Комплексный препарат "Авилакт форте" на основе пробиотика для птицеводства

Калугин, Сергей Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Комплексный препарат "Авилакт форте" на основе пробиотика для птицеводства
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Комплексный препарат "Авилакт форте" на основе пробиотика для птицеводства"

На правах рукописи

КАЛУГИН Сергей Владимирович

Комплексный препарат «Авилакт форте» на основе пробиотика для птицеводства: разработка и доклинические исследования

03.00.23 - биотехнология 16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

17753

На правах рукописи

КАЛУГИН Сергей Владимирович

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в отделе обеспечения качества лекарственных средств для животных Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности РАСХН

Научный руководитель: кандидат биологических наук, старший науч-

ный сотрудник

Неминущая Лариса Анатольевна

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор

Еремец Владимир Иванович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Смоленский Владимир Иванович

Зашита диссертации состоится 25 ноября 2005 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д006.069.01 во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности РАСХН по адресу: 141142, Московская область, Щелковский р-н, п/о Кашинцево, пос. Биокомбинат.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИТИБП Автореферат разослан октября 2005 г.

доктор ветеринарных наук, профессор Субботин Владимир Викторович

Ведущее учреждение:

Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина

1. Общая характеристика работы

1.1. Актуальность работы. Одной из первых отраслей сельского хозяйства, перешедших на промышленную основу производства, является птицеводство. Доля препаратов для птиц составляет 95% мирового рынка лечебных препаратов для животных (более 7 млрд. долларов в стоимостном выражении). Как показывают научные исследования, постоянные стрессовые воздействия на поголовье, несбалансированное питание и нарушения санитарных норм содержания птицы вызывают значительные изменения в экологической нише штаммов микроорганизмов желудочно-кишечного тракта, изменения популяционного уровня кишечных бактерий. Стало очевидно, что интенсивные методы содержания птицы приводят к ослаблению здоровья, появлению новых заболеваний не выявленной этиологии, распространению кишечных инфекций, слабо поддающихся медикаментозному лечению (Воронин Е.С., 1994; Зинченко Е.В., Панин А.Н., 2000; Субботин В.В., 2005).

В связи с этим все более актуальной становится проблема профилактики, лечения и нормализации микробного баланса в пищеварительном тракте, минимизации последствий антибиотикотерапии, повышения эффективности выращивания и сохранности птицы, улучшения качества конечного продукта. Один из способов ее решения разработка и применение лекарственных средств нового поколения, которые характеризуются высокой биодоступностью и положительно влияют на микробиоценоз желудочно-кишечного тракта птицы, что приводит к оздоровлению всего организма в целом и снижению микробизма окружающей среды К их числу относятся эубиотики - пробиотики и пребиотики (Антипов В.А., 1991; Тихонов И.В., Грязнева Т.Н., 2003; Данилевская Н.В., Субботин В.В., 2005).

В последние годы накоплен значительный материал, отражающий действие различных пре- и пробиотических препаратов на сельскохозяйст-

венных животных, птицу, человека. Наиболее перспективным является создание симбиотиков - комплексов про- и пребиотиков, которые могут быть использованы для создания лечебно-профилактических препаратов, обладающих способностью положительно воздействовать на здоровье организма хозяина, повышать его естественную сопротивляемость, не оказывая при этом какого-либо отрицательного влияния на организм (Шевелева С.А., 1999; Панин А Н., Малик Н.И., 2002; Зинченко Е.В., 2002; тендеров Б.А., 2001; Воронин Е.С., 2003). Многие из симбиотиков влияют на гуморальный и клеточный иммунитет, зоотехнические показатели, могут служить естественными стимуляторами роста и обладать токсико- и ра-диопротективным действием, снижающим влияние неблагоприятных экологических факторов.

При разработке нового препарата необходимо учитывать перспективы его конкурентоспособности на рынке, одним из основных составляющих которой является качество. Под качеством лекарственного средства (J1C) понимается, прежде всего, его пригодность к применению, т.е. эффективность и безопасность (Мешковский А., 2003).

В связи с принятием Закона «Об основах технического регулирования в РФ», подготовкой России к вступлению в ВТО, установлению партнерских отношений с зарубежными фирмами и требованиями стандартов ИСО 9000: 2000 появились новые подходы к разработке, производству и применению J1C. Эти подходы реализованы в международных правилах лабораторной, клинической и производственной практики (Good Laboratory Practice - GLP, Good Clinical Practice - GCP, Good Manufacturing Practice - GMP), которые ужесточают контроль безопасности и эффективности ЛС на всех этапах его разработки, производства и применения.

законодательной базы разработан проект Технического Регламента «О требованиях к безопасности J1C для животных, процессов разработки, испытания, производства, изготовления, хранения, перевозки, реализации, применения и утилизации», содержащим в Приложении 6 требования к доклиническим испытаниям, по результатам которых формируется Досье на продукт Таким образом, реализация изложенных в Техническом Регламенте требований к разработке новых препаратов является актуальной, перспективной и представляет научный и практический интерес.

1.2. Цель работы - разработка, проведение доклинических испытаний и отработка схемы применения комплексного препарата для птицеводства «Авилакт форте», состоящего из пробиотика «Авилакт-1К» и пребио-тика «Авистим».

1.3. Задачи исследований:

1. Разработать состав и технологическую схему производства комплексного препарата «Авилакт форте», изготовить опытные серии пробиотика и пребиотика.

2. Провести оценку безвредности комплексного препарата и его компонентов по показателям: эмбриотоксичность; острая токсичность для мышей; безвредность для цыплят суточного возраста; раздражающее действие на слизистые оболочки птицы.

3. Определить антибиотико-резистентность и специфическую активность пробиотика «Авилакт-1 К» в опытах' in vitro (по степени подавления пробиотиком роста патогенных культур Salmonella и E.coli на селективных питательных средах); in vivo (по результатам контрольного заражения птицы культурой патогенного изолята Е. Coli).

4. Исследовать эффективность комплексного препарата «Авилакт форте» для бройлеров по: зоотехническим показателям (сохранность, продуктивные качества, затраты корма); показателям мясных качеств птицы и качества мяса; влиянию на неспецифическую резистент-

ность организма птицы и на эффективность вакцинации против нью-каслской болезни.

5. Отработать схему применения комплексного препарата «Авилакт форте».

6. В модельных экспериментах исследовать возможный механизм действия пребиотика.

1.4. Научная новизна. Разработан новый комплексный препарат «Авилакт форте» на основе пробиотика и способ его применения (подана заявка на изобретение «Кормовая добавка для птицеводства и способ выращивая сельскохозяйственной птицы» и получена приоритетная справка №2004112505/13(013541)).

Схема доклинических исследований нового препарата построена в соответствии с требованиями Правил СЬР. Определена безвредность препаратов на тест-системах различной сложности: куриных эмбрионах, мышах, цыплятах суточного возраста. Модифицирован ХЕТ-КАМ тест и показана возможность его применения для оценки потенциального раздражающего действия биологически активных добавок.

В хозяйстве, неблагополучном по колибактериозу, выделен патогенный изолят Е.соН, определена его летальная доза для цыплят и установлена степень защиты птицы с помощью препарата «Авилакт форте» при контрольном заражении.

Установлено положительное влияние препарата на эффективность вакцинации против ньюкаслской болезни птицы, переболевшей колибак-териозом.

Показано, что пребиотик «Авистим» обладает антиоксидантной активностью и уменьшает нитритную интоксикацию.

' 7.5. Практическое значение работы. В условиях опытного производства освоена технология изготовления препарата «Авилакт форте» и разработан комплект нормативной документации на

разработан комплект нормативной документации на производство и применение препарата.

Практическому птицеводству предложен способ применения препарата, обеспечивающий повышение сохранности цыплят в течение первого месяца жизни, когда резистентность птицы находится на низком уровне.

Разработана методика - модифицированный ХЕТ-КАМ тест, которая соответствует Директиве совета ЕЭС «О защите животных, используемых в экспериментальных и научных целях» и может использоваться как метод контроля потенциального раздражающего действия биологически активных добавок (БАД).

