Компьютерное моделирование активных центров моноаминоксидаз и создание ингибиторов с заданной селективностью

Веселовский, Александр Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Компьютерное моделирование активных центров моноаминоксидаз и создание ингибиторов с заданной селективностью
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Компьютерное моделирование активных центров моноаминоксидаз и создание ингибиторов с заданной селективностью"

На правах рукописи

Веселовский Александр Владимирович

Компьютерное моделирование активных центров моноаминоксидаз и создание ингибиторов с заданной селективностью

03.00.04 «биохимия»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2004

Работа выполнена в ГУ НИИ биомедицинской химии им. В.Н.Ореховича РАМН

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Медведев Алексей Евгеньевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Прозоровский Владимир Николаевич доктор физико-математических наук,

член-корреспондент РАН Гурский Георгий Валерианович

доктор медицинских наук Вальдман Елена Артуровна

Ведущая организация:

Российский государственный медицинский университет

Защита диссертации состоится "/3 " 2004 г. в часов

на заседании диссертационного совета Д 001.010.01 при ГУ НИИ биомедицинской химии им. В.Н.Ореховича РАМН по адресу: 119121 Москва, ул.ГГогодинская, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ биомедицинской химии им.В.Н.Ореховича РАМН.

Автореферат разослан'

2004 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета

В.С. Былинкина

гм? - ^

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность проблемы

Решение фундаментальных проблем биомедицинской химии, связанных как с теоретической, так и клинической медициной, требует изучения структуры и функций ключевых ферментов клеточного метаболизма. Одно из основных направлений в этих исследованиях связано с использованием компьютерных технологий для анализа данных, планирования экспериментов и обработки их результатов. Заметное место в этих подходах занимает компьютерное моделирование структуры биологических макромолекул, их взаимодействия друг с другом, поиск новых биологически активных соединений. Данная область исследований получила название «компьютерное конструирование лекарств» [Matrone et al, 1997; Zeng, 2000]. Использование компьютерных технологий визуализации пространственных структур макромолекул, моделирование взаимодействия макромолекул с низкомолекулярными лигандами, оценка энергии взаимодействия, моделирование новых соединений и предсказание их свойств позволяют значительно ускорить создание новых лекарственных препаратов [Marrone et al, 1997; Zeng, 2000].

Одним из ключевых ферментов, участвующий в катаболизме медиаторных аминов в центральной нервной системе и периферических тканях, является моноаминоксидаза (МАО; К.Ф. 1.4.3.4). Несмотря на то, что этот фермент был открыт более 75 лет назад, он по-прежнему остается важным объектом фундаментальных и клинических исследований [Горкин, Медведев, 1995; Типтон, 1997; Tipton, 2000; Abell, Kwan, 2001; Yamada, Yasuhara, 2004].

Моноаминоксидаза является флавин-содержащим ферментом, локализованным во внешней мембране митохондрий. В организме млекопитающих МАО присутствует в двух формах - МАО А и МАО Б, которые кодируются разными, хотя и высоко гомологичными генами [Shih et al., 1999; Abell, Kwan, 2001]. Эти формы различаются по чувствительности к ингибиторам и по преимущественному окислению субстратов [Горкин, Медведев, 1995; Wouters, 1998]. В организме МАО А и МАО Б, по-видимому, выполняют разные функции, на что указывает различное распределение ферментов в тканях, а также преимущественное окисление определенных субстратов [Abell, Kwan, 2001].

депренил) применяются для лечения болезни Паркинсона [Cesura, Pletscher, 1992; Blanco et al., 2002; Chiap et al., 2002]. Возможно применение ингибиторов МАО в лечении алкогольной и никотиновой зависимостей [Domino, 1996; Farren et al., 1998]. К сожалению, ряд современных ингибиторов МАО обладает выраженными побочными эффектами, тогда как другие проявляют недостаточно высокую активность. Поэтому разработка новых ингибиторов этих ферментов остается актуальной задачей [Tipton, 1989,1997,2000].

Долгое время разработку новых эффективных ингибиторов МАО сдерживало отсутствие информации о пространственных структурах этих ферментов. Поэтому исследователи пытались выявить структурные особенности этих белков различными экспериментальными методами: были определены аминокислотные последовательности различных моноаминоксидаз, процентное содержание вторичных структур в белковой глобуле, место ковалентного связывания кофактора флавинаденилди-нуклеотида (ФАД) с белком [Wouters, 1998; Abell, Kwan, 2001]. В результате анализа последовательностей, конструирования химерных молекул и точечного мутагенеза были предсказаны участки белка, ответственные за нековалентное связывание флавинового кофактора [Zhou et al., 1995; Tsugeno et al., 1995; Chen et al., 1996; Grimsby et al., 1996]. Было установлено несколько ключевых аминокислот, ответственных за связывание субстрата и участие в катализе [Tsugeno, Ito, 1997; Geha et al., 2001; Cesura et al., 1998]. Однако имеющиеся экспериментальные данные не позволяли оценить структуру и свойства активных центров МАО А и МАО Б. Даже появившиеся в 2002 и 2004 годах пространственные структуры МАО Б [Binda et al., 2002] и МАО A [Ma et al., 2004] оставляют нерешенными многие вопросы об особенностях их взаимодействия с различными ингибиторами.

Отсутствие данных о пространственных структурах этих ферментов стимулировало активное применение методов компьютерного моделирования для анализа особенностей их строения. Наличие большого числа обратимых и механизм-активируемых ингибиторов этих ферментов позволило использовать непрямые методы моделирования для анализа структур МАО.

Таким образом, к началу данного исследования, существовавшие результаты о строении МАО А и МАО Б, не позволяли охарактеризовать пространственные структуры их активных центров, что препятствовало поиску новых эффективных ингибиторов МАО.

Поэтому целью данной работы был компьютерный анализ структур активных центров моноаминоксидаз и разработка подходов для создания ингибиторов этих ферментов с заданной селективностью.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Проанализировать репрезентативные ряды низкомолекулярных

лигандов МАО А и Б и опредегапъ общие черты и особенности структур лигандов для каждого типа ферментов.

2. Провести анализ структуры активных центров МАО А и Б методом 3D-QSAR с использованием ингибиторов, отличающихся механизмом действия и относящихся к разным химическим классам.

3. Разработать методику моделирования полости активного центра фермента с неизвестной трехмерной структурой и проверить корректность подхода на примере ферментов с известной пространственной структурой.

4. Построить модели активных центров МАО А и Б.

5. Провести поиск новых базовых структур ингибиторов МАО А и Б с заданной селективностью.

1.2. Научная новизна и практическая значимость Впервые методами 3D-QSAR с CoMFA проанализировано несколько репрезентативных рядов ингибиторов МАО А и МАО Б (производных пиразинокарбазола, индола и изатина и карбобензоксиэтилами, анилида ß-аланина и карбобензоксиэтилдиамина) и построены модели активных центров этих ферментов. Предложена методика моделирования полости активных центров ферментов с неизвестной пространственной структурой для поиска новых ингибиторов в базах данных низкомолекулярных соединений. Показано, что докирование соединений в модель активного центра фермента с неизвестной пространственной структурой, с последующей оценкой их активности по 3D-QSAR с CoMFA моделям, является эффективным методом для поиска новых ингибиторов. Показана возможность создания нового поколения ингибиторов МАО, способных с одинаковой эффективностью тормозить оба типа этих ферментов в фармакологически значимом диапазоне концентраций. Найден ряд новых базовых структур селективных и неселективных ингибиторов МАО А и МАО Б, которые могут быть использованы для разработки новых антидепрессантов.

1.3. Апробация работы

Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на симпозиумах и конференциях:

- IV Российском Национальном Конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1997);

- The 2nd Electronic Molecular Graphics and Modelling Conference (MGM EC-2) on the Internet and World Wide Web (http://www.vei.co.uk/mgmec2/), (1997);

- 12 International Symposium on Microsomes and Drug Oxidations (Montpellier, France, 1998);

- 8th International Amine Oxidase Workshop (Hungary, 1998);

- V Российском Национальном Конгрессе "Человек и лекарство"

(Москва, 1998);

- The Electronic Conference "Molecular Simulation '99" on the Internet and World Wide Web (http://molsim.vei.co.uk) (1999);

- VI Российском Национальном Конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1999);

- 9th International Amine Oxidase Workshop. Amine oxidases: enzymes with novel functions? (Barcelona, 2000);

- 7th International Summer School on Biophysics "Supramolecular structure and function" (Rovinj, 2000);

- 4th INTAS Interdisciplinary Symposium on Physical and Chemical methods in Biology, Medicine, and Environment (Moscow, 2001);

- IX Российском Национальном Конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2002);

- I Национальной конференции «Информационно-вычислительные технологии в решении фундаментальных научных проблем и прикладных задач химии, биологии, фармацевтики, медицины», (Москва, 2002);

- International conference "Genomics, proteomics and bioinformatics for Medicine". (St.Petersburg-Moscow, 2002);

- II Национальной конференции «Информационно-вычислительные технологии в решении фундаментальных научных проблем и прикладных задач химии, биологии, фармацевтики, медицины» (Москва, 2003);

- 5th International Conference on Molecular Structural Biology (Vienna, 2003);

- 2th International conference "Genomics, Proteomics and Bioinformatics for Medicine". (Moscow-Pies-Moscow, 2004).

а также на конкурсах научных работ ГУ НИИ БМХ РАМН (1999,

2001).

1.4. Публикации

Материалы диссертационной работы отражены в 41 публикациях: в 19 статьях и 22 тезисах докладов.

1.5. Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 266 страницах машинописного текста, включая 30 таблиц, 67 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, трех глав результатов, обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 316 источника, в том числе 18 отечественных и 298 иностранных работ.

1.6. Основные положения, выносимые на защиту

1. Предложен подход для компьютерного анализа структур активных центров ферментов с неизвестной пространственной структурой и поиска новых базовых структур ингибиторов, включающий: а) анализ структур конкурентных обратимых ингибиторов с ограниченной

конформационной подвижностью; б) преимущественную оценку стерического фактора, определяющего возможность размещения лиганда в активном центре; в) построение компьютерных моделей полости активного центра фермента, отражающих его форму и размеры;

г) проверку достоверности моделей с использованием близких аналогов с разными размерами и отличающихся ингибиторной активностью;

д) поиск лигандов в молекулярных базах данных с использованием таких моделей; е) экспериментальную проверку новых ингибиторов. Эффективность использования данного подхода была показана в прямых экспериментах на фармакологически важном объекте -моноаминоксидазах типа А и Б.

2. Построены модели активных центров МАО А и МАО Б (фармакофорные модели, 3D-QSAR с CoMFA модели и модели слепков активных центров ферментов), позволяющие охарактеризовать структурные особенности строения активных центров этих ферментов.

3. Обоснован и экспериментально проверен на примере моноаминоксидаз типа А и Б подход по компьютерному поиску новых базовых структур лигандов в базах данных низкомолекулярных соединений для ферментов с неизвестной пространственной структурой. С использованием предложенного подхода обнаружены новые селективные и неселективные ингибиторы МАО, которые могут быть использованы в качестве оригинальных базовых структур для разработки новых эффективных ингибиторов МАО.

4. Доказана принципиальная возможность создания нового поколения обратимых ингибиторов МАО, неселективно ингибирующих оба типа ферментов в фармакологически значимом диапазоне концентраций.

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ

Вычисления были выполнены на графических рабочих станциях Indigo2, 02 и на серверах 0rigin200 (Silicon Graphics Inc.) под управлением операционных систем IRIX 6.x, и на персональных компьютерах под управлением операционных систем Windows9x и Windows2000. Моделирование в основном проводили с использованием молекулярно-графического пакета Sybyl (Sybyl 6.3-6.9) фирмы Tripos, Inc.

В работе использовали пространственные структуры МАО Б в комплексе с ингибиторами (pdblgos, pdbloja, pdblojb, pdblojc, pdblojd, pdbloj9, pdbls2q, pdbls2y, pdbls3e, pdbls3b), МАО А в комплексе с хлоргилином (lo5w), 18 комплексов протеазы вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) с ингибиторами, и модели МАО A (pdblh8q) и МАО Б (pdblh8r), депонированные в базе данных белков Protein Data Bank (PDB) [Berman, 2000].

Геометрические размеры молекул определяли путем построения прямоугольной ячейки вокруг молекул. Размеры минимальной ячейки, в которой может поместиться молекула, рассматривали как ее

геометрические размеры.

Частичные атомарные заряды рассчитывали по методу Gasteiger-Huckel и полуэмпирическим квантово-механическим методом AMI.

Преобразование планарных структур молекул в трехмерные модели проводили с помощью программы CONCORD пакета Sybyl с последующим расчетом парциальных зарядов атомов и оптимизацией структуры методом минимизации энергии.

Поиск конформаций молекул выполняли с помощью программы RANDOM SEARCH пакета Sybyl.

Модели фармакофоров строили с использованием программы DISCO пакета Sybyl, со следующими параметрами: количество возможных фармакофорных точек - от 2 до 6; шаг допустимого отклонения между фармакофорными точками - от 0,5 до 5 А с интервалом 0,5 Ä.

Величину гидрофобности молекул рассчитывали по методу Моригучи [Moriguchi et al., 1994].

Анализ взаимосвязи структура-активность проводили на трех рядах ингибиторов МАО А и Б из различных химических классов: 37 производных пиразинокарбазола, 24 аналога индола и изатина и 32 производных карбобензоксиэтиламина (КЭА), анилида ß-аланина (АА) и карбобензоксиэтилдиамина (КЭДА). Базовые структуры соединений представлены на рисунке 1.

Модель 1 Производные пиразинокарбазола

Модель 2 Аналоги индола и изатина R3 R1

Модель 3 Аналоги КЭА, АА и КЭДА "XIJU R3 КЗ 0

Рис. 1. Базовые структуры производных пиразидола, индола и изатина, аналогов карбобензоксиэтиламина (КЭА), анилида ß-аланина (АА) и карбобензоксиэтилдиамина (КЭДА).

ЗИ (¿ЗАЛ анализ проводили с использованием модуля СоМРА (сравнительный анализ молекулярных полей) пакета БуЬу!. В качестве

зависимой переменной использовался отрицательный десятичный логарифм величины 1С50. Регрессионный анализ методом наименьших квадратов проводили в два этапа. На первом этапе при анализе со скользящим контролем выбирали оптимальное количество компонентов, при котором 112су был бы больше 0,4, а была минимальной. На втором этапе проводили анализ без скользящего контроля с выбранным количеством компонентов. На основе этого анализа строили карты распределения полей.

Поиск новых потенциальных ингибиторов МАО проводили в базе данных коммерчески доступных низкомолекулярных соединений АБШЕХ (http://www.asinex.com).

Допирование молекул выполняли при помощи программы ВоскБеагсЬ [Скворцов, 1998].

Активность МАО определяли радиометрическим методом по накоплению [14С]альдегидов, образующихся в ходе ферментативного окисления [14С]аминов [Позднев и др., 2000; Мес1уес1еу е1 а1., 1994]. В качестве субстратов для МАО А и Б использовали соответственно 0,1 мМ [14С]5-гидрокситриптамин (серотонин) и 5 мкМ [14С]-фенилэтиламин ("АтегеЬат", Англия). Анализ активностей МАО А и МАО Б проводили в суспензии митохондрий печени крысы, которые выделяли традиционным методом дифференциального центрифугирования [Мес1уес1еу е1 а1., 1994].

Ингибиторную активность соединений определяли после 30-минутной преинкубации ингибиторов с митохондриями при 37°, используя диапазон концентраций 10"9 - 10"3 М. Для сопоставления ингибиторной активности исследованных соединений рассчитывали значения 1С50 (концентрация, вызывающая 50% торможение активности фермента).

Об обратимости торможения ферментов судили, определяя активность МАО после отмывки митохондрий от ингибиторов [Северина и др., 2003].

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Анализ ингибиторов МАО

Анализ репрезентативного набора структур эффективных обратимых ингибиторов МАО А и МАО Б из разных химических классов позволил построить фармакофорные модели для этих ферментов. Данные модели

отражают основные общие структурные элементы ингибиторов, которые определяют «узнавание» лигандов активными центрами ферментов. Таких элементов оказалось всего по два для каждого типа МАО. Малое

количество фармакофорных точек согласуется с широкой субстратной и

ингибиторной специфичностью данного фермента (Горкин, 1983; Рамсей,

1987). Фармакофорная модель ингибиторов МАО А включает ароматическое кольцо и расположенный рядом гетероатом (азота или кислорода), парциальный заряд которого отрицателен. Фармакофорная

модель МАО Б отличается только тем, что гетероатом отделен от ароматического кольца одним или двумя углеродными атомами. Такое незначительное различие обеспечивает относительную селективность большинства ингибиторов этих ферментов, когда с увеличением концентрации ингибитор начинает действовать на обе формы фермента. Это обстоятельство необходимо учитывать при детальном анализе взаимосвязи между структурой ингибиторов и их активностью в отношении МАО А и МАО Б.

Для анализа структуры активных центров МАО А и МАО Б мы использовали метод ЗБ-С)8А11 с СоМРА. Поскольку наборы соединений из одного химического класса не могут полностью охарактеризовать пространство в активном центре при использовании методов ЗО-С^АЯ с СоМРА, то для получения более полных данных желательно использовать несколько наборов соединений из различных химических классов. Кроме того, это позволяет получить дополнительный критерий оценки правильности построенных моделей (распределения полей, полученных в разных ЗО-С^БАЛ исследованиях не должны противоречить друг другу при условии единообразного связывания в активном центре).

Двумя основными проблемами при построении ЗО-ОБАК моделей являются неопределенность в правилах пространственного выравнивания и в определении биологически активных конформаций молекул, участвующих в построении модели. Для решения этих проблем мы строили несколько моделей для каждого набора ингибиторов, отличающихся конформациями и правилами выравнивания. Критериями выбора конечной модели, помимо ее статистических показателей, были достоверность предсказания величин ингибиторной активности для тестовых соединений и правдоподобность распределения полей ОБАБ. моделей.

Для анализа структур активных центров МАО А и Б методом ЗВ-С>8А11 с СоМРА использовали следующие группы ингибиторов этих ферментов (рис. 1):

1) производные индола и изатина (модель 1),

2) производные пиразинокарбазола (модель 2),

3) производные карбобензоксиэтиламина, анилида (3-аланина и карбобензоксиэтилдиамина (модель 3).

Эти ингибиторы отличаются как механизмом взаимодействия с ферментом, так и конформационной подвижностью заместителей.

ЗБ-ОРАЛ с СоМРА модели производных индола и изатина. Производные индола и изатина являются конкурентными обратимыми ингибиторами МАО А и Б [Мес1уес1еу е1 а1., 1995] с диапазоном 1С50 от 10"3 до 10"6 М. Анализ структур этих ингибиторов показал, что ряд соединений имеют заместители, которые могут различаться конфигурацией двойной связи, а также двумя правилами выравнивания для МАО Б. Поэтому для ЗО-С^АЯ с СоМРА анализа были построены два набора молекул для МАО А и четыре набора для МАО Б.

Для каждого набора были построены ЗО-С^АЛ с СоМРА модели. Все полученные модели были статистически значимыми. Для построения значимых С^АЯ моделей активного центра МАО Б для всех наборов в анализ был включен дополнительный дескриптор, описывающий величину гидрофобности ингибиторов.

На основе сопоставления статистических показателей, распределения СоМБА полей, предсказанных величин ингибиторных активностей тестовых соединений были выбраны наиболее вероятные ЗБ-рБАЯ + СоМБА модели (табл. 1). Карты распределения стерических полей для данных моделей представлены на рисунке 2.

Таблица 1. Статистические показатели ЗО-С^БАЛ с СоМРА моделей активного центра МАО А и Б, построенных с использованием аналогов индола и изатина в различных конформациях. __________

Модель Бсу п П1 Й2 в Р

МАО А Модель 1 0,57 0,45 3 5 0,94 0,18 84 -

Модель 2 0,49 0,88 3 3 0,84 0,49 52 -

Модель 3 0,51 0,67 6 0 0,93 0,26 45 -

МАО Б Модель 1 0,61 0,68 4 2 0,91 0,33 41 9

Модель 2 0,78 0,34 2 3 0,98 0,1 173 30

Модель 3 0,59 0,63 5 0 0,91 0,31 38 10

- квадрат коэффициента множественной корреляции при анализе со скользящим контролем; - стандартная ошибка при анализе со скользящим контролем; п - оптимальное число компонентов; ш - количество удаленных молекул; Я2 - квадрат коэффициента множественной корреляции при анализе без скользящего контроля; в - стандартная ошибка при анализе без скользящего контроля; Р - коэффициент значимости; - вклад

гидрофобности.

31)-6&4Л с СоМРА анализ производных пиразинокарбазола. Производные пиразинокарбазола относят к селективным прочносвязанным ингибиторам МАО А с диапазоном 1С50 от 10'5 до 10'8 М для МАО А и от 10'3 до 10'8 М для МАО Б [Мескеёеу й а1., 1994].

Первоначально было исследовано 16 производных. Все исследуемые молекулы, кроме одной, имели общую базовую структуру и отличались друг от друга заместителями в 8 положении. Жесткие аналоги пиразидола проявляли высокую селективность в отношении МАО А, тогда как производные с гибкими заместителями были эффективными ингибиторами обоих типов фермента.

Анализ геометрических размеров производных пиразинокарбзола

показал, что жесткие аналоги пиразидола проявляли высокую ингибиторную активность в отношении МАО А, если они укладывались в ячейку размером 13,0x7,1 х4,5 А. Это подтвердило наше предположение о том, что селективные ингибиторы МАО А с жесткими заместителями могут иметь большие размеры по оси X, чем ингибиторы МАО Б.

Л •• г - ух ' '" а ■*) .*< * \ \ » р" > б

^ » 1 г

1 Чг д V-/ 4 У е

Рис. 2. Распределение стерических полей в наиболее вероятных ЗО-С^АЯ моделях активных центров МАО А (а, в, д) и Б (б, г, е), полученных с использованием производных индола и изатина (а, б), производных пиразинокарбазола (в, г) и аналогов КЭА, АА, КЭДА (д, е). Области, благоприятные для наличия заместителя, изображены зеленым цветом, области, неблагоприятные для наличия заместителя, -оранжевым.

