Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Копеечники (Hedysarum L.) Нижнего Поволжья

ВАК РФ 03.02.01, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Копеечники (Hedysarum L.) Нижнего Поволжья"

На правах рукописи

Супрун Наталья Александровна

копеечники (яяягеляс/мь.) нижнего поволжья: изменчивость и систематика

Специальность 03.02.01 - ботаника

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва-2014 1 7 ДПР 2014

005547247

005547247

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина Российской академии науки (ГБС РАН)

Научный руководитель: доктор биологических наук,

Шанцер Иван Алексеевич

Официальные оппоненты: Соколов Дмитрий Дмитриевич

доктор биологических наук, профессор. Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, кафедра высших растений

Сытин Андрей Кириллович

доктор биологических наук. Ботанический институт им. В.Л. Комарова РАН, Гербарий высших растений

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный педагогический университет».

Защита диссертации состоится 29 мая 2014 г. в 14.00 на заседании диссертационного совета Д 002.028.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина Российской академии наук в конференц-зале лабораторного корпуса по адресу: 127276, г. Москва, ул. Ботаническая, д. 4. тел./факс 8(499)977-91-72

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Главного ботанического сада им. Н.В. Цицина Российской академии наук и на сайте www.gbsad.ru.

Автореферат разослан « ¿?3 » 2014 г. и размещен на

сайтах www.gijsad.ru и www.vak.ed.gov.ru/

Ученый секретарь

диссертационного совета /О /ХрВиноградова Юлия Константиновна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Копеечники (Hedysarum L.) - одна из весьма трудных в систематическом отношении групп в семействе бобовых (Fabaceae). Причиной тому является значительная морфологическая изменчивость многих видов и наличие морфологически переходных форм. Разделение на виды порой бывает затруднено из-за отсутствия четких диагностических морфологических признаков. Многие авторы расходятся в отношении систематического состава рода для территории юга Европейской части России. Последняя ревизия рода в полном объеме была предпринята Б.А. Федченко (1902), ревизию внутриродовой систематики, не затронувшую видовой состав секций, позднее опубликовали В. Choi и Н. Ohashi (2003). В связи с этим возникает необходимость в изучении внутривидовой изменчивости на основании анализа всех признаков, использовавшихся систематиками, изучавшими виды с территории, как юга европейской части России, так и Волгоградской области.

Использование генетических маркеров часто оказывается решающим в таких таксономических исследованиях. Только на основе сопоставления данных молекулярно-генетического анализа и данных морфологии можно получить наиболее объективное представление о таксономических границах видов, а также решить проблемы, связанные с внутривидовой изменчивостью и гибридизацией.

Для прояснения систематического статуса близкородственных видов и разграничения морфологически сходных видов рода Hedysarum, в данной работе были использованы морфологические, ценопопуляционные и молекулярно-генетические методы (ISSR).

В силу ряда причин (произрастание приурочено к выходам мела или известняка, лекарственное сырье, декоративность и т. д.) многие копеечники становятся редкими и нуждаются в охране, многие из них занесены в Российскую и региональные Красные книги. Однако какие-либо специальные меры охраны этих видов отсутствуют даже на охраняемых территориях. Для сохранения этих редких видов необходимо изучение состояния их генофонда, динамики популяций и биологии размножения, чему и посвящена настоящая диссертация.

Цель исследования

Цель настоящей работы - установление видового состава, сравнительное изучение внутри- и межпопуляционной изменчивости и структуры популяций видов рода Hedysarum секции Multicaulia в Нижнем Поволжье и на сопредельных территориях юга России и Украины.

Задачи исследования

1. Оценить современное состояние и особенности онтогенетической структуры популяций копеечников в их естественных местообитаниях на территории Волгоградской области.

2. Провести анализ генетического разнообразия видов рода Hedysarum L. по данным изменчивости молекулярно-генетических маркеров.

3. Уточнить границы таксонов копеечников юго-востока Европейской России по данным изменчивости морфологических признаков и молекулярно-генетических маркеров.

Научная новизна работы

Впервые изучены структура и динамика популяций Н. grandiflorum и Н. сгеШсеит для Волгоградской области. Определены типы онтогенетических спектров популяций, их возрастность и жизненность. Впервые с использованием молекулярно-генетических маркеров изучена генетическая структура популяций у Н. grandiflorum и близких видов подсекции БиЬасаиПа. На основе сравнения результатов морфологического и молекулярного анализов уточнены границы, ранг и распространение ряда близкородственных видов Нес]узагит.

Теоретическая значимость

Полученные результаты используются при подготовке обработки рода Нейуяагит для «Флоры Нижнего Поволжья», могут быть использованы при подготовке и составлении флористических сводок и определителей растений в смежных регионах, а также при подготовке таксономической ревизии рода.

Материалы диссертации вносят вклад в понимание биологии, популяци-онной структуры и систематики изученных растений. Результаты и выводы исследований могут быть использованы для решения проблем с включением видов из таксономически сложных групп растений в Российскую и региональные Красные книги и оптимизацию стратегии сохранения генетического разнообразия растений на популяционном уровне на юго-востоке европейской части России и в других регионах страны.

Практическая значимость

Полученные результаты могут быть востребованы при планировании рационального использования степных экосистем и сети особо охраняемых природных территорий на юге европейской части России. Материалы исследования используются на практических занятиях и при проведении полевых практик студентов в рамках учебных курсов «Экология и география растений» и «Ботаника» в Волгоградском государственном социально-педагогическом университете. Научные выводы работы и рекомендации непосредственно используются при проведении мониторинга редких видов рода Нейуъагит, занесенных в Красную книгу Волгоградской области. На основе результатов проведенного исследования Н. исгатсит и Н. ЫеЬеШети были исключены из списка редких и нуждающихся в охране видов Волгоградской области, как полностью отсутствующие на ее территории.

Апробация работы

Основные положения и результаты работы обсуждались на межрегиональных научно-практических конференциях: «Актуальные проблемы ботаники и методики преподавания биологии» (Белгород, 2007); «Изучение и рациональное использование биоразнообразия растений Волгограда» (Волгоград, 2009), молодых исследователей Волгоградской области (Волгоград, 2010), «Молекулярно-генетические подходы в таксономии и экологии (Ростов-на-Дону, 2013). Докладывались на международном II семинаре по реинтродукции (репатриации) редких видов растений (Волгоград, 2007), всероссийской конфе-

ренции «Ведение региональных Красных книг: достижения, проблемы и перспективы» (Волгоград, 2011) и международной конференции «80-летнему юбилею Волгоградского государственного социально-педагогического университета и естественно-географического факультета ВГСПУ» (Волгоград, 2011), международной конференции «Molecular Phylogenetics» (Moscow, 2012), второй международной научно-практической конференции «Изучение, сохранение и восстановление естественных ландшафтов» (Волгоград, 2012).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 2 учебно-методических пособия и 21 публикация, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы

Диссертационная работа изложена на 160 страницах и состоит из введения, пяти глав, выводов, списка литературы, включающего 191 наименование, из них 28 на иностранных языках, и 4 приложений. Диссертация иллюстрирована 30 таблицами и 69 рисунками, из которых 6 таблиц и 39 рисунков вынесены в приложения.

Благодарности

Искренне благодарю своего научного руководителя Шанцера Ивана Алексеевича за полученные знания, неоценимую и всестороннюю поддержку и помощь на всех этапах выполнения работы. Хочется выразить особую признательность Г.Ю. Клинковой за неоценимую помощь в реализации всех исследований, ценные советы и интерес к работе. Огромное спасибо О.И. Короткову и руководителю экологического движения «Излучина» И.А. Зубову за организацию многочисленных полевых выездов; В.Н. Ильиной за помощь в сборе материала исследования; A.B. Федоровой за помощь в лабораторной работе, а также коллегам естественно-географического факультета ФГБОУ ВПО «ВГСПУ», всем сотрудникам ГБУ «Волгоградский региональный ботанический сад» и отдела Гербарий ГБС им. Н.В. Цицина РАН за поддержку и создание атмосферы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ГЛАВА 1. История изучения рода Hedysarum L. в Восточной Европе

В главе 1 рассматривается история систематических и популяционных исследований копеечников секции Multicaulia.

