Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Комплексный анализ полиморфизма генов иммунного ответа при рассеянном склерозе у русских

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Комплексный анализ полиморфизма генов иммунного ответа при рассеянном склерозе у русских"

На правах рукописи

АНДРЕЕВСКИЙ ТИМОФЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

комплексный анализ полиморфизма генов иммунного ответа при рассеянном склерозе у русских

03 00 03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Р

□□3059072

Москва - 2007 . „

003059072

Работа выполнена в отделе биотехнологии Института экспериментальной кардиологии Федерального государственного учреждения "Российский кардиологический научно-производственный комплекс" Росздрава, г Москва

Научный руководитель

доктор биологических наук профессор

О О Фаворова

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор

кандидат биологических наук

В В Носиков А А Белогуров

Ведущая организация Институт молекулярной биологии им В А Энгсльгардта

Зашита состоится 30 мая 2007 года в 11 часов на заседании диссертационного совета К 208 073 02 в ФГУ РКНПК Росздрава по адресу 121552, Москва, 3-я Черепковская улица, 15 А

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУ РКНПК Росздрава

Автореферат разослан 26 апреля 2007 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

РАН

кандидат биологических наук

1 [I Веигерова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы, цель и задачи работы Рассеянный склероз (РС) -тяжелое хроническое дечиелинизирующее заболевание центральной нервной системы В настоящее время принято считать, что основная роль в разрушении миелина принадлежи! воспалительному процессу, связанному с аутоиммунными реакциями РС характеризуется многообразием клинических форм и типов течения патологического процесса скорее всего, вследствие различной этиологии Поражая преимущественно молодых работоспособных людей, РС представляет собой серьезную медицинскую и социальную проблему Хотя этиология РС остается неясной, очевидно, что он относится к комплексным заболеваниям, развитие которых зависит и от генетической предрасположенности человека, и от воздействия внешней среды Различная частота РС для различных этнических групп, а также семейные исследования свидетельствуют о преимущественной роли генетических факторов в формировании восприимчивости к РС и о полигенном типе наследования РС [4, 15,16, 22]

Для идентификации генов, определяющих предрасположенность к РС, в настоящее время используют две основные стратегии выяснение роли того или иного гена-кандидата, выбранного исходя из возможной роли его белкового продукта в этиологии и патогенезе заболевания, и полный геномный скрининг с использованием панели анонимных генетических маркеров, равномерно распределенных по геному, для идентификации областей хромосом, вовлеченных в развитие заболевания При полном геномном скрининге сцепленные с РС локусы обнаружены почти на всех хромосомах причем это сцепление было довольно слабым, а сцепленные локусы зачастую различны для разных популяций, что лишь подтверждает полигенность заболевания и позволяет предполагать его генетическую гетерогенность Таким образом, полный геномный поиск для этого полигенного заболевания пока оказывается не очень эффективным Применение подхода "ген-кандидат" для поиска ассоциированных с РС генов представляется более предпочтительным ввиду возможности проводить поиск ассоциации с РС и/или с его клиническими вариантами конкретных полиморфных участков генов, а также и\ сочетаний

В настоящее время для различных популяций выявлено довотьно большое количество ассоциированных с РС и/или его клиническими вариантами полиморфных участков Для большинства этнических групп найдена ассоциация РС с аллелями гена £>/?/?/, входящего в состав генов главного комплекса совместимости (ГКГ) на хромосоме 6р, которые являются основными генами иммунного ответа человека Помимо генов ГКГ, в ряде работ показана роль в развитии РС генов, которые кодируют два других

компонента тримолекулярных комплексов, участвующих в представлении аутоантигена при РС, Т-клеточный рецептор и основный белок миелина В качестве генов-кандидатов для РС рассматриваются также и другие гены, вовлеченные в аутоиммунные реакции - в первую очередь гены цитокинов и их рецепторов В отличие от достаточно сильной ассоциации РС с аллелями гена £)/?/?/, показанной для большинства популяций, большая часть ассоциаций являются слабыми и/или выявляются только для различных этнических групп, что неудивительно, учитывая полигенность заболевания, а также его большую клиническую и, скорее всего, генетическую гетерогенность Существенные продвижение при поиске факторов генетической предрасположенности к РС и его клиническим вариантам может быть достигнуто в результате исследования вклада в развитие заболевания носительства сочетаний аллелей и/или генотипов нескольких генов В то же время ввиду сложности статистических расчетов, поиск ассоциаций РС с совместным посительством аллелей/генотипов нескольких полиморфных участков является достаточно сложной биоинформатической задачей и нуждается в специальном инструмент арии

Целью настоящей работы является проведение комплексного анализа вклада почиморфных участков генов иммунного ответа и их сочетаний в формирование генетической предрасположенности к РС и/или вариантам его клинического течения у русских Россия относится к странам с умеренным риском РС На 140 млн населения приходится довольно значительное число больных РС (не менее 50000) Однако для русской популяции до настоящей работы было выявлено лишь незначительное количество ассоциаций РС с полиморфными участками нескольких генов и расположенных рядом с ними областей (ассоциация с аллелем /)/?/?/* 15(2) и аллелем ТЫРа*9), причем не охватывающих всю выборку больных РС, а ассоциаций РС с сочетанием полиморфных участков различных генов не было выявлено совсем

Для достижения поставленной цели были поставлены следующие конкретные

задачи

- Создать способ организации, пополнения, представления и хранения данных, позволяющий эффективно анализировать вклад аллельных вариантов генов в развитие и особенности течения полигенных заболевании

- Провести геномное типирование функционально значимых полиморфных участков генов СС/?5, СТЬА4 и ГС^/ для неродственных больных РС русской этнической принадлежности и соответствующей контрольной группы

- С помощью полученной базы данных повести анализ ассоциации аллелей и генотипов исследованных генов с развитием и вариантами клинического течения РС

методом "случай-контроль" с использованием "стандартного" статистическою анализа ни основе точного критерия Фишера

- На материале полученной базы данных доказать эффективность разработанного при нашем участии биоинформатического алгоритма АР5аптр!ег по его способности выявлять уже найденные ранее ассоциации аллелей с РС у русских

- С помощью полученной базы данных и алгоритма АР8атр!ег провести комплексный анализ ассоциации РС с сочетаниями аллелей/генотипов всех генотипированных полиморфных участков генов иммунного ответа

Необходимой предпосылкой подобной работы явтяется правильная постановка диагноза неврологического заболевания при формировании группы больных РС Отбор больных с диагнозом "РС" по принятым па настоящий момент для этого заболевания критериям Макдональда [23] и последующие клинические наблюдения осуществлялись на кафедре неврологии и нейрохирургии ГОУ ВПО "Российский государственный университет" Росздрава д м н , профессором А Н Бойко

Научная новпзпа и практическая ценность работы Впервые проведено геномное типирование полиморфных участков в генах ССЯ5, СТЬА4 и ТТ?/-"/?/ для русской популяции больных РС Впервые выявлена ассоциация с РС сочетанного носительства аллелей ССД5Д32 и ВЯВ1*04 Впервые показана негативная ассоциация совместною носительства аллелей ССЯ5Д32 и ИЯВ!*04 с ранним дебютом заболевания (<18 лет) Впервые применен новый статистический алгоритм АР8атр1ег и с его помощью выявлены ранее не обнаруженные ассоциации РС с совместным носительством двух триаллельных сочетаний (йИВ1* 18(3), -ЗОЭГС/^РС и СТЬА4*в) и (-2387АГ*В1 -308ГЛ7Г*А2 и СТЬА4*С) До настоящей работы ни в одной этнической группе не было описано ассоциации РС с каким-либо триаллельным сочетанием Важно отметить чю группы носителей этих сочетаний среди больных РС являлись непересекающимися что впервые наглядно свидетельствует о генетическом гетерогенности РС как полигенного заболевания

Применение алгоритма АРБаптркг показало его ценность для анализа ассоциации заболевании с сочетаниями аллелей нескольких попичорфных участков Выявпение ассоциированных с РС и его клиническими вариантами полиморфных участков в будущем будет способствовать идентификации предрасположенных к этому заболеванию людей еще до заболевания и принятию адекватных мер профилактики

Структура работы. Диссертация состоит из следующих разделов Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты и обсуждение, Выводы, Список

литературы, она изложена на 103 страницах, включает 9 рисунков и 15 таблиц Список литературы содержит 201 источник

Апробация работы Материалы работы были представлены на научно-практической конференции "Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины" (Москва, 2003), на XIII Всероссийской конференции "Нейроиммунология" (Санкт-Петербург, 2004), на 4-ой Международной конференции по биопнформатике структуры и регуляции генома (BGRS'2004) (Новосибирск, 2004), на II международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2005), на IX Всероссийском съезде иммунологов (Ярославль, 2006), на межлабораторном семинаре Института экспериментальной кардиологии ФГУ РКНПК Росздрава (2007)

МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ Использованные реактивы В работе использованы Taq-полимераза, Т4-полинуклеотидкиназа и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (АО "Силекс М'), протеиназа К ( Boehringer"), нейлоновая мембрана Hybond N ("Amersham"), рестрикционная эидопуклеаза RrfEII (НПО "СибЭнзим") Остальные реактивы были получены от фирм "Merck", "Sigma" или использовались отечественные квалификации осч

Формирование групп больных PC и здоровых контролен В анализируемую ipyririy включено 286 неродственных больных PC (110 мужчин, 186 женщин) со средним возрастом начала заболевания 33 ± 12 лет, все с диагнозом PC по критериям Макдональда [23] проходивших лечение в 1-ой городской клинической больнице (ГКБ №1) Москвы или в Московском городском центре рассеянного склероза Из них 187 человек болели ремиттирующей формой заболевания, 39 - первично прогрессирующей и 60 - вторично прогрессирующей У всех больных оба родителя были русскими (по данным анкетирования) Контрольную группу составили 362 неродственных здоровых по медицинским показаниям добровольцев той же этнической группы (203 мужчин и 159 женщин) со средним возрастом на момент забора крови 30 ± 11 лет, из числа студентов РГМУ, сотрудников ГКБ №1 Москвы, ИЭК ФГУ РКНПК Росздрава и доноров пунктов переливания крови Всероссийского онкологического научного центра РАМН Организация данных

Для хранения данных о фенотипических и генетических признаках, а также данных анамнеза больных была составлена реляционная база данных в формате Microsoft dbf и система управления ею (СУБД) с применением программного обеспечения Microsoft Visual FoxPro Из данных анамнеза база содержит для каждого человека фамилию, имя и отчество, сведения о поле и возрасте на момент сдачи крови, номер образца(ов) крови и

ДНК, а также, для больных РС, о возрасте начала заболевания, типе течения заболевания, характере начала заболевания и некоторые другие, не использующиеся в данной работе сведения (например, наличие родственников) Данные о генетических признаках включают в себя сведения о генотипе индивида по рассматриваемым в данной работе полиморфным участкам (таблица 1), а также данные о других полиморфных участках, не включенных в данную работу

Таблица 1. Полиморфные участки, анализ которых нроводнлсп в работе

Ген/маркер Полиморфизм* Названия аллелен

DRB1 Группы аллелей, соответствующие серологическим специфичностям 01 - 18(3)

Микросателлит TNFa (АС)„ al - а 13

Микросателлит TNFb (ТС)„ Ы - Ь7

tnf БОТ -376А—Л А, G

-308А— AI, А2

БЫР -238А— Bl, В2

LTa БЫР +252в—>А N1, N2

ЭИР +319С—Ю Hl, Н2

TGFßl БОТ -509С—>Т С Т

8ЫР +72 дикий тип—> инсерция С wt, ins

ЭЫР +869Т—>С (ИЗЬеи—>Рго) Т, С

БОТ +9150—>С (25А^->Рго) G, С

БИР + 1632С->Т (263Т11Г—>11е) С, Т

CCR5 Дикий тип —> делеция 32 п и wt, Д32

CTLA4 БЫР +49А-Ю (17ТИг—>А1а ) А, G

Используемые сокращения CCR5 - ген рецептора СС-хемокинов 5, CTLA4 - ген ассоциированного с цитотоксическичи Т-лимфоцитачи белка, DRBI - ген ß-цепи 1 DR комплекса гистосовместимостн класса II LTa - ген лимфотоксина а, TGFßl - ген трансформирующего фактора роста ßl, TNF- ген фактора некроза опухолей, ins - инсерция, vvt - дикий тип, SNP - однонуклеотидный полиморфизм * Все положения SNP указаны относительно участка старта транскрипции, за исключением SNP +49 CTLA4, где +49 является положением относительно участка старта трансляции

Выделение геномной ДНК из кровн Для получения ДНК необходимой чистоты и достаточной для проведения генотипирования молекулярной массы использовали модифицированный метод выделения ДНК из крови с помощью высаливания бетков хлоридом натрия [I]

Геномное тппнрование полиморфного участка в гене CCR5

Аллели полиморфного участка гена CCR5, возникающего вследствие делеции 32 п н , выявляли по длине продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР) Для выявпеиия фрагмента длиной 169 п н (в случае аллеля vvt) или фрагмента длиной 137 п н (в случае аллеля Д32) ДНК амплифицировали с использованием праймеров CCR5A (5'-AGG rCTTCATTACACCTGCAGC-3') и CCR5B (5 '-CTTCTCATTTCGACACCGAAGC-3') [19] Амплификацию проводили в 10 мкл амплификационной смеси, содержащей 70мМ TnsHCl, 20мМ (NH4)2SOj, 0 025% Тритон-ХЮО, dNTP с концентрацией 0,2мМ каждый, 1,5мМ MgCl2, по 10 пмоль каждого праймера, 5 еа Taq ДНК полимеразы и 100 нг геномной ДНК, на протяжении 35 циклов (45 сек - 92°С, 1 мин - 59°С, 1 мин 15 сек -72°С) в амплификаторе MC 16 (АО "ДНК-технология") Результаты амплификации анализировали в 3% агарозном геле в присутствии бромистого этидия В качестве маркера молекулярной массы использовали плазмиду pUC19, обработанную рестрикционной эпдопуклеазой Msp\