Для детального исследования закономерностей ингибирования МАО производными пиразинокарбазола был проведен ЗО-С^АЯ с СоМБА анализ этих соединений. В использованном наборе ингибиторов три молекулы имеют гибкие заместители. Конформационный анализ этих соединений показал, что они могут иметь два основных равновероятных типа конформаций: длинные вытянутые молекулы, когда заместитель располагается почти по прямой относительно базовой структуры и короткие свернутые, когда заместитель располагается под углом к плоскости базовой структуры. Поэтому построение ЗО-С^БАЛ моделей активных центров МАО проводили для нескольких наборов ингибиторов, в которых соединения с гибкими заместителями были представлены в разных конформациях. Анализ полученных моделей показал, что для МАО А наиболее вероятной является модель по набору конформеров, где самая длинная гибкая молекула находилась в свернутой конформации, а две другие гибкие молекулы в вытянутой конформации; лучшая модель активного центра МАО Б была получена по набору конформеров с гибкими молекулами в свернутых конформациях.

Впоследствии в Институте элементоорганических соединений им. А.Н.Несмеянова РАН было синтезировано еще 21 производное пиразинокарбазола. Эти соединения различались типами заместителей в положениях С8, СЮ и N3. Все соединения имели выраженную ингибиторную активность в отношении МАО А.

Введение любого заместителя в ЫЗ-положение пиразинокарбазола приводило к увеличению ингибиторной активности. Тогда как те же заместители, добавленные к пиразидолу или тетриндолу, приводили к снижению активности соединений, причем увеличение размеров заместителей в КЗ-положении для тетриндольной серии более критично, чем для аналогов пиразидола. По-видимому, причиной этого может быть наличие двух карманов для связывания заместителей, расположенных около С8- и N3-положения пиразинокарбазола. В этом случае, в зависимости от длины молекулы, производные пиразинокарбазола могут немного изменять свое положение в активном центре при связывании, сдвигаясь вдоль оси X. Причиной снижения ингибиторной активности для аналогов тетриндола при увеличении длины заместителя, расположенного в КЗ-положении, также может быть отклонение ядра пиразинокарбазола от оптимального положения при связывании.

На основе анализа расширенного набора производных пиразинокарбазолов была построена ЗО-С^АЛ с СоМРА модель для МАО А. Статистические параметры модели представлены в таблице 1. Распределение стерических полей приведено на рисунке 2.

ЗО-0.$А11 с СоМРА модели производных карбобензоксиэтиламина (КЭА), анилида Р-аланина (АА) и карбобепзоксиэтилдшшшш (КЭДА). Соединения этих химических классов относятся к конкурентным обратимым ингибиторам [Позднев и др., 2000], диапазон 1С50 которых от

10"3 до 10'6 М для МАО А и от 10"3 до 10'7 М для МАО Б. Хотя эти соединения принадлежат к разным химическим классам, для них характерны общие структурные элементы: фенольное кольцо, расположенное рядом или через одну связь с отрицательно заряженным атомом азота или кислорода. Это позволило предположить, что производные КЭА, АА и КЭДА связываются в одном месте активного центра, и, следовательно, возможно их совместное использование в ЗО-ОБАЯ с СоМБА анализе.

Статистические показатели моделей активных центров МАО А и МАО Б приведены в таблице 1. Обе модели являются статистически значимыми, причем наиболее достоверная модель для МАО А была получена с учетом распределения донорно-акцепторных полей, а для МАО Б - при добавлении в анализ величин гидрофобности молекул. Распределение стерических полей для МАО А и Б представлены на рисунке 2. Сравнение предсказанных и экспериментально определенных величин ингибиторной активности тестовых соединений по моделям активных центров МАО А и Б показывает хорошую предсказательную силу полученных моделей, что позволило использовать их на следующих этапах работы.

3.2. Моделирование полости активного центра фермента

Разработка подхода к моделированию полости активного центра фермента с неизвестной пространственной струшпурой. Взаимодействие субстратов и конкурентных обратимых ингибиторов с ферментом подразумевает комплементарность структур лиганда и участка его связывания в активном центре. В случае фермента с широкой субстратной специфичностью соединения, относящиеся к различным химическим классам, могут взаимодействовать с функциональными группами, расположенными в разных участках активного центра. Поэтому можно ожидать, что совокупность поверхностей этих лигандов будет отражать структуру участка связывания субстратов/ингибиторов в активном центре. Если данный подход верен, то пространственное совмещение лигандов друг с другом может достаточно полно описать пространственную структуру активного центра фермента. Правомерность такого подхода была проверена на 18 известных пространственных структурах комплексов протеиназы ВИЧ. На рисунке За приведена трехмерная структура этого фермента в разрезе, открывающим вид на поверхность активного центра фермента, который представляет собой вытянутую полость. На рисунке 36 представлен активный центр фермента, в котором показаны молекулы известных ингибиторов в тех положениях, как они расположены в комплексах после выравнивания белковых структур. Видно, что молекулы ингибиторов хорошо накладываются друг на друга, и основные группировки, участвующие в связывании с молекулой белка, совпадают между собой. На рисунке Зв

показана структура активного центра белка с наложенными друг на друга ингибиторами, представленными в виде сфер, имеющие радиусы ван-дер-Ваальса. Видно, что данный набор ингибиторов фактически представляет собой слепок, достаточно хорошо отражающий структуру полости активного центра фермента._

В реальной ситуации, когда структура фермента неизвестна, возникает проблема пространственного совмещения набора лигандов, который используется для моделирования полости активного центра. Для того, чтобы определить вероятное расположение лигандов друг относительно друга, необходимо построить их фармакофорную модель. Для ингибиторов протеазы ВИЧ фармакофорная модель содержит два фармако-форных элемента: акцепторный атом (атом кислорода) и гидрофобный цикл (фенольное кольцо) (рис. Зг). Эти два элемента присутствуют во всех исследованных ингибиторах, их взаимное расположение жестко фиксировано, и они являются основными группировками, определяющими связывание ингибиторов в активном центре [\Vlodawer, Уопскаэек, 1998]. В ряде случаев можно выделить другие функциональные группы, часто встречающиеся у разных ингибиторов и расположенные близко друг к другу в активном центре. Так, у многих ингибиторов протеиназы ВИЧ имеется второе фенольное кольцо, положение которого не так жестко фиксировано в пространстве, как требуется для фармакофорного элемента.

Рис. 3. Срез активного центра протеиназы ВИЧ. а - поверхность активного центра; б -поверхность активного центра с наложенными друг на друга ингибиторами протеиназы ВИЧ; в - поверхность активного центра с наложенными друг на друга ингибиторами протеиназы ВИЧ, представленными в виде сфер с радиусом ван-дер-Ваальса; г - фармакофорная модель ингибиторов протеиназы ВИЧ. АА -акцепторный атом; ДМ - донорное место; ГФ - центроид гидрофобного кольца

К подобным группировкам можно отнести некоторые гетероатомы (кислород, азот). Таким образом, при анализе структур ингибиторов можно выделить структурные элементы, желательные для проявления высокой активности, но не являющиеся абсолютно необходимыми для связывания. Эти элементы могут быть использованы для предсказания конформаций боковых радикалов лигандов при помощи конформационного анализа. Для этого можно также использовать дополнительные данные о стереоселективности, результаты 3D-QSAR-aHanH3a и т.д. Задача пространственного выравнивания лигандов упрощается при наличии среди них соединений с жесткой структурой (так называемый «rigid analog approach»). Это может значительно сократить количество возможных конформеров и соединения такого типа могут быть выбраны в качестве остова при построении модели активного центра фермента с неизвестной пространственной структурой. Данный подход был назван «построение слепка активного центра», а модель «слепок активного центра».

Построение слепков активных центров МАО А и МАО Б. Для построения модели слепка активного центра МАО А были использованы 26 известных эффективных ингибиторов этого фермента. Все молекулы были фитированы по фармакофорной модели МАО А. В основу построения слепков легли соединения, имеющие в своей структуре жесткое гетероциклическое ядро.

Предсказание положения боковых группировок было основано на двух подходах. Первый заключался в использовании данных о структуре активного центра МАО, полученных с помощью 3D-QSAR + CoMFA моделей, второй подход включал конформационный анализ боковых радикалов ингибиторов и нахождение таких конформеров, у которых группировки, потенциально участвующие в связывании с белком, пространственно сближены. Были совмещены некоторые фенольные кольца боковых радикалов, атомы кислорода карбоксильных групп, азота цианогрупп и ряд других группировок. Полученный таким методом слепок активного центра МАО А представлен на рисунке 4а.

Совмещение стерических полей выбранных 3D-QSAR моделей МАО А и полученного слепка активного центра этого фермента показало их хорошее соответствие: области, неблагоприятные для заместителей, находились за пределами слепка, в то время как области, которые предсказываются по моделям как благоприятные для наличия заместителей, располагались внутри него.

Первоначально достоверность формы и размера модели слепка активного центра МАО А проверяли с использованием соединений с жесткой структурой и проявляющих низкую или высокую активность в отношении этого фермента. Для этого были использованы субстраты -аналоги МФТП. Сопоставление их структур со слепком показало, что МПТП (эффективно окисляемый МАО А) хорошо помещается в полость слепка, тогда как его аналоги, являющиеся плохими субстратами МАО А,

Рис. 4. Слепки активных центров МАО А (а) и МАО Б (б).

не могут поместиться в нем. Это указывало, что построенный слепок активного центра МАО А правильно определяет форму и размеры полости активного центра.

Подобным образом был построен и слепок МАО Б. Для этого использовали 29 ингибиторов этого фермента. Полученный слепок активного центра МАО Б показан на рисунке 46. Совмещение стерических полей <38А11 моделей МАО Б, полученных на первом этапе работы, и слепка активного центра показало их хорошее соответствие.

Для оценки достоверности полученной модели активного центра МАО Б были использованы четыре соединения из разных химических классов, различающиеся по ингибиторной активности и имеющие заместители в различных положениях (табл. 2). Первые два соединения были из класса оксазолидонов, но имеющие разную ингибиторную активность в отношении МАО Б. Другими соединениями были моклобемид « (применяемый в медицинской практике селективный ингибитор МАО А,

практически не действующий на МАО Б) и родственное ему соединение Яо 16-3177 (высокоэффективный ингибитор МАО Б). Структуры этих молекул были сопоставлены с полостью слепка активного центра МАО Б. Оказалось, что оксазолидоновое производное Е-2011 (слабый ингибитор МАО Б) вследствие достаточно длинного и жесткого заместителя не помещается в полости активного центра (рис. 5а). В то же время его близкий аналог (алмоксатон), но имеющий гибкий заместитель, может расположиться в ней (рис. 56). Похожая ситуация наблюдалась и для моклобемида и его аналога. Сам моклобемид не может поместиться в полости слепка (рис. 5в), тогда как для его "гибкого"

Таблица 2. Структуры тестовых соединений и величины их ингибиторной активности 1С50 (мкМ) для МАО А и Б fJegham, George, 1998; Wouters, 1998]._

Название Структура МАО А МАО Б

алмоксатон О 1,77 0,028

Е-2011 Г°\ Г\ VXO*t 0,03 0,92

моклобемид 4 >1000

Ro 16-3177 13 10

Рис. 5. Расположение тестовых молекул в полости активного центра МАО Б. я-Е-2011; б - алмоксатон; в - моклобемид; г-Яо 16-3177.

. w^

аналога - Ко 16-3177 существует конформация, позволяющая ему поместиться в полости слепка (рис. 5г). Это указывает, что построенный слепок, по-видимому, правильно отражает структуру активного центра МАО Б.

Сопоставление слепка активного центра МАО Б с пространственной структурой фермента. Одновременно с опубликованием нами модели слепка активного центра МАО Б, группой Д.Эдмондсона была экспериментально определена пространственная структура МАО Б в комплексе с необратимым ингибитором паргшшном [Втс1а е1 а!., 2002], что позволило провести прямое сопоставление и проверку достоверности построенной модели с пространственной структурой этого фермента.

На первом этапе было необходимо определить наиболее вероятное место связывания ингибиторов, использованных при построении слепка, в активном центре. Ингибиторы были по очереди отдокированы в полость активного центра, откуда предварительно был удален необратимый ингибитор. Однако оказалось, что только 7 из 28 молекул могут разместиться в активном центре фермента. Поскольку большинство ингибиторов не помещается в полость активного центра МАО Б, это указывает, что при кристаллизации или при образовании комплекса фермента с необратимым ингибитором произошло изменение структуры активного центра. В результате активный центр фермента стал «уже».

Предложенный ранее слепок активного центра МАО Б был выровнен по положению поместившихся ингибиторов в активном центре. Сопоставление слепка со структурой активного центра МАО Б показало, что полученный слепок в основном правильно предсказывает структурные особенности активного центра (рис. 6): вытянутую полость активного центра и его изгиб возле ФАД. Основное отличие слепка от структуры активного центра МАО Б заключалось в том, что слепок был более широкий по сравнению с экспериментально определенной кристаллической структурой. Это может быть следствием изменения структуры активного центра в результате связывания с необратимым ингибитором, и/или результатом кристаллизации белка, а также возможными различиями в структурах ингибиторов, конформация которых рассчитывалась в вакууме. Таким образом, сопоставление слепка активного центра МАО Б с пространственной структурой белка показало, что предложенный метод построения слепка активного центра позволяет в общих чертах предсказать структуру активного центра фермента с неизвестной пространственной структурой.

Сопоставление слепка активного центра МАО А с пространственной структурой фермента. В 2004 году была получена пространственная структура комплекса МАО А с механизм-активируемым ингибитором хлоргилином. В кристаллической структуре активный центр фермента представляет собой вытянутый вглубь белковой глобулы канал,

Рис. 6. Сопоставление полости активного центра МАО Б (а) с моделью слепка (6).

по-видимому, соединяющий водную фазу с флавиновым кофактором. Сопоставление структур МАО А и МАО Б показало, что активный центр МАО А меньше, чем МАО Б, что противоречило многочисленным данным [Medvedev et al., 1995; Mabic, Castagnoli, 1996; Palmer et al., 1997; Krueger et al., 1992].

Анализ структуры активного центра МАО А показал, что аминокислотный остаток Phe-208 (соответствующий Ие-199 в МАО Б, который регулирует размер полости активного центра, изменяя свою конформацию, в зависимости от величины ингибитора) достаточно свободно расположен в активном центре, и изменение его конформации, эквивалентное Ие-199 в МАО Б, приводит к увеличению полости активного центра МАО А. Сопоставление полости «измененного» активного центра МАО А с моделью слепка показало их хорошее соответствие. Возможность изменения конформации ряда ароматических аминокислотных остатков в активном центре МАО А подтверждается данными по изменению спектра флуоресценции ФАД и спектра кругового дихроизма при связывании крупных ингибиторов этого фермента в активном центре [Hynson et al., 2003; Hynson et al., 2004]. Так, например, было показано, что амфетамин, имеющий сравнительно небольшую молекулу, практически не влияет на спектр кругового дихроизма, тогда как пиразидол (содержит четыре сопряженных цикла) вызывает значительные изменения последнего [Hynson et al., 2004].

Апробация подхода по поиску ингибиторов в молекулярных базах данных методом докинга в слепок. Модель слепка дает представление о размерах и форме активного центра, однако, для корректного описания субстрат/ингибиторного участка необходимо построить поверхность, ограничивающую объем, занимаемый слепком. Тогда, после удаления

молекул, образующих слепок, можно получить полость, близкую к полости активного центра. Полученная таким образом модель полости активного центра фермента с неизвестной пространственной структурой может быть использована для поиска новых лишндов в молекулярных базах данных с использованием программ докинга.

Для проверки корректности и эффективности такого подхода по поиску новых ингибиторов в молекулярных базах данных мы построили более строгую, «усеченную» модель слепка, основываясь только на двух классах ингибиторов МАО А: производных индола и изатина и производных пиразинокарбазолов. Для локирования была выбрана молекулярная база CMC, включающая 6300 структур известных лекарственных веществ. Предварительно был осуществлен препроцессинг этой базы - из нее были выбраны молекулы, имеющие в своих структурах индольный фрагмент. Структуры этих лекарственных препаратов были локированы в полость слепка МАО А. Д ля молекул, поместившихся внутри полости, были предсказаны величины IC50 по 3D-QSAR + CoMFA модели, полученной при анализе производных пиразинокарбазолов. Среди 10 соединений, с наивысшей предсказанной ингибиторной активностью в отношении МАО А, две молекулы действительно являются ингибиторами этого фермента (пиразидол и инказан), которые используются в медицинской практике [Машковский, 1983, 1993]. Если обнаружение пиразидола является вполне ожидаемым, так как он был использован при построении слепка и 3D-QSAR модели, то идентификация инказана, который не использовался при предварительном анализе, подтверждает применимость метода. Кроме того, еще три найденных соединения являются ингибиторами обратного захвата серотонина, а один -ингибитором серотониного рецептора (серотонин является физиологическим субстратом МАО А). Мишени для этих ингибиторов должны иметь общие структурные элементы с МАО А, поскольку все эти белки эффективно взаимодействуют с общим соединением - серотонином.

3.3. Компьютерное моделирование и поиск новых ингибиторов МАО А И МАО Б

Поиск потенциальных ингибиторов МАО А в базе данных низкомолекулярных веществ методом молекулярного докинга. Для поиска потенциальных ингибиторов МАО А была использована одна из баз данных низкомолекулярных соединений фирмы ASINEX, содержащая на момент выполнения работы 7725 коммерчески доступных соединений. Алгоритм поиска представлен на рисунке 7.

На первом этапе был осуществлен препроцессинг базы, в результате которого из нее были удалены следующие соединения: без ароматических колец или содержащие их более пяти, с молекулярным весом превышающим 500, без атомов азота или кислорода, содержащие

Рис. 7. Схема поиска новых селективных ингибиторов МАО А в молекулярной базе данных.

более трех атомов серы или содержащие металлы.

В результате в базе осталось 6130 соединений. Для них были рассчитаны возможные конформеры, что увеличило количество структур для локирования примерно до 50000.

Следующим этапом было поочередное локирование всех структур из полученной выборки в полость слепка активного центра МАО А. Оказалось, что в полость может поместиться 27600 структур, а количество гипотез о возможном расположении этих молекул в полости активного центра превысило 106.

Для первоначальной оценки положения потенциальных ингибиторов в полости активного центра МАО А использовали критерий перекрывания поверхностей локированных молекул с «ядром» слепка. В качестве "ядра"

была выбрана молекула пиразидола. Такой фильтр позволил исключить из дальнейшего рассмотрения гипотетические комплексы, в которых лиганд располагается на периферии и не взаимодействует с основными группами в активном центре. В результате было отобрано 15650 гипотез для 7048 молекул.

Следующим этапом было предсказание величин ингибиторной активности для МАО А по трем ЗО-С^БАК с СоМРА моделям. По предсказанным значениям было отобрано 383 конформера 137 молекул. Поскольку пространственное положение этих молекул после докинга не совпадало с правилами выравнивания для ЗБ-ОБАЯ моделей, то отобранные молекулы были точно выровнены по фармакофорной модели и для них была повторно предсказана ингибиторная активность. В результате было отобрано 20 соединений с наилучшими предсказанными активностями.

Для экспериментальной проверки были выбраны 4 соединения, относящиеся к разным классам и имеющие фармакофорные элементы, характерные для ингибиторов МАО А. Результаты проверки показали, что все соединения в той или иной степени, тормозили МАО А, причем лучшее из них (Ваэ 0442467) имеет значение ГС50 ~ 80 мкМ (табл. 3). В то же время ни одно из выбранных соединений не ингибирует МАО Б. Таким образом были найдены новые селективные ингибиторы МАО А.

Сопоставление этих соединений и слепка активного центра МАО Б показало, что ни одна из проверяемых молекул не помещается в модель полости активного центра МАО Б, хотя по ЗО-рБАЯ моделям предсказывается их достаточно высокая ингибиторная активность для этого фермента. Сравнение структур найденных новых селективных ингибиторов с кристаллической структурой активного центра МАО Б [Втс1а е1 а1., 2002] также подтвердило, что эти соединения не помещаются в активном центре (рис. 8).

Недостаточно высокие величины ингибиторной активности соединений (табл. 3) возможно обусловлены наличием некоторых боковых радикалов, препятствующих эффективному связыванию субстрата с ферментом. Дальнейший анализ этих структур, подбор более удачных заместителей и последующий направленный синтез, по-видимому, могут привести к увеличению желаемой активности. Таким образом, проведенный поиск в молекулярной базе с применением моделей слепка активного центра и ЗО-ОБАЯ моделей позволил обнаружить новые ингибиторы МАО А. Это наглядно демонстрирует эффективность данного подхода для поиска новых базовых структур лигандов для ферментов с неизвестной пространственной структурой.

Поиск ингибиторов МАО Б в молекулярной базе данных. После расшифровки пространственной структуры МАО Б стало возможным использование прямых методов компьютерного конструирования лекарств для поиска новых лигандов этого фермента.

Таблица 3. Предсказанные и экспериментальные величины ингибиторной активности (ГС50, мкМ) для МАО А и Б для выбранных соединений из базы данных АЭДОЕХ при ее локировании в слепок МАО А._

Название и структура МАО А МАО Б

Pir Ins Benz Эксп Pir Ins Benz Эксп

1 Bas 0318948 0,03 2,3 20 316 81 4,9 5,2 »100

он С/5'" vD^a Bas 0355758 0,02 114 44 >100 549 95 2,2 »100

OcffP^ Bas 0370811 0,55 38 58 160 7,6 7,8 0,4 »100

OHK^. Bas 0442467 0,02 114 44 79 141 479 21 »100

Pir - значение, предсказанное по моделям пиразидолов; Ins - значение, предсказанное по моделям индолов и изатинов; Benz - значение, предсказанное по моделям КЭА, АА и КЭДА; Эксп - экспериментальное значение.

Рис. 8. Сопоставление структур селективных ингибиторов МАО А, найденных в базе данных, со структурой активного центра МАО Б.

Для поиска новых ингибиторов МАО Б была использована база данных фирмы ASINEX, содержащая на момент анализа около 180 тысяч соединений. В работе было использовано 120 тысяч структур. Алгоритм поиска бьш близок к использованному ранее при поиске ингибиторов МАО А (рис. 7).