Методические подходы, разработанные в настоящей работе, вошли в «Положение о лаборатории доклинических испытаний потенциальных ЛС и БАД к кормам для животных», утвержденное Отделением Ветеринарной медицины РАСХН 28.01.01 г.

1.6. Основные положения, которые выносятся на защиту:

- Результаты разработки состава и принципиальная технологическая схема производства комплексного препарата «Авилакт форте»;

- результаты оценки безвредности препарата «Авилакт форте» и его компонентов;

- результаты определения специфической активности пробиотика и его резистентности к ряду широко используемых антибиотиков;

- результаты исследования эффективности комплексного препарата для цыплят-бройлеров;

- результаты исследования возможного механизма действия пре-биотика «Авистим».

1.7. Диссертация изложена на.....страницах машинописного текста

и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, предложений для практики, списка лите-

ратуры и приложения. Диссертация иллюстрирована 20 таблицами и 4 рисунками. Список использованной литературы содержит 120 источников, в том числе 30 - иностранных авторов.

1.8. Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены: на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 30-летию института, 8-9 июня 2000 г (Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности, Щелково, 2002); на двух Международных конференциях молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (Щелково, 2001 и 2004 гг.); на 6-й Украинской конференции по птицеводству (Алушта, 2005 г.).

2. Собственные исследования

2.1. Материалы и методы исследований

Работа выполнена в 1999-2005 гг. в отделе обеспечения качества лекарственных средств для животных ВНИТИБП (г.Щелково) и виварии опытного хозяйства ЭПХ ВНИТИП (г. Сергиев Посад) при участии сотрудников институтов ГосНИИСинтезбелок, ВГНКИ ветпрепаратов, МГАВМИБ им. Скрябина в соответствии с Планом НИОКР по заданию 06.02.01 «Разработать и освоить производство и способы применения новых лечебно-профилактических препаратов - биофармкомплексов на основе пробиотиков» и планом ВНИТИБП №02.02.0012997 «Разработать нормативные документы в соответствии с международными требованиями, регламентирующими качество, эффективность и'безопасность биопроизводства».

2.1.1. Материалы

Объект исследования - комплексный препарат для птицеводства «Авилакт форте», состоящий из пробиотика «АвилаюЧК» и пребиотика

«Авистим». «Авилакт-1 К» - бактериальный препарат из группы пробиоти-ков, содержащий в 1 см3 не менее 200 млн. живых клеток молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophilus штамма 1К, выделенного из организма ць;пленка. «Авистим» - препарат из группы пребиотиков, представляет собой культуральную жидкость, получаемую при культивировании высшего лечебного гриба Fusarium sambucinum шт. MKF-2001-3 и содержащую в своем составе аминокислоты (включая незаменимые), микроэлементы и витамины А, Е, Н, группы В (1-3,5,6,12).

Животные: SPF-эмбрионы возрастом 9-10 суток, цыплята - бройлеры кроссов «Конкурент-2» и «Кобб-500», нелинейные белые мыши, крысы-самцы линии «Вистар».

Культуры: Изолят E.coli, выделенный в 2000 г. в ЭПХ ВНИТИП (г.Сергиев-Посад) из организма больной птицы. Полевые штаммы патогенных культур эшерихий (К-88, К-99, А-20Е) и сальмонелл (Salmonella tuphimurium, Salmonella Dublin, Salmonella gallinarum).

Среды: среда №23 (селективная для лактобактерий), Эндо, МПА, МПБ, агар Сабуро, среды для культивирования лактобактерий и культуры гриба.

Препараты: коммерческий препарат «Лактобактерин», сухой, медицинский, (производства НПО «Биомед», г Пермь); антибиотики.

2.1.2. Методы

Раздражающее действие исследовали по модифицированной методике ХЕТ-КАМ Тест (Лукьянов А.С., 1998).

Безвредность определяли по результатам наблюдения в течение 10 суток за цыплятами суточного возраста после выпаивания им пятикратной дозы препарата.

Эмбриотоксичность оценивали по жизнеспособности SPF-эмбрионов после введения в аллантоисную полость 0,2 мл препарата.

Антагонистическую активность в отношении патогенных микроорганизмов исследовали- in vitro - для 3-х штаммов сальмонелл и 3-х штаммов эшерихий; in vivo - для патогенного изолята E.coli; степень защиты определяли по результатам контрольного заражения.

Определение приживляемости лактобактерий в кишечнике птицы проводили по результатам высева содержимого кишечника на селективную среду.

Зоотехнические показатели (сохранность, живая масса и скорость роста, затраты корма), определяли в соответствии с Методическими рекомендациями «Проведение исследований по технологии производства яиц и мяса птицы» (г.Сергиев-Посад, 1994 г.).

Мясные качества птицы определяли согласно с «Методическими рекомендациями по проведению анатомической разделки тушек и органо-лептической оценки качества мяса и яиц сельскохозяйственной птицы, и морфологии яиц» (г.Сергиев-Посад, 2001).

Эффективность вакцинации против ньюкаслской болезни оценивали по содержанию антител в сыворотке крови после вакцинации птицы, клинически здоровой и зараженной полевым изолятом E.coli.

Клинические, биохимические и иммунологические показатели крови определяли в соответствии с «Методическими рекомендациями по контролю и сохранению естественной резистентности птиц в промышленном птицеводстве» (1987 г.).

Исследования острой токсичности на мышах проводили общепринятым методом (пб ЛД50).

Компенсацию нитритной интоксикации определяли по соотношению метгемоглобина и гемоглобина в крови крыс спектрофотометрическим методом по Кушаковскому М.С. (1968 г.).

Исследования антиоксидантной активности образцов пребиотика проводили с помощью прибора «Яуза AAA 01» на базе ОАО «НПО Хи-

мавтоматика» по величине окислительно-восстановительного потенциала, определяемого амперометрическим титрованием (Зуев Е.Т., Яшин Я.И., 2004 г.).

Статистическую обработку полученных результатов проводили по методу Стьюдента в модификации Ашмарина И.П. (1971 г.).

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Изготовление опытных серий препарата

Изготовлено в условиях опытного производства ВНИТИБП 16 опытных серий пробиотика «Авилакт-1К» (12 серий в жидкой форме и 4 серии - в сухой) и 14 серий пребиотика «Авистим». Все серии препаратов прошли испытания на безвредность и эффективность.

Разработаны опытно-промышленные регламенты и стандарты организаций (ТУ) на пробиотик «Авилакт-1 К» и пребиотик «Авистим».

2.2.1.1. Получение пробиотика «Авилакт-1 К».

Культивирование молочнокислых бактерий (штамм 1К, выделенный

из организма цыпленка, депонирован во Всероссийской коллекции Промышленных Микроорганизмов №В-2991, ГосНИИгенетика) проводили в биореакторе АК 210 при автоматическом контроле pH и температуры процесса.

Питательную среду для культивирования лактобактерий, содержащую обезжиренное молоко (ОМ), гидролизат ОМ и молочную сыворотку, готовили в бутылях. Количество жизнеспособных бактерий определяли методом титрования на селективной среде по окончании процесса культивирования. Пробиотик в сухом виде получали методом сублимационного высушивания. Определяли выживаемость бактерий до и после сушки.

2.2.1.2. Получение биомассы гриба и культуральной жидкости (КЖ). Культуру гриба Fusarium sambucinum MKF 2001-3 (ВКПМ №F-867) выращивали в лабораторных условиях в колбах на качалках во ВНИТИБП, для получения более объемных серий - в ферментере на стендовой установке в

ГосНИИсинтезбелок, используя питательную среду на основе молочнокислой сыворотки. КЖ отделяли фильтрованием на воронке Бюхнера с последующей стерилизующей фильтрацией на полых волокнах.

