Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Криоконсервирование и оценка семени кроликов и зубров в связи с технологическими и иммунными факторами

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Криоконсервирование и оценка семени кроликов и зубров в связи с технологическими и иммунными факторами"

Р Г Б ОД

1 3 МАЙ 1398 ^ правах рукописи

Комбарова Нвна Анатольевна

КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЕ И ОЦЕНКА СЕМЕНИ КРОЛИКОВ И ЗУБРОВ В СВЯЗИ С ТЕХНОЛОГИЧЕСКИМИ И ИММУННЫМИ ФАКТОРАМИ

ОЗ.ОС. 13 - физиология человека в животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой стелена кандидата биологических наук

ДуброБицы - 1996

Работа вшпявева г отделе Оиаюгии воспро»гведеши в искусственного осеменения сельскохозяйственных хквотшд Всероссийского ввучно-нсследоватедъского института животноводства.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

h.í.соколовская

Офящахьвые оппоненты: доктор биологических ваук Н.Г.ЕУКАРОВ, кяядиддт биологических ваук В.Ж.ГАЛХЧ.

Зедучее учреждение: Всероссийский научно- исследователь ский институт племенного деда.

Зешта диссертации осжяоитси tttá/Ccf юре г.

в /О «асов ва заседании диссертационного совета Д 020.16.02 щи Воероосяйскш научно-исследовательском институте животноводства.

Aspee: 142012. нос. ДуСровяцы Подольского района Московское оОлестж.

Автореферат равопяв, * " й-И./^сЪХч? iras г.

Ученый секретарь диссертационного Совета профессор

П.А.Науиею®

^ t » л

СЕЕ&Я ХАРАКТЕРИСТИКА PABDTii

Длтуачьисакг работ. В касзоядее зр*ме £ свяви с ажрогам зованиеи к^слкког в зоотехнической zsSopnrcpaoft гтоактике, особенно е связи с получение« граясгентас. живсгнкх ryr?v тгскслъ-зорзкия >лткски>: пслсзых клеток в качестве вектора ДЛ5 чужеродной ДНК, возникла Еастсятелъкая необходимость разработать надежный метод долгосрочного хранения и использования семени кроликов за современном технологической уровне.

Живчики различных видов животных по равному переносят технологическую обработку (Bamba К. Qrsri D.E., 1В88). Поэтому после оттаивания нельзя подходить с одинаковыми требованиями к хивчккаы быка и кролика, во вместе с тем требуется универсальный метод оценки качества семени после оттаивания.

Параллельно возникли вопросы о влиянии иммунных факторов на технологическую обработку и качество семени, вовыояшостн использования эпидидимального семени редких видов животных для его криоконсервации и применения прн искусственном осеменении.

üsjü u вздзш цепездовашя. Разработать метод крноконсерват цки семени кролика и усовершенствовать метод оценки качества оттаянного семени сельскохозяйственных животных.

Для выполнения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать метод криоконсервации семеня кроликов;

2. Уточнить время введения криоконсервироваявого семени в зависимости от овуляции самок;

3. Выяснить действие лммунных факторов на ^неустойчивость и оплодотворяющую способность семени;

4. Уточнить зависимость результатов осеменения самок от состояния акросом живчиков После криоконсервации;

5. Выяснить возможность использования 8пидкдхмельного семени диких животных для криоконсервашт.

Научная вовивва работ

1. Разработан и апробирован метод криоконсервации семени кроликов, вкдючаетий новый состав протектора, способы разбавления, эквилибрации, криоконсервации и оценки качества семени.

2. Выяснено, что травма семенника и аутоиммунные кару-ения ухудаают не только качество свехевзягого. но и заморожено-оттаянного семени. Осеменение самок криококсервирсванкым семенем ст самшв иммунизированных компонентами их эякулята снижает процент окрола по сравнению с контролем.

3. Установлено, что для объективной оценки качества семени помимо традиционных методов необходимо использовать иммукохогя-ческие теста.

Показано, что акроскспический метол определения качества семени является универсальным для всех видов животных как до криоксксервадаи семени, так и после нее.

Практическая цеввосххь. Предложен и испытан новый метод крко-консервации семени кроликов для научных у практических работ в кролиководстве.

Доказана возможность использования акроскзлического метода определения качества живчиков до и после крисконсернации семени полученного различными способами (естественным и хирургическим). Показано, что этот метод дает белее подкую характеристику качества живчиков.

Для определения наличия антител к живчикам, наряду с традиционно используемыми тестами (FW3. к РЛГ-Ж), желательно использовать кммунсферыектный анализ, как наиболее перспективный метод.

Лпробашя рабош. Материалы диссертации доложены на научных конференциях отдела биологии воспроизведения (IGS3-IQQi гг), на Миловановских чтениях ВКЖа (1QS2-1533 гг), ка III Есесссзнзм симпозиуме по иммунологии воспроизведения с межлународным участием (Киев, 1990 г), на конференциях молодых ученых и аспирантов ВИЖа (1988-1983 гг).

По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Находится в оформлении авторское свидетельство.