На первом этапе был выполнен препроцессинг базы данных. Критерии отсева соединений были те же, что и при поиске селективных ингибиторов МАО А (см. выше). Кроме того, из базы данных были удалены соединения, содержащие концевую углеводородую цепь длиной более четырех углеродов. В результате в базе осталось примерно 87 тысяч молекул. Для них был проведен расчет устойчивых конформеров, в результате выборка увеличилась до ~900000 структур.

На следующем этапе был проведен последовательный докинг всех конформеров молекул в активный центр пространственной структуры МАО Б с использованием программы DockSearch.

Первичный анализ результатов докинга проводили по положению лиганда относительно активного центра. Были отобраны 281 молекулы, которые могли поместиться в полости активного центра. Для этих молекул были рассчитаны энергии связывания с белком-мишеныо (с помощью стандартной процедуры SYBYL и в программе LeapFrog) и были предсказаны ингибиторные активности по трем 3D-QSAR с CoMFA моделям, построенным ранее. В результате для дальнейшего анализа было отобрано 64 индивидуальных соединения.

Следующим этапом было предсказание константы связывания лигандов с активным центром МАО Б по регрессионной модели, разработанной в нашей лаборатории [Крепец и др., 2000]. Для этого из полученных на предыдущих этапах веществ были отобраны 37 соединений с высокой предсказанной ингибиторной активностью и энергией связывания для МАО Б, максимально отличающихся по химической структуре. Комплексы МАО Б с этими молекулами, полученные в результате докинга, были минимизированы и для них были предсказаны константы связывания.

На основе этих предсказаний для экспериментальной проверки было отобрано 10 соединений (табл. 4). Видно, что пять соединений ингибируют МАО Б со значениями 1С5о в области концентраций 10"5М и величина 1С50 для лучшего из них равна 10 мкМ (BAS0539411). Только одно из проверенных соединений не проявляло ингибиторную активность в отношении МАО Б (BAS 0015867). В то же время эти соединения ингибировали МАО А в концентрациях на порядок выше (табл. 4). Таким образом, найденные соединения проявляли относительную селективность в отношении МАО Б.

Поиск иеселективпых ингибиторов МАО. МАО относят к ферментам с широкой лигандной специфичностью. Было показано, что их ингибиторы способны взаимодействовать с рядом других ферментов

Таблица 4. Экспериментальные величины ингибиторной активности (ГС50, мкМ)

[Bruhlmann et al., 2001; Weinstock et al., 2002; Petzer et al., 2003; Levant, 2002]. В частности, предполагают тесную взаимосвязь между биохимическими механизмами действия МАО и оксида азота [Sagin et al., 2004]. Ранее было показано, что эндогенный регулятор МАО - изатин может также тормозить активацию растворимой гуанилатциклазы оксидом азота [Medvedev et al., 2002]. Депренил (селективный необратимый ингибитор МАО Б) вызывает увеличение образования оксида азота в тканях и сосудах мозга [Thomas et al., 1998]. Поэтому мы предположили, что соединения, активирующие растворимую гуанилатциклазу, могут вызывать торможение активности МАО. Мы проанализировали ряд активаторов растворимой гуанилатциклазы в качестве потенциальных ингибиторов МАО А и МАО Б.

В работе были использованы четыре производных бензофуроксана (табл. 5). Стимулирующий эффект на активность гуанилатциклазы трех из них обусловлен высвобождением оксида азота [Бусыгина и др., 2000; Пятакова и др., 2002].

Докирование исследуемых соединений с помощью программы DockSearch в полость активного центра пространственных структур ферментов показало, что все они могут единообразным образом поместиться активных центрах МАО А и МАО Б (рис. 9). Для оценки возможности образования комплекса «МАО-ингибитор» были рассчитаны энергии связывания этих лигандов (табл. 5). Видно, что за исключением бензофуроксана все соединения характеризуются высокими виртуальными энергиями связывания, рассчитанными разными методами. Поэтому можно было ожидать, что эти соединения могут проявлять свойства ингибиторов МАО.

Экспериментальная проверка показала, что среди исследованных соединений бензофуроксан (который в компьютерном эксперименте был наименее активным) практически не тормозил активность МАО А и МАО Б (табл. 5). Бензотрифуроксан более избирательно тормозил активность МАО Б, а бензодифуроксан и 7-нитро-бензотетразин-1,3-диоксид (7-НБТДО) вызывали практически одинаковое торможение активности МАО А и МАО Б (табл. 5).

При этом в случае бензодифуроксана величины 1С50 были примерно на порядок ниже, чем при ингибировании обоих ферментов 7-НБТДО. Однократная отмывка митохондрий, предварительно проинкубированных с бензодифуроксаном, уменьшала ингибирование обоих ферментов, что свидетельствует об обратимости торможения МАО А и МАО Б.

Таким образом, в результате компьютерного моделирования и экспериментальной проверки были найдены новые неселективные ингибиторы МАО, характеризующиеся ингибиторной активностью на микромолярном уровне.

Таблица 5. Ингибирование (1С50, мкМ) бензофуроксаном, беюодифуроксаном, бензо-трифуроксаном и 7-НБТДО МАО А и МАО Б митохондрий печени крысы и рассчитанные энерпш связывания (ккал/моль) с активными центрами МАО А и Б.

Соединение МАО А МАО Б

БуЬу1 1С50 БуЬу1 ЬеарРго§ 1С50

0 Беизофуроксап -29,8 >100 1,2 -14,0 »100

о. Гк/1 0-М ° Бснзодифуроксан -52,4 6,8±0,3 -27,1 -19,5 6,3±0,9

0 0-м 1 0 Бепзотрифуроксан -57,7 >100 -23,2 -13,7 63±9

0 А 0 7-НБТДО -35,8 бб±б -33,3 -16,3 70±8

Рис. 9. Положение ингибиторов в полости активного центра МАО Б. Пунктиром показаны возможные водородные связи между тирозином-435 и бензодифуроксаном, бензотрифуроксаном и 7-НБТДО. Бензо-фуроксан может образовывать водородную связь с глутамином-206 (на рисунке не показан).

4. ОБСУЖДЕНИЕ

Изменение активности моноаминоксидаз и эффективность применения их ингибиторов в терапии различных нейродегенеративных заболеваний сделали этот фермент популярным объектом фундаментальных и клинических исследований [Горкин и Медведев, 1995; Jegham, George, 1998; Abell, Kwan, 2001; Yamada, Yasuhara, 2004]. К настоящему времени разработано большое количество ингибиторов МАО, отличающееся по преимущественному ингибированию типа фермента, механизмом действия и относящиеся к разным химическим классам. Однако, наличие побочных эффектов у первых ингибиторов и недостаточная эффективность последующих поколений ингибиторов МАО сдерживает их широкое использование в клинической практике [Типтон, 1997]. Поэтому в настоящее время все активнее говорят о необходимости разработки нового поколения ингибиторов моноаминоксидаз, которые с одинаковой эффективностью ингибировали бы оба типа этого фермента [Glover 1997; Типтон, 1997].

К началу наших исследований были отмечены некоторые общие закономерности в структурах физиологических и суицидных субстратов, определяющих предпочтительность их окисления разными типами флавиновых моноаминоксидаз. Однако о различиях в структурах этих ферментов было мало что известно. Косвенные экспериментальные данные не позволяли представить структуры активных центров этих ферментов. Использование «метаболитически-активных» соединений для оценки свойств активных центров представлялось затруднительным из-за неопределенности, возникающей вследствие трансформации структур в активном центре при каталитическом акте [Trevor et al., 1987].

Появление большого ряда обратимых и конкурентных ингибиторов- аналогов индола и изатина позволило провести первый корректный анализ особенностей активных центров МАО [Medvedev et al., 1995], который показал четкую зависимость между ингибиторной активностью производных индола и изатина и их геометрическими размерами. Это позволило предложить подход по оценки эффективности ингибиторов, основанный на способности соединений помещаться в ячейку определенного размера.

Наличие четких закономерностей между геометрическими размерами ингибиторов и их активностью привело нас к заключению, что для адекватного моделирования активных центров ферментов с неизвестной пространственной структурой (в частности МАО) необходимо придерживаться следующих принципов:

1. использовать обратимые конкурентные ингибиторы, которые не претерпевают МАО-зависимой модификации;

2. использовать преимущественно «жесткие» (с ограниченной конформационной подвижностью) молекулы, имеющие ограниченный набор конформеров;

3. при использовании жестких молекул оценивать в первую очередь стерические факторы, т.к. именно они определяют возможность размещения лиганда в активном центре;

4. использовать ингибиторы с известными ингибиторными свойствами для МАО А и МАО Б, для которых экспериментально доказан конкурентный и обратимый тип взаимодействия.

Другим результатом БАЯ анализа аналогов индола и изатина стала первая, во многом интуитивная модель активного центра МАО [1уапоу е1 а1., 1994]. Эта модель, предсказывающая структуру активного центра в виде сандвича, в котором ингибитор располагается между оксазолиновым кольцом флавина и белковой цепью, была основана на обнаруженной закономерности о необходимости планарной структуры ингибитора МАО и наличие флавинового кофактора, имеющего плоскую структуру оксазолиного кольца. Сопоставление этой модели с пространственной структурой комплекса МАО Б с изатином [ВЫа е1 а1., 2003] показало, что она была далека от реальности, поскольку ингибитор располагается в середине канала активного центра и не взаимодействует с флавиновым кофактором.

Обнаруженная закономерность между эффективностью ингибиторов и их размерами (способностью поместиться в ячейку), позже была подтверждена нами для производных пиразинакарбазола. ЗБ-рБАЯ с СоМБА анализ этих соединений позволил построить модели активных центров МАО А и МАО Б (рис. 10). Согласно этим моделям, активный центр МАО А в области заместителей С-8 пиразинокарбазолов имеет длинную, вытянутую полость (щель), в которой могут прочно связаться длинные гибкие (рис. 10А, слева) или жесткие (рис. 10А, справа) заместители таким образом, что субстрат серотонин не способен их оттуда вытеснить. Тогда как в МАО Б этот регион более короткий (рис. 10), в результате чего длинные жесткие аналоги не могут поместиться в активном центре и легко вытесняются субстратами МАО Б (рис. 10Б, справа). Гибкие же ингибиторы могут связываться в активном центре МАО Б в компактной изогнутой конформации, и не вытесняются субстратом (рис. 17Б, слева). Данная модель позволила объяснить причину более высокой эффективности гибких ингибиторов МАО Б, по сравнению с их жесткими аналогами. Эта модель не противоречила данным других лабораторий, где было установлено, что введение дополнительного мостика в молекулу субстрата или ингибитора, приводящее к более длинным и гибким аналогам, повышает эффективность связывания соединений с МАО Б [Кгиевеге1а1., 1992,1995].

Сравнение данной модели с пространственной структурой МАО Б показывает, что модель правильно распознает ограничение по длине ингибиторов, что заставляет длинные гибкие ингибиторы изменять конформацшо для эффективного связывания с активным центром. Самое существенное отличие построенной нами модели от реальной

rrwnñrfy п-щттФ

PEA

Рис. 10. Схема активных центров МАО А (А) и МАО Б (Б) и предполагаемые позиции гибкой молекулы (слева) и тетриндола (справа). Стрелками показано, что фенилэтиламин (PEA) может вытеснить тетриндол, но не гибкий ингибитор. Серотонин (5-НТ) не способен заместить эти молекулы.

кристаллической структуры активного центра МАО Б заключалось в том, что модель предполагала широкий, короткий и достаточно отрытый активный центр, тогда как в действительности он представляет собой изогнутый канал.

Данная модель и построенные ранее 3D-QSAR + CoMFA модели не давали возможность представить структуру активных центров МАО А и МАО Б и использовать их для эффективного поиска новых лигандов в молекулярных базах данных. Поэтому нами был предложен другой подход по моделированию 3D структуры активных центров ферментов с неизвестной пространственной структурой для поиска новых ингибиторов. Этот подход был назван нами «построение слепка активного центра», а получающая модель слепком активного центра.

В основе данного подхода лежит постулат, что между структурой активного центра мишени и структурой его лиганда должна наблюдаться взаимная стерическая комплементарность. В этом случае совокупность поверхностей лигандов фермента, наложенных друг на друга в биологически активных позициях и конформациях, должна отражать структуру участка связывания ингибиторов в активном центре. Построение слепка активного центра состоит из двух этапов. На первом этапе необходимо определить основные фармакофорные точки для лигандов из разных химических классов и правила их выравнивания. Второй этап более трудный и менее определенный, поскольку он включает поиск взаимного пространственного расположения боковых радикалов у разных соединений. Данный подход был применен для построения слепков активных центров МАО А и МАО Б. Их сопоставление показало, что у МАО А он больше,

чем у МАО Б (рис.4а), что совпадало с рядом литературных данных [Mabic, Castagnoli, 1996; Palmer et al., 1997;Kruegeretal., 1992].

Ранее уже предлагались подходы для построения моделей активных центров для ферментов с неизвестной пространственной структурой, основанные на близкой идеологии. Это, в частности, метод активных аналогов и псевдорецептора [Kettmann, Holtje, 1998; Gurrath et al., 1998; Zbinden et al., 1998; Schleifer, 2000]. Предложенный нами метод построения слепков активных центров отличается от метода активных аналогов тем, что мы используем при построении слепков только высокоактивные соединения, которые заведомо должны хорошо располагаться в активном центре фермента. Это позволяет получить слепок полости активного центра, в котором связываются эффективные ингибиторы фермента. В отличие от метода построения псевдорецептора наш подход не позволяет предсказывать структуру и свойства активных центров ферментов на уровне аминокислот, но он полностью описывает форму и размеры активных центров, что делает его более эффективным для поиска потенциальных ингибиторов.

В отсутствии пространственной структуры мишени оценить достоверность полученных моделей можно с использованием набора близких аналогов, одни их которых эффективно ингибируют данный фермент, тогда как другие соединения являются плохими ингибиторами. Если основной причиной неэффективности этих соединений выступает стерический фактор, то они не должны помещаться в слепок. Так, например, достоверность слепка МАО Б была подтверждена с использованием моклобемида (плохой ингибитор МАО Б, который не помещается в слепок фермента) и его гибкого аналога Ro 16-3177 (эффективный ингибитор МАО Б, который может поместиться в слепок) (табл. 2). Используя такой подход, можно решать и обратную задачу: проводить первичный скрининг соединений на предмет возможности ингибирования ими данного фермента.

Появление пространственной структуры МАО Б позволило провести прямую проверку эффективности предложенного метода и достоверности модели слепка МАО Б. Сопоставление модели слепка МАО Б с активным центром этого фермента показывает, что данная модель правильно предсказывает основные структурные особенности активного центра (рис. 6). Так, правильно были предсказаны размеры полости активного центра, его вытянутая форма, изгиб около флавинового кофактора. Основное отличие слепка от активного центра заключалось в диаметре «цилиндра» активного центра - в модели слепка он был больше. Одна из причин этого, по-видимому, заключается в том, что структура МАО Б была получена в виде комплекса с необратимым ингибитором паргилином, что могло привести к некоторому изменению структуры активного центра, в результате чего он стал уже. На это указывают наши данные, что большинство ингибиторов, использованных для построения слепка МАО Б

(они отбирались как эффективные ингибиторы МАО Б), не могут с высокой стерической комплементарностью поместиться в полости активного центра кристаллической структуры. На достаточно высокую лабильность активного центра МАО Б указывают сопоставление пространственных структур МАО Б с разными ингибиторами. С другой стороны, взаимодействие белка с лигандом может сопровождаться изменением конформации самого лиганда, тогда как при построении слепка используются конформации, рассчитанные в вакууме. Это может быть другой причиной некоторого различия формы слепка и кристаллической структуры активного центра.

Анализ активного центра кристаллической структуры МАО А показал, что у МАО А активный центр меньше, чем у МАО Б. Это противоречило многочисленным данным о том, что в активном центре МАО А могут помещаться более крупные лиганды, чем в МАО Б. В связи с этим мы предположили, что, как и в случае с МАО Б, при связывании ингибитора происходит изменение конформаций ряда аминокислотных остатков в активном центре. На высокую вероятность этого указывали данные по изменению спектров флуоресценции флавинового кофактора и спектра кругового дихроизма при связывании крупных ингибиторов МАО [Нумоп е1 а1., 2003; Нупэоп е1 а!., 2004].

Одной из основных кандидатур был фенилаланин-208. Этому аминокислотному остатку в МАО Б соответствует изолейцин-199. На основании анализа пространственных структур МАО Б с разными ингибиторами было показано, что этот аминокислотный остаток изменяет свою конформацию в зависимости от размеров ингибитора, находящегося в активном центре: при связывании небольшого ингибитора (например, изатина) он закрывает вход в субстрат-связывающую область; при связывании длинного ингибитора, Не-199 находится в конформации, открывающий вход в эту область активного центра. Анализ структуры активного центра МАО А показал, что РЬе-208 может менять свою конформацию (изменение торсионного угла примерно на 40°), и это приводит к увеличению объема активного центра. При этом он по форме и размеру становится близок к модели слепка активного центра МАО А. Сопоставление конформаций у РЬе-208 МАО А и Не-199 МАО Б, приводящих к изменению размеров активных центров, показывает, что они близки. Основное отличие заключается в том, что конформации Не-199 в МАО Б при открытом активном центре (как в комплексе с паргилином) соответствует конформация РЬе-208 в МАО А для узкого активного центра (как в комплексе с хлоргилином) и наоборот - конформации Не-199 в МАО Б при закрытом активном центре (как в комплексе с изатином) соответствует конформация РЬе-208 в МАО А для широкого активного центра (как в модели).

Предсказание положения обратимых ингибиторов в активном центре МАО А и МАО Б, на основании совмещения полостей активных центров с

моделями слепков, показало, что эти ингибиторы, вероятно, располагаются идентичным образом. Близкий аминокислотный состав активных центров МАО А и МАО Б в области флавинового кофактора создает реальные предпосылки для разработки неселективных обратимых ингибиторов этих ферментов.

История изучения МАО неразрывно связана с разработкой ингибиторов этого фермента. В результате многолетних исследований было найдено большое количество соединений, с разным механизмом действия и принадлежащих к различным химическим классам веществ, которые ингибируют МАО [Brown, Martin, 1996; Wouters, 1998]. Некоторые из них используются в медицинской практике, в основном в качестве антидепрессантов. По времени открытия и внедрения в клиническую практику, а так же по селективности и обратимости антидепрессанты-ингибиторы МАО А разделяют на три поколения [Типтон, 1997]. Первое поколение включает неселективные необратимые ингибиторы МАО, второе поколение - селективные необратимые ингибиторы МАО А, третье - селективные обратимые ингибиторы МАО А. Однако, несмотря на долгую историю клинического применения нескольких поколений ингибиторов МАО [Feighner, 1999; Vetulani, Nalepa, 2000], ингибиторы первого поколения (например, ипрониазид), неселективно ингибирующие оба типа МАО в настоящее время остаются наиболее эффективными препаратами. Их широкое применение сдерживается наличием у них ряда серьезных побочных эффектов [Типтон, 1997; Feighner, 1999; Tipton, 2000]. Поэтому долговременная стратегия в разработке эффективных лекарств, механизм действия которых основан на ингибировании МАО, включала поиск селективных и обратимых ингибиторов МАО А и МАО Б [Типтон, 1997; Vetulani, Nalepa, 2000; Tipton, 2000]. Однако в последние годы неоднократно высказывались предположения, что повысить эффективность ингибиторов МАО в качестве антидепрессантов можно созданием неселективных обратимых ингибиторов МАО (антидепрессанты четвертого поколения) [Glover 1997; Типтон, 1997; Youdim, Weinstock, 2004]. Такие препараты будут обладать эффективностью необратимых ингибиторов и не вызывать побочных эффектов, свойственных антидепрессантам третьего поколения.

Долгое время рациональную разработку ингибиторов МАО сдерживало отсутствие информации о структуре активных центров данных ферментов. Поэтому в данной работе, особенно на первых этапах, были использованы в основном непрямые методы компьютерного анализа структуры ферментов и поиска новых лигандов.

Основными непрямыми методами являются построение фармакофорных и QSAR моделей. Фармакофорные модели МАО содержат только ароматическое кольцо (гидрофобный участок) и заряженный атом. Но поиск ингибиторов МАО в базах данных низкомолекулярных веществ

по подобной фармакофорной модели не будет эффективным, вследствие большого количества молекул, удовлетворяющих условиям поиска.

Поэтому для анализа структур активных центров МАО и предсказания активности новых соединений были построены несколько ЗО-ОБАЯ с СоМРА моделей (рис. 2, табл. 1). В соответствии с нашей концепцией для построения этих моделей использовались ингибиторы с жесткой базовой структурой и ограниченным числом гибких заместителей. Это значительно снизило количество возможных конформеров и вариантов выравнивания.

Для поиска новых базовых структур ингибиторов наиболее оптимальным является метод скрининга молекулярных баз данных. Нам представляется, что разработанный нами метод моделирования структур активных центров ферментов с неизвестной пространственной структурой (построение слепка), основанный на пространственном совмещении высокоактивных селективных обратимых ингибиторов этих ферментов, может быть удобным подходом для поиска новых лигандов для таких ферментов. Построение поверхности вокруг слепка, с последующим удалением образующих слепок ингибиторов, приводит к полости, которую можно использовать для локирования соединений из молекулярных баз данных. Поскольку данная полость отражает только размер и форму активного центра, то оптимальным является быстрый метод геометрического докинга. Последующие оценки эффективности лигандов можно проводить с использованием С^АЛ моделей. Кроме того, надо учитывать, что модель слепка, вероятнее всего, показывает максимальный объем, который может иметь активный центр при связывании с различными ингибиторами вследствие его конформационной «адаптации» к ним. Поэтому данную модель, по-видимому, можно использовать и при наличии пространственной структуры белка для предварительного скрининга молекулярных баз данных. В этом случае можно отобрать для дальнейшего анализа соединения, которые при использовании в докинге непосредственно ЗБ структуру белка были бы «отброшены» из рассмотрения вследствие конформационных изменений в структуре активного центра и несовпадении геометрических размеров его и лиганда.

Данный подход был использован для поиска селективных ингибиторов МАО А в молекулярной базе данных коммерчески доступных соединений фирмы АБШЕХ. Для повышения вероятности нахождения соединений с биологической активностью были рассчитаны конформеры молекул из базы данных. Такая процедура резко увеличивает размеры выборки, но использование геометрического докинга (без учета других параметров для оценки результатов на первом этапе) позволяет уменьшить время вычислений до разумных пределов.

