приводит к снижению (F40.001) результативности осеменения - до SES стедьшк норов сравнительно с 75Z в контроле (рисунок 3).

б. АкроскоонческхЯ метод созикн качества семевм

Наряду с традиционными методами оценки криоконсервировачяого семени по подеюгаостн и соотноиени» живых я мертвых жквчикоз (Морозов В.А., 1038) использовал» гироскопический метод описанный И.И. Соколовской и др. (1981). Этот метод имеет ряд преимуществ/ поскольку позволяет одновременно . определять не только состояние ахросом. во и подвижность живчиков.

Данные опыта показали, что подвижность семени кроликов после замораживания снижается сочти до критической для искусственного осеменения точки. Потеря двигательной функции живчиков составляет 801. В то же время разруаевие акросоы половых клеток находились в пределах 25-301.

Хотя результаты полученные разными методами практически совпадает, однако преимущества акроскопического метода гаклочаится в легкости исполнения и меньших затратах времени.■ ■-.'.

Результаты применения акроскопического .метода для аналога подвижных живчиков из свежевзятого.и криоковсервкрозаяного сеыени различных видов животных приведены в таблице 8. •

Из таблицы 8 ведяо, что подвижные живчики различных видев животных.значительно отличаются по состеяшм .акроссм. Так, если в свежевзятои и оттаянном семени быка подвижные живчики с разруганной ахросомой составляют : 2%, то в семени барана их кодич^тво наиболее высокое - 7-81. Среди подвижных живчиков кролика практя-

чески отсутствует клетки с разрушенными афоссмамя (О, II) как в свелеваятом, так н оттаянном семени. ..

Талдса в

Сохранность акросом подвижных живчиков у разных видов животных до к после 1фиоковсервации семени

Хквотше Число зякудятов Число исследованных подвижных живчиков .

Всего Из них с поврежденной вкросоиой

число .

Бык . Баран Кролик 46 6 .10 Свежевзятое сема 8800 -г 186 1200. , 81 2000 . 8 2, (НО, 01' ! 6.75+0,26 ' 0,4+0.001

Бык ' Баран Кролик 17 11 10 Оттаянное сема 3600 . 82 2200 182 2000 2 2,3+0.03 8,3+0.17 0,1+0,003

Большие межвидовые колебания (в пределах,., Б-1БХ) количества подвижных живчиков с поврежденными акросомами. могут служить причиной несоответствия денных по подвижности живчиков м результативности осеменения. Это предположение мы проверят в опыте с. осеменением крольчих криоконсервировавным семенем содержащим живчики с различной цодвнжностъо, но сходным состоянием акросом.

Вшсяеяо, что. подвижность живчиков не влияла на сукрольность и число крольчат в гнезде. Среди крольчих, осемененных семенем а единично-поступателноА подвижностью живчиков (группа I), во на разрушенными (72,02) акросомами, окродклось 73,31 самок. При использовании оттаянного семени с подвижность» живчиков ГО-ЗСХ и сохраняостьв акросои 65,51 (группа III) количество окродквиихся' животных снизилось на 1б£ и составило 671. Примерно разным (73,3 и 751 соответственно) оказалось число окроливлнхея самок в группах I И II, осемененных семенем с разной подвижностью (Б . и 10-15%), но со сходным количеством целых, екроссм (72 и 702). Разкапа по результативности осеменения крольчих между контролем и опитнши группами I и II составила 26-281, ' а мохду III группой и контролем - 43Х.

результат опыта доказывают, ' что состояние акросом более объективный показатель качества семени, чем подвижность живчиков.

В связи о этим изучали результативность искусственного осеменения

крольчих в вазнсимости от состояния акросом живчиков в заморожев-

во-оттаянном семени (табляца 8).

■..■■■■• Таблица 9

"Результат искусственного ссемевевия самок в вавксимости .от состояния акросом хиэчиков

группы Белых агфооом. Подвижность. • Осемевено самок Родилось крольчат

всего скролклось, х всего на самку

; I ' • 41-60 II - 61-75 ; Контроль . 85-90 25 -.18 . 80 9 14 14- Эй,0+3,4"*" 00,0»5.7 100.0 10 62 117 . 3,3 5,2 8,4

Иа таблицы О видно; что. при малом количестве в семени живчиков с пелой акроссиой, снижается число сукральных самок и выход крольчат на саику.В первой группе, где сохранность акросом после криоионсерващт живчиков была минимальной, окролилось ЭОХ осеме^ венных самок.' Несмотря па то; -что подвижность семени в первой группе Ста вначительно выае. чем во второй.. где животных осеменяли семенем с' высоким содержанием целых акрооом (61-751). количество окролов вдесь Сию в 3 раза меньве (Р<0,001), а число крольчат насаыху меньше ва 601. Результативность осеменения во II группа была' сравнимой с контролем,. когда крольчих осеменяли свежераабавленным семенем с 85-002 цалых акросом (loot окролов).

• 7. Качосхет. ядоповсервирававвого эгодааималыюго семекм юзодзаада дкккс «хгютныг и его жоохьаованнв .:

1.В последние.годы.назрела .необходимость создания криобанка семени всчёашюк' видов ■ диких животных для сохранения генофонда редких к исчеааедкх видов, а также отдаленной гибридизации диких копытных с домашними животными. \в Честности зубров с крупным рогатым скотси.- . .'л , ♦

В связи с этим встала вадача изучить эффективность различных способов получения семени зубров. На первом этапе, контролируя подвижность живчиков, как главный критерий качества семени вспольвоваяи состояние их акросом (тййлица 10). 1

Таблице 50

Характеристика криомовсервироваивого семени вубра

полученного различными способами - ;

Способы получения семени Подвижности живчиков, X . Сохранность екросом. х

Свеже- выпе- ленных После криомонсер. Свеже- вьще- ленкых После (фИОКОВСерВ,

1 мес. 3 года 1 мес. 3 года .'.

На месте ' отстрела 60,0 >0,0 30.0 ео.о Б4.6 .г : Бб,5 ■

В лабораг тории 70.0 ¿0,0 ¿0,0 82,6 67, б 64.0'

Электроэякуляция 20.0 - 10.0 10.0 .

Из таблицы 10 видно, что, помимо технических трудностей получения семени от зубров алектроэякуляцией (предварительный отлов самцов, использование релаксантов и пр.)» такое семя оказалась непригодным для использования уже по подвижности живчиков. Выделенное из эпидидимиса сечя не утратило своей биологической полноценности, даже при длительной срок© хранения после криокон-сераацки подвижность живчиков и сохранность их акросои уменьшились незначительно. Лучшее (статистически недостоверно) качество эдидидкмального семени было достигнуто при проведения процедуры замораживания в лабораторных условиях.

После трехлетнего хранения семенем вубра осеменили 8 коров, в контроле коров осеменяли заморакенно-оттаянным семенея чистопородных быков (таблица И).

Таблица 11

Результат осеменения коров семенем вубра

Группы Осеменено коров Родилось телят . Продолжительность стельности, сутки

Всего | X

Контрольная 10 6 60.0 2В5 + Б

Опытная в 4 . / ■ БО.О 260.5+5

Результативность осеменение коров семенем вубра оказалась несколько (недостоверно) нижа, чем семенем быков в контроле.

- ООравает на себя вашазх* более косотгай срок Елгдоиаееаш гвбрндав но ссагяенш с частопорсдвллі телятаи. шсса пйридЕых тмсзчек про рш«вши ва 9 кг лрердагя массу ила чягтопорсдак сг8ерствяа С43 а 3*. ктооответствеево).

ВВОДЫ "'

1, Разработан практически приеклейій метод крнсютгсрззцки семззя кролхязв вогволякрй подучить 60.41 о«фолов при средней рсшер» гнезда 4-5 крольчат ва самку.

•. 2. Увеличение вреигди между стимулом оэуднани и ооемевеаием крольчих ва б чаоов повволяэт аФЭективэее ясссльэоеахь вакзктсми-рованного сшца.' в не влияет на резу— тэты осеменения крольчих криоконеервированнаї семснеи (Б31 окролов яри 561 в контроле).

3. Аутояауввзаяга самцов антигенами живчиков в травма сеизввика приводят к ухудшению качества ве їолько свехевзятсго. во н криокоасервврованзогр семени кроликов: число «фодявтоосся едок снижяэгса ва <б,К (Р<0.05) к 1 СІ соответственно. їммуниза-ша садов ОШЯне влияет на резу-гітаткввссті оселеаеаия крнокоа-сервгрованнш семенем.

"4. Додвгастссть. жявчкков после оттеиваана в меньшей стєегєеи сетаааа с результативностью осеменения. чем состояние их акросом. Ото позволяет считать акросксгояескяй метод более информативным Аля оценка качества не только свевдьвятого. но и краоионсервиро-ванзсго семеня. ■'

5. Качественные характеристики іфисиовсерввроваяаого о сидя-дашьвсго СЄИЄЕК зубров (ЭО-40Х -иодвкквюс живчиков с Б5-67Х паяли акрооомани) позволяет испольеовагъ его при искусственном осеменении поров с хсхкхяыя (ЩИ,отела) реаультатеш.

■ ВРАШЧЕЕЖЕ ©ЕДКЛЭИЙ

: 1. Равреботенный метод краоиовсарващя крслкха,

вкяяаазий воркД ссстгв протектора, сяозоби рззЗаалек.чя, зхзклиб-рации» крамдансерваэш и оценки качества а также сроки

осеизквния крольчих, рекомендуется - к ваюльгоЕаяакго в практккг кролиководства к лабораторных всслсгссднм?*. ;

г. Метол криоконсервирсваакя эпидидимагьного семени рекомендуется к использованию для сохранения генофонда исчезающих видов' диких животных, а также для получения межвидовых гибридов зубров. ■ с крупным рогатым скотом.

СПИСОК ОЯУЕЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ' ■ .

1. Кочетков A.A.. Сскаюсскзя И.К. Ксмбарова H.A. Поверх-костные антигены спермиев в раннем эмбриогенезе/ 4-й Всесоюзный симпозиум по иммунологии репродукции с ыеад.уч.-Киев, 24-£6 окт. 1S33 г. • С. 32

2. Соколовская и.И.', .Авилов А.И., Кочетков A.A., Таг Т.А., Ксмбарова H.A.. Стоянов 8.К., Турбин В,ф. Методические рекоменда-. цми по выявлению, устранению и предотвращен!!» аутоиммуяности у еыкоз-прсизвсдителей/ Дубровиш,- tOQO.- 31 е./

3. Эрнст Д.К., АОилов A.A., Сипко Т.П., Комбаровя H.A.. Шумов A.B. Межвидовая гибридизация зубра с крупным рогатым скотом. Молочное и мясное скотоводство//- 1603,- N 4.- С, 19-21,

4. Kcrtarcva N. А., Kochetkov л.» Sokolovsknya I.';. Ttv prcpertlts of ant 1 sera to bull and ratou ejaculates components'/ -J.Irounol. and patoloffy.- 1992. - N 12,2, -P.8.

5. Kociiethov X. * Kombarova N.A., Sokolovskaya t,I. Factors, lnfluenslnff on bull and rabbit sporms. In vitro capncUatlm (SCAP).// J. Innunol. and patoloffy..- 1992. - К 12,2. -P.Ö,

Лгииінсаио к іечатв 16.04.1996 г. Зша 871.

Тираж TS »з. О&ьем 1,0 уч.-л. .

■ ПМП ВИЖа

і