ГЛАВА 2. Материал и методы исследования

Материал и объекты исследования

Объектом нашего исследования были представители рода Hedysarum (Fa-baceae Lindl.), sect. Multicaulia, произрастающие на территории Волгоградской, Саратовской, Воронежской, Самарской, Ростовской, Оренбургской и Белгородской областей, Ставропольского и Краснодарского краев, Республики Башкортостан, а также Украины, и ряда государств Средней Азии.

Морфологические признаки были изучены у Я. grandiflorum, Н. х smirnovii, Н. biebersteinii, Н. argyrophyllum и Н. candidum из 18 различных популяций. Суммарный объем выборки составил 159 растений. Динамика онтогенетической структуры популяций Я. grandiflorum s.l. на территории Волгоградской области изучалась нами на 17 участках в течение 2-5 лет, популяции Н. cretaceum изучали на 7 участках в течение 2-5 лет.

Материалом для оценки семенной всхожести в условиях интродукции послужили семена Я. grandiflorum различного срока хранения, собранные в естественных местообитаниях Волгоградской области.

Для изучения генетического полиморфизма копеечников подсекции Subacaulia с помощью фрагментного (ISSR - Inter Simple Sequence Repeats) анализа были использованы 47 образцов копеечников, в том числе 36 образцов Я. grandiflorum, 1 образцов Н. biebersteinii и 4 образца Н. argyrophyllum, из 13 географически удаленных друг от друга локальных популяций. Материалом для изучения Н. ucrainicum послужили 47 образцов копеечников, в том числе 36 образцов Н. cretaceum и 8 образцов Я. ucrainicum из 12 географически удаленных друг от друга локальных популяций.

Методы исследований

Методы изучения гербарного материала. При изучении внутривидовой изменчивости в нашем исследовании мы использовали признаки вегетативных и генеративных частей растений (19 признаков), указывавшиеся как диагностические в работах Федченко (1902, 1948), Байтенова (1961), Авдеева (1971), Володиной (1974, 1978), Васильевой (1987), Сагалаева (1982, 1989, 2000) и Князева (2011, 2013). Статистический анализ внутри- и межпопуляционной изменчивости морфологических признаков выполнен методами дисперсионного, дис-криминантного и кластерного анализа в программах PAST (Hammer et al., 2001) и STATISTICA 6.0 for Windows (STATISTICA, 2001).

Методы изучения в условиях интродукции. В качестве источника материала для интродукции нами использованы популяции копеечников Волгоградской области. Для изучения семенного размножения семена Я. grandiflorum Pall, были собраны из десяти различных природных популяций. Лабораторное проращивание семян проводили в чашках Петри на подложке из фильтровальной бумаги по 100 семян в чашке в 3-кратной повторности. Для определения грунтовой всхожести семена высеивали в рассадные ящики.

Методы изучения популяций. При проведении популяционных исследований использовалась терминология и основные методы, разработанные Т.А. Работно-вым (1945,1946,1950,1951), A.A. Урановым (1965,1967, 1975,1977), Е.Л. Любарским (1961, 1976, 1993), Ю.А. Злобиным (1984, 1989), Л.А. Жуковой (1995, 2008), Н.В. Глотовым (1998). Изменчивость онтогенетического спектра популяций оценивалась с помощью следующих показателей: индекс возрастности (Д), индекс восстановления 1в, индекс замещения 13, индекс эффективности (со), классификация «дельта — омега» и индекс виталитета популяции IVC.

Молекулярно-генетические методы. Для проведения фрагментного анали-

за ДНК были использованы межмикросателлитные маркеры (Inter Simple Sequence Repeats, ISSR). ДНК выделяли ЦТАБ методом (Doyle, Doyle, 1987) из листьев гербарных образцов или листьев, высушенных в силикагеле или с помощью набора для экстракции растительной ДНК - NucleoSpin Plant (Macherey-Nagel, Германия), следуя протоколу производителя. В качестве праймеров для проведения ПЦР были использованы 9 олигонуклеотидных последовательностей, комплементарных микросателлитным участкам генома. Амплификацию проводили в стерильных 0,5 мл микроцентрифужных пробирках Эппендорф в 20 мкл реакционной смеси, содержащей около 20 нг ДНК и 4 мкл готового реакционного микса MasterMix 5Х MagDDMIX-2025 (Диалат Лтд., Россия). Обработку результатов проводили с помощью программы Cross Checker (Buntjer, 2000). Статистический анализ полученной бинарной матрицы проводили в программе PAST (Hammer et al., 2001) методом главных координат с использованием расстояния Жаккара. Анализ популяционной структуры проводили методом Байеса в программе Structure 2.2. (Pritchard et al., 2000; Falush et al., 2007). Оценку генетической дифференциации исследованных выборок проводили в программе Arlequin ver. 3.1 (Excoffier et al., 1992; Schneider et al., 2006).

ГЛАВА 3. Структура и динамика популяций видов Hedysaruitt на территории Волгоградской области

Структура популяций Hedysarum grandiflorum и Hedysarum cretaceum

Изучение онтогенетической структуры проводили в природных популяциях H. grandiflorum s.l. и H. cretaceum на территории Волгоградской области.

Исследование генетической изменчивости популяций H. grandiflorum, H. biebersteinii, H. x smirnovii и близкого к ним южноуральского H. argyrophyl-lum с использованием межмикросателлитных (ISSR) маркеров (Супрун, Шан-цер, 2013) показало, что популяции копеечников из области Среднего Дона следует все же относить к H. grandiflorum. В отношении гибридизации между H. biebersteinii и среднедонскими популяциями H. grandiflorum однозначных выводов сделать не удалось: если таковая и происходила, то очень давно, и сейчас мы наблюдаем ее весьма отдаленные последствия. В связи с этим, все исследуемые популяции H. grandiflorum (в пределах Приволжской возвышенности - ПВ) и Я. x smirnovii (территория Среднего Дона - СД) рассматривались нами, как один вид H. grandiflorum.

У H. grandiflorum в сложении структуры популяций на территории Приволжской возвышенности основная роль принадлежит генеративным особям (максимум численности в различных местообитаниях приходится на взрослую часть возрастного спектра). Большинство популяций были полночленные. Неполночленность отмечена только для одной популяции H. grandiflorum (ЦП-4), в которой отсутствовали проростки и ювенильные растения. Преобладание в некоторых популяциях (ЦП-2, ЦП-3) молодых особей и соответственно массовое развитие проростков и ювенильных растений, связано, вероятно, с высокой семенной продуктивностью особей и хорошими условиями для прорастания семян (рис. 1).

ЦП 1

ЦП- 1

ЦП-3

Н. grandiflorum

Н. сге1асеит

• * ■ прегенеративный —■—генеративный —постгенеративный

Рисунок 1. Соотношение онтогенетических периодов в исследуемых популяциях Нес1у$агит на территории Волгоградской области

'Обозначения на диаграмме Н. grandiflorum^.

розовый сектор - популяции Н. grandiflorum на территории Среднего Дона

(«Я. х зтггпоуЦ»);

белый сектор - популяции Н. grandiflonm на территории Приволжской воз-

вышенности.

Минимальное количество генеративных особей наблюдалось в ЦП-12 в (41,94%) по сравнению с остальными популяциями. Число старых генеративных особей во всех популяциях было низким (0-17,8%). Доля особей молодого и зрелого генеративного состояния была примерно одинаковой. Доля особей постгенеративного периода развития составляла незначительную часть в возрастных спектрах изученных популяций. В ЦП-12 и ЦП-13 особи постгенеративного периода отсутствовали вовсе. Во всех популяциях СД максимум приходится на средневозрастные генеративные особи. Плотность особей несколько ниже, чем у популяций Н. grandiflorum с ПВ и составляет 5,5-10,7 особей на 1м2. Среднедонские популяции Н. grandiflorum характеризуются преобладанием особей генеративного периода (41,94 - 78,33%) над особями прегенератив-ного периода (14,47 - 47,31%), тогда как в популяциях Н. grandiflorum на Приволжской возвышенности показатели числа особей прегенеративного периода имеют более высокие и выровненные значения (27,7 - 45,8%).

Возрастные спектры большинства изученных популяций Н. сге1асеит одновершинные правосторонние с доминированием особей в генеративном состоянии. Исключение составляет лишь ЦП-4, возрастной спектр которой явля-

ется бимодальным с максимумами на ювенильных и генеративных особях. Преобладают либо молодые генеративные особи (22,3-29,6%), либо зрелые генеративные (22,7-28,5%). Большинство популяций были полночленные. Непол-ночленность отмечена только для одной популяции (ЦП-5), в которой отсутствовали сенильные особи. Все изученные популяции Н. сШасеит являются жизнеспособными с пиком на зрелой генеративной фракции. Незначительные колебания наблюдаются только в количественном соотношении одних и тех же онтогенетических состояний (рис. 1).

Распределение 17 популяций Н. grandiflorum и 7 популяций Н. сгеШсеит по классификации «дельта-омега» представлено на рисунке 2.

Старая Стареющая

щ Переходная ^ »• Л | Зрелая А

• Молодая — А Зреющая

О 0.5 1

omega

Рисунок 2. Распределение популяций копеечников в Волгоградской области по классификации Л.А. Животовского (2001)

'Условные обозначения:

кружок черный - популяции Н. grandiflorum (Приволжская возвышенность);

кружок серый - популяции Н. grandiflorum (Средний Дон);

треугольник зеленый - популяции Н. cretaceum.

ГЛАВА 4. Систематика и филогения видов рода Hedysarum sect. Mul-ticaulia

Морфологический анализ видов Hedysarum

Исследование изменчивости 19 количественных морфологических признаков исследуемых видов Hedysarum не позволило установить четких морфологических различий между ними. В пределах одной локальной популяции часто встречаются несколько вариантов опушения листовой пластинки и генеративного побега. Однако иерархический дисперсионный анализ (Multivariate Nested ANOVA) по указанным выше количественным признакам показал наличие статистически достоверных различий (р<0,01) как между видами, так и между отдельными популя-

циями Н. апсИ/1огит. Тест Тьюки для неравных групп показал, что между Я. grandijlorum, Я. ЫеЪеШети, Н. аг^горкуПит, Н. candidum и Я. х этьгпоуи наблюдаются достоверные (р<0,05) отличия по 16 количественным морфологическим признакам из 19, разделяющие хотя бы некоторые из этих видов. По таким признакам, как ширина соцветия, высота генеративного побега и длина трубки чашечки различия оказались недостоверными.

На рисунке 3 приведена диаграмма разброса образцов в плоскости 1 и 2 главных компонент.

Рисунок 3. Результаты анализа 16 количественных признаков Н. argyrophyllum, Н. сапМЛит, Н. ЫеЬе^ети, Н. апйЩогит, Н. х ьпйгпоуи методом главных компонент

'Условные обозначения на диаграмме разброса: квадрат желтый - Я. argyrophyllum; треугольник красный - Я. ЫеЬеЫети; треугольник зеленый перевернутый - Я. са^1йит\ кружок - Я. grandiflorum; кружок фиолетовый - Я. х .чпигпоуЦ.

1 -я главная компонента объясняет 67,2%, а 2-я - 19,7% наблюдаемой изменчивости. Наибольшую нагрузку по 1й главной компоненте (0,95) дает признак числа цветков в соцветии, по 2й - признаки высоты цветоноса (0,8) и длины концевого листочка сложного листа (0,5). Как видно из диаграммы разброса, никакого разделения видовых выборок не наблюдается. «Облака» всех видов почти полностью перекрываются друг с другом и попадают в пределы изменчивости Я. ^а^1/1огит, частично отделяются только некоторые образцы Я. candidum.

В работе М.С. Князева (2013) представлен оригинальный ключ по опре-

делению видов Hedysarum Восточной Европы и Урала. Большинство видов Не-dysarum, согласно ключу, отличаются между собой по признакам цветка. Так, Я. candidum, И. biebersteinii и Я. х smirnovii имеют цветки 15-23 мм дл., крылья в 1,5-3 раза короче и в 2-3 раза уже лодочки, чашечка длиннее или равна крыльям. А у Я. argyrophyllum и Я. grandiflorum цветки 22-27 мм дп., крылья в 1/5-1/4 короче и в 1,5-2 раза уже лодочки, чашечка Короче крыльев. Новый гиб-ридогенный вид Я. х smirnovii (приведенный им ранее для территории Среднего Дона Волгоградской области) отличается от Я. biebersteinii чашечкой, которая на четверть короче лодочки, когда как у Я. biebersteinii чашечка обычно равна или длиннее лодочки. Я. argyrophyllum и Я. grandiflorum отличаются друг от друга только окраской венчика. Мы попытались разделить только эти три вида, Я. grandiflorum, Я. biebersteinii и Я. х smirnovii, по размерным параметрам частей цветка методом главных компонент (рис. 4). Однако и в данном случае результат оказался отрицательным.

Компонента 1

Рисунок 4. Анализ изменчивости Н. grandiflorum, Н. ЫеЬепШпи. и Я. х «»нгиотй по 6 количественным признакам венчика методом главных компонент

Условные обозначения на дендрограмме разброса: кружок - Я. grandiflorum; кружок красный - Я. ЫеЪетеМг, треугольник зеленый - Я. х smirnovii.

Результаты морфометрического исследования Я. grandiflorum и близких к нему видов Я. аг%угорку11ит, Н. candidum, Н. ЫеЬеШетп и Я. х эт1гпош позволяют прийти к неутешительному выводу, что различение их по морфологическим признакам крайне затруднено. Причины столь слабой морфологической дифференциации популяций этих видов могут быть различными. Чтобы попы-

таться понять их, мы провели молекулярно-генетическое исследование с использованием фрагментного анализа ДНК (Супрун и др., 2013).

Молекулярно-генетический анализ по данным ISSR маркирования

Оценку внутри- и межпопуляционную изменчивость Я. grandiflorum, Н. biebersteinii, Н. х smirnovii и Я. argyrophyllum в том числе и в областях перекрывания их ареалов оценивали с помощью фрагментного анализа их ДНК.

Результаты анализа этой матрицы в программе PAST методом главных координат показывают, что первая и вторая главные координаты описывают только 21,4 и 10,2% расстояний соответственно. На диаграмме разброса (рис. 5) видно, что только образцы Я. biebersteinii с Северного Кавказа образуют самостоятельное рыхлое облако, соприкасающееся со вторым облаком, в котором перемешаны образцы изо всех остальных популяций. Хотя образцы из отдельных локальных популяций имеют тенденцию группироваться недалеко друг от друга, в целом, никакой определенной закономерности в их распределении не наблюдается.

Координата 1

Рисунок 5. Результаты анализа образцов Hedysarum из 13 локальных популяций методом главных координат (РСоА) в программе PAST

'Условные обозначения на дендрограмме разброса:

Я. biebersteiniv. St - звездочка.

Я. argyrophyllum: Ва -горизонтальный крест; Or - вертикальный крест.

Я. grandiflorum: квадраты, треугольники, ромбы, круги и овалы - образцы из 10 различных локальных популяций.

Анализ этой матрицы в программе Structure показывает, что наиболее вероятным оказывается разделение исследуемой выборки на К=4 групп, соответствующих четырем генетическим популяциям.

Усредненный генетический состав исследованных локальных популяций, где соотношение четырех генетических групп в каждой из исследованных популяций представлено в виде круговых диаграмм, нанесенных на географическую карту (рис. 6).

Рисунок 6. Результаты байесовского анализа в программе Structure

Столбчатая диаграмма: Вероятность отнесения исследованных 47 образцов Hedysarum к одной из групп по составу ISSR-ампликонов по результатам анализа для К=4. Классы групп обозначены разной штриховкой столбцов диаграммы: rpl- группа 1; гр2 - группа 2; грЗ - группа 3; гр4 - группа 4. По горизонтальной оси отложены названия образцов. По вертикальной оси - апостериорная вероятность.

Гiгографическая карта: Соотношение образцов, относящихся к четырем генетическим группам, в отдельных локальных популяциях показано в виде круговых диаграмм. Обозначения групп те же, что и на столбчатой диаграмме.

Как видно из рисунка, в популяциях Я. grandiflorum выявляются относительно "чистые" популяции с более чем 95% преобладанием группы 1 (Lk, Vs) и группы 4 (Vn, Va), группа 2 преобладает только в одной популяции Я. argy-

горкуИит (Ва), а группа 3 в "чистом" виде не встречается нигде, даже северокавказская популяция Я. ЫеЬегя1етИ (81) носит генетически смешанный характер. При этом в среднедонской популяции Я. ^апШ/1огит (Уве!), считавшейся гибридной с Я. ЫеЬеШети (Я. х ятгтох'И: Князев, 2011) или относившейся к этому виду некоторыми авторами (Я. ЫеЪег$1ети\ Володина и др., 1974, 1978) не наблюдается никакого генетического смешения с группой 3. Однако такое " смешение действительно наблюдается в популяциях из Луганской области Украины (Ьа) и Урюпинского района на севере Волгоградской области (Уи).

Анализ молекулярной дисперсии (АМОУА) показал, что 70,56% изменчивости состава ^БЯ маркеров приходится на внутрипопуляционную изменчивость (Ф$1=0,294, р=0,0000), в то время как на межпопуляционную изменчивость в пределах групп приходится 16,98% общей изменчивости (Ф8С=0,194, р=0,0000), а на межгрупповую изменчивость — только 12,46% (Фс1=0,125, р=0,067). В последнем случае различия между группами статистически недостоверны. Результаты анализа суммированы в таблице 1.

Таблица 1. Результаты анализа молекулярной дисперсии (АМОУА) популяций копеечников Нейуъагит &апШ/1огит (9 популяций), Н. argyrophyllum (2 популяции) и Я. ЫеЬегэ1ешИ (1 популяция)

Изменчивость Компоненты дисперсии

ёГ сумма квадратов % дисперсии индекс фиксации Р

Между группами популяций (видами) 2 88,098 12,46 0,125 (Ф<*) 0,067

Между популяциями 9 167,234 16,98 0,194 (Фес) 0,000

Внутри популяций 35 363,008 70,56 0,294 (ФвО 0,000

Уровни достоверности определены на основании 1000 пермутаций матрицы

Анализ КБИ. маркеров оказался подходящим методом для изучения генетического полиморфизма копеечников, так как позволил получить более 100 фрагментов ДНК, все, кроме одного, из которых оказались полиморфными. Вместе с тем, прямолинейный подход к анализу этих данных, такой как ординация методом главных координат (рис. 5), не позволил сделать никаких однозначных выводов о популяционной структуре исследуемых видов. Только образцы Я. ЫёЬеШетИ со Ставропольской возвышенности оказались несколько отличающимися по составу КБЯ маркеров от остальных популяций Я. апсИАогитп и Я. а^горИуПит. Поэтому первоначально возникло предположение, что в данном случае мы можем иметь дело не с тремя видами, а с плохо географически дифференцированными популяциями одного вида, наиболее удаленные из которых (Урал - Кавказ) сильнее всего разошлись между собою генетически.

Байесовский анализ в программе БйисШге позволил все же с высокой вероятностью разделить исследуемую выборку на 4 генетические группы. Но большинство исследованных образцов оказались имеющими смешанную генетическую природу, что опять, же указывает на наличие достаточно сильного потока генов и отсутствие выраженной генетической дифференциации между популяциями. Такой результат заставил предполагать, что локальные популяции копеечников слабо дифференцированы и связаны интенсивным потоком генов, несмотря на кажущуюся изолированность их друг от друга во фрагмен-тированных местообитаниях, связанных с выходами мела и известняка (Супрун, 2012). Этот вывод выглядит достаточно парадоксально, так как остается неясным, каким образом может происходить миграция копеечников, опыляемых перепончатокрылыми и не имеющих специальных приспособлений для дальнего переноса семян, между местонахождениями, разделенными между собой десятками и сотнями километров?

Анализ молекулярной дисперсии (АМОУА) показал, что это не совсем так. Тот факт, что большая часть молекулярной изменчивости приходится на изменчивость внутрипопуляционную, а индексы фиксации (Фв1) достаточно высоки (выше 0,1) говорит об изолированности популяций друг от друга, что вполне естественно, учитывая их приуроченность к специфическим и сильно удаленным друг от друга местообитаниям, связанным с выходами мела и известняка. Тест Мантеля выявляет статистически достоверную корреляцию между попарными значениями Фв1 и географическими расстояниями между популяциями, что однозначно свидетельствует об изоляции популяций расстоянием и ограничении потока генов между ними. Значительное генетическое сходство между ними может быть связано не с современным потоком генов, а с историческими факторами, т.е. с их достаточно давним общим происхождением. Однако для решения этой проблемы требуется использование иных методов и данных по последовательностям ДНК.

По использованным нами данным 15811 маркирования наиболее изолированной по всем критериям оказывается северокавказская популяция Н. ЫеЬегя-<ети, обмен генов которой с популяциями Н. £гап<1'фогит, возможно, и существовал в историческом прошлом, но в настоящее время хотя и не равен нулю, но все же очень сильно ограничен. Интересно, что наибольший, хотя все же очень слабый поток генов (0,44 мигранта на поколение) связывает эту популяцию, действительно, со среднедонскими популяциями Н. grandiflorum, которые Н.И. Володиной (1978) и М.С. Князевым (2011) считались гибридными между этими видами. Напротив, Н. argyrophyllum связан с популяциями Н. gran-й1/1огит потоком генов, вполне сравнимым с таковым между популяциями последнего вида, о чем говорят попарные значения Фб1:.

В целом, можно констатировать, что видовая самостоятельность Н. аг^у-горИуИит и Н. ЫеЬегя1е1пп от Н. grandiflorum требует дополнительного исследования и подтверждения с использованием других, в первую очередь, хлоро-пластных маркеров. Результаты нашего исследования указывают на то, что все они, скорее, могут считаться географическими подвидами Н. grandiflorum. Наши результаты подтверждают существование вторичных контактов между ни-

ми на Южном Урале и на юге европейской равнины, которые, вероятно, происходили в прошлом, и следы которых сохранились в генетической структуре их популяций. Однако можно ли считать эту гибридизацию межвидовой остается пока под вопросом.

Распространение Нейуъагит исгаМсит КаэсЬт. на территории Волгоградской области

Результаты анализа морфологических признаков цветка и маркеров

показали, что Я. исгаМсит приводился для Волгоградской области по ошибочным определениям образцов, относящихся к Я. сгегасеит. На самом деле, этот вид не заходит так далеко на восток, оставаясь узколокальным эндемиком бассейна р. Айдар. Оба вида достаточно хорошо отличаются друг от друга по таким признакам, как размеры элементов цветка и характеру опушения плода. Эти данные вполне подтверждаются нашими молекулярно-генетическими исследованиями. Анализ состава КБЯ маркеров показывает, что образцы, собранные в Волгоградской области и определенные, как Я. исгаМсит, группируются вместе с другими образцами Я. сге1асеит из Волгоградской области, а не с образцами настоящего Я. исгаМсит из Белгородской области (рис. 7).

□ н."

-I

координата 1

Рисунок 7. Результаты анализа образцов Н. cretaceum и Н. ucrainicum из 12 локальных популяций методом главных координат (РСоА) в программе PAST

'Условные обозначения: квадрат серый - Я. cretaceum;

квадрат белый - Я. ucrainicum (Волгоградская область); кружок черный - Я. ucrainicum (Луганская область).

ГЛАВА 5. Интродукция и рекомендации по охране видов рода НеЛу-ъагит

Перспективы выращивания некоторых видов Нейуъагит в условиях Волгоградской области

Опыты по семенному размножению показали, что семена копеечника крупноцветкового прорастают в широком температурном диапазоне от +5°С до +28°С. Однако интервал постоянных температур, в пределах которого наблюдается достаточно высокая всхожесть, составляет 20-25°С. При этих температурах максимальная всхожесть сочетается с максимальной скоростью прорастания. Семена Я. grandiflorum в природных условиях после осыпания на почву сразу не прорастают. Это связано с недоразвитием зародыша, что видно по данным опытов с семенами с 3 летним сроком хранения.

Изучение Я. сШасеит и Н. grandiflorum в условиях интродукции показало, что в условиях культуры особи данных видов проходят только стадии пре-генеративного и генеративного периода. Достижение ими генеративного состояния происходит на первый год развития. Но после цветения и обсеменения растения часто отмирают. Несмотря на то, что в течение сезона за особями копеечников проводился необходимый уход, все растения обычно погибали к концу октября. Те растения, которые ушли в покой на зиму, весной не отрастали. Лишь незначительное число особей (2-3%) перезимовывают и продолжают свое развитие на следующий год. Пересаженные из природных популяций молодые растения в условия ботанического сада приживаются хорошо, но в скором времени выпадают.

По результатам проведенных интродукционных испытаний все изученные виды Hedysarum следует признать малоперспективными для выращивания. При интродукции рекомендуется пользоваться только семенным материалом. Посев следует производить в осенний период для прохождения семенами естественной стратификации (Супрун, 2007, 2008).

Охрана природных популяций копеечников

В Красную книгу Волгоградской области занесены 4 вида Hedysarum^. Я. grandiflorum, Я. ЫеЬегя1етИ, Я. сге1асеит и Я. исгаШсит (Клинкова и др., 2006). Из них Я. grandiflorum, Н. исгаШсит, а также Я. candidum включены и в Красную Книгу РФ (Киселева, 2008; http://www.mnr.gov.ru/regulatory/detail. рЬр?ГО= 128260). В результате проведенных нами исследований установлено, что на территории Волгоградской области произрастают только Я. grandiflorum и Я. сге1асеит, а Я. ЫеЬеМетИ и Я. исгаШсит исключены из состава флоры, как приводившиеся по ошибочным определениям.

В настоящее время редкие виды растений Волгоградской и других областей юга России остаются еще очень слабо изученными в отношении внутривидовой изменчивости вообще и генетической изменчивости в частности. В силу этого нередко возникают трудноразрешимые проблемы при отборе видов для включения в региональные Красные книги.

По данным нашего молекулярно-генетического исследования Я. grandif-lorum можно видеть, что популяции в Волгоградской области, расположенные в пределах Приволжской возвышенности, характеризуются более высоким генетическим разнообразием по сравнению с другими районами исследования. На основании полученных данных для сохранения природных популяций исследуемого вида особое внимание необходимо уделять популяциям, расположенным в пределах Приволжской возвышенности, что связано с большей их уникальностью и высоком уровнем генетического разнообразия. Именно среди них и следует выбирать популяции для организации охраны в естественных условиях и постоянного мониторинга (Супрун, 2012).

Результаты нашего исследования могут быть использованы природоохранными организациями, в том числе при разработке и реализации программ и планов управления особо охраняемыми природными территориями (ООПТ) и оптимизации их деятельности. Научные выводы работы и рекомендации используются при проведении мониторинга популяционного разнообразия видов в Волгоградской области.

ВЫВОДЫ

1. Среди признаков, традиционно используемых для диагностики Я. biebers-teinii, Н. grandiflorum, Я. argyrophyllum, Я. candidum и Я. х smirnovii, только количественные признаки цветка позволяют лишь отчасти разграничить их друг от друга, что объясняет трудности, существующие при их диагностике по традиционным дихотомическим ключам.

2. По данным ISSR маркирования, северокавказский Я. biebersteinii, равнинный Я. grandiflorum и уральский Я. argyrophyllum представляют собой генетически слабо дифференцированные расы, таксономически заслуживающие ранга подвида.

3. Поток генов между популяциями Н. grandiflorum ограничен географическим расстоянием между ними, островное расположение местообитаний ведет к изоляции популяций друг от друга.

4. Онтогенетические спектры природных популяций Я. grandiflorum и Я. cretaceum с территории Волгоградской области являются правосторонними, полночленными. Максимум численности приходится на зрелые генеративные особи. По классификации «дельта-омега» популяции относятся к молодым, переходным и зрелым, что говорит об устойчивом состоянии большинства из них.

5. Я. ucrainicum распространен только в долине реки Айдар и на территории Волгоградской области не встречается. Растения ранее определявшиеся, как Я. ucrainicum, следует относить к Я. cretaceum.

6. Я. grandiflorum мало перспективен для введения в культуру и сохранения ex situ в силу быстрого прохождения всех стадий онтогенеза и отмирания большинства растений уже в конце первого года культивирования.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в периодических изданиях, рекомендованных ВАК РФ:

1. Малаева, Е.В. Генетический банк редких и ценных видов растений ГУ «Волгоградский региональный ботанический сад / Е.В. Малаева, H.A. Супрун, О.И. Короткое, О.О. Короткова // «Вестник ВолГУ». -2008. -№3.- С. 242-246.

2. Супрун, H.A. Онтогенез и структура популяций Hedysarum cretaceum Fisch, на территории Волгоградской области / H.A. Супрун // Вестник Удмуртского университета. Серия «Биология. Науки о Земле». -Ижевск: Изд-во «Удмуртский университет». - 2013. - Вып. 1. — С. 33-39.

3. Супрун, H.A. Структура популяций Hedysarum grandiflorum Pall, в Волгоградской области / H.A. Супрун // Известия Самарского научного центра РАН. - 2013. - Т. 15. № 3(1). - С. 342-347.

Учебно-методические пособия

4. Клинкова, Г.Ю. Мониторинг и оценка состояния ценных ботанических объектов. 4.1. Популяции редких видов растений: учебно-методическое пособие / Г.Ю. Клинкова, H.A. Супрун, A.B. Луконина. - Волгоград: ВГПУ, 2011.-64 с.

5. Луконина, A.B. Мониторинг и оценка состояния ценных ботанических объектов. 4.2. Растительные комплексы: учебно-методическое пособие / A.B. Луконина, Г.Ю. Клинкова, H.A. Супрун. - Волгоград: ВГПУ, 2011. -40 с.

Работы, опубликованные в отечественных журналах и материалах международных, всероссийских и региональных конференций:

6. Клинкова, Г.Ю. Научно-методическое обеспечение мониторинга популяций растений, занесенных в Красную книгу Волгоградской области / Г.Ю. Клинкова, A.B. Луконина, H.A. Супрун // Мониторинг редких видов - важнейший элемент государственной системы экологического мониторинга и охраны биоразнообразия, материалы межрегиональной научно-практической конференции (Волгоград, 6-7 декабря, 2006 г.). -Волгоград, Издательство ВГПУ: «Перемена», 2006. -С. 65-68.

7. Луконина, A.B. Сохранение редких видов растений флоры Нижнего Поволжья в ботанических садах г. Волгограда / A.B. Луконина, Г.Ю. Клинкова, H.A. Супрун // Мониторинг редких видов - важнейший элемент государственной системы экологического мониторинга и охраны биоразнообразия, материалы межрегиональной научно-практической конференции (Волгоград, 6-7 декабря, 2006г.). - Волгоград, Издательство ВГПУ: «Перемена», 2006. - С. 94-99.

8. Клинкова Г.Ю. Hedysarum grandiflorum Pall. / Г.Ю. Клинкова, H.A. Супрун, Д.Е. Матвеев // Красная книга Волгоградской области. Растения и грибы. - Волгоград: Волгоград, 2006. - Т. 2. - С. 115.

9. Супрун, H.A. Некоторые проблемы систематики видов рода Hedysarum L. (секция Subacaulia) в Волгоградской области / H.A. Супрун, Г.Ю. Клинкова // Материалы «Международные Линнеевский чтения, посвященные 300-летию со дня рождения основоположника научной ботаники Карла Линнея». - Луганск, 2007. - С. 95-96.

10. Супрун, H.A. Интродукция Hedysarum grandiflorum Pall, в Волгоградском региональном ботаническом саду / H.A. Супрун // Международная научная конференция «Современные проблемы интродукции и сохранения биоразнообразия растений», посвященная 70-летию Ботанического сада». - Воронеж, 2007. - С. 24-25.

11. Супрун, H.A. Возрастная структура ценопопуляций Hedysarum grandiflorum Pall. (Fabaceae) на территории Волгоградской области / H.A. Супрун // Вторая научно-практическая конференция «Актуальные проблемы ботаники и методики преподавания биологии». - Белгород, 2007. -С. 120-124.

12. Супрун, H.A. Изменчивость морфологических признаков цветка Hedysarum grandiflorum Pall. (Fabaceae) / H.A. Супрун, Е.С. Филимонова // Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники XXI века, часть 6, Экологическая физиология и биохимия растений: материалы всероссийской конференции. - Петрозаводск, 2008. - С. 332-333.

13. Супрун, H.A. Изменчивость морфологических признаков семян Hedysarum grandiflorum Pall. / H.A. Супрун, Е.С. Филимонова // Биоразнообразие: проблемы и перспективы сохранения. Материалы международной научной конференции, посвященной 135-летию со дня рождения М.М. Спрыгина, Ч. I. ПГПУ им. В.Г. Белинского. - Пенза, 2008. - С. 7980.

14. Супрун, H.A. Особенности антэкологии Hedysarum grandiflorum Pall, и Hedysarum biebersteinii Zertova (Fabaceae) Волгоградской области / H.A. Супрун // Всероссийская конференция «Чтения памяти А. П. Хохрякова (1933 -1998)». - Магадан, 2008. - С. 97-102.

15. Супрун, H.A. Культивирование редких и исчезающих видов растений природной флоры в Волгоградском региональном ботаническом саду / H.A. Супрун // X Международный симпозиум. «Эколого-популя-ционный анализ полезных растений: интродукция, воспроизводство, использование». - Сыктывкар, 2008. - С. 187-188.

16. Короткое, О.И. Использование молекулярных маркеров для изучения изменчивости редких видов растений / О.И. Коротков, О.О. Короткова, H.A. Супрун, Е.В. Малаева II Современное состояние и пути развития популяционной биологии: Мат. X Всеросс. попул. сем. - Ижевск: Кни-гоГрад, 2008. - С. 341-342.

17. Супрун, H.A. Генетическая изменчивость видов рода Hedysarum L. на территории Нижнего Поволжья / H.A. Супрун, И.А. Шанцер // Материалы XV региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области: научное издание. Волгоградская ГСХА, ИПК ФГОУ ВПО. - Волгоград: «Нива», 2010. - С. 54-58.

18. Супрун, H,А. Проблемы включения в Красную книгу видов сложных таксономических групп (на примере видов рода Hedysarum L.) / Н.А. Супрун // Сборник статей по материалам I Всероссийской научно-практической конференции «Ведение региональных Красных книг: достижения, проблемы и перспективы». — Волгоград: Арт линия, 2011. -С. 246-249.

19. Schanzer, I.A. Chloroplast DNA phylogeny and phylogeography of Hedysarum L. sect. Multicaulia Boiss. / LA. Schanzer, N.A. Suprun // Molecular Phylogenetics: Contributions to the 3rd Moscow International Conférence «Molecular Phylogenetics» (Moscow, Russia, July 31 — August 4, 2012) / [Compiled by A.Troitsky, L.Rusin, and V.Aleoshin]. - Moscow: TO-PURPRESS,2012.-P. 35.

20. Шанцер, И.А. Молекулярно-генетические данные для мониторинга состояния и сохранения природных ландшафтов / И.А. Шанцер, Н.А. Супрун, Ю.Ю. Кулакова // Изучение, сохранение и восстановление естественных ландшафтов. Сборник статей второй международной научно-практической конференции (17-21 сентября 2012г., г. Волгоград). - Москва: «Планета», 2012.-С. 128-134.

21. Супрун, Н.А. Использование данных популяционной генетики Hedysarum grandiflorum Pall. для определения комплекса мероприятий по сохранению вида / Н.А. Супрун // Изучение, сохранение и восстановление естественных ландшафтов. Сборник статей второй международной научно-практической конференции (17-21 сентября 2012 г., г. Волгоград). — Москва: «Планета». - С. 128=134.

22. Шанцер, И.А. Копеечники (Hedysarum L.) Юга Восточной Европы: структура популяций и филогеография / И.А. Шанцер, Н.А. Супрун // Тезисы докладов научной конференции «молекулярно-генетические подходы в таксономии и экологии (г. Ростов-на-Дону, 25-29 марта 2013г.), отв. ред. чл.-корр. РАН Д.Г. Матишов. - Ростов н/Д: Изд-во ЮНЦ РАН, 2013.-С. 106.

23. Супрун, Н.А. Генетическая изменчивость видов родства Hedysarum grandiflorum Pall. (Fabaceae) по данным ISSR маркирования / Н.А. Супрун, И.А. Шанцер // Бюл. ГБС РАН. - 2013. - №4. - С. 42-49.

Супрун Наталья Александровна

КОПЕЕЧНИКИ (ЯЕЯЕУЛДМ/Ь.) НИЖНЕГО ПОВОЛЖЬЯ: ИЗМЕНЧИВОСТЬ И СИСТЕМАТИКА

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Подписано к печати 24.03.2014 г. Формат 60x84/16. Бум офс. Уч.-изд. л. 1,4. Тираж 110 экз. Заказ № 114. Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии издательства «Перемена», 400066, г. Волгоград, пр. Ленина,27

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Супрун, Наталья Александровна, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки ГЛАВНЫЙ БОТАНИЧЕСКИЙ САД им. Н.В. ЦИЦИНА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

04201457546 На правах рукописи

СУПРУН НАТАЛЬЯ АЛЕКСАНДРОВНА

КОПЕЕЧНИКИ (НЕБУЗАБШМ Ь.) НИЖНЕГО ПОВОЛЖЬЯ: ИЗМЕНЧИВОСТЬ И СИСТЕМАТИКА

03.02.01 - ботаника

Диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

д. б. н. Шанцер Иван Алексеевич

Москва - 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение................................................................................................................................................................................4

Глава 1. История изучения рода Hedysarum L. в Восточной Европе..........................8

1.1. Систематика рода Hedysarum..................................................................................................8

1.2. Гипотезы об эволюции копеечников секции Multicaulia........................................11

1.3. Проблемы систематики видов рода Hedysarum L. юго-востока европейской части России......................................................................................................................13

1.4. Жизненные формы Hedysarum (sect. Multicaulia)....................................................17

1.5. Особенности онтогенеза и структура ценопопуляций видов рода Hedysarum L. на территории юга Восточной Европы..............................................................17

1.6. Интродукция видов Hedysarum....................................................................................................19

1.7. Изучение генетических особенностей видов рода Hedysarum L................20

Глава 2. Материал и методы исследования................................................................................................23

2.1. Материал и объекты исследования........................................................................................23

2.2. Методы исследований............................................................................................................................26

2.2.1. Методы изучения гербарного материала........................................................26

2.2.2. Методы изучения в условиях интродукции..................................................28

2.2.3. Методы изучения популяций........................................................................................28

2.2.4. Молекулярно-генетические методы....................................................................34

2.2.4.1. Выделение ДНК......................................................................................................34

2.2.4.2. Параметры ISSR-ПЦР..............................................................................................35

Глава 3. Структура и динамика популяций видов Hedysarum на территории

Волгоградской области............................................................................................................................................................38

3.1. Характеристика местообитаний видов Hedysarum............................................................38

3.2. Онтогенетическая структура популяций видов Hedysarum в Волгоградской области......................................................................................................................................39

3.3. Структура популяций Hedysarum grandiflorum..........................................................47

3.4. Структура популяций Hedysarum cretaceum......................................................................59

Глава 4. Систематика и филогения видов рода Hedysarum sect.

Multicaulia........................................................................................ 66

4.1. Морфологический анализ видов Hedysarum................................... 66

4.2. Молекулярно-генетический анализ по данным ISSR

маркирования............................................................................. 80

4.3. Распространение Hedysarum ucrainicum Kaschm. на территории Волгоградской области................................................................. 90

Глава 5. Интродукция и рекомендации по охране видов рода Hedysarum L.... 95

5.1. Перспективы выращивания некоторых видов Hedysarum в условиях Волгоградской области............................................................................ 96

5.2. Охрана природных популяций копеечников................................ 101

Выводы............................................................................................ 105

Литература....................................................................................... 106

Приложение 1. Материал и объекты исследования.................................. 127

Приложение 2. Динамика онтогенетической структуры

Hedysarum grandiflorum и Hedysarum cretaceum на территории

Волгоградской области......................................................................... 135

Приложение 3. Средние показатели морфологических признаков популяций

видов Hedysarum..................................................................................... 148

Приложение 4. Продукты амплификации ДНК видов Hedysarum с

различными праймерами.................................................................... 152

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Копеечники {Hedysarum L.) - одна из весьма трудных в систематическом отношении групп в семействе бобовых (Fabaceae). Причиной тому является значительная морфологическая изменчивость многих видов и наличие морфологически переходных форм. Разделение на виды порой бывает затруднено из-за отсутствия четких диагностических морфологических признаков. Многие авторы расходятся в отношении систематического состава рода для территории юга Европейской части России. Последняя ревизия рода в полном объеме была предпринята Б. А. Федченко (1902), ревизию внутриродовой систематики, не затронувшую видовой состав секций, позднее опубликовали В. Choi и Н. Ohashi (2003). В связи с этим, необходимо возникает необходимость в изучении внутривидовой изменчивости видов на основании анализа всех признаков, использовавшихся систематиками, изучавшими виды с территории, как юга европейской части России, так и Волгоградской области.

Использование генетических маркеров часто оказывается решающим в таких таксономических исследованиях. Только на основе сопоставления данных молекулярно-генетического анализа и данных морфологии можно получить наиболее объективное представление о таксономических границах видов, а также решить проблемы, связанные с внутривидовой изменчивостью и гибридизацией.

Для прояснения систематического статуса близкородственных видов и разграничения морфологически сходных видов рода Hedysarum, в данной работе были использованы морфологические, ценопопуляционные и молекулярно-генетические методы (ISSR, секвенирование одного из участков хлоропластного генома).

В силу ряда причин (произрастание приурочено к выходам мела или известняка, лекарственное сырье, декоративность и т. д.) многие копеечники становятся редкими и нуждаются в охране, многие из них занесены в

Российскую и региональные Красные книги. Однако какие-либо специальные меры охраны этих видов отсутствуют даже на охраняемых территориях. Для сохранения этих редких видов необходимо изучение состояния их генофонда, динамики ценопопуляций и биологии размножения, чему и посвящена настоящая диссертация.

Цель исследования

Цель настоящей работы - установление видового состава, сравнительное изучение внутри- и межпопуляционной изменчивости и структуры популяций видов рода Нейуьагит секции МиШсаиПа в Нижнем Поволжье и на сопредельных территориях юга России и Украины.

Задачи исследования

1. Оценить современное состояние и особенности онтогенетической структуры ценопопуляций копеечников в их естественных местообитаниях на территории Волгоградской области.

2. Провести анализ генетического разнообразия видов рода Иейузагит Ь. по данным изменчивости молекулярно-генетических маркеров.

3. Уточнить границы таксонов копеечников юго-востока Европейской России по данным изменчивости морфологических признаков и молекулярно-генетических маркеров.

Научная новизна работы

Впервые изучены структура и динамика популяций Н. ^гапсИАогит и Н. сШасеит для Волгоградской области. Определены типы онтогенетических спектров популяций, их возрастность и жизненность. Впервые с использованием молекулярно-генетических маркеров изучена генетическая структура популяций у Н. grandiflorum и близких видов подсекции ЗиЬасаиНа. На основе сравнения результатов морфологического и молекулярного анализов

уточнены границы, ранг и распространение ряда близкородственных видов Нес1уяагит.

Теоретическая значимость

Полученные результаты используются при подготовке обработки рода Нес1у8агит для «Флоры Нижнего Поволжья», могут быть использованы при подготовке и составлении флористических сводок и определителей растений в смежных регионах, а также при подготовке таксономической ревизии рода.

Материалы диссертации вносят вклад в понимание биологии, популяционной структуры и систематики изученных растений. Результаты и выводы исследований могут быть использованы для решения проблем с включением видов из таксономически сложных групп растений в Российскую и региональные Красные книги и оптимизацию стратегии сохранения генетического разнообразия растений на популяционном уровне на юго-востоке европейской части России и в других регионах страны.

Практическая значимость

Полученные результаты могут быть востребованы при планировании рационального использования степных экосистем и сети особо охраняемых природных территорий на юге европейской части России. Материалы исследования используются на практических занятиях и при проведении полевых практик студентов в рамках учебных курсов «Экология и география растений» и «Ботаника» в Волгоградском государственном социально-педагогическом университете. Научные выводы работы и рекомендации непосредственно используются при проведении мониторинга редких видов рода Нес^узагит, занесенных в Красную книгу Волгоградской области. На основе результатов проведенного исследования Н. исгаШсит и Н. ЫеЬеШети были исключены из списка редких и нуждающихся в охране видов Волгоградской области, как полностью отсутствующие на ее территории.

Апробация работы

Основные положения и результаты работы обсуждались на межрегиональных научно-практических конференциях: «Актуальные проблемы ботаники и методики преподавания биологии» (Белгород, 2007); «Изучение и рациональное использование биоразнообразия растений Волгограда» (Волгоград, 2009), молодых исследователей Волгоградской области (Волгоград, 2010), «Молекулярно-генетические подходы в таксономии и экологии (Ростов-на-Дону, 2013). Докладывались на международном II семинаре по реинтродукции (репатриации) редких видов растений (Волгоград, 2007), всероссийской конференции «Ведение региональных Красных книг: достижения, проблемы и перспективы» (Волгоград, 2011) и международной конференции «80-летнему юбилею Волгоградского государственного социально-педагогического университета и естественно-географического факультета ВГСПУ» (Волгоград, 2011), международной конференции «Molecular Phylogenetics» (Moscow, 2012), второй международной научно-практической конференции. «Изучение, сохранение и восстановление естественных ландшафтов» (Волгоград, 2012).

Благодарности

Искренне благодарю своего научного руководителя Шанцера Ивана Алексеевича за полученные знания, неоценимую и всестороннюю поддержку и помощь на всех этапах выполнения работы. Хочется выразить особую признательность Клинковой Г.Ю. за неоценимую помощь в реализации всех исследований, ценные советы и интерес к работе. Огромное спасибо Короткову О.И. и руководителю экологического движения «Излучина» Зубову И.А. за организацию многочисленных полевых выездов; Ильиной В.Н. за помощь в сборе материала исследования; Федоровой A.B. за помощь в лабораторной работе, а также коллегам естественно-географического факультета ФБГОУ ВПО «ВГСПУ», всем сотрудникам ГБУ «Волгоградский региональный ботанический сад» и отдела Гербарий ГБС им. Н.В. Цицина РАН за поддержку и создание атмосферы.

ГЛАВА 1.

ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ РОДА HEDYSARUM L. В ВОСТОЧНОЙ ЕВРОПЕ

1.1. Систематика рода Hedysarum

По современным оценкам род Hedysarum насчитывает от 100 до 285 видов (Федченко, 1902, 1948; Агагабян, 1951; Яковлев, 1991; Choi and Ohashi, 1998, Миронов, 2000), распространенных как в Старом, так и в Новом Свете. Во флоре бывшего СССР (Федченко, 1948) он представлен 90 видами, большинство из которых сосредоточено в Азии. В Средней России встречаются 12 видов рода.

Карл Линней (Linnaeus, 1753) при построении системы растительного мира выделял 33 вида Hedysarum, поместив их в классе Diadelphia Decandria между родами Scorpiurus и Indigofera. Внутри рода он группировал виды по строению листьев. Впоследствии виды с простыми листьями были отделены в род Alhagi, вид с двумя листочками отнесен к роду Zornia, виды с тройчатосложными листьями разделены в разные роды (Lespedeza, Desmodium и др.), настоящие виды рода Hedysarum все оказались с перистыми листьями (Федченко, 1902). В настоящее время из 33 линнеевских видов только 4 относят к копеечникам (http://www.ildis.org/cgi-bin/Araneus.pl).

Во «Flora Rossica» К.Ф. Ледебура (1842) род Hedysarum представлен 24 видами и разделен на 2 секции по наличию или отсутствию шипиков и щетинок на члениках боба. Из видов, рассматриваемых в нашей диссертации, к секции Echinolobium он относил виды Н. grandißorum Pall., Н. argyrophyllum Ledeb., Н. argenteum М. Bieb., Н. candidum М. Bieb., Н tauricum Pall., H. razoumowianum Helm, et Fisch., а к секции Leiolobium — Н. cretaceum Fisch.

Ф.К. Маршалл фон Биберштейн во «Flora Taurico-Caucasica» (1819) описал целый ряд видов копеечников с территории Крыма и Кавказа: Hedysarum argenteum М. Bieb., Hedysarum buxbaumii M. Bieb. (= Onobrychis circinnata Desf.),

Hedysarum caucasicum M. Bieb., Hedysarum ibericum M. Bieb., Hedysarum pseudalhagi M. Bieb. (= Alhagi maurorum Medik.), Hedysarum sericeum M. Bieb.

Б.А. Федченко первым среди русских ботаников попытался обобщить все известные к тому времени данные по морфологии и систематике копеечников и предпринял попытку пересмотра видовых границ, говоря о необходимости соединения в один вид нескольких морфологически различных форм, которые раньше принимались за самостоятельные виды, если между ними не наблюдается константных различий (Федченко, 1902). Большой научный интерес для него представляли изучение вариаций в пределах одного и того же вида, описание изменений, вызываемых внешними причинами или индивидуальной изменчивостью и выяснение, насколько постоянными являются те признаки, которые считались диагностическими для внутриродовых таксонов разного ранга. В своей монографии Б.А. Федченко (1902) разделил род на 7 секций. Секция Multicaulia Boiss. включала 32 вида, в том числе Н. gmelinii Ledeb., Н. razoumowianum, Н. tauricum, Н. cretaceum. К секции Subacaulia Boiss. Федченко отнес 11 видов, из которых в настоящей работе рассматриваются Н. grandiflorum, Н. biebersteinii Zertova (= Н. argenteum М. Bieb.),//. candidum,H. argyrophyllum.

Во «Флоре СССР» (Федченко, 1948) род разделен на 7 секций в соответствии с предложенной им системой на основании признаков жизненной формы, вегетативных и генеративных органов. Все восточноевропейские степные виды рода принадлежат к секциям Multicaulia и Subacaulia.

Во «Флоре Европейской части СССР» (Васильева, 1987) копеечники подразделяются на три секции, что связано с меньшим числом видов этого рода, распространенных в Европейской России: Gamotion Basin., Multicaulia и Subacaulia. К секции Multicaulia относятся Н. gmelinii, Н. razoumovianum, Н. cretaceum, Н. ucrainicum и Н. tauricum; к секции Subacaulia - Н. candidum, Н. grandiflorum, Н. argyrophyllum, Н. biebersteinii. Некоторые из них приводятся другими авторами из соседних с европейской частью России территорий.

Так, для флоры Казахстана М.С. Байтенов (1961) указывает 38 видов Hedysarum, в том числе и Н. grandiflorum. В работе есть указания, что этот вид

может иметь различные оттенки цвета венчика, рассматриваемые этим автором в ранге разновидностей - желтый (var. sulphureum В. Fedtsch.) или пурпурово-фиолетовый (var. violaceum В. Fedtsch.).

В «Определителе высших растений Северо-западного Кавказа и Предкавказья» И.С. Косенко (1970) приводит 4 вида: Н caucasicum Bieb., Н. tauricum, Н. candidum и Н. biebersteinii (последний под названием Н. argenteum).

Еще Б.А. Федченко (1902) обратил внимание на то, что некоторые виды секции Subacaulia довольно тесно связаны с видами других секций, в особенности, Multicaulia, на что указывает, например, развитие небольшого удлиненного стебля у Н. grandiflorum subsp. sericeum MB. и H lehmannianum subsp. caulescens Bunge. В характеристике секции Multicaulia он обращает внимание на существование переходов между видами этой секции и секций Subacaulia и Obscura. По мнению Б.А. Федченко, группа Subacaulia представляет собой более молодой тип, развившийся путем укорачивания осевых органов из форм, имеющих хорошо развитые стебли -Н. candidum, Н. grandiflorum

В последней по времени таксономической ревизии рода Hedysarum (Choi and Ohashi, 2003) была предложена новая система рода, отличная от наиболее широко распространенной системы Б.А. Федченко (табл. 1).

Как видно из таблицы 1, ряд секций рода Hedysarum,принятых в системе Б.А. Федченко, в системе Choi и Ohashi объединены или перенесены в другие роды. В частности, секции Multicaulia, Crinifera и Subacaulia в новой системе объединены в одну секцию Multicaulia. Понижение их ранга до подсекций обосновывается сходством входящих в них видов по строению цветка, семян, пыльцы (Choi, Ohashi, 1996) и анатомическим признакам (Choi et al., 1999).

Таблица 1. Таксономические и номенклатурные изменения в системе рода Hedysarum по В. Choi и Н. Ohashi (2003)

OeaneHKO, 1902 Choi, Ohashi, 2003

Hedysarum Sect. Spinosissima -► (= Sect. Hedysarum) Sect. Obscura -► Sect. Multicaulia -► Sect. Crinifera -► Sect. Subacaulia -► Sect. Membranacea -► Sect. Fruticosa -------- Stracheya ——______ K Corethrodendron - ' Sulla Hedysarum Sect. Hedysarum Sect. Multicaulia Subsect. Multicaulia Subsect. Crinifera Subsect. Subacaulia Sect. Membranacea Sect. Stracheya Corethrodendron

1.2. Гипотезы об эволюции копеечников секции МиШсаиНа

Эволюционные связи восточноевропейских видов секции МиШсаиНа, Н. исгттсит, Н. ^пеНпп, Н. (аипсит и Н. сШасеит, рассматривались Б.Ф. Кашменским (1905) и П.Л. Горчаковским (1969). Кашменский отмечал близость Н. gmelinii и Н. гагоитоугапит по морфологическим признакам, указывая на их родство в связи с общим географическим происхождением и связями с одним из центров разнообразия видов секции МиШсаиНа (Федченко, 1902). Н. исгттсит рассматривается им как вид, занимающий промежуточное положение в ряду ксероморфизации видов этого цикла при продвижении �