Удаление молекул, расположенных на периферии слепка, предсказание активности оставшихся соединений по ЗЕ)-<38А11 с СоМРА моделям и «ручной» отбор позволили предложить четыре соединения из

молекулярной базы данных для их экспериментальной проверки на ингибиторную активность в отношении МАО А (табл. 3). Все проверенные соединения показали селективное ингибирование МАО А, хотя их активность была невысокой (1Сзо от ~ 80-300 мкМ) (табл. 3). Тем не менее, соединения из этих классов химических веществ никогда ранее не рассматривались в качестве потенциальных ингибиторов МАО. Найденные структуры, по-видимому, можно использовать в качестве базовых соединений, для оптимизации их структуры с целью повышения их активности. Например, в самом активном из найденных соединений (ВАБ 0442467) присутствует на конце алифатической цепи карбоксильная группа, что нехарактерно для ингибиторов МАО. Замена ее на другие группировки может привести к повышению активности этой структуры.

Таким образом, впервые для скрининга базы данных низкомолекулярных веществ была использована модель полости активного центра фермента с неизвестной пространственной структурой. Данный подход показал высокую эффективность. Поэтому можно ожидать, что использование обширных баз данных позволит обнаружить более активные ингибиторы. Самым длительным этапом в предложенной схеме поиска новых лигандов является расчет конформаций молекул. По-видимому, данный подход можно эффективно использовать для поиска новых базовых структур для других ферментов с неизвестной пространственной структурой.

После появления пространственной структуры МАО Б стало возможным использование прямых методов компьютерного конструирования новых ингибиторов. Локирование молекул из базы данных, с последующим предсказанием ингибиторной активности и энергии связывания для МАО Б, позволил отобрать ряд соединений для экспериментальной проверки (табл. 4). Восемь из десяти веществ тормозили активность МАО Б, причем пять из них имели ингибиторную активность в среднем микромолярном диапазоне. В тоже время активность этих соединений в отношении МАО А была на порядок выше. Полученные соединения можно отнести к частично селективным ингибиторам МАО Б. Так как данные ингибиторы не показывают высокой селективности, то при дальнейшей модификации боковых радикалов, по-видимому, могут быть найдены неселективные ингибиторы для обоих типов МАО.

Для разработки неселективных ингибиторов МАО можно применять две стратегии. Первая заключается в использовании в качестве базовой структуры высокоэффективного ингибитора для одной формы фермента и подборке заместителя для этого ингибитора, который увеличивал бы его эффективность для другой формы фермента, даже с возможностью некоторого снижения ингибиторной активности для исходной формы. Например, присутствие нитрогруппы в ароматическом кольце снижает ингибиторную активность в отношении МАО А, но увеличивает для МАО Б [Мес1уес1еу е1 а!., 1995; Позднев и др., 2000]. Поэтому вполне

возможно, что введение нитрогруппы и/или других заместителей с близкими электрон-акцепторными свойствами в высокоэффективный селективный ингибитор МАО А, который может поместиться в активный центр МАО Б, может увеличить эффективность неселективного ингибирования МАО до фармакологически приемлемого уровня. Однако, на наш взгляд более перспективной и интересной является другая стратегия, при которой проводится поиск новых базовых структур, способных с близкой эффективностью связываться с обоими типами МАО.

Для поиска неселективных ингибиторов МАО был проведен анализ возможности ингибирования этого фермента некоторыми активаторами растворимой гуанилатциклазы. Неоднократно было показано, что ряд ингибиторов МАО могут эффективно влиять на работу других ферментов [Bruhlmann et al., 2001; Weinstock et al., 2002; Petzer et al., 2003; Levant, 2002; Medvedev et al., 2001], в том числе систем, сопряженных с регуляцией посредством оксида азота [Medvedev et al., 2002; Thomas et al., 1998; Sagin et al., 2004]. Для исследования был взят ряд активаторов растворимой гуанилатциклазы (производных бензофуроксана), обладающих жесткой базовой структурой, как потенциальных ингибиторов МАО А и МАО Б.

Моделирование взаимодействия этих соединений с МАО А и Б показало, что они расположены единообразно в активных центрах, и три из них имеют высокие предсказанные величины энергий связывания и могут образовывать водородные связи с одним аминокислотным остатком (Туг444 и Туг435 для МАО А и МАО Б, соответственно). Т.е. можно было предполагать, что они могут взаимодействовать с ферментами (табл. 5). Экспериментальная проверка показала, что три соединения, характеризующиеся минимальными значениями энергии связывания, оказались наиболее сильными ингибиторами. Причем два из них в одинаковой степени ингибировали МАО А и МАО Б (табл. 5).

На сегодняшний день известен ряд высоко селективных прочносвязанных ингибиторов МАО А и МАО Б, эффективно тормозящих активность этих ферментов со значениями 1С50 в диапазоне 10"6-10"8 M [Cesura, Plescher, 1992; Wouters, 1998]. Однако до сих пор неселективные ингибиторы МАО, действующие в таком низком диапазоне концентраций, практически не были известны. Ранее в ряду производных бензилоксикарбонил-этилендиамина было обнаружено соединение -3,4-дихлор-бензилоксикарбонил-этилендиамин, вызывающее одинаковое торможение обоих типов МАО со значением 1С50 22 мкМ [Позднев и др., 2000]. В качестве другого примера можно привести производное тетрагидрооксазолохинолина, один из оптических изомеров которого является селективным ингибитором МАО А, а другой представляет собой неселективный ингибитор МАО [Jegham, George, 1998].

Результаты настоящей работы свидетельствуют о том, что «порог чувствительности» обоих типов МАО к неселективному обратимому ингибированию может быть понижен до 1С50 ~1 мкМ. Это создает реальные

предпосылки к разработке нового поколения ингибиторов МАО, способных одинаково эффективно и обратимо тормозить активность и МАО А, и МАО Б, действующих в фармакологически приемлемом уровне концентраций для традиционных лекарственных препаратов (1-0,1 мкМ).

5. ВЫВОДЫ

1. Разработан подход для компьютерного анализа структур активных центров ферментов с неизвестной пространственной структурой и поиску новых базовых структур ингибиторов этих ферментов. Он включает: а) анализ структур конкурентных обратимых ингибиторов с ограниченной конформационной подвижностью; б) преимущественную оценку стерического фактора, определяющего возможность размещения лиганда в активном центре; в) построение компьютерных моделей активного центра фермента, отражающих его форму и размеры; г) проверку достоверности моделей с использованием близких аналогов с разными размерами и отличающихся ингибиторной активностью; д) поиск лигандов в молекулярных базах данных с использованием таких моделей; е) экспериментальную проверку новых ингибиторов. Эффективность использования данного подхода продемонстрирована в прямых экспериментах на фармакологически важном объекте -моноаминоксидазах типа А и Б.

2. На основе анализа репрезентативных рядов конкурентных ингибиторов МАО А и МАО Б были построены: а) фармакофорные модели, характеризующие причины различной селективности торможения активности ферментов разными ингибиторами; б) ЗО-ОБАЯ с СоМБА модели активных центров МАО А и Б (на основе нескольких рядов ингибиторов), позволяющие проводить первичную компьютерную оценку эффективности новых ингибиторов этих ферментов; в) слепки полостей активных центров МАО А и МАО Б, позволяющие оценивать форму и размеры активных центров и проводить поиск новых лигандов в молекулярных базах данных методом молекулярного докинга.

3. Осуществлен поиск новых ингибиторов МАО: а) методом докинга структур из молекулярной базы данных в слепок активного центра МАО А, с последующей оценкой по ЗО-С^БАЯ с СоМРА моделям, найдены ранее не использованные ингибиторы этого фермента. Рандомизированная выборка (~20%) из списка потенциальных ингибиторов была экспериментально проверена, и показана высокая эффективность данного подхода (все соединения проявляли МАО А ингибиторную активность; лучшее соединение имело 1С50 ~ 80 мкМ); б) методом докинга структур из молекулярной базы данных в пространственную структуру активного центра МАО Б, с последующей оценкой энергий связывания и ингибиторной

активности по 3D-QSAR с CoMFA моделям, найдены новые соединения ингибирующие этот фермент с активностью (1С50) в субмикромолярном диапазоне. Лучшее соединение имело ингибиторную активность < 10 мкМ; в) среди производных бензофуроксана были найдены неселективные ингибиторы МАО с 1С50 в микромолярном уровне.

4. Показана возможность создания нового поколения ингибиторов МАО, способных обратимо и с одинаковой эффективностью тормозить оба типа этих ферментов в фармакологически значимом диапазоне концентраций.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Medvedev А.Е., Ivanov A.S., Veselovsky A.V., Skvortsov V.S., Archakov A.I. QSAR Analysis of Indole Analogues as Monoamine Oxidase Inhibitors. // Journal of Chemical Information and Computer Sciences. 1996. 36. 4. 664-671.

2. Иванов A.C., Веселовский A.B., Тихонова O.B., Медведев А.Е. Анализ взаимосвязи структура-активность производных пиразидола ингибиторов моноаминоксидазы типа А и В. // Тезисы IV Российского Национального Конгресса "Человек и лекарство", Москва, 1997.

3. Tikhonova O.V., Veselovsky A.V., Ivanov A.S., Medvedev А.Е. QSAR and CoMFA analysis of pirlindole derivatives as monoamine oxidase A and В inhibitors. // The 2nd Electronic Molecular Graphics and Modelling Conference (MGM EC-2) on the Internet and World Wide Web (http://www.vei.co.uk/mgmec2/) Oct 6-17, 1997. Virtual Environments International Ltd (VEI), Oxford Centre for Innovation, Oxford, 0X1 3HS, UK.

4. Веселовский A.B., Иванов A.C., Медведев А.Е. Использование селективных ингибиторов для компьютерного моделирования активного центра моноаминоксидаз. // Вопросы медицинской химии,

1997. 43. 6. 527-536.

5. Ivanov A.S., Skvortsov V.S., Tikhonova O.V., Veselovsky A.V., Archakov A.I. Database mining for ligands of drug oxidizing enzymes: the ways in binding site description. // In: 12 Internat. Symposium on Microsomes and Drug Oxidations, 20-24 July 1998. Montpellier, France. 1998.259.

6. Medvedev A.E., Ivanov A.S., Veselovsky A.V. Selective inhibitors and computer modelling of the active site of monoamine oxidase. // In: Internat. 8th Amine Oxidase Workshop. 6-10 September 1998. Hungary

7. Medvedev A.E., Ramsay R., Ivanov A.S., Shvedov V.I., Veselovsky A.V., Tikhonova O.V., Moskvitina T.A., Fedotova O.A., Axenova L.N. Inhibition of monoamine oxidase by pirlindole analogues: 3D-QSAR and CoMFA analysis. // In:Internat. 8th Amine Oxidase Workshop. 6-10 September

1998. Hungary

8. Веселовский A.B., Иванов A.C., Медведев А.Е. Может ли одна

аминокислота определять различие каталитических и регуляторных свойств моноаминоксидаз А и Б? // Биохимия. 1998.63.12.1695-1701.

9. Medvedev А.Е., Veselovsky A.V., Shvedov V.I., Tikhonova O.V., Moskvitina T.A., Fedotova O.A., Axenova L.N., Kamyshanskaya N.S., Kirkel A.Z., Ivanov A.S. Inhibition of monoamine oxidase by pirlindole analogues: 3D-QSAR and CoMFA analysis. // Journal of Chemical Information and Computer Sciences. 1998.38.6.1137-1144.

10. Иванов A.C., Веселовский A.B., Арчаков А.И. Высокоэффективный поиск новых физиологически активных соединений: компьютеры и эксперимент. // Тезисы V Российского Национального Конгресса "Человек и лекарство", Москва, 1999. С. 410-411.

11. Иванов А.С., Скворцов B.C., Веселовский А.В., Арчаков А.И. Методы молекулярного докинга в компьютерном конструировании лекарств. // Тезисы V Российского Национального Конгресса "Человек и лекарство", Москва, 1999. С. 411.

12. Tikhonova O.V., Veselovsky A.V., Medvedev А.Е., Ivanov A.S. Models of monoamine oxidase A and В active sites Obtained by Using 3D QSAR with CoMFA Analysis. // The Electronic Conference "Molecular Simulation'99" on the Internet and World Wide Web (http.7/molsim.vei.co.uk) 19 April - 4 May, 1999. Virtual Environments International Ltd (VEI), Oxford Centre for Innovation, Oxford, 0X1 3HS, UK.

13. Веселовский A.B., Медведев A.E., Тихонова O.B., Скворцов B.C., Москвитина T.A., Аксенова JI.H., Иванов А.С. Анализ структур активных центров моноаминоксидаз А и Б методами компьютерного моделирования. // Вопросы медицинской химии. 1999.45.5.436.

14. Medvedev А.Е., Ramsay R.R., Ivanov A.S., Veselovsky A.V., Shvedov V.I., Tikhonova O.V., Barradas A.-P. V., Davidson С. K., Moskvitina T.A., Fedotova O.A., Axenova L.N. Inhibition of monoamine oxidase by pirlindole analogues: 3D-QSAR analysis. // Neurobiology. 1999. 7. 2. 151158.

15. Ivanov A.S., Shkrob A.M., Skvortsov V.S., Dubanov A.V., Veselovsky A.V., Belkina N.V. (1999) The Information System on Molecular Recognition in Protein-Ligand Complexes. // Ch. Freytag and V. Wolfengagen (Eds.): CSIT'99, Proceedings of 1st International Workshop on Computer Science and Information Technologies, January 18-22, 1999, Moscow, Russia. MEPhI Publishing, ISBN 5-7262-0263-5

16. Веселовский A.B., Медведев A.E., Тихонова O.B., Скворцов B.C., Иванов А.С. Моделирование субстрат-связывающей области активного центра моноаминоксидазы А.//Биохимия. 2000.65. 8.1072-1079.

17. Веселовский А.В., Медведев А.Е., Тихонова О.В., Скворцов B.C., Иванов А.С. Метод моделирование полости активных центров ферментов. // VII Российский национальный конгресс "Человек и лекарство". 10-14 апреля 2000. Москва. 2000. С. 481.

18. Medvedev А.Е., Ivanov A.S., Veselovsky А V. Computer visualisation of

the active site of monoamine oxidase A by means of selective inhibitors. // In: 9th Internat. Amine Oxidase Workshop. Amine oxidases: enzymes with novel functions? 9-12 July 2000. Barselone. 2000.28.

19. Ooms F., Wouters J., Durant F., Ramsay R., Veselovsky A., Tikhonova O., Ivanov A., Medvedev A. Molecular interaction of pirlindole analogues with the monoamine oxidase type A. // In: 9th Internat. Amine Oxidase Workshop. Amine oxidases: enzymes with novel functions? 9-12 July 2000. Barselone. 2000. 126.

20. Medvedev A.E., Ivanov A.S., Veselovsky A.V. Selective inhibitors and computer modelling of the active site of monoamine oxidase. // Neurobiology. 2000. 8. 2.201-214.

21. Tikhonova O.V., Veselovsky A.V., Medvedev A.E., Ivanov A.S. Modelling of mould of MAO A substrate/inhibitor binding site. II In: 7th internat. summer school on biophysics "Supramolecular structure and function" 1425 September 2000. Rovinj. 2000. 135.

22. Tikhonova O.V., Veselovsky A.V., Medvedev A.E., Ivanov A.S. Models of monoamine oxidase A and В active sites Obtained by Using 3D QSAR with CoMFA Analysis. // Molecular Simulation. 2000.24.4-6. 379-389.

23. Medvedev A.E., Ivanov A.S., Veselovsky A V. Active site of monoamine oxidase A: computer visualisation using selective inhibitors. // In: "Monoamine oxidases, milestones in deprenyl research", 2000, Medicina Publisher House Co., Budapest, (Eds. K.Magyar, E.S.Vizi). 33-50.

24. Veselovsky A.V., Tikhonova O.V., Skvortsov V.S., Medvedev A.E., Ivanov A.S. An Approach for Visualization of Active Site of Enzymes with Unknown Three-Dimensional Structures. // QSAR and SAR in Environmental Research. 2001. 12. 345-358.

25. Медведев A. E., Иванов A.C., Веселовский А. В. Одна аминокислота не может определять различия каталитических и регуляторных свойств митохондриальных моноаминоксидаз А и Б. // Биохимия. 2001. 66. 5. 718-720.

26. Веселовский А.В., Тихонова О.В., Иванов А.С., Медведев А.Е. Моделирование активного центра моноаминоксидазы типа Б методом построения слепка. // Вопросы медицинской химии. 2001. 47. 6. 642651.

27. Medvedev A., Ooms F., Buneeva О., Veselovsky A., Tikhonova О., Ivanov A., Ramsay R., Wouters J. Molecular interaction of pirlindole analogues with the monoamine oxidase type A. // 4th INTAS Interdisciplinary Symposium on Physical and Chemical methods in Biology, Medicine, and Environment (grant monitoring conference) Moscow University and INTAS Secretariat, Moscow, 2001.

28. Веселовский A.B., Тихонова O.B., Скворцов B.C., Медведев А.Е. Иванов А.С. Сравнительный анализ пространственных структур моноаминоксидазы с моделями активных центров этих ферментов. // IX Российский национальный конгресс "Человек и лекарство". 8-12

апреля 2002. Москва. 2002.594.

29. Иванов А.С., Дубанов А.В., Веселовский А.В., Скворцов B.C., Арчаков А.И. Компьютерное конструирование лекарств на основе структуры белка-мишени в посттеномную эру. // IX Российский национальный конгресс "Человек и лекарство". 8-12 апреля 2002. Москва. 2002.619.

30. Веселовский А.В., Скворцов B.C., Медведев А.Е. Иванов А.С. Сопоставление пространственной структуры моноаминоксидазы Б с компьютерной моделью активного центра этого фермента. // I Национальная конференция «Информационно-вычислительные технологии в решении фундаментальных научных проблем и прикладных задач химии, биологии, фармацевтики, медицины», Москва, 2002.21.

31. Veselovsky A.V., Tikhonova O.V., Ivanov A.S., Medvedev A.E. Computer moulding of monoamine oxidase: the way for discovery of new inhibitors? // Int. conference "Genomics, proteomics and bioinformatics for Medicine". June 22-30,2002. St.Petersburg-Moscow, Russia. 58.

32. Medvedev A. E., Ivanov A. S., Veselovsky A. V. Computer visualisation of the active site of monoamine oxidase A by means of selective inhibitors. // Inflammopharmacology, 2003.11.2.135-143.

33. Veselovsky A.V., Ivanov A.S. Strategy of computer-aided drug design. // Current Drug Targets - Infectious Disorder. 2003.3.33-40.

34. Северина И.С., Аксенова Л.Н., Веселовский A.B., Пятакова Н.В., Бунеева О.А., Иванов А.С., Медведев А.Е. Неселективное ингибирование моноаминоксидаз А и Б активаторами растворимой гуанилатциклазы. //Биохимия. 2003. 68. 9. 1280-1286.

35. Веселовский А.В., Тихонова О.В., Иванов А.С., Медведев А.Е. Поиск селективных ингибиторов моноаминоксидазы А в молекулярной базе данных. // II Национальная конференция «Информационно-вычислительные технологии в решении фундаментальных научных проблем и прикладных задач химии, биологии, фармацевтики, медицины», Москва, 2003.26.

36. Medvedev А.Е., Buneeva О.А., Ivanov A.S., and Veselovsky A.V. The role of specific inhibitors in bio- and computational chemistry of monoamine oxidases. // In: Monoamine Oxidase inhibitors and their role in neurotransmission (drug development). 2003, Medicina Publisher House Co., Budapest, 250-278.

37. Ivanov A.S., Tikhonova O.V., Medvedev A.E., Veselovsky A.V. The use of active site mould for the database mining of new ligands for enzymes with unknown 3D structure: focus on monoamine oxidase A. // 5th International Conference on Molecular Structural Biology, Vienna, 2003.78/P30.

38. Veselovsky A.V., Ivanov A.S., Medvedev A.E. Computer modelling and visualization of active site of monoamine oxidases. // Neurotoxicology 2004.25.1-2. 37-46.

39. Veselovsky A.V., Severina I.S., Buneeva O.A., Ivanov A.S., Medvedev

A.E. Some activators of nitric oxide-stimulated guanylate cyclase regulate monoamine oxidases. // 2nd Int. conference "Genomics, proteomics and bioinformatics for Medicine". July 14-19, 2004. Moscow-Pies-Moscow, Russia. P. Suppl_6.

40. Веселовский A.B. Ингибиторы двойного действия моноаминоксидазы и ацетилхолинэстеразы как потенциальные лекарственные препараты при лечении болезни Альцгеймера. // Биомедицинская химия. 2004. Т. 50. №3. С. 314-317.

41. Смолинская Ю.Ю., Веселовский А.В., Иванов А.С. Полноатомная компьютерная модель бислойной мембраны с МАО А. // Биомедицинская химия. 2004. 50. 451-459.

Работа была поддержана РФФИ (гранты 99-04-48822, 01-04-48128 и 03-04-48244) и INTAS (грант 99-00433).

РНБ Русский фонд

2007-4 17901

■i 1 J i.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Веселовский, Александр Владимирович

1. Введение.

1.1. Актуальность проблемы.

1.2. Научная новизна и практическая значимость.

1.3. Апробация работы.

1.4. Основные положения, выносимые на защиту.

2. Обзор литературы.

2.1. Моноаминоксидаза.

2.1.1. Физиология МАО.

2.1.1.1. Распределение в клетках и тканях.

2.1.1.2. Функции МАО.

2.1.1.3. Регуляция.

2.1.2. Биохимия МАО.

2.1.2.1. Субстраты.

2.1.2.2. Механизмы и кинетика реакций, катализируемые МАО.

2.1.3. Молекулярная биология МАО.

2.1.3.1. Генная структура и локализация.

2.1.3.2. Функциональные участки.

2.1.3.2.1. Динуклеотид-связывающая область.

2.1.3.2.2. Первый дополнительный участок связывания ФАД.

2.1.3.2.3. Второй дополнительный ФАД-связывающий участок.

2.1.3.2.4. Активные центры МАО А и Б.

2.1.3.2.5. Другие функционально важные аминокислотные остатки.