ООъси рабосог. Диссертация _излодбна на страяишх

машинописного текста, содержит таблиц. фотографий, 4 графиков. Состоит из введения, обзора литературы, целей и задач исследования, материалов и методов, результатов исследорачий и их обсуждения, выводов и практических предложил. Список литературы содержит ¿-Pf наименований, в том числе ^ ка и:;сстралксы яьыке.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

tssspjaa я kotoîji skässjsjssösi

Работа проведена в Отделе биологии зоспроиБведенкя БИЕа 1S85-1S8S гг согласно схеме 1. Опыты по разработке криопротектора зн^олкены з внварин отдела с использованием 28 самцов, 200 самок я 4 взБэктомираванньк сзиазэ кроликов породы иаипань в возрасте 1-4 -ТЭТ.

Самцов вазэктоыирг.ваги эа два иэсяца до опытов в хирургическом боксе Отдела биологии во^гтроивведенкя под руководство«

¡к. с.-х. в. А.В.Бронской .

Аутоиыыунностъ у сгыцсв кроликов вызвали травмой семенника, уьй£унизацией СДПЖ и экстрактом живчиков.

Влияние аутоншунности к кивчикаы на устойчивость семени к кшоконсервацки научали на быках ЦСИО, проанализировав ргэг/няый ответ, качество сеыенн и его устойчивость к кркоьээнсервации у 200 загвотных.

Наличке актстел к киечккзм устанавливали в реакциях FEM3, РМ-2, РЬЛ-Э. KSА.

• в опытах по криокоЕсерващи зшщздкыадьЕого семени исподьзс-„ вали 5 зубров.

Эгшдкдимальноэ сема вуора выделяли иэ семенников животных Прнокско- Террасного и Оксксго заловздякксв псковской и Рязанской областей соответственно. 3?от рагдед работы бил выполнен создест-ко с сотрудниками КИИ Охраны природы.

йжэяияз взт'жгсертгкет секна При разработке

протектора семя брали о? 12 самцов кроликов в соотаествкя о методикой описанной у Соколовской H.H. я Кононова В.П. (1071).

Качество сеиэнн опвяквалн по внешнему виду, подвига ости, сохранности акрсгоь янвчккоз (Соколовская н др. 1231) или кэтсдом гфкжизнэнксго окрашкЕаякя (Морозов И.О., 1533).

Концентрате? знвчкксз подсчитывали в камере Горяева при угеламезия X2GQ,

СХЕМА ИССЛЕДОВАНИЯ

Разработать метод криоконсервации семени кроликов и усовершенствовать метод оценки качества оттаянного семени сельскохозяйственных животных

Подбор животных аналогов

Ыетод криоконсервации семени кролика

Разработка новой среды

Короектировка времени от овуляции до введения крио-консервированного семени

Действие различных факторов на криоконсервации семени

Травма

Аута

■низация

Методы выявления аутоиммунности (ж-гел, Э-РФЛ, ИФА)

I I

Показатели семени: объем, подвижность, концентрация, сохранность акросом

Результат осеменения: сукрольность, окрол (2), число крольчат на самку (X)

Сравнительные оценки качества семени до к после криоконсервации

Подвижность, X

Сохранность а-фосом, X

Прижизненное окрашивание по Морозову, X

В эякулятах

1 1

Бык Кролик

В эпидиди-мальном семени -1-

Баран

Зубр

Свя8Ь между качеством семени, спонтанной аутоиммунностью результатом осеменения

- б -

Использовали эякуляты с подвижностью живчиков и сохранностью акросом не менее 60Х. концентрация семенных клеток была не менее 100-140 млн/мл.

Разбавляли эякуляты до 14-20 шш живчиков в дозе. Прототипом криопротектора послужила среда БЭКС (Милованов В.К. и др., 1982).

В качестве антиоксиданта использовали гоиогенат моркови б глицерине в соотношении 1:1 (Зайцев В.В., 1939).

Разбавленное семя выдерживали при температуре +4°С для экзи-либрации, замораживали в гранулах по 0,2 мл в течение 5 мин на пластинах сухого льда. Гранулу помещали в жидкий азот и хранили до использования. Всего заготовили 1000 доэ семени пригодного для искусственного осеменения.

Семя оттаивали в стерильных стеклянных флаконах содержащих 0,3 мл 2,91 цитрата натрия на водяной Оане при +40°С, затем оценивали по подвижности, сохранности акросом как описано у Соколовской И.И. и др. (1981), а также по количеству живых и мертвых кивчиков (Морозов И.О.. 1928).

Самок в охоте выбирали визуально. Животных находящихся в начале и конце охоты (вульва розовая и темно-фиолетовая соответственно) иэ опыта исключали.

Овуляцию вызывали с помощью хорионического гонадотропина (ХГЧ) согласно рекомендациям НИИПЗиК, или используя ваээктомиро-ваниых самцов.

Самок осеменяли однократно вводя семя в глубокий участок влагалища специально изогнутым стеклянным шприцем-катетером (Соколовская И.И., Кононов В.П., 1971). В контроле самок осеменяли свежеразбавленным семенем.

Результат осеменения учитывали по числу окропившихся самок и ковсролденных крольчат в гнезде.

Всего осеменили 148 самок, из них 134 - криоконсервированным семенем.

Нтупивзиця кро-яихав. В опытах использовали по 4 самца

кроликов породы иампань (аналогов по возрасту и характеристикам эякулята). Экспериментальную аутоиммунность к живчикам вызывали иммунизацией экстрактом аутологичных живчиков (ЗЯ). В другой группе в качестве антигена использовали аллогенные секреты доба-

вочных половых салеа о? вазэктомнрованного самца (СИПЕ). Травму иоделнрсвалк точечный проколом левого семенника инъекционной иглой N 15 (Авилов A.M., 1084).

