Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конструирование плазмидных векторов для изучения пренилирования белков возбудителя туляремии

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Конструирование плазмидных векторов для изучения пренилирования белков возбудителя туляремии"

На правах рукописи

МАРАКАСОВА Екатерина Семеновна

Конструирование плазмидных векторов для изучения пренилирования белков возбудителя туляремии

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2013

з о май т

005060452

Работа выполнена на кафедре ветеринарной вирусологии им. В.Н. Сюрина ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И.Скрябина».

Научный руководитель:

доктор биологических наук Ярыгина Елена Игоревна

Официальные оппоненты:

Букова Наталья Константиновна - доктор биологических наук, профессор, ФГБУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов», ученый секретарь;

Цыбанов Содном Жамьянович - доктор биологических наук, профессор ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии», заведующий лабораторией биофизики

Ведущая организация:

ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко».

Защита состоится «¿?-5~» 2013 г. в часов на заседании диссер-

тационного совета Д 220.42.01 при ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И.Скрябина», по адресу: 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, 23. Тел. (495) 377-93-83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И.Скрябина»

Автореферат разослан » иС(-CLr.pl--_2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

Грязнева Т.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Туляремия - это инфекционное заболевание, характеризующиеся воспалительной модификацией ворот входа инфекции. Человек может заразиться при контакте с больным животным или его трупом, через зараженную воду, еду или укус насекомого (комары, клещи, слепни). Это заболевание относится к природно-очаговым зоонозам разных видов грызунов, зайцеобразных, насекомоядных, сумчатых, хищников, копытных, птиц, амфибий, рыб и беспозвоночных (более 80 видов животных) [Гольдин Р.Б. и др., 2003]. Также человек может заразиться при вдыхании аэрозолей, при таком способе инфицирования развивается легочная форма туляремии.

Эндемические очаги туляремии регулярно проявляются на территории Российской Федерации и соседних стран [Кузнецова Е.М., 2011]. Возбудителем туляремии является грамотрицательная неподвижная коккоподобная палочка Francisella tularensis. Бактерии F. tularensis считаются очень контагиозными из-за очень малой инфекционной дозы, известно, что 10 бактериальных клеток [Chopra К. et al, 2011] способны вызвать заболевание человека. Именно из-за такой низкой инфекционной дозы и легкости распространения с аэрозолями F. tularensis причисляют к бактериям, которые потенциально можно использовать в качестве биологического оружия [Kilmury S.L. & Twine S.M., 2010]. Отдел Здоровья и Безопасности США внес F. tularensis в список особо опасных агентов класса A [Foley J.E. & Nieto N.C., 2010]. В Российской Федерации согласно санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 (прил.1) по классификации микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний человека F. tularensis отнесен ко II группе патоген-ности.

В последнее десятилетие накопилось огромное количество данных, полученных в результате секвенирования геномов, на данный момент полностью секвенировано более десятка геномов разных штаммов Francisella, в том числе F. tularensis SCHU S4. Для изучения функций генов Francisella созданы библиотеки мутантных штаммов, непатогенных для человека [Gallagher

L.A. et al, 2007]. Вместе с тем генетические манипуляции с Francisella осложнены тем, что репликативные единицы, используемые для E.coli, неприменимы для франчизелл, а также низкой эффективностью трансформации. Кроме того, бактерии этого рода естественно стойкие к бета-лактамным антибиотикам, Однако для генно-инженерной работы с Francisella были разработаны ряд векторов для мутагенеза с помощью транспозонов, гомологичной рекомбинации, «ловушек» промотеров и комплементации делеционных мутантов [Zogaj X. et al, 2010]. На сегодняшний день подавляющее большинство плазмидных векторов непригодны для комплементации делеций генов штаммов из библиотеки мутантов, поскольку несут гены стойкости к кана-мицину. Актуальным представляется найти решение этой проблемы и создать эффективный вектор.

Патогенез Francisella характеризуется проникновением в клетку хозяина, выходом из фагосомы, размножением, выходом из клетки и опять заражением. Каждая из стадий пристально изучается учеными по всему миру, но механизм выхода франчизелл из фагосомы все еще остается невыясненным. Известно, что бактерия вступает с клеткой-хозяином в различные взаимодействия, в том числе она секретирует в среду или вводит непосредственно в клетку ряд эффекторных молекул. Бактериальные эффекторы, в свою очередь, могут вступать во взаимодействия с белками клетки-хозяина, а также служить субстратами для посттрансляционных модификаций эукариотиче-скими ферментами. Так, бактериальные белки, содержащие мотив СааХ, могут модифицироваться с помощью системы пренилирования клетки-хозяина, что приводит к изменению свойства этих белков. В частности, пренилирова-ние было экспериментально показано для прокариотических белков SifA {Salmonella typhimurium) [Reinicke A.Т. et al, 2005] и AnkB {Legionella pneumophila) [Price C.T. et al, 2010]. Определена необходимость пренилирования этих белков для способности инфицировать и размножаться внутри клетки хозяина.

Представляется актуальным выяснить, имеет ли место пренилирование белков Магет'и в процессе инфекцирования эукариотической клетки.

Цель исследований — сконструировать плазмидные векторы для изучения пренилирования белков возбудителя туляремии.

Задачи исследований:

1. Сконструировать плазмидный вектор для генетической комплементации мутантных штаммов Р. поу1с1с1а Ш12 и доказать эффективность полученной конструкции.

2. Изучить геном Р. ш1агет\5 с целью поиска возможных мишеней эука-риотических пренилтрансфераз.

3. Установить возможные белки-мишени пренилирования при инфицировании клеточных линий человека Р. пог'ю'1с1а Ш 12.

4. Клонировать и экспрессировать выбранные белки, изучить их пренилирование.