2.1.3.2.6. Мембранный якорь.

2.1.3.3. Пространственная структура МАО Б.

2.1.3.4. Пространственная структура МАО А.

2.1.4. Медицинская химия МАО (ингибиторы).

2.2. Методы компьютерного конструирования лекарств. Общие положения.

2.2.1. Прямые методы компьютерного конструирования лекарств

2.2.1.1. Скрининг баз данных низкомолекулярных соединений.

2.2.1.2. Конструирование новых лигандов молекулярно-графическими методами.

2.2.2. Непрямые методы конструирования лекарств.

2.2.3. Взаимосвязь разных подходов и их связь с экспериментом

2.2.4. Компьютерное моделирование МАО и ее ингибиторов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Компьютерное моделирование активных центров моноаминоксидаз и создание ингибиторов с заданной селективностью"

1.1. Актуальность проблемы.

Развитие биомедицинской химии, связанной с теоретической и клинической медициной, требует изучения и анализа структуры и функций ключевых ферментов клеточного метаболизма. Одно из основных направлений в этих исследованиях связано с использованием компьютерных технологий для анализа данных, планирования экспериментов и обработки их результатов. Заметное место в этих подходах занимает компьютерное моделирование структуры биологических молекул, их взаимодействия друг с другом, поиск новых биологически активных соединений. Данная область исследований получила название «компьютерное конструирование лекарств» [Маггопе е1 а1, 1997; Zeng, 2000]. Использование компьютерных технологий для визуализации пространственных структур макромолекул, моделирования взаимодействия макромолекул с низкомолекулярными лигандами, оценки энергии взаимодействия, моделирования новых соединений и предсказания их свойств позволяет значительно ускорить создание новых лекарственных препаратов [Маггопе (Л а1, 1997; 2000].

Wouters, 1998]. В организме МАО А и МАО Б, по-видимому, выполняют разные функции, на что указывают различная локализация ферментов в тканях и преимущественное окисление определенных субстратов [Abell, Kwan, 2001].

Изменение активности этого фермента обнаружено при многих нервно-психических расстройствах (болезни Паркинсона и Альцгеймера, депрессии и др.) [Wouters, 1998; Горкин, Медведев, 1995; Jegham, George, 1998 Yamada, Yasuhara, 2004]. Применение ингибиторов МАО в клинической практике дает выраженный терапевтический эффект и нормализацию состояния больных. Ингибиторы МАО А (такие как моклобемид, брофаромин, пиразидол, тетриндол и др.) нашли свое применение в качестве антидепрессантов, а некоторые ингибиторы МАО Б (например, депренил) применяются для лечения болезни Паркинсона [Cesura, Pletscher, 1992; Blanco et al., 2002; Chiap et al., 2002]. Возможно применение ингибиторов МАО в лечении алкогольной и никотиновой зависимостей [Domino, 1996; Farren et al., 1998]. Поэтому разработка новых ингибиторов этих ферментов остается актуальной задачей [Tipton, 1989; Типтон, 1997; Tipton, 2000].

Долгое время разработку новых эффективных ингибиторов МАО сдерживало отсутствие информации о пространственных структурах этих ферментов. Поэтому исследователи с помощью различных экспериментальных методов пытались выявить структурные особенности этих белков: были определены аминокислотные последовательности различных моноаминоксидаз, процентное содержание вторичных структур в белковой глобуле, место ковалентного связывания кофактора - флавинаденилдинуклеотид (ФАД) - с белком [Wouters, 1998]. В результате анализа последовательностей, конструирования химерных молекул и точечного мутагенеза были предсказаны участки белка, ответственные за нековалентное связывание флавинового кофактора [Zhou et al., 1995; Tsugeno et al., 1995; Chen et al., 1996; Grimsby et al., 1996]. Было установлено несколько ключевых аминокислот, ответственных за связывание субстрата и участие в катализе [Tsugeno, Ito, 1997; Geha et al., 2001; Cesura et al., 1998]. Однако использование косвенных экспериментальных данных не позволяло оценить структуру и свойства активных центров МАО А и МАО Б. Даже появившиеся в 2002 и 2004 годах пространственные структуры МАО Б [Втёа еХ а1., 2002] и МАО А [Ма е1 а1., 2004] оставляют нерешенными многие вопросы об особенностях их взаимодействия с различными ингибиторами.

Отсутствие данных о пространственных структурах этих ферментов и наличие большого числа обратимых и механизм-активируемых ингибиторов этих ферментов стимулировало активное применение методов компьютерного моделирования для анализа особенностей строения этих ферментов.

Таким образом, к началу данного исследования, существовавшие данные о строении МАО А и МАО Б, не позволяли охарактеризовать пространственные структуры их активных центров, что значительно препятствовало поиску новых эффективных ингибиторов этих ферментов.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Проанализировать репрезентативные ряды низкомолекулярных лигандов МАО А и Б и определить общие черты и особенности структур лигандов для каждого типа ферментов.

2. Провести анализ структуры активных центров МАО А и Б методом ЗО-С^АИ. с использованием ингибиторов, отличающихся механизмом действия и относящихся к разным химическим классам.

3. Разработать метод моделирования полости активного центра фермента с неизвестной трехмерной структурой и проверить корректность подхода на примере ферментов с известной пространственной структурой.

4. Построить модели активных центров МАО А и Б.

5. Провести поиск новых базовых структур ингибиторов МАО А и Б с заданной селективностью.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Веселовский, Александр Владимирович

6. ВЫВОДЫ

1. Разработан подход для компьютерного анализа структур активных центров ферментов с неизвестной пространственной структурой и поиску новых базовых структур ингибиторов этих ферментов. Он включает: а) анализ структур конкурентных обратимых ингибиторов с ограниченной конформационной подвижностью; б) преимущественную оценку стерического фактора, определяющего возможность размещения лиганда в активном центре; в) построение компьютерных моделей активного центра фермента, отражающих его форму и размеры; г) проверку достоверности моделей с использованием близких аналогов с разными размерами и отличающихся ингибиторной активностью; д) поиск лигандов в молекулярных базах данных с использованием таких моделей; е) экспериментальную проверку новых ингибиторов. Эффективность использования данного подхода продемонстрирована в прямых экспериментах на фармакологически важном объекте — моноаминоксидазах типа А и Б.

2. На основе анализа репрезентативных рядов конкурентных ингибиторов МАО А и МАО Б были построены: а) фармакофорные модели, характеризующие причины различной селективности торможения активности ферментов разными ингибиторами; б) ЗО-С^БАК и СоМБА модели активных центров МАО А и Б (на основе нескольких рядов ингибиторов), позволяющие проводить первичную компьютерную оценку эффективности новых ингибиторов этих ферментов; в) слепки полостей активных центров МАО А и МАО Б, позволяющие оценивать форму и размеры активных центров и проводить поиск новых лигандов в молекулярных базах данных методом молекулярного докинга.

3. Осуществлен поиск новых ингибиторов МАО: а) методом докинга структур из молекулярной базы данных в слепок активного центра МАО А с последующей оценкой по ЗО-С^БАК и СоМБА моделям найдены ранее не использованные ингибиторы этого фермента. Рандомизированная выборка (-20%) из списка потенциальных ингибиторов была экспериментально проверена и показана высокая эффективность данного подхода (все соединения проявляли МАО А ингибиторную активность; лучшее соединение имело 1С50 ~ 80 мкМ); б) методом докинга структур из молекулярной базы данных в пространственную структуру активного центра МАО Б с последующей оценкой энергий связывания и ингибиторной активности по ЗО-С^АИ. и СоМРА моделям найдены новые соединения ингибирующие этот фермент, с активностью (1С50) в субмикромолярном диапазоне. Лучшее соединение имело ингибиторную активность < 10 мкМ; в) среди производных бензофуроксана были найдены неселективные ингибиторы МАО с 1С50 в микромолярном уровне.

7. СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

2. Иванов A.C., Веселовский A.B., Тихонова O.B., Медведев А.Е. Анализ взаимосвязи структура-активность производных пиразидола - ингибиторов моноаминоксидазы типа А и В. // Тезисы IV Российского Национального Конгресса "Человек и лекарство", Москва, 1997.

5. Ivanov A.S., Skvortsov V.S., Tikhonova O.V., Veselovsky A.V., Archakov A.I. Database mining for ligands of drug oxidizing enzymes: the ways in binding site description. // In: 12 Internal Symposium on Microsomes and Drug Oxidations, 20-24 July 1998. Montpellier, France. 1998. 259.

7. Medvedev A.E., Ramsay R,, Ivanov A.S., Shvedov V.I., Veselovsky A.V., Tikhonova O.V., Moskvitina T.A., Fedotova O.A., Axenova L.N. Inhibition of monoamine oxidase by pirlindole analogues: 3D-QSAR and CoMFA analysis. // In:Internat. 8th Amine Oxidase Workshop. 6-10 September 1998. Hungary

8. Веселовский A.B., Иванов A.C., Медведев A.E. Может ли одна аминокислота определять различие каталитических и регуляторных свойств моноаминоксидаз А и Б? // Биохимия. 1998. 63. 12. 1695-1701.

Ю.Иванов A.C., Веселовский A.B., Арчаков А.И. Высокоэффективный поиск новых физиологически активных соединений: компьютеры и эксперимент. // Тезисы V Российского Национального Конгресса "Человек и лекарство", Москва, 1999. С. 410-411.

П.Иванов А.С., Скворцов B.C., Веселовский А.В., Арчаков А.И. Методы молекулярного докинга в компьютерном конструировании лекарств. // Тезисы V Российского Национального Конгресса "Человек и лекарство", Москва, 1999. С. 411.

12. Tikhonova O.V., Veselovsky A.V., Medvedev А.Е., Ivanov A.S. Models of monoamine oxidase A and В active sites Obtained by Using 3D QSAR with CoMFA Analysis. // The Electronic Conference "Molecular Simulation'99" on the Internet and World Wide Web (http://molsim.vei.co.uk) 19 April - 4 May, 1999. Virtual Environments International Ltd (VEI), Oxford Centre for Innovation, Oxford, OX1 3HS, UK.

13.Веселовский A.B., Медведев A.E., Тихонова O.B., Скворцов B.C., Москвитина Т.А., Аксенова Л.Н., Иванов А.С. Анализ структур активных центров моноаминоксидаз А и Б методами компьютерного моделирования. // Вопросы медицинской химии. 1999. 45. 5. 436.

14. Medvedev А.Е., Ramsay R.R., Ivanov A.S., Veselovsky A.V., Shvedov V.I., Tikhonova O.V., Barradas A.-P. V., Davidson С. K., Moskvitina T.A., Fedotova

О.А., Axenova L.N. Inhibition of monoamine oxidase by pirlindole analogues: 3D-QSAR analysis. //Neurobiology. 1999. 7. 2. 151-158.

15.Ivanov A.S., Shkrob A.M., Skvortsov V.S., Dubanov A.V., Veselovsky A.V., Belkina N.V. (1999) The Information System on Molecular Recognition in Protein-Ligand Complexes. // Ch. Freytag and V. Wolfengagen (Eds.): CSIT'99, Proceedings of 1st International Workshop on Computer Science and Information Technologies, January 18-22, 1999, Moscow, Russia. MEPhI Publishing, ISBN 5-7262-0263-5

16.Веселовский A.B., Медведев A.E., Тихонова O.B., Скворцов B.C., Иванов А.С. Моделирование субстрат-связывающей области активного центра моноаминоксидазы А. // Биохимия. 2000. 65. 8. 1072-1079.

18.Medvedev А.Е., Ivanov A.S., Veselovsky А V. Computer visualisation of the active site of monoamine oxidase A by means of selective inhibitors. // In: 9th Internat. Amine Oxidase Workshop. Amine oxidases: enzymes with novel functions? 9-12 July 2000. Barselone. 2000. 28.

19.0oms F., Wouters J., Durant F., Ramsay R., Veselovsky A., Tikhonova O., Ivanov A., Medvedev A. Molecular interaction of pirlindole analogues with the monoamine oxidase type A. // In: 9th Internat. Amine Oxidase Workshop. Amine oxidases: enzymes with novel functions? 9-12 July 2000. Barselone. 2000. 126.

20. Medvedev A.E., Ivanov A.S., Veselovsky A.V. Selective inhibitors and computer modelling of the active site of monoamine oxidase. // Neurobiology. 2000. 8. 2. 201-214.

21. Tikhonova O.V., Veselovsky A.V., Medvedev A.E., Ivanov A.S. Modelling of mould of MAO A substrate/inhibitor binding site. // In: 7th internat. summer school on biophysics "Supramolecular structure and function" 14-25 September

2000. Rovinj. 2000. 135.

22.Tikhonova O.V., Veselovsky A.V., Medvedev A.E., Ivanov A.S. Models of monoamine oxidase A and В active sites Obtained by Using 3D QSAR with CoMFA Analysis. // Molecular Simulation. 2000. 24.4-6. 379-389.

23.Medvedev A.E., Ivanov A.S., Veselovsky A V. Active site of monoamine oxidase A: computer visualisation using selective inhibitors. // In: "Monoamine oxidases, milestones in deprenyl research", 2000, Medicina Publisher House Co., Budapest, (Eds. K.Magyar, E.S.Vizi). 33-50.

2001. 12.345-358.

25.Медведев A. E., Иванов A.C., Веселовский А. В. Одна аминокислота не может определять различия каталитических и регуляторных свойств митохондриальных моноаминоксидаз А и Б. // Биохимия. 2001. 66. 5. 718720.

27. Medvedev A., Ooms F., Buneeva О., Veselovsky A., Tikhonova О., Ivanov А., Ramsay R., Wouters J. Molecular interaction of pirlindole analogues with the monoamine oxidase type A. // 4th INTAS Interdisciplinary Symposium on Physical and Chemical methods in Biology, Medicine, and Environment (grant monitoring conference) Moscow University and INTAS Secretariat, Moscow, 2001.

Российский национальный конгресс "Человек и лекарство". 8-12 апреля 2002. Москва. 2002. 594.

29. Иванов А.С., Дубанов А.В., Веселовский А.В., Скворцов B.C., Арчаков А.И. Компьютерное конструирование лекарств на основе структуры белка-мишени в постгеномную эру. // IX Российский национальный конгресс "Человек и лекарство". 8-12 апреля 2002. Москва. 2002. 619.

31. Veselovsky A.V., Tikhonova O.V., Ivanov A.S., Medvedev А.Е. Computer moulding of monoamine oxidase: the way for discovery of new inhibitors? // Int. conference "Genomics, proteomics and bioinformatics for Medicine". June 2230, 2002. St.Petersburg-Moscow, Russia. 58.

32. Medvedev A. E., Ivanov A. S., Veselovsky A. V. Computer visualisation of the active site of monoamine oxidase A by means of selective inhibitors. //

Inflammopharmacology, 2003. 11. 2. 135-143.

33.Veselovsky A.V., Ivanov A.S. Strategy of computer-aided drug design. // Current Drug Targets -Infectious Disorder. 2003. 3. 33-40.

34. Северина И.С., Аксенова JI.H., Веселовский A.B., Пятакова Н.В., Бунеева О.А., Иванов А.С., Медведев А.Е. Неселективное ингибирование моноаминоксидаз А и Б активаторами растворимой гуанилатциклазы. // Биохимия. 2003. 68. 9. 1280-1286.

35.Веселовский А.В., Тихонова О.В., Иванов А.С., Медведев А.Е. Поиск селективных ингибиторов моноаминоксидазы А в молекулярной базе данных. // II Национальная конференция «Информационно-вычислительные технологии в решении фундаментальных научных проблем и прикладных задач химии, биологии, фармацевтики, медицины», Москва, 2003. 26.

36.Medvedev А.Е., Buneeva О.А., Ivanov A.S., and Veselovsky A.V. The role of specific inhibitors in bio- and computational chemistry of monoamine oxidases. // In: Monoamine Oxidase inhibitors and their role in neurotransmission (drug development). 2003, Medicina Publisher House Co., Budapest, 250-278.

38.Veselovsky A.V., Ivanov A.S., Medvedev A.E. Computer modelling and visualization of active site of monoamine oxidases. // Neurotoxicology 2004. 25. 1-2. 37-46.

39. Veselovsky A.V., Severina I.S., Buneeva O.A., Ivanov A.S., Medvedev A.E. Some activators of nitric oxide-stimulated guanylate cyclase regulate monoamine oxidases. // 2nd Int. conference "Genomics, proteomics and bioinformatics for Medicine". July 14-19, 2004. Moscow-Pies-Moscow, Russia. P. Suppl6.

40.Веселовский A.B. Ингибиторы двойного действия моноаминоксидазы и ацетилхолинэстеразы как потенциальные лекарственные препараты при лечении болезни Альцгеймера. // Биомедицинская химия. 2004. Т. 50. № 3. С. 314-317.

41.Смолинская Ю.Ю., Веселовский А.В., Иванов А.С. Полноатомная компьютерная модель бислойной мембраны с МАО А. // Биомедицинская химия. 2004.50. 451-459.

2.3. Заключение.

Таким образом, моноаминокидаза ключевой фермент в мозгу и периферических тканях, которая катализирует реакцию окислительного дезаминирования важнейших медиаторных моноаминов. Изменение активности этого фермента при многих нервно-психических расстройствах и возможность их коррекции специфическими ингибиторами сделали МАО популярным объектом фундаментальных и клинических исследований.

В организме млекопитающих и человека МАО существует в двух родственных формах — МАО А и МАО Б, — которые кодируются высокогомологичными генами, и различаются по субстратной специфичности и чувствительности к ингибиторам. Селективные ингибиторы МАО А используются в клинической практике в качестве антидепрессантов, а депренил — селективный ингибитор МАО Б - применяется при лечении болезни Паркинсона.

Несмотря на многолетнюю историю создания нескольких поколений ингибиторов МАО, применявшихся и применяющихся по сей день в клинической практике, принято считать, что необратимые ингибиторы первого поколения (например, ипрониазид), неизбирательно тормозившие оба типа фермента, были самыми эффективными лекарственными препаратами этого типа. Их широкому применению мешал высокий риск развития серьезных побочных эффектов. Поэтому стратегия создания эффективных лекарственных средств-ингибиторов МАО длительное время предусматривала разработку обратимых селективных ингибиторов МАО А и МАО Б. Однако несмотря на большое количество разработанных селективных обратимых ингибиторов этих ферментов эффективность их остается ниже, по сравнению с необратимыми ингибиторами. Поэтому поиск новых обратимых ингибиторов этих ферментов остается актуальной задачей. Эффективной разработке новых поколений ингибиторов МАО долгое время сдерживало отсутствие информации о пространственной структуре этих ферментов. Косвенные методы, такие как анализ первичной последовательности, конструирование химерных молекул, направленный мутагенез, не давали ответа о структурных особенностях их строения. Это стимулировало использование компьютерных технологий для предсказания структуры активных центров МАО и поиска новых лигандов этих ферментов. Развитию данного направления в исследовании моноаминоксидаз и была посвящена данная работа.

3. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ

3.1. Объекты

В работе использовали пространственные структуры МАО Б в комплексе с ингибиторами (pdblgos, pdbloja, pdblojb, pdblojc, pdblojd, pdbloj9, pdbls2q, pdbls2y, pdbls3e, pdbls3b), МАО А в комплексе с хлоргилином (lo5w), 18 комплексов протеазы вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) с ингибиторами, а также модели МАО A (pdblh8q) и МАО Б (pdblh8r), депонированные в базе данных белков Protein Data Bank (PDB) [Berman, 2000].

Анализ взаимосвязи «структура-активность» проводили на трех рядах ингибиторов МАО А и Б из различных химических классов: 37 производных пиразинокарбазола, 24 аналога индола и изатина и 32 производных карбобензоксиэтиламина (КЭА), анилида ß-аланина (АА) и карбобензоксиэтилдиамина (КЭДА). Эти соединения были синтезированы (В.Шведовым, В.С.Вележевой, В.Ф.Поздневым) и охарактеризованы на ингибиторную активность и обратимость взаимодействия с ферментами. Общие структуры соединений представлены на рисунке 23.

Данные о структурах и ингибиторной активности известных конкурентных ингибиторов МАО А и Б были получены из базы данных низкомолекулярных соединений MDL Drug Data Report (MDDR) компании MDL Information Systems [ISIS™/Base, 1997] и из различных литературных источников.

Поиск новых потенциальных ингибиторов МАО проводили в базе данных коммерчески доступных низкомолекулярных соединений ASINEX (www.asinex.ru).

Производные пиразино-карбазола ХШ "сер

Аналоги индола и изатина "ТХС 1 Я1

Аналоги КЭА, АА и КЭДА яз о яз Ю О

Рисунок 23. Базовые структуры производных пиразинокарбозола, производных индола и изатина и аналогов карбобензоксиэтиламина (КЭА), анилида Р-аланина (АА) и карбобензоксиэтилдиамина (КЭДА).

Анализ активностей МАО А и МАО Б проводили в суспензии митохондрии печени крысы, которые выделяли традиционным методом дифференциального центрифугирования [Medvedev et al., 1994]. Выделенные митохондрии промывали и суспендировали в 50 мМ фосфатном буфере, рН 7,4 и хранили при температуре -20°.

3.2. Методы

Основные вычисления проводили с использованием молекулярно-графического пакета Sybyl (Sybyl 6.3-6.9) фирмы Tripos, Inc [SYBYL].

Трехмерные модели молекул оптимизировали с использованием стандартного поля сил Tripos (Sybyl).

Геометрические размеры молекул определяли путем построения прямоугольной ячейки вокруг молекул с использованием программы HyperChem 4.5 (Hypercube Inc., Канада). Размеры минимальной ячейки, в которой может поместиться молекула, рассматривали как ее геометрические размеры (рис. 24).

Поиск конформаций молекул выполняли с помощью программы RANDOM SEARCH пакета Sybyl со следующими параметрами: максимальное количество итераций поиска - 200; максимальное количество шагов минимизации - 300; процедура минимизации останавливалась при достижении градиента энергии между итерациями меньшем, чем 0,05 ккал/(моль-А), или если один и тот же конформер обнаруживался 8 раз. Конформеры считались идентичными, если среднеквадратичное отклонение (RMSD, Root Mean Squared Displacement) не превышало 0,4 А. Не рассматривались конформеры, энергия которых превышала 80 ккал/моль.

