Фармакогеномные исследования эффективности лечения рассеянного склероза иммуномодулирующими препаратами

Царёва, Екатерина Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Фармакогеномные исследования эффективности лечения рассеянного склероза иммуномодулирующими препаратами
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Фармакогеномные исследования эффективности лечения рассеянного склероза иммуномодулирующими препаратами"

На правах рукописи

ЦАРЁВА ЕКАТЕРИНА ЮРЬЕВНА

ФАРМАКОГЕНОМНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИМИ ПРЕПАРАТАМИ

03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 2 НОЯ 2012

Москва-2012

005055264

Работа выполнена на кафедре молекулярной биологии и медицинской биотехнологии ГБОУ ВПО "Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И.Пирогова" Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Москва (зав. кафедрой д.б.н. профессор Фаворова Ольга Олеговна).

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент, ГБОУ ВПО "Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И.Пирогова" Минздрава РФ, г. Москва

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор, ФГУП Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, г. Москва

доктор биологических наук, профессор, ФГБУН Инсппуг молекулярной генетики РАН, г. Москва

Кулакова Ольга Георгиевна

Носиков Валерий Вячеславович

Сломинский Петр Андреевич

Ведущая организация:

ФГБУ Медико-генетический научный центр РАМН, г. Москва

Защита состоится 4 декабря 2012 г. в 14.00 часов на заседании Диссертационного совета Д.217.013.01 при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП "ГосНИИгенетика". Реферат разослан " ,-/ " ЬьСи^Л 2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук, доцент

Т. Л. Воюшина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Рассеянный склероз (PC) - хроническое демиелинизирукмцее заболевание центральной нервной системы (ЦНС), преимущественно поражающее людей трудоспособного возраста. При этом заболевании у больного развивается комплекс иммуноопосредованных патологических реакций, направленных на разрушение миелиновой оболочки нейронов, что впоследствии приводит к необратимой потере неврологических функций и тяжелой инвалидизации (Stadelmann С. et al, 2011). В мире насчитывается более 2.5 миллионов больных PC, в России около 200 тыс. человек. В ряде регионов России заболеваемость PC довольно высока и находится в пределах 35-70 случаев на 100 тыс. населения. Достаточно высокая распространенность PC в мире, а также отсутствие однозначно эффективного лечения этого заболевания, выводят проблемы изучения PC в ряд важнейших медико-биологических задач.

Лечение PC остается одной из наиболее серьезных проблем практической неврологии, однако, в последнее время появились действенные пути влияния на течение болезни. Это стало возможным благодаря разработке современных подходов, опирающихся на знание иммунопатогенеза этого заболевания. В настоящее время для лечения PC широко применяют препараты, изменяющие течение PC (ПИТРС); все они тем или иным образом влияют на развитие иммунопатологических процессов. К разрешенным к использованию ПИТРС в первую очередь относят иммуномодулирующие препараты глатирамера ацетат (ГА) -синтетический сополимер из остатков аланина, лизина, тирозина и глутаминовой кислоты; интерферон-бета (ИФНб) и финголимод - лиганд для рецепторов сфингозин-1-фосфата, которые являются препаратами первой линии при длительном патогенетическом лечении больных PC (Гусев Е.И. и соавт., 2000; Lalive P. et al, 2011; Pelletier D. et al, 2012). Терапевтический эффект этих препаратов на активность PC при ремиттирующем PC был показан в нескольких мультицентровых рандомизированных клинических испытаниях с использованием двойного слепого метода. Эти препараты снижают частоту и тяжесть обострений, задерживают прогрессирование нетрудоспособности и возникновение новых очагов (по данным магнитно-резонансной томографии головного мозга).

В то же время, лечение PC характеризуется выраженной гетерогенностью ответа на лечение ПИТРС: по данным различных клинических испытаний, от 30 до 50% больных (в зависимости от выбора клинических критериев оценки эффективности лечения) остаются невосприимчивыми к проводимой терапии (Laing R. et al, 2011). При этом вывод о действенности терапии ПИТРС для каждого больного PC можно сделать только после длительного приема препарата. К сожалению, к тому времени, когда будет вынесено решение об отмене препарата, неврологическое состояние больного может ухудшиться.

Результаты проведенных ранее исследований свидетельствует о значительной генетической детерминированности индивидуального ответа на лечение многими препаратами. Поскольку вариабельность ответа больных PC на лечение ПИТРС также может быть связана со сложным влиянием генетических факторов, возникла необходимость фармакогеномных исследований эффективности иммуномодулирующей терапии.

Фармакогенетические исследования эффективности лечения PC препаратами ПИТРС первой линии проводятся сейчас во многих странах, однако, в основном, они касаются ИФНб. Эффективность применения ГА при лечении PC анализировали лишь в нескольких исследованиях, в первую очередь направленных на поиск ассоциации эффективности лечения с полиморфизмом генов главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) класса И; в единичных работах анализировали также значение полиморфизма генов, кодирующих Т-клеточный рецептор, некоторые цитокины и белки миелина (Fusco С. et al, 2001; Алифирова В.М. и соавт., 2006; Grossman I. et al., 2007; Gross et al., 2011).

В России ГА, зарегистрированный для применения в 1997 году, активно используется в качестве ПИТРС первой линии. Генетические варианты, влияющие на эффектность действия этого лекарственного препарата, могут быть биологическими маркерами, определяющими выбор лекарственной терапии для конкретного больного еще до начала лечения, что является основой персонализированной медицины.

В последние годы стало ясно, что анализ независимого вклада аллелей/генотипов одиночных генов-кандидатов, каждый из которых может оказывать малый и трудно выявляемый эффект на общую эффективность лечения заболевания тем или иным препаратом, может оказаться недостаточно информативным. Благодаря развитию биоинформатики в последние годы перспективным направлением развития фармакогенетических исследований стало выявление совместного вклада генов, подразумевающее анализ ассоциации совместного носительства сочетаний аллелей/генотипов нескольких генов с эффективностью проводимой терапии.

Цель п задачи работы. Целью настоящей работы является анализ совместного вклада ряда генов иммунного ответа в эффективность лечения иммуномодулирующим

препаратом глатирамера ацетатом (ГА) больных PC, русских по этнической принадлежности.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие конкретные задачи:

1. Провести геномное типирование полиморфных участков ряда генов иммунного ответа, белковые продукты которых вовлечены в механизм действия ГА, а именно генов про- и антивовоспалительных цитокинов (IFNG: rs2430561; TNF: rsl800629; IFNBI: rs 1051922; TGFB1: rsl800469), рецепторов цитокинов и хемокинов (IFNAR1: rsl012335; IL7RA: rs6897932; CCR5: rs333), антигена 4 цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLA4: rs231775), а также гена ГКГ класса II (HLA-DRB1) для больных PC русских по этнической принадлежности.

2. Провести сравнительный анализ как индивидуального, так и совместного вклада полиморфизма генов-кандидатов у больных PC с оптимальным ответом на лечение ГА и больных без оптимального ответа на лечение ГА (всех остальных больных PC).

3. Провести сравнительный анализ как индивидуального, так и совместного вклада полиморфизма генов-кандидатов у больных PC с оптимальным ответом на лечение и больных, характеризующихся полным отсутствием ответа на лечение ГА (сравнение "крайних" групп).

4. Проанализировать возможные механизмы взаимодействия между аллелями в составе сочетаний при их выявленном совместном вкладе в эффективность лечения больных PC препаратом ГА.