Весь антигенный материал центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 минут, оценивали по количеству белка спектрофотсметри-чески, доводили до 10 иг/мл и хранили до использования при -20°С.

Иммунизировали самцов, вводя по 0.3 мл СДЕШ или 32 внутримышечно с полным адьюваатои 4рейнда однократно (Harlcw a Lane, 1988), затем дваады с трехдневным интервалом по 0.1 мл антигена в ноныжтиву глаза (Зубзашкй Н.П., 1860).

йжудпяягэсвиэ иягахя. Периферическую кровь у самцов брали из ушной вены перед и после экспериментов. Лкгфоциты выделяли как списано у Н.И.Соколовской и др.(1985).

Клеточный иммунный ответ (популяции Т-лимфоцитов) определяли методами спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (РОЛ-Э) или собственными яивчиками подопытного животного (РФЛ-Ж).

Гуморальный иммунный ответ (антитела к поверхностным антиге-Еsa гивчнков) определяли в микрореакции РИМЯ (Соколовская И.И. и др. 1990), а таете в прямом и непрямом твердофазном иммунофер-иентнои анализе (ИФА).

СЗрзбскзз даяша.' Все вычисления и статистическую обработку данных проводили в коша'отерной программе Statgraphíes с использованием t-критерия Стьвдента для целых чисел и долей).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Î. М^исяоасзрзгцяя семанн кролпеа

Предварительный анализ нативного семени самцов кроликов показал, что аквотные находятся в нормальном физиологическом состоянии и их эякуляты вполне пригодны для экспериментов по криоконсервации половых клеток.

Щ)И разработке еового протектора руководствовались теорией разбавления семени, сформулированной В.К.Мило5аловым (1952). Испытывали протекторы, предложенные в разное время для разбавления н замораживания семени сельскохозяйственных животных: ВАЧ1АСТ0 (Шловаяов В.К. а др., 1981) - для семени барана; Гликокол-

нитратный (Соколовская И.К., 1957) - для семени кролика: БЗКС (Милованов В.К. и др., 1984) - для семени быка.

Опыты были проведены при одной и той же (1:3) степени разбавления (таблица 1).

Таблица 1

Влияние различных протекторов на качество семени кроликов до и после замораживания

Протекторы Подвижных живчиков в семени, 2 Сохранность акроссм живчиксе

свежевзятом оттаянном

Всего | ив !гих (X) ПОДСЧИТ.1 с цолзй живчиков | акресгмсй

При взятии После разб. Перед замор. Сразу Через 2 Ч

ВАШАСТО 76 40 40. 0 0 600 £1,0+1,65

Гликокол- 80 36 38 С 0 6СО 31,33+1,89

цитратный •

БЭКС 80 79 79 23 17 £00 22 3-'-1 .Уб""1

""^0.001.

Лучшую выживаемость семени крогнглг ¿г-.з.гллс гУ: з сред?; БЭКС содержащей сахара-ра$и:-:ада (ГОСТ 22-75) - 101-2 г. легкой соли НагСа-ЭЛТА - 5.0 г; желтка куриного «йа. - 50.0 -а. глицерина (ГОСТ 62-59) - 75 ил; зхикохро^а - 5.0 ггкм^-ллгаз и стрептомицина по 300000 ед; воды дистидикрозег-ой - до 1 л.

После разбавления и зквилибрации подзнчиостъ оттаянного семени в это« разбавителе составила 23%, а акроссмы сохранились почти у 40Х живчиков. Остальные испытуемые протекторы отрицательно влияли на жизнеспособность живчиков уже сразу после разбавления зякулятов, так как гликокол-цитратный разбавитель рассчитан на хранение семени кролика при температуре не ниже -15°С, а среда ЗАДАСТО сбалансирована для живчиков барана.

Эти данные позволили использовать протектор БЭКС в качестве основного. В дальнейших опытах испытывали различные г.арианты степени разбавлена семени (таблица 2).

Из таблицы 2 видно, что подвижность живчиков и сохрач:-,". .ь их лк;>ссм не зависела от степени разбавления свежевзятогс семени, тогда как после криоконсервации эти показатели уменыгллксь по мс-'„е увеличения степени разбавления эякулята. Лучшие результаты получены при соотношении сечени и среды равном 1:3, когда полвиж-

ность после оттаивания практически не менялась (232) в течение 2-х часов.

Таблица 2

Качественные показатели семени кроликов в зависимости от степени разбавления эякулятов

Степень разбавления семени Подвижных живчиков, 2 Еивчиков с целой акросомой, 2

в свеж.семени в оттаянном в свела-взятом семени в оттаянном семени

После разб. Перед замор. Сразу Через • 2 ч

4 80 80 23 23 81,9+2,57 51.7+2,04

8 80 80 18 1? 81,9+2,57 44,3+2,02 16 80 80 15 13 81.9-2,57 43.0+2,03

*} Р< 0,05.

В следующем эксперименте раьОавленное в 4 раза семя поделили на четыре равные порции. Каждую из них заморозили отдельно после различных режимов эквилибрации. Наибольшее количество живчиков с целыми акросомами было после 4-часового режима эквилибрации (23Х), когда семя в течение 2 часов находилось при комнатной температуре, а ватем 2 часа - при +4°С.