Пространственное выравнивание низкомолекулярных соединений относительно друг друга проводили совмещением центров атомов при помощи процедуры Fit atom пакета Sybyl. Пространственное выравнивание белковых молекул проводили по Ca атомам с использованием программы MULTIFIT пакета Sybyl.

Модели фармакофоров строили в программе DISCO пакета Sybyl, со следующими параметрами: количество возможных фармакофорных точек - от 2 до 6; шаг допустимого отклонения между фармакофорными точками - от 0,5 до 5 А через 0,5 А.

Величину гидрофобности молекул рассчитывали по методу Моригучи [Moriguchi et al., 1994].

3D QSAR анализ проводили с использованием модуля CoMFA пакета Sybyl. В качестве зависимой переменной использовался отрицательный десятичный логарифм величины IC50. Поля CoMFA рассчитывали со следующими параметрами: размер параллелепипеда устанавливался автоматически; шаг решетки - 2 А; пробный атом для стерических полей -углерод в sp3-гибридизации; пробный заряд для электростатических полей - +1; пробный атом для донорно-акцепторных полей - нейтральный атом водорода.

Регрессионный анализ методом наименьших квадратов проводился в два этапа. На первом этапе при анализе в режиме скользящего контроля выбиралось л оптимальное количество компонентов, при котором R cv был бы больше 0,4, a scv была минимальной. На втором этапе проводили анализ без скользящего контроля с выбранным количеством компонентов. На основе этого анализа строили карты распределения полей.

Докирование молекул выполняли при помощи программы DockSearch [Скворцов, 1998] со следующими параметрами: число точек на поверхности каждого атома - 42; угол вращения молекулы вокруг каждой из осей - 20 градусов; разрешение трехмерной решетки аппроксимации 0,2 А; допустимая величина стерических пересечений молекул - 0 А; радиус сферы зонда - 1,4 А; радиус сферы атома - 1,6 А; первичный отбор гипотетических комплексов проводили по величине скрытой поверхности лиганда или по величине пересечения поверхности лиганда с поверхностью места связывания (90 % от максимально полученного значения); допустимое среднеквадратичное отклонение расстояний между атомами лигандов в гипотетических комплексах в пределах одного кластера - 1,5 А.

Оптимизацию положения лиганда в активном центре проводили методом минимизацией энергии комплексов фермент-лиганд в программе LeapFrog из пакета программ SYBYL. Для этого в программе были разрешены только поступательные движения лигандов и их повороты с оценкой энергии взаимодействия после каждого шага. За положения лиганда в активном центре принималось положение с максимальной энергией взаимодействия.

Молекулярную поверхность белка строили с помощью программы MOLCAD из пакета программ SYBYL по методу Колмана. Молекулярную поверхность активного центра фермента определяли с помощью функции программы MOLCAD Multichannel. Радиус пробного атома был 1,4 А. За аминокислоты, формирующие структуру активного центра, принимались аминокислотные остатки, расположенные на расстоянии менее 4 А от молекулы ингибитора.

Активность МАО определяли радиометрическим методом по накоплению [14С]альдегидов, образующихся в ходе ферментативного окисления [14С]аминов как описано ранее [Позднев и др., 2000; Medvedev et al., 1994]. В качестве субстратов для МАО А и Б использовали соответственно 0,1 мМ [14С]5-гидрокситриптамин (серотонин) и 5 мкМ [14С]-фенилэтиламин ("Amersham", Англия).

Ингибиторную активность соединений определяли после 30-минутной преинкубации ингибиторов с митохондриями при 37°, используя диапазон концентраций 10"9 - 10"3 М. Такой подход широко применяется при первичном анализе потенциальных ингибиторов МАО [Da Prada et al., 1989]. Для сопоставления ингибиторной активности исследованных соединений рассчитывали значения 1С50 (концентрация, вызывающая 50% торможение активности фермента).

Исследуемые вещества первоначально растворяли в диметилсульфоксиде в концентрации 10 мМ, все последующие разведения этих исходных растворов готовили на дистиллированной воде. В контрольные пробы добавляли эквивалентные объемы соответствующим образом приготовленного растворителя.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ

Отправной точкой данного исследования стало наблюдение, что существует зависимость между геометрическими размерами производных индола и изатина и величиной их ингибиторной активности в отношении МАО А и МАО Б [Medvedev et al., 1995]. К этому времени был уже известен ряд структурных закономерностей у субстратов, определяющих эффективность их дезаминирования моноаминоксидазами. Было отмечено, что более гидрофобные субстраты являются предпочтительными для МАО Б, а МАО А эффективнее окисляет более длинные субстраты [Singer, 1985; Cesura, Pletscher, 1992]. Был проведен ряд исследований по анализу взаимосвязи структура-активность для суицидных субстратов - производных МФТП [Maret et al., 1990; Ahornare et al., 1992]. Они подтвердили ранние наблюдения, что длинные субстраты лучше окисляются МАО А, а для МАО Б более предпочтительными являются соединения с повышенной гидрофобностью. Однако возникает вопрос: связаны ли наблюдаемые закономерности со структурами самих лигандов или с продуктами их метаболизма?

Анализ репрезентативного набора эффективных обратимых ингибиторов МАО А и МАО Б из разных химических классов позволил построить фармакофорные модели для этих ферментов. Данные модели предсказывают основные общие структурные элементы ингибиторов, которые определяют «узнавание» лигандов активными центрами ферментов. Таких элементов оказалось всего по два для каждого типа МАО. Малое количество фармакофорных элементов согласуется с широкой субстратной и ингибиторной специфичностью данного фермента (Горкин, 1983; Рамсей, 1987). Фармакофорные модели для ингибиторов МАО А и МАО Б представлены на рисунке 25. Фармакофорная модель ингибиторов МАО А (рис. 25А) включает ароматическое кольцо и расположенный рядом гетероатом (азот или кислород), обладающий частичным отрицательным зарядом. Фармакофорная модель МАО

Рисунок 25. Фармакофорные модели МАО А и МАО Б. Заштрихованными кругами отмечены фармакофорные элементы.

Б (рис. 25Б) отличается от МАО А только тем, что гетероатом отодвинут от ароматического кольца на один или два углеродных атома. Такое незначительное различие фармакофорных моделей проявляется в относительной селективности большинства ингибиторов этих ферментов, когда с увеличением концентрации ингибитор начинает действовать на обе формы фермента. Это обстоятельство необходимо было учитывать при анализе взаимодействия ингибиторов с МАО.

4.1. Построение ЗО-С^АК. и СоМРА моделей активных центров МАО А и Б.

Для описания структуры и свойств активного центра фермента методами ЗО-С^АЯ и СоМРА желательно использовать наборы соединений из различных химических классов. Это позволит, с одной стороны, получить детальное представление о структуре активного центра (наборы из одного класса редко могут полностью охарактеризовать пространство вокруг этих молекул), а с другой - получить дополнительный критерий оценки правильности построенных моделей (распределение полей, полученных в разных ЗБ-С>8А11 анализах не должны противоречить друг другу).

Для анализа структур активных центров МАО А и Б методами ЗО-С^АЯ с модулем СоМРА использовали следующие группы ингибиторов этих ферментов (рис. 23):

1)производные индола и изатина (модель 1),

2)производные пиразинокарбазола (модель 2),

3)производные карбобензоксиэтиламина (КЭА), анилида р-аланина (АА) и карбобензоксиэтилдиамина (КЭДА) (модель 3).

Эти ингибиторы отличаются как по механизму взаимодействия с ферментом, так и конформационной подвижностью их структур, что в совокупности позволяет более полно описать структуры активных центров МАО А и Б.

4.1.1. ЗО-С^АЯ и СоМРА модели производных индола и изатина.

Производные индола и изатина являются конкурентными обратимыми ингибиторами МАО А и Б [Ме(1уе(1еу ег а1, 1995], имеющие диапазон 1С50 от 10"3 до 10"6 М. Структуры соединений, использованных в анализе, представлены в таблице 6. Ранее анализ ингибиторной активности этих соединений для МАО А и МАО Б показал, что они могут быть условно разделены на две группы [Меёуеёеу et а1, 1995]. К первой группе относятся производные с заместителями по С2 или СЗ положениям в изатине; ко второй - аналоги с заместителями по С5. Для соединений первой группы было показано, что они проявляют высокую ингибиторную активность при наличии плоского заместителя, расположенного в плоскости индольного ядра. Химическая природа заместителя при этом не столь важна. Все соединения, проявляющие ингибиторную активность в отношении МАО А, имеют максимальные размеры 11.5x5.6x1.8 А. Причем для заместителя, содержащего фенольное кольцо, снижение ингибиторной активности наблюдается в том случае, когда модификация этого кольца изменяет плоскую геометрию молекулы. Любой заместитель в положении СЗ (см. табл. 6) ухудшает ингибиторные свойства изатиновых производных для МАО Б. Для МАО Б также прослеживается необходимость плоского расположения заместителя и общие размеры молекулы не должны превышать 8.5x5.1x1.8 А. Кроме того, для проявления ингибиторной активности для МАО Б важно распределение электронной плотности в молекуле. Так, в случае фенольных заместителей наибольшая активность наблюдается у соединений с повышенной электронной плотностью в фенольном кольце. Производные изатина с заместителями в положении С5 также соответствовали размерам, необходимым для проявления ингибиторной активности в отношении МАО А. Отсутствие прямой корреляции между активностью и длиной углеводородной цепи заместителя может быть связано с наличием нескольких конформеров этих ингибиторов. Для МАО Б различия в ингибиторной активности производных индола и изатина, по-видимому, связаны с различием в распределении электронной плотности в молекулах [Ме(1уе<1еу а1, 1995].

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Веселовский, Александр Владимирович, Москва

1. Белкина Н.В., Скворцов B.C., Иванов A.C., Арчаков А.И. Моделирование трехмерной структуры цитохрома Р450 1А2 и поиск его новых лигандов. // Вопр. мед. химии. 1998. 44. 464-473.

2. Веревкина И.В., Аснина В.В., Горкин В.З., Машковский М.Д. Селективное ингибирование пиразидолом моноаминоксидазы типа А вразличных тканях человека и животных. // Вопр. мед. химии. 1983. 29. 5. 118-123.

3. Гловер В., Медведев А.Е. Сандлер М. Изатин: возможная роль в функциональном взаимодействии натрийуретических пептидов и моноаминоксидаз. // Вопр. мед. химии. 1997. 43. 515-521.

4. Горкин В.З. Аминоксидазы и их значение в медицине. 1981. М.: Медицина. 333 с.

5. Горкин В.З., Медведев А.Е. Моноаминоксидаза. // В кн.: Белки и пептиды. Т. 1. 1995. М.: Наука. 83-89.

6. Дубанов A.B., Иванов A.C., Арчаков А.И. Компьютерный поиск новых мишеней для действия противомикробных средств на основе сравнительного анализа геномов. // Вопр. мед. химии. 2001. 47. 353-367.

7. Кнолл Дж. История депренила первого селективного ингибитора моноаминоксидазы типа В. // Вопр. мед. химии. 1997. 43. 482-493.

8. Крепец В.В., Белкина Н.В., Скворцов B.C., Иванов A.C. Предсказание связывающей способности белок-лигандных комплексов при помощи нелинейных моделей. // Вопр. мед. химии. 2000. 46. 462-473.

9. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М.: Медицина. 1993. 736 с.

10. Медведев А.Е., Типтон К.Ф. Окислительная модификация моноаминокисдаз. // Вопр. мед. химии. 1997. 43. 471-481.

11. Позднев В.Ф., Аксенова JI.H., Медведев А.Е. Ингибирование моноаминоксидазы N-алкилоксикарбонил производными этилендиамина. // Биохимия. 2000. 65. 1288-1294.

12. Рамсей P.P. Механистические исследования по моноаминоксидазе: значение для МАО А и МАО В in suti. // Вопр. мед. химии. 1997. 43. 457470.

13. Сингер Т.П., Янковская B.JL, Бернард М., Кронин К., Саблин С.О. Выделение и характеризация эволюционного предшественника моноаминоксидаз А и Б человека. // Вопр. мед. химии. 1997. 43. 440-456.

14. Сквайерс Р.Ф. Открытие форм моноаминоксидаз А и Б. // Вопр. мед. химии. 1997. 43.433-439.

15. Скворцов B.C. Молекулярный докинг при исследовании белок-лигандных комплексов. // Дисс. канд. биол. наук. 1998. 96 с.

16. Типтон К.Ф. Ингибиторы моноаминоксидазы и прессорный ответ на пищевые амины. // Вопр. мед. химии. 1997. 43. 6. 494-503.

17. Abdel Samed М.М., Akopyan Zh.I., Veryovkina I.V., Kulygina A.A., Gorkin V.Z. Effect of monoamine oxidase inhibitors on qualitative alterations in enzymatic properties of mitochondrial monoamine oxidases. // Biochem. Pharmacol. 1971. 20. 2571-2577.

18. Abell C. W., Kwan S.-W. Molecular characterization of monoamine oxidase A and B. // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 2001. 65. 129-156.

19. Abell C.W., Stewart R.M., Andrews P.J., Kwan S.-W. // Heterocycles. 39. 933-955.

20. Amzel L.M. Structure-based drug design. // Curr. Opin. Biotechnol. 1998. 9. 366-369.

21. Annan N., Silverman R.B. New analogues of N-(2-aminoethyl)-4-chlorobenzamide (Ro 16-6491). Some of the most potent monoamine oxidase-B inactivators. //J. Med. Chem. 1993. 36. 3968-3970.

22. Arscott L. D., Williams C.H., Schulz C.E. // In: "Flavins and Flavoproteins" (V. Massey and C.H. Williams, eds.), Elsevier North-Holland, Amsterdam, 1982. pp. 44-48.

23. Augen J. The evolving role of information technology in the drug discovery process. // Drug Disc. Today. 2002. 7. 315-323.

24. Babine R.E., Bender S.L. Molecular recognition of protein-ligand complexes: applications to drug design. // Chem. Rev. 1997. 97. 1359-1472.

25. Baumann K. Uniform-length molecular descriptors for quantitative structure-property relationships (QSPR) and quantitative structure-activity relationships

26. QSAR): classification studies and similarity searching. // Trends Anal. Chem. 1999. 18.36-46.

27. Berman H.M., Westbrook J., Feng Z., Gilliland G., Bhat T.N., Weissig H., Shindyalov I.N., Bourne P.E. The Protein Data Bank. // Nucl. Acids Res. 2000. 28. 235-242.

28. Bernard S., Paillat C., Oddos T., Seman M., Milcent R. Selective and potent monoamine oxidase type B inhibitors: substituted semicarbazones and acylhyrazones of aromatic aldehydes and ketones. // Eur. J. Med. Chem. 1995.30.471-482.

29. Berry M.D., Juorio A.V., Paterson I.A. The functional role of monoamine oxidases A and B in the mammalian central nervous system. // Prog.Neurobiol. 1994. 42. 375-391.

30. Bianchi P., Seguelas M.H., Parini A., Cambon C. Activation of pro-apoptotic cascade in renal epithelial cells is fully dependent on hydrogen peroxide generation by monoamine oxidases. // J. Am. Soc. Nephrol. 2003. 14. 855862.

31. Binda C., Coda A., Angelini R., Federico R., Ascenzi P., Mattevi A. A 30-angstrom-long U-shaped catalytic tunnel in the crystal structure of polyamine oxidase. // Struct. Fold. Des. 1999. 7. 265-276.

32. Binda C., Hubalek F., Li M., Herzig Y., Sterling J., Edmondson D.E., Mattevi A. Crystal structure of monoamine oxidase B in complex with four inhibitors of the N-propargylaminoindan class. // J. Med. Chem. 2004. 47. 1767-1774.

33. Binda C., Li M., Hubalek F., Restelli N., Edmondson D.E., Mattevi A. Insights into the mode of inhibition of human mitochondrial monoamine oxidase B from high-resolution crystal structures. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. 100. 9750-9755.

34. Binda C., Newton-Vinson P., Hubalek F., Edmondson D.E., Mattevi A. Structure of human monoamine oxidase B, a drug target for the treatment of neurological disorders. // Nature Struct. Biol. 2002. 9. 22-26.

35. Bissantz C., Bernard P., Hibert M., Rognan D. Protein-based virtual screening of chemical databases. II. Are homology models of G-protein coupled receptors suitable targets? // Proteins. 2003. 50. 5-25.

36. Bissantz C., Folkers G., Rognan D. Protein-based virtual screening of chemical databases. 1. Evaluation of different docking/scoring combinations. //J. Med. Chem. 2000. 43. 4759-4767.

37. Blanco C., Antia S. X., Liebowitz M. R. Pharmacotherapy of Social Anxiety Disorder. //Biol. Psychiatry. 2002. 51. 109-120.

38. Bohm H.J. The computer program LUDI: a new method for the de novo design of enzyme inhibitors. //J. Comp.-Aided Mol. Design. 1992. 6. 61-78.

39. Boland A., Gerardy J., Mossay D., Seutin V. Pre- and post-treatment with pirlindole and dehydropirindole protects cultured brain cells against nitric oxide-induced death. // Eur. J. Pharmacol. 2003. 466. 21-30.

40. Bono P., Salmi M., Smith D. J., Jalkanen, S. Cloning and characterization of mouse vascular adhesion protein-1 (mVAP-1) reveals a novel molecule with enzymatic activity. //J. Immunol. 1998. 160. 5563-5571.

41. Boomsma F., de Kam P.J., Tjeerdsma G., van den Meiracker A.H., van Veldhuisen D.J. Plasma semicarbazide-sensitive amine oxidase (SSAO) is an independent prognostic marker for mortality in chronic heart failure. // Eur. Heart J. 2000.21. 1859-1863.

42. Borchardt J.K. New Drug Development Costs Now Average $802 million. // The Alchemist 6 December 2001. http://www.chemweb.com/alchem/articles/1005928853806.html.

43. Brown G. C. Nitric oxide and mitochondrial respiration. // Biochim. Biophys. Acta. 1999. 1411. 351-369.

44. Brown R.D., Martin Y.C. Use of structure-activity data to compare structure-based clustering methods and descriptors for use in compound selection. // J. Chem. Inf. Comp. Sci. 1996. 36. 572-584.

45. Bruhlmann C., Ooms F., Carrupt P.A., Testa B., Catto M., Leonetti F., Altomare C., Carotti A. Coumarin derivatives as dual inhibitors of acetylcholinesterases and monoamine oxidase. // J. Med. Chem. 2001. 44. 3195-3198.

46. Bruhwyler J., Liegeois J.-F., Geczy J. Pirlindole: a selective reversible inhibitor of monoamine oxidase A. A review of its preclinical properties.// Pharmacol. Res. 1997. 36. 23-33.

47. Brunner H.C., Nelen M., Breakefield X.O., Ropers H.H., van Oost B. A. Abnormal behavior associated with a point mutation in the structural gene for monoamine oxidase A. // Science. 1993. 262. 578-580.

48. Bruns C.M., Karplus P.A. Refined crystal structure of spinach ferredoxin reductase at 1.7 A resolution: oxidized, reduced and 2'-phospho-5'-AMP bound states.//J. Mol. Biol. 1995. 247. 125-145.

49. Callingham B.A., Holt A., Elliot J. Properties and functions of the semicarbazide-sensitive amine oxidases.// Biochem. Soc. Transact. 1991. 19. 228-233.

50. Cambria A., Raudino A., Castelli F., Raciti G., Mazzone P., Buemi G., Pignatello R., Mazzone G. Structure-activity studies on monoamine oxidase inhibitors by calorimetric and quantum mechanical calculations. // J. Enzyme Inhib. 1996. 10.215-229.

51. Cesura A.M., Gottowik J., Lang G., Malherbe P., Da Prada M. Structure-function relationships of mitochondrial monoamine oxidase A and B: chimaeric enzymes and site-directed mutagenesis studies.// J. Neural. Transm. 1998. 52(Suppl). 189-200.

52. Cesura A.M., Pletscher A. The new generation of monoamine oxidase inhibitors.//Progr. Drug. Res. 1992. 38. 171-297.

53. Chen K. Organization of MAO A and MAO B promoters and regulation of gene expression. // Neurotoxicology. 2004. 25. 1-2. 31-36.

54. Chen K., Wu H.F., Grimsby J., Shih J.C. Cloning of a novel monoamine oxidase cDNA from trout liver. // Mol. Pharmacol. 1994. 46. 1226-1233.

55. Chen K., Wu H.-F., Shih J.C. Influence of C terminus on monoamine oxidase A and B catalytic activity. // J. Neurochem. 1996. 66. 797-803.

56. Chiba K., Trevor A.J., Castagnoli N.Jr. Active uptake of MPP+, a metabolite of MPTP, by brain synaptosomes. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1985. 128. 1228-1232.

57. Chiba K., Trevor A., Castagnoli N.Jr. Metabolism of the neurotoxic tertiary amine, MPTP, by brain monoamine oxidase. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1984. 120. 574-578.

58. Clark D.E., Pickett S.D. Computational methods for the prediction of "drug-likeness". // Drug Disc. Today. 2000. 5. 49-58.

59. Cohen G., Pasik P., Cohen B., Leist A., Mytilineou C., Yahr M.D. Pargyline and deprenyl prevent the neurotoxicity of l-methyl-4-phenyl-l,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) in monkeys. // Eur. J. Pharmacol. 1984. 106. 209210.

60. Cohen N.C., Blaney J.M., Humblet C., Gund P., Barry D.C. Molecular modeling software and methods for medicinal chemistry. // J. Med. Chem. 1990.33. 883-894.

61. Connolly M.L. Analytical Molecular Surface Calculation. // J. Appl. Cryst. 1983. 16. 548-558.

62. Correll C.C., Batie C.J. Ballou D.P., Ludwig M.L. Phthalate dioxygenase reductase: a modular structure for electron transfer from pyridine nucleotides to 2Fe-2S. // Science. 1992. 258. 1604-1610.

63. Correll C.C., Ludwig M.L., Bruns C.M., Karplus P.A. Structural prototypes for an extended family of flavoprotein reductases: comparison of phthalate dioxygenase reductase with ferredoxin reductase and ferredoxin. // Protein Sei. 1993.2.2112-2133.

64. Cramer III R.D., Petterson D.E., Bunce J.D. Comparative molecular field analysis (CoMFA). 1. Effect of share on binding of steroids to carrier proteins. // J. Am. Chem. Soc. 1988, 110, 5959-5967.