Научная новизна работы. Впервые выполнен фармакогенетический анализ эффективности лечения PC одним из препаратов первой линии - глатирамера ацетатом - для русских по этнической принадлежности больных PC. Впервые проведено целостное систематическое исследование совместного вклада функционально значимых полиморфных участков ряда генов (а именно, девяти генов иммунного ответа) в формирование ответа на лечение препаратом ГА больных PC. Впервые параллельно проведено сравнение генетического статуса больных PC с оптимальным ответом на терапию ПИТРС как с больными PC без оптимального ответа, так с больньми PC с полным отсутствием ответа (сравнение "крайних" групп). Такой анализ, направленный на кросс-валидацию результатов при двух типах сравнения, впервые позволил убедительно показать участие генов CCR5, DRB1, IFNG, TGFB1, IFNAR1 и 1L7RA в формировании ответа полигенной природы на лечение иммуномодулирующим препаратом. Впервые найдены композитные (составные) маркеры, носительство которых ассоциировано с различной эффективностью ответа больных PC на лечение ГА - биаллельное сочетание (DRBI*4+iL7RA *Т), позитивно ассоциированное

с оптимальным ответом на лечение ГА, и сочетание из четырех аллелей (CCR5*á+DRB¡*\5+TGFBI*T+IFNARl*G), негативно ассоциированное с ним. Впервые в рамках фармакогенетического исследования проведен анализ природы кумулятивного эффекта аллелей CCR5*d, DRB1* 15, TGFB1*Т и IFNAR1*G в составе аллельных сочетаний и показано, что имеет место как аддитивный, так и эпистатический (нелинейный) типы взаимодействия между исследуемыми аллелями.

Практическая значимость диссертации. Обнаруженные би- и четырехаллельные сочетания могут служить композитными маркерами при решении вопроса о выборе ГА в качестве препарата первой линии для лечения больных PC. Эти результаты могут быть основой для создания прогностического теста, направленного на выбор одного из альтернативных иммуномодулирующих препаратов первой линии для лечения больных PC еще до назначения патогенетического лечения.

Структура работы. Диссертация состоит из следующих разделов: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты, Обсуждение, Заключение, Выводы, Список литературы; она изложена на 140 страницах, включает 11 рисунков и 30 таблиц. Список литературы содержит 264 источника.

Апробация работы. Материалы работы были представлены на следующих международных научных конференциях: International Moscow Conference on Computational Molecular Biology, 21-24 July 2011 (Moscow, 2011), VII International Pirogov Scientific Medical Conference of Students and Young Scientis (Moscow, 2012), UEPHA*MS Final Network Conference "Multiple Sclerosis and the OMICS Spring" (Spain, 2012) и школе-конференции Summer Training School in Bioinformatics (UK, 2012). Работа была апробирована на заседании кафедры молекулярной биологии и медицинской биотехнологии медико-биологического факультета ГБОУ ВПО "Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И.Пирогова" Минздрава РФ 14 сентября 2011 года и на заседании секции молекулярной биологии Ученого Совета ФГУП "ГосНИИгенетика" 9 октября 2012 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 4 статьи и 6 материалов конференций.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования. Для проведения ретроспективного фармакогенетического исследования методом случай-контроль использовали образцы геномной ДНК 285 неродственных больных PC русской этнической принадлежности, принимавших в качестве иммуномодулирующего препарата глатирамера ацетат (Копаксон®). Все больные PC проходили лечение в Московском городском центре рассеянного склероза (МГЦРС).

Диагноз PC был поставлен согласно критериям Макдонапьда. Соотношение по полу (мужчины:женщины) составило 1:2.4, средний возраст дебюта PC составил 27.0±8.8 лет, средний возраст на момент начала лечения ГА 34.2±9.9 года.

Экспертную оценку эффективности лечения больных PC препаратом ГА осуществляли неврологи МГЦРС. Лечение считали клинически оптимальным, если у больных PC в течение не менее двух лет приема ГА не наблюдали обострений и нарастания неврологического дефицита по шкале EDSS (Expanded Disability Status Scale - расширенная шкала оценки степени инвалидизации). Из 285 больных, получавших ГА, в группу с клинически оптимальным ответом вошли 130 человек (группа "Responders", R). В группу больных без оптимального ответа на лечение ГА вошли все остальные больные (группа "Non-responders", NR, 155 чел.). В составе этой группы были как больные, характеризующиеся полным отсутствием ответа на лечение ГА (группа "Definite non-responders", DNR, 84 чел.), так и больные с промежуточным ответом на лечение ГА (71 человек), течение болезни которых немного улучшалось, однако, наблюдались неблагоприятные клинические события. Все индивиды давали информированное согласие на использование их ДНК для исследования. Проведение исследования было одобрено на заседании этического комитета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова.

В контрольную группу для определения частот аллелей и генотипов полиморфных участков исследуемых генов-кандидатов вошли 125 здоровых добровольцев русской этнической группы (средний возраст 50.0±19.3 лет).

Выделение геномной ДИК из периферической крови. Для получения ДНК необходимой чистоты и достаточной молекулярной массы применяли метод выделения ДНК из венозной крови с использованием экстракции смесью фенол-хлороформ.

Полиморфные участки генов, анализ которых проводили в работе. В работе анализировали группы аллелей гена HLA-DRB1 ГКГ класса И, соответствующие серологическим специфичностям DR1 - DR18, делеционный полиморфизм w—»del32 гена CCR5 (w—>d, rs333) и следующие биаллельные полиморфизмы: -308G>A в промоторной области гена TNF (rsl800629); -509С>Т в промоторной области гена TGFB1 (rsl800469); 49A>G в экзоне 1 гена CTLA4 (rs231775); 874Т>А в интроне 1 гена IFNG (rs2430561); 153Т>С в кодирующей области гена IFNB1 (синонимическая замена Tyr51Tyr, rsl051922), 16725G>C в интроне 3 гена IFNAR1 (rsl012335); ОТ в экзоне 6 гена IL7RA (Thr244Ile, rs6897932).

Геномное типирование. Геномное типирование полиморфного участка в гене CCR5 проводили методом анализа полиморфизма длин продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР). Полиморфные участки генов HLA-DRBI, TNF; IFNG, TGFB1, IFNB1; IFNAR1 и IL7RA

анализировали методом ПЦР с аллелеспецифияескими праймерами. Геномное типирование полиморфного участка в гене CTLA4 проводили методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов продукта ПЦР. Во всех случаях ПЦР проводили в амплификаторе MCI6 (АО "ДНК Технология"). Продукты ПЦР и рестрикции анализировали методом электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле различной плотности в присутствии бромида этидия.

Статистический анализ. Для оценки значимости различий по количественным клиническим признакам при сравнении групп R vs NR и R vs DNR применяли непараметрический критерий Манна-Уитни.

В исследуемых группах больных PC определяли частоты аллелей и частоты носительства аллелей и генотипов анализируемых генов. Отклонение наблюдаемых частот генотипов от равновесия Харди-Вайнберга проверяли по критерию у}. Анализ ассоциации индивидуальных аллелей/генотипов исследуемых генов-кандидатов с эффективностью лечения больных PC препаратом ГА оценивали с помощью двухстороннего точного критерия Фишера с помощью программы GraphPad InStat. При анализе совместного вклада полиморфизма исследуемых генов для выявления ассоциаций носительства аллелей/генотипов и их сочетаний применяли алгоритм APSampler (Favorov A.V. et al., 2005).

Уровень значимости найденных сочетаний проверяли входящими в APSampler программными средствами для валидации на основании точного критерия Фишера (р) и оценки отношения шансов (ОШ) и его 95%-ого доверительного интервала (ДИ). Значимыми считали различия сравниваемых частот при значении р < 0.05, при условии, что значения 95% ДИ для ОШ не пересекают 1. Для валидации результатов также проводили пермутационый анализ (Ррст,, 100 пермутаций), также входящий в программное обеспечение APSampler.

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Анализ индивидуального вклада аллелей/генотипов генов-кандидатов в эффективность лечения ГА

Клинические и демографические данные для больных PC, стратифицированных по эффективности лечения ГА как R, NR и DNR (см. выше), представлены в таблице 1. При ретроспективном анализе выявлено, что до лечения группы больных PC не отличались по клинико-демографическим признакам. Однако на момент оценки эффективности лечения ГА у больных из групп как NR, так и DNR наблюдали значимо более тяжелое течение PC (исходя из тяжести течения по шкале EDSS) по сравнению с больными, попавшими в группу R (р<0.0001).