Физико-химический и биохимический состав КЖ определяли на базе исследовательской лаборатории ГосНИИсинтезбелок:

- общий состав (сухие вещества - 32,2 г/л, общий белок - 2,5 г/л, углеводы - 13,0 г/л);

- микро- и макроэлементы: калий (1850 мг/л), кальций (1210 мг/л), фосфор (460 мг/л), железо (0,6 мг/л), медь (0,24 мг/л), цинк (3,4 мг/л), магний (124 мг/л), марганец (0,06 мг/л);

- широкий спектр аминокислот;

- органические кислоты (общее содержание - 10,9 г/л, в том числе в г/л лимонная, янтарная и уксусная - по 0,5; яблочная - 0,4; фумаро-вая и щавелевая - по 0,3);

- витамины группы В (в мг/мл В, - 0,18; В2 - 2,20; В3 - 1,20; В5 - 192; В6-0,1; В|2— 0,5).

2.2.2. Испытание безвредности препаратов

2 2 2 ! Исследовали эмбриотоксичность 4 лабораторных серий препарата и его компонентов. Препараты вводили в дозе 0,1-0,2 мл SPF-эмбрионам в возрасте 9-10 суток в аллантоисную полость (по 15 штук в группе) и инкубировали, вплоть до вывода цыплят.

Таблица 1

Результаты исследования эмбриотоксичности препарата

Препарат Доза Кол- Результаты (п=4)

введения. во гол % выживших эмбрионов Количество цып-

мл в лят/эмбрионов с патоло-

группе ией развития

1 2 3 4 1 2 3 4

, 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Авнлакт 0.1 15 100 100 93 100 0/0 0/0 о/о о/о

1К 0,2 15 93 100 93 93 0/0 0/0 о/о о/о

«Лвиспим» 0.1 15 100 100 100 93 0/0 о/о о/о о/о

0,2 15 93 100 100 93 1/0 о/о о/о о/о

1 2 3 4 5 6 7 I 8 9 10

«Авилакт 0,1 15 100 100 100 100 0/0 0/0 о/о 1/0

форте 0,2 15 93 100 100 100 о/о 1/0 о/о 0'0

Контроль 0,1 15 94 100 100 100 1/0 о/о Ó/0 о/о

физраствор 0,2 15 100 93 100 100 о/о о/о о/о о/о

Показано отсутствие эмбриотоксичности и тератогенности исследуемых препаратов.

2 22 2 Определение раздражающего действия на хориоаллантоис-ную оболочку куриного эмбриона (ХЕТ-КАМ тест модификация)

Определяли раздражающее действие 4 экспериментальных серий комплексного препарата и его компонентов.

Таблица 2

Результаты ХЕТ-КАМ теста (п=4)

Испытуемый Доза Кол-во Наличие раздражающего действия испытуемых

препарат введения, эмбрио- препаратов

мл нов, шт 1 2 3 4 5

Авилакт - 0,2 5 +/- - - - -

1К 5 - - - - +/-

«Авистим» 0,2 5 - +/- +/- - -

5 - - - - -

«Авилакт 0,2 5 +/- - - -

форте» 5 - - - - +/-

Контроль 0,2 5 - - +/- - -

физ рас-р 5 - - - - -

Показано отсутствие потенциального раздражающего действия исследуемых препаратов.

22 2 3 Безвредность для цыплят суточного возраста Цыплятам суточного возраста выпаивали по 0,5 мл пробиотика и по 5 мл КЖ однократно. Испытывали 4 серии препарата, по 10 голов в каждой группе. Все цыплята к концу срока наблюдения были живы, не наблюдалось угнетения поведенческих реакций птицы и активности поедания кормов.

2 2 2 4 Острая токсичность

При исследовании острой токсичности комплексного препарата и его компонентов на мышах в течение периода наблюдения (8 суток) ни одного случая гибели животных не наблюдали, что свидетельствует об отсутствии токсичности препаратов.

Таким образом, показано, что комплексный препарат и его компоненты не токсичны для эмбрионов и мышей, безвредны для цыплят и не обладают раздражающим действием. В дальнейшем все экспериментальные серии препаратов проходили испытания на эмбриотоксичность и по ХЕТ-КАМ тесту.

2.2.3. Специфическая активность

2.2.3.1. Исследования in vitro антагонистической активности пробио-тика «Авилакт-1К» в отношении патогенных микроорганизмов.

Антагонистическую активность определяли при культивировании пробиотика совместно с патогенными микроорганизмами. На селективную для лактобацилл среду подсевали культуры патогенных микроорганизмов (I мл посевного материала содержал 500 млн. микробных клеток в физиологическом растворе). После процесса инкубации измеряли зону задержки роста исследуемых культур вблизи лакгобактерий.

Таблица 3

Антагонистическая активность в отношении патогенных микроорганизмов

Патогенные микроорганизмы Зона задержки роста, мм

S tuphimurium 5

S.dublin 7

S.galimarum 7

E.coli. K-88 8

E coli K-99 8

Е coli А-20 7

Е coli (полевой изолят) 10

Показана антагонистическая активность культуры Lactobacillus acidophilus штамм 1К в отношении данных микроорганизмов.

2 2 3 2 Определение in vivo антагонистической активности про-биотика в отношении патогенного изолята Е coli

Для выделения патогенного изолята E.coli стерильно извлекали из цыплят костный мозг и другие внутренние органы, делали посевы' отпечатки на питательные селективные среды. Для выделенного штамма í

' E.coli установлена ЛД50 для мышей (500 млн. клеток). По результатам за-

ражения птицы (3 опыта) различными дозами E.coli рассчитана средняя доза (ЛД50) для цыплят и определен ее доверительный интервал для кон-■м трольной группы (К) и группы, получившей пробиотик (Л):

ЛД50 (К) = (7,12±0,12) • 106кл/мл « ЛД50 (Л) = (2,33±0,11) • 107 кл/мл

Применение пробиотика позволило увеличить выживаемость птицы при контрольном заражении на 30-40%.

По результатам опытов показано:

- изолят Е. coli, выделенный от больной птицы, может служить штаммом-пробойником (в разведении Ю"2) при контрольном заражении птицы;

- испытуемый пробиотик достоверно обладает антагонистической активностью против патогенной культуры Е. coli.

2.2.3.3. Результаты определения чувствительности лактобактерий штамма 1К к ряду широко применяемых антибиотиков приведены в табл.4.

Таблица 4

Результаты определения чувствительности лактобактерий * штамма IK к ряду широко применяемых антибиотиков

№ Антибиотик Диаметр зоны задержки роста (мм)"

п/п разведение пробиотика

10"¿ 10

1 2 3 4

1 Кламоксил 50 49

2 Левомицетин 39 40

3 Тетрациклин 37 38

4 Цефазолин 29 30

5 Ампициллин 28 30

6 Рифампицин 27 31

7 Гентамицин 22 22

1 2 3 4

8 Офлоксацин 12 15

9 Ципрофлоксацин 12 11

10 Энрофлон (5%) 12 11

11 Флавомицин 11 11

12 Линкомицин 11 11

Показано, что лактобактерии являются: высокочувствительными к кламоксилу, левомицетину, тетрациклину, цефазолину, ампициллину, ри-фампицину и гентамицину; умеренно чувствительными к офлоксацину, ципрофлоксацину, энрофлону, флавомицину и линкомицину.

2 2 3.4 Приживляемость лактобактерии в кишечнике птицы Для определения количества лактобактерий вскрывали опытную птицу на десятый день после окончания дачи пробиотика. Стерильной пипеткой брали содержимое тонкого и толстого отдела кишечника и ресус-пендировали в пробирках с физиологическим раствором. Полученную суспензию в объеме 0,2 мл переносили на чашки Петри со средой №23. В конце процесса инкубации производили подсчет выросших колоний.

По результатам 4 опытов показано, что приживляемость лактобактерий составляла не менее 106 КОЕ/мл на 10-й день после прекращения применения препарата.

2.2.4. Исследование эффективности препарата для бройлеров На цыплятах-бройлерах двух кроссов «Конкурент» и «Кобб-500» поставлено 10 опытов, суммарное количество птицы — 2150 голов. Во время опытов учитывали зоотехнические показатели (живая масса, прирост, сохранность и затраты корма), показатели мясных качеств птицы и качества мяса, титры антител в сыворотке крови птицы после вакцинации против НБ.

2 2.4 1 Результаты определения зоотехнических показателей и качества мяса птицы, получавшей комплексный препарат и отдельно про-биотик, приведены в табл.5 (контрольная группа не получала препаратов).

