Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Нарушения про- и антиокислительных систем организма при моделировании односторонней ганглиосимпат эктомии без и в сочетании с острым акустическим стрессом

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Нарушения про- и антиокислительных систем организма при моделировании односторонней ганглиосимпат эктомии без и в сочетании с острым акустическим стрессом"

зцзиизиъь зиъртьзпкэзиъ чьзппэзш-ъъьрь иэчизьъ

ичтьиьи ьчппизьъ мььириъппэзиъ ьъиэьзпьз

иигБьгпизиь ипиьь щитьэь

ррд ичтьиьи

- 8 СЕН Ш

опчиььаиь "пгп- и зичиоеиьоьэ яииичипчьпь 1ииъ<шрги-иъьро иьичтииьь чиъчььпимтизьчзпиьизь ипоыичприиъ

сшииьич

и ипгр ичпшзьч иврьиь зьэ эт-чичзчио а.оо.оз. - аьъьзьчи, итьчпн-изьъ чьъиириъппэзт-ъ

йшийшц^тш^шйр ^ЬйишршйшЦшй (^1лгир]тйОЬр|1 рЬЦйшйпф ц[ипш1)ш0 шиифбиий^ Иш]дЛшО штЬ0ш|11пигнр]шй

иьпиичьр

_ ЬрЬшй - 1998___________

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ АРМЕНИЯ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ

МАРТИРОСЯН АРМЕН ГАМЛЕТОВИЧ

НАРУШЕНИЯ ПРО- И АНТИОКИСЛИТЕЛЬНЫХ СИСТЕМ ОРГАНИЗМА ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ОДНОСТОРОННЕЙ ГАНГ Л ИО С ИМ ПАТ ЭКТОМИИ БЕЗ И В СОЧЕТАНИИ С ОСТРЫМ АКУСТИЧЕСКИМ

СТРЕССОМ

оз> С>3

а.00.03 ГЕНЕТИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ереван-1998

ll2fuiuLnuiÜ£G limmmpilbL t QUU Un|bl|nL|uijhü l]büuLupLuGnLpjuj[j hüuin|nnnLinruCi L U.^bptugru шй bp'HPi-fi оСщЬшйгир U ijbüuiuopq. ßh^h^jh müpfinürutf

Ч|1Ч1ш1)шй 11Ь1)Ш11шрйЬр~ quil ш1)шг>Ьй|1^пи

tH.Q.liupuiqjnqjujQ Ifq.p. Q.U.RntlbjujQ

гПш21лпйшЦшй nüryifiüiufunuQbp 'Прпф. t.U.QUnpqjmü

Q.U.QLnpqjuiü

11г2ш2ш1лшр IjUiqüiulibpiqrupjnLÜ bpLiuüh гПЬтш1)шй Зил5ш[ишршй|1 Ijbüuiugfiühwjh ludpfinO

'Пш21лщшйтр]П1йр l)iujujüuj|ni. t 1998 рл » dmüp^'hO QUll

R.PniütiiupjuiGti шОЦшй ^ijüumpfiühuJjh (lOuintimniinpü lj[ig 042 tiuiuüiuqfitniugiliuü funphpr^riLÜ (375014, 3=1, Ьр1хшО -14, Tl.ULiuljh 5/1)

UinbütufununLpjiuDo MiupbLh öiuGnpuiüiuL Q-LiU. 3.PruGhujpjiuG|i шйфий Libüuujp|ii3hLujh hGuinfiinruuih qpiurjiupujGni.i5: Ubr\i5uiqfipG шпшрЦшб t V? » Cf »t? tf! ■ 1998p.

UuuuGuiqhmiugiluiö funphpr)fi qfirn. ршртгицшр

^ЬйишршйшЦшО q|iin. ryiljinnp, щрпфЬипр' Ii. U. UhünQjtuü

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии HAH РА и на кафедре общей и биоорганической химии ЕрГМУ.

Научные руководители: академик HAH РА

К.Г.Карагезян к.б.н. Г.А. Овеян

Официальные оппоненты: Проф. Э.С.Геворкян

Д.б.н. Г.А. Геворкян

Ведущая организация: Кафедра Биохимии Ереванского Гос. Университета

у lt4?P

Защита состоится «//-.»r.f-Jt Т 1998г. в П часов на заседании Специализированного Совета 042 при Институте Биохимии им. Г.Бунятяна HAH РА (375014, Ереван, ул. П. Севака 5/1).

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института Биохимии им. Г. Бунятяна HAH РА.

Автореферат диссертации разослан vj» 1998г.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Изучение молекулярных механизмов адаптационно-трофического действия СНС, выдающегося открытия академика Л.А.Орбели (Орбели Д., 1974), знаменует собой важнейший вклад в фундаментальные и прикладные аспекты современной молекулярной биологии, нейрохимии, нейрофизиологии, неврологии и основы высшей нервной деятельности в целом.

Известна важная роль верхнего шейного симпатического ганглия, как периферического нейроэндокринного центра СНС (СагсНпаИ О., е1 а1„ 1981, 1982) в регуляции обменных процессов в различных структурах головного мозга. Так, при ОГСЭ показаны нарушения углеводного и гликолипидного метаболизма (Мхеян Э., 1965; Буниатян Г., 1966), проницаемости мозговых мембран в отношении ФА и продуктов их превращений (Карагезян К., 1969, 1972; Овсепян Л., 1970), содержания общего белка и нуклеиновых кислот (Мхеян Э., 1974; Карапетян Т., 1976), изменения состава гистоновых и негистоновых белков (Мхеян Э., 1978; Кочарян К., 1981), физико-химических свойств хроматина, качественного и количественного состава его ФА и их жирных кислот (Овеян Г., 1989).

Результаты этих исследований свидетельствуют о возможном нарушении нейрогуморальной регуляции и антирадикальной защиты клеток, в частности, ссотношения про- и антиоксидантных систем крови при ОГСЭ. Особый интерес представляет изучение соответствующих параметров при сочетании ОГСЭ с ОАС, являющимся распространенным патологическим состоянием, характеризующимся многочисленными расстройствами гомеостаза внутренней среды организма на клеточном и организменном уровнях.

Состояние антиокислительной защиты клеток при указанных патологических состояниях изучено далеко недостаточно, в связи с чем актуальность предпринятого исследования обретает особый интерес и значение.

Целью и основными задачами исследования являлись изучение особенностей нарушений соотношения уровней анти- и прооксидантных систем крови, ФА состава СП и МЭ и интенсивности течения процессов СРО в крови белых крыс при ОГСЭ и ее сочетании с ОАС.

Для достижения поставленной цели были поставлены задачи по изучению при ОГСЭ и ее сочетании с ОАС:

- содержания ЦХ Ь5, Ь558(1), Ь558(Ц), Ь558(Ш), и Ь55д(;у);

количества и особенностей сдвигов активности МП антиоксидантного действия - СОД, КТ, ЦП и ТФ;

- количества и супероксидионгенерирующей активности СП;

- качественного и количественного состава ФА СП;

- качественного и количественного состава ФА МЭ;

- процессов ПОЛ, содержания ДК, МДА-модифицированных белков и а-ТФ в МЭ;

- процессов СРО и уровня ДК, МДА-модифицированных белков, а-ТФ, ОХ и СМП в плазме крови.

Научпая повпзпа. Впервые показаны закономерности подавления и стимуляции активностей соответственно антиоксидантных и прооксидантных систем, возрастания количества водорастворимого NADPH-зависимого О2" -продуцирующего ЛП - СП при одновременном падении его активности. Параллельно продемонстрирована роль ФЛ компонента СП в формировании нарушений его физико-химических свойств при ОГСЭ и ее сочетании с ОАС. Выявлена также специфика изменений качественного и количественного состава ФЛ МЭ и ее роль в повышении интенсивности течения процессов СРО как важного аргумента в патогенетическом комплексе изученных состояний.

Практическое значение работы определяется принципиально новыми данными в характере соотношения между анти- и прооксидантной системами, содержания ФЛ компонента СП как критерия прикладного профиля для понимания формы, глубины и специфичности сдвигов констатируемых при ОГСЭ и ОАС как в отдельно взятом виде, так и в сочетании. Этот показатель может оказаться полезным и в реализации принципов дифференциальной диагностики изученных нарушений от других патологических состояний, сопровождающихся также развитием оксидативного стресса.

Результаты проведенных исследований подтверждают необходимость поддержания гомеостаза физиологического балансирования двух контрсистем -про- и антиоксидантного действия, как залог в сохранении компенсаторно-приспособительного потенциала в необычных условиях существования организма. Проведенные исследования еще раз подтверждают универсальность концепции Л.А.Орбели об адаптационно-трофической роли СНС и ее периферического звена - верхнего шейного симпатического ганглия в поддержании структурно-функциональной целостности и метаболической полноценности отдельных биологических систем клетки и организма в целом.

Основные положения диссертации, выносимые па защиту.

- изучение изменений соотношения анти- и прооксидантных систем крови при ОГСЭ и ее сочетании с ОАС.

- изучение активности антиоксидантных ферментов - СОД, KT, ЦП и ТФ.

- изменения содержания и супероксидионгенерирующей активности СП зависящей от качественного и количественного состава его ФЛ, интенсивности течения реакций СРО как самих ФЛ СП, так и липидов МЭ и плазмы крови.

- изменения интенсивности течения СРО в МЭ, содержания ДК, МДА-модифицированных белков и а-ТФ.

- Изменения интенсивности течения процессов СРО в плазме, содержания ДК, МДА-модифицированных белков, ОХ и СМП как показателей глубины наблюдаемых расстройств.

Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на 1-ой Республиканской Конференции "Медико-биологические проблемы стресса" (1997), конференции, посвященной 30-летию со дня основания Института молекулярной биологии HAH РА (1998), X Международной конференции по химии органических и

элементорганических пероксидов (Москва, 1998). Апробация диссертационной работы состоялась на заседании Ученого совета Института молекулярной биологии НАН РА (1998).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 научных

работ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, описания результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа представлена на страницах русского компьютерного текста, иллюстрирована 5 таблицами и 3 диаграммами. Библиографический указатель включает 267 ссылок (198 русских и 69 иностранных источников).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводили на 200 белых беспородных крысах-самцах, массой 180-200г, содержавшихся на обычном пищевом рационе. ОГСЭ проводили под легким эфирным наркозом с констатацией синдрома Бернара-Горнера (четко выраженный энофтальм, сужение глазной щели и зрачка). ОАС моделировали воздействием шума (91дБА) с максимальной энергией в области средних и высоких частот в течение 2 ч. Животных декапитировали под легким эфирным наркозом спустя 7 суток после ОГСЭ. Манипуляции по изоляции, очистке и фракционированию биологических объектов исследования производили в строго ограниченные промежутки времени при +4°С в условиях холодовой комнаты.

1. Мембраны эритроцитов выделяли осаждением после их осмотического шока в течение суток в условиях рефрижератора в буферной среде ( Limber G. et al., 1970).

2. Метод выделения металлопротеипов. Одновременное выделение и очистку МП крови проводили с некоторой модификацией (Симонян М. и др., 1996а), состоявшей в первоначальной очистке сыворотки крови от форменных элементов, которую затем, равно как и белковую фракцию МЭ, солюбилизированную неионными детергентами, и гемолизат, очищенный от МЭ (после диализа против воды и центрифугирования на центрифугах К-24 и К-70, Германия) подвергали в отдельности ионообменной хроматографии вначале на целлюлозе КМ-52, затем целлюлозе ДЭ-52 ("Whatman", Англия), гель-фильтрации на сефадексах G-75, G-100 ("Pharmacia", Швеция) и на биогелях Р-60, Р-100, Р-150 ("Reanal", Венгрия), размещенных в стеклянных колонках (2x6 см) для целлюлоз и (1x60 см) для сефадексов и биогелей.

Выделение СОД, КТ и ЦХ Ь5 проводили из растворимой фракции эритроцитов, ЦП, ТФ, ЦХ b558(i) и Ь558(Ц) и СП - из сыворотки крови, а ЦХ Ь558(Ш) и b55g(iv) - из МЭ.

3. Определение содержапия металлопротеипов основывалось на измерении величины плотности характерного оптического поглощения: для ЦП при 610 нм, ТФ - 490 нм, ЦХ b5 - 525 нм, ЦХ Ь55В(1). Ь558(П)>

1*558(111) и b558(IV) - 530 нм, СП (слабое поглощение)- 430-440 им (спектрофотометр "Specord М-40", Германия).

4. Метод определеиия активности супероксиддисмутазы. Активность СОД определяли по иншбированию 02"-радикалов, генерируемых в модельной системе, содержащей феназинметасульфат, NADH, нитротетразолий синий (Nishikimi М. et al., 1972). Колориметрирование проводили спустя 10 мин при 530 нм.

5. Определение каталазной активности проводилось методом спектральных измерений (Abei Н„ 1974).

6. Метод определения супероксидгенерирующей активности супрола. Активирование СП достигалось комплексованием его со следами иона Fe3+ (Симонян М. и др., 19966), 02'-продуцирующую активность СП измеряли НТС-методом (Fu X. et al., 1992), в % увеличения степени поглощения формазана (при 588 нм) в присутствии 3 мг СП.

7. Выделение, фракционирование и количественное определение ФЛ.

Экстракцию ФЛ проводили по методу Фолча ( Folch J. et al. 1957)

в модификации К.Г. Карагезяна ( Карагезян К., 1969).

Фракционирование индивидуальных ФЛ проводили методом одномерной восходящей тонкослойной хроматогрфии (Ахрем А. и др., 1965) использованием системы расгвоителей хлороформ-метанол-аммиак (65:35:5). Пятна ФЛ идентифицировали с помощью химически чистых стандартных свидетелей ("Sigma", США), в атмосфере, насыщенной парами йода. Минерализацию липидного фосфора проводили в среде концентрированных серной и азотной кислот с последующим пересчетом его содержания в мкг на 1 мг сухого остатка исследуемой ткани (Прохорова М., 1982).

8. Метод определения перекисей липидов в ферментативной и иеферментативной системах окисления.

В основе метода определения степени интенсивности течения СРО липидов лежит реакция взаимодействия МДА с тиобарбитуровой кислотой, протекающая при высокой температуре и кислом значении pH с образованием окрашенного триметилового комплекса в виде розового хромогена (Владимиров Ю. и др., 1972), интенсивность окраски которого, адекватную содержанию МДА определяли спектрофотометрически при 535 нм.

9. Диеновые коныогаты и МДА- модифидироваппые белки - определялись по методу (Владимиров Ю. и др., 1972)

10. Метд определения а-токоферола (витамина Е).

Свободный а-ТФ определялся в плазме крови и МЭ (Duggan D., 1959) с использованием флуоресцентного спектрофотометра "Hitachi" при максимуме возбуждения 295 нм и максимуме флуоресценции 330 нм.

11. Среднемолекулярные пептиды определялись по методу (Владыко А. и др., 1987).

12. Метод определения общего холестерипа.

ОХ определялся в плазме крови по методу (Сентебова Н. и др., 1977). Колориметрирование проводилось на СФ-46 при длине волны 560 нм.

Концентрацию белка определяли по методу Лоури (Ьолсту О. е1

а1„ 1951)

Достоверность полученного фактического цифрового материала определялась методом вариационной статистики Стьюдента-Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Состояние прооксчидаптпой и антиоксидантной систем крови белых крыс при односторонней ганглиосимпатэктомии и ее сочетании с острым акустическим стрессом.

Восстановление кислорода в биологических системах до воды сопровождается процессами одноэлектронного переноса, с формированием его токсических интермедиантов с высоким уровнем реакционной способности, таких как О2", Н2О2, ОН', '02- Среди последних особый интерес представляет О2", в связи с чем изучение систем, контролирующих и регулирующих его образование, утилизацию и распад при различных экстремальных и патологических состояниях, например, при воздействиях острых стрессоров типа ОАС, сопровождающихся ярко выраженным усилением интенсивности течения процессов СРО липидов (Ме1кошап М. е1 а1., 1996), заслуживает пристального внимания.

Целью настоящего исследования являлось изучение особенностей сдвигов активности и количества МП антиоксидантного действия - СОД, КТ, ЦП, ТФ, недавно выявленнных прооксидантов - ЦХ Ь558(1). Ь558(Н), Ъ558(1П), Ь558(1л/), ЫАОРН-содержащего водорастворимого липопротеина СП, 02"-генерирующей активности последнего и количества ЦХ Ь5 при ОГСЭ и его сочетании с ОАС.

Как показали результаты проведенных исследований, отраженные в табл. 1, ОГСЭ, хотя и приводит к приблизительно 40% уменьшению содержания ЦХ Ь5, являющегося субстратом ЫАЕ)РН-оксигемоглобин-метгемоглобин-оксидоредуктазы (Симонян М. и др., 1995), и суммы находящихся в плазме крови ЦХ Ь558(1), Ь558(П). тем пе менее сопровождается четырехкратным возрастанием содержания ЦХ Ь558(Ш)> Ь558(ГУ) в мэ и СП. Нестабильность полученного СП характеризуется сравнительно быстро проявляющейся потерей растворимости, обусловленной самоагрегацией, связанной не только с его количественными, но и качественными именениями. Не исключено, что изменения физико-химических свойств СП в известной степени предопределены изменениями комплексованных с ним ФА.

Несмотря на установленное нами уменьшение О2"-продуцирующей активности СП, как это показано на рис. 1, увеличение его абсолютного количества и содержания мембранных ЦХ Ъ558 свидетельствует тем не менее об имеющем место усилении процесса генерации О2". С другой стороны, согласно рис. 2, возрастание

содержания антиоксиданта ТФ, увеличивающего захват Ре^- + из среды, свидетельствует о нарушении метаболизма железа, чего, однако, по всей вероятности, не достаточно для предотвращения усиления О2"-зависимого катализа реакции образования ОН', еще более интенсифицирующих процесс перекисеобразования. Логическим подтверждением отмеченных сдвигов может явиться факт подавления активности СОД, КТ (рис. 3) и ЦП (рис. 2), наделенного, как известно, ферроксидазной и 02~-захватывающей активностями.

к а в

Рис.1. Содержание (1) н активность (2) супрола, выраженная в % увеличения поглощения формазапа при восстановлении НТС супероксиднымн радикалами, продуцируемыми 3 мг супрола в кровп белых крыс при односторонней ганглиосимпатэктомип (А) и се сочетании с острым акустическим стрессом (В), (п=8).

Таблица 1

Изменения содержания прооксидантов в крови белых крыс при различных стрессовых состояниях, (п=8).

Название и максимальное оптическое поглощение Величины плотностей максимального оптического поглощения

Контроль Симпатэк-томия откл. от контр., % Симпатэкт+аку ст стресс Откл от контр %

Цитохром Ь5 (А525) 0,Ю ± 0,010 0,060 ± 0,004ы - 40,0 0,084 ± 0,007 - 16,0

Сумма цитохромов В^,,, и В55а(„, (А530) 0,12 ±0,015 0,072 ± О.ОЮ11 - 40,0 0,048 ± 0,009ь - 60,0

Цитохром ЬМ8(Ш1 (А530) 0,27 ± 0,040 1,080 ± 0,150а + 300,0 0,450 ± 0,065" + 66,7

Цитохром Ь558|1У| (А530) 0,21 ± 0,010 0,854 ± 0,050" + 306,7 0,420 ± 0,040а +100,0

Супрол (А430) 0,15 ± 0,010 0,519 ± 0,020* + 246,0 0,369 ± 0,040" +146,0

02" -продуцирующая активность супрола (%)2 60 ± 3 34 ± 2,4" - 43,3 40 ± 2,9Ь - 33,3

Примечание: 1- статистическая достоверность изменений относительно контроля

в таблицах и рисунках * -р < 0,001, ь -р < 0,01,

с -р < 0,02, а -р < 0,05

в остальных случаях изменения по сравнению с конторлем статистически не достоверны

2- активность супрола выражена в % увеличения поглощения формазана при восстановлении НТС супероксидными радикалами, продуцируемыми 3 мг супрола.

Таким образом, разыгрывающиеся при ОГСЭ нарушения формирования АФК и процессов, регулирующих их метаболизм, свидетельствуют о подавлении активности систем антирадикальной защиты клеток и компенсаторно-приспособительных возможностей организма, отражающихся соответствующим образом на про- и антиоксидантных показателях крови.

1 2

Рис. 2. Динамика изменений активности СОД (1), каталазы (2) в крови белых крыс при односторонней ганглиосим-патэктомии (А) и ее сочетании с острым акустическим стрессом (В), (п=8).

Сочетание ОГСЭ с ОАС не отражается на установленной направленности изменений. Отмечается некоторое повышение компенсаторно-приспособительных возможностей организма при изученных моделированных состояниях, разительным образом отражающихся на функциональной активности биологических систем в целом, что находит свое адекватное отражение в картине защитных механизмов крови. Так, например, при изученной ситуации количество СП хотя и возрастает приблизительно на 146% (табл. 1), однако его О2"-генерирующая способность оказывается пониженной на треть (при ОГСЭ - на 43,3%) (рис. 1). В сопоставлении с одним только ОГСЭ происходит в сравнительно меньшей степени инактивирование антиоксидантных ферментов - ЦП (рис. 2), СОД и КТ (рис. 3).

1 ■2

Рис.3. Изменения величины плотности максимального оптического поглоще пия церулоплазмина (1) и трансферрина (2) в крови белых крыс при односторонней ганглиосимпатэктомии (А) и ее сочетании с острым акустическим стрессом (В), (п=8).

2. Изменения фосфолипидиого компонента супрола крови белых крыс при односторонней ганглиосимпатэктомии и ее сочетании с острым акустическим стрессом.

Для выяснения роли ФА СП в выявленных изменениях его физико-химических свойств было предпринято изучение особенностей качественных и количественных изменений ФЛ компонента СП при ОГСЭ и ее сочетании с ОАС.

Результаты исследований приведенные в табл. 2 показывают уменьшение при ОГСЭ как СФЛ, так и их отдельных представителей, в частности, ФХ, ФЭ, ФС и КЛ, что сопровождается заметным увеличением ЛФХ, по всей вероятности, в результате повышения активности фосфолипазы А2, способствующего также активному подключению образующегося при этом высокого пула НЭЖК моно- и полиенового ряда в процессы СРО. В этом отношении немаловажно также увеличение К СНФЛ/СКФЛ, вследствие уменьшения суммарного количества КФЛ.

Таблица 2.

Количественные изменения фосфолипидпого состава (в мкг липидпого фосфора/ мг сухого остатка супрола) супрола крови белых крыс при односторонней ганглпосимпатэктомия (А) и ее сочетании с острым акустическим стрессом (В), (п=8).

Название Контроль (К.) А В

% от СФЛ % от СФЛ % откл. от К % от СФЛ % откл. от К

Лизофосфатидилхолины 0.157 +.0,004 7,62 0,277+. 0,005 ® 15,56 + 76,43 0,241+. 0,004 3 12.23 + 53,50

Монофосфоинозитиды 0,246+. 0,002 11,94 0,231+. 0,003 Ь 12,98 - 6,10 0,251+. 0,003 12,74 + 2,03

Сфингомиелины 0.186+. 0,003 9,03 0,220+. 0,002 а 12,36 + 8,28 0,233+. 0,003 а 11,82 + 25,27

Фосфатидилхолины 0,512+. 0,003 24,85 0,344+. 0,006 3 19,33 - 32,81 0,343+1 0,004 а 17,40 - 33,00

Фосфатидилсерины 0,422+. 0,007 20,49 0,331+. 0,005 3 18,60 - 21,56 0,473+. 0,003 а 24,00 +12,09

Фосфатидилэтаноламины 0,327+. 0,005 15,87 0,222+. 0,002 а 12,47 - 32,11 0,248+. 0,002 3 12,58 - 24,16

Кардиолипины 0,210+. 0,003 10,20 0,155.+ 0,002 а 8,70 - 26,19 0,182+. 0,003 а 9,23 - 13,33

СФЛ 2,060+. 0,028 1,780+. 0,026 3 - 13,59 1.971+_ 0,022 0 - 2,86

СНФА 1,182+. 0,016 57,38 1,063+1 0,016 а 59,72 - 10,07 1,065+. 0,013а 54,03 - 9,90

СКФЛ 0,878+. 0,012 42,62 0,717+. 0,010 а 40,28 - 18,34 0,906+1 0,009 45,97 + 3,19

К СНФЛ/СКФЛ 1,35 1,48 + 9,63 1,175 -14,23

При сочетании ОГСЭ с ОАС изменения носят иной характер. Хотя содержание ЛФХ остается увеличенным по сравнению с контролем, а ФХ и ФЭ - пониженным, наблюдается увеличение ФС. Содержание КЛ также продолжает оставаться ниже контрольного, но менее, чем при ОГСЭ, что совместно с увеличением содержания ФС приводит к уменьшению К СНФЛ/СКФЛ. Это свидетельствует о возможном повышении компенсаторных возможностей организма при воздействии ОАС и коррелирует с данными о содержании и 02~-генери-рующей активности СП.

3. Измепеиия фосфолипидпого состава мембран эритроцитов и интенсивности течения процессов свободнорадпкального окисления в крови белых крыс при одпостороиней ганглиосимпатэктомпи и ее сочетании с острым акустическим стрессом.

Ранее было показано (Карагезян К. и др., 1970) изменение при ОГСЭ количественного и качественного состава ФА крови, притекающей в головной мозг и оттекающей от него. В связи с этим была поставлена цель изучить изменения ФА компонента МЭ, в значительной степени отражающих состояние гомеостаза крови и организма в целом, а также связанных с ними изменений ПОЛ и антиоксидантной системы МЭ и плазмы крови.

Как показали результаты проведенных исследований, отраженные в табл. 3, при ОГСЭ и ее сочетании с ОАС наблюдается уменьшение как СФЛ МЭ, так и их отдельных представителей, в частности, ФХ, СФМ, ФЭ, с параллельным заметным увеличением ЛФХ, что связано с повышением активности фосфолипазы А2 и может привести к вовлечению НЭЖК ФА МЭ в процессы СРО. При этом представляет определенный интерес специфика изменений содержания МФИ и ФС. Так, если уровень МФИ при ОГСЭ увеличивается примерно на 16,79%, то при ее сочетании с ОАС почти однозначный сдвиг в противоположном направлении (-18,89%). Количество же ФС, уменьшающееся при ОГСЭ приблизительно на 17,08%, становится недостоверно увеличенным при ее сочетании с ОАС ( + 4,07%).

Особый интерес представляет изменение К СНФЛ/СКФЛ, что связано с уменьшением содержания НФЛ при практически постоянном уровне КФЛ. Эти данные свидетельствуют об изменениях процессов деацилирования и реацилирования ФА (Карагезян К. и др., 1986), а также о важном значении фосфоинозитидного и фосфатидилхолинового циклов (Ре1е5Ь Э. е1 а1., 1989), что чревато изменениями процессов СРО как в МЭ, так и в плазме крови.

Таблица. 3

Фосфолипидпый состав (в мкг липидного фосфора/мг сухого остатка мембран) эрнтроцитарных мембран белых крыс при дносторонней ганглиосимпатэктомии (А) и ее сочетании с острым акустическим стрессом (В), (п=8).

Название Контроль А В

% от СФЛ % от СФЛ откл. от К % от СФЛ откл. от К

Дизофосфатидил холины 0,611 +0,025 10,02 0,936 + 0,034' 17,08 + 53,19 1,023 + 0,038" 19,11 + 67,43

Монофосфоинозити ды 0,524 ± 0,020 8,60 0,612 + 0,024'' 11,17 + 16,79 0,425 + 0,015" 7,94 - 18,89

Сфингомиелины 1,260 + 0,051 20,68 0,902 + 0,033' 16,46' - 28,41 0,828 ± 0,031' 15,47 - 34,29

Фосфатидилхолины 1,730 ± 0,072 28,39 1,243 ± 0,060' 22,69 - 28,15 1,051 ± 0,052' 19,63 - 39,25

Фосфатидилсерины 0,884 + 0,035 14,51 0,733 ± 0,029е 13,38 - 17,08 0,920 ± 0,034 17,18 + 4,07

Фосфатидилэтанола мины 0,514 ± 0,021 8,43 0,431 + 0,020" 7,87 - 16,15 0,414 + 0,018ъ 7,73 - 19,46

Кардиолипины 0,571 ±0,024 9,37 0,622 ± 0,028 11,35 + 8,93 0,693 ± 0,030е 12,94 + 21,37

СФЛ 6,094 + 0,248 5,479 ± 0,228 - 10,09 5,354 + 0,218 - 12,14

СНФЛ 4,115 + 0,169 67,52 3,512 + 0 ,147" 64,10 - 14,65 3,316 ± 0,139ь 61,94 - 19,42

СКФЛ 1,979 ± 0,079 32,48 1,967 + 0,081 35,90 - 0,61 2,038 ± 0,079 38,06 + 2,98

К СНФЛ/СКФЛ 2,08 1,79 - 13,94 1,63 - 21,63

Таблица 4

Изменения интенсивности течения процессов ПОЛ (по выходу малопового диальдегида) и содержания МДА-модифицированных белков, диеновых конъюгатов и а-токоферола в эритроцитарных мембран белых крыс при односоронней ганглиоснмнатэктомии (А) и ее сочетании с острым акустическим стрессом (В), (п=8).

Название Контроль А В

Аскорбатзависимое переокисление 2,23+ 0,14 3,15±0,20ь 3,20 + 0,19"

ЫАБРН-зависимое переокисление 3,27+ 0,21 4,32 + 0,29е 4,08 + 0,25"

МДА-модифициро-ванные белки 0,05 + 0,01 0,07 ±0,01 0,07 + 0,01

Диеновые конъюгаты 3,93 ± 0,35 5,32 + 0,40е1 4,74 ± 0,37

а-Токоферол 7,51 +0,35 5,25 ± 0,33ь 6,02 ± 0,38"

Таблица 5

Изменения интенсивности течения процессов ПОЛ (по выходу малопового диальдегида ) и содержания МДА-модифицированных белков, днеповых конъюгатов и а-токоферола, средпемолекулярных пептидов и общего холестерина в плазме крови белых крыс при односторонней ганглиосимпатэктошш (А) и ее сочетании с острым акустическим стрессом (В), (п=8).

Название Контроль А В

Фоновые липидные перекиси 5,751+0,47 7,850 ± 0,60" 8,310 ± 0,69е

МДА-модифициро-ванные белки 0,730 ± 0,06 0,921 ±0,08 1,010 ±0,10''

Диеновые конъюгаты 4,201+0,27 5,510 ± 0,32е 5,84 0± 0,41е

а-Токоферол 1,420 ±0,09 1,050 ± 0,08е 0,930 ±0,08"

Среднемолекулярн ые пептиды 0,150 ±0,01 0,191 ± 0,0 И 0,201 ±0,01ь

Общий холестерин 1,430 ±0,08 1,750 ±0,09" 1,850 ±0,09"

Проведенные исследования по изучению процессов ПОЛ МЭ (табл. 4) показывают значительное повышение интенсивности течения процессов ферментативного (ЫАОРН-зависимого) и неферментативного (аскорбатзависимого) переокисления, увеличение содержания МДА-модифицированных белков, ДК и снижение уровня важнейшего эндогенного антиоксиданта - а-ТФ. Это свидетельствует о заметных нарушениях в системе ПОЛ - антиоксидантная система со структурной реорганизацией МЭ, носящих более выраженный характер при сочетании ОГСЭ с ОАС, свидетельствуя тем самым об альтерации компенсаторно-приспособительных возможностей мембранных структур. Это коррелирует с данными наших исследований по изучению особенностей изменений интенсивности течения процессов СРО в плазме крови (табл. 5). Примечательно, что заметное возрастание содержания фоновых липидных перекисей, ДК и МДА-модифицированных белков сопровождается одновременно проявляющимся чувствительным уменьшением содержания а-ТФ. Эти данные свидетельствуют о заметной интенсификации процессов ПОЛ (Бурлакова Е., и др., 1996).

Особый интерес представляет также увеличение содержания СМП, являющихся субстратами эндогенной интоксикации при различных патологических состояниях (Галактионов С и др., 1984) и наделенных антиоксидантными свойствами, а также ОХ, обладающего тормозящим влиянием на окисление быстроокисляющихся липидов, что, по всей вероятности, указывает на проявления компенсаторно-адаптационных пертурбаций в крови, в известной степени перекликающихся со сдвигами качественного и количественного состава ФЛ МЭ, а также интенсивностью течения процессов СРО в МЭ и плазме крови. Эти данные говорят о наличии ярко выраженных структурно-функциональных изменениях в изучаемой системе, и возникновении и развитии оксидативного стресса как при ОГСЭ, так и при ее сочетании с ОАС.

ВЫВОДЫ

1. Односторонняя ганглиосимпатэктомия характеризуется заметным отклонением равновесия между про- и антиоксидантными системами крови с выраженным активированием первых и подавлением вторых.

2. Четырехкратное увеличение при односторонней ганглиосимпатэктомии количества супрола сопровождается отчетливым подавлением его супероксидгенерирующей активности и изменением качественного и количественного состава его фосфолипидов, коэффициента отношения суммы их нейтральных представителей к сумме кислых.

3. При сочетании односторонней ганглиосимпатэктомии с острым акустическим стрессом наблюдаются аналогичные изменения с некоторым нивелированием степени их выраженности.

4. Установленные изменения фосфолипидного состава мембран эритроцитов оказываются более выраженными при односторонней ганглиосимпатэктомии.

5. Односторонняя ганглиосимпатэктомия характеризуется снижением содержания а-токоферола в мембранах эритроцитов и плазме крови и выраженной интенсификацией процессов перекисного окисления липидов в обеих системах перокисления, ослабевающих при сочетании односторонней ганглиосимпатэктомии с острым акустическим стрессом.

6. Полученные результаты свидетельствуют о выраженном подавлении активности систем антирадикальной защиты и адаптационно-приспособительных возможностей организма с развитием оксидативного стресса, отчетливо проявляющегося как при односторонней ганглиосимпатэктомии, так и при ее сочетании с острым акустическим стрессом.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

а-ТФ АФК ДК

- а-токоферол

- активные формы кислорода

- диеновые конъюгаты

- кардиолипины

- коэффициент отношения СНФЛ к

КЛ

К СНФЛ/СКФЛ

СКФЛ

КТ

КФЛ

АФХ

МДА

МП

МФИ

МЭ

НФЛ

нэжк

- каталаза

- кислые фосфолипиды

- лизофосфатидилхолины

- малоновый диальдегид

- металлопротеины

- монофосфоинозитиды

- мембраны эритроцитов

- нейтральные фосфолипиды

- неэстерифицированные

ОАС

ОГСЭ

ОХ

СКФЛ

ПОЛ

СМП

СНС

СНФЛ

СОД

СП

СРО

СФЛ

жирные кислоты

- острый акустический стресс

- односторонняя ганглиосимпатэктомия

- общий холестерин

- сумма кислых фосфолипидов

- перекисное окисление липидов

- среднемолекулярные пептиды

- симпатическая нервная система

- сумма нейтральных фосфолипидов

- супероксиддисмутаза

- супрол

- свободнорадикальное окисление

- сумма фосфолипидов

СФМ

ТФ

ФА

ФС

ФХ

ФЭ

ЦП

ЦХ

- сфингомиелины

- трансферин

- фосфолипиды

- фосфатидилсерины

- фосфатидилхолины

- фосфатидилэтаноламины

- церулоплазмин

- цитохром

СПИСОК НАУЧНЫХ ТРУДОВ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Г. А. Овеян, М.М.Мелконян, М.А.Симонян, А.А.Казинян, А.Г.Мартиросян, В.А.Григорян. Изменения липопротеинов крови белых крыс при односторонней ганглиосимпатэктомии. // Материалы 70-ой научной конференции ЕрГМУ им. М.Гераци. - Ереван. - 1997. - С.24.

2. Г.А.Овеян, М.А_Симонян, В.А.Григорян, А.А.Казинян, Л.А.Амирян, М.А.Бадалян, А.Г.Мартиросян, Г.Г.Багдасарян. Молекулярные механизмы нарушения антирадикалыюй защиты клеток при различных патологических состояниях. // Материалы конференции, посвященной 30-летию со дня основания Института Молекулярной биологии НАН РА 1997. - С. 50.

3. Г.А.Овеян, М.М.Мелконян, К.М.Кочарян, М.А.Бадалян, А.Г.Мартиросян, Л.А.Амирян. Роль ганглиосимпатэктомии в формировании оксидативного стресса у белых крыс. // 1-ая Республиканская Конференция "Медико-биологические проблемы стресса". - Ереван. - 1997. - С.86.

4. А.Г.Мартиросян, М.М.Мелконян, Г.А.Овеян, А.Х.Маишнян, Т.Р.Меликян, С.Ю.Ншанян. Действие шумового фактора на фоне односторонней ганглиосимпатэктомии. // 1-ая Республиканская Конференция "Медико-биологические проблемы стресса". - Ереван. -1997. - С. 106-107.

5. А.Г.Мартиросян, М.А.Симонян, Л.М.Овсепян, Э.С.Секоян, К.Г.Карагезян, А.Ю.Погосян, Г.А.Овеян. Особенности молекулярных механизмов включения фосфолипидов комплексованных с супролом в реакции перекисеобразования в крови белых крыс с моделированием односторонней ганглиосимпатэктомии. // X Международная конференция по химии органических и элементорганических пероксидов. Москва. - 1998г. - В 8.

6. АГ.Мартиросян, К.Г.Карагезян, Г.А.Овеян, М.М.Мелконян, М.А.Симонян, М.А.Бадалян, М.К.Карагезян. Нарушения равновесия между металлопротеинами про- и антиоксидантного действия в крови белых крыс при ганглиосимпатэктомии и ее сочетании с острым акустическим стрессом. // Украинский Биохимический Журнал. - 1998. -Т. 70, № 5. - С. 201-205.

7. АГ.Мартиросян. Изменения фосфолипидного компонента супрола белых крыс при односторонней ганглиосимпатэктомии и ее сочетании с острым акустическим стрессом. // Ежеогдник Академии Хирургических Наук. - Ереван. - 1998. - Т.З. - С. 36-38.

1ШФПФП1-1Г

U2hiuiuiujûg[3 üilfipilujó t iífiml<nn.i5müh qujGqi.hnu|iúu(iuinl:Liinni5bwjh li

urup ml(ruuinfil) uppbu[i hbm йрш qniqiuljgiîiijG ujujjúujGübpruCÍ шpJшQ hiuLjiu- b щрпориИшйтш^й йшЦшрг^шЦйЬрЬ huipiupbpnLpjiuG, luqujin nuiq|il4uj|iujhû uipngbuübph bümbüutulrupjiuü nLuniúDiuutipnipjiuDQ: UjG múfi fiú¿u{bu шЬиш1|шй, ujjûiqbu t[ ^ршпш^шй úbó ü^mümljnLpjnLÜ, ршЦш^шй mprçfiujljUjG t U 1)шщ11ш0 ш^шг^ЬйЬЦпи L.U.Oppb[nL Ljnqúfig hiujuiúiuqnpáiuá иЬйщшифЦ GjujprujujtiG huiúiuljuipqh трпфЬЦ-шг^шщшшдЬпй uiqrvbgiupjiuû dn|bl|niiujjhG úbfuuiGfiqúúbph ujiupqiupuiúúiuD hbin: Snijg t шрЦшб, np ОгЦшб lufumiupuiGuj^UJÛ ЦЬбшЦОЬрпиЗ Ijuipntlj tuiufuimJruiS t lupjuuG hiuljuj- Ii ujpnojauJiquiGimujfiG hiui5iuL)iupqbp|i Gnpi5iu¡. hiupiupbptu-pjniG|], |ЗшийшЦпрши)Ьи О2" ujpiniurçpnq игищрп[|1 piuûiu4rupjni.Q[i L uiljuifiilnLpjnLÛQ U np fuhurn Ijuiplinp t 4bp2hü|iu puiriiuriprupjiuü úbg i3münr\ фпифп|_[ичЬ^0Ьр|1 ршйш1)ш1)шй L npuiljiuljujG Lituqún тг^Ы^дЦЬ^Ц [ЬчпФпифшшЬчЬ^п^ййЬрЬ puuûuiljni.pjiJuG ЦтргиЦ шбт1 U фпифп^щЬчйЬр[1 ¿bqnp U ppru ÔLbph hujpujpbpuiL|gni.pjujû [иш^итшйпЦ, прй t[ hiuGrifiuiuGnu] t щштбшпОЬрЬд úbljo tphppnghmübph Li uiLLuqúiujfi ifi^h^bph qbpopufirçuigùuiG mpngfauûbph |iGmbGu|iilrupjuiü puipápuigiíiuúp, hiuùiuL(iupq[i ИшЦишшгфЦи^шфй uju^uimuiGrupjiuG pGLjâi|mânLpjmùp, oguhqiuinhil upphufi qiupquigúuiüp U lupjuiG npujbu Gbjpn-hrui3npiu|_ LjuipLnpujqni.jG hiuúiuL|Ujpqh iur)iuimnujgfiiujh ujpngbuGbph tunpp Jiiuráqiupúiuúp:

итшдЦшй фпрбшршрш1)шй imJjiuiGbpD Ljujpnri bû inbuujljujû hfiúp НшОфишйш1 тшррЬр iufiuniupujGujL)uiG 4frôiuLjGbprui5 qiupqiugnq opufirpuinfiil uppbufi lulmnuióGmpjuiü h(ii5üiuripiujpübp|i qiupqiugúuiG huiúuip:

=R QUU R. hj. Pni-bhU©3Ubh UWUb i4bbUUehUhli3h hbUShSfttS

яимпрзиь ьт-ьь mwbbh

tUSPUnhnLh иааЬЗПКЭЗРЬЬС QUuflhablh PahabbPh ПРПС 0 r bbBüßfiau3hb циппгзаиоеььрь inuanhbnahSh^bbPh ' 1 u рютгрпнэзиь цри

4 - ;.of

Q.00.03 - qbQbw|iliui, 6ni.blinL^j|iQ ljbüuiupujQnipjni.ü dmuüiuqjitnrupjutüp 1|Ь0ишрш0ш(|шй qhinrupjni.QQbpfr рЬЦйшбпф qfitnujl|iiiG uiuuifiöuiOfi huijgüiuü tuinbüiu|iiriiinipjtuü

UblUUQhP

bpLuiü -1998

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ ИМ. Г.Х.БУНИАТЯНА HAH PA АКОПЯН НУНЕ РОМЕНОВНА

ДЕЙСТВИЕ ЭСТРАДИОАА НА СОСТАВ ФОСФОИНОЗИТИДОВ НЕКОТОРЫХ СУБКЛЕТОЧНЫХ СТРУКТУР ГОЛОВНОГО МОЗГА

АВТОРЕФЕРАТ

(? 5 • С с ■. ' -]

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности Г.00.03 - генетика, молекулярная биология

Ереван - 1998

UinhCuiJunurupiuiG рЬ\1шй fiuiumuiuiiJUi1 t/plouG|i u|Uimul|iuG fiuitfiuiuuipuiGniil Ч-|плш1)шС цЭДшфир' 1|ЬСишршСш^шС qjirupimGGbpfi rjnljinnp,

хцрпфЬипр trlTM, UflUh аЬЧПРавЦ'и Ч1ш21ПпСш14шй рЙгугф11ш}ипиGUp1 l)hGuvupuiGud)UjG qfinipiriiGQhp]i unljinnp,

гцрпфЬипр «nbsnnu UPUATb 'иШи.РЗЦЛ>

ljhGuuipuiGuil|uiG qjiiniupjniGGtipJi Г(П1)шпр,

ъцрпфьипр иьпаьз ucnsh р-иаьъвил.

U-nuiguiuimp liiuqilmljbpuimpjniG' ¿,<2, 4.UU. ЛпОДпциц^Б l|tiGuiupuiGmpiiuG JiGuuiJunnun , 00

^mgmmuGnipiniGii ^ицшОицги t. V/ " hm / hu к 1998p. d.

II q-UU, ЦИишр^ш^ fiGuuifiinnLinfi (375014 bpUiuG. H.UUui^ ф. 5/1) 042 tf ши Giuq Ji vi ml( ш G Junpfip^mtf

UuitGuijumiiupiuiGp ljuipti|\ t öuiGnpuiGuii ¿.¿, Ч-1Ш. l)bGuuip}nI|iuiili fiGuuifiuiniinfi qpiuntupmGmvJ

Dhi\tIGuiq}ipG шпшр^шй t "2Z." hfK-UfrüA 1998p. lTuiuGmq}iuiwl|UiG |ипрйртф ршршт^шр,

l|tGuuipuiGiul|UiG qJiinnipjTuGGhpfi трйцппр, л

Тема диссертации утверждена в Ереванском государственном университете Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

ГЕВОРКЯН ЭМИЛЬ СОСЕВИЧ Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

КАЗАРЯН ПЕТРОС АРАМОВИЧ доктор биологических наук, профессор БАДЖИНЯН СЕРГЕЙ АШОТОВИЧ

Ведущая организация — Институт молекулярной биологии HAH РА

Защита состоится

и И) /1Я 1998 года, в ff часов на заседанш специализированного совета 042 НИИ биохимии HAH РА (375014, Ереван, ул П.Севака 5/1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ биохимии HAH РА Автореферат разослан

// /S?H Я 1998 года. Ученый секретарь специализированною совета,

доктор биологических наук, профессор /Э 0 АА.СИМОНЯН

V /1 . л

ш toa^-1 СЛч,

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение молекулярных механизмов внутриклеточной регуляции является одной из важнейших проблем современной молекулярной биологии. Внутриклеточная регуляция, осуществляемая с помощью эндогенных регуляторов — гормонов, сопровождается либо модификационными изменениями белков, ферментов, либо изменениями уровня их синтеза de novo. В совокупности такие изменения приводят к регуляции внутриклеточных обменных процессов в клетках-мишенях, сохранению в них нормального физиологического статуса.

В настоящее время принято считать, что гормоны, в зависимости от молекулярного механизма их воздействия на клетки-мишени, делятся на две группы. Первая группа гормонов (пептидные гормоны, катехоламины) передает клетке свою информацию путем, так называемого, мембрада-контактного типа циторецепции, связываясь с рецепторными белками, расположенными на клеточной поверхности. Такое высокоспецифическое связывание приводит к стимуляции трансмембранных универсальных механизмов, в результате чего гормональная информация передастся во внутриклеточный метаболизм, посредством вторичных посредников (Розен, 1980, Cooper, Spraulding, 1985; Calvo et al 1996 и др). Функционирование в настоящее время хорошо известных этих механизмов (циклонуклеотидный и фосфоинозитидный) приводит к регуляции внутриклеточного метаболизма, главным образом, посредством модификации структуры белков, ферментов. Наряду с этим, гормоны второй группы (стероидные и тиреоидине гормоны), действуя на клетки-мишени посредством внутриклеточного типа циторецепции, регулируют метаболизм клетки, в основном, изменяя в них уровень биосинтетических процессов белков. Причем эти гормоны, будучи липофильными, сравнительно легко проникают в клетку, высокоаффинно связываются там с соответствующими рецепторными белками, образуя гормон-рецепторные комплексы. Специфическое взаимодействие этих колтлексов с генетическим аппаратом клетки, в процессе которого рецепторы выступают как

Факторы транскрипции, приводит к усилению синтеза белков de novo (Розен, 1980; rami et al, 1995; Yamamoto, 1995, 1996; Guiochon-Mantcl et al, 1996; Beato et al, 1996; Jeyakumar et al 1997).

За последние два десятилетия в научной литературе появились данные, свидетельствующие о возможной взаимосвязи этих двух механизмов гормональной циторецепции. В частности, в ряде исследований показано, что стероидные гормоны способны также воздействовать на циклонуклеотидный и фосфоинозитидный пути регуляции (Бужурина, Панов, 1986; Brann et al 1995; Sadler et al, 1996), в то же время пептидные гормоны, в частности инсулин, способны интернализоваться в клетку и взаимодействовать с геномом (Dumonteil, 1996). В ряде работ показано, что рецепторы стероидных гормонов имеются также на поверхности мембран (Brann et al, 1996; Sadler et al, 1996), то есть при взаимодействии гормонов с клетками-мишенями не исключается их воздействие на циклонуклеотидныи или фосфоинозитидный механизмы. Ауриккио и сотр. (Migliaccio et al, 1984, 1986; Auricchio et al, 1985, 1987, 1996) выяснили, что активация внутриклеточных рецепторов эстрздиола, необходимая для их взаимодействия с гормоном, представляет собой процесс фосфорилирозания рецептора, который осуществляется протеи нкиназами, регулируемыми фосфоинозитидным механизмом. Вместе с тем, было показано, что на первичных этапах воздействия эстрадиол способен инициировать функционирование фосфоинозитидсго регуляторного механизма, а действуя на уровне генома клеток, на раннем этапе воздействия и активируя биосинтетические процессы белков, привести к изменению физиологического статуса мембран, что может сказываться также на функционировании фосфоинозитидного механизма (Grove, Korach, 1987; Геворкян, Тадевосян 1990; Тадевосян, Гепоркян, 1990; Brann et al 1995; Schulman et al, 1996).

Таким образом, несмотря на имеющиеся в литературе данные, в настоящее врелш изуче1тие взаимозависимости мехаш13мов мембрана-контактной

и внутриклеточной циторецепций гормонов далеко не удовлетворительно. Исследования в этом направлении имеют большое значение как в аспекте дальнейшего изучения молекулярных механизмов действия гормонов, так. и в отношении выяснения интимных гормональных механизмов внутриклеточной регуляции. Настоящая работа является частью исследований, посвященных этой проблеме.

Цель и задачи -исследования. Основной целью диссертационной работы было изучение количественных изменений отдельных фракций фосфоинозитидов — как ключевых в функционировании фосфоинозитидного регуляторного механизма липидов, в некоторых мембранных и ксмембранных субклеточных структурах головного мозга крыс на первичном, раннем и позднем этапах in vivo воздействия эстрадиола.

В задачи работы входило:

1. Исследовать содержание общих фосфолипидов, а также их отдельных фракций, в особенности, фосфоинозитидов в сингштосомах клеток головного мозга крыс на разных этапах воздействия эстрадиола.

2. Изучить сдвиги в содержании фосфолипидов, в особенности, фосфоинозитидов в препаратах ядерных мембран клеток головного мозга крыс на разных этапах воздействия эстрадиола.

3. Изучить сдвиги в составе фосфолипидов и, в особенности, фосфоинозитидов ядерного матрикса клеток головного мозга крыс при активирующем геном воздействии эстрадиола.

4. Изучить сдвиги в содержании отдельных фракций фосфолипидов и, в особенности, фосфоинозитидов хроматина клеток головного мозга крыс при активирующем тсном воздействии эстрадиола.

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований выяснено, что в синаптосомах и ядерных структурах (ядерная мембрана, ядерный матрикс, хроматин) головного мозга крыс воздействие эстрадиола сопровождается Сдвигами содержания общих фосфолипидов и их отдельных фракции, что более выражено на раннем этапе воздействия гормона. При этом показано повышение общего содержания фосфолипидов и, в частности, фосфоинозитидов как на первичном, так и на раннем этапах воздействия эстрадиола. Выявлена разнонаправленноегь изменений фосфатидилхолина и сфингомиелина внутриядерных структур клеток головного мозга крыс при in vivo воздействии эстрадиола. Одновременно, установлешго, что при воздействии эстрадиола как в мембранных (синаптосомы и ядерные мембраны), так и внутриядерных (ядерный матрикс и хроматин) структурах происходит заметное перераспределение содержания фосфоинозитидов, причем повышение содержания монофосфоинозитида сопровождается уменьшением количества

трифосфоинозитида, т.е. наблюдается достоверное снижение соотношения трифосфоидазитид/монофосфоинозитид, что не может не иметь важное значение в функционировании фосфоинозитидного регуляторного механизма в мембранных субклеточных структурах.

Практическое значение работы. Изучение молекулярных механизмов действия эстрадиола на состав фосфолипидов и фосфоинозитидоа в некоторых субклеточных структурах головного мозга, несомненно, может иметь также практическое значение, в особенности, для выяснения некоторых задач клинической эндокринологии, в частности, гормонотерапии. Выявление возможных путей гормональной регуляции липидного обмена может оказаться весьма перспективным для лечения обменных метаболических заболеваний.

докладывались на: конференции "Биология старения", посвящешюй 50-легию основания ХГУ, Харьков, Украина, 1995; IX Международной конференции по вторичным посредникам и фосфопротеинам, Нешвилл, США, 1995; научной конференции, посвященной 30-летию основания отделения биофизики биологического факультета ЕГУ, Ереван, 1996; конференции, посвященной 30-летию основания института молекулярной биологии НАН РА, Ереван, 1997.

Публшсцрш. По теме диссертации опубликовано 8 работ (3 статьи и 5

тезисов).

Объем и структура работы. Работа изложена на 125 страницах и содержит 14 тэБлиц и 12 рисунков. Библиография включает 258 наименований литературных источников, из них 25 на русском и 233 на иностранных языках.

Работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы.

В главе I ("Обзор литературы") изложены современные представления о механизмах действия стероидных гормонов и о фосфоикозитидном пути внутриклеточной регуляции.

Краткое содержание остальных глав приводится ниже.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводили на белых беспородных половозрелых крысах-самках массой 100-150 г. Эстрадиол — 17 ß (фирма "Sigma", США) вводили в брюшную полость в концентрации 20 мкг на 100 г массы животного. Крыс декапитировали через 0,5; 1; 4 и 24 часа после введения гормона.

Выделение сннаптосом. Синаптосомы из клеток головного мозга крыс выделяли центрифугированием в градиенте сахарозы по методу Айоша (Hayos,

Выделение ядер. Ядра из клеток головного мозга крыс выделяли по методу Чу и др. (Choie et al., 19/7).

Выделение ядерных мембран. Ядерные мембраны клеток головного мозга крыс выделяли из очищенных ядер по методу Березни и др. (Berezney et al.,

Выделение ядерного мятрикса. Ядерный матоикс клеток головного мозга крыс выделяли по методу Березни и Кофи (Berezney, Coffey, 1976).

Выделение хроматина. Хроматин из очищенных ядер клеток головного мо:!га крыс выделяли по методу Шо и Хуанга (Shaw, Huang, 1970).

Определение белка, ДНК и РНК. Количество белка в пробах определяли по методу Лоури и др. (Lowry et al., 1951). Экстракцию и гидролиз нуклеиновых кислот проводили по методу Спелсберга и Хнилицы (Speisberg, Hnilica, 1971). Количественное определение ДНК и РНК проводили спектрофотометрически, по методу Шмидта и Танхаузера (Schmidt, Tarin hauser, 1945).

Экстракция фосфолшгилов, Фосфолипиды в пробах экстрагировали по методу Каргаполоаа (Каргаполов, 1981)

Кисдашзя зкстратодкЯ- ф^ф01Ш0ЭТ1ТИАРВ. Фосфоинозитиды выделяли из остатка после экстракции фосфолипидов путем избирательной кислотной экстракции (Бергельсон и др., 198Í).

Определение содержания фосфора з фосфолипилах. Количество фосфолипидов определяли по содержанию неорганического фосфора, по методу Эймса (AmeSj 1966), после минерализации проб фосфолипидных экстрактов в присутствии 5N H2S04 и ко1гцентрированной HN03.

ф рдодтшш1родзгше__<рдефоднпидпа____и__фосфоинозттов.

Фракционирование фосфолипидов проводили методом тонкослойной хроматографии, на пластинках (9 х 24 см2, толщина слоя 250 мкм) с с ил moi гелем L в системе растворителей хлороформ — метанол — вода в соотношении 65:25:4 (Кирхнер, 1981).

Фосфоинозитиды фракционировали методом микротонкослойной хроматографии, на пластинках с силикагелем КСК, импрегнированных оксалатом калия (пластинки 6x9 см2, толщина слоя 5-7 мкм). Для разделения использовали систему растворителей хлороформ — метанол — 4N МН4ОН в соотношении 9:7:2 (Бергельсон, 1981).

Пятна фосфолипидов после фракционирования проявляли парами йода. Для идентификации отдельных фракции использовали стандартные фосфолипиды.

Количественное определение фосфолипидов, в том числе фосфоинозитидов проводили по неорганическому фосфору (Ames, 1966).

Результаты экспериментов обрабатывали статистически.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Действие эеградиола на состав фосфоинозитидов синаптосом клеток головного мозга крыс

Общеизтвесгно, что стероидные гормоны имеют внутриклеточный тип циторецепции, однако некоторые литературные данные (Grove, Korach, 1987; Ruzycky, Cranksnaw, 1988) свидетельствуют о том, что стероиды способны воздействовать на инициацию и функционирование фосфоинозитидного механизма. А функционирование фосфоинозитидного механизма наряду с другими факторами во многом зависит от содержания и соотношения фосфоинозитидов, которые могут изменяться в зависимости от функционального статуса мембран. С этой точки зрения, изучение состава полифосфоинозитидов ггри воздействии стероидного гормона эеградиола, способного опосредованно (посредством регуляции биосинтетических процессов) повлиять на функциональный статус мембран, представляло определенный интерес.

Первая серия экспериментов была посвящена изучению содержания фосфолипидов, а также moho-, ди- и трифосфоинозитидов в синаптосомах головного мозга крыс на разных этапах in vivo воздействия эеградиола.

Применение одномерной тонкослойной хроматографии позволило выявить наличие семи индивидуальных фракций фосфолипидов синаптосом (табл. 1). Главными фосфолипидами синаптосом являются фосфатидилхолин и фосфатидилэтаноламин, составляющие соответственно около 30 и 20% от общего количества фосфолипидов. Остальные пять фракций представлены примерно в равных количествах (табл. 1).

В таблице 1 приведены также результаты по изучению содержания фосфолипидов синаптосом через 1; 4 и 24 ч. после введелгия эеградиола. Выбор этих экспозиций был обусловлен литературными данными о том, что уже через час после введения гормона, на первичном этапе его воздействия, усиливается синтез липидов, в то время как на раннем этапе воздействия стероида (4-часовая экспозиция) активируются биосинтетические процессы функциональных белков. Известно также, что стероидная индукция этих белков нивелируется на позднем этапе воздействия (24-часовая экспозиция).

Приведенные в табл. 1 результаты показывают, что как 1-часовое так и 24-часовое воздействие эстрадиола не приводят к достоверному изменению содержания общих фосфолипидов. Достоверное повышение содержания общих фосфолипидов (до 45%) наблюдается лишь через 4 часа после воздействия эстрадиола.

Следует отметить, что повышение содержания общих фосфолипидов неоднозначно сказывается на количестве их отдельных фракций. Причем, изменения в содержании отдельных фракций фосфолипидов наблюдаются как на раннем (через 4 часа после введения), так и на первичном (через 1 час после введения) этапах воздействия эспрадиола. Более значительным изменениям подвергаются фосфолиииды на 4-ом часу воздействия гормона Полученные нами данные свидетельствуют о достоверных изменениях пяти фракций фосфолипидов, причем наибольшему повышению (трехкратному) подвергается фракция

Таблица 1

Содержание обгцих фосфолипидов и их отдельных фракций в синаптосомах клеток головного мозга крыс в контроле и при воздействии эстрадиола

Фосфолипиды Экспозиция гормона в часах

Контроль 1 4 24

мкг/мг белка % мкг/мг белка % мкг/мг белка % мкг/мг белка %

Фосфатидил-серин 47,30 ±4,89 9,0 44,40 ±1,85 8,5 ♦65,12 ±5,62 8,6 51,50 ±1,82 8,9

Сфингомиелин 46,25 ±2,63 8,8 49,06 ±2,54 9,5 ♦144,12 ±13,20 19,2 43,87 ±3,01 7,7

Фосфатидилинозитол 47,71 ±3,43 9,1 ♦101,96 ±3,05 19,6 ♦64,36 ±5,68 8,6 57,94 ±1,70 10,1

Фосфатидил-холин 145,90 ±3,18 27,8 125 ДО ±3,00 24,5 »214,12 ±5,38 28,5 ♦190,60 ±2,26 ЗЗД

Фосфатидил-этаноламин 111,57 ±3,62 21,3 86,41 ±1,89 16,7 117,74 ±15,61 15,7 124,9041 ,96 21,7

Кардиолипин 66,66 ±3,51 12,6 54,33 ±2,89 10,6 62Д1 ±6,31 8,2 54,72 ±4,38 9,5

Фосфатидпая кислота 59,72 ±3,48 11,4 56,67 ±1,84 10,9 ♦84,88 ±10,31 ил 51,19 ±3,25 8,9

Общие фосфолипиды 525,11 ±24,74 100 518,53 ±17,06 100 ♦752,55 ±62,11 100 580Д2±1 838 100

* - Р<0,05

ефшггомиелина Содержание фосфатидилхолина повышается в среднем на 47%, фосфатидной кислоты на 42%, фосфатидилсерина на 38% и фосфатидилинозитола на 35% (табл. 1).

Итак, полученные результаты свидетельствуют о сдвигах в содержании как общего фосфолипида, так и отдельных его фракций в синаптосомах, особенно после 4-х часового воздействия эстрадиола, что, по-видимому, связано с эстрадиоловой активацией биосинтетических процессов в клетках головного мозга крыс.

Ранее Геворкяном и Тадевосяном было показано,что эстрадиол при воздействии in vivo, в концентрациях и при экспозиции, приводящих к активации биосинтетических процессов, способен повлиять на инициацию фосфоинозитидного механизма (Геворкян, Тадевосян, 1990). Вместе с тем, известно, что инициация механизма осуществляется распадом не фосфатидилинозитола, а фосфатидилинозитол 4,5 — дифосфата, т.е. трифосфоинозитида. Следовательно, влияние гормона на иницируемость фосфоинозитидного механизма может затрагивать также его воздействие на состав полифосфоинозитидов в мембранах синаптосом. Для проверки данного предположения Были проведены эксперименты по изучению состава и содержания полифосфоинозитидов в мембранах синаптосом, результаты которых представлены в таблице 2. Как видно из таблицы, значительное

повышение общего количества фосфоинозитидоп наблюдается через 1 ч после введения гормона (почти двукратное повышение содержания монофосфоиноэитида, повышение количества дифосфоиноэитида на 50%, снижение количества трифосфоинозитида на 20%). При 4-часовой экспозиции действия гормона наблюдается повышение содержания монофосфоинозитида и дифосфоиноэитида, в то время как 24-часовое воздействие не приводит к достоверным изменениям содержания всех трех фракций (табл. 2).

Таблица 2

Содержание фосфошшзитидов в сшшптосомах клеток головного мозга крыс в контроле и при воздействии эстрадиола

Фосфоино-зитиды Экспозиция го рмона в часах

Контроль 1 4 24

мхг/мг белка % мкг/мг белка % мкг/мг белка % мкг/мг белка %

Монофосфоинозитид 44,60 ±1,26 54 *95Д0 ±1,82 68,0 +58,80 ±1,0S 59 50,20 ±1,82 50

Дифосфо-инозитид 21 ДО ±0,50 26 *32,60 ±1,29 22,5 23,80 ±0,47 24 25,60 ±0,99 25

Трифосфоинозитид 16,60 ±0,46 20 ♦13,40 ±1,08 9,5 16,60 ±0,34 17 14,60 ±0,27 17

Общее содержание 82,40 ±2,22 100 *141Д0 ±4,19 100 *99Д)±1,90 100 90,40 ±3,08 100

* - Р<0,05

Полученные результаты свидетельстуют о том, что воздействие эстрадиола как на первичном, так и на раннем этапах приводит, главным образом, к повышению количества монофосфоинозитида, причем это повышение заметнее проявляется на первичном этапе воздействия гормона и имеет место не за счет снижения содержания ди- и трифосфоинозитидов, что, вероятно свидетельствует об активации синтетических процессов фосфолипидов стероидным гормоном. Наряду с этим необходимо отметить также достоверное снижение содержания трифосфоинозитидов после 1-часового воздействия гормона, что свидетельствует о заметном перераспределении полифосфоинозитидов в мембранах синаптосом. Примечательно, что соотношение трифосфоинозитид / монофосфоинозитид снижается более чем в 2,5 раза на первичном этапе воздействия гормона, что не может не сказываться на инициируемое™ и функционировании фосфоинозитидного регуляторного механизма- Полученные результаты показывают, что это соотношение в контрольных вариантах опытов составляет 0,35-0,37, в то время как при воздействии эстрадиола оно уменьшается до 0,14-0,16 на первычном этапе и до 0,27-0,28 на раннем этапе.

2. Действие эстрадиола на состав фосфоинозитидов ядерных мембран клеток головного мозга крыс

Данная часть экспериментов была посвящена изучению содержания фосфолипидов, а также moho-, ди- и трифосфоинозитидов в препаратах ядерных мембран головного мозга крыс на разных этапах воздействия эстрадиола in vivo. Изучение фосфолипидного состава ядерных мембран выявило наличие семи индивидуальных фракций, причем содержание фосфатидилхолина и фосфатидилэтаполамина составляло около 50% от общего содержания фосфолипидов, а остальные пять фракций были представлены примерно в разных количествах (табл. 3).

Таблица 3

Содержание обицнх фосфолипидоа и нх отдельных фракций в ядерных мембранах клеток головного мозга крыс в __контроле и ггри ооздействии эстрадиола_

Фосфолипиды Экспозиция гормона в часах

Контроль 0,5 1 4 24

мкг/мг белка % мкг/мг белка % мкг/мг белка % мкг/мг белка % мкг/мг белка %

Фосфатидилсерин 81,60±1,37 9,4 ♦88,6010,94 9,7 ♦973011,86 83 ♦89,701134 8,4 8420±0,79 9,6

Сфингомиелин 89.60ttl.34 10Д 86,0С42,16 9.4 *110,00*2,28 10,0 122,3010,82 11,5 893010,95 10,2

Фосфатидил-инозитол 107ДЮ±1,19 123 ♦142,00±2,26 15,6 ♦145,0012,57 13,2 ♦132,50±1,40 12,4 107,2011,27 12,2

Фосфатидилхолин 260,0014,24 30,0 245,00±3,66 26,8 ♦309,0015,16 28,1 ♦308,304:2,66 28,9 255Д0±1,42 29,1

Фосфатидилэтаноламин 174,00± 2,39 20,0 175,0012,85 19,1 ♦231,00±2,99 21,0 ♦238,4014,99 223 171,8010,66 19,5

Фосфатидная кислота 83,0011,25 9,5 90,0010,97 9,8 ♦104,0011,69 9,5 88,0011 ДО 8,3 87,20±0,85 9,9

Кардиолипин 75,00±1,30 8,6 *88,00±и5 9,6 ♦103,50±1,79 9,4 ♦87,8011,14 8,2 ♦833010,95 93

Общие фосфолипиды 869,60±13,08 100 914,60±14,09 100 ♦1099,8011834 100 ♦1067,00113,75 100 879Д0±6,89 100

* - Р<0Д5

В таблице 3 приведены также результаты изучения фосфолипидногс состава ядерных мембран после введения животным эстрадиола. Через 1 и 4 ча« после воздействия гормона содержание общих фосфолипидов в ядерных мембрана} повышалось на 22-26'%, в то время как получасовая и 24-часовая экспозиций гормона не приводили к достоверным изменениям в содержании фосфолипидов Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что эстрадиол прк воздействии in vivo способен вызвать заметные перестройки в составе фосфолипидов ядерных мембран клеток головного мозга крыс, видимс необходимые для реализации действия тормона на геном. На последнее указывает также отсутствие гормонального эффекта на первичном (0,5 часа) и позднем (24 часа) этапах воздействия эстрадиола (табл.3). Под действием гормона наблюдается повышение содержания почти всех индивидуальных фракций фосфолипидов, что. по нашему мнению, свидетельствует об универсальном и однозначном характере влияния тормона на обмен фосфолипидов в ядрах (табл.3). Эти сдвиги могут изменить функциональный статус ядерных мембран, в результате чего, заметное повышение содержания фосфатидилинозитола в мембранах может сказываться на функционировании фосфоинозитидной регуляторной системы, наличие которой в ядерных мембранах нельзя исключить, исходя из некоторых данных научной литературы (Asano et al,, 1994). Проведенные нами дальнейшие исследования по изучению содержания фосфоинозитидов в ядерных мембранах клеток головного мозга крыс, показали, что повышение содержания монофосфоинозитида (28-40%) на первичном и раннем этапах воздействия гормона, главным образом, происходит за счет снижения содержания ди- и, в особенности, трифосфоинозитида, что свидетельствует о заметном перераспределении полифосфоинозитидов в ядерных мембранах (табл. 4). По-видимому, эсградиол регулирует активность ферментов, ответственных за взаимопревращение фосфоинозитидов, и полученное нами 24-36% повышение содержания фосфатидилинозитола (т.е. монофосфоинозитида) (табл.3) не яа\яется следствием активации синтетических процессов фосфолипидов вызванных стериодом, тем более, что повышение общего содержания трех фракций фосфоинозитидов недостоверно (табл4).

Таблица 4

Содержание полмфосфоиноизитидов в ядерных мембранах клеток головного мозга крыс в контроле и при воздействии эстрадиола

Фосфо-инозитиды Экспозиция гормона в часах

Контроль 0,5 1 4 24

мкг/мг белка % мкг/мг белка % мкг/мг белка % мкг/мг белка % мкг/мг белка. %

Монофосфо-инозитид 101,30 ±1,92 46,4 ♦133,00 ±3,40 59Д ♦142,50 ±3,39 59,8 ♦130,00 ±1,47 54,8 ♦109,30 ±1,68 49,5

Дифосфо-инозитид 68 ДО ±0,93 28,8 ♦55,60 ±0,90 24,8 ♦62,80 ±0,77 26,3 67,70 ±0,64 28,6 63,40 ±1,56 28,7

Трифосфо- и1юзитид 54,00 ±0,53 24,8 ♦36,20 ±0,79 16,0 ♦33,00 ±0,71 13,9 ♦39,30 ±1,04 16,6 48,10 ±3,75 21,8

Общее содержание 223,50 ±3,38 100 224,80 ±5,09 100 238,30 ±4,87 100 237,00 ±3,15 100 220,80 ±6,99 100

* - Р<0,01

Результаты исследований показывают, что стероидное воздействие вызывает снижение соотношения трифосфоинозитид/монофосфоинозитид примерно в 1,82,3 раза, в зависимости от экспозиции гормона, что не может не сказываться на возможном функционировании фосфоинозитидного механизма в ядерных мембранах.

3. Действие эстрадиола lia состав фосфоинозитидов ядерного матрикса клеток головного мозга крыс

Важную структурно-функциональную роль ядерного матрикса в жизнедеятельности клетки трудно переоценить. Хотя фосфолипиды представлены в лгатриксе в малых количествах, не исключена возможность их участия в таких фундаментальных процессах, как репликация и транскрипция, тем более, что липидные компоненты других ядерных структур несут определенную функциональную нагрузку (Левитана, 19/5; Viola-Magni et al., 1985). Не исключено также участие липидов ядерного матрикса в процессах гормональной регуляции генетического аппарата.

Данная серия экспериментов была посвящена изучению содержания фосфолипидов, а также moho-, ди- и трифосфоинозитидов в препаратах ядерного матрикса клеток головного мозга крыс на первичном, раннем и позднем этапах in vivo воздействия эстрадиола, что позволит ближе подойти к пониманию роли фосфолипидов ядерных структур в процессах стероидной регуляции генома.

Фракционирование фосфолипидов препаратов ядерного матрикса выявило наличие шести индивидуальных фракций с характерным для этих препаратов процентным соотношением (табл.5); более 30% общих фосфолипидов представлено сфингомиелином, в то время как содержание основного фосфолипида ядер — фосфатидилхолина не доходит до 22%. Обращает на себя внимание также присутствие в препаратах заметного количества фосфатидилэтаноламина (примерно 16%), фосфатидилинозитола (12,7%), в особенности, кардиолипина и фосфатидной кислоты (10,2 и 9,1% соответственно) — фосфолипидов характерных для внутренных структур ядра (Алесенко и др., 1982).

В таблице 5 приведены также результаты по изучению действия эстрадиола на содержание фосфолипидов в ядерном матриксе. Эстрадиол приводит к достоверному повышению содержания общих фосфолипидов (примерно на 1520%) лишь через 1 и 4 часа после введения гормона, (табл.5), что свидетельствует о влиянии стероида на липидный состав матрикса посредством активации им биосинтетических процессов. Примечательно, что 0,5-часовая и 24-часовая экспозиции гормона не приводят к достоверным изменениям общего содержания фосфолипидов. В то же время, изменения в содержании отдельных фракций фосфолипидов наблюдаются как на раннем (через 4 часа после введения гормона), так и на первичном (через 0,5 и 1 час после введения) этапах воздействия эстрадиола (табл. 5). Последнее указывает на быстродействие гормона, приводящее к межфракционным превращениям фосфолипидов внутриядерных структур, в частности, ядерного матрикса. Разнонаправленносгь изменений в содержании фосфатидилхолина и сфингомилина, по-видомому, объясняется гормональным усилением процесса перехода фосфорилхолина с молекулы фосфатидилхолина на молекулу сфингомиелина (Nelson et at, 1981). Известно, что высокая концентрация сфингомиелина в ядерном матриксе объясняется возможной ролью этого фосфолипида в инициации репликации ДНК, а повышение его относительного содержания может привести к дестабилизации структуры ДНК, разрыхлению суперструктуры хроматина, что будет способствовать повышению его матричной активности при воздействии стероида (Алесенко и др., 1982; Геворкян и др. 1987). С таким предположением созвучны полученные нами результаты, свидетельствующие о том, что достоверное повышение доли сфингомиелина в общем количестве фосфолипидов ядерного матрикса наблюдается лишь на 4-ом часу воздействия гормона, т.е. при максимальной активации биосинтетических процессов (табл. 5).

Результаты, полученные нами показывают, что на первичном этапе воздействия эстрадиола наиболее значительное повышение наблюдается в содержании фосфатидилинозитола (на 25% — при 0,5- часовой и на 52% — при 1-часовой экспозициях гормона, табл. 5). Примечательно, что фосфатидилинозитол

Таблица 5

Содержание общих фоофолшгидоя и их отдельных фракций в ядерном, матриксе клеток головного мозга крыс в

контроле и при воздействии эстрадиола

Фосфолипиды Экспозиция гормон« II 'ИК'Д*

Контроль 03 1 4 24

мкг/мг белка % мкг/мг белка % мкг/мг белка % мкг/мг белка % мкг/мг белка %

Сфингомиелин 12,97±0,04 30,6 13,06±0,04 29,4 ♦14,56±0,11 29,8 *17,82±0,18 35,4 12,46±0,69 29,4

Фосфатидил-инозитол 5,41*0,08 12,7 *6,75±ОД5 Ш »8,2010,03 16,8 *6,32±0,05 12,6 5,64±0,09 13,3

Фосфатидил-холин 9,18±0,04 21,7 *8,43±0,08 19,0 *8Д5±0,05 16,9 *7,41±0,10 14,7 8,87±0,09 20,9

Фосфатидил-этаноламин 6,65±0,15 15,7 *732±0,05 16,9 *7,98±0,05 163 *8Д8±0,03 16,5 7,16±0,07 16,9

Фосфатидная кислота 335±0Д8 9,1 *4,12±0,05 93 *4,74±0,03 9,7 *5,02±0,08 10,0 3,88±0,02 9,1

Кардиолипин 434±016 10,2 *4,55±0,01 10,2 ♦5, то,03 103 ♦5,45±0,03 103 4,42±0,09 10,4

Общие фосфолИМИДЫ 42,40±0,55 100 44,43±0,48 100 *48,85±0,30 100 *50,3±0,47 100 42,4 3± 1,05 100

* - Р<0Д5

является единственной фракцией, доля которой в общем содержании фосфолипидов ядерного матрикса заметно повышается на первичном этапе воздействия гормона (с 12,7% — в контроле, до 16,8% — после воздействия эстрадиола), а на раннем и позднем этапах воздействия снижается до контрольного уровня. Изменения в содержании фосфолипида, несущего значительную функциональную нагрузку особенно в нервной ткани, могут быть опосредованно связаны с воздействием стероидного гормона на функционирование фосфоинозитидного регуляторного механизма, наличие которого в ядрах можно считать вероятным (Азапо й а1., 1994). Проведенный нами анализ состава фосфоинозитидов фракций ядерного матрикса показал, что если общее количество фосфоинозитидов достоверно не изменяется при воздействии гормона, то содержание всех трех фракций при этом значительно изменяется (табл. 6). Повышение содержания монофосфоинозитидов сопровождается снижением количества ди- и ■фифосфоинозитидов как на первичном, так и на раннем этапах воздействия эстрадиола Примечательно, что соотношение

трифосфоинозитид/монофосфоинозитид снижается более чем в 2,5 раза на первичном этапе, а на позднем этапе воздействия доходит до контрольного уровня. Наблюдаемое перераспределение в фосфоинозитидах ядерного матрикса, указывает на то, что эсградиол, при активации биосинтетических процессов, способен вызывать изменения в содержании фосфоинозитидов внутриядерных структур, по-видимому, однозначно влияя на активность ферментов, ответственных за их взаимопревращения.

Таблица 6

Содержание фосфоинозитидов в ядерном матриксе клеток головного мозга крыс в контроле и при воздействии эстрадиола

Фосфо-инозитиды Экспозиция гормона в часах

Контроль 0,5 1 4 24

мкг/мг белка % мкг/мг белка % мкг/мг белка % Мкг/мг белка % лисг/мг белка %

Монофосфо-инозитид 6,51 ±0,07 46 *8,14 ±0,06 58 *9,77 ±0,05 65 *7,70 ±0,05 60 6,74 ±0,06 49

Дифосфо-инозитид 4,24 +0,03 30 *3,55 ±0,02 26 *3,37 ±0,02 22 *2,53 +0,03 20 *4,06 ±0,05 29

Трифосфо-инозитид 3,36 ±0,03 24 *2,23 ±0,03 16 *1,87 ±0,02 13 *2,62 ±0,03 20 3,04 ±0,03 22

Общее содержание 14,11 +0,13 100 13,92 ±0,11 100 »15,01 ±0,09 100 *12,85 ±0,11 100 *13,84 ±0,14 100

Р<0,05

Таким образом, эстрадиол на первичном и раннем этапах воздействия способен как активировать синтетические процессы фосфолипидов, так и вызывать заметное межфракционное перераспределение индивидуальных фосфолипидов ядерного матрикса, которые могут быть связаны с процессами специфической активации генома вызванных воздействием стероида.

4. Действие эстрадиола на состав фосфоинозитидов хроматина клеток головного мозга крыс

Основным этапом в молекулярном механизме действия стероидных гормонов на геном клеток-мишеней является связывание ядерных рецепторов — факторов транскрипции с хроматином, в частности, со специфическими последовательностями ДНК ( Zilliacus et al., 1995; McEwen et al., 1997). При этом специфические сдвиги могут наблюдаться как в составе главных, так и минорных

компонентов хроматина, какими являются липиды. Эта липиды, в особенности фосфолипиды, могут влиять на функциональную активность генома, возможно, образуя с нетисгоновыми белками хроматина липопротеидные комплексы, регулирующие генную активность.

Данная серия экспериментов была посвящена изучению качественного и количественного состава фосфолипидов и moho-, ди- и трифосфоинозитидов в препаратах хроматина клеток головного мозга крыс на раннем (через 4 часа после введения) этапе воздействия эстрадиола. Фракционирование выявило наличие шести фосфолипидов в препаратах хроматина, причем более 2/3 общего количества фосфолипидов представлено фосфатидилхолином — 23,5%,

фосфатидилэтаноламином — ¿0,4% и сфингомиелином — 21,4%, в то время как кардиолипин, фосфатидилинозитол и фосфатидилсерин составляют лишь 10—15% каждый (табл.7). Результаты наших исследований показали, что

воздействие

Таблица 7

Содержание общих фосфолипидов и их отдельных фракций в препаратах хроматина клеток головного мозга крыс в контроле и при воздействии эстрадиола_

Фосфолипиды Контроль Эсградиол

мкг/мг белка % мкг/мг белка %

Фосфатидилхолин 23,80+2,38 23,5 24,6Gt2,ll 19,4

Сфингомиелин 21,70+1,50 21,4 »33,60+3,31 26,5

Фосфатидилэтаноламин 20,65± 2,40 20,4 *25,15±2,37 19,8

Кардиолипин 14,9 5± 1,53 14,8 17,75+1,66 14,0

Фосфатидилинозитол 10,10+1,02 10,0 *15,05±1,30 11,9 "

Фосфатидилсерин 10,05±1,56 9,9 10,65±1,78 8,4

Общие фосфолипиды 101,2 5±9,3 100 *126,80£11,5 10Ü

* - Р<0,05

эстрадиола приводит к повышению общего количества фосфолипидов более, чем на 25%, причем наибольшие изменения претерпевают фракции сфингомиелина и фосфатидилинозитола, содержание которых повышается почти на 55% и 49% соответственно (табл.7).

Воздействие стероида приводит также к некоторому перераспределению фракций хроматиновых фосфолипидов, в частности, уменьшению относительного содержания фосфатидилхолина и повышению относительного содержания сфингомиелина (табл.7). Разнонаправленность изменений содержания фосфатидилхолина и сфингомиелина здесь также можно объяснить возможным гормональным усилением процесса перехода фосфорилхолина с молекулы фосфатидилхолина на молекулу сфингомиелина, что предполагается также другими авторами (Nelson et al., 1981). Известно, также, что повышение содержания сфингомиелина может оказывать дестабилизирующее влияние на хроматин и, тем самым, способствовать повышению его матричной активности при воздействии эстрадиола.

С целью выяснения возможных причин столь значительного повышения содержания фосфатидилинозитола нами проводилось также дальнейшее его изучение путем фракционирования и определения содержания полифосфоинозитидов в препаратах хроматина (табл. 8). Исследования показали, что более половины содержания фосфоинозитидов обнаруживается во фракции монофосфоинозитида (т.е. фосфатидилинозитола), в то время как содержание трифосфоинозитида едва доходит до 20% (рис. 1). При эстрадиоловом воздействии (через 4 часа после введения гормона) значительное повышение содержания монофосфоинозитида сопровождается заметным уменьшением содержания ди- и трифосфоинозитидов (табл.8), т.е по-видимому, гормон главным образом действует на активность ферментов, осуществляющих взаимопревраще!Гие

полифосфоинозитидов. Соотношение трифосфоинозитид/монофосфоинозитид при этом снижается более, чем в два раза (в контроле — 0,35, при воздействии гормона — ОД6) (рис. 1).

Таблица 8

Содержание фосфоинозитидов в препаратах хроматина клеток головного мозга крыс в контроле и при воздействии эстрадиола

Фосфоинозитиды Контроль Эстрадиол

ллкг/мг белка мкг/мг белка

Монофосфои нозити д 10,73±0,68 *15,82±1,02

Дифосфоинозитид 6,15±0,42 *3,62±0,24

Трифосфоинозитид 3,80±ОД5 *2,52±0,16

Общее содержание 20,68±135 21,96±1,42

* - Р<0,05

Таким образом, воздействие эстрадиола in vivo в концентрации и жспозиции, вызывающих активацию биосинтетических процессов

функциональных белков, заметно сказывается на содержании фосфолипидов в грепаратах хроматина. Эти результаты созвучны с изменениями в составе ¡юсфолипидов ядерных мембран и ядерного матрикса и свидетельствуют о том, то, видимо, некоторые пути липидного метаболизма ядер клеток головного мозга ;рыс находятся под контролем стероидного гормона эстрадиола.

Рис. 1. Процентное содержание отдельных фракций фосфоинозитидов в репаратах хроматина головного мозга крыс в контроле и при воздействии :традиола.

— контроль, 2 — воздействие эстрадиола;

иофосфоинозитид, [ | — дифосфоинозитид,

—грифосфонозитид.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изменение содержания фосфатидилинозитола, а также сдвиги в соотношении moho-, ди- и трифосфоиноэитидов в мембранных структурах клеток-мишеней, наблюдаемые на первичном и раннем этапах действия эстрадиола, могут быть непосредственно связаны с функционированием фосфоинозитидною регуляторного механизма. С этой точки зрения, полученные нами результаты об изменениях в составе фосфоинозитидов, в особенности в синаптосомах и ядерных мембранах, представляют определенный интерес Учитывая, что изучалось влияние гормона в концентрации и экспозициях, приводящих к индукции функциональных белков, выявленные сдвиги могут быть результатом эстрадиоловой активации биосинтетических процессов в клетках головного мозга и могут свидетельствовать о взаимосвязи процессов стероидной активации генома и функционированием фосфоинозитидною регуляторного механизма. Эти результаты содержат научную новизну и существенно дополняют имеющиеся в литературе данные о чувствительности фосфоинозитидною пути регуляции в1гугоиклеточного метаболизма к воздействию стероидных гормонов (Grove, Korach, 1987; Ruzycky, Crankshaw, 1988; Brann et al, 1995).

Схожие результаты были получены также при изучении состава фосфолипидов и фосфоинозитидов внутриядерных структур — ядерного матрикса и хроматина, играющих ключевую роль в основных функциях ядра — репликации и транскрипции. Эстрадиол на раннем этапе воздействия вызывал достоверное повышение содержания этих минорных компонентов ядерного матрикса и хроматина, причем были выявлены аналогичные сдвиги в содержании отдельных фракций. На фоне заметного повышения содержания сфингомиелина, фосфатидилинозитола, фосфатидилэтаноламина в обеих структурах наблюдалось резкое снижение доли фосфатидилхоли¡га. Последнее, как было уже отмечено, вероятно, обусловлено усилением переноса группы фосфорилхолина из молекулы фосфатидилхолина в молекулу сфингомиелина, на что указывают и литературные данные (Nelson et al., 1981). По всей видимости, стероидный гормон регулирует этот процесс, увеличивая содержание сфингомиелина в хроматине и ядерном матриксе, что свидетельствует о важной функциональной роли этого фосфолипида в процессах экспресии генома. Как известно, сфингомиелин, по сравнению с другими фосфолипидами, имеет сильное дестабилизирующее действие на структуру ДНК, а повышение его содержания способствует повышению матричной активности хроматина (Алесенко, 1982). Примечательно, что сдвиги в составе полифосфоинозитидов внутриядерных структур аналогичны изменениям, наблюдаемым в мембранных структурах — синаптосомах и ядерных мембранах.

Изменения в составе фосфолипидов и фосфоинозитидов во всех изученных субклеточных структурах выявляются на первичном и, в особенности, на раннем этапах воздействия стероида и полностью нивелируются на позднем этапе воздействия. Данный факт является дополнительным подтверждением того, что эти сдвиги связаны с эстрадиоловой активацией биосинтетических процессов белков, ферментов, так как хорошо известно, что на позднем этапе воздействия стероидов (на 24-ом часу воздействия) гормональная индукция большинства функциональных белков нивелируется и их биологическая активность возвращается к контрольному уровню.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что эстрадиол, активируя биосинтетические процессы в клетках головного мозга крыс, приводит к достоверным сдвигам в составе фосфоинозитидов во всех исследованных субклеточных структурах. Повышение содержания монофосфоинозитида с одновременным снижением содержания трифосфоинозитида может быть связано с эстрадиоловой регуляцией активности ферментов, ответственных за взаимопревращение полифосфоинозитидов. Разумеется, что для такого утверждения необходимы дополнительные, непосредственные эксперименты по изучению влияния эстрадиола на ферментативную активность соответствующих фосфолипид-киназ и фосфолипид-фосфатаз, что может быть предметом отдельного исследования. Обнаруженное

нами перераспределение во фракциях фосфоинозитидов в изученных мембранных структурах должно иметь важное значение в функционировании фосфоинозитидного механизма, а количественное соотношение трифосфоинозитид/монофосфоинозитид может служить своеобразным показателем

Физиологического статуса мембран, в отношении функционирования осфоинозитидного регуляторного пути.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что эстрадиол на раннем этапе воздействия приводит к повышению общего количества фосфолипидов синаптосом клеток головного мозга крыс, причем заметно увеличивается содержание пяти из семи выявленных фракций. Повышение содержания фосфатидилинозитола — ключевого для функционирования фосфоинозитидного механизма фосфолипида, обнаруживается как на первичном, так и на раннем этапах воздействия гормона.

2. Обнаружено, что на первичном и раннем этапах воздействия гормона повышение монофосфоинозитида в синаптосолгах сопровождается снижением доли ди- и, в особенности, трифосфоинозитида.

3. Показано, что эстрадиол как на первичном, так и, в особенности, на раннем этапах воздействия приводит к повышению содержания как общего фосфолипида, так и всех отдельных фракций в препаратах ядерных мембран клеток головного мозга крыс, что свидетельствует об универсальном и однозначном влиянии гормона.

4. Показано, что в ядерных мембранах также повышение количества монофосфоинозитида сопровождается снижением содержания трифосфоинозитида как на первичном, так и на раннем этапах воздействия эстрадиола.

5. Показано, что эстрадиол на первичном и раннем этапах воздействия приводит к заметному повышению содержания фосфолипидов - минорных компонентов внутриядерных структур: ядерного матрикса и хроматина В обеих структурах обнаруживается заметное повышение сфингомиелина -, липида, играющего важную роль в процессах активации транскрипции, с одновременным значительным снижением доли фосфатидилхолина

6. Обнаружено, что во внутриядерных структурах также эстрадиол на первичном и раннем этапах воздействия приводит к повышению содержания монофосфоинозитида, что является следствием межфракционных превращений полифосфоинозитидов и сопровождается снижением содержания ди- и, в особенности, трифосфоинозитидов.

7. Во всех изученных структурах на позднем этапе воздействия эстрадиола сдвиги изменений в содержании общего фосфолипида и его отдельных фракций не обнаруживаются. Это, вероятнее всего, свидетельствует о том, что выявляемые заметные сдвиги в содержании фосфолипидов и, в том числе, фосфоинозитидов, на первичном и раннем этапах воздействия гормона являются результатом гормональной активации биосинтетических процессов.

8. Обнаружено, что эстрадиол на первичном и раннем этапах воздействия приводит к заметному снижению количественного соотношения грифосфоинозитид/монофосфоинозитид, что не может не сказываться на функционировании фосфоинозитидного регуляторного механизма в изученных мембранных структурах. Данное соотношение можно предложить как своеобразный функциональный показатель мембран в отношении функционирования фосфоинозитидного механизма.

Список работ, опубликованных по Л1атериадам диссертации

1. Геворкян Э.С, Арцруни И.Г., Явроян Ж.В., Лкопян Н.Р. Сдвиги в составе фосфоинозитидов мембран синаптосом головного мозга крыс при воздействии эстрадиола // Тез. докл. конф. "Биология старения", поев. 50-летию основания ХГУ, Харьков, 1994. - с. 23.

2.Геворкян Э.С, .Явроян Ж.В., Арцруни И.Г., Акопян Н.Р. Действие эсградиола на состав фосфоинозитидов синаптосом головного мозга крыс // Вопр. мед. химии. -1995.-М - с. 35-37.

3. Gevorkian Е., Yavroyan Zh., Arzruni I.,Tadevosian Yu., Hakobian Ы. Interdepency between the mechanisms of protein induction and protein modification caused by estradiol // 9-th International con£ on second messengers & phosphoproteins, 1993. Nashville, Tennesseu, USA, N5 269.

4. Арцруни И.Г., Акопян H.P. Действие эсградиола на содержание фосфолипидов хроматина из мозга крыс // Мат. науч. конф. поев 30-летию основ, отдел, биофизики биол. фак. ЕГу, Ереван, 1996. - с 27.

5. Явроян Ж.В, Акопян H.P. Действие эсградиола на состав полифосфоинозитидов ядерных мембран клеток головного мозга крыс // Мат. науч. конф. поев. 30-летию основ, отдел, биофизики биол фак. ЕГУ, Ереван, 1996. - с. 64.

6. Геворкян Э.С, Акопян Н.Р., Явроян Ж.В., Арцруни И.Г., Демирханян Л.О. Состав полифосфоинозитидов ядерных мембран клеток головного мозга крыс при воздействии эсгоадиола // Мат. науч. конф., поев. 30-летию основ, инст. мол. биологии НАН РА, Ереван, 1997. - с. 22.

7. Геворкян Э.С, Явроян Ж.В., Арцруни И.Г., Акопян Н.Р. Демирханян АО. Действие эсградиола на состав фосфоинозитидов ядерных мембран клеток головного мозга крыс // Укр. биохим. ж. -1998. -Т. 70. -№ Г.- с. 53-58.

8. Геворкян Э.С, Арцруни И.Г., Явроян Ж.В., Акопян Н.Р., Демирханян Л.О. Действие эсградиола на состав фосфолипидов ядерного ллатрикса клеток головного мозга крыс /У Вопр. мед. химии. -1998. -№ 4.-е.

9.Геворкян Э.С, Акопян Н.Р, Лрцруни И.Г., Явроян Ж.В., Демирханян АО. Действие эсградиола на состав фосфолипидов хроматина клеток головного мозга крыс // Вопр. мед. химии, (в печати).

10. Акопян Н.Р, Действие эсградиола на состав фосфоинозитидов ядерного матрикса клеток головного мозга крыс // Ученые записки ЕГУ, (в печати).

¿UMílPOU-u "bíU'bb iMUTbtib

tusnu-n-hnuh идаьвпмэ-зпь'ъц qajuniibat1 РДЬЯ'ЬЬРЪ flPflD b'bia-U.PSSU.Bh-U MUf>ni84U.tr-ß,obPh гьпи&пм^пзг'зпп.ъьръ чри.

Ц.1ГФПФЦ,ЯФР

¿,iuGqmguii|iG pumbp1 GkppgpuijfiG l/uipqwi{r>pmil, tvinpiuiffini, фпифщ^щ^вЬр, $nu$nfiGnqfiwftriiu¡liG niqf), щ^пщЬц, uftûiuufutnumf, Ijnpfiqiupiur} iiiGp, IfnpfiquijfiG ifuiinpfrgu, gpnihuinfiG:

U,2futummí¡Bii Gilfipi^ö t dun]iuGuil|Lul||ig йп^пцш^С IjbGuuipuiGmpiiuG U ^bGuuiEtuJfiwifi шргфш1|шй fi|nlûuifiuipgbpfig iThlifiG4 Ghppggmjt>G 1|шр qun|riptfuiG tfn]hl|m]Uij|iG tfhJuuiG^qiîGhpJi

numuJGuiuJipmpiuiGp: ¿.buiuiqmnmpiiuG шпшр1)ш hC г^шрЙЬх uinGbuiJi tVifumrihT\Ji pgfigGhplig uiGguiim|uiü фрш1)д}Ю10ЬргшГ JiGimulpn u}iGuiu|mnun\JGhpiuiI, ljnji|iquipiuriiuGpGhpmtJ, l|np)iqujj|iG tfutuipfigunuT U ppniluunfiGnuI фпифп^ифг^Ьр^ U, fiuunl|uiu|hu, $ni^nfiGnqliinfiqGhpti ljuiqilnuJ mbq|i niGhgnr^ giuGiul)iul|uiG U пршЦш^шО i|im|m}umpini.GGhpp tuwpuirj}ini|) in vivo uiqri-hgtupiiuG inuipphp dxuiFlihinGbpfi rj.bu|j3nul: Tluipqijbi t, np tuinpmrvfin^G }ip iuq»ibgnipiuiG uimu^GuijliG k, umiuG3Guiiqbu, ^шц фпцгт! ргцпр Rbinuiqnini|nq GilnigGhpnuI fimGqbgGruil t фпифп^щ^г^СЬр}! pGqfiuiGnip uiuipniGuilinippuG, }iG£U|hu GuiU umuiGSftG фрш1|д|1шСЬр{1 puiGuilnuljuiG ifimfinfurupiruGGbpf), fiGyi i[lpuinul t qijuniqbiifi pgJigGbpnuI llia||ir}Ghpti UbinmpniJiqiTti finpiInG-qquipuGmpjiuG iIuiufiG: l}Gpuarypi|nuI t, np mqrçbgrupiiuG uin.ui¡>GuijtiG U Ц.ШЧ фпцЬрпи! }i fiiujin bljnq ици i(ini|infumpjmGGbpp |Jiu|}irvGbp}i U фпШ^д^пОш! uiqJiuiiutyiugGbpti l)hGuiuu}iGjshin|iL| u)pngbuGbp]i uil|infii|uigiîuiG uipqjmGp hG: Uinuigi(uiô luprçjruGpGhpJi fiftiJutG 4РШ uip}^ni^Ti|iGnq]iintiTj/i]nGr^ni^n|iGnq|7intir} puiGiuL|uiljiuG fiiupiupbpnippuG[] шпш2шр1ц[пн1 t npiqhu pmr^mGpGhpfi фпифгфОг^^ифгуъифС l|uipqwi(npji¿ iTblurnGJiqiTJi qnpôruGbnipjuiG шппиГт| inipiufiiuuinil| фтиС^д^пСиц gnigutG|i2:

U.uihGiii|unumpiiuG Ubg Ghp^uiimg^uiö uipqimGpGbpp mGhG JiGjiqbu RfitfGuipiup qfiuiujl|uuG, iu¡Gu)bu t;[ qnpöGuil|wG G2UiGuil|ni.p]mG:

Il.W