Таблица 1. Демографические и клинические характеристики групп больных РС, стратифицированных по эффективности лечения ГА.___

Демографические и клинические данные R,п=130 NR, п=155 DNR, п=84

Соотношение по полу (мужчины:женщины) 1:2.0 1:3.0 1:3.0

Средний возраст дебюта+БО (годы) 26.9±8.9 27,2±8,8 27.2±8.5

Средний возраст на момент начала лечения±80 (годы) ЗЗ.ЬНО.О 35.3±10.1 35.5±10.2

Формы PC (РРС:ВПРС) На момент начала лечения 130/0 84/0 84/0

На момент оценки эффективности лечения 130/0 70/14 70/14

Среднее значение по шкале EDSS (SD) [диапазон] На момент начала лечения 1.9(0.6) [1.0-4.0] 2.1(0.8) [1.0-4.5] 2.1(0.8) [1.0-4.5]

На момент оценки эффективности лечения 1.9 (0.7)*# [1.0-4.5] 3.2(1.2)* [1.5-6.5] 3.2(1.2)# [1.5-6.5]

РРС - ремитирующий PC; ВПРС - вторично-прогрессирующий PC; EDSS (Expanded Disability Status Scale) - расширенная шкала оценки степени инвалидизации; SD (standard deviation) - стандартное отклонение; R - группа больных PC с оптимальным ответом на терапию ГА; NR - группа больных PC без оптимального ответа на лечение ГА; DNR - группа больных PC, характеризующаяся полным отсутствием ответа на лечение ГА. *, # - р<0.0001 при попарном сравнении по Манну-Уитни.

Анализ распределения частот аллелей и генотипов всех исследуемых полиморфных участков в общей группе больных PC, принимавших ГА, а также в группе здоровых индивидов, с помощью критерия х2 показал, что равновесие Харди-Вайнберга соблюдается во всех случаях.

В результате сравнительного анализа частот аллелей, частот носительства аллелей и генотипов полиморфных участков исследованных генов-кандидатов в группах больных PC с различной эффективностью лечения ГА значимые ассоциации наблюдались только при сравнении групп R vj NR для аллелей генов HLA-DRB1 и CCR5 (таблицы 2 и 3).

Таблица 2. Частоты аллелей и частоты носительства аллелей гена ОДВ/ НЬА класса II у больных РС с различной эффективностью лечения препаратом ГА (II га N11).

Аллели Я п=130 N11 п=155 Величина р\ ОШ [95% ДИ]

Аллели, число (%)

ОЯВ1*1 19 (7.3) 24 (7.7) Н.з.

32 (12.3) 21 (6.8) 0.029 1.9 11.1-3.4]

ШВУ* 7 23 (8.8) 37(11.9) Н.з.

йнвт 12 (4.6) 19(6.1) Н.з.

йШ* 11 23 (8.8) 28 (9.0) Н.з.

ДЯВ/*13 43 (16.5) 32 (10.3) 0.034 1.7 [1.1-2.8]

ОШ1* 15 58 (22.3) 88 (28.4) Н.з.

ОКВ1*16 8(3.1) 10 (3.2) Н.з.

34(13.1) 37(11.9) Н.э.

Аллели, число носителей (%)

£>ЛВ/*1 18(13.8) 24(15.5) Н.э.

30(23.1) 21(13.5) 0.044 1.9 [1.0-3.5]

£>ЯВ7* 7 21(16.2) 32(20.6) Н.з.

12(9.2) 19(12.3) Н.з.

21(16.2) 27(17.4) Н.з.

ШВ/*13 37(28.5) 32(20.6) Н.з.

£)ЛВ/*15 54(41.5) 79(51.0) Н.з.

8(6.2) 10(6.5) Н.з.

йЯВ1*П 31(23.8) 34(21.9) Н.з.

Н.з. - не значимо

Из таблицы 2 видно, что частоты аллеля ОКБ 1*4 и аллеля ОНВ1* 13 были значимо выше в группе больных с оптимальным ответом на лечении ГА (р=0.029, 0111=1.9 и р=0.034, 011=1.7, соответственно). При сравнении частот носительства аллелей гена £>/?Я/ показано, что частота носительства аллеля ОШ}1*4 также значимо выше в группе Я (р=0.044, ОШ=1.9), тогда как для ОЯВ1* 13 значимых отличий не наблюдалось. Для остальных аллелей гена \\LA-DRB1 не наблюдали значимых различий между Я и N11.

Частота аллеля СС7?5*\у значимо выше у больных с оптимальным ответом на лечение ГА (р=0.025, ОШ=1.9), а аллеля ССЛ5*<1 - в группе больных РС без оптимального ответа

(р=0.025, 0111=0.53) (таблица 3). При сравнении частот носительства аллелей и генотипов этого полиморфного участка уровень значимости не был достигнут.

Таблица 3. Частоты аллелей, частоты носительства аллелей и частоты генотипов инсерционно-делеционного полиморфизма (№—>с!32) гена СС115 у больных РС с различной

Аллели и генотипы Я п=130 п=155 Величина р ОШ [95% ДИ]

Частота аллелей, число (%)

V/ 239(91.9) 266 (85.8) 0.025 1.9 |1.1-3.31

й 21 (8.5) 44 (14.2) 0.025 0.53 10.3-0.92]

Частота носительства аллелей, число (%) носителей

V/ 130(100.0) 150(96.8) Н.з.

а 21 (16.2) 39 (25.2) Н.з.

Частота генотипов, число (%) носителей

109 (83.8) 116(74.8) Н.з.

ч/М 21 (16.2) 34(21.9) Н.з.

т 0(0) 5 (3.3) Н.з.

Н.з. - не значимо.

2. Анализ совместного вклада аллелей/генотппов генов-кандидатов в эффективность лечения ГА

При сравнении групп Я у.5 N11 выявлена значимая ассоциация с эффективностью лечения ГА носительства ряда сочетаний, содержащих те или иные аллели/генотипы семи из девяти исследованных генов, за исключением генов /ЯУВ/ и СТ1А4 (таблица 4). Выявлены сочетания, состоящие из двух, трех и четырех аллелей, частота носительства которых была значимо выше как в группе Я, так и в группе N[1.

Только для двух из двенадцати выявленных аллельных сочетаний показана значимая ассоциация с оптимальным ответом на ГА. Носительство сочетания (йКВ 1 *4+1Ь7ПЛ*Т) характеризуется наибольшей значимостью среди всех биаллельных сочетаний и выдерживает пермутационный тест (Ррсгш^О.ОЗб, ОШ=3.7), а величинар по Фишеру для него на порядок ниже, чем в случае носительства одиночного аллеля ОЯВ1*4 (см. табл. 2). Еще одно биаллельное сочетание, ассоциированное с оптимальным ответом на лечение ГА, включало аллели /ГШ*Т и ТЫР>А (р=0.035, ОШ=1.9).

Все остальные выявленные аллельные сочетания характеризуются значением ОШ меньше 1 и ассоциированы с отсутствием оптимального ответа на лечение ГА. Все они включают аллель ССА5*(1, за исключением биаллельного сочетания (ОИВ1*\5+7"С/'7?/*Т)

(р=0.015, 0111=0.5). В их состав также входят различные аллели гена ВКВ1 (*11 и 15), аллели гага/*Т, шылт*в, И7НА*С и генотип

Наибольшим уровнем значимости (р=0.0002) характеризуется четырехаллельное сочетание (CCR5*d+DRB 1* l5+TGFBI*^+IFNARI*G'), ассоциированное с отсутствием оптимального ответа при лечении ГА и валидированное пермутационным тестом (Ррсгтп=0.0048, ОШ=0.038). Были также обнаружены два триаллельных и четыре биаллельных сочетания, являющиеся составными частями выявленного четырехаллельного сочетания, частота носительства которых также была значимо выше в группе N11. Из них одно, наиболее значимое триаллельное сочетание (CCR5*d+DRBl*\S+TGFBl*T), также выдерживало пермутационный тест (Ррст1=0.02, ОШ=0.08), хотя уровень значимости ассоциации с неблагоприятным ответом на лечение ГА для него был в 6 раз меньше по сравнению с четырехаплельным сочетанием. Выявлено еще одно, не входящее в состав четырехаллельного сочетания, триаллельное сочетание (CCR5*d+IFNARl*G+IL7RA*C), носительство которого также значимо выше в группе ИИ (р=0.014, 0111=0.5).