Таблица 5

Результаты определения зоотехнических показателей (п=9)

и качества мяса (п=3)

Показатель Препарат Контроль

Авилакт-1К Авилакт форте

Живая масса (%) 102,5±0,5 105,5±1,5 100

Прирост (%) 103,2±1,0 107,4±2,0 100

Сохранность (%) 92,3 97,4 90,3

Затраты корма (%) 93,5 88,3 100

Содержание белка в 21,29-25,89 20.56-25,16 21,11-25,71

мясе птицы, %

Содержание жира в 0,81-1,11 0,87-1,07 1,21-1,49

мясе птицы, %

Результаты определения мясных качеств птицы, получавшей препа-

рат Авилакт форте, приведены в табл.6.

Таблица 6

Результаты анатомической разделки цыплят-бройлеров

Показатель Препарат

П эобиотик Авилакт форте Контроль

г % от потрошенной тушки г % от потрошенной тушки г % от потрошенной тушки

1 2 3 4 5 6 7

Масса потрошеной тушки 1416,0 1530,8 1403,8

Убойный выход 67,1 70,4 67,6

Грудь

мышцы 345,7 24,42 361,6 23,63 322,2 22,96

в т ч филе 291,7 20,63 308,4 20,16 277,6 19,78

Бедро

Мышцы 198,0 13,98 208,0 13 58 177,5 12 65

Внутренний жир 39,7 2,80 35.1 3,60 34,1 2,43

Съедобные части

Мышцы 836,45 59,07 903,1 58,99 835,9 59,55

Отношение съедобных частей к несъедобным 5,00 5.23 5,10

Отношение массы мышц к массе костей 3,62 3,75 3,52

Анализ результатов, приведенных в таблицах 5 и 6, показывает, что применение препарата «Авилакт форте» способствует улучшению зоотехнических показателей и повышению мясных качеств птицы по сравнению с применением одного пробиотика и, тем более, с контролем (обычный режим кормления).

2 2 4 2 Исследование влияния комплексного препарата и пробиотика на эффективность вакцинации птицы против ньюкаслской болезни (НБ)

Птицу всех групп вакцинировали в первом опыте интраназально в возрасте 18-суток, во втором опыте птицу, выжившую после контрольного заражения полевым изолятом E.coli, вакцинировали через 12 дней после заражения. Результаты исследований приведены в таблице 7.

Таблица 7

Титры антител к вирусу НБ в сыворотке крови

вакцинированной птицы

/ опыт - здоровая птица

Препарат Титры антител

через 2 недели через 3 недели

Контроль 64, 16, 16 62, 16, 16, 16, 16, 8,4

Авилакт 1К 128, 128,64,32 64,32,32, 16, 8,4,4

Авилакт форте 512,256, 128,64 64, 64, 32,16, 8,4

U опыт - переболевшая птица

Разведение Е coli Титры антител

Контроль Авилакт форте

ю- - 16, 32, 16. 16

кГ 4, 8, 16 8, 16, 16, 16,32, 32

10" 4,4,4,32 32, 64, 64

10" 4,8, 8, 16 8,8, 64, 64

Показано, что пробиотик и комплексный препарат не оказывали отрицательного влияния на уровень специфических антител к вирусу НБ у здоровой птицы и достоверно увеличивали титр антител у переболевшей птицы (по сравнению с контрольной группой, не получавшей «Авилакт форте»).

2 2 4 3 Оценка естественной резистентности птицы Для исследования брали кровь у птицы через 12 суток после окончания применения препарата.

Таблица 8

Показатели физиологического статуса птицы

Показатели Норма Авилакт форте Контроль

Эритроциты млн/мм3 2,89 ± 0,05 2,80 ± 0,08 2.75 ± 0,05

Гемоглобин, г % 8,92 ±0,12 8,90 ±0,11 7,69 ± 0.09 Г 1,0и 0.63

Лизоцим, мкг/мл 10,80 ±0,51 9,85 ± 0.62

Комплемент, % гемолиза 19,94 ±0,55 18,81 ±0,61 17,80 ±0,51 19.65 ±0,44

Холинэстераза МкМ/ч 19,72 ±0,42 19.23 ±0,42

Содержание ЛКБ, ед 1,23 ±0,14 1,02 ±0,12 1 09 ±0.11

% завершенного фагоцитоза 18-20 18 18

По результатам проведенных исследований установлено, что определяемые показатели находились в пределах колебаний, характерных для здоровой птицы и не отличались в опытной (получали «Авилакт-форте») и контрольной (не получали препарат) группах.

2.2.5. Разработка способа применения препарата Использовали следующие схемы применения препарата: №1 - жидкую форму пробиотика, дозы 0,5; 0,1; 0,05 и 0,025 мл/гол выпаивали ежедневно в течение 7 недель.

№2 - жидкую форму пробиотика, доза 0,1 мл/гол (107 КОЕ/гол) в сутки, разводили препаратом Авистим, взятом в соотношении 1:10 к суточной дозе питьевой воды и выпаивали через вакуумные или ниппельные поилки двумя курсами: с 1 по 10-е сутки и с 21 по 30-е сутки.

№3 - сухой пробиотик в дозе 0,3 г/гол в сутки (1 доза - 107 КОЕ/гол) смешивали с кормом, препарат «Авистим» смешивали с питьевой водой в соотношении 1:10 (по объему) и выпаивали одновременно со скармливанием пробиотика двумя курсами: с 1 по 10-й день и с 21 по 30-й день

Эффективность испытуемых схем оценивали по увеличению живой массы птицы и степени колонизации кишечника лактобактериями.

При использовании первой схемы живая масса птицы в опытной группе (пробиотик) превышала таковую в контрольной на 5,2; 5,3; 3,1; 1,8% соответственно дозам пробиотика 0,5; 0,1 и 0,025 мл/гол в сутки. Оптимальной являлась доза 0,1 мл/гол, что соответствовало 107 КОЕ/гол. Однако при переходе с вакуумных поилок на ниппельные длительный курс выпаивания приводил к забиванию поилок остатками пробиотика и тем самым к уменьшению дозы, которую получала птица, и загрязнению поилок.

Вторая схема применения по эффективности не уступала первой, однако было установлено, что выживаемость лактобактерий в питьевой воде быстро снижалась (в 15 раз через 4 часа после начала выпаивания, в 60 раз через 8 часов и в 80 раз через 16 часов). Полученные данные свидетельствовали в пользу применения сухой формы пробиотика.

Результаты применения препарата по третьей схеме свидетельствовали в пользу ее эффективности: прирост живой массы увеличился на 7,3% по сравнению с контролем, приживляемость лактобактерий составила 1,2 ■ 107 КОЕ/мл. По технологичности данный способ больше отвечает условиям промышленного птицеводства.

В результате проведенных исследований отработана схема применения препарата для двух форм пробиотика, которая выглядит следующим образом:

- жидкий пробиотик в дозе 0,1 мл/гол в сутки разводят препаратом «Авистим», взятом в соотношении 1:10 к суточной дозе питьевой воды и выпаивают птице двумя курсами: с 1-го по 10-й день и с 21-го по 30-й день; ч

- сухой пробиотик в дозе 0,3 г/гол в сутки смешивают с кормом, препарат «Авистим» разводят питьевой водой в соотношении 1:10

к суточной дозе питьевой воды и выпаивают одновременно со скармливанием пробиотика двумя курсами, с I по 10 и с 21 по 30 дни.

2.2.6. Исследование возможного механизма действия пребиотика «Лвистим»

2 2 61 Компенсацию нитритного отравления с помощью пребиотика моделировали в опытах на крысах Острую нитритную интоксикацию вызывали однократной инъекцией (внутрибрюшинно) 2 мл водного раствора ЫаТ"Ю2.

Известно, что под действием нитрита Ре2< в молекуле гемоглобина окисляется до Ре34 (гемиглобин или метгемоглобин), что блокирует связывание и доставку кислорода кровью к тканям. В таблице 9 приведены результаты измерения общего гемоглобина и изменения содержания (%) метгемоглобина в крови животных при нитритном отравлении. Опытная группа - животные, которые длительное время употребляли препарат «Авистим». Контрольная группа получала физиологический раствор по той же схеме, что и «Авистим».