Учитывая вышеизложенное. попытались выяснить действие различных этапов криоконсервации на качество семени кроликов. Для этого провели серию опытов (п-15), где изучали подеижкость и сохранность акросом после каждого этапа криоконсервации. Установили, что потери полноценных живчиков после эквилибрации составили всего 102, а после оттаивания глубокозаыороженного семени - 322 (Р<0,001).

Известно, что для повышения устойчивости мембран живчиков традиционно используют фосфолипиды (Милованов В.К., Селиванова О., 1932), в частности выделенные из яичного желтка.

Для выяснения оптимального количества яичного желтка в состав среды его вводили в различных концентрациях (таблица 3).

По мере нарастания в среде концентрации желтка, улучшается подвижность живчиков и сохранность их акросом в оттаянном семени. Увеличение концентрации желтка до 202 повысило подвижность живчиков в 2 раза, а сохранность кх акросом возросла ка статистически достоверную величину (Р<0.001).

Таблица 3

Влияние различных концентраций яичного желтка ка качество оттаянного семени кроликов

Желтка в среде, » Подвижных живчиков б семени, м Сохранность акросом живчиков

свежевзятом оттаянном

Всего подсчит. живчиков ИЗ них (X) с целой акрссомой

После разбав. Перед замор. Сразу Через 2 ч

5 83 76 10 5 600 29,5+1,86

10 83 80 12 3 600 35,5+1,95

15 83 80 12 6 600 40.3+2,00.мм

20 81 78 20 15 600 45,5+2,03

"**}Р<0,001.

Поскольку отрицательнк>: осмотических явлений при разбавлении семени кролика средой БЗКС не наблюдалось, концентрацию сахара-рафинада оставили без изменения - 101,2г/л с допустимыми отклонениями в пределах 0,1 г/л.

Для уменьшения потерь ионов Ка+, К+, Са+ и Р под влиянием низких тешератур и повышения криоустойчизости гкивчиков в состав среды вводили СаНаг-ЗДТА.

Установили, что оптимум натрий-кальциевой комплексной соли ЭЛТА довольно четко ограничен и составляет 7,0 г/л при допуске вариаций не более 0,05 г/л. Изменений концентрации ЭДТА на 0,5 г/л в ту или другую сторону резко ухудшало качество семени. Особенно эти колебания отражались на сохранности акросом после оттаивания.

Сравнительно с другими природными антиоксидантами (токоферолом и эхинохрбмом), лучше действовала на семя надссадочная лил кость гомогената моркови в глицерине (1:1). Семя, замороженное и оттаянное в протекторе, содержащем этот антиокскдант, имело лучшую подвижность как перед замораживанием после эквилибрации, так и после оттаивания. Сохранность акросом живчиков была выше на статистически достоверную величину (Р<0.001) и составила 54%. Это согласуется с данными других авторов, использовавших растительные антиоксиданты при криоконсервации семени барана (Лизунков А.Ф., 1989; Зайцез В.В., 1989).

Наряду с другими криоконсервантаыи, такими как сахар и желток куриного яйца, в состав криопротектора вводили глицерин, как

вещество способное увеличивать морозостойкость живых биологически объектов включая семенные клетки (Есдд* н др., 1855). На основе анализа литературных данных о влиянии глицерина на живчики кролзка (Hanala А.& Nagase Н. 1980), ограничились испытанием концентраций глицерина в пределах от i до BZ.

Данные опыта Показали, что сохранность акроссм живчиков в средах с таким содержанием глицерина остается бег изменения в течение двух часов после отт-зявания.

Таким образом, мы установили следующее оптимальное соотношение компонентов среды (рН-6,8) для криоконсервацки семени кролика:

1. Сахар рафинад (ГССГ-22-78) - 101,2 г

2. Еелтск куриного нйца - 200.0 од

3. Комплексная соль КагСа-ЗДТА - 7,0 г

4. Гшогена? глицерина с морковью (1:1) - 40,0 ил

5. Глицерин (Г0СТ-62-59) - 40,0 мл

6. Вода бидистиллироваяная - 1000 ид

Среда атого состава кспольвовааась во всех дальнейших опытах по кркокоясервации семени кролика.

2. Резухь-аsu осгжеаения крольчих . кряскеоеоргэфовааимы сомовом

Для определения оплодотворяющей способности живчиков, самок осеыенялн в свежевэятьм разбавленных, и ваморохенно-оттаянным сеыенеи. ........

Результативность осеменения крольчих оттаянным семенем составила 60,4Z при"среднем выходе 4.0 крольчат на сосу с варьированием в пределах от 1 до 10. Таким образом, использование предложенного криопротектора позволяет получить процент сукроль-востн практически вдвое больший чем в аналогичных опытах других азтороз - 33,91 с рангом от 4 до 10 (Dubiel А., 1&ьб).

В природе у крольчих овуляция происходит, не спонтанно, а провоцируется коитусом. Поэтому при искусственном осеменении требуется внешний стимул вызывающий овуляцию. Факторами стимула-рушими выход яйцеклетки могут быть спаривание с вазэктомироваа-

- и -

кш самцом, введение гонадотропных препаратов и пр. Подготовка вазэктомированных самцов сопряжена с определенными трудностями, а их большое количество в стаде связано с непроизводительными затратами. Поэтому необходимо увеличить нагрузку на одного ваззк-т-млроБанного самца путем сокращения времени от овуляции до сведения семени, либо применять гормональные препарата.