Геномное тппнрование полиморфного участка в положении +49 первого жзоил гена CTLA4 проводили методом анализа полиморфизма длины рестрикционных фра1 ментов продуктов попнмеразной цепной реакции (ПЦР-ПДРФ) Для ПЦР использовали пару праймеров 5'-AAGGCTCAGCTGAACCTGGT и 5'-CTGCTGAAACAAATGAAACCC [10] Амплификационная смесь в обьеме 20 мкл содержала 0,05 M KCl, 0,01 M TrisHCl (pH 9,0), 5% формамида, 1,5 мМ MgC12, по 0,2 мМ каждого dNTP, по 10 пкмоль каждого праймера, 1 е а полимеразы Taq и 100-200 нг ДНК Амплификацию проводили в амплификаторе Genius ("Techne") в следующих условиях 1) предварительная инкубация в течение 5 мин при 94°С, 2) 30 циклов (94°С, 58°С и 72°С, по 1 мин), 3) инкубация при 72°С в течение 7 мин Амплифицированные продукты объемом 5мл инкубировали с 5 е а рестрикционной эндонуклеазы BstV.ll при 37°С в течение 5 час Продукты рестрикции разделяли методом электрофореза в 3%-ном агарозном геле, содержащем бромид этидия, и визуализировали в проходящем УФ-свете Наличие рестрицированного фрагмента длиной 130 п н свидетельствовало о присутствии аллеля А, наличие интактного фрагмента длиной 152 п н - аллеля G

Геномное тнппрованпс полиморфных участков в гспс TGFßl В гене TGFßl проводили генотипирование пяти участков SNP, приведенных выше (см таблицу 1) Анализ проводили методом гибридизации иммобилизованных продуктов ПЦР с аллелеспецифическими зондами с использованием праймеров и зондов, приведенных в таблице (табпица 2 [2])

Таблица 2 Используемые для анализа полиморфных участков в гене TGFßl пранмсры н зонды

Положение в гене Праимеры (5'-3') Аллелеспецифические зонды (5' —> 3')

-509 U AAGGCATGGCACCGCTTCTG С TTCCATCCCTCAGGTGT

L GAAGGAGGGTCTGTCAACAT Т TTCCATCCTTCAGGTGT

+72 U GGCCGGGGGCGGCTTCAAAA wt GGCACCCCCCCGGCTCT

L CGGCGGCGGCTCGTCTCAGA ins GGCACCCCCCCCGGCTC

+869 U CTACCTTTTGCCGGGAGACC Т GCTGCTGCTGCTGCTGC

L GGCGAGCCGCAGCTTGGACA С GCTGCTGCCGCTGCTGC

+915 как для полиморфизма +869 G GCCTGGCCGGCCGGCCG

С GCCTGGCCCGCCGGCCG

+1632 U GCTTCCCTCTCGCCACTCCT С CATGGCCACCCCGCTGG

L GCCTCCATCCAGGCTACAAG T CATGGCCATCCCGCTGG

Амплификацию проводили в 20 мкл амплификациопной смеси, содержащей ЮмМ TrisHCI pH 9,0, 50мМ KCl, 0,1% Тритона X, dNTP с концентрацией 0,2 мМ каждый, 2 5 мМ MgCb, по 5 пмоль каждого праймера, 10 е а Taq ДНК полимеразы и 40 нг геномной ДНК в амплификаторе Genius ("Techne") или MC 16 (АО "ДНК-те\нология") (только для полиморфизма +1632) Параметры ПЦР составляли для полиморфизма -509 94°С - 5 мин , (94°С, 57°С, 72°С по 1 мин) х 30, 72°С - 7 мин , для полиморфизма +72 (94°С, 68°С по 1,5 мин) х 35, 72°С - 5 мин , для полиморфизмов +869 и +915 94°С - 5 мин (94°С, 60°С, 72°С по I мин) х 30, 72"С - 7 мин , для полиморфизма +1632 (92°С, 62°С, 72°С по по 1,5 мин) х 35, 72°С - 5 мин Качество амплификации проверяли с помощью гель-электрофореза в 2%-ном агарозном геле в присутствии бромистого этидия Гель фотографировали в проходящем УФ свете

Продукты амплификации подвергали щелочной денатурации в 0,4М NaOH и 0,025М ЭДТА в течение 2 часов, а затем переносили на нейлоновую мембрану Hybond-N с помощью прибора для слот-блотинга Фиксацию проб ДНК на мембране проводили с помощью УФ излучения в течение 1 часа

Гибридизацию полученных фильтров с аллелеспецифическими зондами проводили в присутствии хлорида тетраметиламмония, что позволяло проводить отмывку зондов одной длины при одинаковой температуре, независимо от их нуклеотидного состава [1] Предгибридизацию проводити при 52°С в течение 2 часов в смеси, содержащей 50 мМ TrisHCI pH 9,0, 2мМ ЭДТА, пятикратный раствор Дэнхарда (5% фиколл, 5% поливннилпирролидон, 5% БСА), 0,1% SDS, 100 мг/мл денатурированной ДНК спермы лосося, в присутствии немеченных олигонуклеотидных зондов, специфичных для другого аллеля Аллелеспецифические зонды подвергали мечению путем кинирования с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4 (ПНК) Смесь для кинирования в объеме 20 мкл содержала 20 пкмоль олигонуклеотидного зонда, 70 мМ TrisHCI pH 7,6, 10 мМ MgCh, 5 мМ

дитиотреитол, 10 е а ПНК, 15 мкКи [y-32P]dATP Кинирование проводили в течение 30 мин при 37°С с последующей остановкой реакции путем добавления равного объема 0,5 М ЭДТА Гибридизацию с 32Р-меченными аллелеспецифичными зондами проводили не менее 4 часов при 52°С Для удаления несвязавшейся метки фильтры отмывали в 2х SSC, в течение 30 мин при комнатной температуре, затем два раза по 15 мин в 2х SSC, 0,1% SDS при комнатной температуре Отмывку неспецифически связавшихся зондов проводили 2 раза по 15 мин при 58°С в растворе, содержащем 3,0 М ТМАС, 50 мМ PrisHCl рН 8 0, 2 мМ ЭДТА, 0,1% SDS Анализ результатов гибридизации проводили методом радиоавтографии

Геномное тнпирование других полиморфных участков Типирование гена DRBI и микросателлитных повторов TNFa и TNFb проводилось М А Судомойной, как описано [24 25] а генов TNFn LTa - А Д Алексеенковым как описано в [6]

Результаты геномного типирования всех полиморфных участков вводили в созданную базу данных

Статистический анализ У больных PC и здоровых лиц определяли аллельную частоту, частоту носителей (фенотипическую частоту) аллелей анализируемых полиморфных участков и частоту генотипов Достоверность отличий проверяли с помощью точного критерия Фишера на уровне значимости р < 0,01 Силу ассоциаций выражали в значениях относительного риска (ОР), рассчитанного как отношение шансов (odds iatio), приводя 95% интервал достоверности (95% ИД) и не рассматривая в качестве статистически значимых ассоциаций те, для которых доверительный интервал включал 1 Всс эти расчеты проводили с помощью программного обеспечения GraphPad Prism для Windows (GraphPad Software)

Анализ отклонения наблюдаемых частот генотипов от равновесия Харди-Вайнберга, анализ неравновесного сцепления и оценку частот гаплотипов у рассматриваемых индивидов проводили с помощью алгоритма максимизации математического ожидания (expectation maximization - ЕМ), с использованием свободно распространяемой программы Haploview 3 32

Анализ ассоциации PC с сочетаниями аллелей и генотипов полиморфных участков проводили также с помощью созданной СУБД и разработанного при пашем участии нового биоинформатического подхода, который осуществляет поиск наиболее сильно ассоциированных с заболеванием наборов из сочетаний аллелей/генотипов анализируемых полиморфных участков Соответствующий алгоритм получил название APSampler [5] и основан па методе Монте-Карло посредством цепей Маркова (МСМС) Величиной, распределение которой исследуется методом МСМС при этом подходе,

является вероятность ассоциации всех сочетаний из каждого рассматриваемого набора с заболеванием, а сама вероятность определяется посредством непараметрпческого многомерного критерия, построенного на основе статистики Вилкоксона-Мана-Уитни Полученные с помощью АР8атр1ег результаты также проверяли с помощью точною критерия Фишера, как указано выше

РЕЗУЛЬТАТЫ II ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ распределения аллелей и геношпов исследуемых полиморфных участков у бозьных РС и здоровых русской этнической принадлежности

В данной работе проводилось геномное типирование семи полиморфных участков генов ССЛ5, СТЬА4 и ЮГ/Л (см таблицу 1) ССЯ5 представляет собой рецептор для СС-хемокннов воспалительного белка макрофагов М1Р-1а, М1Р-1|3 и ИАЫТЕЗ Он принадлежит к семейству рецепторов, сопряженных с й-белками [14, 17] Ген СС115 картирован на хромосоме Зр21 человека [17] СС1<5 обнаружен на лимфоцитах, макрофагах и микроглиии в активных очагах демиелииизации при РС [20] В ходе обострения РС происходит значительное обогащение Т-клеток цереброспинальной жидкости клетками, экспрессирующими ССЯ5, по сравнению с циркулирующими Т-клетками [20] В настоящей работе анализировали возможную ассоциацию РС в русской популяции с делецией размером 32 и и в гене ССГ15, обнаруженной в 1996 г [18] Эта делеция представлена с достаточной частотой в популяциях европеоидов и отсутствует у негроидов и в японской популяции [18] Делеция локализована в кодирующей части гена ССЛ5 и приводит к сдвигу рамки считывания, преждевременной терминации трансляции с образованием нефункционального белка без трех последних трансмембранных доменов и участка связывания й-белков ГСГ/?/ и СТЬА4 являются одними из основных генов, участвующих в подавлении воспаления [13] Нуль-мутация в этих генах приводит к развитию синдрома тяжелого полиорганного воспаления и к быстрой гибели модельных животных, например, мышей Показано также, что аллели полиморфного участка гена СТЬА4 +49А—ассоциированы с РС в популяциях датчан и сербов [3, 9] Сведений об ассоциации с РС каких-либо полиморфных участков гена ЮГ/И нет, поэтому для анализа были выбраны полиморфные участки в значимых областях гена, которые вишсм на уровень продукции ТСРр 1 [7] и встречаются с достаточной частотой [2]

Результаты геномного типирования по исследованным полиморфным у час псам генов СС&5, СТЬА4 и ТС/7/?/ у больных РС и здоровых приведены в таблицах 3-5 Достоверных отличий частоты аллелей и генотипов у больных РС и здоровых ни по одному исследованному полиморфному участку выявлено не было Откпонешш

распределения аллелей и генотипов для всех полиморфных участков и анализируемых групп от равновесия Харди-Вайнберга не наблюдали, за исключением распределения аллелей полиморфизма 7"GFJ5/ +915 для контрольной группы, что может являться следствием случайных отклонений ввиду малой встречаемости одного из аллелей

Таблица 3 Частоты аллелей и генотипов (%) полиморфизма ССЛ5А32 у пациентов с РС и здоровых контролен.

Больные, N=219 Контроль, N=354

Частота аллелей

Д32 57(13) 70(10)

381(87) 638 (90)

Частота генотипов

Д32/А32 4(2) 2(1)

Д32/Ш 49 (22) 66(19)

\vtZvvt 166(76) 286(81)

Таблица 4 Частоты аллелей и генотипов (%) полиморфизма СТЬА4+49 у пациентов с РС п здоровых контролен

Больные, N=168 Контроль, N=209

Частота аллелей

А 187(56) 240 (57)

0 149 (44) 178 (43)

Часюгы генотипов

А/А 51 (30) 68 (33)

А/О 85(51) 104 (50)

О/О 32(19) 37(18)

Гдблицл 5 Частоты аллелей п гепотппов (%) пяти участков 8ОТ гена 7"(7.Р/?/ у пациентов с РС н здоровых контролен

ТОТ/П-5(>9

Больные, N=119 Контроль, N=295

Частота алпелей

С 156(66) 361 (61)

Г 82 (34) 229 (39)

Частоты генотипов

С/С 53(45) 112(38)

С/Т 50 (42) 137 (46)

тя 16(13) 46(16)

7X7/7?/+ 72

Больные, N=198 Контроль N=340

Частота аллслеи

358(90) 633 (93)

те С 38(10) 47 (7)

Частоты гемотипов

\S\lvA 166 (84) 298 (88)

1у1/1п5 с 26(13) 37(11)

тэ С/ШБ С 6(3) 5(1)

ТС,Гр1+Ш)

Больные, N=150 Контрочь, N=248

Частота аллелей

186 (62) 292 (59)

С 114(38) 204 (41)

Частоты генотипов

О/й 60 (40) 87 (35)

в/С 66(44) 118 (48)

С/С 24(16) 43 (17)

Больные, N=157 Контроль, N=248

Частота аллслеи

в 288 (92) 457 (92)

С 26 (8) 39(8)

Частоты генотипов

ею 135 (86) 215 (87)

ас 18(11) 27(11)

С/С 4(3) 6(2)

7(7////+1632

Больные, N=77 Контроль, N=109

Частота аллслеи

12

С 150 (97) 210(96)

т 4(3) 8(4)

Частоты генотипов

С/С 73(95) 101(93)

ся 4(5) 8(7)

Т/Т 0(0) 0(0)

Рисунок I. Частоты наиболее распространенны^ (>1% у больных PC или здоровых индивидов) гаи.] orí ниш кз ».мелен генотипироваи ПЫХ полиморфных участков I'GFßl.

•t. 60 -,

jo -j—

u öpnthws pc ВКан7ропь

--!