Научная новизна работы. Впервые разработан вектор для клонирования генов и экспрессии у Р. novicida, как туляремийный вектор, несущий поли-линкерный регион - ген стойкости к тетрациклину, что в полной мере обеспечивает эффективность генно-инженерных манипуляций с Р. поУ1С1с/а, при этом созданный вектор совместим для работы с транспозонными мутантами Р. Ыаге№1я.

Проведен детальный анализ белков, кодируемых геномом Р. Ш1агет15 БСНи Б4, и предсказаны мишени пренилирования с помощью биоинформа-тических методов. Впервые в России клонированы гены ФТТ-0482, ФТТ-1693, ФТТ-0900 из генома Р. ¡Ыагепя'я БСНи Б4. Впервые в мире экспериментально установлено, что белки ФТТ-0482, ФТТ-1693, ФТТ-0900 не модифицируются эукариотической системой пренилирования.

Впервые использован метод метаболического введения меченого азидом фарнезила одновременно с трансфекцией клеток.

Впервые установлено, что белок ФТН-0357 пренилируется, и впервые с помощью моделирования предсказана его пространственная структура.

Практическая значимость работы. Разработан туляремийный вектор для комплементации делеционных мутаций, как первый вектор, в котором присутствует полилинкерный регион для эффективного клонирования и экспрессии белков в по\Шс1а, устойчивых к канамицину. Вектор охарактеризован с помощью рестрикционного анализа и секвенирования и депонирован в ГНУ ВНИИВВиМ.

Проведен биоинформатический анализ и моделирование пространственной структуры белков ФТТ-0482, ФТТ-1693, ФТТ-0900 и ФТТ-0502. Получены данные о влиянии мутаций аналогичных генов в по\чс1с1а на рост, способность проникать и размножаться внутри клеток макрофагов мыши, которые используются в научно-исследовательской работе, а также в учебном процессе в ФГБОУ ВПО МГАВМ.

Доказано, что ФТТ-0482, ФТТ-1693, ФТТ-0900 не пренилируются в клетках эмбриональной почки человека, несмотря на то, что программа РгеРБ предсказывала, что эти белки содержат возможные мишени для пренил-трансфераз человека. Поскольку функции генов ФТТ-0482, ФТТ-1693, ФТТ-0900 и ФТТ-0502 неизвестны, то полученные в этой работе данные помогают в дальнейшем исследовании функций этих белков.

Результаты проведенных исследований по инфицированию клеточных культур франчизеллой доказали, что пренилирование играет важную роль в инфекционном процессе на молекулярном уровне. Установлено, что белок ФТН-0357 пренилируется, что существенно дополняют картину инфекционного процесса, вызываемого Ггапс/ьеНа.

Разработаны «Методические указания по клонированию генов в вектор рКК-полилинкер», утвержденные ректором ФГБОУ ВПО МГАВМиБ в установленном порядке 14 мая 2013 г.

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Автор лично выполнила весь объем научно-исследовательских работ, проанализировала результаты, сформулировала выводы работы.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены в 2012 году на ежегодном собрании академии наук в штате Виргиния (США), первой конференции по взаимодействию между хозяином и патогенным микроорганизмом в биозащите и новым болезням (штат Виргиния, США, 2012), среднеатлантической встрече ученых (по итогам конкурса работа признана лучшей, а её автор была награждена фантом для посещения встречи-конференции) по микробному патогенезу (Виргиния, США, 2013).

Автор работы является стипендиатом программы Фулбрайт в 2011-2012 гг, победителем конкурса «Молодые новаторы аграрной России» в 2010 г, по итогам которого был получен грант на исследования, и победителем олимпиад по нанотехнологиям в 2010 и 2011 годах (МГУ имени М.В. Ломоносова).

Публикации результатов работы. По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работы, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 1 - в сборниках международных конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 134 страницах машинописного текста и содержит следующие главы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, список использованной литературы, список сокращений, список иллюстраций и приложения. Работа содержит 8 таблиц, 29 рисунков. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 168 литературных источника, в том числе 158 зарубежных.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Сконструированный рекомбинантный вектор позволяет клонировать гены и экспрессировать их в клетках бактерий Francisella.

2. Белки ФТТ-0482, ФТТ-1693, ФТТ-0900 не модифицируются пренил-трансферазами клеток эмбриональной почки человека.

3. ФТН-0357 пренилируется при экспрессии в гетерологических условиях.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена на кафедре ветеринарной вирусологии им. В.Н. Сюрина ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И.Скрябина», ряд экспериментов был выполнен в университете Дж. Мэйсона (США) при поддержке программы Фулбрайта.

Бактериальные штаммы, клеточные культуры, нлазмиды и условия культивирования. Штаммы Е. coli (New England Biolabs, США), штаммы F. novicida получены от BEI, США [Gallagher L.A. et al, 2007]. E.coli культивировали на ТВ, L-агаре (Invitrogen, США). Для F. novicida использовали TSB-С (BD, США) или TSA-C (BD, США).

Культура клеток НЕК293Т (эпителиальные клетки эмбриональной почки человека, АТСС CRL-11268), J77A (клеточная линия макрофагов мыши, АТСС TIB-67) и А549 (клетки легочного эпителия человека, АТСС CCL-185). Поддержание клеточной культуры осуществляли по рекомендациям производителя (АТСС, США).

В работе использованы плазмидные векторы для изоляции генов производства DNASU Plasmid Repository (США), для клонирования производства Евроген (Россия) и Invitrogen (США).

ДНК-манипуляции и клонирование. Для выделения плазмидной ДНК использовали Qiaprep Miniprep или Maxiprep Spin Kit (Qiagen, США).

Реакции рестрикции, лигирования, преципитации ДНК были проведены по инструкциям стандартных протоколов [Sambrook J. & Russell D., 2001]. В работе использованы следующие эндонуклеазы рестрикции производства Fermentas (Литва), Т4-ДНК лигаза (New England Biolabs Inc, США).