Сроки осеменения самок (сразу или спустя 5 часов) поело стимуляции вазэктомированными сачцами не повлияли на количество окролившихся самок (53 и 562 соответственно) и на число крольчат (5 и 6) в гнезде. Увеличение срока от стимуляции ХГЧ до введения семени на 5 часов также не повлияло на разнер гнезда (по 4 крольчонка). а его влияние на результаты окрола (58,3 и 71,4Х) было статистически недостоверным.

Средние показатели окролов поело пртаенешщ двух способов вызывания овуляции показаны в таблице 4.

Таблица 4

Влияние способов вызывания овуляции у крольчих на результативность осеменения

Способы Осеменено сачок Получено !фодьчат

Всего из них окрол. % окрола всего на окроливпуюся СГ-'ОСу

Вазэктомированньгй самец 49 27 55,0+5,1 140 5,2+0,6

Хоркокический гонад отропин 26 17 65,0+6,6 63 4,0+0,7

Из таблицы видно, что эффективность стимуляции вазэктомиро-вачт.-м самцом и ХГЧ практически равноценна. Если ¡использование вазэктомированного самца позволило увеличить выход крольчат на сачку. то применение ХГЧ - повысить процент окрола. При этом увеличение срока между стимуляцией и осеменением, т.е. уменьшение срока между овуляцией и введение« семени до Б часов но влияло на результаты осеменением криоконсерзировашшм семенем.

- 12 -

3. разлг.-шшх фахтороз на характернасекогш

с результата освмздошся

В производственных условиях довольно часты случаи травмирования половых органов производителей. Так например, в 1988 г из 191 быка ЦСИО, 312 животных перенесли заболевания органов рззцно-кения.

Налг была сделана попытка выяснить влияние травш семеннике на технологические свойства семени, количественные к качественные характеристики свегевзятого и зачсрохеняо-оттаянного семени, $ тагащ действие нарушения целостности гемато тестикулярного барьера на оплодотЕорящую способность криоконсервкроЕанного семени.

Точечный прокол семенника оказал существенное влияние на все показатели семени. Наиболее значительные изменения зафиксировала в первый месяц после транш. Так, через 15 суток после проколу семенника объеи эякулята и концентрация живчиков в нем снизились на 422,' а сохранность акрсссм - на 15Х. Общее число живчиков £ эякуляте и их подвижность сократилось в три раза.

Однако уяе через £0 суток зги показатели приблизились к контрольным величинам (до опыта), а через 45 суток практически вр отличались от них. Эхо объясняется тек, что сперматогенез у лшвотных продолжается в течение 45-60 суток. За это время происходит частичное и/или полное восстановление функций семенника.

Количество окроливсихся самок после осеменения криоконсерви-рованныы семенем от травмированных хулотных сократилось на 19Х по сравнения с контролем (41 и 601 соответственно). Однако выхол крольчат на сажу до опыта и после него практически не менялся (5,3 и 5,0). Вероятно это связано с ранней эмбриональной смертностью после оплодотворения неполноценными глвчкками.

ЕзГ^лхкз раз®гашх гаг-лорол па ¡ммунный огьэт м харапторзюшну сошит

Клеточный и гуморальный имнунный ответ организма самцов ¡, к после травмы семенника -изучали в реакциях неспецифического специфического розеткофориирэвания и с помогаю икмунсфзрментно! анализа (таблица 5).

Таблица б

действие односторонней травмы семенника на иммунный ответ организма самцов

Группы РМ-Н (X) РМ-Э (X) ИФА (ед. погл.)

Контроль (до опыта)

Опыт

Разница

12.3+0,72 6,25+0,5 28.0+1,11 31,0 +1,18 . + 15,7""* + 24,75"''

263+12

306+14 . + 33*

,)Р<0,05; "",)Р<0.001.

Как видно из таблицы 5. травма семенника вызывала значительное увеличение содержания Т-лимфоцитов в крови самцов связанное с активацией клеточного звена ¡к иммунной системы. Это подтверждают реакции специфического (РФЛ-3) и неспецифического розеткофорыиро-вания (РВЛ-Э). Иммуноферменткый анализ показал достоверное (Р<0.05) наличие спермоантител к поверхностным антигенам яивчиков в крови травмкровангшх самцов.

Несмотря на то, что количественные и качественные показатели семени через 45 суток после травмы семенника практически вернулись к норме, иммунный ответ организма самцов оставался высоким. Таким образом снижение результативности осеменения самок криокснсервированным семенем было вызвано иммунными причинами.

Так как эякулят состой^ т двух основных компонентов. плазмы семени к живчиков, ваяно знать который из них больше влияет на воспроизведение. Подобные эксперименты проводили ранее, но с дальнейшим изучением све.т.еваятого семени (Соколовская И.И. и др., 1682; Абилов А.И., 1984).

В таблице б показано влияние иммунизации Ш и СДГИ на иммунный ответ организма самцов кроликов. Видно, что иммунизация самцов антигенами обоих групп выбывает значительную активацию клеточного звена их иммунной системы (РМ-З и РЭД-Э). Однако, циркулирующие антитела достоверно выявлены (ИФА) только в крови самцоз иммунизированных СДПН, что связано с большей иммуноген-ностью антигенов этого происхождения сравнительно о собственными антигенами Чичиков.