Таблица 4. Сочетания аллелей/генотипов генов CCR5, DRB1, IFNG, TGFB1, TNF, IFNARI и IL7RA, носительетво которых ассоциировано с эффективностью лекарственной терапии ГА при сравнении групп больных PC с оптимальным ответом на лечение (R) и больных без оптимального ответа на лечение (NR).

Аллели/генотипы в составе сочетания Число носителей (%)/ число неносителей (%) сочетания Р ОШ (95% ДИ) Ррепп

CCR5 w— DRB1 IFNG 874Т>А TGFB1 -5090Т INF -308G>A IFNARI 16725G>C IL7RA Thr244Ile*

R п=130 NR п=155

Носительетво сочетания из двух аллелей/генотипов

- 4 - - T 19 (15)/110 (85) 7 (4.5)/148 (95.5) 0.0027 3.7 11.5-9.01 0.036

d 11 - - - - - 2 (1.5)/127 (98.5) 14 (9)/141 (91) 0.0049 0.2 f0.04-0.71 0.049

15 Т 24 (18)/106 (82) 47 (30%)/108 (70%) 0.015 0.5 Г0.3-0.91

d G 18(14)7111 (86) 37 (24)/] 18 (76) 0.024 0.5 f0.3-0.96]

d 15 7 (5)/122 (95) 20 (13)/135 (87) 0.025 0.4 f0.2-0.9]

d - - . G/G ■ ■ 14 (11)/114 (89) 31 (20)/124 (80) 0.027 0.5 f0.2-0.97]

d Т 10 (8)/120 (92) 24 (15)/131 (85) 0.032 0.5 f0.2-0.99]

. Т - А - 26 (20V103 (80) 18 (11)/137 (89) 0.035 1.9 Ц.0-3.71

Носительетво сочетания из трех аллелей

d 15 т - - - 1 (0.8)/129 (99.2) 14(9.0)/141 (91.0) 0.0012 0.08 fO.01-0.61 0.02

d - - - - G С 16 (12.5)/112 (87.5) 36 (23)/119 (77) 0.014 0.5 f0.2-0.91

d - - т - G - 8 (6V121 (94) 23 (15)/132 (85) 0.015 0.4 f0.2-0.91

Носительетво сочетания из четырех аллелей

d | 15 | | Т | | G | | 0(0)/130(100) | 14(9)/141 (91) | 0.0002 | 0.038 f0.0022-0.61 1 0.0048

Жирным шрифтом выделены сочетания аллелей, частоты которых ассоциированы с оптимальным ответом на лечение ГА (ОШ больше 1).

♦Соответствует замене С—>Т в экзоне 6 гена 1Ь7КА. р - величинар по одностороннему точному критерию Фишера; Ррегш - величинар после пермутационного теста (100 пермутаций).

Четыре биаллельных сочетания (DRBI * 15+TGFB1 *Т), (CCR5*d+IFNARl*G), (CCR5*d+DRBl*lS) и (CCR5*d+TGFB!*T), являющиеся составными частями четырехаллельной комбинации, характеризуются близкими значениями р в диапозоне от 0.015 до 0.032 и ОШ от 0.4 до 0.5. Еще два выявленных негативных биаллельных сочетания содержат аллель CCR5*d в сочетании с аллелем DRBI* 11 (Ppcmr0.049, 01И=0.2) или генотипом TNF*G/G (р=0.027, 01И=0.5).

Аллели генов CTLA4 и IFNB1 не входят ни в одно сочетание, значимо ассоциированное с эффективностью лечение ГА, что, вероятно, свидетельствует об отсутствии вклада аллелей этих генов в эффективность лечения ГА.

Полученные результаты согласуются с представлением о суммировании независимых вкладов отдельных генов в формирование ответа на лечение. При этом в ряде случаев (это касается генов DRBI, TNF и 1L7RÄ) удается наблюдать разнонаправленное влияние носительства различных аллелей одного гена на эффективность лечения ГА. Аллель CCR5*d входит во все сочетания (кроме одного), носительство которых выше в группе NR (диапазон ОШ от 0.038 до 0.5). Большинство негативных сочетаний содержало также аллели TGFBI*T и/или IFNAR1 *G. В единичные сочетания вошли аллели TNF*G (в составе генотипа G/G) и 1L7RA*C. Носительство аллелей DRBI * 11 и DRBI* 15 ассоциировано с отсутствием оптимального ответа на терапию ГА, a DRBI*4 - с оптимальным ответом.

На следующем этапе работы мы провели аналогичное фармакогенетическое исследование, исключив из рассмотрения группу с промежуточным ответом на лечение ГА и сравнивая "крайние" группы больных -Rh DNR. В таблице 5 представлены результаты анализа совместного вклада аллелей/генотипов исследованных генов, полученные при сравнении "крайних" групп. Выявлены сочетания, состоящие из двух, трех и четырех аллелей, частота носительства которых была значимо выше в группе R или в группе DNR. Полученные результаты свидетельствуют о вкладе в эффективность терапии ГА полиморфизма тех же генов, что и при сравнении R vi NR (см. табл. 4), за исключением гена TNF.

Таблица 5. Сочетания аллелей генов CCR5, DRB1, IFNG, TGFB1, IFNAR1 и IL7RA, носительство которых ассоциировано с эффективностью

терапии ГА при сравнении групп больных РС с оптимальным ответом (Я) и с полным отсутствием ответа (БЫЛ) на лечение ГА.

Аллели в составе сочетания Число носителей (%)/число неносители (%)сочетания Р ОШ (95% ДИ) Ррепп

CCR5 w—»d DRB1 IFNG 874Т>А TGFB1 -5090Т IFNAR1 16725G>C IL7RA Thr244Ile*

R п=130 DNR п=84

Носительство сочетания из двух аллелей

- 15 Т 24 (18)/106 (82) 29 (35)755 (65) 0.0066 0.43 [0.23-0.811 0.049

- - Т - - Т 39 (30)/89 (70) 14 (17)/70 (83) 0.016 2.2 [1.1-4.41

- Т - С - 53 (41)/76 (59) 22 (26)/62 (74) 0.018 2.0 [1.1-3.61

- 4 - - - Т 19 (15)7110(85) 5 (6)779 (94) 0.036 2.7 [1.0-7.61

Носительство сочетания из трех аллелей

d 15 - Т - - 1 (1)/129 (99) 9 (11)/75 (89) 0.0012 0.065 [0.008-0.52] 0.013

d - - Т G - 8 (6)/121 (94) 13(15)771 (85) 0.025 0.4 [0.1-0.9]

Носительство сочетания из четырех аллелей

d | 15 | | Т | G | | 0(0)7130(100) | 9(11)/75(89) | 0.00018 | 0.072 f0.02-0.281 1 0.0056

р-величина р по одностороннему точному критерию Фишера; .Ppcrm" величина р после пермутационного теста (100 пермутаций) ♦Соответствует замене С—>Т в экзоне 6 гена IL7RA.

Для трех из семи выявленных аллельных сочетаний показана ассоциация с оптимальным ответом на ГА, все они являются биаллельными. Однако ни одно из них не выдерживало пермутационного теста. Среди благоприятных сочетаний присутствует сочетание (DRBI*4+IL7RA*T) (р=0.036, 0111=2.7), которое ранее было выявлено при сравнении групп R vs NR, где оно выдерживало пермутационный тест (табл. 4), что связано, вероятно, с большим размером выборки. Два других биаллельных сочетания содержат ранее выявленный "благоприятный" аллель IFNG*Т, в паре с "благоприятным" аллелем 1L7RA*Т (р=0.016, ОШ=2.2) или с аллелем IFNAR1*C (р=0.018, 0ш=2.0), альтернативным к ранее выявленному "неблагоприятному" аллелю IFNAR1*G.

Остальные сочетания ассоциированы с полным отсутствием оптимального ответа на лечение ГА; они включают аллели CCR5*d, DRB1* 15, TGFB1*Т и IFNAR1*Q и были также выявлены ранее при сравнении групп R vi NR (см. табл. 4). Наиболее значимым сочетанием, выдерживающим пермутационный тест, является четырехаллельное сочетания (CCR5*d+DRBl*l5+TGFBl*T+IFNARl*G) (р=0.00018, ррегт=0.0056, 01П=0.072). Остальные би- и триаллельные сочетания являются его составными частями. Из них сочетания СCCR5*d+DRBl*l5+TGFBl*T) и (DRB1*15+TGFBI*T) также выдерживают валидацию пермутационным тестом (р= 0.0012 и 0.066; ррСт,=0.013 и 0.049; 0ш=0.065 и 0.43, соответственно). Таким образом, данные, полученные при сравнении R кг DNR, убедительно подтверждают результаты, полученные при сравнении групп R vi NR.

В целом, сравнение "крайних" групп, использованное для кросс-валидации результатов, полученных при сравнении больных с оптимальным ответом на лечение ГА со всеми остальными больными, позволило подтвердить ассоциацию носительства аллелей генов CCR5, DRB1, IFNG, TGFB1, 1FNAR1 и 117RA (позитивную или негативную) с оптимальным ответом на лечение ГА у русских больных PC. В отношении гена TNF, ассоциацию аллелей которого с эффективностью лечения ГА мы наблюдали только при одном из двух проведенных сравнений (R vs NR, табл. 4), аналогичный вывод носит предварительный характер. Во всех случаях соблюдается закономерность: аллель того или иного полиморфного участка гена, входящего в ассоциированные с успешным лечением сочетания, является альтернативным к аллелю из "неблагоприятных" сочетаний. Это выявлено для генов CCR5, DRB1, IFNAR1 и IL7RA. При обоих типах сравнения не наблюдали участия генов CTLA4 и IFNB1 в формировании ответа на лечение ГА.

3. Анализ природы кумулятивного вклада аллелен СС/?5*с1, £>/?В7*15, 7"GFB/*T н //г/УЛ/?/*С в составе сочетаний в эффективность лечения препаратом ГА больных РС

Полученные результаты свидетельствуют о кумулятивном (совместном) вкладе исследованных генов в составе сочетаний в эффективность терапии ГА больных РС. Наблюдаемый кумулятивный эффект может возникать как в результате суммирования малых независимых вкладов аллелей отдельных генов (аддитивность), так и/или как следствие эпистатических взаимодействий между ними. Мы провели анализ возможных механизмов формирования кумулятивного эффекта аллелей ССН5*й, ИЯВ]* 15, ТСГВ1*Т и в

составе би-, три- и четырехаллельных сочетаний при сравнении групп Я уз БЫК.

Для выявления характера взаимодействия (эпистатического или аддитивного) между указанными аллелями при формировании ответа на ГА мы сравнили, опираясь на значения величин ОШ, шансы больных РС попасть в группу И. или БИЯ в зависимости от носительства сочетания (CCR5*&+DRB1*\5+TGFB1VY+IFNAR1*G') и всех возможных комбинаций входящих в него аллелей.

На рис. 1 представлены величины ОШ больных РС оказаться в группе Я или БЫЯ в зависимости от носительства различных комбинаций аллелей ййВ1* 15, ТйРВ1*Т, ССЕ5 и //•Л'///?/ *0. В случае носительства одиночных аллелей ЮРВ1 *Т, ССК5 *с) и 1РЫАШ*й или биаллельных сочетаний (ТСГВ1*Т+!РШП1*С), (0НВ1*15+!ГМАП1*0),

(ССН5*А+1РЫАК1*С) и {ТСРВ1*Т+ССН5*й) не обнаружено значимых различий в шансе больных оказаться в группе Я или ОЫЯ, поскольку 95% ДИ величины ОШ пересекает 1. У носителей ШВ/*15, биаллельных комбинаций (0/?В/*15+ГО^Д/*Т) и (ОКВ1*15+ССН5*Л) или триаллельных комбинаций (ОЛВ/ * 15 + ГО/^В/ *Т+1РМАШ Ю),

(Т0РВ1*Т+ССК5*й+1РШЯ1*0) и (0ВВ!*15+ССН5*й+1РЫАВ1*0) величины ОШ находились в диапазоне от 0.59 до 0.27, т.е. носители имели в 1.7-3.7 раз больший шанс оказаться в группе больных с полным отсутствием ответа на лечение ГА, по сравнению с неносителями указанных сочетаний. У носителей наиболее значимых комбинаций из четырех и трех аллелей (ШВ/* 15+ ТСГВ! *Т+ССЯ5*<1+ГГЫАН1 *С) и (ШВ/*15+ГОЯ"В/*Т+ССЛ5*с1) шанс оказаться в группе с полным отсутствием ответа на лечение ГА был повышен 14-15 раз (величины ОШ составляли 0.072 и 0.065, соответственно) по сравнению с не-носителями указанных сочетаний.

Рис 1. Величины отношений шансов (ОШ) и значения 95% доверительного интервала (ДИ) для больных РС оказаться в группе с оптимальным ответом (Я) или в группе с полным отсутствием ответа (ОЫИ) на лечение ГА в зависимости от носительства различных комбинаций аллелей £>ДВ/* 15, ТСРВ1*Т, СС&5*(1 и ШАЮЮ.

оявпб тода-г еея5*<г

/Я\ЙЯГб 0Ш{95%ЗЮ

0,065 «Ш»-0.52) « 0.072 (ояг-ощ* ♦ 0.2? {0.09-0.81 + 0.36 {0.14-0.93) 0.38{0. »4-1.0) 0.43 (0-23-0.81) + 0.45 {0.23-0.88) 0.46 {0.19-1.1) 1- 0.52 {0.25-1.1) 0.59 (0.3-1.0) + 0.61 {0,35-1.07) 0.62 {0.31-1,24) + 0.83 {0.38-1.83) » 0.86 (0.49-1.46) 0.83(0.5-1.5)

1—♦)—1

0.01 0.1 1 величины ОШ;95%ДИ!

ОШ - отношение шансов, ДИ - доверительный интервал;

* ОШ (95%ДИ) посчитано с помощью метода Пето (УиэиГ Э. е1 а1., 1985) для случая, когда четырехпольная таблица содержит нулевые значения.

Присутствие того или иного аллеля в рассматриваемом сочетании обозначено знаком "+".

При анализе механизмов кумулятивного эффекта мы исходили из того, что если два или более аллелей не взаимодействуют друг с другом, тогда величина ОШ в случае носительства сочетания этих аллелей приблизительно равна произведению величин ОШ входящих в сочетание отдельных аллелей, а их вклад в формирование изучаемого признака (отсутствие ответа на лечение) аддитивен. Чем больше отношение этих величин ОШ отличается от 1, тем более сильного эпистатического взаимодействия между генами можно ожидать.

Для каждого аплельного сочетания произведение величин ОШ входящих в сочетание отдельных аллелей обозначали как "ожидаемое ОШ" и сравнивали его с величиной "наблюдаемое ОШ" (полученной в эксперименте). Оценивали отношение величины "наблюдаемое ОШ" к величине "ожидаемое ОШ" для всех возможных комбинаций аллелей, являющихся составными частями исследуемого четырехаллельного сочетания.

Для анализа выявленных различий в величинах "наблюдаемого ОШ" и "ожидаемого ОШ" для всех возможных комбинаций из аллелей £>ДВ/*15, ТСГВ1*Т, ССЯ5*й и IFNAR1*G использовали диаграмму Венна, позволяющую графически отразить характер взаимодействия (аддитивность или эпистаз) различных компонентов выявленного "неблагоприятного" аллельного сочетания (рис. 2). Величина "наблюдаемое ОШ"/"ожидаемое ОШ" для всех биаллельных сочетаний и для большинства триаллельных сочетаний близка к 1. Наиболее сильно отличающиеся от 1 величины "наблюдаемое ОШ"/"ожидаемое ОШ" (темные области на диаграмме Венна) соответствуют триаллельному сочетанию (ОЯВ1*\5+ТОРВ1*1+ССК5*й) и четырехаллельному сочетанию (DRBl*l5+TGFBI*^+CCR5*d+IFNARI*G). В случае триаллельного сочетания отношение "наблюдаемого" ОШ к "ожидаемому" ОШ составило 0.2 и несколько увеличилось при добавлении аллеля IFNAR1*G.