""-"-Саплошп SKP 1 2 3 4 5 6

-509 Г Т С Т Т С

+72 wt wt ins С wl vrt vv1

+869 Т С С Т С С

+915 G G С G G С

+ 1632 С С С С Т С

Анализ гаплотипов гена TGF0I проводили с помощью программы I laploview 332.

Показано, что аллели TGFßl находятся к неравновесном сцсплсннн. Частоты наиболее распространенных гаплотипов не отличаются в гр> ппе больных PC и контрольной группе (рис, 1).

Поиск ассоциаций РС с сочетанием аллслсп полиморфных участков с применением "стандартных" подходов на основе точного критерия Фишера

Собранная база данных позволила с помощью "стандартного" критерия Фишера сравнить частоту аллелей полиморфных участках в группах больных РС и здоровых индивидов, сформированных по принципу носительства аллелей гена £>/?В/, что принято при исследовании РС ввиду наиболее сильной из известных ассоциации с заболеванием аллелей этого гена Этот подход позволил выявить значимое отличие частоты носительства аплеля ССЯ5Д32 в группах больных РС и здоровых индивидов носителей аллеля £>ЛВ/*04 (таблица 6) Также достоверными оказались разтичия частот совместного носительства £>/?В/*04 и ССЛ5Д32 для полных групп больных РС и здоровых индивидов (р < 0,001, ОР = 4,7, 95% ИД = 1,8- 12,1)

Аналогичный анализ сочетанной ассоциации РС с аллелями гена СТЬА4 (или 7X^/3/) с аллелями гена ОЯВ1 не выявил достоверного вклада как СТЬА4, так и ТйГ/Н в группах, сформированных по принципу носительства аллелей гена ШВ/

Таблица 6 Частоты носителей аллеля СС115Л32 в группах носителей аллелей

ДЛЯ/

Аллели Больные РС, N=213 Здоровые индивиды, N=312 Р ОР (95% ИД)

ОКВ1 ССЯ5Д32 йЯВ! ССЯ5Д32

ДЯВ/* 01 51 16(31,37) 90 20 (22,22) И 3

ОЯВ1* 15(2) 91 18(19,78) 60 11 (18,33) И 3

ШВ/* 16(2) 9 1(П,П) 27 3(11,11) ИЗ

ШВ/*17(3) 28 10(35,71) 52 10(19,23) ИЗ

£>/?В/* 04 50 18(36,00) 69 6(8,70) < 0,004 5,9 (2,1-16,3)

ОЛВ/*11(5) 36 7 (19,44) 59 14 (23,73) НЗ

ЖВ1* 12(5) 13 3 (23,08) 20 5 (25,00) НЗ

ОЯВ1* 13(6) 34 5(14,71) 37 6(16,22) НЗ

£М?В/ *07 45 12(26,67) 85 19 (22,35) НЗ

СКВ/*08 15 3 (20,00) 21 4(19,05) НЗ

Значения приведены как п (%) За 100% приняты носители аллелей £№й/ Приведены группы, в которых частота носительства аллелей РИВ! превышает 5% у больных РС и здоровых

Поиск ассоциации клинических вариантов РС с агпепямн полиморфных \частков с применением "стандартных" подходов па основе точного критерия Фишера

Также с помощью собранной базы данных анализировали ассоциацию клинических вариантов РС с носительством аллелей анализируемых полиморфных участков, а также

аллелей полиморфных участков в группах носителей аллелей гена DRBI Этот анализ позволили выявить отрицательную ассоциацию совместного носнтельства сочетания ССЯ5А32,ОЯВ I "04 с ранним дебютом заболевания (таблица 7)

Таблица 7 Ассоциация совместного носнтельства СС/?5Д32,0/?В/*04 с дебютом PC (р < 0,008)

Признак начала заболевания (CCR5 А32,DRB1 *04)-негативные, п=18 (CCR5tö2,DRBl *04)-позитивные, п=195 ОР (95% ИД)

Ранний дебют (< 18 лет) 1 (5,6)* 71 (36,4) 0,10(0,01-0,79)

Дебют после 18 лет 17 (94,4)* 124 (63,6) 9,73 (1 27-74 73)

Анализ базы данных с применением алгоритма APSampIei

Дальнейший поиск сочетанных ассоциаций с применением "стандартных" способов осложнился количеством необходимых расчетов Количество вычислений при увеличении числа рассматриваемых полиморфных участков росто не менее чем экспоненциально Кроме того трудности возникли при написании алгоритмов и представлении данных Для решения этой пробпемы п был создан новый биоипформатическии алгоритм APSampIei Этот алгоритм в качестве входных данных рассматривает все сочетания из каждого рассматриваемого набора аллелей полиморфных участков индивида и находит те из них, которые максимально ассоциированы с заболеванием Применяемый в основе алгоритма метод МСМС позволяет существенно упростить алгоритм поиска и сократить время, необходимое для получения значимых результатов

Применение алгоритма APSampler к собранной базе данных позволило выявить уже найденные ранее "стандартными способами" для этой выборки ассоциации PC с DRB1* 15(2), TNFa9 и совместным носительством CCR5A32 и DRBI* 04, что свидетельствует о его способности выявлять достоверные ассоциации

Кроме реидентификации (валидации) уже выявленных ассоциаций, применение алгоритма APSampler позволило выявить ассоциацию PC с двумя сочетаниями аллелей трех полиморфных участков (-509TGFßJ*С, DRB1* 18(3), CTLA4*G) и (-238TNF*B], -30877VF*A2, CTLA4*G) (таблица 8) Ни одно из входящих в состав триаплельных сочетаний попарное сочетание аллелей и ни один аллель поодиночке не были ассоциированы с заболеванием Полиморфные участки -2387jVF и -308TNF, аллели которых -238ГЛ'/7*В1 и -3087jVF*A2 входят в состав второго сочетания, расположены достаточно близко друг от друга в промоторном участке гена, поэтому можно предположить, что эти аллели находятся в жестком сцеплении друг с другом Однако анализ гаплотипов TNF для исследуемых групп не выявил ни одного распространенного

гатотипа, в который бы входили рассматриваемые аллели Таким образом, можно заключить, что аллели -2387М;'*В1 и -3087Л'/7*А2 вносят независимый вклад в предрасположенность к РС Полученные результаты убедительно демонстрируют преимущества подхода, основанного на комплексном анализе вклада отдельных генов в развитие полигенного заболевания

Таблица 8 Достоверность ассоциации РС с сочетаниями трех аллелей -509ТОГ/11*С, ПЯВ1*ЩЗ), СГЫ4"С и -23877^^1, -3087Л7-'*Л2, СЛЛ4кС, и входящими в их состав парами аллелей

Сочетания Пациенты, N (%) Контроль, N (%) P

-5Q9TGFßl*CßRB!*\%(3\CTLA4*G 5(5) 0(0) 0,009

-509TGFßl*C,DRBl*\8(3) 5(5) 2(1) 0,114

-509TGFßl*C CTLA4*G 60(бГГ 88 {51) " 0 603

DRB1* 18(3),CTLA4*G "5(5) "KD 0,035

-23 8 ГЛ'/^В] ,-308TNF*A2,CTLÄ4*G "lf(9) | 0(0)" ~ 0ДЮЗ

-23 8 Г>/Г*В 1 ,-308 WF*A2 13 (10) 4(5) ^ 0,198

-23STNF*B 1 ,CTLA4*G 38 (30) 15(17) 0,037

-3Q%TNF*A2,CTLA4*G 23(18) l 13(15) 0,580

Общим для двух выявленных триаллельных сочетаний является то обстоятельство, что входящие в них аллели могут изменять уровень/свойства кодируемых белковых продуктов в одном направлении - способствуя развитию воспали гельного процесса и тем самым предрасполагая индивида к РС Действительно, известно, что присутствующий в обоих сочетаниях аллель CTLA4*G определяет синтез продукта со сниженной ингибиторной функцией [12] Аллель -509TGFßI*C определяет пониженную продукцию противовоспалительного цитокина TGFßl [7] и в составе первого сочетания совместно действует с CTLA4*G в направлении усиления воспаления Для DRB1* 18(3), третьего аллеля этого сочетания, показано, что он в некоторых этнических группах ассоциирован с PC [II] Что касается второго сочетания, то установлено, что оба аллеля гена TNF -23877v'F*Bl и -30877v'F*A2 определяют повышенную продукцию этого провоспалптельного цитокина [8, 21], также действуя совместно с CTLA4*G в направлении усиления воспаления

Выявление двух независимых ассоциаций с сочетанием аллелей различных полиморфных участков, действующих в одном направлении наглядно свидетельствует о генетической гетерогенности РС

выводы

1 Разработан способ организации, пополнения, представления и хранения данных в виде реляционной базы, позволяющий выявлять вклад аллельных вариантов генов в развитие и особенности течения полигенных заболеваний на основании анализа анамнеза индивидов совместно с результатами их геномного типирования Такая база сформирована для неродственных больных РС русской этнической принадлежности и соответствующей контрольной группы и включает данные по генотипированию 15 полиморфных участков 8 локусов в генах иммунного ответа пли рядом с ними

2 При анализе аллелыюго полиморфизма генов СТЬА4 (ЭЫР +49А—Ю в экзоне 1), ССЯ5 (\уЬ->Д32) и ГОР/?/ (ЭЫР -509С-УГ, +72\\4-^тз С, ЭЫР +869Т^С, 8ЫР +9150—>С, +1632С—>Т) у индивидов, типированпых ранее по гену ОКБ/, с применением "стандартных" статистических методов, основанных на точном критерии Фишера показано достоверное повышение частоты иосительсгва аплеля ССИ5Д32 в подгруппе больных РС - носителей ОКВ1*04 по сравнению с соответствующей контрольной группой, и повышение частоты совместного носительства ССН5Д32 и йЯВ1*04 в общей группе больных РС по сравнению с контрольной группой

3 Показана негативная ассоциация совместного носительства аллелей ССЯ5А32 и ОЯВ1*04 с ранним дебютом заболевания (в возрасте 18 и менее лет)

4 Показана применимость разработанной базы данных для популяционного анализа методом "случай-контроль" с использованием как "стандартной" статистики основанной на точном критерии Фишера, так и непараметрического миогоаллельного теста с помощью алгоритма АР8ашр1ег С помощью этого алгоритма выявлены все ранее обнаруженные ассоциированные с РС аллели £>ЛВ/*2(15), ТЫРа9 и сочетание йЯВ1*04 и ССЛ5Д32

5 С помощью алгоритма АР8атр1ег в базе данных показано достоверное повышение частоты встречаемости сочетания аллелей ШВ/*18(3), -509ТОР/11*С и СПА4*0, а также сочетания аллелей -2387№*В1, -3087^7^2 и СПА4Ю, в группе больных РС по сравнению с контрольной группой Для входящих в эти сочетания аллелей не выявлено достоверной ассоциации с РС ни поодиночке, ни попарно

6 В целом, в группе больных РС русской этнической принадлежности идентифицировано несколько подгрупп, различающихся по носительству тех или иных аллелей генов иммунного ответа или их сочетаний, определяющих предрасположенность к заболеванию Полученные данные свидетельствуют о генетической гетерогенности РС

Список сокращений е а - единицы активности, ГКГ - главный комплекс гистосовместимости, ОР - относительный риск, ПЦР - поличеразная цепная реакция, PC -рассеянный склероз, ИД - интервал достоверности, Н 3 - не значимо, CCR5 - ген рецептора СС-хемокинов 5, CTLA4 - ген ассоциированного с цитотоксическимн Т-лимфоцнтами белка, DRB1 - геи р-цепи 1 DR комплекса гистосовместимости класса И, LTa - геи личфотоксина a, TGF01 - ген трансформирующего фактора роста pi, TNF - ген фактора некроза опухолей, SNP - однонуклеотидный полиморфизм

Список цитированной в автореферате литературы

1 HLA et Medecine, Twelfth International Histocompatibility Workshop, Technical handbook, 1996, Paris

2 F Cambien, S Ricard, A Troesch, С Mallet, L Generenaz, A Evans, D Arveiler, G Luc, J В Ruidavets, О Poirier "Polymorphisms of the transforming growth factor-beta 1 gene m relation to myocardial infarction and blood pressure The Etude Cas-Temoin de l'Infarctus du Myocarde (ECTIM) Study " Hypertension, 1996, 28(5), стр 881-887

3 E Dincic, M Zivkovic, A Stankovic, D Obradovic, D Alavantic, V Kostic, R Raicevic "Association of polymorphisms in CTLA-4, IL-lra and IL-lbeta genes with multiple sclerosis m Serbian population " J Neuroimmunol, 2006, 177(1-2), стр 146-150

4 G С Ebers, A D Sadovnick, N J Risch "A genetic basis for familial aggregation in multiple sclerosis Canadian Collaborative Study Group" Nature, 1995, 377(6545), стр 150151

5 A V Favorov, T V Andreewski, M A Sudomotna, О О Favorova G Parmigiani M F Ochs "A Markov chain Monte Carlo technique lor identification of combinations of allelic variants underlying complex diseases in humans " Genctics, 2005, 171(4) стр 2113-2121

6 О О Favorova, A V Favorov, A N Boiko, T V Andieewski, M A Sudomoma, A D Alekseenkov, О G Kulakova, E 1 Gusev, G Parmigiani, M Г Ochs "Three allele combinations associated with multiple sclerosis " BMC Med Genet, 2006, 7, стр 63

7 D J Grainger, К Heathcote, M Chiano, H Smeder, P R Kemp, I С Metcalfe, N D Carter, T D Spector "Genetic control of the circulating concentration of transforming growth factor type betal " Hum Mol Genet, 1999, 8(1), стр 93-97

8 J Grove, А К Daly, M Г Bassendine, С P Day "Association of a tumor necrosis factor promoter polymorphism with susceptibility to alcoholic steatohepatitis " Hepatology, 1997, 26(1), стр 143-146

9 H F Harbo, E G Celius, F Vartdal, A Spurkland "CTLA4 promoter and exon I dimorphisms in multiple sclerosis " Tissue Antigens, 1999, 53(1), стр 106-110

10 M P Marron, L I Raffel, H I Garchon, C 0 Jacob, M Serrano-Rios, M T Martinez Larrad, VV P Teng, Y Park, Z X Zhang, D R Goldstein, Y W Tao, G Beauram, J F Bach, H S Huang, D F Luo, A Zeidler, J 1 Rotter, M C Yang, T Modilevsky, N K Maclaren, J X She "Insulin-dependent diabetes mellitus (1DDM) is associated with CTLA4 polymorphisms in multiple ethnic groups " Hum Mol Genet, 1997, 6(8), CTp 1275-1282

11 M G Marrosu, C Sardu, E Cocco, G Costa, M R Murru, C Mancosu, R Murru, M Lai, P Contu "Bias in parental transmission of the HLA-DR3 allele in Sardinian multiple sclerosis " Neurology, 2004, 63(6), CTp 1084-1086

12 M Maurer, S Loserth, A Kolb-Maurer, A Ponath, S Wiese, N Kruse, P Rieckmann "A polymoiphism in the human cytotoxic T-lymphocyte antigen 4 ( CTLA4) gene (exon I +49) alters T-ccll activation " Immunogenetics, 2002, 54(1), CTp 1-8

13 G I Prud'homme, C A Piccinllo "The inhibitory effects of transforming growth factor-beta-1 (TGF-betal) in autoimmune diseases " 1 Autoimmun, 2000, 14(1), CTp 23-42

14 C J Rapoit, J Gosling, V L Schweickart, P W Gray, 1 F Charo "Moleculai cloning and functional characterization of a novel human CC chemokine receptor (CCR5) foi RANTES, MlP-lbeta, and M1P-1 alpha " J Biol Chem, 1996, 271(29), CTp 17161-17166

15 A D Sadovmck, A Dircks, G C Ebers "Genetic counselling in multiple sclerosis risks to sibs and children of affected individuals " Clin Genet, 1999, 56(2), CTp 118-122

16 A D Sadovmck, G C Ebers, D A Dyment, N J Risch "Evidence for genetic basis of multiple sclerosis The Canadian Collaborative Study Group " Lancet, 1996, 347(9017), CTp 1728-1730

17 M Samson, O Labbe, C Mollereau, G Vassart, M Parmentier "Molecular cloning and functional expression of a new human CC-chemokine receptor gene " Biochemistry, 1996, 35(11) CTP 3362-3367

18 M Samson, F L ibert, B 1 Doranz, 1 Rucker, C Liesnard, C M Farber, S Saragosti, C Lapoumerouhe I Cognaux, C Forceille, G Muyldermans, C Verhofstede, G Burtonboy, M Georges, T Imai, S Rana, Y Yi, R J Smyth, R G Collman, R W Doms, G Vassart, M Parmentier "Resistance to HIV-1 infection in Caucasian individuals bearing mutant alleles of the CCR-5 chemokine receptor gene " Nature, 1996, 382(6593), CTp 722-725

19 A J Sandford, P D Pare "Direct PCR of small genomic DNA fragments from serum " Biotechmques, 1997, 23(5), CTp 890-892

20 T L Soiensen, M Tani, J Jensen, V Pierce, C Lucchinetti, V A Folcik, S Qin, J Rottman, T Sellebjerg, R M Stneter, J L Fredenksen, R M Ransohoff "Expression of specific chemokines and chemokine receptors in the central nervous system of multiple sclerosis patients " I Clin Invest 1999, 103(6), ctP 807-815

21 MU Uboldi de Capei, E Dametto, M E Fasano, S Rendine, E S Curtoni "Genotyping for cytokine polymorphisms allele frequencies in the Italian population " Eur I Immunogenet, 2003, 30(1), стр 5-10

22 A H Бойко, О О Фаворова "Рассеянный склероз молекулярные и клеточные механизмы " Молекулярная биочогия, 1995, 29(4), стр 727-749

23 В Я Макдональд, Ф Фазекас, А Д Томпсон "Диагностика рассеянного склероза " Журнал неврологии и психиатрии имени С С Корсакова, 2003, 2, стр 4-9

24 М А Судомоина, А Н Бойко, Т Л Демина, Е И Гусев, М Н Болдырева, Д 10 Трофимов, JI П Алексеев, О О Фаворова "Связь рассеянного склероза в русской популяции с аллелями гена DRB1 главного комплекса гистосовместимости" Молекулярная биология, 1998, 32, стр 291-296

25 М А Судомоина, А Н Бойко, Р Л Турецкая, Е И Гусев, Т Л Демина, О О Фаворова "Генетический полиморфизм локуса генома человека, содержащего гены факторов некроза опухолей новые маркеры восприимчивости к рассеянному склерозу " Доклады РАН, 1995, 343, стр 119-123

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Т В Андреевский, М А Судочоина, Е И Гусев, А Н Бойко, А Д Алексеенков, О О Фаворова "Полиморфизм A/G в положении +49 первого экзона гена CTLA4 при рассеяном склерозе у русских", Молекулярная биология, 2002, 34(4), 643-648

2 О О Favorova, Т V Andreewski, А N Boiko, М A Sudomoina, A D Alekseenkov, О G Kulakova, А V Slanova, Е I Gusev "The chemokme receptor CCR5 deletion mutation is associated with MS in HLA-DR4-positive Russians", Neurology, 2002, 59(10), 1652-1655

3 0 0 Фаворова, T В Андреевский, A H Бойко, M А Судомоипа, А Д Алексеенков, О Г Кулакова А В Сланова, Е И Гусев Связь рассеянного склероза в русской популяции с делециеи в кодирующей области гена рецептора хемокинов CCR5 Вестник РГМУ, 2003 4(30), 53-56

4 Т В Андреевский, М А Судомоипа, А Н Бойко, О О Фаворова "Генетика рассеянного склероза", Рассеянный склероз и другие демиелинизирующие заболевания, под ред Е И Гусева, И А Завалишина, А Н Бойко, изд-во Микпош, Москва, 2004, 43-59

5 А V Favorov, Т V Andreewski, М A Sudomoina, О О Favorova, G Parmigiani, М F Ochs "A Markov chain Monte Carlo technique for identification of combinations of allelic variants underlying complex diseases m humans", Genetics, 2005, 171(4), 2113-2121

6 0 0 Favorova, A V Favoiov, A N Boiko, T V Andreewski, M A Sudomoina, A D Alekseenkov О G Kulakova, Г 1 Gusev, G Parmigiani, M F Ochs "Three allele combinations associated with multiple sclerosis", BMC Med Genet, 2006, 7, 63

Заказ № 224/04/07 Подписано в печать 25 04 2007 Тираж 70 экз Уст пп 1,25

ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 - V тии с// / и, е-тай т/о@с[г т

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Андреевский, Тимофей Владимирович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Этиология и клинико-эпидемиологическая характеристика PC

1.1.1. Клинические признаки PC

1.1.2. Эпидемиология PC

1.1.3. Этиология PC И

1.2. Стратегии анализа генетической предрасположенности

1.3. Полный геномный поиск

1.4. Подход "ген-кандидат"

1.4.1. Принципы выбора "генов-кандидатов" при исследованиях PC и некоторые результаты этих исследований для отдельных генов

1.4.2. Ассоциации PC с несколькими полиморфными участками генома

1.4.3. Ассоциации полиморфных участков генома с клиническими вариантами PC

1.5. Сравнение результатов полного геномного поиска и подхода "ген-кандидат" и оценка перспектив исследования генетической предрасположенности к PC.

1.6. Обоснование выбора генов-кандидатов для PC

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Использованные реактивы

2.2. Объект исследования

2.3. Организация данных

2.4. Выделение геномной ДНК из периферической крови

2.5. Геномное типирование

2.5.1. Геномное типирование полиморфного участка в гене CCR

2.5.2. Геномное типирование полиморфного участка в положении +49 первого экзона гена CTLA

2.5.3. Геномное типирование полиморфных участков в гене TGFP1.

2.5.4. Геномное типирование других полиморфных участков

2.6. Статистический анализ 46 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Анализ полиморфизма CCRJA

3.2. Анализ полиморфизма полиморфизма CTLА4+

3.3. Анализ полиморфизма гена TGFfil

3.4. Поиск ассоциаций PC с сочетанием аллелей полиморфных участков с применением "стандартных" подходов на основе точного критерия Фишера

3.5. Поиск ассоциаций клинических вариантов PC с аллелями полиморфных участков с применением "стандартных" подходов на основе точного критерия Фишера

3.6. Анализ базы данных с применением алгоритма APSampler 65 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 70 ВЫВОДЫ 71 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

CCR5 - рецептор СС-хемокинов (CC-chemokine receptor 5)

CTLA4 - антиген 4 цитотоксических Т-лимфоцитов (cytotoxic Т lymphocyte antigen dHhO - дистилированная Н2О HLA - лейкоцитарный антиген человека LTa - лимфотоксин a (lymphotoxin a) SDS - додецилсульфат натрия (sodium dodecyl sulfate) SNP - однонуклеотидный полиморфизм (single nucleotide polymorphism) SSC - раствор, содержащий хлорид натрия и цитрат натрия TGFpl - трансформирующий фактор роста pi (transforming growth factor pi, TGFpi)

TNF - фактор некроза опухоли (tumor necrosis factor)

ВПРС - вторично-прогрессирующий PC

ГКГ - главный комплекс гистосовместимости

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИД - интервал достоверности (confidence interval)

МКП - микросателлитный повтор

МНП - минисателлитный повтор

ОБМ - общий белок миелина

ОР - относительный риск п.н. - пара нуклеотидов

ПДРФ - полиморфизм длины рестрикционных фрагментов

ПНК - полинуклеотидкиназа

ППРС - первично-прогрессирующий PC

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РРС - ремиггарующий PC

PC - рассеянный склероз

СУБД - система управления базами данных

УФ-излучение - ультрафиолетовое излучение

ЦНС - центральная нервная система

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

Введение Диссертация по биологии, на тему "Комплексный анализ полиморфизма генов иммунного ответа при рассеянном склерозе у русских"

Рассеянный склероз (PC) представляет собой тяжелое воспалительное заболевание ЦНС, приводящее к инвалидизации довольно молодых людей в трудоспособном возрасте. Поражая преимущественно молодых работоспособных людей, PC представляет собой серьезную медицинскую и социальную проблему. Он является заболеванием со средним уровнем распространенности (до 200 человек на 100000 населения [115]). В России частота PC составляет от 30 до 70 человек на 100000 населения, что соответствует среднему и высокому (выше 50) риску PC [5]. PC характеризуется множеством клинических форм и проявлений [162]. Этиология PC до настоящего времени является неизвестной, но показано, что PC является типичным комплексным заболеванием, в развитие которого большой вклад вносит наследственная предрасположенность с неменделевским полигенным типом наследования, на основе которой действуют остальные факторы риска [51; 200]. Несмотря на многочисленные усилия исследователей, вопрос о факторах генетической предрасположенности к PC далек от своего разрешения. Одной из основных причин этого может являться клиническая и возможная генетическая гетерогенность. Другой причиной, затрудняющей получение однозначных выводов, является, судя по всему, отсутствие для PC главного(ых) гена(ов). Кроме того, исследование вклада в заболевание нескольких генов наталкивается на проблему необходимости большого количества статистических расчетов и недостаточной мощности существующего в настоящий момент в мире математического аппарата для таких расчетов.

Для идентификации генов, определяющих предрасположенность к PC, в настоящее время используют две основные стратегии: выяснение роли того или иного гена-кандидата, выбранного исходя из возможной роли его белкового продукта в этиологии и патогенезе заболевания, и полный геномный скрининг с использованием панели анонимных генетических маркеров, равномерно распределенных по геному, для идентификации областей хромосом, вовлеченных в развитие заболевания. В целом, подход "ген-кандидат" в данный момент представляется более перспективным и более успешным, чем полный геномный поиск, и в настоящей работе тоже применяется этот подход.

Целью настоящей работы является проведение комплексного анализа вклада полиморфных участков генов иммунного ответа и их сочетаний в формирование генетической предрасположенности к PC и/или вариантам его клинического течения у русских. Исходя из сложившихся представлений о полигенной природе PC, было принято решение разработать математический алгоритм, позволяющий провести компьютерный анализ сочетанной встречаемости аллелей и генотипов различных генов в группах больных PC и здоровых.

Для достижения поставленной цели были поставлены следующие конкретные задачи:

- Создать способ организации, пополнения, представления и хранения данных, позволяющий эффективно анализировать вклад аллельных вариантов генов в развитие и особенности течения полигенных заболеваний.

- Провести геномное титрование функционально значимых полиморфных участков генов CCR5, CTLA4 и TGF01 для неродственных больных PC русской этнической принадлежности и соответствующей контрольной группы.

- С помощью полученной базы данных повести анализ ассоциации аллелей и генотипов исследованных генов с развитием и вариантами клинического течения PC методом "случай-контроль" с использованием "стандартного" статистического анализа на основе точного критерия Фишера.

- На материале полученной базы данных доказать эффективность разработанного при нашем участии биоинформатического алгоритма APSampler по его способности выявлять уже найденные ранее ассоциации аллелей с PC у русских.

- С помощью полученной базы данных и алгоритма APSampler провести комплексный анализ ассоциации PC с сочетаниями аллелей/генотипов всех генотипированных полиморфных участков генов иммунного ответа.

Научная новизна. В настоящем исследовании впервые проводится исследование полиморфизма гена TGFfil для PC у русских. Кроме того, в настоящем исследовании впервые проводится комплексный анализ совместного вклада в развитие PC полиморфных участков в генах CCR5, CTLA4 и TGFfil с применением как "стандартных" статистических методов, так и вновь разработанного биоинформатического алгоритма APSampler. Настоящая работа представляет собой целостное систематическое исследование вклада 15 функционально значимых полиморфных участков в 6 генах иммунного ответа или рядом с ними в развитие PC у русских.

В настоящей работе впервые выявлена ассоциация с PC сочетанного носительства аллелей CCR5А32 и DRB1*04. Впервые показана негативная ассоциация совместного носительства аллелей CCR5A32 и DRB1* 04 с ранним дебютом заболевания (<18 лет). Впервые применен новый статистический алгоритм APSampler и с его помощью выявлены ранее не обнаруженные ассоциации PC с совместным носительством двух триаллельных сочетаний (DRB1* 18(3), -509TGFfil*C и CTLA4*G) и (-2387WF*B1, -30877VF*A2 и CTLA4*G). До настоящей работы ни в одной этнической группе не было описано ассоциации PC с каким-либо триаллельным сочетанием. Важно отметить, что группы носителей этих сочетаний среди больных PC являлись непересекающимися, что впервые наглядно свидетельствует о генетической гетерогенности PC как полигенного заболевания.

Практическая значимость работы. Изучение PC на молекулярно-генетическом уровне может в будущем позволить индивидуально оценивать степень риска его развития у индивидов, разработать эффективные основы профилактики с учетом генетической конституции и особенностей образа жизни отдельного индивида. Кроме того, практическое применение алгоритма APSampler показало его ценность для анализа ассоциации заболеваний с сочетаниями аллелей нескольких полиморфных участков.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Рассеянный склероз как комплексное заболевание и стратегии поиска связанных с ним генов

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Андреевский, Тимофей Владимирович

выводы

1. Разработан способ организации, пополнения, представления и хранения данных в виде реляционной базы, позволяющий выявлять вклад аллельных вариантов генов в развитие и особенности течения полигенных заболеваний на основании анализа анамнеза индивидов совместно с результатами их геномного типирования. Такая база сформирована для неродственных больных PC русской этнической принадлежности и соответствующей контрольной группы и включает данные по генотипированию 15 полиморфных участков 8 локусов в генах иммунного ответа или рядом с ними.

2. При анализе аллельного полиморфизма генов CTLA4 (SNP +49A-»G в экзоне 1), CCR5 (wt-»A32) и TGFpl (SNP -509С->Т, SNP +72wt->ins С, SNP +869T->C, SNP +915G-»C, SNP +1632C->T) у индивидов, типированных ранее по гену DRB1, с применением "стандартных" статистических методов, основанных на точном критерии Фишера, показано достоверное повышение частоты носительства аллеля CCR5A.32 в подгруппе больных PC - носителей DRB1* 04 по сравнению с соответствующей контрольной группой, и повышение частоты совместного носительства CCR5A32 и DRB1*04 в общей группе больных PC по сравнению с контрольной группой.

3. Показана негативная ассоциация совместного носительства аллелей CCR5A32 и DRB1* 04 с ранним дебютом заболевания (в возрасте 18 и менее лет).

4. Показана применимость разработанной базы данных для популяционного анализа методом "случай-контроль" с использованием как "стандартной" статистики, основанной на точном критерии Фишера, так и непараметрического многоаллельного теста с помощью алгоритма APSampler. С помощью этого алгоритма выявлены все ранее обнаруженные ассоциированные с PC аллели: DRB1*2(15), TNFa9 и сочетание DRB1* 04 и CCR5A32.

5. С помощью алгоритма APSampler в базе данных показано достоверное повышение частоты встречаемости сочетания аллелей DRB1* 18(3), -509TGF]31*C и

CTLA4*G, а также сочетания аллелей -2387WF*B1, -30877VF*A2 и CTLA4*G, в группе больных PC по сравнению с контрольной группой. Для входящих в эти сочетания аллелей не выявлено достоверной ассоциации с PC ни поодиночке, ни попарно.

6. В целом, в группе больных PC русской этнической принадлежности идентифицировано несколько подгрупп, различающихся по носительству тех или иных аллелей генов иммунного ответа или их сочетаний, определяющих предрасположенность к заболеванию. Полученные данные свидетельствуют о генетической гетерогенности PC.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В целом, наша работа подтвердила необходимость проведения комплексного анализа генетической предрасположенности к PC. Нами быпо показано, что все выбранные нами для анализа в этой работе гены (CCR5, CTLA4, TGFfil), вовлечены в развитие PC. Причем их роль выявлялась именно при анализе совместной встречаемости аллелей этих генов. При сравнении результатов нашей работы с работами других авторов видно, что остается эффективным исследование PC в этнически однородных группах. Выявленные в работе для единой выборки два независимых ассоциированных с PC триаллельных сочетания, однозначно демонстрирует, что PC является генетически гетерогенным заболеванием.

Впервые показанная в настоящей работе негативная ассоциация совместного носительства аллелей CCR5A32 и DRB1*04 с ранним дебютом заболевания (<18 лет) может свидетельствовать о клинической гетерогенности PC и о возможных различиях в формировании генетической предрасположенности к различным клиническим формам заболевания.

Применение в данной работе алгоритма APSampler наглядно продемонстрировало его ценность для анализа ассоциации заболеваний с сочетаниями аллелей нескольких полиморфных участков. Выявление ассоциированных с PC и его клиническими вариантами полиморфных участков в будущем может способствовать идентификации предрасположенных к этому заболеванию людей еще до заболевания и принятию адекватных мер профилактики.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Андреевский, Тимофей Владимирович, Москва

1. А. Д. Алексеенков, М. А. Судомоина, А. Н. Бойко, Т. JI. Демина, Е. И. Гусев, О. О.

2. Фаворова. Анализ двух участков биаллельного полиморфизма в локусе фактора некроза опухолей у больных рассеянным склерозом из русской популяции: связь с ГТДРФ Ncol в первом интроне гена лимфотоксина а. Молекулярная биология, 1999, 33,190-196.

3. А. Н. Бойко, О. О. Фаворова. Рассеянный склероз: молекулярные и клеточныемеханизмы. Молекулярная биология, 1995,29(4), 727-749.

4. Е. И. Гусев. Современные диагностические критерии рассеянного склероза. Рассеянныйсклероз и другие демиелинизирующие заболевания, 2004,252-261.

5. Е. И. Гусев. Экзогенные факторы риска развития рассеянного склероза. Рассеянныйсклероз и другие демиелинизирующие заболевания, 2004,30-42.

6. Е. И. Гусев, А. Н. Бойко, Завалишин, О. В. Быкова. Современная эпидемиологиярассеянного склероза. Рассеянный склероз и другие демиелинизирующие заболевания, 2004, 8-29.

7. Е. И. Гусев, А. Н. Бойко, В. А. Силуянова, О. В. Быкова, О. И. Маслова, Г. Воробейчик.

8. Варианты течения и прогноз при рассеянном склерозе. Рассеянный склероз и другие демиелинизирующие заболевания, 2004,158-180.

9. Е. И. Гусев, Т. JI. Демина, А. Н. Бойко. Рассеянный склероз, 1997.

10. И. А. Завалишин, М. Н. Захарова. Рассеянный склероз: основные аспекты патогенеза.

11. Рассеянный склероз и другие демиелинизирующие заболевания, 2004,60-74.

12. И. А. Завалишин, О. М. Невская, Б. Б. Кулов. Антигены гистосовместимости приретробульбарном неврите и рассеянном склерозе. Журнал неврологии и психиатрии имени С.С.Корсакова, 1989,4,55-58.

13. В. Я. Макдональд, Ф. Фазекас, А. Д. Томпсон. Диагностика рассеянного склероза.

14. Журнал неврологии и психиатрии имени С.С.Корсакова, 2003,2,4-9.

15. М. А. Судомоина, А. Н. Бойко, Т. J1. Демина, Е. И. Гусев, М. Н. Болдырева, Д. Ю.

16. Трофимов, Л. П. Алексеев, О. О. Фаворова. Связь рассеянного склероза в русской популяции с аллелями гена DRB1 главного комплекса гистосовместимости. Молекулярная биология, 1998,32,291-296.

17. М. А. Судомоина, А. Н. Бойко, А. Спуркланд, Е. И. Гусев, М. Н. Болдырева, Д. Ю.

18. Трофимов, Л. П. Алексеев, О. О. Фаворова, Ф. Вардал. Исследование полиморфизма гена DPB1 главного комплекса гистосовместимости у больных рассеянным склерозом в русской популяции. Иммунология, 1999,5,45-48.

19. М. А. Судомоина, А. Н. Бойко, Р. Л. Турецкая, Е. И. Гусев, Т. Л. Демина, О. О.

20. Фаворова. Генетический полиморфизм локуса генома человека, содержащего гены факторов некроза опухолей: новые маркеры восприимчивости к рассеянному склерозу. Доклады РАН, 1995,343,119-123.

21. М. А. Судомоина, О. О. Фаворова. Поиск генов предрасположенности к рассеянномусклерозу. Молекулярная биология, 2000,34(4), 654-670.

22. С. S. Raine. J Neuroimmunol, 2003,143(1-2).

23. H. Abdeen, S. Heggarty, S. A. Hawkins, M. Hutchinson, G. V. McDonnell, C. A. Graham.

24. Mapping candidate non-MHC susceptibility regions to multiple sclerosis. Genes Immun, 2006,7(6), 494-502.

25. E. Akesson, A. Oturai, J. Berg, S. Fredrikson, O. Andersen, H. F. Harbo, M. Laaksonen, K.

26. Alaev. Multiple Sclerosis in Europe, 1994, Firnhaber, Lauer, Darmstadt. Leuchtturn-Verlag,1.V Press, 236-240.

27. M. Alizadeh, M. C. Babron, B. Birebent, F. Matsuda, E. Quelvennec, R. Liblau, I. Cournu

28. L. Almeras, B. Meresse, J. Seze, D. De Lefranc, S. Dubucquoi, I. Fajardy, P. Vermersch, L.

29. Prin. Interleukin-10 promoter polymorphism in multiple sclerosis: association with disease progression. Eur Cytokine Netw, 2002,13(2), 200-206.

30. С. Ballerini, D. Campani, G. Rombola, B. Gran, B. Nacmias, M. P. Amato, G. Siracusa, L.

31. Bartolozzi, S. Sorbi, L. Massacesi. Association of apolipoprotein E polymorphism to clinical heterogeneity of multiple sclerosis. Neurosci Lett, 2000,296(2-3), 174-176.

32. C. Ballerini, F. R. Guerini, G. Rombola, E. Rosati, L. Massacesi, P. Ferrante, D. Caputo, L.

33. F. Talamanca, P. Naldi, M. Liguori, M. Alizadeh, P. Momigliano-Richiardi, S. D'Alfonso. HLA-multiple sclerosis association in continental Italy and correlation with disease prevalence in Europe. J Neuroimmunol, 2004,150(1-2), 178-185.

34. C. Ballerini, E. Rosati, M. Salvetti, G. Ristori, S. Cannoni, T. Biagioli, L. Massacesi, S.

35. Sorbi, M. Vergelli. Protein tyrosine phosphatase receptor-type С exon 4 gene mutation distribution in an Italian multiple sclerosis population. Neurosci Lett, 2002, 328(3), 325327.

36. M. Ban, G. J. Stewart, В. H. Bennetts, R. Heard, R. Simmons, M. Maranian, A. Compston, S.

37. J. Sawcer. A genome screen for linkage in Australian sibling-pairs with multiple sclerosis. Genes Immun, 2002,3(8), 464-469.

38. L. F. Barcellos, W. Klitz, L. L. Field, R. Tobias, A. M. Bowcock, R. Wilson, M. P. Nelson, J.

39. Nagatomi, G. Thomson. Association mapping of disease loci, by use of a pooled DNA genomic screen. Am J Hum Genet, 1997,61(3), 734-747.

40. L. F. Barcellos, A. M. Schito, J. B. Rimmler, E. Vittinghoff, A. Shih, R. Lincoln, S. Callier,

41. В. H. Bennetts, S. M. Teutsch, M. M. Buhler, R. N. Heard, G. J. Stewart. The CCR5 deletionmutation fails to protect against multiple sclerosis. Hum Immunol, 1997,58(1), 52-59.

42. A. N. Boiko, E. I. Gusev, M. A. Sudomoina, A. D. Alekseenkov, O. G. Kulakova, О. V.

43. Bikova, О. I. Maslova, M. R. Guseva, S. Y. Boiko, M. E. Guseva, О. O. Favorova. Association and linkage of juvenile MS with HLA-DR2(15) in Russians. Neurology, 2002,58(4), 658-660.

44. D. Brassat, A. A. Motsinger, S. J. Caillier, H. A. Erlich, K. Walker, L. L. Steiner, B. A. Cree,

45. S. Broadley, S. Sawcer, S. D'Alfonso, A. Hensiek, F. Coraddu, J. Gray, R. Roxburgh, D.

46. Clayton, C. Buttinelli, A. Quattrone, M. Trojano, L. Massacesi, A. Compston. A genome screen for multiple sclerosis in Italian families. Genes Immun, 2001,2(4), 205-210.

47. M. M. Buhler, В. H. Bennetts, R. N. Heard, G. J. Stewart. T cell receptor beta chaingenotyping in Australian relapsing-remitting multiple sclerosis patients. Mult Scler, 2000,6(3), 140-147.

48. S. Caillier, L. F. Barcellos, S. E. Baranzini, A. Swerdlin, R. R. Lincoln, L. Steinman, E.

49. Martin, J. L. Haines, M. Pericak-Vance, S. L. Hauser, J. R. Oksenberg. Osteopontin polymorphisms and disease course in multiple sclerosis. Genes Immun, 2003, 4(4), 312315.

50. P. A. Calabresi, R. Martin, S. Jacobson. Chemokines in chronic progressive neurologicaldiseases: HTLV-1 associated myelopathy and multiple sclerosis. J Neurovirol, 1999, 5(1), 102-108.

51. F. Cambien, S. Ricard, A. Troesch, C. Mallet, L. Generenaz, A. Evans, D. Arveiler, G. Luc,

52. J. B. Ruidavets, 0. Poirier. Polymorphisms of the transforming growth factor-beta 1 gene in relation to myocardial infarction and blood pressure. The Etude Cas-Temoin de l'lnfarctus du Myocarde (ECTIM) Study. Hypertension, 1996,28(5), 881-887.

53. J. Chapman, S. Vinokurov, A. Achiron, D. M. Karussis, K. Mitosek-Szewczyk, M.

54. Birnbaum, D. M. Michaelson, A. D. Korczyn. APOE genotype is a major predictor of long-term progression of disability in MS. Neurology, 2001,56(3), 312-316.

55. J. Chataway, R. Feakes, F. Coraddu, J. Gray, J. Deans, M. Fraser, N. Robertson, S. Broadley,

56. H. Jones, D. Clayton, P. Goodfellow, S. Sawcer, A. Compston. The genetics of multiple sclerosis: principles, background and updated results of the United Kingdom systematic genome screen. Brain, 1998,121 (Pt 10), 1869-1887.

57. L. Chatenoud. Protection from autoimmunity: immunological indifference versus T-cellmediated suppression? Eur J Immunol, 2006,36(9), 2296-2298.

58. D. Chen, M. Zhao, G. R. Mundy. Bone morphogenetic proteins. Growth Factors, 2004, 22(4), 233-241.

59. W. Chen, W. Jin, S. M. Wahl. Engagement of cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 (CTLA-4) induces transforming growth factor beta (TGF-beta) production by murine CD4(+) T cells. J Exp Med, 1998,188(10), 1849-1857.

60. A. Compston, A. Coles. Multiple sclerosis. Lancet, 2002,359(9313), 1221-1231.

61. D. A. Compston, H. Kellar Wood, N. Robertson, S. Sawcer, N. W. Wood. Genes and susceptibility to multiple sclerosis. Acta Neurol Scand Suppl, 1995,161,43-51.

62. F. Coraddu, S. Sawcer, S. D'Alfonso, M. Lai, A. Hensiek, E. Solla, S. Broadley, C. Mancosu, M. Pugliatti, M. G. Marrosu, A. Compston. A genome screen for multiple sclerosis in Sardinian multiplex families. Eur J Hum Genet, 2001,9(8), 621-626.

63. E. P. Cowan, M. L. Pierce, H. F. McFarland, D. E. McFarlin. HLA-DR and -DQ allelic sequences in multiple sclerosis patients are identical to those found in the general population. Hum Immunol, 1991,32(3), 203-210.

64. G. Dean. Annual incidence, prevalence, and mortality of multiple sclerosis in white South-African-born and in white immigrants to South Africa. Br Med J, 1967, 2(5554), 724730.

65. J. W. Dekker, S. Easteal, I. B. Jakobsen, X. Gao, G. J. Stewart, M. M. Buhler, B. R.

66. Hawkins, D. A. Higgins, Y. L. Yu, S. W. Serjeantson. HLA-DPB1 alleles correlate with risk for multiple sclerosis in Caucasoid and Cantonese patients lacking the high-risk DQB 1*0602 allele. Tissue Antigens, 1993,41(1), 31-36.

67. A. A. Delvig, J. J. Lee, Z. M. Chrzanowska-Lightowlers, J. H. Robinson. TGF-betal and

68. N-gamma cross-regulate antigen presentation to CD4 T cells by macrophages. J Leukoc Biol, 2002,72(1), 163-166.

69. E. Dincic, M. Zivkovic, A. Stankovic, D. Obradovic, D. Alavantic, V. Kostic, R. Raicevic.

70. Association of polymorphisms in CTLA-4, IL-lra and IL-lbeta genes with multiple sclerosis in Serbian population. J Neuroimmunol, 2006,177(1-2), 146-150.

71. J. Drulovic, D. Popadic, S. Mesaros, I. Dujmovic, I. Cvetkovic, D. Miljkovic, N.

72. Stojsavljevic, V. Pravica, T. Pekmezovic, G. Bogdanovic, M. Jarebinski, M. Mostarica Stojkovic. Decreased frequency of the tumor necrosis factor alpha -308 allele in Serbian patients with multiple sclerosis. Eur Neurol, 2003,50(1), 25-29.

73. D. A. Dyment, G. C. Ebers, A. D. Sadovnick. Genetics of multiple sclerosis. Lancet Neurol,2004,3(2), 104-110.

74. G. C. Ebers, D. A. Dyment. Genetics of multiple sclerosis. Semin Neurol, 1998, 18(3), 295299.

75. G. C. Ebers, K. Kukay, D. E. Bulman, A. D. Sadovnick, G. Rice, C. Anderson, H.

76. Armstrong, K. Cousin, R. B. Bell, W. Hader, D. W. Paty, S. Hashimoto, J. Oger, P. Duquette, S. Warren, T. Gray, P. O'Connor, A. Nath, A. Auty, L. Metz, G. Francis, J. E.

77. Paulseth, Т. J. Murray, W. Pryse-Phillips, R. Nelson, M. Freedman, D. Brunet, J. P. Bouchard, D. Hinds, N. Risch. A full genome search in multiple sclerosis. Nat Genet, 1996,13(4), 472-476.

78. G. C. Ebers, D. W. Paty, C. R. Stiller, R. F. Nelson, T. P. Seland, B. Larsen. HLA-typing inmultiple sclerosis sibling pairs. Lancet, 1982,2(8289), 88-90.

79. G. C. Ebers, A. D. Sadovnick, N. J. Risch. A genetic basis for familial aggregation inmultiple sclerosis. Canadian Collaborative Study Group. Nature, 1995, 377(6545), 150151.

80. V, N. Efimenko, S. K. Evtushenko, A. V. Khodakovskii. Histocompatibility antigens inmultiple sclerosis in children. Lik Sprava, 1998,(6), 67-69.

81. R. Ehling, C. Gassner, A. Lutterotti, S. Strasser-Fuchs, H. Kollegger, W. Kristoferitsch, M.

82. Reindl, T. Berger. Genetic variants in the tumor necrosis factor receptor II gene in patients with multiple sclerosis. Tissue Antigens, 2004,63(1), 28-33.

83. M. E. Engel, P. K. Datta, H. L. Moses. Signal transduction by transforming growth factorbeta: a cooperative paradigm with extensive negative regulation. J Cell Biochem Suppl, 1998,30-31,111-122.

84. C. Epplen, J. Buitkamp, H. Rumpf, M. D'Souza, J. T. Epplen. Immunoprinting revealsdifferent genetic bases for (auto)immuno diseases. Electrophoresis, 1995, 16(9), 16931697.

85. С. Epplen, S. Jackel, E. J. Santos, M. D'Souza, D. Poehlau, B. Dotzauer, E. Sindern, M.

86. Haupts, K. P. Rude, F. Weber, J. Stover, S. Poser, W. Gehler, J. P. Malin, H. Przuntek, J. T. Epplen. Genetic predisposition to multiple sclerosis as revealed by immunoprinting. Ann Neurol, 1997,41(3), 341-352.

87. M. Eraksoy, M. Kurtuncu, G. Akman-Demir, M. Kilinc, M. Gedizlioglu, M. Mirza, 0. Anlar,

88. C. Kutlu, M. Demirkiran, H. A. Idrisoglu, A. Compston, S. Sawcer. A whole genome screen for linkage in Turkish multiple sclerosis. J Neuroimmunol, 2003,143(1-2), 17-24.

89. M. Farrall. Mapping genetic susceptibility to multiple sclerosis. Lancet, 1996, 348(9043),1674-1675.

90. A. V. Favorov, Т. V. Andreewski, M. A. Sudomoina, О. O. Favorova, G. Parmigiani, M. F.

91. Ochs. A Markov chain Monte Carlo technique for identification of combinations of allelic variants underlying complex diseases in humans. Genetics, 2005, 171(4), 21132121.

92. F. Fazekas, S. Strasser-Fuchs, H. Kollegger, T. Berger, W. Kristoferitsch, H. Schmidt, C.

93. J. L. Fdez-Morera, A. Tunon, S. Rodriguez-Rodero, L. Rodrigo, J. Martinez-Borra, S.

94. Gonzalez, A. Lopez-Vazquez, С. H. Lahoz, C. Lopez-Larrea. Clinical behavior of multiple sclerosis is modulated by the MHC class I-chain-related gene A. Tissue Antigens, 2006, 67(5), 409-414.

95. M. Fedetz, F. Matesanz, A. Caro-Maldonado, O. Fernandez, J. A. Tamayo, M. Guerrero, C. Delgado, J. A. Lopez-Guerrero, A. Alcina. OAS1 gene haplotype confers susceptibility to multiple sclerosis. Tissue Antigens, 2006,68(5), 446-449.

96. M. Fernandez-Arquero, R. Arroyo, A. Rubio, C. Martin, P. Vigil, L. Conejero, M. A. Figueredo, E. G. de la Concha. Primary association of a TNF gene polymorphism with susceptibility to multiple sclerosis. Neurology, 1999,53(6), 1361-1363.

97. A. Fontana, D. B. Constam, K. Frei, U. Malipiero, H. W. Pfister. Modulation of the immune response by transforming growth factor beta. Int Arch Allergy Immunol, 1992, 99(1), 17.

98. T. Fukazawa, S. Kikuchi, H. Sasaki, I. Yabe, R. Miyagishi, T. Hamada, K. Tashiro. Genomic HLA profiles of MS in Hokkaido, Japan: important role of DPB1*0501 allele. J Neurol, 2000,247(3), 175-178.

99. T. Fukazawa, I. Yabe, S. Kikuchi, H. Sasaki, T. Hamada, K. Miyasaka, K. Tashiro. Association of vitamin D receptor gene polymorphism with multiple sclerosis in Japanese. J Neurol Sci, 1999,166(1), 47-52.

100. T. Fukazawa, T. Yanagawa, S. Kikuchi, I. Yabe, H. Sasaki, T. Hamada, K. Miyasaka, K. Gomi, K. Tashiro. CTLA-4 gene polymorphism may modulate disease in Japanese multiple sclerosis patients. J Neurol Sci, 1999,171(1), 49-55.

101. R. Gade-Andavolu, D. E. Comings, J. MacMurray, M. Rostamkhani, L. S. Cheng, W. W. Tourtellotte, L. A. Cone. Association of CCR5 delta32 deletion with early death in multiple sclerosis. Genet Med, 2004,6(3), 126-131.

102. G. Gallagher, J. Eskdale, H. H. Oh, S. D. Richards, D. A. Campbell, M. Field. Polymorphisms in the TNF gene cluster and MHC serotypes in the West of Scotland. Immunogenetics, 1997,45(3), 188-194.

103. GAMES, Т. M. S. G. Cooperative. A meta-analysis of whole genome linkage screens in multiple sclerosis. J Neuroimmunol, 2003,143(1-2), 39-46.

104. P. Garred, H. O. Madsen, J. Petersen, H. Marquart, Т. M. Hansen, S. Freiesleben Sorensen, B. Volck, A. Svejgaard, V. Andersen. CC chemokine receptor 5 polymorphism in rheumatoid arthritis. J Rheumatol, 1998,25(8), 1462-1465.

105. GeneFisher, http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher

106. R. Giess, M. Maurer, R. Linker, R. Gold, M. Warmuth-Metz, К. V. Toyka, M. Sendtner, P. Rieckmann. Association of a null mutation in the CNTF gene with early onset of multiple sclerosis. Arch Neurol, 2002,59(3), 407-409.

107. M. Gomez-Lira, М. Liguori, С. Magnani, D. Bonamini, A. Salviati, M. Leone, V. Andreoli,

108. A. Goris, C. Epplen, P. Fiten, M. Andersson, R. Murru, F. L. Sciacca, I. Ronsse, S. Jackel, J.

109. D. J. Grainger, K. Heathcote, M. Chiano, H. Snieder, P. R. Kemp, J. C. Metcalfe, N. D.

110. Carter, T. D. Spector. Genetic control of the circulating concentration of transforming growth factor type betal. Hum Mol Genet, 1999,8(1), 93-97.

111. Granieri, Tola. Experience in multiple sclerosis epidemiology in Italy. Multiple Sclerosis in

112. Europe, 1994, Firnhaber, Lauer, Darmstadt. Leuchtturn-Verlag, LTV Press, 195-207.

113. A. J. Green, L. F. Barcellos, J. B. Rimmler, M. E. Garcia, S. Caillier, R. R. Lincoln, P.

114. Bucher, M. A. Pericak-Vance, J. L. Haines, S. L. Hauser, J. R. Oksenberg. Sequence variation in the transforming growth factor-betal (TGFB1) gene and multiple sclerosis susceptibility. J Neuroimmunol, 2001,116(1), 116-124.

115. J. Grove, A. K. Daly, M. F. Bassendine, C. P. Day. Association of a tumor necrosis factorpromoter polymorphism with susceptibility to alcoholic steatohepatitis. Hepatology, 1997,26(1), 143-146.

116. F. R. Guerini, P. Ferrante, L. Losciale, D. Caputo, M. L. Lombardi, G. Pirozzi, V. Luongo,

117. M. A. Sudomoina, Т. V. Andreewski, A. D. Alekseenkov, A. N. Boiko, E. I. Gusev, 0. O. Favorova. Myelin basic protein gene is associated with MS in DR4- and DR5-positive Italians and Russians. Neurology, 2003,61(4), 520-526.

118. H. Hackstein, A. Bitsch, A. Bohnert, H. Hofmann, F. Weber, A. Ohly, C. Linington, M.

119. Maurer, S. Poser, P. Rieckmann, G. Bein. Analysis of interleukin-4 receptor alpha chain variants in multiple sclerosis. J Neuroimmunol, 2001,113(2), 240-248.

120. D. G. Haegert, F. V. Swift, J. Benedikz. Evidence for a complex role of HLA class IIgenotypes in susceptibility to multiple sclerosis in Iceland. Neurology, 1996,46(4), 11071111.

121. J. L. Haines, Y. Bradford, M. E. Garcia, A. D. Reed, E. Neumeister, M. A. Pericak-Vance, J.

122. B. Rimmler, M. M. Menold, E. R. Martin, J. R. Oksenberg, L. F. Barcellos, R. Lincoln, S. L. Hauser. Multiple susceptibility loci for multiple sclerosis. Hum Mol Genet, 2002, 11(19), 2251-2256.

123. J. L. Haines, M. Ter-Minassian, A. Bazyk, J. F. Gusella, D. J. Kim, H. Terwedow, M. A.

124. J. L. Haines, H. A. Terwedow, K. Burgess, M. A. Pericak-Vance, J. B. Rimmler, E. R.

125. Martin, J. R. Oksenberg, R. Lincoln, D. Y. Zhang, D. R. Banatao, N. Gatto, D. E.

126. Goodkin, S. L. Hauser. Linkage of the MHC to familial multiple sclerosis suggests genetic heterogeneity. The Multiple Sclerosis Genetics Group. Hum Mol Genet, 1998, 7(8), 1229-1234.

127. H. F. Harbo, E. G. Celius, F. Vartdal, A. Spurkland. CTLA4 promoter and exon 1dimorphisms in multiple sclerosis. Tissue Antigens, 1999,53(1), 106-110.

128. S. L. Hauser, E. Fleischnick, H. L. Weiner, D. Marcus, Z. Awdeh, E. J. Yunis, C. A. Alper.

129. Extended major histocompatibility complex haplotypes in patients with multiple sclerosis. Neurology, 1989,39(2 Pt 1), 275-277.

130. В. He, V. Navikas, J. Lundahl, M. Soderstrom, J. Hillert. Tumor necrosis factor alpha-308alleles in multiple sclerosis and optic neuritis. J Neuroimmunol, 1995,63(2), 143-147.

131. В. He, C. Xu, B. Yang, A. M. Landtblom, S. Fredrikson, J. Hillert. Linkage and associationanalysis of genes encoding cytokines and myelin proteins in multiple sclerosis. J Neuroimmunol, 1998,86(1), 13-19.

132. В. M. Herrera, G. C. Ebers. Progress in deciphering the genetics of multiple sclerosis. Сип

133. Орт Neurol, 2003, 16(3), 253-258.

134. J. Hillert. Human leukocyte antigen studies in multiple sclerosis. Ann Neurol, 1994, 361. Suppl, SI 5-17.98. http://cmpg.unibe.ch/software/arlequin399. http://www.broad.mit.edu/mpg/haploview/100. http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm

135. S. N. Ibsen, J. Clausen. A repetitive DNA sequence 5' to the human myelin basic proteingene may be linked to MS in Danes. Acta Neurol Scand, 1996,93(4), 236-240.

136. H. I to, K. Yamasaki, Y. Kawano, I. Horiuchi, C. Yun, Y. Nishimura, J. Kira. HLA-DPassociated susceptibility to the optico-spinal form of multiple sclerosis in the Japanese. Tissue Antigens, 1998,52(2), 179-182.

137. Q. Jin, K. Hemminki, E. Grzybowska, R. Klaes, M. Soderberg, H. Zientek, J. Rogozinska

138. Szczepka, B. Utracka-Hutka, J. Pamula, W. Pekala, A. Forsti. Polymorphisms and haplotype structures in genes for transforming growth factor betal and its receptors in familial and unselected breast cancers. Int J Cancer, 2004,112(1), 94-99.

139. D. Kabelitz, D. Wesch. Features and functions of gamma delta T lymphocytes: focus onchemokines and their receptors. Crit Rev Immunol, 2003,23(5-6), 339-370.

140. B. Kalman, F. D. Lublin. The genetics of multiple sclerosis. A review. Biomed

141. Pharmacother, 1999,53(8), 358-370.

142. О. H. Kantarci, D. D. Hebrink, S. J. Achenbach, E. J. Atkinson, M. de Andrade, С. T.

143. McMurray, B. G. Weinshenker. CD95 polymorphisms are associated with susceptibility to MS in women. A population-based study of CD95 and CD95L in MS. J Neuroimmunol, 2004,146(1-2), 162-170.

144. О. Н. Kantarci, J. L. Schaefer-Klein, D. D. Hebrink, S. J. Achenbach, E. J. Atkinson, С. T.

145. McMurray, B. G. Weinshenker. A population-based study of IL4 polymorphisms in multiple sclerosis. J Neuroimmunol, 2003,137(1-2), 134-139.

146. R. Kantor, M. Bakhanashvili, A. Achiron. A mutated CCR5 gene may have favorableprognostic implications in MS. Neurology, 2003,61(2), 238-240.

147. H. F. Kellar-Wood, N. W. Wood, P. Holmans, D. Clayton, N. Robertson, D. A. Compston.

148. Multiple sclerosis and the HLA-D region: linkage and association studies. J Neuroimmunol, 1995,58(2), 183-190.

149. M. A. Kelly, Y. Zhang, M. A. Penny, К. H. Jacobs, D. A. Cavan, С. H. Mijovic, K. Y.

150. Chou, A. H. Barnett, D. A. Francis. Genetic susceptibility to multiple sclerosis in a Shanghai Chinese population. The role of the HLA class II genes. Hum Immunol, 1995, 42(3), 203-208.

151. D. M. Kingsley. The TGF-beta superfamily: new members, new receptors, and new genetictests of function in different organisms. Genes Dev, 1994,8(2), 133-146.

152. C. W. Kirk, A. G. Droogan, S. A. Hawkins, S. A. McMillan, N. C. Nevin, C. A. Graham.

153. Tumour necrosis factor microsatellites show association with multiple sclerosis. J Neurol Sci, 1997,147(1), 21-25.

154. M. J. Kotze, J. N. de Villiers, R. N. Rooney, J. J. Grobbelaar, E. P. Mansvelt, C. S.

155. Bouwens, J. Carr, I. Stander, L. du Plessis. Analysis of the NRAMP1 gene implicated in iron transport: association with multiple sclerosis and age effects. Blood Cells Mol Dis, 2001,27(1), 44-53.

156. S. Kuokkanen, M. Gschwend, J. D. Rioux, M. J. Daly, J. D. Terwilliger, P. J. Tienari, J.

157. Wikstrom, J. Palo, L. D. Stein, T. J. Hudson, E. S. Lander, L. Peltonen. Genomewide scan of multiple sclerosis in Finnish multiplex families. Am J Hum Genet, 1997, 61(6), 1379-1387.

158. J. F. Kurtzke. Epidemiology of multiple sclerosis. Does this really point toward an etiology?1.ctio Doctoralis. Neurol Sci, 2000,21(6), 383-403.

159. J. M. Kwon, A. M. Goate. The candidate gene approach. Alcohol Res Health, 2000, 24(3),164.168.

160. M. Laaksonen, A. Jonasdottir, R. Fossdal, J. Ruutiainen, S. Sawcer, A. Compston, K.

161. Benediktsson, T. Thorlacius, J. Gulcher, J. Ilonen. A whole genome association study in Finnish multiple sclerosis patients with 3669 markers. J Neuroimmunol, 2003, 143(1-2), 70-73.

162. C. Lee, Q. H. Liu, B. Tomkowicz, Y. Yi, B. D. Freedman, R. G. Collman. Macrophageactivation through CCR5- and CXCR4-mediated gpl20-elicited signaling pathways. J Leukoc Biol, 2003,74(5), 676-682.

163. J. J. Letterio, A. B. Roberts. Regulation of immune responses by TGF-beta. Annu Rev1.munol, 1998,16,137-161.

164. A. Ligers, C. Xu, S. Saarinen, J. Hillert, O. Olerup. The CTLA-4 gene is associated withmultiple sclerosis. J Neuroimmunol, 1999,97(1-2), 182-190.

165. M. Liguori, R. Cittadella, I. Manna, P. Valentino, A. La Russa, P. Serra, M. Trojano, D.

166. Messina, F. Ruscica, V. Andreoli, N. Romeo, P. Livrea, A. Quattrone. Association between Synapsin III gene promoter polymorphisms and multiple sclerosis. J Neurol, 2004,251(2), 165-170.

167. P. Y. Liu, Y. Y. Zhang, Y. Lu, J. R. Long, H. Shen, L. J. Zhao, F. H. Xu, P. Xiao, D. H.

168. Xiong, Y. J. Liu, R. R. Recker, H. W. Deng. A survey of haplotype variants at several disease candidate genes: the importance of rare variants for complex diseases. J Med Genet, 2005,42(3), 221-227.

169. L. Lovrecic, S. Ristic, N. Starcevic-Cizmarevic, S. S. Jazbec, J. Sepcic, M. Kapovic, B.

170. Peterlin. Angiotensin-converting enzyme I/D gene polymorphism and risk of multiple sclerosis. Acta Neurol Scand, 2006,114(6), 374-377.

171. M. Luomala, I. Elovaara, M. Ukkonen, T. Koivula, T. Lehtimaki. Plasminogen activatorinhibitor 1 gene and risk of MS in women. Neurology, 2000,54(9), 1862-1864.

172. M. Luomala, T. Lehtimaki, H. Huhtala, M. Ukkonen, T. Koivula, M. Hurme, I. Elovaara.

173. Promoter polymorphism of IL-10 and severity of multiple sclerosis. Acta Neurol Scand, 2003,108(6), 396-400.

174. G. Malferrari, A. Stella, E. Monferini, G. Saltini, M. C. Proverbio, L. M. Grimaldi, L.

175. Rossi-Bernardi, I. Biunno. Ctla4 and multiple sclerosis in the Italian population. Exp Mol Pathol, 2005,78(1), 55-57.

176. C. L. Mann, M. B. Davies, V. L. Stevenson, S. M. Leary, M. D. Boggild, С. Ко Ко, P. W.

177. Jones, A. A. Fryer, R. C. Strange, A. J. Thompson, C. P. Hawkins. Interleukin 1 genotypes in multiple sclerosis and relationship to disease severity. J Neuroimmunol, 2002,129(1-2), 197-204.

178. M. B. Mann, S. Wu, M. Rostamkhani, W. Tourtellotte, J. P. MacMurray, D. E. Comings.

179. Association between the phenylethanolamine N-methyltransferase gene and multiple sclerosis. J Neuroimmunol, 2002,124(1-2), 101-105.

180. M. G. Marrosu, M. R. Murru, G. Costa, F. Cucca, S. Sotgiu, G. Rosati, F. Muntoni.

181. Multiple sclerosis in Sardinia is associated and in linkage disequilibrium with HLA-DR3 and -DR4 alleles. Am J Hum Genet, 1997,61(2), 454-457.

182. M. G. Marrosu, M. R. Murru, G. Costa, R. Murru, F. Muntoni, F. Cucca. DRB1-DQA1

183. DQB1 loci and multiple sclerosis predisposition in the Sardinian population. Hum Mol Genet, 1998,7(8), 1235-1237.

184. M. G. Marrosu, С. Sardu, E. Cocco, G. Costa, M. R. Murru, C. Mancosu, R. Murru, M. Lai,

185. P. Contu. Bias in parental transmission of the HLA-DR3 allele in Sardinian multiple sclerosis. Neurology, 2004,63(6), 1084-1086.

186. A. Martinez Doncel, A. Rubio, R. Arroyo, V. de las Heras, C. Martin, M. Fernandez

187. Arquero, E. G. de la Concha. Interleukin-10 polymorphisms in Spanish multiple sclerosis patients. J Neuroimmunol, 2002,131(1-2), 168-172.

188. B. Martins Silva, T. Thorlacius, K. Benediktsson, C. Pereira, R. Fossdal, H. H. Jonsson, A.

189. Silva, I. Leite, J. Cerqueira, P. P. Costa, M. Marta, T. Foltynie, S. Sawcer, A. Compston, A. Jonasdottir. A whole genome association study in multiple sclerosis patients from north Portugal. J Neuroimmunol, 2003,143(1-2), 116-119.

190. F. Matesanz, M. Fedetz, M. Collado-Romero, O. Fernandez, M. Guerrero, C. Delgado, A.

191. Alcina. Allelic expression and interleukin-2 polymorphisms in multiple sclerosis. J Neuroimmunol, 2001,119(1), 101-105.

192. M. Maurer, S. Loserth, A. Kolb-Maurer, A. Ponath, S. Wiese, N. Kruse, P. Rieckmann. Apolymorphism in the human cytotoxic T-lymphocyte antigen 4 ( CTLA4) gene (exon 1 +49) alters T-cell activation. Immunogenetics, 2002,54(1), 1-8.

193. M. Maurer, A. Ponath, N. Kruse, P. Rieckmann. CTLA4 exon 1 dimorphism is associatedwith primary progressive multiple sclerosis. J Neuroimmunol, 2002,131(1-2), 213-215.

194. A. J. McAdam, A. N. Schweitzer, A. H. Sharpe. The role of B7 co-stimulation in activationand differentiation of CD4+ and CD8+ T cells. Immunol Rev, 1998,165,231-247.

195. N. L. McCartney-Francis, M. Frazier-Jessen, S. M. Wahl. TGF-beta: a balancing act. Int

196. Rev Immunol, 1998, 16(5-6), 553-580.

197. W. I. McDonald, M. A. Ron. Multiple sclerosis: the disease and its manifestations. Philos

198. Trans R Soc Lond В Biol Sci, 1999,354(1390), 1615-1622.

199. H. F. McFarland, S. Dhib-Jalbut. Multiple sclerosis: possible immunological mechanisms.

200. Clin Immunol Immunopathol, 1989,50(1 Pt 2), S96-105.

201. P. Menten, A. Wuyts, J. Van Damme. Macrophage inflammatory protein-1. Cytokine

202. Growth Factor Rev, 2002,13(6), 455-481.

203. D. B. Mirel, L. F. Barcellos, J. Wang, S. L. Hauser, J. R. Oksenberg, H. A. Erlich. Analysisof IL4R haplotypes in predisposition to multiple sclerosis. Genes Immun, 2004, 5(2), 138-141.

204. R. Miyagishi, M. Niino, T. Fukazawa, I. Yabe, S. Kikuchi, K. Tashiro. C-C chemokinereceptor 2 gene polymorphism in Japanese patients with multiple sclerosis. J Neuroimmunol, 2003, 145(1-2), 135-138.

205. S. Nejentsev, M. Laaksonen, P. J. Tienari, O. Fernandez, H. Cordell, J. Ruutiainen, J.

206. Wikstrom, T. Pastinen, S. Kuokkanen, J. Hillert, J. Ilonen. Intercellular adhesionmolecule-1 K469E polymorphism: study of association with multiple sclerosis. Hum Immunol, 2003,64(3), 345-349.

207. I. Nelissen, B. Dubois, A. Goris, I. Ronsse, H. Carton, G. Opdenakker. Gelatinase B,

208. PECAM-1 and MCP-3 gene polymorphisms in Belgian multiple sclerosis. J Neurol Sci, 2002,200(1-2), 43-48.

209. M. Niino, S. Kikuchi, T. Fukazawa, I. Yabe, K. Tashiro. Estrogen receptor genepolymorphism in Japanese patients with multiple sclerosis. J Neurol Sci, 2000, 179(S 12), 70-75.

210. M. Niino, S. Kikuchi, T. Fukazawa, I. Yabe, K. Tashiro. Genetic polymorphisms ofosteopontin in association with multiple sclerosis in Japanese patients. J Neuroimmunol, 2003,136(1-2), 125-129.

211. Т. Ono, M. R. Zambenedetti, K. Yamasaki, Y. Kawano, N. Kamikawaji, H. Ito, M. Sakurai,

212. Y. Nishimura, J. Kira, I. Kanazawa, T. Sasazuki. Molecular analysis of HLA class I (HLA-A and -B) and HLA class II (HLA-DRB1) genes in Japanese patients with multiple sclerosis (Western type and Asian type). Tissue Antigens, 1998,52(6), 539-542.

213. B. A. Parmenter, D. R. Denney, S. G. Lynch, L. S. Middleton, L. M. Harlan. Cognitiveimpairment in patients with multiple sclerosis: association with the APOE gene and promoter polymorphisms. Mult Scler, 2007,13(1), 25-32.

214. P. Perini, C. Tagliaferri, M. Belloni, G. Biasi, P. Gallo. The HLA-DR13 haplotype isassociated with "benign" multiple sclerosis in northeast Italy. Neurology, 2001, 57(1), 158-159.

215. H. Pihlaja, Т. Rantamaki, J. Wikstrom, M. L. Sumelahti, M. Laaksonen, J. Ilonen, J.

216. A. V. Polonikov, V. P. Ivanov, D. A. Belugin, I. V. Khoroshaya, I. 0. Kolchanova, M. A.

217. Solodilova, M. P. Tutochkina, A. A. Stepchenko. Analysis of common transforming growth factor beta-1 gene polymorphisms in gastric and duodenal ulcer disease: Pilot study. J Gastroenterol Hepatol, 2007,22(4), 555-564.

218. С. M. Poser, V. V. Brinar. Diagnostic criteria for multiple sclerosis. Clin Neurol Neurosurg,2001,103(1), 1-11.

219. G. J. Prud'homme, C. A. Piccirillo. The inhibitory effects of transforming growth factorbeta-1 (TGF-betal) in autoimmune diseases. J Autoimmun, 2000,14(1), 23-42.

220. K. Pulkkinen, M. Luomala, H. Kuusisto, T. Lehtimaki, M. Saarela, Т. O. Jalonen, I.

221. Elovaara. Increase in CCR5 Delta32/Delta32 genotype in multiple sclerosis. Acta Neurol Scand, 2004,109(5), 342-347.

222. C. Rajda, K. Bencsik, E. Seres, A. Jonasdottir, T. Foltynie, S. Sawcer, K. Benediktsson, R.

223. Fossdal, E. Setakis, A. Compston, L. Vecsei. A genome-wide screen for association in Hungarian multiple sclerosis. J Neuroimmunol, 2003,143(1-2), 84-87.

224. С. J. Raport, J. Gosling, V. L. Schweickart, P. W. Gray, I. F. Charo. Molecular cloning and functional characterization of a novel human CC chemokine receptor (CCR5) for RANTES, MlP-lbeta, and MlP-lalpha. J Biol Chem, 1996,271(29), 17161-17166.

225. H. B. Rasmussen, M. A. Kelly, D. A. Francis, J. Clausen. CTLA4 in multiple sclerosis.1.ck of genetic association in a European Caucasian population but evidence of interaction with HLA-DR2 among Shanghai Chinese. J Neurol Sci, 2001, 184(2), 143147.

226. R. G. Richards, F. C. Sampson, S. M. Beard, P. Tappenden. A review of the natural historyand epidemiology of multiple sclerosis: implications for resource allocation and health economic models. Health Technol Assess, 2002,6(10), 1-73.

227. C. J. Ring, K. W. Cho. Specificity in transforming growth factor-beta signaling pathways.

228. Am J Hum Genet, 1999,64(3), 691-697.

229. H. Z. Ring, D. L. Kroetz. Candidate gene approach for pharmacogenetic studies.

230. Pharmacogenomics, 2002,3(1), 47-56.

231. S. Ristic, L. Lovrecic, N. Starcevic-Cizmarevic, B. Brajenovic-Milic, S. S. Jazbec, V.

232. Barac-Latas, D. Vejnovic, J. Sepcic, M. Kapovic, B. Peterlin. No association of CCR5delta32 gene mutation with multiple sclerosis in Croatian and Slovenian patients. Mult Scler, 2006,12(3), 360-362.

233. N. P. Robertson, M. Fraser, J. Deans, D. Clayton, N. Walker, D. A. Compston. Ageadjusted recurrence risks for relatives of patients with multiple sclerosis. Brain, 1996,119 (Pt 2), 449-455.

234. М. P. Roth, L. Nogueira, H. Coppin, M. Clanet, J. Clayton, A. Cambon-Thomsen. Tumornecrosis factor polymorphism in multiple sclerosis: no additional association independent of HLA. J Neuroimmunol, 1994,51(1), 93-99.

235. A. D. Sadovnick, A. Dircks, G. C. Ebers. Genetic counselling in multiple sclerosis: risks tosibs and children of affected individuals. Clin Genet, 1999,56(2), 118-122.

236. A. D. Sadovnick, G. C. Ebers, D. A. Dyment, N. J. Risch. Evidence for genetic basis ofmultiple sclerosis. The Canadian Collaborative Study Group. Lancet, 1996, 347(9017), 1728-1730.

237. M. Samson, 0. Labbe, C. Mollereau, G. Vassart, M. Parmentier. Molecular cloning andfunctional expression of a new human CC-chemokine receptor gene. Biochemistry, 1996, 35(11), 3362-3367.

238. M. Sandberg-Wollheim, E. Ciusani, A. Salmaggi, F. Pociot. An evaluation of tumornecrosis factor microsatellite alleles in genetic susceptibility to multiple sclerosis. Mult Scler, 1995,1(3), 181-185.

239. A. J. Sandford, P. D. Pare. Direct PCR of small genomic DNA fragments from serum.

240. Biotechniques, 1997, 23(5), 890-892.

241. G. Saruhan-Direskeneli, S. Esin, B. Baykan-Kurt, I. Ornek, R. Vaughan, M. Eraksoy. HLA

242. DR and -DQ associations with multiple sclerosis in Turkey. Hum Immunol, 1997, 55(1), 59-65.

243. S. Sawcer, H. B. Jones, R. Feakes, J. Gray, N. Smaldon, J. Chataway, N. Robertson, D.

244. Clayton, P. N. Goodfellow, A. Compston. A genome screen in multiple sclerosis reveals susceptibility loci on chromosome 6p21 and 17q22. Nat Genet, 1996,13(4), 464-468.

245. H. Schmidt, D. Williamson, A. Ashley-Koch. HLA-DR15 Haplotype and Multiple

246. Sclerosis: A HuGE Review. Am J Epidemiol, 2007.

247. S. Schmidt, L. F. Barcellos, K. DeSombre, J. B. Rimmler, R. R. Lincoln, P. Bucher, A. M.

248. S. Schmidt, M. A. Pericak-Vance, S. Sawcer, L. F. Barcellos, J. Hart, J. Sims, A. M.

249. Н. М. Schrijver, J. В. Crusius, М. A. Garcia-Gonzalez, С. Н. Polman, A. S. Репа, F.

250. Barkhof, В. М. Uitdehaag. Gender-related association between the TGFB1+869 polymorphism and multiple sclerosis. J Interferon Cytokine Res, 2004,24(9), 536-542.

251. R. Schwinzer, T. Witte, J. Hundrieser, S. Ehlers, T. Momot, N. Hunzelmann, T. Krieg, R. E.

252. Schmidt, K. Wonigeit. Enhanced frequency of a PTPRC (CD45) exon A mutation (77C-->G) in systemic sclerosis. Genes Immun, 2003,4(2), 168-169.

253. F. Sellebjerg, H. O. Madsen, С. V. Jensen, J. Jensen, P. Garred. CCR5 delta32, matrixmetalloproteinase-9 and disease activity in multiple sclerosis. J Neuroimmunol, 2000, 102(1), 98-106.

254. J. A. Silversides, S. V. Heggarty, G. V. McDonnell, S. A. Hawkins, C. A. Graham.1.fluence of CCR5 delta32 polymorphism on multiple sclerosis susceptibility and disease course. Mult Scler, 2004,10(2), 149-152.

255. T. L. Sorensen, M. Tani, J. Jensen, V. Pierce, C. Lucchinetti, V. A. Folcik, S. Qin, J.

256. Rottman, F. Sellebjerg, R. M. Strieter, J. L. Frederiksen, R. M. Ransohoff. Expression of specific chemokines and chemokine receptors in the central nervous system of multiple sclerosis patients. J Clin Invest, 1999,103(6), 807-815.

257. R. S. Spielman, R. E. McGinnis, W. J. Ewens. Transmission test for linkage disequilibrium:the insulin gene region and insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM). Am J Hum Genet, 1993,52(3), 506-516.

258. A. Svejgaard, L. P. Ryder. HLA and disease associations: detecting the strongestassociation. Tissue Antigens, 1994,43(1), 18-27.

259. G. Thomson. Mapping disease genes: family-based association studies. Am J Hum Genet,1995,57(2), 487-498.

260. M. M. Tiemessen, S. Kunzmann, С. B. Schmidt-Weber, J. Garssen, C. A. Bruijnzeel

261. Koomen, E. F. Knol, E. van Hoffen. Transforming growth factor-beta inhibits human antigen-specific CD4+ T cell proliferation without modulating the cytokine response. Int Immunol, 2003,15(12), 1495-1504.

262. P. J. Tienari, S. Kuokkanen, T. Pastinen, J. Wikstrom, A. Sajantila, M. Sandberg-Wollheim,

263. J. Palo, L. Peltonen. Golli-MBP gene in multiple sclerosis susceptibility. J Neuroimmunol, 1998,81(1-2), 158-167.

264. P. J. Tienari, J. Wikstrom, A. Sajantila, J. Palo, L. Peltonen. Genetic susceptibility tomultiple sclerosis linked to myelin basic protein gene. Lancet, 1992,340(8826), 987-991.

265. M. U. Uboldi de Capei, E. Dametto, M. E. Fasano, S. Rendine, E. S. Curtoni. Genotypingfor cytokine polymorphisms: allele frequencies in the Italian population. Eur J Immunogenet, 2003,30(1), 5-10.

266. T. van Veen, N. F. Kalkers, J. B. Crusius, L. van Winsen, F. Barkhof, P. J. Jongen, A. S.

267. Репа, С. H. Polman, В. M. Uitdehaag. The FAS-670 polymorphism influences susceptibility to multiple sclerosis. J Neuroimmunol, 2002,128(1-2), 95-100.

268. K. Vandenbroeck, P. Fiten, I. Ronsse, A. Goris, I. Porru, C. Melis, M. Rolesu, A. Billiau,

269. M. G. Marrosu, G. Opdenakker. High-resolution analysis of IL-6 minisatellite polymorphism in Sardinian multiple sclerosis: effect on course and onset of disease. Genes Immun, 2000,1(7), 460-463.

270. К. Vandenbroeck, G. Martino, M. Marrosu, A. Consiglio, M. Zaffaroni, S. Vaccargiu, D.

271. Franciotta, M. Ruggeri, G. Comi, L. M. Grimaldi. Occurrence and clinical relevance of an interleukin-4 gene polymorphism in patients with multiple sclerosis. J Neuroimmunol, 1997,76(1-2), 189-192.

272. M. Vergelli, M. Kalbus, S. C. Rojo, B. Hemmer, H. Kalbacher, L. Tranquill, H. Beck, H. F.

273. B. G. Weinshenker, D. Hebrink, О. H. Kantarci, J. Schaefer-Klein, E. Atkinson, D. Schaid,

274. С. M. McMurray. Genetic variation in the transforming growth factor betal gene in multiple sclerosis. J Neuroimmunol, 2001,120(1-2), 138-145.

275. L. H. Wise, J. S. Lanchbury, С. M. Lewis. Meta-analysis of genome searches. Ann Hum

276. Genet, 1999,63(Pt 3), 263-272.

277. HLA et Medecine, Twelfth International Histocompatibility Workshop, Technicalhandbook, 1996, Paris.

278. M. D. Zayas, M. Lucas, F. Solano, M. J. Fernandez-Perez, G. Izquierdo. Association of a

279. CA repeat polymorphism upstream of the Fas ligand gene with multiple sclerosis. J Neuroimmunol, 2001,116(2), 238-241.

280. H. Zhang, H. Zhao, K. Merikangas. Strategies to identify genes for complex diseases. Ann1. Med, 1997,29(6), 493-498.

281. H. Zhao, R. Pfeiffer, M. H. Gail. Haplotype analysis in population genetics and associationstudies. Pharmacogenomics, 2003,4(2), 171-178.