Амплификацию ДНК фрагментов до 1000 пар нуклеотидов (пн) проводили с использованием Qiagen hot start master mix. ПЦР больших фрагментов проводили с помощью LongRange PCR Kit (Qiagen, США). Электрофорез ДНК проводили в 0.7% или 1.0% агарозном геле в 1х ТАЕ буфере.

Введение плазмидной ДНК в клетки. Компетентные клетки Е. coli (New England Biolabs, США) трансформировали, следуя протоколу производителя.

F. novicïda трансформировали методом электропорации [Baron G.S. et al, 1995]. Трансфекцию НЕК293Т плазмидной ДНК проводили с помощью реагента Lipofectamine 2000 (Invitrogen, США) с бессывороточной средой OPTI-МЕМ (Gibco, США).

Биоинформатические и статистические методы. Использованы следующие программы: BLAST, NEB cutter V2.0 [Gagniuc P. et al, 2011], Reverse Complement [Stothard P., 2000], Invitrogen Oligo Perfect Designer. Схемы-карты плазмидных векторов построены с помощью программы BVTech Plasmid. Для моделирования пространственной структуры белков использовали I-TASSER [Zhang Y., 2008], Modeller [Fiser A. & Sali A., 2003]. Сайты узнавания пренилтрансфераз в белках анализировали с помощью PrePS [Maurer-Stroh S. & Eisenhaber F., 2005]. Белки анализированы с помощью NCBI Conserved domains, PROSITE [Sigrist CJ. et al, 2002], Signal? 4.1 [Petersen T.N. et al, 2011].

Для статистической достоверности эксперименты повторяли не менее трех раз, графики стоились на основе данных, полученных в результате подсчета среднего арифметического. В расчетах учитывали стандартное отклонение и статическую значимость (Р<0.05). Статистическая обработка экспериментальных данных осуществлялась при помощи программного пакета Microsoft Office Exel 2007.

Работа с белками. Концентрацию общего белка определяли с помощью набора ВСА Protein Assay (Pierce, США). Для электрофореза в полиакрила-мидном геле (ПААГ) использовали NuPAGE 4-12% Бис-Трис ПААГ (Novex, США) и lxMES-SDS буфера (Invitrogen, США). Для вестерн блотгинга использовали: в качестве блокирующего раствора 5% молоко (сухое, обезжиренное) в IxTBS (Буферный раствор Трис, рН=7.4, Fisher Scientific, США), 0.05% Tween-20 (Sigma-Aldrich, США), а буфер для промывки - IxTBS, 0.05% Tween-20.

В данной работе использованы первичные антитела: специфичные к фар-незил группе ^-ацетил-8-фарнезил-Ь-цистеин, также реагируют с геранил

группой) антитела (Abeam, США); специфичные к RFP антитела (Евроген, Россия); специфичные к метке FLAG антитела (Sigma-Aldrich, США); моно-клональные антитела против 6-His (Sigma-Aldrich, США); моноклональные антитела на биотин (Abeam, США). Вторичные антитела: HRP-конъю-гированные антитела против IgG мыши (Thermo Scientific, США); HRP-конъюгированные антитела против IgG кролика (Thermo Scientific, США).

Гели окрашивали кумасси G-250 (Pierce, США) или серебром (Pierce, США). Белковые фракции очищены с помощью иммунопреципитации (Dynabeads Protein G, Invitrogen, США) или методом липофильного фракционирования с помощью тритона Х-144 [Thakran S. et al, 2008]. В работе был использован Клик-Ит метод метаболического введения меток в белки и набор для определения хитиназной активности производства Sigma-Aldrich (США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Разработка генетической системы для комплементаций делеционных мутаций генов в Francisella и ее тестирование

Наиболее часто используемая плазмида для комплементации делеционных мутаций Francisella — это вектор pFLNIO [Rasko et al, 2007], но так как вектор содержит ген устойчивости канамицину, то его невозможно использовать для комплементации мутаций, получаемых вставками канамицин-устойчивых транспозонов. pFNLTPl [Maier et al, 2004] также содержит ген устойчивости к канамицину. рКК214 [Norqvist et al, 1996] - это вектор, несущий маркер тетрациклиновой устойчивости, не содержит промотерный регион, что делает его непригодным для генно-инженерных манипуляций. Из базы плазмид выбрана плазмидная конструкция на основе вектора рКК214, которую мы просеквенировали. В результате анализа полученных данных установлено, что в этой плазмиде присутствует сильный промотер и вставка гена по PstI и EcoRI, что определило выбор этой плазмиды для конструирования вектора, пригодного для введения генов в канамицин-устойчивые штаммы из библиотеки мутантов F. novicida U112.

На следующем этапе мы разработали полилинкерный регион. Для этого на основе данных рестрикционного анализа по 12 сайтам рестрикции: Pstl, НЫШ, EcoRl, BamHl, Sacl, Kpnl, Sali, Bglll, Xhol, Seal, Pvull, Xbal был создан полилинкерный регион, состоящий из четырех сайтов узнавания рест-рикционных ферментов: Pstl, Xhol, Kpnl, EcoRl.

Комплементарные цепи полилинкера были синтезированы и клонированы по Pstl/EcoRl на место вырезанного гена в вектор рКК. Отбор колоний, несущих полилинкерный регион, проводили с помощью ПЦР с праймерами For3 5 '-ATGAGAATATTGTTGGCTGAAGATGATCTT-3' и Rev3 5'-TTACTTAATTACTTTATCCTTTTGTACAAAGT-3' и отбирали образцы плазмидной ДНК, не несущей вставки гена. Затем провели рестрикционный анализ по Kpnl, так как данный сайт присутствует в полилинкере, а в векторе нет. Колонии, не содержащие вставки гена, резались по Kpnl, секвенированы праймером For2 5' -CCTCGGTTC A A AG AGTTGGTAG-3'. Анализ нуклеотид-ных последовательностей установил, что плазмида сконструирована правильно (рис.1). Плазмиды дополнительно проверяли рестрикцией.

Рис.1. Карта-схема конструкций рКК-полилинкер и рКК-ФТН-6027

Для тестирования созданной конструкции необходимо клонировать такой ген, который можно было бы ввести в мутант из библиотеки Е. novicida и 112

EcoR

мутантов и легко детектировать комплементацию мутации. Для этой цели выбран ген ФТН-0627 - ген хитиназы А из F. novicida U112. Выбор определен также и тем, что для тестирования активности хитиназы можно использовать простой колориметрический тест.

Проведена амплификация гена ФТН-0627 с помощью Long Range PCR kit на матрице кДНК из F. novicida U112. Праймеры были сконструированы таким образом, что N-концевая последовательность включала Shine-Dalgarno последовательность до старт кодона и Pstl сайт узнавания (5'-CTGCAGAGGAGAAATACTTATGAACAAAACAAAAT-3'), а праймер на С конец гена включал в себя стоп ко дон и Kpnl сайт узнавания (5'-GGTACCTTATTGTTTTTCCCAAACATTACTA-3'). Полученный фрагмент 2634 пн был очищен из геля и использован для дальнейших манипуляций. Клонирование проводилось по Pstl/KpnI. Отбор колоний производился с помощью рестрикционного анализа, с использованием Pstl. Полученная плаз-мида рКК-ФТН-6027 проверялась рестрикционным анализом и секвенирова-нием (Рис.2). Далее конструкция была ведена в мутантный штамм F. novicida U112 А ФТН-0627 с помощью электропорации. Колонии, несущие рКК-ФТН-0627 были отобраны с помощью одновременной резистентности к канамици-ну и тетрациклину. Хитиназная активность измерялась с помощью колориметрического теста (Sigma-Aldrich, США).

Клонирование генов из генома F. tularensis SCHU S4

Результаты биоинформатических исследований, проведенных с помощью PrePS и I-TAS SER, показали, что белки бактерий Francisella вероятно могут быть модифицированы с помощью эукариотической системы принелирова-ния, при этом анализ показал четыре возможных кандидата: ФТТ-0482, ФТТ-1693, ФТТ-0900 и ФТТ-0502. Конструкции, несущие гены генома F. tularensis SCHU S4 были получены от компании DNASU Plasmid Repository (США), и использованы для ПЦР амплификации. Для клонирования и экспрессии белков бактерий Francisella выбран вектор pTagRFP-C (Евроген, Россия) так как

данный вектор несет красный флуоресцентный белок на N конце от поли-линкерного региона для клонирования, и так же для pTagRFP-C характерен сильный эукариотической промотер (PCMV-IE). Далее полученные ДНК фрагменты были клонированы в pTagRFP-C по Sali/ BamHI. Плазмидная ДНК была выделена из трансформантов и проанализирована с помощью ПЦР со специфическими к вставке праймерами. В результате были успешно кло-нированны гены ФТТ-0482, ФТТ-0900, ФТТ-1693 из генома F. tularensis SCHU S4 в вектор pTagRFP-C, правильность полученных конструкций проверили секвенированием.

Разработанные плазмидные конструкции введены в НЕК293Т линию клеток с помощью липофектаминовой трансфекции в комбинации с Opti-MEM средой. После 24-48 часов роста, клетки подвергали лизису и экстракции белков. Образцы использовали для анализа с помощью иммуноблотинга. Вестерн блоттинг, с использованием антифарнезил антител в качестве первичных и HRP-конъюгированные антитела против антител кролика, в качестве вторичных антител, показал, что ни один из изучаемых белков не прени-лируется. Анализ экспрессии показал, что введенные конструкции экспрес-сируются в НЕК293Т.

Для подтверждения полученного результата мы использовали метод метаболического введения метки в белок (Клик-Ит метод), позволяющей выявить белки, которые модифицируются или синтезируются с помощью исследуемых молекул. При этом использовали фарнезил, меченный азидом, как исследуемый компонент. НЕК293Т были трансфектированы с ранее полученными плазмидами, после чего в полноценную среду были добавлены азидо-фарезил алкоголь (20 микромоль) и ловастатин (25 микромоль). Культураль-ную среду меняли через 12 часов роста культуры клеток, а через 24 часа клетки подвергали лизису с помощью лизис буфера, состоящего из 50 мМ Трис-НС1, 1% SDS, рН=8.0 и коктейля ингибиторов протеаз. Белок был концентрирован с помощью метанол-хлороформ преципитации, осадок был растворен в лизис буфере и белок измерен с помощью метода BSA. 150 мкг бел-

ка было использовано для реакции с алкин-биотином. Данная реакция проходит с участием Cu(I) с образованием стабильного триазольного комплекса, вследствие чего все белки, включающие меченный фарнезил, становились меченными биотином. Полученные образцы анализировали методом вестерн блоттинга. Как первичные антитела были использованы специфичные к биотину антитела мышей, а как вторичные - антитела меченные пероксидазой хрена, специфичные к антителам мыши. Клик-Ит метод полностью подтвердил ранее полученные результаты.

Изучение иренилирования белков F. novicida U112 методом инфекций

культуры клеток

Проведен анализ делеционных мутантов F. novicida U112 установил, что кинетика роста мутанта по гену ФТН-0426 (аналог ФТТ-0900) немного замедлен по сравнению с F. novicida U112, что говорит об инактивации или отсутствии функциональности жизненно важных процессов в результате нокаута ФТН-0426. Исследования по изучению способности мутантных штаммов инфицировать клетки хозяина показали, что мутант по гену ФТН-0573 (аналог ФТТ-0482) важен для размножения внутри клеток А549. Инфицирование клеточной линии эпителиальных клетки эмбриональной почки человека и клеток легочного эпителия человека не выявили значимой разницы экспрессии или модификации пренилируемых белков, в сравнении с F. novicida U112. Эксперименты выявили значительную разницу между зараженными франчизеллой клетками и незараженным контролем во фракциях белка подверженных пренилированию.

Было проведено инфицирование с двумя разными временными точками (4 и 20 часов инфекции), чтоб уточнить разницу в пренилировании на ранних и поздних стадиях инфекции. В качестве контроля нанесения образцов использовали вестерн блоттинг на бета-актин. Для выявления Francisella в клетках (контроль инфекции) использован иммуноблоттинг с антителами против белка ФТН-0427 и метод подсчета колоний, высеваемых из клеточного лизата.

Для обогащения гидрофобных фракций белка использовали метод фракционирования с помощью Triton Х-114. Фракции белка в одинаковой концентрации были использованы для 4-12% Бис-Трис ПААГ электрофореза. Один гель был использован для вестерн блоттинга с антифарнезил антителами, а второй для окрашиванья серебром. В результате выбранных манипуляций получена фракция белка размером около 20 кДа и проведен его анализ помощью масс-спектроскопии. В результате анализа спектров было выявлено белок ФТТ-0357.

Клонирование и анализ гена ФТН-0357

Ген ФТН-0357 был амплифицирован с использованием праймеров 5'-ATGATGAAAAAAAGGATAATAAACTTAGC-3' и 5'-

CTATGAATTGCTCTCATCACATTTAG-3' на матрице кДНК F. novicida U112 и клонирован с помощью набора для TOPO клонирования (Invitrogen, США). Экспрессия конструкции подтвердила пренилирование ФТН-0357.

Моделированием пространственной структуры ФТН-0357 с помощью программы I-TASSER установлено, что С-конец белка открыт для взаимодействия с пренилтрансферазой, а анализ аминокислотных последовательностей доменной структуры с помощью NCBI Conserved domains выявил OmpA домен (E-value:3.44e-28) и OmpA С-подобный домен (E-value 7.61е-30).

Установлено, что ФТН-0357 состоит из 207 аминокислотных остатка, с 1 по 196 представляют собой OmpA регион, а 76 по 161 имеют высокую гомологию к OmpA С - подобному региону. С помощью программы PROSITE проведен анализ ФТН-0357 и обнаружен сайт бактериального липидирова-ния: цистеин (21) который может быть модифицирован с помощью N-пальмитоилирования или присоединением S-диацилглицерола.

Для исследования консервативности последовательностей гомологичных генов к ФТН-0357 провели анализ аминокислотной последовательности зрелого белка (26-207) с помощью BLAST. Исследования показали, что этот белок (26-207) высоко консервативен для рода Francisella, и последовательно-

сти этого белка внутри рода совпадают более чем на 98% и это же характерно для препептида.

Для биоинформатичного подтверждения возможности пренилирования белка ФТН-0357 использовали РгеРБ анализ, при этом ни один из РгеРЯ алгоритмов не выявил сайтов узнавания пренилтрансфераз, но на наш взгляд это не достоверный показатель отсутствия сайта пренилирования, поскольку уже есть данные, когда экспериментально подтвержденные белки не предсказывались выбранной программой анализа (например, белок 8!1А).

В результате проведенных исследований на наш взгляд можно предположить следующий сценарий молекулярных процессов в инфекционном процессе: белок ФТН-0357 состоящий из аминокислот 1-207 синтезируется в цитоплазме бактериальной клетки и благодаря сигнальному пептиду направляется в клеточную стенку, где сигнальный пептид отрезается с помощью сигнальной пептидазы II (ФТН-0440) во время транслокации через плазматическую мембрану.

Известно, что белок ФТН-0440 локализован в мембране клеточной стенки и состоит из трех трансмембранных доменов (два внешних, один внутренний), а в составе белка ФТН-0357 нет трансмебранных доменов, мы предполагаем, что он локализуется на внутренней стороне внешней мембраны клеточной стенки либо заякоривается в пептидогликан. Для некоторых грамот-рицательных бактерий уже установлено, что белки, сходные с ФТН-0357, могут быть секретированы из бактериальной клетки.

Нами было экспериментально показано пренилирование ФТН-0357, предполагаем, что именно цистеин на С-конце белка ФТН-0357 в составе последовательности СОЕБ^, может быть модифицирован пренилтрансферазой. Очевидно, что такая модификация может быть важна и необходима для функционирования белка ФТН-0357 при инфекционном процессе.

выводы

1. Сконструирована плазмида рКК-полилинкер, обеспечивающая ком-плементирование делеционных мутантных штаммов У*1. по\чс1с!а и 112, и депонирована в ГНУ ВНИИВВиМ.

2. С помощью программы РгеР8 предсказано пренилирование белков гм/агамй БСНи Б4 ФТТ-0482, ФТТ-1693, ФТТ-0900 в клетках человека. Получены плазмидные конструкции pTagRFP-0482, pTagRFP-1693, pTagRFP-0900, несущие гены предсказанных белков.

3. Экспрессия плазмидных конструкций pTagRFP-0482, pTagRFP-1693, рТа§КТР-0900 в клетках человека доказала отсутствие пренилирования белков ФТТ-0482, ФТТ-1693, ФТТ-0900.

4. Установлено, что белок ФТТ-0482 непосредственно участвует в инфекционном процессе, а белок ФТТ-0900 принимает участие в общих процессах жизнедеятельности бактерии К ийагет'м.

5. Пренилирование белка ФТН-0357 К по\'1с'и1а Ш12 доказано методами масс-спектроскопии и иммуноблоттинга.

Практическое использование научных результатов

Материалы, изложенные в диссертации, использованы в учебном процессе по дисциплинам «Молекулярная биология», «Основы генной инженерии», «Генетическая инженерия» ФГБОУ ВПО МГАВМиБ. На основе материалов диссертации подготовлены «Методические указания по клонированию генов в рКК-полилинкер».

Плазмидный вектор рКК-полилинкер депонирован в ГНУ ВНИИВВиМ; используется для создания новых конструкций для введения генов в клетки бактерий Ргапс1хеИа и комплементации делеционных мутаций в университете Дж. Мэйсона.

Рекомендации по использованию научных выводов

Для расшифровки механизмов инфекционного процесса, вызываемого Francisella, в частности, для изучения функции белка ФТН-0357, рекомендуем применять сконструированную нами плазмиду, несущую выделенный из генома F. novicida U112 ген ФТН-0357.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Методы предсказания сайтов посттрансляционной модификации при образовании липопротеинов / Е.С. Маракасова, Е.И. Ярыгина, А.В.Шибаева и др. // Здоровье населения и среда обитания. — 2013. - № 4. - С. 24-27.

2. Новый метод подготовки биологического материала к проведению протеомного и фосфопротеомного анализа / A.B. Шибаева, М.С. Смирнова, Е.С. Маракасова и др. // Фундаментальные исследования. - 2013. - № 1 - С. 51-55.

3. Prenylation of Francisella tularensis SCHU S4 proteins by host cell machinery / E. Marakasova, A. Baranova, M. vanHoek // Mid-atlantic Pathogenesis Meeting. - Jan. 2013. - b. 60.

4. Структурные и функциональные особенности IGAl-протеаз / Т.Н. Казеева, А.Б. Шевелев, O.A. Леонович, Т.Х. Фаизов, A.B. Белякова, A.A. Лебедева, Т.В. Кузнецова, Е.С. Маракасова и др. // Современные проблемы науки и образования. - 2012- № 1.- С. 1-8.

Отпечатано в типографии ООО «Мещёра», г. Щёлково, ул.Свирская, д.8а ИНН 5050006864. Формат 60x84/16. Тираж 100 экз. Заказ №066. 2013 г.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Маракасова, Екатерина Семеновна, Москва

Федеральное государственное бюджетное образовательное учереждение высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветерииарной медицины и биотехнологии имени К.И.Скрябина»

На правах рукописи

04201353007

МАРАКАСОВА Екатерина Семеновна

Конструирование плазмидных векторов для изучения пренилирования белков возбудителя туляремии

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный рукаводитель: Ярыгина Елена Игоревна доктор биологических наук, старшиий научный сотрудник

Москва 2013

Оглавление

Введение....................................................................................................................4

1. Обзор литературы.............................................................................................10

1.1. Туляремия..........................................................................................................10

1.2. Механизм инфекционного процесса, вызываемого ЕгапсгяеНа.....................14

1.3. Липидные посттрансляционные модификации и методы их изучения.........17

1.4. Пренилирование................................................................................................25

1.4.1. Механизм ирснилирования..............................................................................28

1.4.2. Предсказание пренилирования белков............................................................31

1.4.3. Пренилирусмые белки эукариот......................................................................34

1.4.4. Белки патогенных микроорганизмов, пренилирусмые в клетках эукариот.. 37

1.4.5. Небелковое пренилирование у бактерий........................................................40

1.5. Ингибиторы пренилирования...........................................................................43

1.6. Заключение..........................................................................................................45

2. Материалы и методы исследований................................................................47

2.1. Бактериальные штаммы, плазмиды и условия культивирования.....................47

2.2. ДНК манипуляции и клонирование...................................................................50

2.3. Трансформация бактерий....................................................................................54

2.4. Оценка дефективности роста бактерий..............................................................55

2.5. Биоинформатические методы и статистика.......................................................55

2.6. Культура клеток и условия культивирования....................................................55

2.7. Трансфекция эукариотических клеток...............................................................56

2.8. Подсчет количества клеток.................................................................................57

2.9. Инфекция эукариотических клеток, оценка способности бактерий инфицировать и размножаться внутри эукариотических клеток............................58

2.10. Лизис клеток......................................................................................................60

2.11. Определение концентрации белка....................................................................61

2.12. Электрофорез в ПААГ и иммуноблотинг........................................................61

2ЛЗ. Окраска ПААГ...................................................................................................63

2.14. Очистка и концентрирование белковых фракций...........................................64

2.15. Определение хигиназной активности..............................................................66

2.16. Клик-Ит метод...................................................................................................67

3. Результаты собственных исследований.............................................................69

3.1 Разработка генетической системы для комплементаций делеционных мутаций генов в РгапЫзеПа и ее тестирование.....................................................69

3.1.1. Разработка и создание вектора с полилинкером для молекулярного клонирования..............................................................................................................69

3.1.2. Клонирование ФТН-0627 ..............................................................................75

3.2. Клонирование генов из генома Т7. /и/агешй 8СН11 84................................79

3.2.1. Биоинформатические исследования.............................................................79

3.2.2. Клонирование генов ФТТ-0482, ФТТ-0502, ФТТ-1693, ФТТ-0900 в вектор для экспрессии в эукариотических клетках..............................................................81

3.2.3. Экспрессия и изучение пренилирования белков в клетках человека.........85

3.3. Изучение пренилирования белков Е. поу1Ыс1а Ш12 методом инфекций культуры клеток......................................................................................................88

3.4. Клонирование и анализ гена ФТН-0357.......................................................94

4. Обсуждение результатов исследований........................................................102

Выводы..................................................................................................................113

Список использованной литературы...................................................................114

Список использованных сокращений..................................................................131

Список иллюстративного материала...................................................................133

ПРИЛОЖЕНИЯ.....................................................................................................135

Введение

Туляремия - это инфекционное заболевание, характеризующиеся воспалительной модификацией ворот входа инфекции. Человек может заразиться при контакте с больным животным или его трупом, через зараженную воду, еду или укус насекомого (комары, клещи, слепни). Это заболевание относится к природно-очаговым зоонозам разных видов грызунов, зайцеобразных, насекомоядных, сумчатых, хищников, копытных, птиц, амфибий, рыб и беспозвоночных (более 80 видов животных) [1]. Также человек может заразиться при вдыхании аэрозолей, при таком способе инфицирования развивается легочная форма туляремии.

Эндемические очаги туляремии регулярно проявляются на территории Российской Федерации и соседних стран [5]. Возбудителем туляремии является грамотрицателытая неподвижная кокоподобная палочка }7гапсие11а пйагет«ч Бактерии Р. шЬгепьчя считаются очень контагиозными из-за очень малой инфекционной дозы, считается, что 10 бактериальных клеток [46] способны вызвать заболевание человека. Именно из-за такой низкой инфекционной дозы и легкости распространения с аэрозолями Ш1агепз15 причисляют к бактериям, которые потенциально можно использовать в качестве биологического оружия [92]. Отдел Здоровья и Безопасности США внес Г. 1и1агет18 в список особо опасных агентов класса А [69]. В Российской Федерации согласно санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 (прил.1) по классификации микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний человека Г. Ьйагет'ю отнесен ко II группе патогенности.

В последнее десятилетие накопилось огромное количество данных, полученных в результате секвенирования геномов, на данный момент полностью секвенировано более десятка геномов разных штаммов ЕгапЫзеИа, в том числе /л шШгегтз БСГШ Б4. Для изучения функций генов РгапЫзеИа созданы библиотеки мутантпых штаммов, непатогенных для человека [75]. Вместе с тем, генетические

манипуляции с Francisella осложнены тем, что репликативпые единицы, используемые для E.coli, неприменимы для франчизелл, также бактерии этого рода естественно устойчивые к бета-лактамным антибиотикам, а также низкой эффективностью трансформации. Однако, для генно-инженерной работы с Francisella были разработаны ряд векторов для мутагенеза с помощью транспозонов, гомологичной рекомбинации, «ловушек» промотеров и комплементации делеционных мутантов [168]. IIa сегодняшний день подавляющее большинство плазмидных векторов непригодны для комплементации делеций генов, штаммов из библиотеки мутантов, поскольку несут гены стойкости к канамицину. Актуальным представляется найти решение этой проблеме и создать эффективный вектор.

Патогенез Francisella характеризуется проникновением в клетку хозяина, выход из фагосомы, размножение, выход из клетки и опять заражение. Каждая из стадий пристально изучается учеными по всему миру, но механизм выхода франчизелл из фагосомы все еще остается невыясненным. Известно, что бактерия вступает с клеткой-хозяином в различные взаимодействия, в том числе она секретирует в среду или вводит непосредственно в клетку ряд эффекторных молекул. Бактериальные эффекторы, в свою очередь, могут вступать во взаимодействия с белками клетки-хозяина, а также служить субстратами для посттрансляционных модификаций ее ферментами. Так, бактериальные белки, содержащие мотив СааХ, могут подвергаться пренилированию с помощью эукариотпческой системы пренилирования, что приводит к изменению свойства этих белков. В частности, пренилирование было экспериментально показано для прокариотических белков SifA {Salmonella typhimurium) [129] и AnkB (Legionella pneumophila) [125]. Определена необходимость пренилирования этих белков для установления способности их инфицировать и размножаться внутри клетки хозяина.

Представляется актуальным выяснить, имеет ли место пренилирование белков F. tularensis в процессе инфицирования эукариотпческой клетки.

Цель исследований - сконструировать плазмидные векторы для изучения пренилирования белков возбудителя туляремии.

Задачи исследований:

1. Сконструировать плазмидный вектор для генетической комплементации мутантных штаммов Г. по\пЫс1а Ш12 и доказать эффективность полученной конструкции.

2. Изучить геном /л Ыагетчя с целью поиска возможных мишеней эукариотических пренилтрансфераз.

3. Установить возможные белки-мишени пренилирования при инфицировании клеточных линий человека Т7. поушсЬ Ш 12.

4. Клонировать и экспрессировать выбранные белки, изучить их преиилирование.

Научная новизна работы. Впервые разработан вектор для клонирования генов и экспрессии у Р. novicida, как туляремийный вектор, несущий полилинкерный регион - ген стойкости к тетрациклину, что в полной мере обеспечивает эффективность генпо-инженерных манипуляций с Г. по\чс1с!а, при этом созданный вектор совместим для работы с транспозонными мутантами К ийагетшя.

Проведен детальный анализ белков, кодируемых геномом /Г Ш1агет18 БСНи 84, и предсказаны мишени пренилирования с помощью биоинформатических методов. Впервые в России клонированы гены ФТТ-0482, ФТТ-1693, ФТТ-0900 из генома Е Ийагет'и БСШ 84. Впервые в мире экспериментально установлено, что белки ФТТ-0482, ФТТ-1693, ФТТ-0900 не модифицируются эукариотической системой пренилирования.

Впервые использован метод метаболического введения меченого азидом фарнезила одновременно с трансфекцией клеток. Впервые установлено, что белок ФТН-0357 препилируется, и впервые с помощью моделирования предсказана его пространственная структура.

Практическая значимость работы. Разработан туляремийный вектор для комплементации делеционных мутаций, как первый вектор, в котором

присутствует полшшнкерный регион для эффективного клонирования и экспрессии белков в F. по\пЫс1а, устойчивых к канамицину. Вектор охарактеризован с помощью рестрикционного анализа и секвенирования и депонирован в П1У ВЫИИВВиМ.

Проведен биоипформатический анализ и моделирование пространственной структуры белков ФТТ-0482, ФТТ-1693, ФТТ-0900 и ФТТ-0502. Получены данные о влиянии мутаций аналогичных генов в К по\пс1с1а на рост, способность проникать и размножаться внутри клеток макрофагов мыши, которые используются в научно-исследовательской работе, а также в учебном процессе в ФГБОУ ВГЮ МГАВМ.

Доказано, что ФТТ-0482, ФТТ-1693, ФТТ-0900 не пренилируются в клетках эмбриональной почки человека, несмотря на то, что программа РгеР8 предсказывала, что эги белки содержат возможные мишени для пренилтрансфераз человека. Поскольку функции генов ФТТ-0482, ФТТ-1693, ФТТ-0900 и ФТТ-0502 неизвестны, то полученные в этой работе данные помогают в дальнейшем исследовании функций этих белков.

Результаты проведенных исследований по инфицированию клеточных культур франчизеллой доказали, что пренилирование играет важную роль в инфекционном процессе на молекулярном уровне. Установлено, что белок ФТН-0357 пренилируется, что существенно дополняют картину инфекционного процесса, вызываемого Ггапс1$е11а.

Разработаны «Методические указания по клонированию генов в вектор рКК-полилинкер», утвержденные ректором ФГБОУ ВПО МГАВМиБ в установленном порядке 14 мая 2013 г.

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самосюятельно. Автор лично выполнила весь объем научно-исследовательских работ, проанализировала результаты, сформулировала выводы работы.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены в 2012 году на ежегодном собрании академии наук в штате Виргиния (США), первой конференции по взаимодействию между хозяином и патогенным

микроорганизмом в биозащите и новым болезням (штат Виргиния, США, 2012), среднеатлантической встрече ученых (по итогам конкурса работа признана лучшей, а её автор была награждена грантом для посещения встречи-конферснции) по микробному патогенезу (Виргиния, США, 2013).

Автор работы является стипендиатом программы Фулбрайт в 2011-2012 гг, победителем конкурса «Молодые новаторы аграрной России» в 2010 г, по итогам которого был получен грант на исследования, и победителем олимпиад по нанотехиологиям в 2010 и 2011 годах (МГУ имени М.В. Ломоносова).

Публикации результатов работы. По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работы, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 1 - в сборниках международных конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 134 страницах машинописного текста и содержит следующие главы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, список использованной литературы, список сокращений, список иллюстраций и приложения. Работа содержит 8 таблиц, 29 рисунков. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 168 литературных источника, в том числе 158 зарубежных.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Сконструированный рекомбинантный вектор позволяет клонировать гены и экспрессировать их в клетках бактерий ЕгапшеИа. .

2. Белки ФТТ-0482, ФТТ-1693, ФТТ-0900 не модифицируются пренилтрансферазами клеток эмбриональной почки человека.

3. ФТН-0357 пренилируется при экспрессии в гетерологических условиях.

Рекомендации по практическому использованию научных результатов:

Материалы, изложенные в диссертации, использованы в учебном процессе по дисциплинам «Молекулярная биология», «Основы генной инженерии», «Генетическая инженерия» ФГБОУ ВПО МГАВМиБ. На основе материалов

диссертации подготовлены «Методические указания по клонированию генов в рКК-полилинкер».

Плазмидный вектор рКК-полилинкер депонирован в ГНУ ВНИИВВиМ; используется для создания новых конструкций для введения генов в клетки бактерий Ргапс18е11а и комплементации делеционных мутаций в университете Дж. Мэйсона.

Для расшифровки механизмов инфекционного процесса, вызываемого РгапЫзеИа, в частности, для изучения функции белка ФТН-0357, рекомендуем применять сконструированную нами плазмиду, несущую выделенный из генома К по\пск1а Ш 12 ген ФТН-0357.

1. Обзор литературы 1.1. Туляремия

Туляремия, известная также под такими синонимами как кроличья лихорадка, лихорадка оленьей мухи, представляет собой острое инфекционное заболевание, вызываемое Ггапа'яеПа Пйагети. Для данного заболевания характерны следующие признаки: общая интоксикация, лихорадка, поражение лимфатических узлов. Формы заболевания прямо зависят от ворот входа инфекции: формирование так называемых бубонов наблюдается при заражении через кожу, попадании микроба на слизистую или употреблении зараженной воды; легочная форма развивается при аэрогенном заражении [1]. Туляремию относят к зоонозам с природной очаговостью. Резервуарами туляремийных микробов в природе являются грызуны, зайцеобразные, насекомоядные, сумчатые, хищники, копытные, птицы, амфибии, рыбы и беспозвоночные (более 80 видов животных) [9, 62]. Предполагают, что при инфицировании рыб важную роль могут играть простейшие, поскольку экспериментально была показана инфекция франчизеллой клеток АсаШНатоеЪа са${е11апИ и возможность формирования цист, содержащих франчизеллу [10].

Течение болезни определяется способом заражения, восприимчивостью иммунитета и концентрацией возбудителя. В среднем инкубационный период длится от трех до семи дней. После чего температура тела повышается (38-39 °С), начинаются головные боли, слабость, разбитость, сильная интоксикация. При попадании возбудителя через кожу происходит увеличение лимфатических узлов до 3-5 сантиметров, а также формирование местных язв - так званых бубонов. Бубон со временем может либо размягчаться, либо уплотняться, либо вскрываться с выделением гноя. Легочная форма может быть с поражением бронхов и/или легких. Болезнь протекает тяжело и долго, она опасна абсцессами легких, бронхоэктазиями, гангренами и гнойными плевритами.

Человек может заразиться при контакте с больным животным или его трупом, через зараженную воду, еду или укус насекомого (комары, клещи, слепни) [6, 117]. Хотя и существует вероятность заразиться туляремией аэрогенным способом, но на сегодняшний день случаев передачи инфекции от человека к человеку не зарегистрировано [122]. Возбудитель сохраняет инфекционную активность в водной среде до трех месяцев, в сухих растениях -до шести месяцев, в организме мертвых животных - до трех месяцев, в шкурках и моллюсках - до сорока суток. Фрапчизелла чувствительна к дезинфицирующим средствам и температуре: �