- и -

Таблица 6

Действие иммунизации самцов 32 и СДПХ на иммунный ответ их организма

Группы РОД-K (X) РФЛ-Э (2) KiA (ед погл.)

до после Раз- до после Раз- после Раз-

им. иммун ность им. иммун ность иммун. ность

263 +12

Контроль 0,8 12,2 +2.4 8 12,2 +4,2

35 8,8 20,7 +16,7*" 10 38,5 +28,5*" 292 +29*

+13

СИШ 10,3 16,7 +6,4*** 7.1 25,2 +18.1"* 338 +65"

+25

в)Р<0.05; **)Р<0,01: *"")Р<0.001.

Наличие в крови самцов антител к компонентам собственного эякулята приводит к значительному снижению качества семени, и макет служить причиной выбраковки свежевзягах зякулягов высокоценных производителей (Абилов А.И., 1091). Выяснено, что антитела к антигенам тестакулярно-эпидидюшьного происхождения, но не антигенам СДПХ. вызывают эмбриональную смертность на предимлачта-цконной стадии (Кочетков A.A., 1QS8).

В таблице 7 показаны качественные и количественные характеристики сведевзятого и криоконсервированного семени полученного от самцов иммунизированных различными компонента«« эякулята.

Таблица 7

Действие иммунизации самцов на характеристики эякулированного и и криоконсервированного семени

Группы Объем, ил Концентрация, ШШ/ЦД Подвижность, Z Целых акросом, Z

до замораживал. после оттайв. до замо-раадвач. после оттаив.

Контроль Кон

0.61+0.05 281.5+22.6 71.0+2.0 18.0*2.0 82.0*2.1 57.8+2.0 онтроль

NaCl 0.61+0.04 287.6+48.8 73.0*2.0 21.0+1.0 78.4+1.8 52.2+2.8

***

32 0.68+0.10 239.6+31.7 60.0+3.0 11,0+1.0 71.5+2.7 42.0+2.2

сада 0.6S+0.09 235.5+25.0 бз.о+з.о 14.0+1.0 67.5+2.5 40.6+2.2

***)Р<0,001.

Ив таблицы 7 видно, что з обоих коитролпх качественные г количественные характеристики семеня были одгааковыми. йммунива-цкя СЩШ достоверно ке повлияла на качественные показатели еяку-лятов, хотя иммунный ответ организма саыюз па введение данногс антигена был значительным. Иммунизация S3 приводила к значительному (Р<0,001) сниженкп подвижности живчиков в сведевзятсг/ семени, а после процедуры вамораживання-оттаивания эта тенденция сохранялась.

После осеменения крольчих кркскоксервироваяным семенем от самцов, иммунизированных а?, количество окрасившихся сгнок достоверно (Р<0,05) снизилось до 18Х по сравнением с обоими гантролями (64.5 и 62.0Z). Иммунизащтя самцов СДГЕ вначительно не повлияла на результативность осеменения (50Z окрола).

Таким образом, снижение результатов воспроизведения под действием антител к антигенам живчиков, ранее выявленное; для све-жевзятого семени, сохраняется и после кркококсервацин эякулятов.

Б. Аутодммукпсстй б^о^прокзаодЕкыжЗ п рззухьгаззигкхггь осешшгпкп

Известно, что каждый бык ПСИО имеет высокуо племашгуп ценность. и поэтому важно своевременно выяснить нэ является ли он носителем аутоантител к собственнш ккзчккаи.

С этой целью 200 быков ЦСИО исследовали в гуморальной реакции иммобилизации живчиков в аутосыворотке !фовн. Полученные данные сопоставили с результатами стельности коров. У 22,8% обследованных производителей была выявлена аутоиммунЕость, но высокий титр антител (8-16) к собственным живчикам обнаружили лишь у 14,25% быков.

Подвижность свежевзятнх живчиков у быкоз, проявлгяпгщх ауто-юшунность в титрах 4-8, но отличалась от таковой (в среднем 80Z) у производителей без спермоантител в 1фОви. Общее количество живчиков в эякулятах ау?о;м^унгак быков было на 400 шш меньсэ, чем у нормальных животных. Семя, полученное от таких производителей хуже переносило технологические этапы криоконссрвацил, что выразилось в снижении выхода доз семени пригодного к использование (рисунок 1).

Рисупок 1. Связь аутоим.чунностн с устойчивостью ЖИИЧПКОК ( криоконссрштни.

Рисунок 2. Влияние аутои.чмунностн быкои О'ПМЖ) на pr.¡v:;¡,i;i:

осомгнсння корон,

Аутоиммунность на выявлена

ВСтжли стшльмыыи □ Прохолост

Аутоиммунность выявлена (РИМЖ, РОЛ-Ж)

Q Стали стельными □ Прохолост

Рисунок 3. Влияние ауюиммунности Пыков на 1ффективность осеменения короп.

Из рисунка 2 видео, что, даже после жесткой выбраковки эяку-лятов по традиционный параметрам, процент стельности снижается (Р<0,С5) при осеменении криоконсервированным семенем бькоз ЦСИО, проявляло« аутоиммунность в различных титрах.