Таблица 9

Содержание гемоглобина (г/л) и метгемоглобина (%) в крови крыс при нитритной интоксикации (п=3)

Группа живот- Продолжительность нитритной интоксикации после инъекции №N0:

ных 6-8 голов 0 ! 30 _ _ 60 90

1. Содержание гемоглобина (г/л)

Контроль 167±10 | 165±9 !68±7 171±9

Авистим 173±9 1 166±8 172±10 169±7

2 Содержание метгемоглобина (г/л)

Контроль 0,11 ±0,07 | 7,94±0,40 8,00±0,44 4,73±0,25

Авистим 0,28±0,11 | 5,77±0,33 6,39±0,48 3,31 ±0,23

Показано, что на фоне постоянного содержания гемоглобина достоверно снижается по сравнению с контролем доля метгемоглобина в крови крыс, получавших пребиотик, то есть пребиотик способен компенсировать токсичность афлатоксинов в недоброкачественных кормах.

2 2 6 2 Исследование антиоксидантной активности (АА) пребиоти-ка «Авистим»

Величину АА пребиотика определяли в сравнении с дигидрокверце-тином - веществом, обладающим выраженной АА и служащим в подобных исследованиях общепринятым маркером (табл.10 )

Таблица 10

Величина АА пребиотика (в пересчете на дигидрокверцетин)

№ Исследованный образец Сигнал прибо- Отношение АА

ра площадь пи- площади пиков (мг/мл)

ков на хрома- иссл образца к

тограмме) площади пика

(п=5) дигидрокверце-

тина

1 ' «Авистим», с 1 8135 5,95 0,59

2 «Авистим», с 2 7944 5,81 0,58

3 «Авистим», с 3 7589 5,55 0,55 0,10

4 Дигидрокверцетин 1366 1,0

Полученные данные подтверждали наличие выраженной антиоксидантной активности пребиотика и его возможное защитное действие на организм в условиях различных стрессов.

3. Выводы

1. Разработан состав и технологическая схема производства комплексного препарата «Авилакт форте». В условиях опытного производства ВНИТИБП освоена технология и изготовлены: 16 опытных серий пробиотика «Авилакт-1 К» (12 серий - в жидком виде, 4 серии - в сухом) и 14 серий пребиотика «Авистйм» для доклинических исследований.

2. Испытания безопасности комплексного препарата «Авилакт форте» и его компонентов на тест-системах различной сложности показали:

- отсутствие токсичности для БРР-эмбрионов и мышей;

- безвредность для цыплят суточного возраста;

- отсутствие раздражающего действия на слизистую оболочку (модифицированный ХЕТ-КАМ тест).

Установлено, что пробиотик «Авилакт-1К» обладает антагонистической активностью:

- in vitro по отношению к патогенным штаммам сальмонелл (S.tuphimurium, S dublin, Sgallinarum) и эшерихий (К-88, К-99, А-20 и полевого изолята E.coli): диаметр зоны задержки роста исследуемых культур вблизи Lact acidophilus составлял 5-10 мм;

- in vivo по отношению к полевому изоляту E.coli: применение про-биотика позволяет увеличить выживаемость птицы при контрольном заражении на 30-40%.

Показано, что пробиотик «Авилакт-1К» обладает умеренной чувствительностью к офлоксацину (12 мм), ципрофлоксацину (12 мм), эн-рофлону (12 мм), флавомицину (11 мм), линкомицину (11 мм) и высокой чувствительностью к кламоксилу (50 мм), левомицетину (39 мм), цефазолину (29 мм), ампициллину (28 мм), рифампицину (27 мм), гентамицину (22 мм), тетрациклину (37 мм). Установлено, что применение комплексного препарата «Авилакт форте» для цыплят-бройлеров:

- повышает зоотехнические показатели (увеличение живой массы и ее прироста на 4-9%, сохранности птицы на 2-5%, уменьшение затрат корма на 5-10%);

- способствует улучшению качества мяса (без изменения содержания белка содержание жира в мясе уменьшается на 38-39%) и увеличению доли съедобной части (на 2,5-6,5%).

- не оказывает отрицательного влияния на эффективность вакцинации против ньюкаслской болезни клинически здоровой птицы и

повышает эффективность вакцинации птицы, переболевшей ко-либактериозом.

6 Отработаны схемы применения препарата «Авилакт форте» для двух форм пробиотика (сухой и жидкой) и разработана «Инструкция по применению комплексного препарата «Авилакт форте».

7. Показано, что пребиотик «Авистим»:

- обладает антиоксидантной активностью, в 5 раз превышающей активность маркера - дигидрокверцетина;

- способен снижать нитритную интоксикацию (по снижению на 1,5-2,0% относительного содержания метгемоглобина в крови крыс, подвергнутых нитритной интоксикации).

4. Практические предложения

Разработаны проекты нормативной документации на производство и применение препарата: технологические регламенты опытно-промышленного производства и стандарты организации (технические условия) на пробиотик «Авилакт-1К» и пребиотик «Авистим» и инструкция по применению комплексного препарата «Авилакт форте».

Результаты работы включены в «Положение о лаборатории доклинических испытаний потенциальных лекарственных средств и биологически активных добавок к кормам для животных», утвержденное Отделением Ветеринарной медицины РАСХН 28.12.01 г.

Модифицированная методика ХЕТ-КАМ теста включена в «Методические рекомендации по определению потенциальной токсичности биологически активных добавок к кормам», утвержденные директором ВНИ-ТИБП 25.04.01 г.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Калугин C.B. Исследование эффективности пробиотика «Авилакт-1К» для цыплят бройлеров. / Научные основы производства ветеринарных биологический препаратов / Тезисы докладов Всероссийской научно-практической конференции, посвяшенной 30-летию института, 8-9 июня 2000 г. /Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности, Щелково, 2000. с. 347.

2. Калугин C.B., Ковальская J1.A., Сазанова Э.Я., Калугин C.B., Токарик Э.Ф., Филоненко В.И., Воробьева Г.И. Препараты для птиц «Авилакт-1К» и «Авинорм-3» - биофармкомплексы на основе пробиотиков и биологически активных добавок. / Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов. / Тезисы докладов Всероссийской научно-практической конференции, Щелково, 2000, с.45-47.

3. Еремец В.И., Токарик Э.Ф., Еремец Н.К., Калугин C.B. Положение о лаборатории доклинических испытаний потенциальных лекарственных средств и биологически активных добавок к кормам для животных, М., 2001,26 с.

4. Калугин C.B., Ипатов A.B., Еремец A.B., Ковальская J1.A. Разработка технологический процессов изготовления и контроля пробиотика «Авилакт-1К» / Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов./ Сб.докладов межд.конф. молодых ученых. Щелково, 2001, с.88-91.

5. Ипатов А.В, Калугин C.B., Скотникова Т.А., Еремец В.И., Токарик Э.Ф. / Влияние пробиотического препарата «Авилакт форте» на результаты вакцинации бройлеров против ньюкаслской болезни. / Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов. / Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности, Щелково, 2004, с.ЗЗ.

6. Калугин C.B., Зуев И.В., Неминущая J1.A., Еремец В.И., Самуйленко А.Я. Исследование эффективности различных лекарственных форм препарата «Авилакт форте» для птиц. / Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов. / Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности, Щелково, 2004, с.84.

7. Мальцев О.В., Калугин C.B., Еремец В.И., Еремец Н.К. Доклинические исследования потенциальной токсичности биоингредиентов на биотест-системах различной сложности. / Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов. / Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности, Щелково, 2004, с.89.

8. Неминущая Л.А., Еремец В.И., Зуев И.В., Калугин C.B., Салеева И.П. Эффективность применения пробиотиков «Авилакт-1 К» и «Лактобак-терин» при выращивании цыплят-бройлеров./ Пробиотики, пребиоти-ки, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы. / Тезисы доклада международной конференции, М„ 2004, с.153.

