Кооперативные процессы модификации липидного компонента мембран в регуляции клеточной активности

Тадевосян, Юрий Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Кооперативные процессы модификации липидного компонента мембран в регуляции клеточной активности
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Кооперативные процессы модификации липидного компонента мембран в регуляции клеточной активности"

ИНСТИТУТ ВИОХИМИИ им. Г.Х. ВУНИЯТЯНА НАН НА

ГТ6 од

_ На кранах рукописи

- ъ ОПТ «96

и ТАДКВОСИНЮРИП ВИКТОРОВИЧ

удк 577.125 (577,15 ? .05

кооперативные процессы модификации ли1шдного компонента мемнран в регуляции клеточной активности

(Ч.ООЛМ-бинхимии)

а в т о р н ф и р а т диссертации на соискание ученой си-пени доктора биологических наук

ереван - 1996

чци ч. е. ргиъьшэзиьь шй^шй мььииемгьизь мл^ьэльэ

ЭЬпшчр[1 ^ршфиОеш!

гаичьапизиь зги-рь а^эппь

П^П 577.125-t-577.151.05

гаиаиыэъьпь ьь'льпизы. рцчцорьэь иппьъьмцзьизь мгульриэм ^рпзьиъьпь оьро рааизьъ ц^мш-газиъ ццрадаприиъ иьа

(Р.00.04 - ^ЬОишеИЬш)

иБьъи^пилказиь иьаииррр

1)Ь0ишршйш1|ш0 ц|илтр]П100Ьр|1 (1пЦтпр|1 ч|шии1|шй шиифбшй ИицдЬци Ишйшр

ЬРЫ11Ь - 1996

Работа выполнена н Именную молекулярной биологии ПАН 1'Л

Официальные оппоненты : докт. биол. паук,

профессор ХАЧАТРЯН Г.С.

докт. бпол. наук, профессор БАДЖПНЯН С.А.

докт. биол. наук

ст. и. с. НАЗАРЯН К.Б.

Ведущая организация : Ереванский государственный медицинский университет им. М. Гераци

Защита состоится "// " _ 1996 г.

//у IС-О '

в /7 часов на заседании специшшзнронанного Сонета 042 при Институте биохимии им. Г. X. Бумятяна НАН РА но адресу: Ереван-14, ул. П. Севака 5/1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии им. Г.Х. Бунятяна HAH РА

Автореферат разослан " д?, " _ (996 I

Ученый секретарь специализированного Совета

докт. биол. наук, профессор W. . () A.A. Симонян

ОБЩАЯ ХАРАКТНРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В накопленном за последние два десятилетия обширном фактическом материале о функционировании в клеточных мембранах ФИ -го сигнального механизма псе больше появляется экспериментальных данных о быстрой (в течение секунд) активации ФИ-ФДЭ (Drummond А.Н., 1986; Matozaki Т. and Williams A., 1989) с последующим образованием вторичных посредников. Наряду с этим, внимание исследователей привлекают вопросы, связанные с выяснением функционального значения как процессов модификационных взаимопревращений отдельных ФЛ фракций (Ilirata F. et.al, 1980, Akamatsu Y., 1994), так и продукт» ферментативного гидролиза последних (Huang J. et.al, 1992; Asaoka Y. et.al, 1993; Ryborg А.К. et.al, 1994) на различных л'апах стимуляции клеток и формирования клеточных ответов. Все очевиднее становится огромная роль модификаций ЖК-состава лшшдов в функционировании мембранных структур нормальных и патологически трансформированных клеток. Однако при этом традиционно исследуются в основном мембраносвязанные и цитозольные ФЛазы А2 (Cifone M.G. et.al,

1993). Накапливаются данные и о возможном участии мембранных ФЛаз типа Д и С (Isakov N., 1993; Ktistakis N.T. et.al, 1995) в обеспечении транслокации внешних сигналов. Довольно широкомасштабными продолжают оставаться исследования на уровне изучения изменений во фракционном составе н реакциях de novo синтеза мембранных ФЛ и НЛ (Selevich M.I. et.al, 1993; Nakano 11. et.al, 1994; Van Den Boom M.A.P. et.al,

1994), а также процессов их деащшнропания-реацшшрования (Fisk H.А., and Kano-Sucoka T., 1992; (ïalli С. et.al, 1993) n различных патологических состояниях организма.

* Использованные сокращения: ЛПКЧ-лимфоциты периферической крови человека, ПМ-плазматическая мембрана, ЛМ-лизосомапьная мембрана, ЯМ-ядерная мембрана, ФЛаза-фосфолипаза, ФИ-ФДЭ- фосфоинози гнд-специфичная фосфодиэстераза, ПКаза-протеннкиназа, ЛОГ-липоксигеназа, ЦОГ-цнклоксигеназа, ФЛ-фосфолипиды, НЛ-нейтральные липиды, ФХ-фосфатидилхолины, ФИ-фосфатидилинозиты, ФИ-4-Ф-фосфатидилинозит-4-фосфат, ФИ-4,5-Ф2-фосфатидилинозит-4,5-дифосфат, ФС-

фосфатидилсерины, ФЭ-фосфатидилэтаноламины, ФК-фосфатидные кислоты, ДФГ-дифосфатцдилглицерины, СФМ-сфннгомиелины, МГ-моноглицеридцДАГ-диглицериды, ТГ-триглицериды, Х-холестерин, ЭХ-эфиры холестерина, ЖК-жнрные кислоты, АК-арахидоновая кислота, ОК-олеиновая кислота, ПК-пальмитиновая кислота, 5-НЕТЕ-5-гидроксиэйкозатетраеновая кислота, ИФ3-инозит трнфосфат, ГФИ-глицерофосфорнлинозпт, КонА-конканавалин А, I Ш-2-интерлейкин-2, ХЛЛ-хроничеекий лимфолейко), ПГ-прошш галлат, пВФАБ-пара-бромофеиацилбромиц. пХМИ-пара-хлоромеркуробензоат

На сегодняшни» день пока остаются проблематичными тонкие молекулярные и биохимические механизмы, обеспечивающие передачу внешнего сигнала от рецеиторнош белка к ФИ-ФДЭ. Обсуждаемое в литературе (СНпшп А.С., 1984) участие в этом процессе промежуточных ГТФ-связывшотих С-белков также полностью не раскрывает природу транслокшнш сигнала, рассматривая кип,ко белок-белковые взаимодействия при инициации ФИ-го каскадного механизма. Но прежнему остаются без должного внимания возможные липид-белковые взаимодействия на отдельных этапах передачи внешнего сигнала через гидрофильное и гидрофобное липидные микроокружения мембранных белковых молекул -компонентов сигнальных механизмов. Довольно разноречивы и труднообъяснимы существующие в литературе немногочисленные сведения как о характере и скорости активации, так и о субстратной специфичности ФИ-ФДЭ - ключевого звена сигнального каскада белков в различных клеточных популяциях.

Несмотря на отдельные попытки (Аката1ви У., 1994; 5еу<1е11.К. е1.а1., 1994) анализировать, систематизировать и обобщить экспериментальные данные, полученные исследователями в различных областях мембранной лшшдологин, накопленный фактический материал п целом все еще нуждается как в существенных угочиеннях и легальном анализе, так и в исчерпывающих обобщениях.

Исходя из вышеизложенных немногочисленных литературных данных по мембранной липидологии можно заметить, что в большинстве своем они хотя и остаются на уровне научных предположений, но в общей массе, по всей вероятности, недалеки от "критического уровня". Все это позволяет надеяться о возможном скором прорыве в данной области биологической науки с обобщениями, имеющими огромное фундаментальное и концептуальное значение.

Цель и задачи исследования. Основной целью диссертационной работы было выявление и уточнение механизмов кооперации процессов модификации липидиого компонента мемГфаннмх структур клеток при транспокацин внешних сигналов через ФИ сигнальный механизм в нормальных и патологически (или хронически) трансформированных клетках. В специфические задачи работы, п частности, входило:

а) идентификация и характеристика отдельных ферментных систем модификации липндного компонента различных мембранных структур;

б) исследование закономерностей активации ФИ-ФДЭ на начальных этапах (5-60 сек) стимуляции различных клезочнмх популяций соответствующими агонистами;

п) выявление к уточнение мехашпмоп кооперации быстрых и обратимых процессов модификации липидного бислоя в отмеченные сроки инициации ФИ-цикла;

г) выяснение характера специфических нарушений в функционировании липид-модифицирующнх систем на фоне хронически измененного метаболического статуса липопротеинового бислоя.

Научная новизна. В результате проведенных специальных серий исследований выявлены закономерности включения и распределения меченых инозита и ЖК в ФЛ мембран различных клеточных популяций. Установлена зависимость процесса регулируемой модификации ЖК-состава отмечнных соединений от функциональной активности и степени дифференциации отдельных пикт клеток.

Во внутриклеточных мембранных структурах впервые идентифицированы липид-модифнцирующне ферментные системы деацнлированпя-реацилнрования, днэстеразного расщепления и локального dc novo синтеза ФЛ.

На ранних этапах (5-60 сек) стимуляции клеток соответствующими первичными сигналами в пределах постулированного ФИ-го липопротеинового морфо-функционалыюго домена впервые выявлены кооперативные процессы двухфазной активации ФИ-ФДЭ и модификаций лнпидпого компонента мембран. Установлено функционирование в мембранах различных каскадных систем метаболических цепей, осуществляющих кооперативные процессы модификации липидного составляющего этих структур в вышеотмеченные короткие сроки активации нормальных клеток.

Установлено, что изменение общего морфо-функционального статуса клеток в условиях длительных внешних воздействий (30-тн дневная алкогольная интоксикации, 4-х часовое in vivo воздействие стероидов), приводит к кооперативному изменению исходного и становлению нового метаболического стазуса лшюнротеинового бислоя мембран. Последний характеризуется превалированием катаболнческих или синтетических процессов в лшшдиом бис.чое ЛМ и ЯМ, соответственно. Показано специфическое изменение в л их условиях процессов быстрой и обратимой модификации ФЛ клеточных мембран при инициации ФИ-цикла.

Впервые выявлены специфические для патогенеза ХЛЛ закономерные нарушения в кооперативных процессах де- и реацнлирования и фракционных взаимопревращений липидного компонента ПМ лимфоцитов как в покое, так и в исследуемые короткие сроки транслокащш внешнего сигнала.

Полученные результаты исследований свидетельствуют о роли выявленных процессов модификации липидного составляющего мембран лимфоцитов в качестве мишени для действия иммуномодулятора Т-активина

и применяемых в клинике других химиотерапевтических средств, а также об их кооперативном вовлечении в процессы регуляции клеточной активности.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на: V Всесоюзном биохимическом съезде, Киев, 1986; 111 Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции лизосом", Тбилиси, 1986; Всесоюзном симпозиуме по биохимии липндов, Алма-Ата, 1987; VI Всесоюзном симпозиуме "Роль циклических нуклеотндов и вторичных посредников в регуляции ферментативных процессов", Петрозаводск, 1988; Международном симпозиуме "Нейрохимические аспекты фосфолинидиого метаболизма", Перуджии, Италия, 1УХК; IX Международно» конференции по вторичным посредникам и фосфонротеинам, Нашвилл, США, 1995 н др.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 24 работы, в том числе 13 статей.

Объем и структура работы. Работа изложена на 247 страницах и содержит 53 рисунка и 7 таблиц. Библиография включает 406 наименований литературных источников на русском и английском языках.

В введении изложена точка зрения автора на проблему кооперации процессов модификации липидного компонента мембранных структур клеток при транслокации внешних сигналов ФИ-ым механизмом и формирования клеточных ответов.

В разделе 1 (Обзор литературы) приводятся современные представления как о роли липид-моднфицирующих механизмов в структурно-функциональной организации биомембран, так и об их вовлечении к различные процессы регуляции клеточной активности.

В разделе 2 приводится описание матершшон и методов исследования. В работе использованы очищенные препараты ЯМ, J1M гепатоцитоа и ПМ сннаптосом крыс, а также ЛГ1КЧ, тнмоциты и синаптосомы крыс. Описываются методы как мечеиия ФЛ мембран клеток различными радиоактивными предшественниками, гак и стимуляции клеток специфичекнми внешними сигналами. Приводится описание методов определения активностей ферментных систем обмена ФЛ с использованием различных радиоактивных субстратов, а также методы выделения и анализа отдельных классов ФЛ и ПЛ. Краткое содержание остальных разделов работы приводится ниже.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. ПРОЦЕССЫ МОДИФИКАЦИИ ДИПИДНОГО БИСЛОЯ МЕМБРАННЫХ СТРУКТУР ИНТАКТНЫХ КЛЕТОК

1.1 ОСОБЕННОСТИ РЕГУЛИРУЕМОЙ МОДИФИКАЦИИ ФОСФОЛИПИДОВ ПЛАЗМАТИЧЕСКИХ МЕМБРАН КЛЕТОК

При изучении роли лшшдон н процессах транслокации внешних сигналоп наиболее широко применяемым метдом ншшегся предварительное включение в ИМ клеток радиоичотоипмх зондов и виде предшественников лнпидных молекул, таких, как молекула глицерина, ЖК остатки и соединения, входящие в состав полярных групп различных ФЛ, специфически меченные 3Н, ,4С и 32Р атомами.

Метаболические превращения липидных молекул, связанные с активацией клеток внешними сигналами, могут быть выявлены и охарактеризованы только при наличии данных об исходной картине включения, топографии и количственного распределения радиоактивности в отдельных лнпидных фракциях ПМ в состоянии покоя интактных клеток.

По возможности полный объем подобной информации позволил бы не только характеризовать состояние исходного метаболического статуса покоя мембранного бислоя, целенаправлено и грамотно планировать условия проведения последующих экспериментов, но и точно оценить и корректно интерпретировать полученные данные исследования кооперативных механизмов быстрой модификации липидного бислоя в условиях функционирования ФИ-цикла, инициируемого различными агонисгами.

Все это послужило основанием для проведения специальной серии исследований по изучению закономерностей включения и распределения радноактнвностей [3Н]мио-инознта, свободной [|4С]АК и КоА-эфиров [мС]ОК и [|4С]ПК в различных липидных фракциях мембран синаптосом и тимоцитов крыс, а также ЛПКЧ, инкубированных в различных культуральных средах.

Инкубация суспензии тимоцитов крыс в среде ЯРМ1 с 2-[3Н]-инозитом показала включение метки во фракции ФИ, ФИ-4-Ф, ФИ-4,5-Фг и лизоФИ, составляющее, соответственно, 87,7; 4,7; 5,4 и 2,2% от суммы включенной радиоактивности. Полученные нами результаты соответствуют литературным данным о существующем количественом соотношении ФИ-ов в ПМ клеток. Так, по данным Меджеруса и сотр. (Majeпls Р.\У. et.al.1986) нолиФИ, ФИ-4-Ф л ФИ-4,5-Ф2 составляют 10-20 % от суммы фракций ФИ-ов, из коих от 1 до 10 % приходится па долю ФИ-4,5-Ф2. Применение нами в данном исследовании 3 ч инкубации (в отличие от обычно используемых 24 или 72 ч) для введения (З-МЦ-ппозмтл п мембранные ФИ-ы обеспечивает как

включение необходимого для достоверной регистрации количества радиоактивной метки во фракциях ФИ-4,5-Ф3 и ФИ-4-Ф, так и сохранение высокого процента (более 90%) жизнеспособных клеток в суспензии.

Для исследования метаболических превращений мембранных ФЛ-глицеридов при активации клеток весьма информативным является предварительное введение в эти соединения различных меченых насыщенных и ненасыщенных ЖК., специфически распределяющихся соответственно у 1- и 2-углеродных атомов их глицеринового остова. По своей функциональной значимости в жизнедеятельности клеток особое место занимает метаболизм АК, что и предопределило более детальное исследование особенностей ее включения и распределения в мембранных липидах.

Количественный анализ ФЛ состава [1-|4С]АК-меченых тимоцитов крыс, инкубированных в средах RPMI или Игла, показал возможность избирательного включения метки преимущественно в определенные фракции отмеченных соединений. Так, в зависимости от наличия в инкубационной среде акцепторов свободных ЖК для ацилтрансфсразных реакций лизоФИ (рис. 1) или лизоФХ (рис. 2) более 80% общей радиоактивности включенной АК было обнаружено по фракциях ФИ или ФХ, соответственно. Такая закономерность избирательного включения [1-ИС]АК н мембранные ФЛ была обнаружена и в снмантосомах коры мозга крыс.

Если при включении меченой АК но фракцию ФИ синаитосом обнаруживалась незначительная степень радиоактивности во фракции ФХ, то при осуществлении аналогичной процедуры в отношении ФХ наблюдалось параллельное, приблизительно 10%-ное (от общего) включение метки во фракцию ФИ. По-видимому, это происходит вследствие либо более быстрой обмениваемости последних, либо же в результате присутствия в интактных синаптосомах некоторого количества лизоФИ - эндогенного акцептора АК.

Избирательное, преимущественное включение [|4С]ОК в ФХ фракцию было обнаружено и при модификации ФЛ синаитосом в присутствии 1-ацил-2-лизоФХ. Закономерности включения и распределения меченой ОК в ФЛ мембран синаитосом идентичны с вышеприведенными (рис. 2). Трехкратная промывка суспензии предварительно меченых клеток забуференным альбумином, свободным от ЖК, не приводила к существенной потере радиоактивности, что свидетельствовало о включении синтезированных меченых ФЛ и клеточные мембраны н полном соответствии с существующими литературными данными (Manning R. and Sun G.Y., 1983).

Полученные данные свидетельствуют о способности интактных тимоцитов и синаптосом крыс к избирательной, регулируемой модификации ЖК-состава липидного компонента ПМ с преимущественным включением

Рис. 1. Включение и процентное распределение [|4С]АКв ФЛ мембран тимоцнтов крыс в присутствии лнзоФИ. Система растворителей ТСХ -хлороформ-ацетон-метанол-уксусная кислота-вода (6:8:2:2:1, об/об). Примечание. Здесь и далее: а) распределение метки в ФЛ фракциях в процентах от суммы включенной радиоактивности (расп/мин); б) радносканиграмма пласгинок ТСХ; последовательность расположения липпдных фракций па хроматограмме следующая: 0-сгарт, 1-лизоФХ, 2-СФМ, 3-ФХ, 4-ФИ, 5-ФС, 6-ФЭ, 7-ФК, 8-ДФГ, 9-НЛ, АК.

Рис. 2. Включение и процентное распределение [МС]АК. в ФЛ мембран т'нмоцнтов крыс н присутствии лнзоФХ. Система растворителей ТСХ -хлороформ-метанол-уксусная кислота-вода (25:15:4:2, об/об). Фракции ФЛ: 1-лизоФХ,2-СФМ, 3-ФХ, 4-ФИ+ФС, 5-ФЭ+ФК+ДФГ+НЛ+АК.

лсюгаию добавленных меченых ЖК и отдельные ФЛ с|)ракцин лнпопротеинового бислоя.

Исследование процесса ацилирования и распределения [1-14С]АК в ФЛ мембран ЛПКЧ показало (рис. 3) преимущественное включение метки в количественно преобладающую во внешнем монослое мембран фракцию ФХ, независимо от наличия в инкубационной среде лизоФЛ. Если добавление в среду лизоФИ не приводило к существенным сдвигам в распределении метки, то в присутствии лнзоФХ наблюдалось двукратное увеличение включения меченой АК во фракцию ФХ на фоне уменьшения радиоактивности почти во всех остальных фракциях. Аналогичная закономерность включения ЖК в ФХ фракцию лимфоцитарных мембран обнаруживалась и при использовании для предварительного мечення клеток КоА-эфиров ОК и ПК, что составляло, соответственно, 51 и 53,4% от суммы радиоактивности всех ФЛ. В случае использования [1-14С]пальмитоил-КоА примечательно наличие 15% метки во фракции ФС. Обнаруженные закономерности включения и процентного распределения отдельных меченых ЖК в ФЛ при инкубации в течение I ч не претерпевали существенных изменений вследствие применения различных инкубационных сред. Добавление в последние строго контролируемых одинаковых количеств липидных метаболитов в течение указанного периода инкубации приводило к установлению практически идентичных (по показателю процентного соотношения лнпидов) стационарных состояний в метаболическом статусе Г1М отдельных клеточных популяций.

Полученные данные свидетельствуют также о существовании в покоящихся дифференцированных клеточных популяциях более жесткого контроля над относительным постоянством ЖК-состава мембраных ФЛ, чем и объясняется обнаруженное памп в зрелых ЛПКЧ свойство большей стабильности по отношению к регулируемой модификации ЖК-состава лппидпого бислоя но сравнению как с функционально лабильными синаптосомамн, так и с гстероюнной популяцией тимоцитов с высоким содержанием бластных клеток.

Можно было предположит!», что любое внешнее воздействие на клеточную мембрану, в первую очередь, инициирует быстрые и обратимые модификационные изменения липидного составляющего (в целом или отдельных фракций) с локальными сдвигами в физико-химических свойствах ПМ. Эти сдвиги обеспечивают нормальное функционирование мембраносвязанных белковых молекул, ответственных за протекание определенных функциональных процессов. Это послужило основанием для проведения исследований по изучению изменений закономерностей включения и распределения использованных нами меченых ЖК в ЛПКЧ при добавлении в инкубационную среду специфического внешнего сигнала.

по о» е т& е ••

0123 456 789

Рис. 3. Включение и процентное распределение [' (С]АК в ФЛ мембран ЛПКЧ, инкубированные в среде без лизоФЛ (П), с лизоФИ ({Я) и с лизоФХ

Ф-

Результаты экспериментов выявили изменения метаболического статуса ФЛ компонента мембран. Так, наличие в инкубационной среде такого фактора активации лимфоцитов, как КонА приводило (рис. 4а) к понижению уровня АК почти во всех фракциях мембранных ФЛ с более выраженных эффектом, в основном, для фракции ФХ. Доминирование процессов катаболизма данной фракции под действием КонА при 1 ч инкубации наблюдалось (рис. 46) и в случае применения ПК для мечения ФЛ. Однако, при этом обнаруживалось значительное увеличение уровня включенной метки в ФС фракции. В случае же премечення ЛПКЧ ОК наблюдаюсь превалирование процессов ацилнронанпя всех исследуемых ФЛ (рис. 4в) с многократным увеличением количества радиоактивной метки во фракции ФЭ.

Таким образом, сопоставление полученных нами экспериментальных данных с литературными свндетельспювало в пользу: а) вовлечения

и 60

* Р < 0,1 X* Р< 0,05 Н««Р< 0,02 * ***Р< 0,001

Lew

ли nxI'X СФМ ФХ ■I'll ФЭ ли iii'l'X С 'ФМ ФХ 'I'll «К?' Ф'-Э литФХ ФХ ФИ ФС Ф'Э ФС

Рис. 4. Действие Кона (И) на включение и процентное распределение радиоактивности АК (а), ПК (б) и ОК (в) во фракциях ФЛ (без ФК и ДФГ) мембран ЛПКЧ при 1 ч инкубации.

механизмов модификации липидного бислоя как в поддержании исходного стационарного состояния ПМ клеток, так п в изменении последнего в ответ на различные внешние воздействия; б) участия в модификационных процессах ферментных систем деацшшрования-реацилирования ФЛ; в) наличия в липидном бислое ПМ клеток метаболически различных пулов отдельных липидных фракций в зависимости от их ЖК состава.

1.2. ФЕРМЕНТНЫЕ СИСТЕМЫ МОДИФИКАЦИИ ЛИПИДНОГО ПИСЛОЯ ЛИ ЮСОМАЛЫ1ЫХ И ЯДЕРНЫХ МЕМБРАН ГЕПАТОЦПТОВ КРЫС

Известно, что многие продукты ферментативного гидролиза ФЛ (амфппатнчеекпе соединения тина лизоФЛ, нсэстерифпцированные ЖК н ДАГ) могут действовать, с одной стороны, как природные ионофоры или детергенты, обладающие мсмбраиолитнческими свойствами, с другой -выступать в роли регуляторов активности самих гидролаз ФЛ ( Majerus P.W. et.al, 1986, King L., 1988J.

Действие на клетки рецепгор-опосредуемых или -неопосредуемых, быстродействующих или хронических внешних сигналов, приводящих к

формированию разнообразных клеточных ответов, должно быть модулировано через модификационные процессы липидного бислоя как ПМ, так и внутриклеточных образований. Отмеченные процессы, в частности, осуществляются различными мембраносвязанными ферментными системами деацилирования-реацилирования,

трансметнлнропания, декарбокснлиронанпя и диэстеразного расщепления мембранных ФЛ.

Вышеуказанные модификационные процессы, несомненно, участвуют и в обеспечении таких составляющих формирования различных клеточных ответов, каковыми, п частности, я или юте я осуществление экзоцитоза ЛМ и участие ЯМ в регуляции функциональной активности генома. Относительная скудость н противоречивость литературных данных (Никитин В.Н. и др., 1970; Rahman Y.E. et.al, 1970; Franson R.C. et.al, 1971; Manzoli F.A., 1982) о функционировании в отмеченных мембранных струкурах подобных ферментативных активностей послужили основанием для проведения специальных исследовании по выявлению и характеристике мембраносвязанных липид-модифицирующмх ферментных систем в ЛМ и ЯМ гепатоцитов крыс. В очищенных препаратах мембран отмеченных внутриклеточных органелл нами впервые идентифицированы ферментные системы цикла деацилирования-реацилирования ФЛ. Установлено, что в ЯМ реакция деацилирования осуществляется Са2+-зависимой ФЛазой А2 с оптимумом при рН 7,0, а в гидролизе ненасыщенной ЖК в молекулах ФЛ JIM вовлечена каскадная система деацилирования, включающая Ca2t-актнпнруемую ФЛазу А| и субстрат-актнпнруемую лизоФЛазу, максимально активных при рН 7,0. Если кажущаяся активность ФЛазы А| JIM была максимальна в присутствии 2,5 мМ Са2\ то аналогичная активность лизоФЛаэы многократно подавлялась и идентичных условиях эксперимента.

Как в ЛМ, так и в ЯМ впервые установлено ацнлирование лизоФХ Мд*+-зависимой ацилтрансферазой с рН оптимумом 7,2. В ЯМ гепатоцитов идентифицирована также реакция диэстеразного расщепления ФХ Са2+-зависимой ФЛазой С с оптимумом при рН 7,0. Наличие в ЛМ и ЯМ подобных лнпнд-модифицирующих, особенно многоступенчатых, каскадных ферментных систем свидетельствует о высоком внутреннем потенциале этих мембранных структур, обеспечивающем тонкую регуляцию механизмов, изменяющих или поддерживающих на относительно постоянном уровне ФЛ и ЖК-баланс липидного бислоя на различных этапах проявления клеткой определенной функциональной активности.

Суммируя вышеизложенные результаты можно заключить, что ЛМ и ЯМ гепатоцитов крыс не являются исключением из общих закономерностей функционирования в бномембранах собственных мембраносвязанных ферментных систем обратимой модификации липидного бислоя.

2. КООПЕРАЦИЯ ПРОЦЕССОВ ЕЫСГРОЙ МОДИФИКАЦИИ ЛИПИДИОГО БИСЛОЯ ПЛАЗМАТИЧЕСКИХ МЕМБРАН КЛЕТОК ПРИ ИНИЦИАЦИИ ФИ - ЦИКЛА

2.1. ЗАКОНОМЕРНОСТИ АКТИВАЦИИ ФИ-ФДЭ НА РАННИХ ЭТАПАХ ИНИЦИАЦИИ ФИ-ЦИКЛА В РАЗЛИЧИЯХ КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ

Ключевым звеном и функционировании ФИ-цикла мембраносвязанного каскадного механизма, преобразующего внешние сигналы во внутриклеточные, является активация ФИ-ФДЭ, расщепляющей ФИ-ы (преимущественно ФИ-4,5-Ф2), с образованием молекул вторичных посредников. Таковыми являются ИФ3 и 1,2-ДАГ, вызывающие соответственно высвобождение из эндоплазматического ретикулума пнуфиклеточного запасного кальция (Berridge M.J., 1984) и активацию мембраносвяэанной ПКазы С (Wolf M. et.al, 1985).

В настоящее время ente не полностью раскрыты молекулярные механизмы регуляции ФИ-ФДЭ, активирующейся вслед за лиганд-рсцепторным взаимодействием или при воздействии па клетку различных внешних сигналов. Весьма немногочисленны и противоречивы существующие литературные данные (Уапо К. et.al, 1984; King S. et.al, 1989; Matozaki T. and Williams A.J., 1989) о возможности быстрой активации и характере динамики изменения активности этого фермента в отдельных клеточных популяциях с различными морфо-функциональными свойствами.

Литературные данные (Drummond А.H., 1986) свидетельствуют, что увеличение количества внутриклеточного Са2+ вследствие инициации ФИ-пути передачи внешних сигналов, начинается после первой сек активации клеток и достигает максимума через 6-8 сек. При этом, если образование ИФ3 происходит без lag периода, то первичный кальциевый ответ отстает от последнего по крайней мере на 1 сек (Berridge M.J., 1983). В дальнейшем включаются механизмы входа в клетку внешнего Са2* через специализированные каналы. Следовательно, первичная активация ФИ-ФДЭ - центрального звена каскадного механизма передачи внешнего сигнала также должна быть осуществлена в течение первых нескольких сек инициации ФИ-цикла.

Исходя из вышеизложенного, была проведена серия экспериментов по изучению закономерностей динамики активации процесса быстрого расщепления ФИ-он мембран J1I1K4, тпмоцитов и снмаптосом крыс в течение 60 сек после инициации ФИ-цикла соответствующими внешними сигналами.

Для более прямой и корректной оценки активности ФИ-ФДЭ при изучении динамики активации данного фермента п условиях инициации ФИ-цикла были проведены исследования с использованием [3Н]инозит-меченых

ЛПКЧ. Было обнаружено (рнс. 5) повышение содержания всех метаболитов ФДЭ расщепления ФИ-ов ( [3Н]ИФ|, [ЯН]ИФ2 и ['Н]ИФ3) начиная с 5 сек действия на ЛПКЧ митогенного лсктина КонА. Если повышение уровня ИФ( и ИФ2 продолжается до 10 сек эксперимента с последующим спадом на 30 и 60 сек, то динамика изменения ИФ5 имеет двухфазный характер с начальным пиком на 5 сек и вторичным увеличением его на 60 сек. Количество же ГФИ после резкого уменьшения на 50% (5 сек) возрастает до 170 % (10 сек) и остается выше исходного в течение последующего времени наблюдения. Диаметрально противоположные сдвиги в содержании данного метаболита на 5 и 10 сек инициации ФИ-цикла могут быть следствием изменения активности отдельных компонентов ферментной системы деацилирования-реацилирования определенного пула фракции ФИ.

J_i i i i

Рис. 5. Изменение количества метаболитов ФИ-ов в динамике действия КонА (2 мкг/мл) на [,Н]инознт-мечсные ЛПКЧ. Примечание: Здесь и на последующих рисунках в качестве контроля (100%) принты уровни метаболитов до стимуляции клеток.

Обнаруженные нами сдвиги в количестве 1-аичл-2-| МС] арихидопил-ДАГ, второго продукта ФП-ФДЭ реакции, течение 60 сек инициации КопА ФИ-цикла в ЛПКЧ, премечениых (1->С1АК, выявили их идентичность с таковыми для ИФз в ['Н^пюзнт-мечепых клетках. Параллельное повышение при этом (в идентичных условиях эксперимента) уровня [|4С]арахидонил-МГ только на 5 сек наблюдения и в отсутствие распада ТГ может быть следствием усиления, активирующегося вслед за ФИ-ФДЭ, ДАГ-липазного пути высвобождения свободной АК.

ИФ, А IмМ Ы'

с;

о £

о ^

0510

сек

Рис. 6. Динамика изменения количества инознтфосфатов (а) и ([юсфонпозптидов (б) при КонА-нндуцироваинон активации ФИ-ФДЭ | Н]ннозпт-мсченых тимоцитп крыс.

Под действием 2 мкг/мл КонД в ['Н^Н'ошт-меченых тнмоцитах также наблюдаюсь (рис. 6а) повышение уровня всех выпк'огмечемных продуктов цизстсразного расщеплении ФИ-оп. Примечательно, что динамика птмснсжш в содержании И«1>( строю соответствует таковой, обнаруженной в ЛПКЧ. В обоих случаях после перпнчшмо повышения уровня данного метаболита (до 15"«) уже на 5 сек действия КонД наблюдалось понижение ею содержания ниже исходною (10-30 сек) с последующим более выраженным (до 60%) повышением на 60 сек инициации цикла.

Параллельное исследование изменений содержания в ПМ тимоцитов липидных фракций ['Н]ФИ-ов. возможных субстратов ФИ-ФДЭ, показало (рис. 66) соответствующее с повышением уровня вышеотмеченных

метаболитов, понижение содержания псех. трех фракций ФИ-ов под действием КонА. Однако, четкая корреляция между динамикой высвобождения продукта и распада соответствующего субстрата наблюдалась только для ИФ, и ФИ-4,5-Ф2. Некоррелирующее с изменениями соответствующих продуктов уменьшение содержания ФИ и ФИ-4-Ф не может быть объяснено только активацией компенсаторных механизмов, обеспечивающих фосфорилирование их до ФИ-4,5-Фг. Данные литературы свидетельствуют (Billah М.М. and Lapctina E.G., 1982) о существовании гетерогенных пулов ФИ-ов, подвергающихся различным метаболическим превращениям при стимуляции клеток. Можно предположить о наличии пула отмеченных липндиых фракций, подвергающихся действию деацшшрующнх ферментных систем, о чем свидетельствуют также изменения количества ГФИ (рис. 5).

Четкая корреляция динамики образования ИФз и 1,2-ДАГ с таковой ФДЭ-ного гидролиза ФИ-4,5-Ф2 свидетельствует о том, что последний является первичным (предпочитаемым) субстратом ФИ-ФДЭ в лимфоцитах при митогенной инициации ФИ-цикла. Закономерности, обнаруженные при исследовании процессов быстрой активации ФИ-ФДЭ в культуре фибробластов (Wright Т.М., 1988), в клетках поджелудочной железы (Matozaki Т. and Williams A.J., 1989) и гладких мышц (Griendling K.K. et.al, 1986) в основном подтверждают полученные нами результаты.

В последующей серии экспериментов были исследованы ннтактные синаптосомы коры мозга крыс со встроенными в их мембраны [14С]арахидонат-мечеш1ыми ФИ в качестве эндогенных субстратов для ФИ-ФДЭ реакции в условиях деполяризации ПМ синаптосом.

Под действием К'-деноляризаинн обнаружилось (рис. 7) более чем 30%-иое (от исходного) повышение уровня 1,2-ДАГ в течение 5 сек, спидегсльствугощее о быстрой активации ФИ-ФДЭ.

H соответствии с пьппепрппедсиными экспериментальными данными о двухфазной активации ФИ-ФДЭ п ЛПКЧ и тимоцитах крыс, в настоящих экспериментальных условиях дальнейшее понижение (до 30 сек) уровня 1,2-ДАГ сменяется вторичным, резким повышением уровня данного метаболита диэстеразного расщепления ФИ-4,5-Ф2, указывающее на однотипную динамику активации ФИ-цикла в усливиях ^-деполяризации синаптосом. На фоне предварительного, незначительного включения меченой АК в остальные фракции ФЛ ПМ синаптосом, деполяризация мембран приводит к резкому понижению контрольного уровня данной свободной ЖК на 5 сек эксперимента. Имеющиеся литературные данные (Emilsson A. and Sundler R., 1984; Mahadevappa V.G. and Holub B.J., 1986) указывают на возможный механизм прямого высвобождения АК преимущественно различными зависимыми или -активируемыми деаццлазами, действующими на ФЛ фракции ФИ, ФХ и ФК. Показан (Cliau L.Y. and Tai H.H., 1981; Prescott S.M. and Majcins P.W., 1983) :акже дпухэтнпнмй характер гидролиза 1,2,-

с* с; О си Ь-¡Г

О ^

140

120

100

5 Ю

3(1

сек Рис. 7.

сек

1'ис. К.

Рис. 7. Динамика К'-индуцнрованного высвобождения ДАГ (1) и АК (2) в спнаптосомах, содержащих меченую ЖК преимущественно во (фракциях фосфоинозитпдов.

Рис. 8. Действие эстрадпола (а,- 10 М, б,- 10 ' М, в.- 10' М) на выход ДАГ (1) н АК (2) в мембранах синаптосом. содержащих меченые фосфоинозитиды.

ДАГ с промежуточным образованием 2-арахндонилМГ, содержащего меченую АК в условиях нашего эксперимента.

В серии данных экспериментов с предварительным включением меченой АК преимущественно но фракции ФИ-ов, обнаруженное нами понижение уровня свободной АК на 5 сек активации ФИ-ФДЭ может бьгп. следствием лишь превалирования процессов утилизации свободной ЖК. При этом возможно подавление активностей как деацилаз, действующих на ФИ-ы и образующихся нз ДАГФК, так и ферментов ДАГ-липазного пути ее высвобождения. Превалирование же отмеченных ферментных систем процессов высвобождения АК, по-видимому, происходит в более поздние сроки функционирования ФИ-цикла, о чем свидетельствует повышение уровня АК на 10 и 30 сек наблюдения, коррелирующее с понижением уровня 1,2-ДАГ. Однако возможно, что активация процессов деацилирования фракции ФХ "замаскировано" вследствие исходного незначительного уровня включении меченой АК в данной фракции ФЛ.

В последнее время формируются представления о способности гормонов помимо влияния на клетчиый метаболизм через внутриклеточные рецепторы, вызывать также относительно быстротечные сдвиги в обменных процессах посредством воздействии и на мембранном уровне. В этом плане

примечательны работы, свидетельствующие как о рецепции некоторых гормонов ПМ клеток (Baulicu Е.Е., 1978; Szego С.М., 1984), так и об их воздействии ФИ-сишальным механизмом (Billah M.M. and Michell R.II., 1979; Farese R.V., 1983; Berridgc M.J., 1986).

Приведенные выше данные о быстроте и идентичной динамике активации ФИ-ФДЭ на ранних этапах стимуляции различных клеточных топов соотвтствуюшнмн агонистами, а также отсутствие литературных данных о подобных исследованиях с применением эстрогенов послужили основанием для проведения серии экспериментов по изучению закономерностей инициации ФИ-цнкла в АК-премеченых синаптосомах под действием эстрадиола.

Полученные результаты экспериментов свидетельствуют (рис. 8а,б,в) о быстрой инициации ФИ-цикла эстрадиолом в мембранах синаптосом, содержащих меченую АК преимущественно во фракции ФИ-ов. Значительное (50% от исходного) повышение уровня 1,2-ДАГ -днэстеразного продукта катаболизма ФИ-ов на 5 сек действия гормона в дальнейшем несколько снижается (вплоть до 30 сек), оставаясь однако на достаточно высоком уровне. Примечательно, что идентичная динамика активации ФИ-ФДЭ наблюдается при воздействии как фармакологических, так и физиологических кониентрацинй гормона. Эти данные, подтверждая имеющиеся в литературе сведения (Rao G.S., 1981; Duval D. ct.al, 1983) о влиянии стероидных гормонов на мембранном уровне, указывают на реализацию этого влияния через ФП-нмй сигнальный механизм.

Если характер динамики активации ФИ-ФДЭ эстрадиолом на начальной фазё инициации ФИ-цикла (5-30 сек) соответствует таковому действия калиевой деполяризации мембран, то параллельное исследование выхода свободной АК выявило некоторые различия в протекании процессов деацшшрования в тех же условиях эксперимента. Так, резкое повышение активности ФИ-ФДЭ под действием эстрадиола сопровождается постепенным усилением процесса(-ов) деацилнрования с повышением уровня свободной АК, в то время как деполяризация ПМ синаптосом приводила (см. рис. 7) к быстрому понижению ее исходного уровня. Специфическое взаимодействие стероидного гормона со своим рецептором на мембране синаптосом и вызывающее начальную активацию ФИ-ФДЭ, по-видимому, быстро включает кооперативные механизмы либо яеапилиропання определенного пул а мембранных ФИ-ов, либо ДАГ-лииазный путь выхода свободной АК. Некоторое понижение уровня 1,2-ДАГ на 10 и 30 сек воздействия гормона может быть следствием установления равновесия между активацией ФИ-ФДЭ, с одной стороны, и ДАГ- и МГ-липаз, с другой.

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о быстрой (до 5 сек) рецептор-опосредованной и -неопосредованной инициации ФИ-цикла при воздействии соответствующих агонистов на иитактные клетки.

I Ipil этом примечательно параллельное чк.чюченпе и специфический характер (в зависимости от ним клеток и внешнего сигнала) различных механизмов деацнлировання отдельных лнпидных фракций ПМ клеток.

В дополнение к уже известным фактам об активации ФИ-цикла КонА и К'-деполяризацней нами впервые установлено вовлечение ФИ-цикла в передачу сигналов эстрадиола и IIJ1-2 в синаптосомах и лимфоцитах, соответственно. Что же касается изложенных выше собственных результатов о быстрой двухфазной активации ФИ-ФДЭ, то единичные известные нам литературные данные об аналогичной динамике активации последнего в мышечных клетках (Griendling К.К., 1986), фибробластах (Wright Т.М. et.al, 1988) и панкреатических клетках (Matozaki Т. and Williams A.J., 1989) были опубликованы параллельно с нашими данными или же позже. Результаты же аналогичных исследований с использованием тимоцнтов и Л11КЧ весьма противоречивы (Taylor M.V., 1984; Rosoff P.M. et.al, 1987; King S. et.al, T989), что, на наш взгляд, обусловлено типом использованных клеточных популяций, концентрацией агонистов, продолжительностью инкубации и т. д.

2.2. БЫСТРЫЕ СДВИГИ В ОБМЕНЕ ФОСФАТИДИЛХОЛИНОВОЙ

ФРАКЦИИ МЕМБРАН КЛЕТОК ПРИ ИНИЦИАЦИИ ФИ- ЦИКЛА

Обнаруженное памп быс трое (5 сек) образование в клетках двух вторичных посредников вследствие агоппст—>рецептор-»С-белок—»ФИ-ФДЭ каскадных взаимодействий можно считать результатом активации начального, мембрапа-ассоцннрованного этапа стимуляции клеток через ФИ-цикл. В последующие сроки (10, 30, 60 сек) стимуляции клеток целостная картина кооперативного функционирования механизмов, определяющих протекание дальнейших этапов формирования клеточных ответов, могла быть усложнена вовлечением в единый процесс как мембраносвязанных, так и внутриклеточных Са^-активируемых составляющих. Возможно, последние и определяют вторичное, начиная с 60 сек, пролонгированное образование из других фракций ФЛ молекул вторичных посредников, в частности ДАГ, обеспечивающего дальнейшую активацию ГЖазы С. Исходя из этого, в наших исследованиях большее внимание было уделено изучению механизмов возможной кооперации процессов модификации различных лнпидных фракций мембранного бислоя именно на 5 сек агонист-стпмулпруемой инициации отмеченного сигнального пути.

Имеющиеся в литературе данные свидетельствуют об активирующем влиянии дезокенхолата натрия на мембраносвязанную ФИ-ФДЭ (Manning R. and Sun G.Y., 1983). Сходным действием на растворимую форму последней оказывают (Нота S.L. et.al, 1983) свободные АК н OK, наряду с лизоФХ,

обладающими дстергентонодобпыми свойствами. Предполагается также ассоциирование мембранной ФИ-ФДЭ со специфическим липидным микроокружением, чем и объясняется выраженное ингнбирующее действие на ее активность холиисодержащих ФЛ (Irvine R.F. et.al, 1979; Hofmann S.L. and Majerus P.W., 1982), в частности ФХ. В последние годы появились данные об активации как реакций Са2+-зависнмого ферментативного распада различных ФЛ фракций (Jones A.W. et.al, 1991; Nakamura S. et.al, 1993; Szamel M. et.al, 1993; Stephenson D.T. et.al, 1994), так и обнаруженных ранее процессов ацнлирования (Ferber Е. et.al, 1976) в течение нескольких мин рецептор-опосредованной стимуляции клеток. Выявлено также стимулирование активности ФИ-ФДЭ и ПКазы С продуктами гидролиза ФХ - лизоФХ, AK (Rustenbeck I. and Lenzen S., 1992; Asaoka Y. et.al, 1993).

В свете вышеприведенных литературных данных весьма примечательны изложенные в этом разделе собственные экспериментальные результаты, подтверждающие кооперативное функционирование различных метаболических цепей взаимопревращений лииидных фракций на более ранних этапах (5, 10, 30, 60 сек) стимуляции клеток ФИ путем. В качестве инициирующего звена одного из подобных цепей было установлено двухфазное (5 и 30 сек) усиление процесса деацшшрования фракции ФХ, коррелирующее с первичной активацией ФИ-ФДЭ на мембраносвязанном этапе (5 сек) транслокации различных внешних сигналов. Обнаружение факта четкой корреляции процессов де- и реацилирования фракции ФХ (рис. 9) в случае использования различных ЖК (AK, OK, ПК) в идентичных экспериментальных условиях активации лимфоцитов, позволило рассматривать отмеченные противоположно направленные метаболические реакции как две стороны единого механизма, участвующего в быстрой и обратимой модификации липидного микроокружения мембранных белков. Как в этих, так и в последующих специальных сериях экспериментов было установлено наличие в липидном бнелое различных клеточных мембран метаболически гетерогенных (по ЖК-составу) пулов

отдельных ФЛ фракции, агонист-стимулнруемый быстрый катаболизм которых отличается по динамике или по обменным направлениям.

В АК- или OK-меченых ЛПКЧ, стимулированных КонА преобладает катаболизм ФХ фракции по диэстеразному (рис. 10а) или деацилазному путям (рис. 106), соответственно. Специфически отличаются также динамики высвобождения ЖК в сннаптосомах, содержащих меченые АК (рис. 11) или OK (рис. 12) преимущественно в ФХ фракции, и стимулированных одним и тем же внешним сигналом.

Следовательно, по нашим данным вовлечение липидных компонентов биомембран в различные этапы транедукции внешних сигналов и преобладающие при этом метаболические направленности превращений отдельных фракций этих соединений зависят не только от их типа, но и от

i л l\

I \ ! '

0510 30 60 в сск

Рис. 9. Динамика деацплпропания (—) и реанимирования (фракции ФХ в КонА-спшулнроианных J1IIK4. а) АК, б) ПК, в) ОК.

Рис. К). Сдвиги и содержании IIJIJ111КЧ и меченых АК (а) и ОК (б) на 5 сек действия КоиА в среде 1 luía, содержащей различные концентрации Си".

ЖК-состава. Результаты данной серии собственных исследований, а также появившиеся в литературе новые данные (Khan М.А. ct.al, 1993; Nakano Н.

et.al, 1994) подтверждают сделанное нам» предположение о гетерогенности организации сигнальных систем на разных этапах их функционирования.

В вышеотмеченной серии экспериментов (рис. 10) были уточнены также и оптимальные параметры активации процессов деацилирования и ФДЭ-расщепления ФЛ, премеченных АК и ОК, на мембраносвязанном этапе (5 сек) инициации ФИ-цшсла митогеном в средах с различным содержанием ионов кальция.

Добавление 5 мМ Са2> в среду Игла, содержащей 1,8 мМ двухвалентных ионов этого металла, приводило к дальнейшей активации (по сравнению со средой, содержащей 5 мМ ЭГТА) процессов деацилирования ОК-модифицированных ФЛ с повышением уровня свободной ОК. Однако в идентичных условиях эксперимента двухкратное повышение уровня 1,2-ДАГ в АК-модифицированных клетках значительно снижалось как в присутствии 5 мМ ЭГТА, так и 5 мМ Са2\ На фоне повышения уровня [|4С]арахидонил-ТГ обнаруженное нами 10%-ное увеличение количества также и свободной АК при наличии в клетках различных механизмов ее быстрой утилизации свидетельствовало об усилении процессов катаболизма определенного пула АК-меченых ФЛ и дсацилачнымн путями.

Исходя из вышеприведенных собственных экспериментальных данных можно утверждать о Саг*-активируемости процессов деацилирования ФЛ мембран ЛПКЧ и о наличии определенного узкого интервала (около 2 мМ) оптимальных для активации ФИ-ФДЭ, концентраций этих ионов на начальной мембраносвязанной фазе (5 сек) митогенной инициации ФИ-цикла отмеченных иммунокомпетентных клеток.

Наличие в литературе единичных, весьма противоречивых данных (Trotter J. and Ferber E., 1981; Gopplelt-Strube M. and Resch K., 1987) о функционировании в лимфоцитах ФЛаз типа А, а также отсутствие сведений, касающихся изменений в активностях отмеченных деацилаз иа ранних этапах инициации ФИ-цикла, предопределили проведение специальных исследований по идентификации ФХ-деацилнрующих ферментных систем ПМ этих клеток. Исходя из известного факта эстерификации АК исключительно во втором положении молекулы глицерина мембранных ФЛ, обнаруженное нами резкое повышение уровня 2-[|'1С]арахидонш1-лизоФХ в среде Игла (1,8мМ Са2+) на 5 сек инициации ФИ-цикла ЛПКЧ митогеном свидетельствовало об осуществлении процесса деацилирования ФХ кооперативной активацией Са^-актнвируемой ФЛазы А|. Подавление исходного катаболизма 1-ацил-2-[|4С]арахидонил-ФХ и накопление промежуточного 1-лизоФХ в условиях блокирования ПГ-ом ЦОГ и ЛОГ путей синтеза эйкозаноидов из свободной АК, во-первых, подгверждали функционирование в ПМ ЛПКЧ кооперативной метаболической цепи быстрог о катаболизма ФХ, регулируемой но принципу отрицательной обратной связи. Во-вторых, обнаруженные факты указывают на быстрое высвобождение АК каскадной ферментной системой

120

100

80-

[,4С]ОК

[,4С]ДАГ

1—1—

5 10

60 сек

Рис. 12.

Рис. 11. Динамика К'-шшуцнрованного высвобождения ДАГ (1) и АК (2) в сннантосомах, содержащих меченую АК преимущественно во фракции ФХ.

Рис. 12. К'-пндуцировшшый быстрый обмен синаптосомальной фракции ФХ. прснмушеспкчню меченной ОК.

дсацилиропання ФЛ, включающей наряду с ФЛазой А| и лизоФЛазу, что было выявлено и н ЛМ Iспаюцнтон. Функционирование отмеченной каскадной ферментной системы дсацилиропання ФЛ п ИМ лимфоцитов на ранних этапах их мптогенной стимуляции нам представляется биологнчски более целесообразным по двум соображениям. Во-первых, кратковременное понижение в ПМ соотношения насыщенные ЖК/ ненасыщенные ЖК (вследствие активации ФЛазы А|) обеспечивает быстрое уменьшение микровязкости липидного бислоя, необходимое для увеличения скорости исходного латерального передвижения агонист-рецепторных комплексов при их кластеризации. Во-вторых, наличие в мембранах многоступенчатых кооперативных ферментных систем модификации липидного бислоя подразумевает и функционирование в них более тонких и лабильных регуляторных механизмов, необходимых для осуществления такого сложного процесса, каковым является сигнальная транедукция.

О возможности быстрого высвобождения и утилизации АК, начиная с 5 сск стрнмуляцип лимфоцитов. 111ндстсл1.сп!оп;шп также полученные нами данные (рис. (>л) о четкой корреляции динамики дсацилиропання

[иС]арахидонил-ФХ (5-60 сек) с изменениями в содержании как 5-НЕТЕ -ЛОГ продукта АК (рис. 15), так и [|4С]арахндонил-ТГ, выступающего в роли "промежуточного депо" дня данной ЖК.

Имеющиеся немногочисленные литературные данные указывают (Шга1а Р. et.nl, 1980) па комитогеиное действие экзогенно добавленных фракций ФС и лизоФС при стимуляции тучных клеток КонА п течение 5 мин. При этом предполагается, что отмеченный факт обусловлен активацией процессов декарбоксилирования ФС, последующего двухэтапного метилирования ФЭ и перехода (флип-флон) образованных молекул ФХ в наружный монослой ПМ клеток. Изучение эффектов действия митогена на АК- и ПК-меченые ЛПКЧ в условиях быстрого эксперимента (5-60 сек) обнаружило, коррелирующее с активацией с ФИ-ФДЭ и деацилирования ФХ, функционирование в мембранном бнелое метаболической цепи взимопревращений отмеченных фосфоглицерндов по схеме ФС-»ФЭ-»ФХ. Подтверждение запуска подобного механизма быстрой модификации липидного бислоя (наряду с циклом деацилирования-реацилировання ФЛ) на 5 сек стимуляции тимоцитов крыс и ЛПКЧ, а также идентификация отдельных их звеньев были осуществлены в специальных экспериментах с применением Са2+-хелатора - Э1ТА, ингибитора деацилаз ФЛ - пБФАБ и ингибитора лизоФЛаз и ацшпрансфераз - пХМБ. На схеме, представленной в диссертации, суммированы все известные нам из литературы и, в основном, полученные при выполнении данной работы экспериментальные результаты, свидетельствующие о функционировании в ПМ клеток сложных механизмов кооперации процессов модификации лнпндного бислоя при инициации ФИ-ого сигнального механизма. Наиболее четко они выявлялись на 5 сек мембраносвязанного этапа транслокации внешних сигналов.

На основании анализа вышеприведенных экспериментальных данных можно заключить о существовании в липидном бнелое ПМ различных кооперативных механизмов быстрой и обратимой его модификации и активации ФИ-ФДЭ, подтверждающих функционирование в ПМ клеток относительно автономного, морфо-функционального лннопротеинового домена ФИ-го нуги транслокации внешних сигналов.

3. ЗАКОНОМЕРНОСТИ МОДИФИКАЦИИ ЛИПИДНОГО БИСЛОЯ МЕМБРАН В УСЛОВИЯХ ДЛИТЕЛЬНЫХ ВНЕШНИХ ВОЗДЕЙСТВИЙ ПА КЛЕТКИ

При определении цели и задач диссертационной работы в качестве одной из рабочих гипотез было сформулировано, что различные формы длительных внешних воздействий на клетки, возможно, приводят к специфическим изменениям "метаболического статуса покоя" липопротеннового бислоя ПМ и клетки в целом, на фоне которых также

специфически измененными и информативными могут быть агоннст-нндуциируемые кооперативные процессы быстрой модификации липидного составляющего биомембран. В качестве внешних воздействеий, вызывающих либо дезорганизацию мембранных структур, либо активацию биосинтетических процессов в гснатоцитах крыс, были использованы 30-дневная алкогольная интоксикация или 4-х часовое воздействие стероидных гормонов, соответственно. Как наиболее целесообразные для наших исследований внутриклеточные объекты, отражающие изменение общего морфо-функционального статуса гепатоцитов крыс под действием отмеченных длительных воздействий, были выбраны мембраны лизосом и ядер. Лимфоциты крови больных ХЛЛ нами были использованы в качестве объектов, по всей вероятности, с хронически измененными (под действием неизвестного этиологического фактора) мембранными структурами.

3.1. ДЕЙСТВИЕ ХРОНИЧЕСКОЙ АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ НА ПРОЦЕССЫ ЛИПИДНОЙ МОДИФИКАЦИИ В ЛИЗОСОМАХ

печени крыс

Из литературы известно (Pringle M.J. and Miller K.W., 1978; Saito Т. ct.al, 1985), что длительное действие алкоголя, как и других основных u:;ecieniKOB, на живой организм проявляется на клеточном уровне прежде всего через изменения физических и химических свойств биологических мембран. Эти модификацнонные сдвиги модулируются в основном через изменения липидного компонента мембран (Chin J.H. et.al, 1978).

Полученные нами данные (см. пар. 1.2.) свидетельствовали о наличии в ЛМ печени крыс ферментных систем обратимой модификации липидного бислоя (деацилирования-реацилирования ФЛ). В литературе отсутствуют однозначные данные о нарушениях отмеченных механизмов при установлении в этих мембранных структурах нового, измененного метаболического статуса в условиях хронического воздействия этанола на организм. Все это послужило основанием для проведения специальной серии экспериментов по изучению как липидного состава и состояния мембраноспязапных ферментативных механизмов модификации липидного компонента JIM печени крыс в условиях 30-дневной алкогольной интоксикации, так и возможного нормализующего действия тиосульфата натрии мл нарушения мпднфнкацшшных процессов п лпнндном бнелое отмеченных мембранных струмур.

Выло обнаружено, что иод действием длительного алкогольного травления крыс, действительно происходит изменение исходного морфо-функционального статуса гепатоцитов. На уровне лнггопротеинового бислоя ЛМ такое изменение выявлялось в стойкой активации идентифицированной нами каскадной ферментной системы деацнлировання и в подавлении процесса реацнлирования мембранных ФЛ. Схожая картина кооперативной

Таблица 1. ФЛлизосом печени крыс н норме н при ЗО-цненной алкогольной (шшксикашш (М ± м, п=9).

КОНТРОЛЬ АЛКОГОЛЬ

'1>ракцни мкг Фн/ % мкг Фп/ % %

ФЛ мгбелка (от 1ФЛ) мг белка (от 1ФЛ) (от К)

лизоФХ 1,12 ± 0,11 4,4 1,87 ± 0,21 6,7 166,96

СФМ 7,11 ± 0,26 27,7 3,14 ± 0,28 11,3 44,16

ФХ 5,41 + 0,18 21,1 9,59 ± 0,69 34,3 176,15

ФИ 2,44 ± 0,2 9,5 1,74 ± 0,09 63 71,31

ФС 3,50 ± 0,1 13,6 2,50 ±0,11 9,0 71,4

ФЭ 3,13 ± 0,11 12,2 4,34 ± 0,4 15,6 138,66

лиюВФК 2,96 ± 0,28 11.5 3,22 ± 0,3 11,6 108,8

лняоФЭ - - 1,41 ± 0,16 5,1 -

X 25,67 1 00,0 27,75 100,0 108,1

Таблица 2. НЛ лизосомалышх мембран исчсии крыс п норме и при 30-дневной алкогольной интоксикации_

КОНТРОЛЬ АЛКОГОЛЬ

Фрак- мкг / мкг / % %

ции мг белка (от£ НЛ) мг белка (от £ НЛ) (от К)

МГ 20,7 ± 1,9 8,4 24,2 ± 0,2 5,2 ! 116,9

ДГ+Х 72,5 ± 5,9 29,4 95,5 ± 9,0 20,5 131,7

ЖК 97,6 ± 18,3 39,6 176,9 ± 8,9 37,8 180,5

ТГ 17,7 ± 1,2 7,2 76,5 ± 5,7 16,4 432,2

ЭХ 37,9 ±3,3 15,4 93,3 ± 6,0 20,0 246,2

Е 246.4 100.0 465.7 100.0 189.0

активации всех процессов катаболизма ФЛ нами была выявлена в специальной серии исследований ферментных систем внутрилизосомальных кислых гидролаз (данные не представлены). Подобное смещение нормального равновесного состояния модификациопного механизма цикла дсшшлировашш-рсацштрованнн ФЛ коррелирует с изменениями качественно-количественного состава липидного бислоя, г1рояш1яюишмися как и понижении количества днацильнмх форм ФЛ (табл. 1), так и в повышении (табл. 2) содержании продуктов их гидролиза (лизоФХ, лизоФЭ, ЖК, НЛ). Некоторое повышение уровня только фракций ФХ и ФЭ в этих мембранных структурах хронически трансформированных генатоцитов

объясняется обнаруженной нами кооперативной активацией компенсаторных процессов de novo синтеза ФЛ в микросомах клеток.

Следовательно, длительное этаноловое отравление организма на уровне внутриклеточных органелл гепатоцитов выявляется в превалировании процессов катаболизма мембранных ФЛ лпзосом. Все эти кооперативные сдвига в активности ферментных систем модификации липидного бнслоя, с одной стороны, Moiyr служить причиной "дестабилизации" JIM, приводящей к активации процесса экзоцптоза и объясняющей обнаруженный нами усиленный выход из этих органелл кислой фосфатазы. С другой стороны, обсуждаемые здесь собственные экспериментальные данные проливают свет на молекулярные н биохимические механизмы известных из литературы фактов повышения уровня общей ненасыщенности ЖК-состава (Cunningham С.С. et.al, 1982), увеличения текучести (Hill M.W. and Bengham A.D., 1975) и повреждения нормальной структурной организации (Chin J.H., 1979; Irvine R.F., 1982) мембранного бислоя клеток под действием этанола. Примечательно, что коррегирующее действие разового введения животным гиоисульфата натрия выявлялось в кооперативной нормализации обнаруженных нами нарушений в активности всех исследованных ферментных систем модификации ФЛ мембранного бислоя лнзосом. Результаты этой серии экспериментов подтверждают обсуждаемое в литературе (Seydel J.K. et.al, 1994) значение липидов мембран для понимания механизмов действия лекарственных препаратов на клеточном уровне.

3.2. ЛИПИДНЫЙ КОМПОНЕНТ ЯДЕРНЫХ МЕМБРАН ГЕПАТОЦНТОВ КРЫС ПРИ 4-ЧАСОВОМ ВОЗДЕЙСТВИИ ГИДРОКОРТИЗОНА

Вопросы, связанные с выяснением функциональной роли липидного составляющего различных мембранных структур (ЯМ, ПМ) в механизмах реализации эффектов in vivo действия стероидных гормонов в процессах как транслокации внешних сигналов ФИ-иугем, так и активации генома и по сей день остаются наименее изученными.

В серии специальных экспериментов были проведены сравнительные исследования по изучению процессов-модификации липидного бислоя ЯМ гепатоцнтов крыс в норме и при 4-х часовом in vivo воздействии гидрокортизона. Длительное, приводящее к специфической активации генома, действие стероидных гормонов, характеризовалось установлением в липонротепновом бислое последних нового, измененного метаболического статуса. При этом, состояние метаболического равновесия и качественно-количественного состава липидного компонента отмеченных мембранных структур определялось обнаруженным нами многократным подавлением идентифицированных ранее всех лииид-модифицнрующнх ферментных

систем деашишронаиия-реацшшрсшания и диэстеразного расщепления ФЛ. В экспериментах по определению активностей ФЛ-пшролизующих ферментов (деацилаза и фосфоднэстераза) было обнаружено, тю гидрокортизон подавляет ферментативные активности деацилирования и

фосфодиэстеразного расщепления ФХ в 5,3 и 9,3 раза, соответственно. Подобная гормонозавнснмость исследованных ферментных систем четко проявлялась в сдвигах во фракционном составе липидного компонента мембран, характеризующихся повышением (табл. 3) абсолютного количества всех ФЛ (кроме лизоФХ и ФС) на фоне одновременной убыли (табл. 4) содержания НЛ, в основном, метаболитов последних.

В этих условиях вовлечение микросомального центрального синтетического аппарата в общий кооперативный процесс становления нового морфо-функционального статуса клетки, по-видимому, делает излишним и "отключает" обнаруженный нами локальный механизм de novo синтеза ФЛ ЯМ гепатоцитон. Обнаруженное также впервые гормонозавненмое подавление реакции реацшшрования лизоФХ в ЯМ подтверждает ранее сделанное нами заключение о кооператнвности механизма цикла де- и реацилиронания ФЛ в мембранных структурах клеток.

Таким образом, при гидрокортнзонопой активации генома гепатоцитов крыс липопротеиновый бислой ЯМ претерпевает закономерные перестройки вследствие изменения кооперативных механизмов модификации их липидного составляющего. Обнаруженные сдвиги могут быть компонентами многоступенчатого механизма, обеспечивающего гормональную активацию генетического аппарата клеток.

Следует отметить, что идентичная с вышеизложенной картина кооперативных сдвигов в процессах модификации липидного бислоя биомембран нами была обнаружена и в синаптосомальных мембранах крыс при 4-х часовом in vivo воздействии эстраднола. Суммируя результаты этих двух серий исследований, можно констатировать факт превалировння сшпетических процессов над катаболичеекпми в липидном бислое различных мембранных структур вследствие длительного /л vivo воздействия стероидных гормонов.

Еще одним проявлением 4-х часового />/ vivo воздействия эстрадиола является обнаруженное нами подавление последним активности ФП-ФДЭ синаптосомальных мембарн на 5 сек К'-индуцироканной стимуляции ФИ-пикла. Подтверждением зависимости инициации ФИ-ого сигнального домена от состояния морфо-фупкнионалыюго статуса липидного бислоя, специфически измененного активацией зстрадиолом бносинтетическнх процессов клетки является также факт полного иивелировния выявленого нами понижения активности ФИ-ФДЭ предварительным введением животным актиномицина Д.

Как вышеизложенные собственные, так и появившиеся в последние годы литературные данные, свидетельствуют о более сложной и тонкой

Таблица 3. Фосфолипиды ядерных мембран печени крыс в контроле и при воздействии гидрокортизона. Приведены средние значения пяти серий экспериментов по 3 - 5 параллелей (Р < 0,05).

К О 11 т р о л ь Гидрокортизон

Фосфолипиды мкг Ф„ / мг белка %ог! мкг Ф„ / мг белка %от! %отК

лизо-ФХ 22,1 ± 2,0 5,0 16,1 ± 1,7 2,4 79,2

СФМ 26,1 ± 2,1 5,7 30,0 ± 2,1 4,2 114,9

ФХ 185,5 ± 15,2 43,0 354,5 ±39,5 50,1 191,1

ФИ 38,2 ± 2,2 8,8 57,5 ± 4,5 8,1 150,5

ФС 28,2 ± 4,1 6,4 28,1 ± 3,5 4,0 99,6

ФЭ 104,5 ± 23,9 23,9 178,5 ±18,5 25,2 170,8

ФГ 10,0 ± 2,7 2,7 12,1 ± 2,1 1,7 121,0

ДФГ 21,0 + 2,5 4,6 30,5 ± 6,5 4,3 145,2

1ФЛ 435,5 ± 34,1 100,0 707,2 ± 62,2 100,0 162,4

Таблица 4. Нейтральные линиды ядерных мембран печени крыс в контроле и прп действии гидрокортизона (М ± м; п = 5)

К о и т р о л I. Гидрокортизон

НЛ мкг / мг белка % от! мкг / мг белка % от £ % от К

мг 21,1 ± 1,4 6,5 - - -

X 137,5 ± 12,8 37,7 111,6 ± 10,8 60,6 81,2

дг 13,4 ± 1,1 8,9 7,5 ± 0,7 6,3 56,0

жк 94,5 ± 4,0 29,1 48,4 ± 4,8 27,2 51,2

тг 30,8 ± 2,8 9,5 10,6 ± 1,0 5,9 30,4

эх 27,3 ± 2,7 8,4 - - -

1НЛ 324,6 ± 10,7 100,0 178,1+ 16,9 100,0 54,9

(нежели было известно до сегодняшнего дня) морфо-функционалъной организации липопротеинового бпслоя ЯМ клеток. Обнаружение в ЯМ целого семейства различных ФИ-ФДЭ (Азапо М. е1.а1, 1994) и

возможность осуществления клеткой процесса их обратимой транслокацнн из цитозоля в мембранный бислой открывают новые перспективы для более полного понимания и раскрытия важной роли липидного компонента этих структур п процессах гормональной регуляции генетического аппарата.

3.3. ПРОЦЕССЫ МОДИФИКАЦИИ ЛИШЩНОГО БИСЛОЯ ЛИМФОЦИТОВ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ЛИМФОЛЕЙКОЗЕ

Обсужденные выше данные об эффектах in vivo воздействий этанола и стероидных гормонов на кооперативные процессы модификации липидного бислоя внутриклеточных мембранных структур в определенной степени можно считать изначально предсказуемыми. Наши исследования, во-первых, экспериментально подтвердили и дополнили известные из литературы мембрана-дезорганизнрующие (Lee A.G., 1976; Chin J.H. and Goldstein D.B., 1984) и активирующие бносинтетические процессы (Розен В.Б., 1984; John М. et.al, 1985) эффекты длительного воздействия этанола и гормонов, соответственно. Во-вторых, они позволили выяснить и уточнить определенные молекулярно-биологические и биохимические механизмы реализации отмеченных воздействий на уровне липопротеииового бислоя бпомембран.

В плане подобных исследований, на наш взгляд, весьма примечательны представленные ниже собственные экспериментальные данные, полученные в поисковых, сравнительных исследованиях с использованием в качестве объектов лимфоцитов крови здоровых доноров, больных ХЛЛ и после принятия ими полного курса химиотерапии. Следовательно, целью данного раздела работы было исследование состояния быстропротекающнх (5 сек) и пролонгированных (60 мин) модификационных процессов липидного составляющего лимфоцитарных мембран с хронически измененым (под действием неизвестного внешнего или внутреннего воздействия) метаболическим статусом. Теоретической базой и отправными точками для проведения данных серий исследований послужило нижеперечисленное:

а) в основе феномена возникновения и развитая опухолевого зачатка лежат иммунные процессы, в связи с чем главной нерешенной проблемой этого заболевания, по-прежнему, остается выяснение основных молекулярно-биологическнх и биохимических механизмов перерождения нормальной клетки в раковую, особенно в случае такового иммунокомпетентных клеток;

б) основным морфо-функциональным локусом клеток, несомненно, участвующим в механизмах действия разнообразных этиологических факторов канцерогенеза для всех известных гипотез (вирусная, генная, химическая, радиационная, мембранной аугогибридизации и пр.) возникновения опухолевого зачатка, является ПМ клеток;

в) в осуществлении всех жизненно важных функций клеток, затрагиваемых патогенезом злокачественного роста, основную роль также играет ПМ;

г) для выяснения механизмов возникновения злокачественных новообразований особого внимания заслуживает гипотеза "мембранной

§2 2

и 1 ё

1 лизоФХ 54

фх

Л^л

фи+фс

м ■

гч

-I { I

Т фэ+фк+кл

05 10 30 60 0510 30 60 051(1 30 60 0510 30 60 Рис. 13. Изменение содержания мембранных ФЛ в динамике митогенной инициации ФИ-цикла ЛГ1К.Ч здоровых доноров (- - -) и больных ХЛЛ (—).

г.

аугогибридизации", принципиально меняющая понимание их этионатогенеза, предполагая исходную неполноценность ПМ клеток, как первопричины опухолевого роста;

д) отсутствие целенаправленных и масштабных исследований по изучению механизмов кооперативного вовлечения в этиопатогенез малигпизации клеток, помимо белкой, также и мембранных линидон, имеющих нммуноиндифферентную природу, низкомолекулярные ферментные системы модификации которых локализованы, в основном, в обращенном в цитоплазме липидном монослое или же "замаскированы" в толще клеточной мембраны.

Обнаруженные существенные различия уровней исходного включения и перераспределения [ИС]АК п отдельных фракциях ФЛ (рис. 13) и ИЛ (рис. 14) лимфоцитарных мембран при ХЛЛ в течение 60 мин, и в отсутствие внешнего сигнала, свидетельствуют о специфическом изменении по сравнению с нормой исходного морфо-фупкционального статуса клеток. Если повышенный уровень накопления ЖК во фракции ФХ на фоне многократного понижения содержания арахндонил-лизоФХ в патологически трансформированных клетках свидетельствует об относительном ингибировании процессов деацилирования ФЛ, то обратные сдвиги во фракциях ФС, ФИ и ФК указывают на возможное подавление функционирования ФИ-цикла и аномально высокую ФС-декарбоксилазную активность мембран лейкозных лимфоцитов. Эти результаты подтверждаются как обнаруженным низким (по сравнению с нормой) содержанием свободной АК и 1,2-ДАГ, так и результатами последующих

Рис. 14. Изменение содержания НЛ и ЛК и динамике инициации ФИ-цнкла ЛПКЧ здоровых доноров (---) и больных ХЛЛ (—).

ос к

Рис. 15. Динамика образования 5-НЕТЕ при мнтогенной стимуляции ЛПКЧ здоровых доноров (— ) и больных ХЛЛ (—).

исследований по изучению процессов аиплироваиия ФЛ, меченных ОК в тех же условиях эксперимента.

Рецептор-опосредуемая быстрая стимуляция лейкозных клеток на фоне измененого "стационарного состояния покоя" обнаружила специфические изменения как в ФИ-ом обмене, так и в процессах кооперативной модификации липмдного бислоя. Полученные данные обнаруживают общую закономерность либо подавления отмеченых процессов, либо развития в них диаметрально противоположных (по сравнению с нормой) сдвигов, наиболее четко выявляемых на начальной, мембраносвязанной фазе (5 сек) митогенной инициации ФИ-цикла. Идентичная картина изменения динамики образования 5-НЕТЕ, ЛОГ продукта АК (рис. 15), подтверждает эти данные. Для ХЛЛ характерно также нарушение обнаруженног о в норме ФИ-ФДЭ->1,2-ДАГ-липаза->МГ-липаза кооперативного нуги высвобождения АК с установлением новой кооперативной связи между процессами образования и утилизации АК и ТГ (рис. 14).

Исходя из вышеизложенного, можно заключить, что в АК-меченых малигнизнрованных лимфоцитах обнаруживаются закономерные нарушения процессов как в становлении исходного стационарного состояния липидного бислоя, так и в процессах кооперирования быстрых модификаций липидного компонента иммунокомпстептных клеток. Отмеченные нарушения сказываются на протекании процессов, осуществляющих транслокацию внешнего митогенного сигнала именно на мембрана-ассоциированном этапе.

Подобное заключение подверждается результатами последующей серии экспериментов по исследованию закономерностей бысрого или пролонгированного включения и распределения [|4С]ОК в ФЛ мембран лимфоцитов. В крови нормальных доноров быстрое (5 сек) и преимущественное (до 80% о г суммы включенной радиоактивности) ацилирование данной ЖК обнаруживалось (рис. 16) во фракции ФС, как и в ранее проведенных экспериментах с применением [14С]ПК. В патологически трансформированных клетках, однако, параллельно с двухкратным понижением (по сравнению с нормой) уровня фракции ФС, до 90% включенной ЖК обнаруживалось во фракции ФЭ. Аномально высокий уровень накопления ОК в этой фракции ФЛ наблюдался (рис. 17) и при инкубации клеток в течение 60 мин, тогда как в норме наибольшее количество включенной ЖК обнаруживалось во фракции ФХ в тех же условиях эксперимента.

Примечательно, что обнаруженные при ХЛЛ нарушения процессов ацнлирования и распределения ОК в отдельных ФЛ фракциях лейкозных лимфоцитов как при кратковременной, так и длительной ннкубациях клеток обнаруживают четко выраженную тенденцию к нормализации после получения больными полного курса химиотерапии. О наличии патологических дефектов в моднфнканнонных процесах деацилнрования-

2 70

н 50

20 -

2 :

■ Норма

еахлл

ЕЭХЛЛ + химиотерапия

—ДтСТ ШтЯЯ

1 2 3 4 5

Рис, 16. Включение и процентное распределение [14С]ОК в ФЛ ЛПКЧ здоровых доноров ( Ц ), больных ХЛЛ ( §) и больных после химиотерапии ( д ) в течение 5 сек. Здесь н на следующем рисунке: 1-лизоФХ, 2- ФХ, 3-ФИ, 4-ФС, 5-ФЭ.

_ 60 --а

2 3 4 5

Рис. 17. Включение и процентное распределение [иС]ОК в ФЛ ЛПКЧ здоровых доноров ( |), больных ХЛЛ ( §) и больных после курса химиотерапии ( § ) в течении 60 мин.

реаишшрошшин и межфракционных прекращений ФЛ н лшшдном Гжслос лпмфощгти больных, помимо вышеприведенных данных, свидетельствует и о|сутсишс (в огличие ог нормы) достисрпых изменений в отмеченных

процессах при воздействии на них ингибитора деапилаз - меиакрина (рис. 18).

Следует также отметить обнаруженный нами факт чувствительности исследуемых процессов модификации липидного бислоя к иммуномодулирующему действию Т-активина. Эти результаты, подтверждающие литературные данные (Flescher Е. et.al, 1991; Fujimiya Н. et.al, 1994) о роли ПМ как мишени для различных лекарственных препаратов, также были получены на 5 сек митогенной инициации ФИ-го сигнального механизма в исследуемых типах лимфоцитов (норма, ХЛЛ, после химиотерапии).

На основании представленного в главе 3 экспериментального материала можно заключить, что в условиях длительных внешних воздействий на клетки в изменении исходного метаболического

Рис. 18. Действие КонА на длительное (60 мин) включение и распределение [иС]ОК в ФЛ нормальных и злокачественно перерожденных ЛПКЧ в отсутствие (I) и в присутствии (2) менкрииа.

статуса различных мембранных структур кооперативно вовлекется и их липидное составляющее. Специфически измененное и динамически уравновешанное новое состояние липопротеинового бислоя проявляется также в специфических нарушениях процессов кооперации быстрой и обратимой модификации липидного бислоя, особенно на мембраносвязаниом этапе стимуляции ФИ-ого сигнального домена.

ВЫВОДЫ

1. В зависимости от функциональной активности и степени дифференциации клеток, липидный компонент плазматических мембран последних в норме характеризуется различной степенью пластичности по отношению к процессам модификации жнрнокислотного состава отдельных фосфолинидных фракций.

2. Обнаруженная нами однотипная, двухфазная активация фосфоинозитид-специфичной фосфоднэстеразы на ранних [5-60 сек) этапах стимуляции различных клеточных популяций соответствующими первичными внешними сигналами подтверждает универсальность механизмов регуляции функционирования фосфоинозитидного-цикла.

3. На мембраносвязанном этапе (с 5 сек) трансдукции внешних сигналов обнаружено кооперативное функционирование процессов модификации липидного компонента мембран при двухфазной активации фосфоинозитид-специфичной фсфодиэстеразы с обратимым и быстрым изменением дискретно стационарных состоянии в фосфоинозитидном сигнальном домене плазматических мембран клеток.

В качестве подобных лшшд-моднфнцируюшнх механизмов выступают ферментные системы: а) цикла деацнлироваиия-реацшшровання и взаимопревращения фосфолинидов; б) обмена триацнлглицеринов, выступающих в роли "временного депо" для свободной арахидиновой кислоты, и лнпоксигеназиого пути утилизации последней.

4. Мембранные структуры клеток предстаилшот собой совокупность относительно автономных липопротеиновых доменов, функционирующих по принципу кооперативности. Полученные результаты свидетельствуют о том, что одним из подобных структурно-функциональных единиц плазматических мембран изученных клеточных популяций является кооперативный домен фосфоинозитидного снгналыюго механизма.

5. В мембранах внутриклеточных структур впервые идентифицированы ферментные системы модификации липидного бислоя, включаюшие Са2+ - активируемые фосфолипазы тола А и С, субстрат-активируемую лизофосфолипазу и Mg^-зависимую ацил-КоА:лизофосфолипид ацшпрансферазу. В ядерных мембранах выявлена активность локальной цитнднпднфосфохолнн: 1,2-диацилглицерин фосфохолннтраисферазы, лимитирующей один щ путей cfc novo синтеза фосфатндилхолинов.

6. 30-тн дневная алкогольная интоксикация крыс приводит к стойкому изменению общего метаболического статуса гепатоцитов, что на уровне лизосомальных мембран выявлется в превалировании процессов катаболизма фосфолипидов над их образованием, приводящего к стимуляции лизосомального экзоцитоза и к компенсаторной активации de novo синтеза фосфолипидов в микросомах. Коррегирующее действие

разового введения тиосульфата иагрия кооперативно выявляется в нормализации нарушений в активности всех исследованных ферментных систем.

7. Длительное изменение метаболического статуса гепатоцитов и синаптосом крыс при 4-х часовом in vivo воздействии стероидных гормонов проявляется и в процессах модификации липндного компонента мембранных структур общим эффектом превалирования синтетических процессов'над катаболическимн. Установлено;

а) подавление активностей ферментных систем цикла деацилировання-реацилированпя и диэстераэиого расщепления мембранных фосфолниидов, четко выявляющееся и количественных изменениях метаболитов последних и нейтральных лииидои;

б) ингибирование локальной, ядерномембранной системы синтеза фосфолипидов при гормональной активации центрального микросомалыюго синтетического аппарата.

8. При длительном in vivo воздействии эстрадиола кооперативное изменение общего морфо-функционального статуса синаптосом с модификацией плазматических мембран приводит к подавлению активности фосфоиноэитид-специфнчной фосфодиэстераэы.

9. Выявлены специфические для хронического лимфолейкоза дефекты в кооперативных процессах деацнлирования-реацилирования и фракционных взаимопревращений липидного компонента плазматических мембран иммунокомпетентных клеток как в покое, так и на ранних этапах (5 сек) митогенной стимуляции фосфоинозитидного домена.

10. В качестве мембранной мишени для иммуномодулятора Т-активина и применяемых в клинике хронического лимфолейкоза других химиотераневтпчсских средств, нами установлены процессы обратимой модификации лшшдиого компонента плазмат ических мембран лимфоцитов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Тадевосян Ю.В., Карагезян К.Г., Геворкян Г. А., Батикян Т.Б. Нейтральные липиды мембран лизосом и внугрилизосомальные ферментные системы липолиза при алкогольном отравлении //Биол. журн. Армении, 1985, Т. 38, #5, С. 42-445.

2. Тадевосян Ю.В., Карагезян К.Г., Геворкян Г.А., Батикян Т.Б. Роль фосфолипидов в изменении стабильности лизосомальных мембран в условиях хронической алкогольной интоксикации //Бюлл. эксп. биол. и мед., 1985, С. 11, С. 553-554.

3. Карагезян К.Г., Тадевосян Ю.В., Батикян Т.Б. Лнпидный состав, активности некоторых ферментных систем липолиза и стабильность

лизосомальных мембран печени крыс » условиях хронического алкогольного отравления //Тезисы V Всесоюзн. биохим. съезда, 1986.

4. Геворкян Э.С., Тадевосян Ю.В., Яврояи Ж.В., Геворкян Г.А. Действие гидрокортизона на фосфолнпидный состав и активность некоторых ферментов метаболизма фосфолшшдов ядерных мембран в печени крыс //Биохимия, 1986, Т. 51, # 10, С. 1630-1633.

5. Карагезян К.Г., Тадевосян Ю.В., Батикян Т.Б. Система деацилирования-реацилирования фосфоглицерндов в лизосомальных мембранах печени белых крыс //ДАН СССР, 1986, Т. 286, # 2, С. 465-467.

6. Карагезян К.Г., Тадевосян Ю.В. Ферментные системы метаболизма фосфолипидов в ядерных мембранах печени белых крыс //ДАН СССР, 1986, Т. 287, #5, С. 1248-1250.

7. Паносян Г.А., Геворкян Э.С., Тадевосян Ю.В., Явроян Ж.В. Изучение липидов ядерных структур печени крыс при воздействии гидрокортизона //Тезисы Всесоюзн. симп. '"Макромолекулы и функционирование клетки", Ереван, 1986.

8. Тадевосян Ю.В., Карагезян К.Г., Батикян Т.Б. Фосфолипиды и ферментные системы деацилирования-реацилнрования фосфоглицерндов лизосомальных мембран печени крыс в условиях хронического алкогольного отравления //Тезисы III "Всесоюзн. симп. Структура и функции лизосом", Тбилиси, 1986.

9. Батикян Т.Б., Тадевосян Ю.В., Карагезян К.Г. Процессы катаболизма фосфоглицерндов в растворимой фракции лизосом печени крыс в условиях длительной алкогольной интоксикации // Тезисы III Всесоюзн. симп. "Структура и функции лизосом", Тбилиси, 1986.

10. Тадевосян Ю.В., Карагезян К.Г., Батикян Т.Б. Кооперация функционирования фосфолипазы А2 и фосфоинозитид-специфичной фосфодиэстеразы синапгосом мозга крыс при инициации фосфоинозитидного цикла//ДАН СССР, 1987, Т. 295, #5, С. 1254-1257.

11. Тадевосян Ю.В., Карагезян К.Г., Батикян Т.Б. Возможная кооперация мембранных фосфолипидов в запуске фосфоинозитидного цикла //Тезисы Всесоюзн. симп. по биохимии липидов, Алма-Ата, 1987.

12. Геворкян Э.С., Тадевосян Ю.В., Карагезян К.Г. Инициация катаболизма фосфоиноэитндов К+-деполярнзацией мембран сииаптосом мозга крыс при воздействии эстрадиола //Тезисы Всесоюзн. сими, но биохимии липидов, Алма-Ата, 1987.

13. Геворкян Э.С., Тадевосян Ю.В., Явроян Ж.В., Карагезян К.Г., Паносян Г.А. Ферментные системы метаболизма фосфолипидов ядерных структур при активации гидрокортизоном //Тезисы IX Всесоюзн. симп. "Структура и функции клеточного ядра", Черноголовка, 1987.

14. Геворкян Э.С., Тадевосян Ю.В., Явроян Ж.В., Карагезян К.Г. Повышение ЦЦФ-холин:диглицерид фосфохолинтрансферазной активности

во фракции микросом и снижение в ядерных мембранах печени крыс при воздействии гидрокортизона//Укр. биохим. жури., 1988, Т. 60, #4, С. 81-83.

15. Тадевосян Ю.В., Карагезян К.Г., Фаркаш Т. Обмен фосфолипвдов мембран тимоцитоп и сипаптосом крыс при инициации фосфоинозитидного цикла //Тезисы VI Всесоюзн. снмп. "Роль циклических нуклеотидов и вторичных посредников в регуляции ферментативных процессов", Петрозаводск, 1988.

16. Tadevosian Yu.V., Batikyan 'Г.В., Kaiageuzyan K.G. Depolarization-induced phodphoinositide-specific phosphodiesterase activation and phosphatidylcholine deacylation in synaptosomes //Int. Meeting "Neurochemical Aspects of Phospholipid Metabolism , Perugia, Italy, 1988.

17. Tadevosian Yu.V., Karageuzyan K.G, Farkash T. Phospholipid metabolism of synaptosomes and thymocytes in phosphoinositide-cycle initiation //ISF-JOCS World Congress, Tokyo, Japan, 1988.

18. Тадевосян Ю.В., Геворкян Э.С. Инициация эстрадиолом катаболизма фосфоинозитидов в мембранах синаптосом головного мозга крыс //Укр. биохим. хурн., 1990, Т. 62, # 4, С. 103-106.

19. Геворкян Э.С., Тадевосян Ю.В. Действие эстрадиола на инициацию катаболизма фосфоинозитидов в мембранах синаптосом головного мозга крыс //Биохимия, 1990, Т. 55, Вып. 9, С. 1381-1386.

20. Батикян Т.Б., Карагезян К.Г., Тадевосян Ю.В. Ферментная система деацилирования-реацшшрования фосфолшшдов в мембранах лизосом печени крыс//Биохимия, 1990, Т. 55, Вып. 9, С. 1700-1706.

21. Тадевосян Ю.В., Асатрян Л.10., Карагезян КГ. Процессы деацилирования мембранных фосфолипидов при инициации фосфониозитидного цикла в синаптосомах крыс и лимфоцитах крови человека //Ненрохимия, 1992, Т. 11, # 2, С. 194-201.

22. Тадевосян Ю.В., Асатрян Л.Ю., Карагезян К Г. Исследование включения и распределения меченых предшественников фосфолипидов в интактных лимфоцитах //Биол. журн. Армении, 1993, Т.46, # 2, С. 3-8.

23.Tadevosian Yu.V., Balikyan Т.В., Asatrian L.Yu., Gevorkian E.S., Tadevosian A. Yu., Melik-Andreasian M.G. Lymphocytes lipid bilayer rapid modifications in leukemia //9th Int. Conf. on Second Messengers and Phosphprot., Nashville, USA, 1995.

24. Тадевосян Ю.В., Асатрян Jl.IO., Батикян Т.Б., Карагезян К.Г., Тадевосян АЛО. Процессы катаболизма мембранных фосфатидилхолииов в ранние сроки митогешюй инициации фосфоииозитндиого цикла в лимфоцитах //Биохимия, 1996, Т. 61, Выи. 8, С. 1414-1421.

U и Ф П Ф ni- и

UzfuujuiiuDpn Qi||ipilw& t puiquiGpuijfiG |Jiu|fiqn|nq|iuJ|[i duui5iuGujl|uulj[ig IjuipLnpuiqrujG nuiqnipjniGGbplig úbl}|í ^nu^nfiGnqfipfirçi^fiG iuqquiCÍ2iuüuj]liü hiiiúiuL|Ujpq}i

niunLi5Gu]u|iprupjuiii[i: Rbuiuiqninrupjujû шпшр1|ш bû quipóbi pgfigGbpji fupiuGúuuG i{mri фпцЬрпи] (5-60 i(pL|) $nu;|)nfrGnq|ipfrqujj¡iG-gfi(jLh Bh¿ niiiruúÜLUufipiliuó, uipiuq qnpôiuûbnLpjujG op|iGiu¿u^nipjnLÚGbpQ, fi0¿UL)bu GuiL GpiuGgniC piur\iuGpujj[iG |]iu)|iqGbpti iniuppbp puirçiuripiui5iuubp|i únnfr$filjLugbujübp|i' ^пщЬршифЦ liiuuGuiligrupjuiG rçbpQ U ЦЬ0ише|и5(1ш1<шй tfbfuiuGtiqúGbpQ: liniugfiG luGqujú huíjinGiupbpilbL t $nu$nfÍGnqtipfin.-jnipuihtumni.lj $nu$nqfitupbpuiqfi bpl^uuq ииЦифЦшдйшй hbin 1)гицЬршдфи0 puunuiûpGbph ijiqh^jhû pmriujrçpfafi йпгффМшэЬпС uipaiq U qiupàb|Ji iqpngbuGbpjn ujnljuujnLpjniGQ: Siuppbp ршцшйршфО ^итгидфибейЬрпиЗ puigiuhiujmilbL t |jtin|iqGbp|i i5nr|fi$hliujg{iujjfi uiu)unjugfi|uigi5uiG, фршшд(1[шд15ш0, rçfitupbpuiquijfiG бЬгцэйшО L de novo ufiDpbqfr $bpi5bûiniujhG huit5tu4iupqbpti libGuiuqnpínuGbrupjruÜQ:

U2fmumujüß[i IjfipiunuitjuiG Û2uuGiJUlirupjuiû inbumG^jniGtig oiniuijbL ЦшрЬпр t hbinuiqninni.pjni.GGbp}i uijG 2ШРБС. nPD йфрЦшб t |jiu|fiqiuj|iG pairiüjqpbih фРП Ü2U»a>ó ¿¡п^ФЬЦшдЬпй ujpngbuGbpti hiuúbiíuitmii^iuG ruum.úGiuufipm.pjwü[! Опр(5ш[ U h|n|iuGrçiuq}iG mpujDu$np¿¡aig|iuJj|i bGpuipl^iuó рдзилгфщЬрпиЗ: (BiuqiuGpljuJU^uió ищ mpngbuGbpnuí pu!guuhiujini[b[ bG fufiuin jnipiuhiuuinili L ор^йш^шф faiuGqujpruúGbp ЬрЦшриллЬ ujiljnhniuijtiü pnLÛu^npùujû, in vivo hnptfnGuiL luqrçbgnipjiuG L fupnGpljiu^LuG |Jn5$n|bjljnq|i u|iiiji3mDGbpnLi5: Яшт^и^шршй I; haijinúujpbpi{lu¿r ujjG фшитр, пр гнипиЗйилфрфид iqpngbuGbpp huiGq|iuiuGriLi5 bG

uituppbp fifrôfmpbpiuuiUwlili úfigngGbpfi uiqqbgrupjujG ршпшйршфО pfiptu|iiGbp:

UwbGu)|unurupjujû übg ¿шрищрфи^ фшишш^шй ini[|Uj|Gbp[i U uipijujá huijbgiLiliiupquijJrô bqpuiljuignipjniGGbpfi ruGbû n¿ tffiiujG 1фййшршр qfiinuiLjuiG, tuj(L IjiupLnp lifipumujipjuû Û2UiGu]4rupjniG U Grip dnuibgnuîGbp bû umujpiuripni-ú hbimuquj 1{ф£ф1|ш1(шй 1LUjGuióu^u][ hbmiuqninnLpjniüGbpti huiúiup:

Информация о работе

Тадевосян, Юрий Викторович
доктора биологических наук
Ереван, 1996
ВАК 03.00.04

Автореферат

Похожие работы