Данные по выявлении сенсибилизированных Т-лимфоцитов в клеточных реакциях РФЛ-Э и РЬЛ-Ж согласуются с титрами спермоим-мобклизируших антител, выявленных з гуморальной реакций РИМ£. Применение оттаянного семени быков, одновременно имею®« высокие (4-16) титры сперыоаятител и значительное (6-122) количество Т-лимфоцитов, приводит к снижения (Р<0,001) результативности осеменения - до 552 стельных коров сравнительно с 752 е контроле (рисунок 3).

8. Акрссхошгческкй меток сизяки качества семеян

Наряду с традиционными методами оценки криоконсервированного семени по подвижности и соотношению живых и мертвых живчиков (Изрозов В.А.. 1938) использовали акросколический метод описанный И.й. Соколовской и др. (1081). Этот метод имеет ряд преимуществ, поскольку позволяет одновременно определять не только состояние акросси, но н подвижность живчиков.

Данные опыта показали, что подвижность семени кроликов после замораживания снижается почти до критической для искусственного осеменения точки. Потеря двигательной функции живчиков составляет 802. В то же время разруаение акросои половых клеток находились в пределах 25-302.

Хотя результаты полученные разными методами практически совпадают, однако преимущества гироскопического метода заключаются в легкости исполнения и меньших затратах времени.

Результаты применения акроскопического метода для анализа подвижных хизчкков кз свехевзятого и криоконсервированкого семени различных видов животных приведены в таблице 8.

Из таблицы 8 видно, что подвижные хивчики различны/, видов животных значительно отличатся по состояний акроссм. Так, если в свежевзятом и оттаянном семени быка подвижные живчики с разрушенной акросомой составляет 22, то в семени барана их количество наиболее высокое - 7-82. Среди подвихных живчиков кролика пра-г:/-

чески отсутствуют клетки с разрушенными акроссыами (О,IX) как в свежевзятоы, так и оттаянном семени.

Таблица 8

Сохранность акросом подвижных живчиков у разных видов животных до и после криоконсервации семени

Животные Число зякулятов Число исследованных подвижных живчиков

Всего Из них с поврежденной акросоыой

число { Z

Бык

Баран

Кролик

Бык

Баран

Кролик

49 б 10

1? 11 10

Свежевзятое семя 9800 1S5

1200 81 2000 8

Оттаянное семя 3600 82

2200 182 2000 2

2,0+0,01

6.75+0.26

0,4+0,001

2.3+0.03 8,3*0,17 0,1+0,003

Большие межвидовые колебания (в пределах 5-15Х) количества подвижных живчиков с поврежденными акросоиами могут гнужить причиной несоответствия данных по подвижности живчиков и результативности осеменения. Это предположение мы проверили в опыте с осеменением крольчих криоконсерзированныа семенем содержавши живчики с различной подвижностью, но сходным состоянием акросом.

Выяснено, что подвижность живчиков не влияла на сукрольность и число крольчат в гнезде. Среди крольчих, осемененных семенем а единично-поступательной подвижностью живчиков (группа I), но не разрушенными (72.0Z) акросоыами, окролклось 73,31 самок. При использовании оттаянного семени с подвижностью аивчикоз 20-Э0Х и сохранностью акросом 65,51 (группа III) количество окролившихся животных снизилось на 16Z и составило 57Z. Примерно разный (73,3 и 75Z соответственно) оказалось число окролнввнхся самок в группах I и II, осемененных семенем с разной подвижностью (Б и 10-15Z), но со сходным количеством целых акросом (72 и 70Z). Разница по результативности осеменения крольчих между контролем и опытными группами I и II составила 25-28Z, а между III группой и контролем - 43%.

Результаты опыта доказывают, что состояние акросом более объективный показатель качества сяиени, чем подвижность живчиков.

В связи с этим изучали результативность искусственного осеменения крольчих в зависимости от состояния акросом живчиков в заморохен-но-оттаянном семени (таблица 9).

Таблица 9

Результат искусственного осеменения самок в зависимости от состояния а'фосом живчиков

Группы Целых акросом. г Подвижность, г Осеменено самок Родилось крольчат

всего ¡окролилось, 2 всего на самку

I 41-60 II 61-75 Контооль 85-90 25 15 80 9 30,0+3,4"* 14 ЭО.О+б.?*" 14 100.0 10 62 117 3.3 5.2 8.4

"в)Р<0,001

Й8 таблица 9 видно, что, при малом количестве в семени живчиков с целой акросоиой» снижается число сукрольных самок и выход крольчат ва самку. В первой группе, где сохранность акросом после криоконсервации живчиков была минимальной, окролилось 302 осемененных саяск. Несмотря на то, что подвижность семени в первой группе была значительно выше, чем во второй, где животных осеменяли семенем с высоким содержанием целых акросом (61-752), количество окролов здесь было в 3 раза меньше (Р<0,001), а число крольчат ва самку меньше ва 602. Результативность осеменения во II группе была сравнимой с контролем, когда крольчих осеменяли свежеразбавленным семенем с 85-902 целых акросом (1002 окролов).

7. Качество криоковсервированвого эпщудамального семени исчззавдпс датах кивояшх н его использование

В последние годы назрела - необходимость создания криобанка семени исчезающих видов диких животных для сохранения генофонда редких и исчезающих видов, а также отдаленной гибридизации диких копытных с домашними животными, в частности зубров с крупным рогатый скотом.

В связи с этим встала задача изучить эффективность различных способов получения семени зубров. На первом этапе, контролируя подвижность живчиков, как главный критерий качества семени использовали состояние их акросом (таблица 10).

Таблица 10

Характеристика криоконсервированного семени вубра полученного различными способами

Способы получения семени Подвижносг- живчиков, X Сохранность акросом, X

Свеже-выделенных После криоконсер. Свехе-выделенных После криоконсерв.

1 мес. 3 года 1 мес. 3 года

На месте отстрела 60,0 30,0 30,0 80,0 64,5 55,5

В лаборатории 70,0 40,0 40,0 82,6 67,5 64,0

Электроэякуляция 20,0 10,0 10,0

Из таблицы 10 видно, что, пошшо технических трудностей получения семени от зубров электроэякуляцией (предварительный отлов самцов, использование релаксантов и пр.), такое семя оказалась непригодным для использования уже по подвияности живчиков. Выделенное из эпидидимиса семя не утратило своей биологической полноценности, даже при длительном сроке хранения после криокон-серзации подвижность живчиков и сохранность их акросом уменьшились незначительно. Лучшее (статистически недостоверно) качество эпидидимального семени было достигнуто при проведении процедуры замораживания в лабораторных условиях.

После трехлетнего хранения семенем зубра осеменили 8 коров, . в контроле коров осеменяли замороженно-оттаянным семенен чистопородных быков (таблица 11).

Таблица 11

Результат осеменения коров семенем зубра

Группы Осеменено коров Родилось телят Продолжительность стельности, сутки

Всего X

Контрольная 10 в 60,0 285 +5

Опытная 8 4 50.0 26Й.5+5

Результативность осеменения короз семенеи зубра оказалась несколько (недостоверно) нижа, чей семенем быков в контроле.

- ^ -

Обращает на себя внииаапэ более короткий срок плсдонсге:шь Г£йрадов по сразненив с чнстопорсдэ&ш Ыасса гибридных

тегочек щи роаденин ва 9 кг прешаала массу уела чвстопорсдкъЕ сверстниц (43 а 34 кг соответственно).

1. Разработан практически приемлемей метод криоконссрвгцни сеькгзз кроликов погволягазй подучить 60,42 окролов пра среднем раваере гнезда 4-5 крольчат на самку.

2. Увеличение вре^ни ыезду сткыудга овудягми и осеменением крольчих на 5 часов позволяет вффектнвзее использовать ваззктоии-роваяного самца, в не влияет на сет/." тага осеыейэння крольчих криокоЕсерзироЕанныу сеыенеа (531 окролов при 56% в контроле).

3. Аутозшыунизацяя сашзрв антигенами живчиков н травна семзнника приводят к ухудшения качества не только езегевзятого, во в кряоконсервироЕанвого семени кроликов: число окролявшихся саззк снккеется на 46,52 (Р<0.05) к 102 соответственно. Иыууниза-даа савдзв СШШ Ее влияет на результативность осеменения крнокон-сервированныы семенем.

4. Подвнкзсстъ. яивчиков после оттаязаакя в меньшей степенк связана с результативностью осеменения, чем состояние их акросоа. Ого позволяет считать гироскопический метод более информативным для сценки качества не только свеаеьзятого, но и криокоЕсервиро-ванного семени.

5. Качественные характеристики крнаконсервированного эпиди-дкиального семени зубров СйО-401 подвижных яивчиков с 55-67% целыми вкросомами) позволяй; использовать его при искусственно?.' осеменении коров с хереггки (60% о-гела) результатами.

практические шшашт

1. Разработанный «етод криоконезрвацни со^кя крелкка, екшхэзщй еовый состав протектора, свотоби разбавлен;«, гкзхлиб-рщик, крёоконсервации н оценки качества сеиьзн, а сроки

осеменения крольчих, рекомендуется к ксяагьгог&яакз'с в срактккг кролиководства и лабораторных нсследогдям;/..

2. Метод криоконсервирования эпидидимального семени рекомендуется к использованию для сохранения генофонда исчезающих видов' диких животных, а также для получения межвидовых гибридов зубров с крупным рогатым скосом.

СПИСОК СПУБЛГКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кочетков A.A.. Сскологс'сзя И.И. Комбарова H.A. Поверх-костные антигены спермиев в раннем эмбриогенезе/ 4-й Всесоюзный симпозиум по иммунологии репродукции с межд.уч.-Киев, 24-26 ок?. 19С-0 Г. - С. 32

2. Соколовская И.И.. Абилов А.И., Кочетков A.A., Таг Т.А., Комбарова H.A.. Стоянов В.К., Турбин В.Ф. Методические рекомендации по выявлению, устранению и предотвращению лvтоиммунисюти У быков-производителей/ ВИЗ.- Дубровицы,- 1690.- xi с.

3. Эрнст Л.К., Абилов A.A., Сипко Т.П., Комбарова H.A.. Шумев A.B. Межвидовая гибридизация зубра с крупным рогатым скотом. Молочное и мясное скотоводство//- 1993,- N 4.- С. 19-21.

4. Koroarova N.A., Kochetkov A., Sckolovsknya l.i. n>-prcpertlts of antlsera to bull and rabbit ejaculates component;-.' - J.lrnunol. and patology.- 1992. - N 12,2. -P.8.

5. Kcchetkov A., Kombarova N. A. . Sokolovskaya I.I. F.vto:.-., lnfluenslnjj on bull and rabbit sporms In vitro capncltatlor. (CCA?).// J. Iimunol. and patology.,- 1902. - N 12,2. -P.8.