65. Da Prada M., Kettler R., Keller H.H., Burkland W.P., Haefely W.E. Preclinical profiles of the novel reversible MAO-A inhibitors, moclobemide and brofaromine, in comparison with irreversible MAO inhibitors. // J. Neural. Transm. 1989. 28(SuppI.). 5-20.

66. Denney R.M., Fritz R.B., Patel N.T., Widen S.G., Abell C.W. Use of a monoclonal antibody for comparative studies of monoamine oxidase B in mitochondrial extracts of human brain and peripheral tissues. // Mol. Pharmacol. 1983. 24. 60-68.

67. Denney R.M., Fritz R.H., Patel N.T., Abell C.W. Human liver MAO-A and MAO-B separated by immunoafflnity chromatography with MAO-B-specific monoclonal antibody.//Science. 1982.215. 1400-1403.

68. Denney R.M., Patel N.T., Fritz R.R., Abell C.W. A monoclonal antibody elicited to human platelet monoamine oxidase. Isolation and specificity for human monoamine oxidase B but not A. // Mol. Pharmacol. 1982. 22. 500508.

69. Denney R.M., Sharma A., Dave S.K., Waguespack A. A new look at the promoter of the human monoamine oxidase A gene: mapping transcription initiation sites and capacity to drive luciferase expression. // J. Neurochem. 1994. 63. 843-856.

70. Dollery C.T., Brown M.J., Davies D.S., Strolin B.M. // In: Tipton K.F., Dorsert P., Strolin B.M. (eds). Monoamine oxidase and disease. Academic Press, London, 1984. 429-441.

71. Domino E.F. Monoamine oxidase, tobacco smoking, and psychiatric disorders. //Biol. Psychiatry. 1996. 40. 433-434.

72. Dostert P., Benedetti M.S. Structure-modulated recognition of substrates and inhibitors by monoamine oxidases A and B. // Biochem. Soc. Transact. 1991. 19. 207-211.

73. Dostert P., Benedetti M.S., Tipton K.F. Interaction of monoamine oxidase with substrates and inhibitors. // Med. Res. Rev. 1989. 9. 45-89.

74. Ebadi M., Srinivasan S.K., Baxi M.D. Oxidative stress and antioxidant therapy in Parkinson's disease. // Prog. Neurobiol. 1996. 48. 1-19.

75. Effect of deprenyl on the progression of disability in early Parkinson's disease. Parkinson Study Group. New Engl. J. Med. 1989. 321. 1364-1371.

76. Effects of tocopherol and deprenyl on the progression of disability in early Parkinson's disease. Parkinson Study Group. New Engl. J. Med. 1993. 328. 176-183.

77. Eggink C., Engel H., Vriend C., Terpstra P., Witholt B. Rubredoxin reductase of Pseudomonas oleovorans. Structural relationship to other flavoprotein oxidoreductases based on one NAD and two FAD fingerprints. // J. Mol. Biol. 1990.212. 135-142.

78. Ewing T.J.A., Makino S., Skillman A.G., Kuntz I.D. DOCK 4.0: Search strategies for automated molecular docking of flexible molecule databases. // J. Comp.-Aided Mol. Design. 2001. 15. 411^28.

79. Farren C.K., Clare A.W., Tipton K.F., Dinan T.G. Platelet MAO activity in subtypes of alcoholics and controls in a homogenous population. // J. Psychiatr. Res. 1998. 32. 49-54.

80. Feighner J.P. Overview of antidepressants currently used to treat anxiety disorders. // J. Clin. Psychiatry. 1999. 60 (Suppl. 4). 4-11.

81. Feighner, J.P. Mechanism of action of antidepressant medications. // J. Clin. Psychiatry. 1999. 60(Suppl. 4). 4-11.

82. Fernandes P.B. Technological advances in high-throughput screening. // Curr. Opin. Chem. Biol. 1998. 2. 597-603.

83. Fowler J.S., Volkow N.D., Wang C.J., Pappas N., Logan J., MacGregor R., Alexoff D., Shea C., Schlyer D., Wolf A.P., Warner D., Zezulkova I., Cilento R. Inhibition of monoamine oxidase B in the brains of smokers. // Nature. 1996a. 379. 733-736.

84. Fowler J.S., Volkow N.D., Wang C.J., Pappas N., Logan J., Shea C., Alexoff D., MacGregor R.R., Schlyer D.J., Zezulkova I., Wolf A.P. Brain monoamine oxidase A inhibition in cigarette smokers. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. 93.14065-14069.

85. Fraaije M.W., Mattevi A. Flavoenzymes: diverse catalysts with recurrent features. //Trends Biochem. Sci. 2000. 25. 126-132.

86. Freiberg C. Novel computational methods in anti-microbial target identification. // Drug Disc. Today. 2001. 6. S72-S80.

87. Fritz R.R., Abell C.W., Patel N.T., Gessner W., Brossi A. Metabolism of the neurotoxin in MPTP by human liver monoamine oxidase B. // FEBS Lett. 1985. 186.224-228.

88. Fujita T. Recent success stories leading to commercializable bioactive compound with the aid of traditional QSAR procedures. // QSAR. 1997. 16. 107-112.

89. Geha R., Chen K., Shih J. Phe-208 and lie-199 in human monoamine oxidase A and B do not determine substrate and inhibitor specificities as in rat. // J. Neurochem. 2000a. 75. 1304-1309.

90. Geha R., Chen K., Shih, J. One corresponding amino acid pair is responsiblefor substrate and inhibitor preference in human monoamine oxidase A and B. th

91. In 9 International Amine Oxidase Workshop, The Millenium Meeting. 2000b. Barcelona, P.59.

92. Geha R.M., Chen K., Wouters J., Ooms F., Shih J.C. Análisis of conserves active site residues in monoamine oxidase A and B and their three-dimentional molecular modeling. // J. Biol. Chem. 2002. 277. 17209-17216.

93. Geha R.M., Rebrin I., Chen K., Shih J.C. Substrate and inhibitor specificities for human monoamine oxidase A and B are influenced by a single amino acid. // J. Biol. Chem. 2001. 276. 9877-9882.

94. Ghose A.K., Wendoloski J.J. Pharmacophore modeling: methods, experimental verification and applications. // In "3D QSAR in Drug Design". /Ed. by Kubinyi H. Kluwer Academic Publishers, Great Britain. 1998. 3. 87104.

95. Glover V., Halket J.M., Watkins P.J., Clow A., Goodwin B.L., Sandler M. Isatin: identity with the purified monoamine oxidase inhibitor, tribulin. // J. Neurochem. 1988. 51. 656-659.

96. Glover V., Medvedev A., Sandler M. Isatin is a potent endogenous antagonist of guanylate cyclase-coupled atrial natriuretic peptide receptors. // Life Sci. 1995. 57. 2073-2079.

97. Glover, V. (1997) in Antidepressants: New Pharmacological Strategies (Skolnick, Ph., ed.) Humana Press, Totowa, NJ, pp. 69-80.

98. Goodsell D.S., Morris G.M., Olson A.J. Automated docking of flexible ligands: applications of AutoDock. //J. Mol. Recognit. 1996. 9. 1-5.

99. Gorkin V.Z. Monoamine oxidases.//Pharacol. Rev. 1966. 18. 115-120.

100. Gorkin V.Z. Qualitative alterations in enzymatic properties of amine oxidases. // Adv. Biochem. Psychopharmacol. 1972. 5. 55-65.

101. Gottowik J., Cesura A.M., Malherbe P., Lang C., Da Prada M. Characterisation of wild-type and mutant forms of human monoamine oxidase A and B expressed in a mammalian cell line. // FEBS Lett. 1993. 317. 152156.

102. Gottowik J., Malherbe P., Lang G., Da Prada M., Cesura A. M. Structure/function relationships of mitochondrial monoamine oxidase A and B chimeric forms. //Eur. J. Biochem. 1995. 230. 934-942.

103. Grandi T., Sparatore F. Monoamine oxidase inhibitory properties of some benzazoles: Structure-activity relationships.//AAPS Pharmasci. 1999. 1. 1-4.

104. Grimsby J., Zentner M., Shih J.C. Identification of a region important for human monoamine oxidase B substrate and inhibitor selectivity. // Life Sci. 1996. 58. 777-787.

105. Gurrath M., Muller G., Holtje H.-D. Pseudoreceptor modelling in drug design: application of Yak and PrGen. // In "Perspectives in drug discovery and design."/ Ed. by Anderson P.S., Kenyon G.L., Marshall G.R. 1998. 12/13/14. 135-157.

106. Hansch C. Quantitative Structure-Activity Relationships and the Unnamed Science.//Account Chem. Res. 1993.26. 147-153.

107. Harfenist M., Joseph D.M., Spence S.C., Mcgee D.P.C., Reeves M.D., White

108. H.L. Selective inhibitors of monoamine oxidase. 4. SAR of tricyclic N-methylcarboxamides and congeners at the tricyclics' hydrophilic binding site. // J. Med. Chem. 1997. 40. 2466-2473.

109. Harfenist M., Joyner C.T., Mize P.D., White H.L. Selective inhibitors of monoamine oxidase. 2. Arylamide SAR. // J. Med. Chem. 1994. 37. 20852089.

110. Hasan F., McCrodden J.M., Kennedy N.P., Tipton K.F. The involvement of intestinal monoamine oxidase in the transport and metabolism of tyramine. // J. Neural. Transm. 1988. 26(suppl.). 1-9.

111. Hasegawa S., Matsubara K., Takahashi A., Naoi M., Nagatsu T. Inhibition of type A monoamine oxidasre by N-methyl p-carbolinium ions. // Biogenic Amines. 1995. 11. 295-303.

112. Hiramatsu A., Tsurushiin S., Yasunobu K.T. Evidence for essential histidine residues in bovine-liver mitochondrial monoamine oxidase. // Eur. J. Biochem. 1975. 57. 587-593.

113. Ho B.T., Mclsaac W.M., Walker K.E., Estevez V. Inhibitors of monoamine oxidase. Influence of methyl substitution on the inhibitory activity of beta-carbolines. // J. Pharm. Sci. 1968. 57. 269-274.

114. Hoffmann D., Kramer B., Washio T., Steinmetzer T., Rarey M., Lengauer T. Two-stage method for protein-ligand docking. // J. Med. Chem. 1999. 42. 4422-4433.

115. Holt A., Berry M.D., Boulton A.A. On the binding of monoamine oxidase inhibitors to some sites distinct from the MAO active site, and effects thereby elicited. //Neurotoxicology. 2004. 25. 1-2. 251-266.

116. Hossain C.F., Okuyama E., Yamazaki M. A new series of coumarin derivatives having monoamine oxidase inhibitory from Monascus anka. // Chem. Pharm. Bull. 1996. 44. 1535-1539.

117. Hsu Y.-P.P., Weyler W., Chen S., Sims K.B., Rinehart W.B., Utterback M.C., Powell J.F., Breakefleld X.O. Structural features of human monoamine oxidase A elucidated from cDNA and peptide sequences. // J. Neurochem. 1988. 51. 1321-1324.

118. Hubbard R.E. Can drugs be designed? Curr. Opin. Biotech. 1997. 8. 696-700.

119. Husain M., Edmonton D.E., Singer T.P. Kinetic studies on the catalytic mechanism of liver monoamine oxidase. // Biochemistry. 1982. 21. 595-600.

120. Hynson R.M, Kelly S.M, Price N.C, Ramsay R.R. Conformational changes in monoamine oxidase A in response to ligand binding or reduction. // Biochim. Biophys. Acta. 2004. 1672. 60-66.

121. Hynson R.M.G., Wouters J., Ramsay R.R. Monoamine oxidase A inhibitory potency and flavin perturbation are influenced by different aspects of pirlindole inhibitor structure. // Biochem. Pharmacol. 2003. 65. 1867-1874.

122. Impact of deprenyl and tocopherol treatment on Parkinson's disease in DATATOP patients requiring levodopa. Parkinson Study Group. Ann Neurol.1996. 39. 37-45.

123. ISIS™/Base: MDL Drug Data Report, Molecular Design Limited Information Systems, Inc., 14600 Catalina Street, San Leandro, California, 94577, USA.1997.

124. Ito A., Kuwahara T., Inadome S., Sagara Y. Molecular cloning of a cDNA for rat liver monoamine oxidase B. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1988. 157. 970-976.

125. Ivanov A.S., Medvedev A.E., Lyulkin Y.A., Skvortsov V.S., Rumjantsev A.B., Gorkin V.Z. Computer modelling of active site of monoamine oxidase A. // In: 14th European workshop on drug metabolism, Paris, France, 4-8 July 1994, 1994, p. 66.

126. Jegham S., George P. Monoamine oxidase A and B inhibitors. // Exp.Opin.Ther.Patents. 1998. 8. 1143-1150.

127. Jo Y.S., Huong D.T., Bae K., Lee M.K., Kim Y.H. Monoamine oxidase inhibitory coumarin from Zanthoxylum schinifolium. // Planta Med. 2002. 68. 84-85.

128. Karplus P.A., Daniels M.J., Herriott J.R. Atomic structure of ferredoxin-NADP+ reductase: prototype for a structurally novel flavoenzyme family. // Science. 1991.251. 60-66.

129. Kettmann V., Holtje H.-D. Mapping of the benzothiazepine binding site on the calcium channel. // QSAR. 1998. 17. 91-101.

130. Kim H., Sablin S.O., Ramsay R.R. Inhibition of monoamine oxidase A by beta-carboline derivatives. // Arch. Biochem. Biophys. 1997. 337. 137-142.

131. Kim J., Fuller J.H., Kuusk V., Cunane L., Chen Z.W., Mathews F.S., Mclntire W.S. The cytochrome subunit is necessary for covalent FAD attachment tothe flavoprotein subunit of p-cresol methylhydroxylase. // J. Biol. Chem. 1995.270.31202-31209.

132. Kim K.H. Comparative molecular field analysis (CoMFA). // In "Molecular simulation and Drug Design". / Ed. Dean, P.M., Blackie academic & professional, London. 1995. 291-331.

133. King L., Parke D.V., Williams R.T. The metabolism of 2-14C. indole in the rat. //Biochem. J. 1966. 98.266-277.

134. Kirksey T.J., Kwan S.-W., Abell C.W. Arginine-42 and threonine-45 are required for FAD incorporation and catalytic activity in human monoamine oxidase B. //Biochemistry. 1998. 37. 12360-12366.

135. Klebe G. Comparative Molecular Similarity Indices: CoMSIA. // In "3D QSAR in Drug Design". / Ed. by Kubinyi H. Kluwer Academic Publishers, Great Britain. 1998. 3. 87-104.

136. Kochersperger L.M., Parker E.L., Siciliano M., Darlington G.J., Denney R.M. Assignment of genes for human monoamine oxidases A and B to the X chromosome.//J. Neurosci. Res. 1986. 16. 601-616.

137. Krueger M.J., Mazouz F., Ramsay R.R., Milcent R., Singer T.P. Dramatic species differences in the susceptibility of monoamine oxidase B to a group of powerful inhibitors. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. 206. 556-562.

138. Kubinyi H. QSAR and Crystallography in Industrial Drug Design. // In "Computer-Aided Drug Design Industrial Research". / Ed. Herrmann E.C., Franke R. Springer Verlag, Berlin. 1995. 99-109.

139. Kubinyi H. Variable Selection in QSAR Studies. I. An Evolutionary Algorithm.//QSAR. 1994. 13.285-294.

140. Kuntz I.D., Blaney J.M., Oatley S.J., Landridge R., Ferrin T.E. A geometric approach to macromolecule-ligand interactions. // J. Mol. Biol. 1982. 161. 269-288.

141. Kuwahara T., Takamoto S., Ito A. Primary structure of rat monoamine oxidase A deduced from cDNA and its expression in rat tissues. // Agric. Biol. Chem. 1990. 54. 253-257.

142. Kwan S.-W. Abell C.W. cDNA cloning and sequencing of rat monoamine oxidase A: comparison with the human and bovine enzymes. // Comp. Biochem. Physiol. 1992. 102B, 143-147.

143. Kwan S.-W., Bergeron J.M., Abell C.W. Molecular properties of monoamine oxidase. // Psichofarmacology. 1992. 106. 1-5.

144. Kwan S.-W., Lewis D.A., Zhou B.P., Abell C.W. Characterization of a dinucleotide-binding site in monoamine oxidase B by site-directed mutagenesis. // Arch. Biochem. Biophys. 1995. 316. 385-391.

145. Lan N.C., Heinzmann C., Gal A., Klisak I., Orth U., Lai E., Grimsby J., Sparkes R.S., Mohandas T., Shih J.C. Human monoamine oxidase A and B genes map to Xp 11.23 and are deleted in a patient with Norrie disease. // Genomics. 1989. 4. 552-559.

146. Langston J.W., Ballard P., Tetrud J.W., Irwin I. Chronic Parkinsonism in humans due to a product of meperidine-analog synthesis. // Science. 1983. 219. 979-980.

147. Langston J.W., Irwin I., Langston E.B., Forno L.S. Pargyline prevents MPTP-induced parkinsonism in primates. // Science. 1984. 225. 1480-1482.

148. Lawrence M.C., David P.C. CLIX: a search algorithm for finding novel ligands capable of binding protein of known three-dimensional structure. // Proteins. 1992. 12.31-41.

149. Lebreton L., Curet O., Gueddari S., Mazouz F., Bernard S., Burstein C., Milcent R. Selective and potent monoamine oxidase type B inhibitors: 2-substituted 5-aryltetrazole derivatives. // J. Med. Chem. 1995. 38. 4786-4792.

150. Levant B. Novel drug interactions at D(2) dopamine receptors: modulation of 3H.quinpirole binding by monoamine oxidase inhibitors. // Life Sci. 2002. 71.2691-2700.

151. Levitt P., Pintar J.E., Breakfield X.O. Immunocytochemical demonstration of monoamine oxidase B in brain astrocytes and serotonergic neurons. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. 79. 6385-6389.

152. Levy E.R., Powell J.F., Buckle V.J., Hsu Y.-P.P., Breakefield X.O., Craig I.W. Localization of human monoamine oxidase-A gene to Xpl 1.23-11.4 by in situ hybridization: implications for Norrie disease. // Genomics. 1989. 5. 368-370.

153. Liu K.J., Grinstaff M.W., Jiang J., Suslick K.S., Swartz H.M., Wang W. In vivo measurement of oxygen concentration using sonochemically synthesized microspheres. 11 Biophys. J. 1994. 67. 896-901.

154. Lohse M.J. The future of pharmacology // Trends Pharmacol. Sci. 1998. 19. 198-200.

155. Lu G., Campbell W.H., Schneider G., Lindqvist Y. Crystal structure of the FAD-containing fragment of corn nitrate reductase at 2.5 A resolution: relationship to other flavoprotein reductases. // Structure. 1994. 2.809-821.

156. Lu X., Silverman R.B. Inactivation of Monoamine Oxidase B by cis- and trans-5-Aminomethyl-3-(4-methoxyphenyl)dihydrofuran-2(3H)-ones. // Bioorg. Med. Chem. 1998. 6. 1851-1856.

157. Luque J.M., Kwan S.-W., Abell C.W., Da Prada M., Richards J.C. Cellular expression of mRNAs encoding monoamine oxidases A and B in the rat central nervous system. // J. Comp. Neurol. 1995. 363. 665-680.

158. Lyles G.A. Mammalian plasma and tissue-bond semicarbazide-sensitive amine oxidases: Biochemical, pharmacological and toxicological aspects. // Int. J. Biochem. Cell. Biol. 1996. 28. 259-274.

159. Ma J., Yoshimura M., Yamashita E., Nakagawa A., Ito A., Tsukihara T. Structure of rat monoamine oxidase A and its specific recognitions for substrates and inhibitors. // J. Mol. Biol. 2004b. 338. 103-114.

160. Manallack D.T., Livingstone D.J. Neural networks in drug discovery: have they lived up to their promise? // Eur. J. Med. Chem. 1999. 34. 195-208.

161. Maret G., Tayar N.E., Carrupt P.-A., Testa B., Jenner P., Baird M. Toxication of MPTP (l-Metil-4-Phenil-l,2,3,6,-Tetrahydropyridine) and Analogs by Monoamine Oxidase. A Structure-Reactivity Relationship Study. // Biochem. Pharmacol. 1990. 40. 783-792.

162. Marrone T.J., Briggs J.M., McCammon J.A. Structure-Based Drug Design: Computational Advances. // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1997. 37. 7190.

163. Massey V., Curti B. A new method of preparation of D-amino acid oxidase apoprotein and a conformational change after its combination with flavin adenine dinucleotide. // J. Biol. Chem. 1966. 241. 3417-3423.

164. May T., Rommelspacher H., Pawlik M. 3H.harman binding experiments. I: A reversible and selective radioligand for monoamine oxidase subtype A in the CNS of the rat. // J. Neurochem. 1991. 56. 490-499.

165. Medevedev A.E., Gorkin V.Z. Endogenous stimulation of lipid peroxidation in brain increases proteolytic inactivation of mitochondrial monoamine oxidases.//Int. J. Devel. Neurosci. 1994. 12. 151-155.

166. Medvedev A., Bussygina O., Pyatakova N., Glover V., Severina I.S. Effect of isatin on nitric oxide-stimulated soluble guanylate cyclase from human platelets. // Biochem. Pharmacol., 2002. 63. 763-766.

167. Medvedev A.E., Abakumova O.Yu., Podobed O.V., Tsvetkova T.A., Sandler M., Glover V. Effects of isatin on atrial natriuretic peptide-mediated accumulation of cGMP and guanylyl cyclase activity of PC 12 cells. Life Sei. 2001.69. 1783-1790.

168. Medvedev A.E., Glover V. Tribulin and endogenous MAO-inhibitory regulation in vivo. //Neurotoxicology. 2004. 25. 1-2. 185-192.

169. Medvedev A.E., Kirkel A.A., Kamyshanskaya N.S., Moskvitina T.A., Axenova L.N., Gorkin V.Z., Andreeva N.I., Golovina S.M., Mashkovsky M.D. Monoamine oxidase inhibition by novel antidepressant tertindole. // Biochem. Pharmacol. 1994. 47. 303-308.

170. Medvedev A.E., Kirkel A.Z., Kamyshanskaya N.S., Gorkin V.Z. Lipid peroxidation affects catalytic properties of rat liver mitochondrial monoamine oxidases and their sensitivity to proteolysis. // Int. J. Biochem. 1993. 25. 1791-1799.