9. Неминущая Л.А., Токарик Э.Ф., Шоль В.Г., Филоненко В.И., Салеева И.П., Скотникова Т.А., Воробьева Г.И., Самуйленко А.Я., Калугин C.B., Еремец В.И. Кормовая добавка для птицеводства и способ выращивания сельскохозяйственной птицы. Приоритетная справка о выдаче патента РФ на изобретение №2004112505 от 02.07.2004 г.

10 Неминущая Л.А., Еремец В.И., Токарик Э.Ф , Еремец H К., Зуев И.В., Албулов А И., Воробьева Г.И., Калугин C.B. Испытание различных лекарственных форм препарата «Авилакт форте» для птиц. / Материалы 6-й Украинской конференции по птицеводству с международным участием. / Птахтництво, вип.57, 2005 г., с.430-433.

frf

)

>> 4

I 20238

РНБ Русский фонд

2006-4 17753

Отпечатано в ООО «Мещера» МО г. Щелково, ул Свирская, д 8а тир 100 экз эак №521

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Калугин, Сергей Владимирович

1. ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность темы

1.2. Цель и задачи исследований

1.3. Научная новизна

1.4. Практическое значение работы

1.5. Основные положения, которые выносятся на защиту

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Факторы, индуцирующие изменение кишечной микрофлоры

2.2. Пробиотики

2.2.1. Определение и свойства пробиотиков

2.2.2. Критерии отбора штаммов пробиотиков

2.2.3. Механизмы действия пробиотиков

2.2.4. Технологические аспекты изготовления пробиотических препаратов

2.3. Пребиотики

2.4. Доклинические исследования новых лекарственных средств

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Материалы

3.2. Методы

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

4.1. Изготовление опытных серий препаратов

4.2. Испытание безвредности препаратов

4.3. Определение специфической активности

4.4. Исследование эффективности препарата для бройлеров

4.5. Разработка способа применения препарата «Авилакт форте»

4.6. Исследование возможного механизма действия пребиотика «Авистим»

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

6. ВЫВОДЫ 93 • 7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Комплексный препарат "Авилакт форте" на основе пробиотика для птицеводства"

1.1.Актуальность темы.

Одной из первых отраслей сельского хозяйства, перешедших на промышленную основу производства, является птицеводство. Доля препаратов для птиц составляет 95% мирового рынка лечебных препаратов для животных (более 7 млрд. долларов в стоимостном выражении). Как показывают научные исследования, постоянные стрессовые воздействия на поголовье, несбалансированное питание и нарушения санитарных норм содержания птицы вызывают значительные изменения в экологической нише штаммов микроорганизмов желудочно-кишечного тракта, изменения популяционного уровня кишечных бактерий. Стало очевидно, что интенсивные методы содержания птицы приводят к ослаблению здоровья, появлению новых заболеваний не выявленной этиологии, распространению кишечных инфекций, слабо поддающихся медикаментозному лечению (18,32).

В связи с этим все более актуальной становится проблема профилактики, лечения и нормализации микробного баланса в пищеварительном тракте, минимизации последствий антибиотикотерапии, повышения эффективности выращивания и сохранности птицы, улучшения качества конечного продукта. Один из способов ее решения — разработка и применение лекарственных средств нового поколения, которые характеризуются высокой биодоступностью и положительно влияют на микробиоценоз желудочно-кишечного тракта птицы, что приводит к оздоровлению всего организма в целом и снижению микробизма окружающей среды. К их числу относятся эубиотики - пробиотики и пребиотики (2,21,74,82).

В последние годы накоплен значительный материал, отражающий действие различных пре- и пробиотических препаратов на сельскохозяйственных животных, птицу, человека. Наиболее перспективным является создание симбиотиков - комплексов про- и пребиотиков, которые могут быть использованы для создания лечебно-профилактических препаратов, обладающих способностью положительно воздействовать на здоровье организма хозяина, повышать его естественную сопротивляемость, не оказывая; при этом какого-либо отрицательного влияния на организм (19,32,58,90). Многие из симбиотиков влияют на гуморальный и клеточный иммунитет, зоотехнические: показатели, могут служить естественными стимуляторами роста и обладать токсико- и радиопротективным действием, снижающим влияние неблагоприятных экологических факторов.

При разработке нового препарата необходимо учитывать перспективы его конкурентоспособности на рынке,. одним из основных составляющих которой является: качество. Под качеством лекарственного средства (JIC) понимается, прежде всего, его пригодность к применению, т.е. эффективность и безопасность (52).

В связи с принятием Закона РФ «О Техническом Регулировании», подготовкой России к вступлению в ВТО, установлению партнерских отношений с зарубежными фирмами и требованиями стандартов ИСО 9000: 2000 появились новые подходы к разработке, производству и применению JIC. Эти подходы реализованы в международных правилах лабораторной, клинической и производственной практики (Good Laboratory Practice - GLP, Good Clinical Practice - GCP, Good Manufacturing Practice - GMP), которые ужесточают контроль безопасности и эффективности ЛС на всех этапах его разработки, производства и применения(ЗО).

Правила GLP делают обязательными доклинические исследования эффективности и безопасности лекарственных средств. В целях гармонизации с международными правилами национальной нормативно-законодательной базы разработан проект Технического Регламента «О требованиях к безопасности JIC для животных, процессов разработки, испытания, производства, изготовления, хранения, перевозки, реализации, применения и: утилизации», содержащий в Приложении 6 требования к доклиническим испытаниям, по результатам которых формируется Досье на продукт. Таким образом,, реализация изложенных в;Техническом; Регламенте требований к разработке новых препаратов* является актуальной, перспективной* и представляет научный и практический интерес.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Калугин, Сергей Владимирович

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Калугин, Сергей Владимирович, Щёлково

1. Авакян А.Д. Изменение картины белой крови при применении культуральной жидкости желтого гриба. Материалы первого Всероссийского конгресса по медицинской миологии «Успехи медицинской микологии».

2. Антипов В.А. Использование пробиотиков в животноводстве. //Ветеринария, 1991, №4, с. 55-58.

3. Антипов В.А., Ермакова Т.И. Новые отечественные пробиотики (Пропиацид и энтерацид). Тезисный доклад международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарно-санитарного контроля с.-х. продукции». М., 1995, с.71-72.

4. Антипов В.А., Кременпикова В.И. Фармако-токсикологические свойства ацидофилина. //Ветеринария, 1987, №6, с.57-59.

5. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Ленинград, 1962, с.127-130.

6. Бабкина М. П. Коррекция иммунного статуса и повышение продуктивности цыплят бройлеров пробиотиками. «Актуальн. пробл. интенсивн. развития животноводства». Горки, 1998, с.201-207.

7. Башкиров O.K. «Биоплюс 2Б» натуральный пробиотик с широким спектром профилакторной активности. //Зооиндустрия, 2002, №2, с.24-27.

8. Белова Н.В., Природа биологической активности высших грибов. Материалы первого Всероссийского конгресса по медицинской миологии «Успехи медицинской микологии». М., 2003, том. 1 с.230-233.

9. Брагинцева Л.М., «Грибы — источник биологически активных веществ» Материалы Всероссийского конгресса по медицинской микологии «Успехи медицинской микологии», М;, 2003, том 1,, с.242-244.

10. Бовкун Г.Ф. Имманов А.Н., Семенченко В.Ф., Рожкова И.В., Борсенкова А.Н. Профилактическое действие бификорма при желудочно-кишечных болезнях цыплят.//Ветеринария, 1998, №12, с.51-53;

11. Н.Болотина Е. Н. Продуценты токоферолов — микроорганизмы пищеварительного тракта птицы. Научн. конф. профес.-препод. состава ,сотрудн. и аспирантов/ Самарская; гос. с.- х. академия, Самара, 1997, 4.1, с.45-47.

12. Бузлама B.C. Экологические требования к ветеринарным фармакологическим препаратам. //Вестник РАСХН. Состояние, проблемы и перспективы развития ветеринарной науки России. 1999, с.83-85.

13. Василисин С. В., Капленко Н. Н., Новаков П. Б. и др. Регенерация отработанных питательных сред. Сборник материалов конференции «Пробиотические микроорганизмысовременное состояние вопроса и перспективы использования». М., 2002, с. 105-106.

14. Васильева С., Берзиня Н. Тест-система для оценки иммунного статуса цыплят при воздействии тяжелых металлов. Материалы 3 Украинской конференции по птицеводству с международным участием, Вып. 51, Борки, 2001, с.31.

15. Грязнева Т. Н. Технология производства пробиотика Биод-5 и его лечебно-профилактическая эффективность для разных видов животных. Автореферат диссертации на соискание доктора биологических наук. М. 2005, 32с.

16. Грязнева Т. Н., Ставцева Л .Я. Антагонистическая активность бифидо- и лактобактерий в отношении энтеробактерий. //Ветеринария, 1991, №6, с.21-22.

17. Данилевская Н. В., Субботин А. В., Методика фармаэкономического анализа результатов; применения ветеринарного препарата при? откорме бройлеров на примере пробиотика ЛАКТОБИФАДОЛ. //Ветеринария и кормление, №2, 2005, с.24-25.

18. Данилян Л.Т., Биологические свойства культуральной жидкости иг активного вещества чайного гриба. Материалы первого Всероссийского конгресса по медицинской миологии «Успехи медицинской микологии». М;, 2003, т. 1, с. 249-250.

19. Джавадов Э.Д. Иммунодефицита вирусной? этиологии» в промышленном; птицеводстве: состояние и перспективы. //Медицина, Ветеринария, Фармация; 1998, №2, с.3-6.

20. Джанова З.Ф. Сочетанное применение пробиотика бифидумбактерина и иммуномодулятора тималина для профилактики колибактериоза у цыплят. Автореферат дис. канд. вет. наук, г. Санкт-Петербург, 2001, 25с.

21. Егоров И;, Куренева В., Паньков П., Егорова Т. Пробиотики в кормлении цыплят-бройлеров. //Передовой; научно-производственный опыт в; птицеводстве. Экспресс-информ., 1995 №1-2, с.35-37.

22. Зуев Е. Т. Новые биотехнологии, методы контроля и менеджмент качества в производстве напитков. Автореферат диссерт. на соискание ученой степени доктора биологических наук. М., 2004, 58с.

23. Информационная брошюра. Биологически активная добавка к пище «Микро-вет», применение для восстановления нарушенных функций организма. М., 1998 , с.35-41.

24. Капустин А.В. Этиологическая структура эшерихиоза кур. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук. М., 2001, 24с.

25. Карпуть И.М., Бабина М.П. Микрофлора в местной защите и повышении продуктивности птиц. //Наука производству. Гродно, 1996, стр. 233-234.

26. Ковальская JI.A. и др. Препараты для птиц «Авилакт-1 К» и «Авинорм-3» биофармкомплексы на основе пробиотиков и биологически активных добавок. Тезисы докладов Всероссийской научно-практической конференции, 8-9.06.2000 г., Щелково-2000, с.346.

27. Комаров А. А. Способ получения, физико-химическая характеристика и иммунобиологическое действие аминокислотно-пептидного препарата для птиц. Автореферат на соискание ученой степени кандидата биологических наук. М., 1995, 26с.

28. Комоков Е.Е., Лысенко М.А., Столяр Т.А., Лукашенко B.C. Мясные качества бройлеров с повышенной живой массой. //Мясная индустрия, 1997, №10 с. 31-32.

29. Краткие сообщения о деятельности ВОЗ. Бюллетень ВОЗ. 1991, т.69, №2, с.31-33.

30. Кузнецова М.Н. и др. Влияние комплексного использования бифидумбактерина и опои на гематологические показатели у цыплят. Тезисы докладов Всероссийской конференции «Пробиотики и пробиотические продукты». М., 1999, с.63.

31. Малик Н.И., Панин А.Н. Ветеринарные пробиотические препараты.// Ветеринария, 2001, №1, с.24-26.

32. Между народная научно-практическая конференция памяти Г.И. Гончаровой. Сборник материалов конференции. М., 2002, 267с.

33. Методические рекомендации по контролю и сохранению естественной резистентности птиц в промышленном птицеводстве. MB А им. Скрябина, М., 1987, 31с.

34. Методические рекомендации по проведению анатомической разделки тушек и органолептической оценки качества мяса и яиц сельскохозяйственной птицы, и морфологии яиц. ВНИТИП, г. Сергиев Посад, 2001, 26с.

35. Мешковский А. П. Надлежащая лабораторная практика (GLP): сравнительный анализ международных и российских требований. //Фарматека, 2001, №7, с. 11-17.

36. Минжаков М. Стрептоцид в профилактике эхинококкоза. Тезисы докладов Всероссийской конференции «Пробиотики и пробиотические продукты», М., 1999, с.67.

37. Молохова Е. И. Биофармацевтические аспекты пробиотиков. Сборник материалов конференции «Пробиотические микроорганизмы современное состояние вопроса и перспективы использования». М., 2002, с.61-62.

38. Панин А. Н., Малик Н. И., Чупахина Н. А. Влияние пребиотической добавки на микробиоценоз кишечника цыплят. Сборник материалов конференции «Пробиотические микроорганизмы современное состояние вопроса и перспективы использования». М., 2002, с.31-34.

39. Панин А.Н. и др. Биотехнологические аспекты изготовления сухих пробиотических препаратов. Тезисы докладов Всероссийской научно-практической конференции, 8-9.06.2000, Щелково-2000, с.344.

40. Парций JI.E. Ненадлежащее качество продукции. Новая правовая литература. М., 2001, с.254.

41. Петренчук Э.П., Фукс П.П. Усовершенствование технологии получения сухих пробиотиков. Материалы науч. конф. «Общ. эпизоотология: иммунол., экология и методол. пробл.», Харьков, 1995, с.91-92.

42. Пивняк И.Г., Шайдулина Р.Г., Заболотский В.А. Каротинобактерин новый пробиотик для птицы. //Зоотехния, М., 1998, №3 , с.11-14.

43. Пировано Ф. Пробиотики: производственно-технологические аспекты. Тезисы докладов Всероссийской конференции «Пробиотики и пробиотические продукты», М., 1999, с. 38.

44. Подберезный В.В., Полянцев Н.И. Влияние эндобактерина на иммунный статус организма и паренхиматозные органы коров при мастите. //С.-х. биология. Сер. Биология животных, 1994, №6, с.26-30.

45. Положение о Совете по ветеринарным препаратам Департамента ветеринарии Российской Федерации. М., 1995.

46. Родин В.В. Изучение влияния комплексного пробиотического препарата на сохранность бройлеров. Сб. «Современные достижения биотехнологии», Ставрополь, 1995, с. 126-129.

47. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ под редакцией В.Н. Фисенко, М., 2000, 380 с.

48. Сафонов Г.А. и др. Пробиотики как фактор, стабилизирующий здоровье животных,//Ветеринария, 1992, №7-8, с.3.

49. Сидоров М.А., Субботин В.В., Данилевская Н.В. Нормальная микрофлора животных и ее коррекция пробиотиками. //Ветеринария, 2000, №11, с.23-27.

50. Силкина В.А., Проворов E.JL, Солдатова В.В., Лаптев Г.Ю. Использование пробиотика «Целлобактерин» при кормлении кур-несушек. Материалы 3 Украинской конф. по птицеводству. Борки, 2001, выпуск 51, с.48-51.

51. Система стандартизации в здравоохранении Российской Федерации. Министерство здравоохранения РФ, нормативные документы. Москва, 2000. с.259.

52. Скворцова М.М., Горшина Е.С., Качепай Д.П. Биологически активные добавки на основе биомассы высшего гриба. Материалы первого Всероссийского конгресса по медицинской миологии «Успехи медицинской микологии». М., 2003, т.1, с.305-307.

53. Смоленский В.И. Средства и методы специфической профилактики болезней птиц вирусной этиологии. Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук. М., 1999, 44 с.

54. Степаненко И.П. Влияние пробиотического препарата стрептобифида-форте на иммуногенез и формирование кишечного микробиоценоза цыплят. Автореферат на соискание ученой степени кандидата биологических наук. М., 2001, 24с.

55. Субботин В. В., Данилевская Н. В. Применение пробиотического препарата ЛАКТОБИФАДОЛ при промышленном откорме бройлеров. // Ветеринария и кормление, 2004, сигнальный номер, с. 11-13.

56. Субботин В.В., Сидоров М.А. Биотехнология пробиотиков ветеринарного назначения. //Аграрная наука ,1998, №3 , с.70-72.

57. Субботин В.В., Сидоров М.А. Профилактика желудочно-кишечных болезней новорожденных животных с симптомокомплексом диареи. //Ветеринария,2001, №4, с.30-33.

58. Субботин В.В. Биотехнология пробиотика лактобифидола, бифацидобактера и его лечебно-профилактический эффект. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук, М., 1999.

59. Тараканов Б. В., Николичева Т. А. Пробиотический потенциал Lactobacillus casei subsp. pseudoplantarum при выращивании телят. //Ветеринария, 2001, №3, с.23-27.

60. Терешина В.М., Меморская А.С., Феофилова E.JI., Немцев Д.В., Козлов В.М. Получение из мицелиальных грибов полисахаридных комплексов и определение степени их деацетилирования. //Микробиология, 1997, том 66, №1, с.84-86.

61. Тихонов И. В., Воронин Е. С., Грязнева Т. Н. и др. Концентрирование и высушивание биопрепаратов. Учебно-методическое пособие. Москва, МГАВМиБ, 2002, 50 с.

62. Тихонов И. В., Воронин Е. С., Ковалев С. В., Грязнева Т. Н. и др. Промышленное культивирование микроорганизмов. Учебно-методическое пособие по биотехнологии. Москва, МГАВМиБ, 2000, 60 с.

63. Топурия Л.Ю. Пробиотикотерапия сальмонеллезов сельскохозяйственной птицы. Актуальные вопросы ветеринарии. Оренбург, 1997, с.79-83.

64. Требования к доклиническому изучению обще-токсического действия новых фармакологических веществ. М., 1985, 19 с.

65. Факторы, способствующие распространению заболеваний. //Международное животноводство. 1998, №3.5/3.6, с. 21-24.

66. Фарматека, 1999, №3, с.38.

67. Хаитов P.M., Гущин И.С., Пинелин Б.В., Зебров А.И. Экспериментальное изучение иммунотропной активности фармакологических препаратов. //Ведомости Фармакологического комитета. 1999, №1, с. 31-32.

68. Шевелева С.А. Пробиотики, пребиотики и пробиотические продукты. Современное состояние вопроса. //Вопросы питания. 1999, №2, стр.32-39.

69. Adams M.R., Hall C.J. Growth inhibition of food-born patogens by lactic and acetic acids and their mixtures// Int. J. Food Scin. Technol. 1988. V. P. 287-292.

70. Affitives, antibiotics and probioties: Choices for the future. Poultry intern vol 35 №4 1996, P. 34-39

71. Barrow P.A. and со. The attashment of bacteria to the gastric epitelium of the pig and its importance in the microecology of the intestine//J. Appl. Bacteriol. 1980. V. 96.P. 161-169.

72. Barry R. Goldin. Healt benefits of probioties. British Jornal of Nutrition, 1998.80, Suppl. 2 S 203-207.

73. Bohnhoff M., Drake B.L. and Miller C.P. Effect of streptomycin on susceptibility of the intestinal tract to salmonella infection// Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1954. V.86. P. 132-137

74. Chatov L., Trenev N., Probiotics Publishing Group, North-amptonshive, England, 1990, P 141-142.

75. Colins E.V., Aramaki K. Production og hydrogen peroxide by Lactobacillus acidofillus//J. Daily Sci. 1980. V. 63. P. 353-357.

76. Condons S. Responses of lactic acid bacteria to oxygen // FEMS; Microbiol. Rev. 1987. V.46. p. 269-280.

77. Crary R.S., Taylor, Christine M. Williams. Effects of probiotics and prebioties on blood lipids British Jornal' of Nutrition (1998, S. 225230)

78. Firon N., Oftek Г., Sharon N. Carbogydrate-bindings of mannose-spesific fimbrial lectins of enterobacterial Infect. Immun. 1984. V. 43. p. 1088-1090

79. Freter R. The fatal enteric cholera infection in the guinea pig achived by inhibition of normal: enteric flora// J. Infectious Diseasis. 1955. V. 97. P. 57-65

80. Fuller R. and со. Microbial competition in the mouth and gastrointestinal tract. /Gould G.W., Rhodes-Roberts M.E. Charnley A.K. et al. Natur. Antimicrobial System. Bath University Press. Bath. 1986. P. 11-28.

81. Fuller R. Probioties// J. Appl. Bacteriol. Symposium Supplment. 1986/ IS-7S

82. Fuller R., Turvey A. Bacteria associated with the intestinal wall of the flow (Gallus domesticus)//J. Appl. Bacteriol. 1971. V.34. P. 617-621

83. Fuller W.B. Probiotics. Fact or ficsion// Large Animal Veterinarian. November-December , 1987. p.28-30.

84. Fuller. Probiotics in man and animals. A review // J.Appl. Bacteriol. 1989. V.66. N 5. P. 365-378.

85. Guillot S.-F. Role tes probiotiques utilises on alimentation animale. C.R. Acad. Agr. Fr., 1997, vol. 83, №p. 87-96.

86. Jay J.M. Antimicrobial properties of diacetil// Appl. Environ. Microbiol. 1982. V. 44. P. 525-532.

87. Kumprecht I., Zobac P. Continuons applications of probioties based on Saccharomyces cevevisae var.elipsoidens and Bacillus CIP 5832 in the nutritions of chicken broiler. Zivocina vyroba, 1996, vol.41, №7. P 48-51.

88. Lilly D.M., Stillwell R.H. Probioties: growth promoting factors produced by microorganisms // Science. 1965. V. 147. P. 747748.

89. Mary E. Sanders Development of consumer for the US market. British J. of nutrition 1998 . 80 №2. P 201-205.

90. Nagaraga K.V., Mulder R.V., Ruff M.D. XX World Poultry Congress. September, 1996.

91. Parker R.B. Probioties the other half of the antibiotics story // Anim. Nutrition and Health. 1974. V.29. P. 4-8.

92. Parova J., Kumprecht I., Robosova E. The effect of probioties based on Bacllus CIP 5832 on utility and economical pavameters in duck fattening. Zivocisna Vyroba. 199, R 39, p. 11.

93. Patterson J.A., Orban S.I., Sutton A.L., Richards G.N. Selektive enrichment of bifidobacteria in the intestinal tract of broilers by termally produced Kestoses and effect on broiler perfomance. Poultry Sc., 1997, vol. 76, №3, p. 497-500

94. Pedron O., Giardini A., DelP'orto V., Durand H. Perfomans di broilers in seguito alia somministrazione di Pediociccus acidi lactici, ceppo MA 18-5M, a due diversi livelli. Seler veter. 1997, №8/9, p. 843-853

95. Savage D.C. The ecological digestive system and its colonization.//Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 1989. V. 8. P.259-273

96. Shoib H.K.,Sayed A.N.,Sofony S.A. Response of broiler chicks to probiotic (pronifer) supplementation. Assinf. vet. med. 7,v/36,№71 1996 p.104-114.

97. Sofos J.N., Fagerberg D.J.,Quarles C.L. Effects of sorbic acid feed fungistat on the intestinal microflora of floor-reared broiler chickens.Poultry Sc. 1985 T.64 ,№5. p. 43-52.

98. Takahahi K., Akiba Y., Matsuda A. Effect of a probiotika on immune responses in boiler chick unter different sanitary conditions or immune activations. Anim. Sc. Technikol. 1997. Vol.68 №6 p. 537-544.

99. Tannok G.V. Effect of dietary and environmental stress on the gastrointestinal microflora // Human Intestinal Microflora and Disease. London: Acad. Press, 1983. p. 517-539.

Информация о работе

Калугин, Сергей Владимирович
кандидата биологических наук
Щёлково, 2005
ВАК 03.00.23

Диссертация

Комплексный препарат "Авилакт форте" на основе пробиотика для птицеводства - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы