Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конструирование новых энтомопатогенных штаммов Bacillus thuringiensis методами селекции с применением ионов высоких энергий

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Канаева, Елена Николаевна

ВВЕДЕНИЕ

1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Современный рынок средств защиты растений

1.2. Биологические средства защиты растений на основе Bacillus thuringiensis

1.3. Факторы патогенности Bacillus thuringiensis

1.4. Механизм действия белковых токсинов

1.5. Определение биологической активности препаратов на основе Bacillus thuringiensis

1.6 Преимущества билогических средств защиты растений

1.7.Методы повышения биологической активности

1.8.Влияние радиоактивного облучения на микроорганизмы

1.9. Влияние условий космического орбитального полета на микроорганизмы

1.10. Механизм воздействия радиоактивного излучения на биологические объекты

1.11 Радиационная обстановка в условиях орбитального космического полета с точки зрения влияния на биообъекты

Введение Диссертация по биологии, на тему "Конструирование новых энтомопатогенных штаммов Bacillus thuringiensis методами селекции с применением ионов высоких энергий"

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ:

Техногенная деятельность человека связана с использованием большого количества разнообразных экологически опасных для окружающей среды веществ, в том числе пестицидов, гербицидов, различных химических отравляющих веществ и др. Производство и хранение таких веществ сопряжено с риском их попадания в окружающую среду и может привести к экологической катастрофе. Поэтому проблема разработки эффективных методов очистки окружающей среды от подобного рода загрязнений и замены химических препаратов, используемых в народном хозяйстве, на экологические безопасные биологические средства является актуальной.

В настоящее время значительную долю среди методов борьбы с вредными насекомыми составляют способы с использованием химических препаратов. Однако, их систематическое применение приводит к подавлению полезной фауны и загрязнению окружающей среды. Накапливаясь в продуктах питания и корме, эти соединения могут вызывать отравления человека и животных [16,47]. Кроме того, с увеличением масштабов применения и расширения спектра ядохимикатов происходит рост числа устойчивых к ним насекомых.

На территориях, где регулярно ведется химическая борьба, нарушаются естественные биоценозные связи, нарушаются межвидовые отношения. Уничтожаются биологические агенты, контролирующие численность вредных насекомых, и возникает необходимость регулярного применения инсектицидов. Необходимость же регулярной химической борьбы делает агротехнику более трудоемкой и значительно повышает затраты, требуемые для получения урожая. Кроме того, следует учесть, что в популяции вредителей, против которых регулярно проводится химическая борьба, выживают более или менее устойчивые к пестицидам линии, а некоторые виды, исходно более стойкие к тому или иному пестициду, оказываются в очень благоприятных условиях для своего выживания и размножения, о становясь массовыми в тех местностях, где они прежде не имели отрицательного значения [17]. Все это вынудило пересмотреть практику использования химических инсектицидов и по-новому оценить химический метод контроля. Сейчас наиболее перспективным считается экологический подход, предусматривающий рациональное сочетание современных защитных приемов и биометодов, в частности использование микробиологических средств защиты растений. В отличие от химических микробиологические инсектициды обладают высокой специфичностью - они поражают только вид или группу видов насекомых; не вызывают устойчивого иммунитета; безвредны для человека, теплокровных животных и полезных насекомых, а также производство микробиологических инсектицидов выгодно отличается от химического отсутствием вторичных отходов, экологической безопасностью и т.д. [139]

Среди микробиологических инсектицидов доминирующее положение занимают бактериальные препараты на основе кристаллообразующих бактерий Bacillus thur-ingiensis. Ежегодно в мире применяются несколько десятков тысяч тонн биологических препаратов на основе Bacillus thuringiensis [14,106]. Мировое производство энтомопатогенных биопрепаратов к 2000 году должно составить более половины всех средств защиты растений.

В нашей стране разработана и производится широкая гамма препаратов на основе различных подвидов Bacillus thuringiensis: лепидоцид, дендробациллин, битоксибациллин, гомелин и др. Однако, потребности сельского и лесного хозяйства нашей страны в бактериальных средствах защиты растений еще далеко не удовлетворены. И в настоящее время объективной необходимостью является увеличение их выпуска и снижение себестоимости за счет внедрения более совершенной технологии. Потери сельскохозяйственного производства в нашей стране за счет уничтожения насекомыми-вредителями составляют примерно 30% потенциального урожая сельскохозяйственных культур [44]. Для уменьшения таких потерь требуется постоянное наращивание объемов производства и применения средств борьбы с вредителями, болезнями культурных сельскохозяйственных растений и сорняками.

Обычно, основной задачей многих исследователей, работающих над интенсификацией производства бактериальных инсектицидов являлась разработка сред и условий культивирования продуцента, способствующих увеличению концентрации жизнеспособных клеток [18,19,31,41]. Это, безусловно, очень важно и в этом отношении достигнут определенный успех. Но, как показали исследования последних лет для достоверного суждения о влиянии указанных факторов на качество также необходимо учитывать биологическую активность бактериальных препаратов. Основным действующим началом бактериальных препаратов на основе Bacillus thur-ingiensis являются белковые кристаллы, специфичность и сила действия которых может меняться при изменении условий культивирования, не всегда коррелируя при этом с изменениями продуктивности культуры по спорам [15,31]. К перспективным направлениям интенсификации технологии бактериальных инсектицидов относится как совершенствование процесса культивирования, так и получение новых штаммов с расширенным спектром действия.

Это требует решения таких вопросов, как выбор оптимальных условий культивирования, изучение физиологии микроорганизмов и создание сбалансированных по составу сред в соответствии с потребностями микроорганизмов [18,41], а с другой стороны создание новых высокоактивных штаммов микроорганизмов.

Для получения новых штаммов широко используются различные мутагенные факторы. Целенаправленный выбор мутагена для проведения эффективного мутагенеза и получение высокопродуктивных мутантов зависит от многих факторов, среди которых не последнюю роль играет доступность мутагена и возможность его использования в лабораторных условиях.

Сравнительно новым и пока не очень широко используемым способом является применение в качестве мутагенов ускоренных тяжелых заряженные частицы (протонов, альфа частиц и более тяжелых ионов).

Одним из путей решения данной проблемы может стать интенсивное развитие космической биотехнологии, возможности которые не ограничены. Условия орбитального полета уникальны по комплексу его составляющих условий [3,102] и позволяют без специальных энергетических затрат получить воздействие тех или иных факторов, которые в условия Земли невозможны или очень дорогостоящи. Поэтому актуально и своевременно использовать ионы высоких энергий для получения активных энтомопатогенных культур бактерий для сельского хозяйства.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ:

Целью настоящей работы являлось изучение влияния воздействия тяжелых заряженных частиц на культуру Bacillus thuringiensis sp. kurstaki var. Z-52 с позиции получения новых продуктивных и высокоактивных штаммов энтомопатогенных бактерий.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

- изучение воздействия тяжелых заряженных частиц радиоактивных источников (Калифорний-252, Америций-241) на культуру Bacillus thuringiensis sp. kurstaki var. Z-52, выявление моноизолятов, обладающими улучшенными свойствами;

- изучение воздействия тяжелых заряженных частиц, полученных на циклотроне НИИЯФ МГУ на культуру Bacillus thuringiensis sp. kurstaki var. Z-52, выявление моноизолятов, обладающими улучшенными свойствами;

- изучение воздействия факторов космического полета (ФКП) на орбитальной станции «Мир» на культуру Bacillus thuringiensis sp. kurstaki var. Z-52, выявление моноизолятов, обладающими улучшенными свойствами

- разработка технологических режимов культивирования наиболее активных моноизолятов в лабораторных и опытно-промышленных условиях.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА:

Впервые изучено влияние радиоактивных источников (Калифорний-252 и Америций -241) и потока альфа частиц, полученных на циклотроне, на культуру ВаУ cillus thuringiensis sp. kurstaki var. Z-52. Установлено, что все используемые в работе источники радиоактивного излучения являются мутагенным фактором при воздействии на культуру Bacillus thuringiensis sp. kurstaki var. Z-52. При этом отмечено, что независимо от источника радиоактивного излучения образуются новые штаммы, как со значительно улучшенными, так и негативными свойствами.

Показано, что условия орбитального космического полета обладают комплексом факторов, оказывающих мутагенное воздействие на культуру, которые необходимо учитывать при планировании биологических опытов в условиях космического полета. Доказано, что даже при непродолжительных сроках эксперимента (10 суток) в условиях орбитального космического полета биообъекты подвергаются воздействию радиоактивных потоков. Получены новые штаммы культуры Bacillus thuringiensis sp. kurstaki обладающие большей продуктивностью и энтомопатогенной активностью по сравнению с культурой Bacillus thuringiensis sp. kurstaki var. Z-52. Селекционированы два новых мутантных штамма JT-25 и МИБ-90, обладающие повышенной биологической активностью и продуктивностью. Они депонированы в коллекции ВКПМ ВНИИ Генетики.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Показана реальная возможность использования радиоактивного мутагенеза для получения новых высокопродуктивных штаммов культуры Bacillus thuringiensis sp. kurstaki, как в лабораторных условиях (при использовании радиоактивных источников и ускорителя частиц циклотрона), так и в условиях космического полета. Доказано, что используемый в настоящее время штамм культуры Z-52 обладает потенциальными возможностями для получения на его основе более высокопродуктивных и активных штаммов энтомопатогенных бактерий.

Разработана методика проведения биологических экспериментов на борту орбитальной станции, позволяющая на новом качественном уровне анализировать и воздействия радиоактивного излучения на биологические объекты, а также получать новые штаммы- су пер продуценты биологически-активных веществ.

Испытаны и разработаны условия культивирования для новых штаммов культуры Bacillus thuringiensis sp. kurstaki Jl-25 и МИБ-90 (коллекционные номера ВКПМ В-7740 и В-7789), которые рекомендуются для использования в производственных условиях при получении препаратов-средств защиты растений. Разработана нормативная технологическая документация на получение опытной партии препаратов-средств защиты растений. Получена партия препарата на опытно-промышленной установке (на базе АООТ «Биохиммаш»). Проведена успешная апробация препарата, получен акт испытания, показавший высокую биологическую активность препарата.