171. Medvedev A.E., Shedov V.l., Chulkova T.M., Fedotova O.A., Saederup E., Squires R.F. Effects of the antidepressant pirindole and its dehydroderivative on the activity of monoamine oxidase-A and on GABAa receptors. // Neurochem. Res. 1996.21. 1521-1526.

172. Meng E.C., Kuntz I.D., Abraham D.J., Kellog G.E. Evaluating docked complexes with the HINT exponential function and empirical atomic hydrophobicities. // J.Comp.-Aided Mol. Design. 1994. 8. P.299-306.

173. Meng E.C., Shoichet B.K., Kuntz I.D. Automated Docking with Grid-Based Energy Evaluation. // J. Comp. Chem. 1992. 13. 505-524.

174. Minamiura N., Yasunobu K.T. Bovine liver monoamine oxidase. A modified purification procedure and preliminary evidence for two subunits and one FAD. //Arch. Biochem. Biophys. 1978. 189. 481-489.

175. Mitoma J.-Y., Ito A. The carboxy-terminal 10 amino acid residues of cytochrome b5 are necessary for its targeting to the endoplasmic reticulum. // EMBO J. 1992. 11.4197-4203.

176. Morens D.M., Grandinetti A., Reed D., White L.R., Ross C.W. Cigarette smoking and protection from Parkinson's disease: false association or etiologic clue?//Neurology. 1995.45. 1041-1051.

177. Moriguchi I., Hirono S., Nakagome I. Comparison of reliability of logP values for drugs calculated by several methods. // Chem. Pharm. Bull. 1994. 42. 976-978.

178. Myers P.L. Will combinatorial chemistry deliver real medicines? // Curr. Opin. Biotech. 1997. 8. 701-707.

179. Nicotra A., Pierucci F., Parvez H., Senatori O. Monoamine oxidase expression during development and aging. // Neurotoxicology. 2004. 25. 1-2. 155-166.

180. Norinder U. The Advantages of Using Rational Drug Design in Modern Drug Discovery: How to Integrate Computer-Aided Drug Design and Modern

181. Biotechnology. // In "Computer-Aided Drug Design Industrial Research". / Ed. Herrmann E.C., Franke R. Springer Verlag, Berlin. 1995. 99-109.

182. O'Sullivan J., Unzeta M., Healy J., O'Sullivan M/I., Davey G., Tipton K.F. Semicarbazide-sensitive amine oxidases: enzymes with quite a lot to do. // Neurotoxicology. 2004. 25. 1-2. 303-316.

183. Ooms F. Molecular modeling and computer aided drug design. Examples of their applications in medicinal chemistry. // Curr. Med. Chem. 2000. 7. 141158.

184. Oprea T.I., Marshall G.R. Receptor-based prediction of binding affinities. // In "Perspectives in drug discovery and design." Ed. Anderson P.S., Kenyon G.L., Marshall G.R. 1998. 09/10/11. 35-61.

185. Oreland L. Purification and properties of pig liver mitochondrial monoamine oxidase. // Arch. Biochem. Biophys. 1971. 146. 410-421.

186. Otto A., Stoltz M., Sailer H.P., Brandsch R., Biogenesis of the covalently flavinylated mitochondrial enzyme dimethylglycine dehydrogenase. // J. Biol. Chem. 1996. 271. 9823-9829.

187. Packman L.C., Mewies M., Scrutton N.S. The flavinylation reaction of trimethylamine dehydrogenase. Analysis by directed mutagenesis and electrospray mass spectrometry. // J. Biol. Chem. 1995. 270. 13186-13191.

188. Palmer S.L., Mabic S., and Castagnoli N. Jr. Probing the active sites of monoamine oxidase A and B with 1,4-disubstituted tetrahydropyridine substrates and inactivators. // J. Med. Chem. 1997. 40. 1982-1989.

189. Panova N.G., Zemskova M.A., Axenova L.N., Medvedev A.E. Does isatin interact with rat brain monoamine oxidases in vivo? // Neurosci. Lett. 1997. 233. 58-60.

190. Pawelek P.D., Cheah J., Coulombe R., Macheroux P., Ghisla S., Vrielink A. The structure of L-amino acid oxidase reveals the substrate trajectory into an enantiomerically conserved active site. // EMBO J. 2000. 19. 4204-4215.

191. Petzer J.P., Steyn S., Castagnoli K.P., Chen J.F., Schwarzschild M.A., Van der Schyf C.J., Castagnoli N. Inhibition of monoamine oxidase B by selective adenosine A2A receptor antagonists. // Bioorg. Med. Chem. 2003. 11. 12991310.

192. Pintar J.E., Barbosa J., Francke U., Castiglione C.M.Jr., Hawkins M., Breakefield X.O. Gene for monoamine oxidase type A assigned to the human X chromosome.//J. Neurosci. 1981. 1. 166-175.

193. Ponec R, Amat L, Carbo-Dorca R Molecular basis of quantitative structure-properties relationships (QSPR): a quantum similarity approach. // J. Comp.-Aided Mol. Des. 1999. 13. 259-270.

194. Poroikov V.V., Filimonov D.A. How to acquire new biological activities in old compounds by computer prediction. // J. Comp.-Aided Mol. Des. 2002. 16. 819-824.

195. Poroikov, V.V.; Filimonov, D.A.; Borodina, Yu.V.; Lagunin, A.A.; Kos, A. Robustness of biological activity predicting by computer program PASS for noncongeneric sets of chemical compounds. // J. Chem. Inf. Comput. Sci. 2000. 40. 1349-1355.

196. Poulos T.L., Finzel B.C., Howard A.J. High-resolution crystal structure of cytochrome P450cam. // J. Mol. Biol. 1987. 195. 687-700.

197. Prosser R.S., Luchette P.A., Westerman P.W., Rozek A., Hancock R.E. Determination of membrane immersion depth with 0(2): a high-pressure (19)F NMR study. // Biophys. J. 2001. 80. 1406-1416.

198. Ramsay R., Tan A.K., Weyler W. Kinetic properties of cloned human liver monoamine oxidase A. // J. Neural. Trans. 1994. 41(Suppl.). 17-26.

199. Ramsay R.R., Hunter D.J.B. Inhibitors alter the spectrum and redox properties of monoamine oxidase A. // Biochim. Biophys. Acta. 2002. 1601. 178-184.

200. Ramsay R.R., Sablin S.O. A second redox group in monoamine oxidase: its role in catalysis and inhibition. // Neurobiology. 1999. 7. 205-212.

201. Ramsay R.R., Singer T.P. The kinetic mechanisms of monoamine oxidases A andB. //Biochem. Soc. Transact. 1991. 19. 219-223.

202. Rarey M, Wefing S, Lengauer T. Placement of medium-sized molecular fragments into active sites of proteins. // J. Comp.-Aided Mol. Des. 1996. 10. 41-54.

203. Riley L.A., Waguespack M.A., Denney R.M. Characterization and quantitation of monoamine oxidases A and B in mitochondria from human placenta. // Mol. Pharmacol. 1989. 36. 54-60.

204. Robinson K.M., Lemire B.D. A requirement for matrix processing peptidase but not for mitochondrial chaperonin in the covalent attachment of FAD to the yeast succinate dehydrogenase flavoprotein. // J. Biol. Chem. 1996. 271. 4055-4060.

205. Rommelspacher H., May T., Salewski B. Harman (1-methyl-beta-carboline) is a natural inhibitor of monoamine oxidase type A in rats. // Eur. J. Pharmacol. 1994. 252. 51-59.

206. Sablin S.O., Ramsay R.R. Monoamine oxidase contains a redox-active disulfide. // J. Biol. Chem. 1998. 273. 14074-14076.

207. Sagin F.G., Sozmen E.Y., Ersoz B., Mentes G. Link between monoamine oxidase and nitric oxide. // Neurotoxicology. 2004. 25. 1-2. 91-100.

208. Salach J.I. Monoamine oxidase from beef liver mitochondria: simplified isolation procedure, properties, and determination of its cysteinyl flavin content.//Arch. Biochem. Biophys. 1979. 192. 128-137.

209. Schildkraut J.J. The catecholamine hypothesis of affective disorders: a review of supporting evidence. // Amer. J. Psychiat. 1965. 122. 509-522.

210. Schilling B., Lerch K. Amine oxidase from Aspergillus niger: Identification of the a novel flavin-dependent enzyme. // Biochim. Biophys. Acta. 1995. V.1243. P.529-537.

211. Schleifer K.-J. Pseudoreceptor model for ryanodine derivatives at calcium release channels. // J. Comp.-Aided Mol. Des. 2000. 14. 467-475.

212. Schneider G., Bohm H-J. Virtual screening and fast automated docking methods. // Drug Disc. Today. 2002. 7. 64-70.

213. Schoichet B.K., Kuntz I.D. Matching chemistry and shape in molecular docking. // Protein Eng. 1993. 6. 723-732.

214. Shih J.C. Cloning, after cloning, knock-out mice, and physiological functions of MAO A and B. // Neurotoxicology. 2004. 25. 1-2. 21-30.

215. Shih J.C., Grimsby J., Chen K., Zhu Q.S. Structure and promoter organization of the human monoamine oxidase A and B genes. // J. Psychiatry Neurosci. 1993. 18.25-32.

216. Shih J.C., Zhu Q.S., Grimsby J., Chen K. Identification of human monoamine oxidase (MAO) A and B gene promoters. // J. Neural. Transm. 1994. 41(Suppl.). 27-33.

217. Shih J.C., Chen K., Ridd M.J. Monoamine oxidase: from genes to behavior. // Annu. Rev. Neurosci. 1999. 22. 197-217.

218. Shiloff B.A., Behrens P.Q., Kwan S.-W., Lee J.H., Abell C.W. Monoamine oxidase B isolated from bovine liver exists as large oligomeric complexes in vitro. // Eur. J. Biochem. 1996. 242. 41-50.

219. Silverman R.B. The use of mechanism-based inactivators to probe the mechanism of monoamine oxidase. // Biochem. Soc. Transact 1991. 19. 201206.

220. Silvestri R., La Regina G., De Martino G., Artico M., Befani O., Palumbo M., Agostinelli E., Turini P. Simple, potent, and selective pyrrole inhibitors of monoamine oxidase types A and B. // J. Med. Chem. 2003. 46. 917-920.

221. Silvestri R., La Regina G., De Martino G., Artico M., Befani O., Palumbo M., Agostinelli E., Turini P. Simple, potent, and selective pyrrole inhibitors of monoamine oxidase types A and B. // J. Med. Chem. 2003. 46. 917-920.

222. Singer T.P. Inhibitors of FAD-Containing Monoamine Oxidases. // In "Structure and functions of amine oxidase". / Ed. Mondovi B., Boca Raton. Florida. 1985.219-230.

223. Singer T.P., Salach J.I., Castagnoli N.Jr., Trevor A. Interactions of the neurotoxic amine, MPTP, with monoamine oxidases. // Biochem. J. 1986. 235. 785-789.

224. Singer T.P., Salach J.I., Crabtree D. Reversible inhibition and mechanism-based inhibition of monoamine oxidase by MPTP. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1985. 127. 707-712.

225. Sippl W. Receptor-based 3D QSAR analysis of estrogen receptor ligands — merging the accuracy of receptor-based alignments with the computational efficiency of ligand-based methods. // J. Comp.-Aided Mol. Des. 2000. 14. 559-572.

226. Sippl W., Contreras J.-M., Parrot I., Rival Y.M., Wermuth C.G. Structure-based 3D QSAR and design of novel acetylcholineesterase inhibitors. // J. Comp.-Aided Mol. Des. 2001. 1., 395-410.

227. Skulachev V.P. Power transmission along biological membranes. // J. Membr. Biol. 1990. 114. 97-112.

228. Spaltmann F., Blunck M., Ziegelbauer K. Computer-aided target selection -prioritizing targets for antifungal drug discovery. // Drug Disc. Today. 1999. 4. 17-26.

229. Sybyl 6.8, Tripos Inc., 1699 South Hanley Road, St Louis, Missouri, 63144, USA.

230. Tetrud J.W., Langston J.W. The effect of deprenyl (selegiline) on the natural history of Parkinson's disease. // Science. 1989. 245. 519-522.

231. Thibaut U. Application of CoMFA and related 3D QSAR approaches. // In: 3D-QSAR in drug design: Theory, methods, and application. / Ed. Kubinyi,H. ESCOM, Leiden, The Netherland, 1993. 661-696.

232. Thomas T., McLendon C., Thomas G. L-deprenyl: nitric oxide production and dilation of cerebral blood vessels. // Neuroreport. 1998. 9. 2595-2600.

233. Thorpe L. W., Westlund K. N., Kochersperger L. M., Abell C. W., Denney R. M. Immunocytochemical localization of monoamine oxidases A and B in human peripheral tissues and brain. // J. Histochem. Cytochem. 1987. 35, 2332.

234. Thull U., Kneubuhler S., Gaillard P., Carrupt P.-A., Testa B., Altomare C., Carotti A., Jenner P., McNaught K.,St.P. Inhibition of Monoamine Oxidase by Isoquinoline Derivatives. // Biochem. Pharmacol. 1995. 50. 869-877.

235. Tipton K. F. Inhibitors of monoamine oxidase and the pressor response to dietary amines. // In: Milestones in monoamine oxidase research: discovery of (-)deprenyl (K.Magyar and E.S.Visi eds.) Meditcina Publishing House Co., Budapest, 2000, pp. 19-32.

236. Tipton K.F. // In: Biochemical and pharmacological aspects of depression. Tipton K.F., Youdim M.B.H. (eds.) Taylor & Francis, London, 1989. 193203.

237. Tipton K.F., O'Carroll A.-M., McCrodden J.M. The catalytic behaviour of monoamine oxidase. // J. Neural. Transm. 1987. 43(Suppl.). 25-35.

238. Trevor A.J., Singer T.P., Ramsay R.R., and Castagnoli N.Jr. Processing of MPTP by monoamine oxidases: implications for molecular toxicology. // J. Neural Transm. 1987. 23(Suppl.). 73-89.

239. Tsugeno Y. Ito A. A key amino acid responsible for substrate selectivity of monoamine oxidase A and B. // J. Biol. Chem. 1997. 272. 14033-14036.

240. Tsugeno Y., Hirashiki I., Ogata F., Ito A. Regions of the molecule responsible for substrate specificity of monoamine oxidase A and B: A chimeric enzyme analysis. // J. Biochem. 1995. 118. 974-980.

241. Vetulani J., Nalepa I. Antidepressants: past, present and future. // Eur. J. Pharmacol., 2000. 405. 351-363.

242. Violette S.M., Shakespeare W.C., Bartlett C., Guan W., Smith J.A., Rickles R.J., Bohacek R.S., Holt D.A., Baron R., Sawyer T.K. A Src SH2 selective binding compound inhibits osteoclast-mediated resorption. // Chem. Biol. 2000. 7. 225-235.

243. Waldmeier P.C. Amine oxidases and their endogenous substrates (with special reference to monoamine oxidase and the brain). // J. Neural. Transm. 1987. 23(Suppl.). 55-72.

244. Walker M.C., Edmondson D.E. Structure-activity relationships in the oxidation of benzylamine analogues by bovine liver mitochondrial monoamine oxidase B. // Biochemistry. 1994. 33. 7088-7098.

245. Walker W.H., Kearney E.B., Seng R., Singer T.P. The covalently-bound flavin of hepatic monoamine oxidase. 2. Identification and properties of cysteinyl riboflavin. // Eur. J. Biochem. 1971. 24. 328-331.

246. Way JC. 2000. Covalent modification as a strategy to block protein-protein interactions with small-molecule drugs. // Curr. Opin. Chem. Biol. 4. 40-46.

247. Weber H.P. Screening three-dimensional databases for lead finding. // In "Computer-Aided Drug Design Industrial Research."/ Ed. Herrmann E.C., Franke R. Springer Verlag. Berlin. 1995. 111-128.

248. Weinstock M., Poltyrev T., Bejar C., Youdim M.B.H. Effect of TV3326, a novel monoamine-oxidase cholinesterase inhibitor, in rat models of anxiety and depression. // Psychopharmacology. 2002. 160. 318-324.

249. Westlund K.N., Denney R.M., Kochersperger L.M., Rose R.M., Abell C.W. Distinct monoamine oxidase A and B populations in primate brain. // Science. 1985.230. 181-183.

250. Westlund K.N., Denney H.M., Rose R.M., Abell C.W. Localization of distinct monoamine oxidase A and monoamine oxidase B cell populations in human brainstem. //Neuroscience. 1988. 25. 439-456.

251. Weyer W., Hsu Y.-P.P., Breakefield X.O. Biochemistry and genetics of monoamine oxidase. // Pharmac. Ther. 1990. 47. 391-417

252. Weyler W. Functional expression of C-terminally truncated human monoamine oxidase type A in Saccharomyces cerevisiae. // J. Neural Transm. 1994. 41(suppl.). 3-15.

253. Weyler W. Monoamine oxidase A from human placenta and monoamine oxidase B from bovine liver both have one FAD per subunit. // Biochem. J. 1989. 260. 725-729.

254. Wierenga R.K., Terpstra P., Hoi W.G.J. Prediction of the occurrence of the ADP-binding beta alpha beta-fold in proteins, using an amino acid sequence fingerprint.//J. Mol. Biol. 1986/ 187. 101-107.

255. Wiesner R., Kasuschke A., Kuhn H., Anton M., Schewe T. Oxygenation of mitochondrial membranes by the reticulocyte lipoxygenase. Action on monoamine oxidase activities A and B. // Biochim. Biophys. Acta. 1989. 986. 11-17.

256. Windrem D.A., Plachy W.Z. The diffusion-solubility of oxygen in lipid bilayers. // Biochim. Biophys. Acta. 1980.600. 655-665.

257. Wlodawer A., Vondrasek J. Inhibitors of HIV-1 protease: a major success of structure-assisted drug design. // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1998. 27. 249-284.

258. Wouters J. Structural aspects of monoamine oxidase and its reversible inhibition. // Curr. Med. Chem. 1998. 5. 137-162.

259. Wouters J., Baudoux G. First partial three-dimensional model of human monoamine oxidase A. // Proteins: Structure, Function, and Genetics. 1998. 32. 97-110.

260. Wouters J., Durant F., Champagne B., Andre J.M. Electronic properties of flavins: implications on the reactivity and absorption properties of flavoproteins. //Int. J. Quant. Chem. 1997. 64. 721-733.

261. Wu H.-F., Chen K., Shih J.C. Site-directed mutagenesis of monoamine oxidase A and B: role of cysteines. // Mol. Pharmacol. 1993. 43. 888-893.

262. Yamada M, Yasuhara H. Clinical pharmacology of MAO inhibitors: safety and future. Neurotoxicology. 2004. 25. 215-221,

263. Yoshimi K., Kozuka M., Sakai J., Iizawa T., Shimizu Y., Kaneko I., Kojima K., Iwata N. Novel Monoamine Oxidase Inhibitors, 3-(2-Aminoethoxy)-l,2-benzisoxazole Derivatives, and Their Differential Reversibility. // Jpn. J. Pharmacol. 2002. 88. 174 182.

264. Youdim M.B.H., Finberg J.P.M. New directions in monoamine oxidase A and B selective inhibitors and substrates. // Biochem. Pharmacol. 1991. 41. 155162.

265. Youdim M.B.H., Narshak N., Yoshioka M., Araki H., Mukai Y., Gotto G. Novel substrates and products of amine oxidase-catalysed reactions. // Biochem. Soc. Transact. 1991. 19. 224-228.

266. Youdim M.B.H., Weinstock M. Therapeutic applications of selective and non-selective inhibitors of monoamine oxidase A and B that do not cause significant tyramine potentiation. // Neurotoxicology. 2004. 25. 1-2. 243-250.

267. Zbinden P., Dobler M., Folkers G., Vedani A. PrGen: pseudoreceptor modeling using receptor-mediated ligand alignment and pharmacophore equilibration.//QSAR. 1998. 17. 122-129.

268. Zeng J. Mini-review: computational structure-based design of inhibitors that target protein surfaces. // Comb. Chem. High Throughput Screen. 2000. 3. 355-362.

269. Zhong B., Silverman R. B. Identification of the active site cysteine in bovine liver monoamine oxidase B. // J. Am. Chem. Soc. 1997. 119. 6690-6691.

270. Zhou B.P., Lewis D.A., Kwan S.-W., Kirksey T.J., Abell C.W. Mutagenesis at a highly conserved tyrosine in monoamine oxidase B affects FAD incorporation and catalytic activity. //Biochemistry. 1995. 34. 9526-9531.

271. Zhou B.P., Wu B., Kwan S.-W., Abell C.W. Characterization of a highly conserved FAD-binding site in human monoamine oxidase B. // J. Biol. Chem. 1998.273. 14862-14868.

272. Zhu Q.S., Grimsby J., Chen K., Shih J.C. Promoter organization and activity of human monoamine oxidase (MAO) A and B genes. // Neurosci. 1992. 12. 4437-4446.

273. Zutshi R, Chmielewski J. 2000. Targeting the dimerization interface for irreversible inhibition of HIV-1 protease. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 10. 1901-1903.1. Благодарности

274. Автор выражает искреннюю признательность своему консультанту (проф., д.б.н. Медведеву А.Е.) за многолетнее плодотворное сотрудничество, за внимание и ценные критические замечания при написании данной работы.

275. Выражаю благодарность проф. K.Tipton (Ireland), проф. Rona Ramsay (Scottland) и д-ру JohanWouters (Belgium) за полезные советы и дискуссии.

276. Выражаю признательность всем сотрудникам лаборатории молекулярно-графического конструирования лекарств ГУ НИИ БМХ РАМН за всестороннюю поддержку при выполнении данной работы. Хочется поблагодарить к.б.н. О.В.Тихонову за совместную плодотворную работу.

277. Автор выражает благодарность за финансовую поддержку работы РФФИ (гранты 99-04-48822, 01-04-48128 и 03-04-48244) и 1ЫТА8 (грант 99-00433).

Информация о работе

Веселовский, Александр Владимирович
доктора биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.04

Диссертация

Компьютерное моделирование активных центров моноаминоксидаз и создание ингибиторов с заданной селективностью - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы