Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кооперация процессов модификации липидного компонента мембран лимфоцитов при инициации фосфоинозитидного цикла

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Кооперация процессов модификации липидного компонента мембран лимфоцитов при инициации фосфоинозитидного цикла"

РГ6 од

1 9 ноя 1э!)3

J НАЦИОНАЛЬНАЯ ШЩШЯ НАУК АЕЛЕШШ ИНСТИТУТ БИОХШШ им. Г.Х. БУНЯГЯНА

На правах рукописи

Асагрян Лмана Юрьевна

УДО 577.125:577.151.042

ОШЕРАЦШ ПРОЦЕССОВ МОДИФИКАЦИИ ЛШИДЕЮГО КОШОНШТА ЕМЕРАН ЛИЖЩИТОЗ ПРИ ИНИЦИАЦИИ ФОСФОИНОЗИТИДНОГО ЦИКЛА

03.00.04 - Биохимия

Автореферат

диссертации на соисканиэ ученой степэяи кандидата биологических наук

Ереван- 1993

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии HAH Армении, в лаборатории биохимии липидов.'

Научные руководители:

член-корр. HAH Армении, доктор биол. наук, профессор Каратезян К.Г.

кандидат биол. наук Тадевосян Ю.В.

Официальные оппоненты:

доктор биол. наук, профессор Агадаанов М.И.

доктор биол. наук, профессор Геворкян Э.С.

Ведущая организация - Ереванский зооветеринарный

институт

Защита диссертации состоится " / " 1993 г.

в /3 часов на заседании специализированного совета Л 005.15.01 по присуждению ученой степени доктора биологических наук при Институте биохимик HAH Армении.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии..

Автореферат разослан "/!9" . 1993 г.

Ученый секретарь спец. совета, проф.

- 3 -

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Интенсивные исследования обмена ¡осфоинозитвдов (ФИ-ов), проведенные в последние два десятиле-'ия на самых разнообразных типах клеток, привели к формировать понятия о так называемом ФИ-цшсле, как одной из двух ос-:овных и универсальных систем, действующ* на уровне плаэмати-:еокой мембраны (ПМ), обеспечивая транемембранную передачу яешних сигналов различной природы. Инициация Фй-цикла приво-;ит к активации ключевого фермента - ФИ-специфичной фосфодиэс-еразы (ФИ-ФДЭ), катализирующей реакцию расщепления минорных шщщшх компонентов мембранного бислоя - поли-ФИ (ПФИ) с об-йзованиеьц двух вторичных посредников - инозит-1,4,5-трифосфа-а (ИФ3) и 1,2-диацилглицерина (1,2-ДАГ), вызывающих, соответ-твенно, высвобождение внутриклеточного запасного Са (Berridge .J., 1984 ) и активацию протеинкиназы С ( Hishizuka Y.,1984). риводя к формированию разнообразных клеточных ответов."

Известно ( King s.b.,1988), что через ФИ-цинл осуществляйся дейотвие многих антигенов и митогенных лектинов на Т-лим-юциты. Изучение механизмов активации Т-двд$оцитов и других щунокомпетентных клеток, особенно связанных с ранними этапа-щ транслокации внешнего сигнала через ПМ, является одной из ажнейших задач не только современной биохимии, но также тщ-ологии и медицины.

Однако, на сегодняшний день остаются проблематичными моле-улярные механизмы, обеспечивающие передачу внешнего сигнала от ецепторных белков к ФИ-ФДЭ. В этой связи заслуживают внимания е только белок-белковые, но и липид-белковые взаимодействия, днные как литературы последних лет (Hozawa Y.et.al,199l,Meuer i. & Reach К.,1989 ), так и исследований, проведенных в лабо-атории биохимии липидов Института молекулярной биологии НАН А (Тадевосян Ю.В. и др., 1987), свидетельствуют о существова-ии тесной взаимосвязи между различными фосфолипидными (ФЛ) ракциями, а также продуктами их метаболизма и трансмембранной ередачей внешних сигналов. Отмеченные процессы включают быст-опротекавдие (в течение сек), обратимые и взаимосвязанные из-внения активности широкого спектра ферментных систем обмена ФЛ.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось

изучение молевуяярных механизмов активащи и кооперирования ферментных систем обмана на ранних этапах митогэяной шшцнации " -Kí-гщкла лимфоцитовÍ ■ 4.. ,

В задачи рабою входило; I. Изучение законоиарностеЗ шштвнзя щ распределения различных шченцх првдшестввеников §1 вШ интактннх тишцатов крыс н JüCjJBorprroa периферической кровн человека (ЛПКЧ). 2« Иссдэдоваше дзяамввя активация Ш-фДЗ изучаешх типов юштое в теченкэ 5-Ш oes посла действия магогеяов кошсанавалина А (КонА) i? иятбряейк1ша.-2 (ВД-2) .* Уточнениэ оптимальных условий дая проявления антЕвноатя отмеченного фвршята. 3. Выявление кооперативах взаншсвязей ^вкцаонЕрованзщ ферментных сесх-ои обгона Ш н ьштогенной активации Щ-ФДЗ в от-шченянэ сроки вницвацни EI-циаяа лпгфщитов.* Нз?чная новизна и практическая ценность. При изучении специфики вкятения к распределения маченах кирншс кислот (ЖК) в &Д кэмбран в условиях добавления в инзубацконную среду лизофос-фйтвдшшмшна (JISI) ш лпзофосфатЕдюинозЕта (МИ) - субстратов джя ащдтраясфвразных реакций, выявлена относительная стабильность зрелых ШПСЧ к регулируемой иодафшщии ЖК состава мембранных № во сравнение с тншщиташ крыс. Наиа сформулировано понятие штаболяческого статуса биологических мембран, внлзз-чаацее совокупность устшозлгояэдгогся и еохрашшщкся (в продол-панно различных этапов данного функционального состояния) в динамическом равновесия качественно-количественных, стрргаурно-функциональнах, обаенных и пр. параметров указаниях структур.1

В Щ кяе ШКЧ, так и тшещегов крыс наш впервые обнаруге-¡:а двухфазная однотипная антивация ФИ-ФДЭ с максивдмата на 5 и 60 сек стщулявдк клеток КояД.. Показано коррелщ?рщеэ с активацией откаченного фермента усиление процессов дзадллнровашы фос-фатидалхолннов (SI), обеспечиваемое каскадной фераенткой сноте-шй фосфояшшза Aj- (ФЛаза Aj) - лизо-ФЛаза (ЛШДаза). В арахвдо-нат- (АК) и палшитат (ПК)-кодифицированных лиьфзцитах наряду с быстрой активацией процесса деацалнровашш ФХ показано параллельное Функционирование пути взаимопревращений фосфатвдилсернн (<5С) фосфатйдилэтаноламнк (ФЭ) Ш. С первых сек действия лвктина на лшл^оциты выявлена также коррелирующая с вншеотмачея-•пм чатабатлз:лом ФХ активация процессов ацшшрования этого <М

^азлпшла «ечэншш НС,

Вперзыо показано ьшогократяоэ увеличение количества продукта лпиопеагоназноЗ "(ЛОГ) реакции, 5-гицроксиэйкозатетраенозо5-кеолоты (5-НЕТЕ), на 5 и 30 сея действия КонА, коррелирующее с динамикой как деацшгарованпя ФХ, так н изменения уровня тригли-цэрядсв (ТГ), внступгЕЦих в роли прокедуточных "депо" дал свободной Жi

Следовательно,- мозно заключить о существовании в бислое бко!лэ1йран лгг.троцнтов относительно автоко?гного иор^о-функциозазь-пого лтгопроТзияового докеяа ФИ-цикла, кодзгонеятадст которого по-шко уно известных белковых т:олекул, являются лшщщше Фракции п ферментные систегы их обмена.

Полученные результата дополняют известные на сегодняшний день данные о тонких молекулярных гехаянз.улх, легален в основе трансглзпбранной передачи внешнего сигнала через ФИ-цикл. Обнаружение столь ранних, быстрых и обратимых изменений в лшаднои метаболизм щгтогея-сткгулпровашшх лщБоцитов наряду с ::с следованиями других клеток свидетельствует об универсальности вы-неотмеченных мембранных процессов при активации многих эукарио-тических клеток различиями внепнгаа! сигналами. Исходя из теории о ПМ как первичной "мииеян" действии широкого крута патогенна факторов, результаты данной работы когут иметь важное практическое значение как для выявления нарушений обнаруженных нами закономерностей лншдного кетаболизка, протекающих параллельно с инициацией Ш-цикла при различных патологических состояниях организма, так и для изыскания путей и средств их коррекции.

Алробалия работа. Материалы диссертационной работы были до-лонены на конференции молодых ученых и специалистов р-на 26 Комиссаров г. Еревана, 1990 г.

Работа апробирована на заседании Ученого совета Института молекулярной биологии ПАН РА от 29 июня.1993 г.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 3 научные работы.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, изложения и обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (154ссылок, в топ числе 142 яа английском языке). Работа изложена на 129 стр. машинописного текста и включает 24 рисунка а 2 схемы,

- 6 -

МАТЕРИАЛ и жщщ ИССЛЕДОВАНИЯ

ЛПКЧ и тимоциты крыс ввделяли согласно общепринятым методикам (Innés J. et.al, 1979 ). Интактность клеток, определяемая окрашиванием трипаяовым синим, составляла более 90$.

Примеченные соответствующими радиоактивными липвдаш и их предшественниками (1-стеарошг-2-[Г-^ф-арахадонил-ФХ, сп. акт. 50,3 мКи/ммоль; [г-^инозит, сп. акт. 22,8 Ки/ммоль; [l--^Ç]-AKf сп. акт. 56.6 мКи/ммоль; I-^C-олеоил-КоА, сп. акт. 52 мКи/ ммоль; [1-^(|-пальмитош1-КоА, сп. акт. 54 мКи/ммоль) клетки (Ю 10^ клеток в мл) стимулировали КонА (2 и 10 мкг/мл) или ИЛ-2 (40 Ед/мл). На 5, 10, 30, 60 сек реакцию осгаяовливали 2 мл холодной смеси хлороформ-мегаяола (1:2). В экспериментах с клетка ми без предварительного мечения радиоактивный субстрат добавлял к суспензии клеток в среде (контроль) или в смеси с внешним сиг налом (опыт).

Экстракцию M и нейтральных липидов (НЛ) проводили по мето ду Влай и Дайера (Bligh E.G. & Dyer ff.i., 1959 ). ФИ-ы экстра гировали согласно Фюэ и Таи (Puse I. & Tai H.H., 1987)«

ФЛ разделяли одномерной одноэтапной TCI в системе раствори телей хлороформ-ацетон-метанся-уксусная кислота-вода (6:8:2:2:1 или хлороформ-метаяол-уксусная кислота-вода (25:15:4:2), а фрак ционироваяие НЯ проводили в системе пегролейный эфир-диэтиловыЕ эфир-ыуравышая кислота (30:20:1). Одновременное разделение фракций Ф1 и HJI каждой пробы производили с помощью одномерной двухэтапной ТСХ.

Для фракционирования ФИ-ов пластины, импрегнированные 1% К-оксалатом, пропускали либо в системе хлороформ-метанол-аммиаз (43:38:12), либо хлороформ-ацетон-матанол-уксусная кислота-вода (40:15:13:12:8).

Инозитфосфаты (ИФ-ы) разделяли методом ионообменной хроматографии, разработанным Беррицжем (Berridge M.J., 1383).

Распределение радиоактивности идентифицированных в парах йода липидных фракций определяли сканированием пластин ТСХ на приборе фирмы 'ïerthoid", ФРГ. Степень радиоактивности определяли на сцинтилляционном спектрометре 'koche-Bioelectronique", модель sL-4221, Франция,

Данные подвергали статистической обработке по методу Стыэ дента.

- 7 -

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ЕКЛКНЕНШ И РАСПРЕДЕЛЕНИЯ МЕЧЕНЫХ ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ ЛИОДОВ В ФОСФОЛШЩДАХ ПЛАЗИА-ТИЧЕСКИХ МЕМБРАН ИНТАКТНЫХ КЛЕТОК

Метаболические превращения липидныг молекул, связанные с активацией клеток внешними сигналами, могут бить выявлены, охарактеризованы и корректно интерпретированы только при наличии данных о полной исходной картине включения, топографии и количественного распределения радиоактивности зондов в отдельных лшидных фракциях ГОЛ интактных клеток в состоянии покоя.

Инкубация суспензии тимоцнтов крыс в среде НШ с [%]-инозитом показала включение метки во фракции фосфатидшшнозита (ФИ), фосфатвдилинознт-4-фосфата (ФЙ-4-Ф), фосфатидилинозиг-4, 5-дифосфата ('511-4,5-^2^ и ®И, составлящее соответственно 87,6; 4,7; 5,4 и 2,2% от сутагы включенной радиоактивности.

По своей функциональной значимости в жизнедеятельности клеток особое место занимает метаболизм АК, что и предопределило более детальное исследование 'особенностей ее включения и распределения в мембранных липидах. Количественный анализ ФЛ состава [^с]-АК-мвченых тикоцитов крыс, инкубированных в средах EPMI и Игла, показал возможность избирательного включения метки преимущественно в определенные фракции Ш-ношонента биомембран, Так, в зависимости от наличия в инкубационной среде акцепторов свободных Ж для ацилтрансферазных реакций ЛФХ или ЛЕИ около 80$ общей радиоактивности включенной АК было обнаружено во фракциях ФХ и ФИ.

Исследование распределения [14с]-АК в ФЛ мембран ЛПКЧ показало включение мотки главным образом в количественно преобладающую во внешнем мояослое мембран фракцию ФХ, независимо от наличия в инкубационной среде лизо-ФЛ (ЖД). Аналогичная закономерность включения Ж в ФХ фракцию лим$оцитарных мембран обнаруживалась и при использовании для предварительного меченая клеток КоА-эфиров олеиновой (OK) и пальмитиновой (ПК) кислот, что составляло, соответственно, 49 и 53,4$ от суммы радиоактивности всех ФЛ. В случае [14С] -пальмитоил-КоА примечательно наличие 15$ метки во фракции ФС. Обнаруженные закономерности включения и процентного распределения в ФЛ отдельных меченых IK при инкуба-

ции в течение I ч не претерпевали существенных изменений вследствие применения различных инкубационных сред. Добавление в последние строго контролируемых одинаковых количеств лишйушх метаболитов в течение определенного периода инкубации приводило к установлению практически идентичных (по показателю % соотношения лгшвдов) стационарных состояний в метаболическом статусе ПМ отдельных клеточных популяций, определяемое наш как совокупность устанойливащихся при различных состояниях клеток и находящихся в динамическом равновесии качественно-количественных, структурно-функциональных, обменных и пр„ параметров указанных структур.

Исходя из вышеизложенного, а также специфичности как асимметричного распределения различных М фракций в бислое мембраны, так и процессов эстерификации насыщенными и ненасыщенными Ж эти франций в мжрооружении белковых молекул, можно предположить существование в ПМ отдельных морфо-функциональных на просто лшидных $1огас5гИоуа а. в. ей &1, 19в6 ), а липопротеиновых доменов, в целом определяющих метаболический статус мембраны. В согласии с этим полученные нами данные свидетельствуют о белее жестком контроле относительного постоянства доменов в покоящихся дифференцированных клеточных популяциях, чем и объясняется обнаруженное нами свойство большей стабильности и консерватизма зрелых Ж1КЧ к регулируемой модификации ЖКсостава мембранных ФЛ в состоянии покоя по сравнению с гетерогенной фракцией тимоцитов крыс с высоким содержанием бластных клеток.

Таким образом, можно предположить, что любое внешнее воздействие на клеточную мембрану в первую очередь модулируется через быстрые и обратимые модификационные изменения липвдного составляющего доменов с локальными сдвигами в их физико-химических свойствах, обеспечивающими нормальное функционирование белковых молекул, ответственных за протекание определенных функциональных процессов. Действительно, результаты экспериментов по включению и распределению использованных наш меченых Ж в ЛПКЧ в присутствии митогвнного внешнего сигнала выявили изменение метаболического статуса ФЛ компонента мембран. Так, наличие в инкубационной среде митогенного лектина КонА приводило (рис„ 1а) к понижению уровня АК почти во всех фракциях мембранных ФЛ с более пыраленным эффектом, в основном, для Ж. Доминирование процессов катаболизма данной фракции под действием КонА при I ч инкубации

наблюдалось и в случае пресечения ФЛ ПК (рис. 16). Однако, при этом обнаруживалось значительное увеличение уровня включенной . метки в ФС фракцию. В случае же премэчения ЛПКЧ ОК наблюдалось превалирование процессов ацилирования всех исследуемых ФЛ (рис. 1в) с многократным увеличением количества радиоактивной метки во фракции ФЭ.

Сопоставление полученных нами экспериментальных данных с литературными позволило сделать вывод о возможном вовлечении в, первичные модификавдонные процессы биомембран наряду с ФИ, тагске и ФХ, ФЭ, ФС фракций при воздействии- на клетку митогенного

<Р< 0,1 «,Р< 0,05

*#*Р < 0,02

« «**Р< 0,004

п- ги

»*

пй

Мй.

Гй.

р>1

АФХ С9Н Ф1 ФИ Ф! АФИ СФН в» ФС

96

ЛФХ ФХ ФИ Фо ФЭ

Рис. I. Действие КонА (О) на процентное распределение радиоактивности АК (а), ПК (б), 0К (в) в ФЛ фракциях мембран ЛПКЧ при I ч инкубации,

внешнего сигнала.

ИССЛЕДОВАНИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ ДИНАМИКИ АКТИВАЦИИ ФОС-ФОДИЭСТЕРАЗНОГО РАСЩЕПЛЕНИЯ ФОСФОИНОЗИТИДОЗ И ЕЕ ВЗАИМОСВЯЗИ С ПРОЦЕССАМ ДЕАЦИДИРООАНИЯ .ЖДБРАННЫХ ФОСФАВДИЛХОЖЮВ ПРИ ШТ0ШШ0Й СТИШ1ЯЦИИ ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА И ТИЮЦЙТ0В КРЫС

Согласно немногочисленным литературным даннш ( Бгшшпопа' А.Н., 1986), увеличение количества внутриклеточного Са^" вследствие инициации ФИ-пути передачи внешних сигналов, начинается

1«

2

- 10 -

после первой сек активации клеток и достигает максимума через 6-8 сак. При этом, если образование й£3 происходит без lag периода, то первичный кальциевый ответ отстает от последнего по крайней мере на I сек (Bexridge м.J., 1983).

Исходя из вышеизложенного была проведена серия экспери-

но

ш

«с

ич;

г«ри

OS 10

Рис. 2. Изменения количества метаболитов ФДЭ реакции в динамике действия КонА. (2мкг/мл) на [%]-инозит-меченые ШИ,

ментов по изучению закономерностей как активации процесса ди-зстзразного расщепления ФИ-ов, так и его взаимосвязи с реакцией деацшщрования ФЛ мембран ЛПК? и тимоцитов крыс в течение 60 сек после ияицияции ФИ-цикла мдтогенннми внешними сигналам] При прямой и корректной оценке активности ФИ-ФДЭ в исследовании динамики активации данного фермента в условиях инициации ФИ-цикла на [3Н]-инозит-меченых ЛПКЧ-Е тимоцитах крас, 6hj обнаружено (рис. 2) повышение содержания всех метаболитов ФДЭ

расщепления ФИ-ов ([3Н]-ИФ1, [3Н]-ИФ2, [3н]-ИФ3) уже на 5 сек действия КонА на ЛПКЧ, Еоли повышение уровня и ®2 продолжалось до 10 сек эксперимента с последующим спадом на 30 и 60 сек, то динамика изменения количества ИФ3 имело двухфазный ха-

а

Рис, 3. Динамика изменения количества [%]-ИФ-ов (а) и [3Н]-ФИ-ов (б) при КонА-иццуцироваяной активации ФИ-ФДЭ [%]-инозит-меченых тимоцитов крыс.

рактер с начальным пиком на 5 сек и вторичным увеличением его на 60 сек. Своеобразна также динамика изменения количества глицерофосФоинозита (МИ), содержание которого после резкого уменьшения на 50% (5 сек) под действием КонА, возрастало то

170$ (10 сек) и оставалось выше исходного в течение последующего времени наблюдения. Диаметрально протшгополоаные сдвиги ё содержании данного метаболита на 5 и 10 сек инициации ФИ-цикла может быть следствием изменения активности отдельных компонентов ферментной системы даацилирования-реацилирования фракции ФИ.

В идентичных условиях эксперимента под действием митогена

л с г

о

•10

0 5-ю за

«о

СЕК.

Рис. 4. Изменение в содержании 1,2-ДАГ и 2-МГ в [^С]-АК-меченых ЛПКЧ в течение 60 сек после инициации ФИ-цикла 2 мкг/мя КонА..

в [%]-инозит-меченых тимоцитах такке наблюдалось (рис. За) повышение уровня всех вышеотмеченных продуктов ФДЭ расщепления ФМ-оз. Примечательно, что динамика изменения содераания ИФ3 строго соответствовала таковой, обнаруженной в ЛПКЧ.

На фоне вышеизложенного, в ПМ тимоцитов под действием КонА наблюдалось параллельное уменьшение содержания липвдных фракций [%]-ФИ-ов, возможных субстратов ФЙ-ФДЭ. Однако, четкая корреляция между динамиками высвободцения продукта и рас-

- 13 -

пада соответствующего субстрата наблюдалась только для ИФ3 и Ф1Й>2 • Уменьшение же содержания ФИ и ФИ-4-Ф объясняется не только активацией компенсаторных механизмов, обеспечивающих фосфо-рилирование их до $11-4,5-^2• Эти сдвиги, а также Изменения количества 1Ш (см. выше) подтверждают данные литературы ( Biliah м.м. & Lapetina e.g., 1982 ) о существовании гетерогенных пулов ФИ-ов, подвергающихся различным метаболическим превращениям.

Обнаруженные нами сдвиги в количестве Г-ацил-2- [^с] -ара-хвдонил-ДАГ, второго првдукта ФДЭ реакции, в течение 60 сек инициации КонА ФИ-цикла в ЛПКЧ, пресеченных [I4Cj-AK, выявили (рис, 4) их идентичность с таковыми для ИФ^ в [*%]-инозит-ме-ченшсШКЧ и тимоцитах крыс. Параллельное повышение при этом уровня [^фарахвдонил-моноглицерида (Г/Г) только на 5 сек наблюдения и в отсутствие (рис, 5) распада триглицервдов (ТГ) может быть следствием усиления, активирующегося вслед за ФИ-ФДЭ, ДАГ-липазного пути высвобождения свободной Ali. Четкая корреляция динамики образования ИФд и 1,2-ДАГ с таковой ФДЭ гидролиза

свидетельствует о том, что последний является первичным (предпочитаемым) субстратом ФИ-ФДЭ в лимфоцитах при ми-тогенной инициации ФИ-цикла. Аналогичные данные о двухфазной активации ФИ-ФДЭ ранее были получены наш (Тадевосян Ю.В. и др., 1992) при исследовании действия К+-деполяризации на [I4Cj-АК-меченые синаптосомы мозга крыс. Идентичная с КонА активирующая способность на ФИ-ФДЭ ЛПКЧ VJ1-2 (данные не приводятся) позволила сделать вывод о том, что действие этого межклеточного медиатора на лимфоциты также осуществляется Фй-путем.

Суммируя вышеизложенное модно заключить о быстрой (5 сек) стимуляции активности ФИ-ФДЭ в лимфоцитах, Выявленная наш впервые однотипная динамика высвобождения продуктов диэстеразного расщепления ФИ-4,5-Ф2 при инициации ФИ-цикла в отличающихся по своим морфо-функциональным характеристикам неточных популяциях (ЛПКЧ, тимоциты, синаптосомы) под действием различных первичных сигналов (КонА, Ш-2, К+-деполяризация) свидетельствует об универсальности механизмов, регулирующих протекание начальных, скоротечных этапов активации различных клеточных популяций разнообразными внесшими сигналами, В качестве инициирующего этапа в каскаде трансмембранной передачи сигнала выступав" первичная активация ФИ-ФДЭ с максимумом на 5 сек стимулят;:.-

клеток (что хорошо согласуется с вышеприведенными данными литературы о времени мобилизации внутриклеточного запасного ), регулирующаяся, по всей вероятности, внутримембранными 'механиз-{¿ами, обеспечивающими нормальный процесс передачи сигнала от рецептора к усилительному ферменту, В этой связи в дальнейших наших экспериментах по изучению лшшдного метаболизма ПМ лимфоцитов особое внимание уделялось изменениям, происходящим в течение первых 5 сек активации клетокс

¿со

С

О <60 о.

а:

о »

о\

<60 НО

ив

100 ао 6И

1

М

л

о + эгта

хг

т

м.

т

ок. 4

АК- 1 4

Рис, 5. Сдвиги в содержании НЛ ЛЕПСЧ, премеченных [^С]-АК (а) и [14С]-0К (б) на 5 сек действия КонА в среде Игла, содержащей 5 мМ ЭГГА (Ш, 1,8 мМ Са2+ (□) и 5 мМ Са21" (И): I -МГ, 2 ~ 1,2-ДАГ, 3 - 1,3-ДАГ,

4 - ТГ.

Предварительный анализ экспериментальных данных, приведенных в предыдущем параграфе, об изменении специфики включения различных меченых ЕК в мембранные ФЛ под действием КонА. позволил предположить о параллельном с Фй-циклом функционировании такае ферментных систем деацилирования отдельных липвдных фракций.

Исследование изменений количества отдельных фракций НЛ на

5 сек инициации цикла показало доминирование процессов катаболизма ^С] -АК- и [^4С]-0К-меч9Ных ФЛ диэстеразным и деацилаз-

I

- 15 -

ным путями, соответственно (рис. 5а,б). Если добавление 5 мМ Ca2f в среду Игла, содержащей 1,8 мМ Са^+ , приводило к досто-г верной активации процесса(ов) деацилирования ОК-модифицирован-ных ФЛ на 5 сек стимуляции КонА ЛПКЧ, то двухкратное (по сравнению с исходным) повышение уровня 1,2-ДЛГ в АК-модифицирован-ных клетках значительно снижалось как под действием 5 iuM ЭГГА, так и при добавлении о среду 5 мМ Са^". Исходя из подученных результатов могло утвервдать об абсолютной Са2+-зависимости . процесса(ов) деацилирования и о наличии узкого интервала концентраций этих ионов, оптимальных для активации ФИ-ФДЭ. Обнаруженное нами 10^-ное повышение уровня свободной АК (рис. 5а), при наличии в клетках известных механизмов быстрой ее утилизации, позволило предположить об усилении процессов катаболизма АК-меченых ФЛ также и деацилазным путем»

Имеющиеся в настоящее время данные литературы (Молотковс-кая И.М. и др., 1985) свидетельствуют о количественном изменении ФХ при стимуляции лимфоцитов, приводящем к вытеснению ее из микроокружения рецепторных и других мембранных белков с максимумом на 2 мин после действия КонА. В [х С]-АК-меченых тимоци-тах крыс, в которых в присутствие в инкубационной среде ЛФИ обеспечивало включение метки в ФИ и ФХ, соответственно на 80 и 10%, нами были исследованы количественные сдвиги как диэстэ-разного, так и деацилазного метаболитов отмеченных ФЛ фракций на 5 и 10 сек действия КонА. Быстрое диэстеразное расщепление ФИ-ов с повышением (на уровня 1,2-ДАГ на 5 сек активации тимоцитов в среде Игла коррелировало (рис. 6) с усилением процесс а(ов) деацилирования арахцдонил-ФХ, приводящего к накоплению как р^С]-арахвдонил-ЛФХ (20%), так и некоторого детектируемого количества [14С]-АК.

Известно (Брокерхоф X., Дженсен Р., 1978), что прямое деа-цилирование мембранных ФЛ обеспечивается начальной активацией ФЛаз Aj или Ag, осуществляющих высвобождение насыщенной и ненасыщенной Ж, соответственно из положений C-I и С-2 молекулы глицерина. Данные о наличии в ПМ лимфоцитов ФЛазной активности типа А2 неоднозначны (Goppelt-Strube М. & Reach К.,1987,Trotier J. & Perber Е., 1981 ), а относительно идентификации ФЛазы Aj отсутствуют.

Исходя из специфичности эстерификации свободной АК исклю-

чительно во втором положении глицеринового остова ФЛ, образование под действием КонА 2-арахццонил-ЛФХ, прямого продукта ФЛазы

О л.

в среде с высоким содержанием Са (подавляющим ЛФЛазную активность) свидетельствует о наличии в ПМ тимоцитов подобной активности, '¡ункционирующей при мигогеяной инициации ФИ-цикла. Под действием парабромофенацилбромида (пБФАБ), специфического ингибитора активности ФЛазы ¿2 (;РегЪег Е» 19во ), наблвдалось параллельное подавление образования продуктов как ФДЭ расщеп-

Рис. 6. Изменение содержания продуктов деацшшрования ФХ фракции и ФИ-ФДЭ реакции на 5 и 10 сек действия 2 мкг/мл КонА на [5%]-АК-меченые тимоциты, инкубированные в среде без (—) и с добавлением (—) пБФАБ. Прединкубацию клеток с 100 ыкМ пБФАБ проводили в течение 15 мин. ления ФИ-ов, так и деацшшрования ФХ, что позволяет утверждать о кооперативном функционировании ФИ-ФДЭ и деацилаз при митоген-ной инициации ФИ-цикла.

Полученные наш данные позволяют предположить функционирование в ПМ лимфоцитов различных систем кооперативных цепей быс-

С вн.

Л

арык обменных взаимопревращений отдельных -М фракций и их метаболитов, регулирующихся в основном, аллостерическим механизмом отрицательной обратно;! связи. Естественно было предположить, что блокированием определенных звеньев в кооперативно'' цепи превращений ФЛ фракций и их метаболитов при стимуляции клеток -'Тонно но только подтвердить действительное ео -функционирование в ШЯ клеток, но и вдента?ицировать отдельные составляющие этой цепи.

*

»0-

70-

0 L •—i—i_i_i

Q5IO SO 60

СЕ«.

Рчс. 7. Изменение количества 1-стеароил-2- [^С]-арахи-донил-ФХ ЛПКЧ под действием 2 мкг/мл КонЛ в отсутствие (—) и в присутствии (—) 200 мкМ ПГ.

Наличие в инкубационной среде RMÍ 200 мкМ пропил галлата (ПГ), известного ингибитора ЦОГ и ЛОГ путей синтеза эйкозаноя-дов из свободной АК (Smith J.в. 'et.al, 1985 ) приводило к достоверному подавлению процесса расщепления ФХ в течение первой мин инициации ФИ-цикла ЛПКЧ со встроенными в их ПМ 1-стеароил-2- [14С] -арахвдонил-ФХ. Полненные результаты свидетельствуют в пользу предположения как о наличии в ПМ ЛПКЧ кооперативной цепи метаболизма ФХ, так и о возможности, связанной с процессом (ами) деацилирования отмеченной липвдной фракции, быстрой ак- . тивации эйкозаноид-сиктезирутащих ферментных систем. Последнее

предположение яодтнердллось обнаруженным (рис. 8) наш впервые двухфазным многократным повышенном уровня одного из ЮГ продуктов метаболизма АК •- 5-ПЕТЕ (с максимумами на 5 и 30 с-ек инициации ФИ-цикла), свидетельствующее также и о возможном з"гч';-чении этого метаболита в процесс активации различных компетентных клеток0

При уточнении пути ферментативного высвобождения Л:\ в ЖПГН в среде НРМ1 (0,43 м'Л Па ) наблюдалось (рис. 9а,б)однотипное (как и в случае активации ФИ-ФДЭ) действие КонА и ИЛ-2 на процессы деацилирозания Фракции ФХ. Повышение уровня свободной АК (при низко"; концентрации на 5 сек инициации ФИ-цикла кор-

? боо

«о

с

200

о 5 10

СЕК

Рис. 8. Динамика образования 5-ИЕТЕ в ных ЛПКЧ.

С о нА-ст имулирован-

релпровало с усилением распада как арахадоши-ФХ, так и 2-ара-хадонил-ЛФХо Присутствие в среде ПГ не приводило к повышению уровня свободной АК, что естественно было ожидать в условиях подавления Ц0Г и ЛОГ путей ее утилизации. Достоверное увеличение при этом только количества 2-арахидонил-ШХ на фоне повышения уровня ФХ свидетельствует в пользу функционирования в ПМ ЛПКЧ каскадной ферментной системы деацилирования ФХ, включающей ФЛазу А^ и ЛФЛазу, что било доказано и .для других мембранных структур (Батикян Т.Б., 1939). Функционирование отмеченной ферментной системы в ПМ лимфоцитов на начальных этапах их ми- ' тогенной стимуляции нами представляется биологически более целесообразным в плане осуществления ею необходимого уменьшения микровязкости лили,дного бислоя, обеспечивающего увеличение скорости латерального движения агонист-рецептерных комплексов.

Исходя из данных (Батикян Т.Б., 1989) об активирующем и

ингибиругацем действии 2,5 мМ Са2+, соответственно на, ФЛазу А£ и ЛФЛазу, была изучена роль различных (по содержанию в среде Са2+) условий инкубаций на выявленный нами процесс деацилирования ФХ

ФХ-меченнх ЛШСЧ, инкубированных в сродо КЙЯ без (О) и с добавлением ПГ (Е2).

сдвиги как в содержания арахидошл-ФХ, та!С и арахццоншг-ЛФХ при использовании трех вариантов иш^бационных сред (НЕШ, содержащей 5 мМ ЭГГА, 0,43 мМ Са2* и 2,5 Ш Са2и) под действием КонА, а такге полученные ранее данные (см. рис. 5), свидетельствуют. о Са21"-зависимости ФЛазн-А|-Ш-ЛПКЧ и тимоцитов крыс. Исходя из отого, в условиях нашего эксперимента было целесообразным применение среды Игла, содержащей близкую к оптимальной для вы- • неотмеченной активации ФИ-ВДЭ и деацилаз концентрацию Са2*.

- 20 -

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ КООПЕРАЦИИ НЕКОТОРъК ФЕРМЕНТНЫХ

СИСТЕМ ЛИПИДНОГО МЕТАБОЛИЗМА В ДИНАМИКЕ ШТОГЕШОЙ

АКТИВАЦИИ ФОСФОШОЗИТВД-СПЕЦИФИЧНОЙ Ф0СФ0ДИЭСТЕРАЗЫ В ЛИМФОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

Вышеприведенные экспериментальные данные свидетельствуют о специфической направленности метаболических превращений отдельных -липидных фракций ФЛ в зависимости от их Ж состава в условиях митогенной стимуляции ЛПКЧ. Исходя из этого, в последующих экспериментах особое внимание было уделено получению максимально полной картины качественно-количественных изменений функционально важных меченых ФЛ и их метаболитов, характеризующих активности отдельных ферментных систем.

Уменьшение уровня [^С] -АК-меченых ФИ на 5 и 60 сек действия КонА (рис. 10) явилось дополнительным подтверждением установленного наш процесса быстрой активации ФДЭ-пути расщепления ФИ-ов в связи с соответствием двухфазной активации ФИ-ФДЭ. Параллельно с этим наблюдалось усиление двухфазного катаболизма фракции ФХ с максимумами на 5 и 30 сек инициации цикла. Начальное уменьшение количества ФХ на 5 сек, сопровождавшееся одновременным повышением уровня 2-арзхидонил-ЛФХ, подтвердило факт активации каскадной ферментной системы деащли-рования ФХ ФЛаза А} - ЛФЛаза при стимуляции ЛПКЧ митогеном.

В связи с установленным фактом Са^1" -зависимости как ФИ-ФДЭ, так и ФЛазы А^ уточнение кооперированное™ реакций, катализируемых этими ферментами, при инициации ФИ-цикла КонА было проведено в присутствии ЭГГА в инкубационной среде Игла. При этом, в первые 5 сек действия митогена на фоне резкого увеличения количества ФХ и ФИ регистрировалось достоверное уменьшение фракций как ЛФХ (рис. 10), так и 1,2-ДАГ и 2-МГ (рис. II) при сравнении с контролем (без ЭГГА), указывающее на ингибиро-ваяие Са2+-зависимнх активностей ФЛазы А| и ФИ-ФДЭ, соответственно.

На основании этих данных можно предположить о существовании причино-следсгвенной связи процессов деацилазного и диэс-теразного путей расщепления различных фракций мембранных ФЛ. Преимущественное расположение молекул ФХ во внеинем монослое ПМ позволяет утверздать, что обнаруженная наш интенсификация процессов деацшшрования ФХ фракции либо предшествует, либо

происходит параллельно с начальной мембраносвязанной .фазой активации ФИ-ФДЭ под действием митогенного внеинего сигнала.

Данные литературы (Н1га*а Р. е1;.а1, 1980) о ко-стшдулирую-щем действии экзогенно добавленных ФС и лизо-ФС на*активацию тучных клеток КонА авторы связывают с интенсификацией процессов

тэ

160

450

130

420

О «о

95

фх

170-

Ф с

к р< 0,25 160** р< 0.05. * х*р< 0,001

150-

С.ЕК

Рис. 10. Динамика изменения количества различных ФЛ фракций -АК-меченых ЛПК?, стимулированных КонА. Эффект ЭГГА (—) на 5 сек инициации ФИ-цикла.

декарбоксилирования ФС, последующего метилирования ФЭ с поэтапным переходом образованных молекул ФХ в наружный монослой ПМ. Осуществление этих процессов было 'показано лишь на 5 мин действия КонА.

Исследование эффектов более раннего (в течение I мин) действия КонА. на АК-премеченные ЛПКЧ обнаружило (рис. 10) уменьшение количества ФС и ФЭ фракций (соответственно на 20 и $%) уже на 5 сек инициации ФИ-цикла, объясняемое как активацией процессов деацшшрования этих ФЛ, так и их межфракционных взаимопревращений по схеме: ФС ФЭ ФХ.. Добавление в инкубационную среду ЭГГА приводило к ингибированию процесса деацилирования ФХ, сопровождающемуся (рис. 10) еще большим уменьшением содержания фракции ФЭ с параллельным увеличением количества ФС по сравнению с контролем. Следовательно, исключая возможность гидролиза ФЭ фракции Са2*"-зависимой ФЛазой А^- ( Н1гага р. ег.а1, 1980 ), ЭГГА, не затрагивая процесс пополнении пула ФХ через трансметилирование ФЭ, приводит к частичному ингибированию процесса де-карбоксилирования ФС (возможно Са -активируемого), вероятно, по принципу отрицательной обратной связи, в результате резкого угнетения Са^-хелатором расщепления ФХ ФЛазой Ар

Таким образом, на основании полученных нами данных можно утверждать об активации кооперативных механизмов компенсации убыли ФХ из пулов ФС и ФЭ в результате их декарбоксилирования и поэтапного трансметилирования на мембраносвязанном этапе ми-тогенной стимуляции ЛПКЧ. Промежуточная же роль ФЭ в отмеченных взаимопревращениях и обуславливает зарегистрированные нами сравнительно слабо выраженные (в пределах 10%) изменения в содержании этой ФЛ фракции.

Исследованиединамики изменения количеств некоторых фракций НЛ митоген-стимулированных ЛПКЧ дополняет картину выявленных взаимосвязей процессов активации ФДЭ и деацилазного путей метаболизма ФЛ. Динамика изменения содержания 1,2-ДАГ и 2-Ш? (рис. II), обсуждаемая выше (стр. 13), подтвердила быструю двухфазную активацию ФИ-ФДЭ, Активация как ДАТ- и МГ-липаз, так и 2-арахидонил-ЛФХ-ЛФЛазы, компонента системы деацилирования ФХ, предполагала также повышение уровня свободной АК с первых сек стимуляции клеток. Однако, резкое увеличение содержания последней наблюдалось лишь на 10 сек действия КонА (рис. II). Выявленная однотипность динамики изменения ТГ (рис, II) с таковой 5-НЕТЕ, представленной выше (рис. 8), коррелирующей также с кривой распада ФХ, свидетельствует о действительном высвобождении АК уже с первых сек действия митогена и поз-

- 23 -

.воляет предполояить о возыоаном включении части этой-Ж во . фракции ТГ, выступающей в роли временного "депо" для ноэстери-фицированной АК, предотвращая ее накопление в ИМ ЛПКЧ.

Обнаруженная наш в ПМ ЛПКЧ каскадная ферментная система деацшшрования И (ФЛаза А-^ - ЛФЛаза), активируеьйя при стимуляции клеток КонА, предполагала расщепление этого ФЛ в первую

се«

Рис. II. Содержание фракций НИ и свободной АК в динамике действия КонА на АК-шчеша ЛПКЧ без (—) и в присутствии (—) Э1ТА на 5 сек.

очередь по пололэшт 0-1 молекулы глицерина о высвобождением насыщенной Ж» Исходя из этого, в условиях инициации ФИ-цикла КонА интересно было исследовать закономерности метаболизма ФЛ фракций ПМ ЛПКЧ, модифицированных насыщенной [^с]-ПК, которой обогащена ФХ фракция лимфоцитов в норме (Ъвъ±в в.м., 1976 ). •

Динамика изменения содержания [ С]-пальмитоил-ФХ в условиях митогенной стимуляции ЛПКЧ соответствовало (рис. 12) таковой [14С] -арахидонял-ФХ, подтверждая превалирование обнаружен- '

ных нами процессов катаболизма этой фракции ФЛ о максимумами на 5 и 30 сек активации клеток независимо от ее Ж состава. Увеличение количества свободной ПК на 5, 10 сек действия КонА

Рис. 12. КонА-иядуцированные изменения в содержании ФЛ фракций и овободеой ПК в течение 60 сек инициации ФИ-цикла [14С] -4Ж-меченых ЛПКЧ без (—) и в присутствии (--) пБФАБ.

указывало на начальный гидролиз молекулы ФХ тленно ФЛазой Aj. Динамика изменения содержания 1-[^С]-пальмитоил-ЛФХ, на иер^ вый взгляд, свидетельствует в пользу предположения о функционировании ФЛазной активности типа Ag на 5 сек активации ЛПКЧ митогеном. Однако, результаты экспериментов по предварительной обработке клеток пБФАБ, специфичеким ингибитором ФЛзаы Ag, показавши еще большее (хотя и не достоверное) истощение пула ФХ и увеличение содержания свободной ПК, исключают воз- ' кожность расщепления ФХ ФЛазой типа Ag на мембраносвязанном этапе транслокации митогеяного сигнала. Регистрируемое же на 5 сек повышение уровня 1-пальмиголл-ЛФХ монет быть результатом активации компенсаторных процессоа реацшшрования полностью деацилированной формы ФХ - Г$Х.

Сравнение количественных изменений пальмитоил-ФХ, -ФЭ, -ФС фракций (рис. 12) в динамике (5-60 сек) активации клеток с таковыми [ С]-арахидонат-меченшс ФЛ (рис. 10) выявило их идентичность за исключением увеличения количества пальмитоил-ФС на 5 сек активации ЛПКЧ КонА. Можно допустить, что паль-мзтоил-Ж) тагам подвергается аналогичным с арахздонил-ФС изменениям (имеется ввиду направленность их метаболизма) в течение указанного срока наблюдения, однако эти сдвиги экранируются обнаруженной наш способностью свободной ПК очень быстро (в течение 5 сек) включаться в пул ФС П!Л ЛПКЧ. Таким образом, наблюдаемое повышение уровня ФС фракции на 5 сек стимуляции клеток является следствием усиления процесса ее реэсте-рификации ПК, высвобожденной из ФХ фракции ФЛазой Aj. Об этом свидетельствует также увеличение количества ФС под действием пБФАБ, приводящего к еще больиецу (35$ по сравнению с нормой) повышению уровня свободной ПК. В этих условиях эксперимента если дальнейший (10 сек) спад в содержании ФС сопровождался более чем двухкратным приростом ФЭ, то последующее (30 сек) снижение уровня последнего - повышением содержания ФХ. Отмеченные метаболические сдвиги согласуются с вышеприведенными данными о быстрой активации ФС-декарбоксялазы и ФЭ-метил-трансфераз.

Итак, результаты экспериментов с [^С] -ПК-премеченными ЛПКЧ в целом подтверждают факт быстрой и кооперативной активации процессов деацилирования ФХ и взаимопревращения трех

близких по отроению М фракций на меыбраяосвязанном этапа инициации ФИ-цикла, При интерпретации некоторых экспериментальных данных, полученных, в частности, при изучении действия цЕЖБ на процессы дебетирования ЕС (и в тиыоцитах.и в ЛПКЧ) на фоне инициации ФИ-цикла митогеном, ш ограничивались только констатацией полученных фактов. Невозможность на данном этапе исследований объяснить некоторые аспекты как специфичности, так и механизмов действия этого ингибитора свидетельствует о необходимости проведения дополнительных специальных серий исследований для получения целостной картины взаимосвязанных

но 430 (11

. но 100

а

О 90 а

о ' и

О 220

уО

а"*

180 НО 100 60

но

<00

м

А

\

\

\

\

\1

90

1*0 <20 100 80 ¿0

i i

_/ К I_I_с_

-Д—

V

<1 I I.

1

Л 1\ I \ I \

\1 \ I V

О £10

за

_1 КI I I

60

о 5 т ¿о ео

ах

05« 10

а о б

Рис. 13. Динамика деацшшрования (—) и реацилирования (—) Ш. фракции КонА-стимулированных ЛПКЧ. а - [14С] -Ж, б - [14С]-ПК, в - [14С]-ОК.

и взаимозависимых обменных процессов в первые сек активации клеток.

- 27 -

Несмотря на наличие данных (РвгЪег е. е-ь.аг, 1976 ) об активации мембраносвязанной ацил-КоА:ЛФХ ацшггрансферазы в течение нескольких мин стимуляции лглг? сцитоа, в литературе отсутствует информация, касающаяся как садов ракплх изменений а активности этого фермента, так и возможной интенсификации про-' цессов ацшщровааяя лизо-производных ФЛ насыщенными ЖК. Полученные наш результаты об активации ФЛазн А- на 5 сек действия КонА на тимоциты и ЛПКТ позволило предположить о возможности ранней интенсификации процессов реацилирования образованного арахвдонил-ЛФХ.

Исследование кинетики накопления в ФХ фракции ненасыщенных (АК и ОК) и насыщенной (ЯК) ЖК выявило (рис. 13) противоположно направленные сдвиги при сравнении с соответствующей динамикой процесса деацилированш ФХ в определенные сроки инициации КонА ФИ-цякла. Примечательно, что динамики де- н реацилирования ФХ АК и ПК подчиняются одинаковым закономерностям с максимумами изменений на 5 и 30 сек действия мито;ена,.а в случае ОК они подвергаются выраженным сдвигам на 10 и КО сек стимуляции клеток. Обнаруженная наш корреляция мезщу процессами де- и реацшшрования ФХ представляет возможность рассматривать эти противополояно направленные метаболические пути как динамически уравновешанные стороны единого процесса, задействованного в механизме быстрой модификации ФЛ компонента ПМ. '

Исходя из выявленной наш взаимосвязи процессов де- ;г реацилирования ФХ и взаимопревращений ?С, ФЭ и ФХ фракций, в опытах по реацилированию интересно бнло одновременно проследить за количественными изменениями трех указанных фракций на 5, 1С, 30 и 60 сек активации ЛПКЧ КонА. --нарушенная нагл! очел^. ранняя активация ФЛазы А| и быстрое включение высвободившейся ПК в ФС фракцию под действием КонА лселушли основанием для проведения исследований процессов включения и распределения , С}-ПК в отмеченные ФЛ ПМ.

Изменение абсолютных уровней включения метки (в пмп/мпн) кал в отсутствие, гак и в присутствии в среде внешнего сигнала свидетельствует о роли ФС как "первичной мишени" для реакции эстерификацш [^с]-ПК. В отсутствие митогена уровень включения метки в отмеченную фракцию ФЛ уже на 5 сек более чем

на два порядка превышает таковые в ФХ и ФЭ фракциях. В последующие сроки наблюдения (10, 30 и 60 сек) количество метка либо оставалось на неизменно высоком (ФС) или низком (ФЭ) уровнях, либо резко падал (ФХ). Следовательно, наличие, в инкубационной среде любых неспецифических (рецептор-неопосре-дуемых) как свойственных (различные КК), так и несвойственных (везикулы ди-С-^.д-ФХ; неопубликованные данные) для ПЫ клеток веществ инициирует-протекание быстрых кодификационных процессов (в первую очередь де- и реацилировашя ФЛ), обнаруживающих защитную природу. Действие же на ЛПКЧ специфического, рецептор-опосредуемого (КонА) внешнего сигнала при наличии и неспецифического вносит свои коррективы в вышеотке-ченные модйфикационные процессы ФЛ 1Ш, проявляющиеся-в тенденции к повышению (5сек), резком понижении (10 сек), уравновешивании (30 сек) и, наконец, вторичном повышении (60 сек) уровней включения метки во все изученные фракции ФЛ. Эти сдвиги наиболее выражены для ФС и ФХ, наименее - для ФЭ фракции, что указывает большую чувствительность первых двух к действие ферментной системы деацшшрования-реацилирования в условиях митогеяной стимуляции ШКЧ.

Идентичность динамики изменения уровня включенной [^с] -ПК (% от контроля, т.е. без КонА) в ФС, ФЭ и ФХ фракциях свидетельствовала о наличии в Ш',1 единого механизма, регулирующего взаимопревращения этих трех ФЛ.

В условиях нарушения нормального метаболизма ФЛ ПМ под действием парахлормеркуробанзоата (пХМБ) наблюдалось достоверное понижение (5 сек) содержания ФС и ФХ (соответственно на 40 и 20$) на фоне практически неизменных уровней ФЭ фракции на 5 и 30 сек стимуляции ЛПКЧ. Резкое же увеличение количества последней на 60% от контроля при отсутствии достоверных изменений в содержании ФХ фракции во временном промежутке от 5 до 10 сек действия лектина свидетельствует, что в быстрой модификации липидного бислоя ПМ ЛПКЧ при инициации ФИ-цикла в качестве основного регуляторного звена выступает процесс деацилирования-реацилировадая фракции ФХ.

Сумшруя вышеприведенный экспериментальный материал, можно констатировать существование четких кооперативных взаимосвязей процессов модификации липидного бислоя и активации ФИ-

- 29 -

<5ДЭ, свздетвльствугащх в пользу функционирования в ПМ клеток относительно автономного'лшопротеинового, морфо-функциональ-ного доиэна ФИ-цпкла, компонентами которого помимо белковых молекул, валяются такш липидные фракции, их метаболиты, включая ферментные системы метаболизма этих соединений.

ВЫВОДЫ

1.' Показана двухфазная, однотипная активация фосфоинози-тид-спвцифичной фосфодиэствразы цри стимуляции лимфоцитов .крови человека а тимоцитов крыс конканавалином А.

2. Сттдулируюцеэ действие эндогенного менклеточного медиатора интер1еЭкина-2 на линфоциты осуществляется фосфоино-зптвднып путем^

3; На кембраносвязанном этапа шлогзнной инициации фос-фоннозитидаого цикла цри изиеношш исходных и становлении новых стационарных состояний плазматических мембран лимфоцитов обнаружена корреляция активации фосфюинозитид-специфич-ноё фосфодизстэразн с функционированием дэацилироваяия-реа-цилироаания фосфатццилхолшовой фракции.

4. На ма^раносзязанном этапе транслокации митогенных внешних сигналов фосфошгазитвдным путем в качестве кооперативных кеханизшв быстрой модификации липидного бислоя выступают:

а) функционирование фзр?.;энтной система цикла деацилирования-реацшшрования фосфолипидов, состоящая из Са2+-зависимой фссфагапазн А£, лазофосфолипази и ацилтрансферазы.

б) фзрмеятйтивные процессы взаимопревращения близких по строеню фосфатвдилсеринозоЗ, фосфатидилэтаноламиновой и фосфатццшшшшовой фракций.

5; При стимуляции конканавалином А фосфоинозитидного цикла лимфоцитов в кооперативной цепи метаболических превращений арахидонил-фосфатцщшхолияовой фракции обнаружены коррелирующие с динамикой двухфазного деацилирования данного фосфолишща: изменения в содержании триглицервдов, выступающих в роли промежуточного "депо" для свободной арахидоновой кислоты, а также активация липоксигеназного пути метаболизма свободной арахвдоновой кислоты с многократным повышением

уровня 5-гадроксиэйкозатетраеновой кислоты.

6. Транслокация митогенных первичных сигналов через плазматическую мембрану лимфоцитов осуществляется функционирующим по принципу кооперативное™ относительно автономным, лилоиротеиновым, морфо-функциональным доменом фосфоинозитид-ного цикла.

■ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Асатрян Л.10. Деацилирование фосфатидилхолинов мембран лимфоцитов» при инициации фосфоинозитвдного цикла кон-канавалином А. - Тезисы докл. 6-ой научно-технической конференции молодых ученых и специалистов р-на 26 Комиссаров г. Еревана, 1990 г, с. 49.

2. Тадевосян Ю,В., Асатрян Л.Ю., Карагэзян К.Г„ Процессы деацилирования мембранных фосфолипвдов при инициации фос-■фоинозитддного цикла в синаптосомах крыс и лимфоцитах крови человека. - Нейрохимия, 1992, т. II, № 2, с. 194202.

3. Тацевосян Ю.В., Асатрян Л.Ю., Карагезян К.Г. Исследование включения и распределения меченых предшественников фосфолипидов в мембранах интактных лимфоцитов. - Биологический журнал Армении, 1993, т. ХХХХУ1, № 2, (в печати).

СПИСОК