Рисунок 2. Диаграмма Венна, характеризующая взаимодействия различных компонентов, входящих в аллельное сочетание (DRBl*l5+TGFBl*^+CCR5*d +IFNAR1*G).

ССЯ5'й

ТвРВГТ

ОЯВГ15

наблюдаемое ОШ'ожидаемое ОШ 0.2 1« 1.2

Каждый из эллипсов диаграммы соответствует одному из четырех аллелей, каждая область на диаграмме соответствует носительству одиночного аллеля или комбинации аллелей (в случае пересечения эллипсов). Величина отношения "наблюдаемого" ОШ для данного аллеля/аллельного сочетания к "ожидаемому" ОШ представлена в виде градиента оттенков серого цвета. Области, соответствующие одиночным аллелям, а также референсные области, показанные в виде кружков, соответствуют величине "наблюдаемое" ОШ/"ожидаемое" ОШ, равной 1. Чем темнее область пересечения эллипсов, тем сильнее величина этого отношения отличается от 1 и тем сильнее проявляется эпистатическое взаимодействие между аллелями, входящими в состав сочетания. Практически черные области предположительно свидетельствуют о нелинейном взаимодействии аллелей исследуемых генов (эпистазу). ОШ - отношение шансов.

Мы рассматриваем эти данные как указание на эпистатическое взаимодействие, возникающее на уровне аллелей DRB1* 15, TGFB1 *Т и CCR5*d. Аллель IFNAR1*G, скорее всего, не вносит вклад в эпистатическое взаимодействие между названными аллелями, а уменьшение величины рре™ с 0.013 до 0.0056 при дополнительном носительстве 1FNAR1*G отражает аддитивный характер его вклада. Таким образом, мы наблюдаем кумулятивное взаимодействие аллелей DRB1* 15, TGFB1*Т, CCR5*d и IFNAR1*G, реализуемое по сложному механизму аддитивного и эпистатического взаимодействия между четырьмя генами иммунной системы при формировании ответа на лечение ГА.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Анализ ассоциации полиморфизма девяти генов-кандидатов, белковые продукты которых вовлечены в механизм действия иммуномодулирующего препарата ГА, с эффективностью лечения больных PC этим препаратом, проводили с помощью двух типов сравнения. Сначала сравнивали больных PC с оптимальным ответом на лечение ГА со всеми остальными больными (R vs NR), а, затем, используя подход сравнения "крайних" групп, сравнивали больных с оптимальным ответом на лечение ГА с больными, характеризующимися полным отсутствием ответа на лечение (R vs DNR), что позволяет осуществить кросс-валидацию результатов анализа в группах R vs NR. Сопоставление результатов анализа ассоциации исследованных полиморфных вариантов генов-кандидатов в составе сочетаний с эффективностью лечения ГА, полученных с помощью двух подходов, позволило показать и затем подтвердить ассоциацию носительства аллелей генов CCR5, DRB1, IFNG, TGFB1, IFNAR1 и 1L7RA (позитивную или негативную) с оптимальным ответом на лечение ГА (Табл. 6). Полученные данные свидетельствуют об участии этих генов в формировании ответа полигенной природы на лечение иммуномодулирующим препаратом ГА. Отсутствие значимых различий в распределении частот аллелей/генотипов генов DRB1 и CCR5 по отдельности при сравнении групп R vs DNR, которые были выявлены при сравнении групп R vs NR, может быть связано с уменьшением размера выборки.

При этом направленность влияния носительства того или иного аллеля на эффективность лечения ГА всегда сохраняется. Аллели CCR5*d; DRB1*4* 11,* 15; TGFB1*Т, IFNAR1*G и IL7RA*Т входят в аллельные сочетание, валидированные хотя бы в одном из типов сравнения с помощью пермутационного теста. Для генов DRB1, IFNAR1, TNFи IL7RA показано участие альтернативных аллелей при формировании позитивного и негативного ответа на лечение ГА.

Таблица 6. Сопоставление результатов анализа ассоциации исследованных полиморфных вариантов генов-кандидатов с эффективностью лечения ГА, полученных при сравнении больных с оптимальным ответом на лечение ГА (Я) со всеми остальными больными (N11) и с больными, характеризующимися полньм отсутствием ответа на лечение ГА (БИЯ).

Ген Аллель Я та N11 Я та ОЫЯ

ССД5 <Ш _♦

ОЯВ/ 4# +* +

11 Н.з.

/КШ Т + +

ТОРВ1 т _*

тт А + Н.э.

ею - Н.з.

в _+

С Н.з. +

117К А т +* +

С - Н.з.

"+" - позитивная и "—" - негативная ассоциация с оптимальным ответом в составе аллельных сочетаний (р < 0.05). Н.з. — не значимо.

* Входят в сочетания, валидированные при пермутационном анализе (/Эрегт < 0.05)

# Ассоциация выявлена также при оценке индивидуального вклада аллелей.

Наибольшим уровнем значимости среди выявленных нами сочетаний обладают сочетание из двух аллелей (ОЛВ/*4+Л,7&4*Т), позитивно ассоциированное с оптимальным ответом на лечение ГА, и сочетание из четырех аллелей (CC^^J*d+DЯS^*15+ГGF5/*T + 1Р№АЯ1*в), негативно ассоциированное с ним. Они выявлены при кросс-валидации результатов и выдерживают пермутационный тест хотя бы при одном типе сравнения.

Для оценки возможности использования этих сочетаний в качестве биомаркеров эффективности лечения больных РС препаратом ГА, мы вычислили для них величины, характеризующие чувствительность, специфичность и точность оценки (таблица 7). Чувствительность для сочетания, позитивно ассоциированного с эффективностью лечения, оценивали как процент больных, несущих данное сочетание и оказавшихся в группе Я (соответственно, для негативно ассоциированного с эффективностью лечения сочетания — в группе ЫЯ или ОИЯ). Специфичность позитивно ассоциированного с эффективностью лечения сочетания оценивали как процент больных, не несущих данное сочетание, оказавшихся в группе N11 или ОЫЯ (для негативно ассоциированного с эффективностью

лечения сочетания — в группе Я). Точность оценивали как процент правильно сделанных предсказаний.

Таблица 7. Чувствительность, специфичность и точность для сочетаний (DRBI*4+IL7RA*^), и (CCR5*|\±DRB¡ * 1 5+TGFBl*^+IFNARI*G), ассоциированных с различной эффективностью лечения больных РС препаратом ГА.

Сочетание Сравнение в группах Чувствительность (Sensitivity) Специфичность (Specificity) Точность (Accuracy)

DRB1*4+IL7RA *Т R vs NR 0.15 0.95 0.59

R vs DNR 0.15 0.94 0.46

CCR5 *d+DRBI * 15+ TGFB1 *T+IFNARJ *G R vs NR 0.09 1.0 0.51

R vs DNR 0.11 1.0 0.65

Как видно из табл. 7, носительство каждого из сочетаний характеризуется чрезвычайно высокой специфичностью, что позволяет очень четко выделить группы больных PC с различной эффективностью терапии ГА. При этом среди носителей сочетания (CCR5 *d+DRBI * 15+TGFB1 *T+IFNARI *G) не было носителей аллеля DRB1*4, т.о., группы больных, стратифицированные по носительству указанных аллельных сочетаний, не пересекаются. В то же время, наблюдается низкая чувствительность носительства каждого из композитных маркеров при обоих типах сравнения; вероятно, она обусловлена гетерогенностью полигенного ответа на лечение ГА.

Таким образом, выявленные сочетания могут служить высокоспецифичными композитными маркерами, и их носительство должно стать определяющим при решении вопроса о выборе ГА в качестве препарата первой линии для лечения данного больного PC. Однако отсутствие у больного этих маркеров не может служить предсказательным признаком.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Впервые проведен фармакогенетический анализ эффективности лечения больных PC, русских по этнической принадлежности, иммуномодулирующим препаратом длительного применения ГА. Выполнено целостное систематическое исследование как индивидуального, так и совместного вклада функционально значимых полиморфных участков девяти генов иммунного ответа, кодирующих про- и антивовоспалительные цитокины (IFNG; TNF; IFNB1, TGFB1), рецепторы цитокинов и хемокинов (IFNAR1, IL7RA, CCR5), антигена 4 цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLA4), а также молекулы HLA-DRB1 HLA класса II, в формирование ответа на лечение этим препаратом.

Сравнение генетического статуса больных PC с оптимальным ответом на терапию ГА с больными PC без оптимального ответа и кросс-валидация результатов при сравнении

"крайних" групп позволило выявить ассоциацию носительства аллелей генов ССЯ5, йКВ1, №N0, ТСРВ1, 1ГЫАИ1 и II,7ЯА (позитивную или негативную) с эффективностью ответа на лечение этим иммуномодулирующим препаратом. Полученные данные свидетельствуют о полигенной природе формирования ответа на лечение препаратом ГА. Найдены высокоспецифичные композитные маркеры, носительство которых ассоциировано с различной эффективностью ответа больных РС на лечение ГА - биаллельное сочетание (ОДВ/*4+Я,7Л4*Т), позитивно ассоциированное с оптимальным ответом на лечение ГА, и четырехаллельное сочетание (ССД5*а+ШВ/*15+Г0га/*Т+7ЯУ/Ш*0), негативно ассоциированное с ним. Эти сочетания могут служить биомаркерами при решении вопроса о выборе ГА в качестве препарата первой линии для лечения больных РС. Анализ природы кумулятивного эффекта аллелей ССА5*с1, £>ДВ/*15, ТОРВ1*Т и ¡ЕЫАН1*0 в составе аллельных сочетаний при сравнении "крайних" групп показал, что имеет место как аддитивный, так и эпистатический (нелинейный) характеры взаимодействия между исследуемыми аллелями при формировании ответа на лечение ГА.

Сопоставление полученных результатов с данными проведенного нами независимо фармакогенетического исследования с тем же набором генов эффективности лечения больных РС другим иммуномодулирующим препаратом первой линии - ИФНб, продемонстрировало перспективность выбранного дизайна эксперимента. Есть все основания рассчитывать на выявление дискриминирующих маркеров, которые еще до назначения терапии позволят выбирать иммуномодулирующий препарат первой линии, наиболее подходящий для каждого больного РС, из двух.

ВЫВОДЫ

1. При оценке индивидуального вклада полиморфизма генов ШЫв (^2430561), 77\У (ге 1800629), ШВ1 (ге 1051922), ШРВ1 (г51800469), ШАШ (ге1012335) И7М ^6897932), ССЛ5 (геЗЗЗ), СТ1А4 (гэ231775) и НЬА-йШ1 в эффективность лечения иммуномодулирующим препаратом глатирамера ацетатом (ГА) больных рассеянным склерозом (РС), русских по этнической принадлежности, у больных с оптимальным ответом на лечение наблюдали значимо более высокую частоту аллелей ОЯВ1*4, йШН* 13 и ССЯ5*\у (ОШ от 1.7 до 1.9), а также частоту носительства аллеля £)ДД/*4 (0111=1.9), чем у остальных больных (без оптимального ответа), получавших ГА. Частота аллеля ССЩ*& была значимо выше в группе без оптимального ответа на ГА (ОШ=0.53).

2. При сравнении больных с оптимальным ответом на лечение ГА с больными, характеризующимися полным отсутствием ответа на лечение (сравнение "крайних" групп),

значимых различий в распределении аллелей/генотипов анализируемых полиморфных участков не наблюдали.

3. Анализ совместного носительства аллелей/генотипов исследованных полиморфных участков выявил биаллельное сочетание (DRB1*4+IL 7RA *Т), значимо ассоциированное с оптимальным ответом на лечение ГА при обоих использованных типах сравнения (ОШ=3.7 и 2.7). Аллели JFNG*Т, TNF*A, IFNAR1*C и IL7RA*Т формируют ряд других биаллельных сочетаний, значимо ассоциированных с оптимальным ответом больных PC на лечение ГА при одном из использованных типах сравнения (ОШ от 1.9 до 2.7).

4. Совместное носительство в составе би- и триаллельных сочетаний, включающих аллели CCR5*d, DRBI* 15, TGFB1*Т или IFNARI*G, а также совместное носительство всех этих четырех аллелей, ассоциированы с отсутствием оптимального ответа при обоих типах сравнения. За единственным исключением (DRB1*\5+TGFB1*T), эти сочетания включают аллель CCR5* d. Биаллельные сочетания аллеля CCR5*d с аллелем DRB1* 11 или с генотипом TNF*G/G, негативно ассоциированные с оптимальным ответом на лечение ГА, выявлены только при сравнении с больными без оптимального ответа. ОШ для всех негативных ассоциаций лежат в пределах от 0.038 до 0.5.

5. Анализ природы кумулятивного эффекта аллелей CCR5*d, DRBI* 15, TGFB1*Т и JFNARI*G в составе сочетаний, проведенный при сравнении "крайних" групп, показал, что имеет место как аддитивный, так и эпистатический типы взаимодействия между исследуемыми аллелями.

6. Сравнение "крайних" групп, использованное для кросс-валидации результатов, полученных при сравнении больных с оптимальным ответом на лечение ГА со всеми остальными больными, позволило подтвердить ассоциацию носительства аллелей генов CCR5, DRBI, JFNG, TGFB1, IFNAR1 и IL7RA (позитивную или негативную) с оптимальным ответом на лечение ГА. Полученные данные свидетельствуют об участии этих генов в формировании ответа полигенной природы на лечение иммуномодулирующим препаратом ГА.

7. Биаллельное сочетание (DRBI*4+]L7RA*T), позитивно ассоциированное с оптимальным ответом на лечение ГА, и четырехаллельное сочетание (CCR5*d+DRBl*l5+TGFBl*T + IFNARl*G), негативно ассоциированное с ним, значимость которых выдерживает пермутационный тест (Ppcrm <0.05), могут служить высокоспецифичными композитными маркерами при решении вопроса о выборе ГА в качестве препарата первой линии для лечения больных PC.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАНЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

СТАТЬИ В НАУЧНЫХ ЖУРНАЛАХ

1. О. Ю. Макарычева, Е. Ю. Царева, М. А. Судомоина, О. Г. Кулакова, О. В. Быкова, Н. В. Гольцова, Л. М. Кузенкова, А. Н. Бойко, О. О. Фаворова. Анализ сцепления и ассоциации аллелей генов провоспалительных цитокинов IL-6, IFNg и TNF с рассеянным склерозом с помощью теста неравновесной передачи аллелей (TDT). Молекулярная биология, 2010, том 44, № 5, с. 1-7.

2. О.Ю. Макарычева, Е.Ю.Царева, М. А. Судомоина, О.Г. Кулакова, Б.В. Титов, О.В. Быкова, Н. В. Гольцова, Л.М. Кузенкова, А.Н.Бойко, О.О. Фаворова. Семейный анализ сцепления и ассоциации полиморфизмов генов DRB1, CTLA4, TGFB1, IL4, CCR5, RANTES, ММР9 и TIMP1 с рассеянным склерозом. 2011. ActaNaturae, том 3, 1(8), стр. 91-98.

3. ЕЛО. Царева, О.Г. Кулакова, О.Ю. Макарычева, А.Н. Бойко, С.Г. Щур, Н.Ю. Лащ, Н.Ф. Попова, Е.И. Гусев, В.В. Башинская, Д. В. Львов, А. В. Фаворов, М. F. Ochs, О. О. Фаворова. Фармакогеномика рассеянного склероза: ассоциация полиморфизма генов иммунного ответа с эффективностью лечения копаксоном. Молекулярная биология, 2011.45(6), стр. 963-972.

4. Tsareva E.Y., Kulakova O.G., Boyko A.N., Shchur S.G., Lvovs D„ Favorov A.V., Gusev E.I., Vandenbroeck K, Favorova O.O. Allelic combinations of immune-response genes associated with glatiramer acetate treatment response in Russian multiple sclerosis patients. Pharmacogenomics. 2012; 13(l):43-53.

МАТЕРИАЛЫ КОНФЕРЕНЦИЙ

1. Щур С.Г., Царёва Е.Ю., Макарычева О.Ю., Судомоина М.А., Кулакова О.Г., Бойко А.Н., Фаворова О.О. Фармакогенетика рассеянного склероза: эффективность лечения интерфероном-бета и глатирамера ацетатом в зависимости от носительства аллелей генов иммунного ответа. Материалы XVI Российского национального конгресса "ЧЕЛОВЕК И ЛЕКАРСТВО", г. Москва, 2009 г., стр. 566.

2. Царёва Е.Ю., Кулакова О.Г., Судомоина М.А., Макарычева О.Ю., Щур С.Г., Лащ Н.Ю., Бойко А.Н., Фаворова О.О. Ассоциация аллелей генов иммунного ответа и их сочетаний с характером течения рассеянного склероза и эффективностью его лечения иммуномодулирующими препаратами. Материалы XVII Всероссийской научной конференции "Нейроиммунология. Рассеянный склероз", г. Санкт-Петербург, 2009 г., Нейроиммунология, том 7, выпуск 1, стр 102-103.

3. Кулакова О.Г., Бойко А.Н., Царева Е.Ю., Макарычева О.Ю., Щур С.Г., Давыдовская М.Ф., Хачанова Н.В., Попова Е.В., Попова Н.Ф., Фаворова О.О. Генетические маркеры в прогнозе развития и лечения рассеянного склероза. Материалы Научно-практической конференции с международным участием "Современные проблемы рассеянного склероза: теория и практика", г. Казань, 2010 г., Неврологический вестник, том 42, вып. 1, стр. 151.

4. Tsareva E.Yu., Lvovs D., Kulakova O.G. Pharmacogenetics of glatiramer acetate treatment in Russian patients with multiple sclerosis. Proceedings of the 11th course of the European School ofNeuroimmunology, 2011, p. 8.

5. O.G. Kulakova, E.Yu. Tsareva, V.V. Bashinskaya, A.N. Boyko, S.G. Shchur, D.V. L'vovs, A.V.Favorov, K. Vandenbroeck, O.O. Favorova. Pharmacogenetics of disease-modifying treatment in patients Russian with multiple sclerosis Proceedings of the International Moscow Conference on Computational Molecular Biology, 2011, p. 372.

6. E.Yu. Tsareva, O.G. Kulakova, O.O. Favorova. Association of immune response genes polymorphism with glatiramer acetate treatment efficiency in multiple sclerosis patients Proceedings of the VII International Pirogov Scientific Medical Conference of Students and Young Scientists, Moscow, 2012, p. 213.

Список использованных сокращений. ВПРС - вторично-прогрессирующий PC; ГА -глатирамера ацета; ГКГ - главный комплекс гистосовместимости; ИФНб - интерферон-бета; ЦНС - центральная нервная система; ПИТРС - препараты, изменяющие течение PC; ПЦР -полимеразная цепная реакция; PC - рассеянный склероз; РРС - ремитирующий PC; CCR5 - ген рецептора СС-хемокинов 5; CTLA4 - ген антигена 4 цитотоксических Т-лимфоцитов; HLA-DRB1 - ген бета-1 цепи молекул главного комплекса гистосовместимости класса II; d - генотип с делецией; DNR (Definite Non-Responders) — больные, характеризующиеся полным отсутствием клинического ответа на лечение ГА; EDSS (Expanded Disability Status Scale) - расширенная шкала оценки степени инвалидизации; IFNAR1 - ген первой субъединицы рецептора для интерферонов типа I; 1FNB1 — ген интерферона-бета; IFNG - ген интерферона-гамма; 1L7RA -ген альфа-субъединицы рецептора интерлекина-7; NR (Non-Responders) - больные без оптимального клинического ответа на лечение ГА; R (Responders) — больные с оптимальным клиническим ответом на лечение ГА; TGFB1 - ген трансформирующего фактора роста бета 1; TNF - ген фактора некроза опухолей; р- величина р по точному критерию Фишера; ррСгт -величина р после пермутационного теста (100 пермутаций); w - генотип дикого типа.

Подписано в печать:

29.10.2012

Заказ № 7767 Тираж - 70 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Царёва, Екатерина Юрьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1.1. Основные аспекты иммунопатогенеза РС и подходы к его лечению иммуномодулируюхцими препаратами.

1.1.1. Основные аспекты иммунопатогенеза РС.

1.1.2. Патогенетическое лечение больных РС иммуномодулирующими препаратами.

1.2. Фармакогенетические исследования эффективности лечения ПИТРС больных РС.

1.2.1. Фармакогенетические исследования эффективности ИФНб при РС.

1.2.2. Фармакогенетические исследования эффективности ГА при РС.

1.3. Обоснование выбора генов для фармакогенетического исследования эффективности иммуномодулирующей терапии у русских больных РС.

1.3.1. Ген ПЪА-ОЯВ!.

1.3.2. Ген ССК5.

1.3.3. Гены провоспалительных цитокинов: Ш^и/Т'Жг.

1.3.4. Гены противовоспалительных цитокинов: ГGF5^ и/РМ?7.

1.3.5. Ген СТЬА4.

1.3.6. Ген ИШШ.

1.3.7. ГенЛ7Л4.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Использованные реактивы.

2.2. Объект исследования.

2.3. Полиморфные локусы генов, анализ которых проводили в работе.

2.4. Выделение геномной ДНК из периферической крови больных РС.

2.5. Геномное типирование.

2.5.1. Геномное типирование локуса НЬА-ОЯВ1.

2.5.2. Геномное типирование полиморфного участка "дикий тип—»делеция 32-х п.н. в гене ССЯ5 (лу—><!, геЗЗЗ).7.7.

2.5.3. Геномное типирование БЫР -3080А в гене ГМ^ге 1800629).

2.5.4. Геномное типирование 8741>А в гене /^М? ^2430561).

2.5.5. Геномное типирование -509С>Т в гене ТвЕВ1 (ге1800469).

2.5.6. Геномное типирование БКР 153Т>С в гене №№1 (ге 1051922).

2.5.7. Геномное типирование БОТ 49А>в в гене СТЬА4 (гз231775).

2.5.8. Геномное типирование 167250С в гене ШАЮ (ге1012335).

2.5.9. Геномное типирование 8№ С->Тв экзоне б гена И7КА (г56897932).

2.6. Статистический анализ.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Анализ вклада полиморфизма генов-кандидатов в эффективность лечения больных РС препаратом ГА при сравнении больных с оптимальным ответом на лечение ГА и больных без оптимального ответа (всех остальных больных РС).

3.1.1. Сравнительная характеристика групп больных РС (Я га N11).

3.1.2. Анализ индивидуального вклада аллелей/генотипов генов-кандидатов в эффективность лечения ГА при сравнении больных с оптимальным ответом на лечение и без оптимального ответа на лечение ГА (К га N11).

3.1.3. Анализ совместного вклада аллелей/генотипов генов-кандидатов в эффективность лечения ГА при сравнении больных с оптимальным ответом на лечение и без оптимального ответа на лечение ГА (И. га N11).

3.2. Выявление генетических маркеров эффективности лечения ГА, при сравнении больных с оптимальным ответом на терапию ГА и больных, характеризующимися полным отсутствием ответа на лечение (сравнение «крайних» групп, Л га DNR).

3.2.1. Сравнительная характеристика групп больных (Я га DNR).

3.2.2. Анализ индивидуального вклада аллелей/генотипов генов-кандидатов в эффективность лечения ГА при сравнении больных с оптимальным ответом на лечение и ГА и больных, характеризующимися полным отсутствием ответа на лечение (II га БШ).

3.2.3. Анализ совместного вклада аллелей/генотипов генов-кандидатов в эффективность лечения ГА при сравнении больных с оптимальным ответом на лечение и больных, характеризующихся полным отсутствием ответа на терапию

ГА (RraDNR).

3.3. Анализ природы кумулятивного вклада аллелей ССЯ5*с1, ЖВ1*\ 5, ГОКВ1 *Т и /РАШ?7*С в составе сочетаний в эффективность лечения препаратом ГА больных РС.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Фармакогеномные исследования эффективности лечения рассеянного склероза иммуномодулирующими препаратами"

Рассеянный склероз (РС) - хроническое демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы (ЦНС), преимущественно поражающее людей трудоспособного возраста При этом заболевании у больного развивается комплекс иммуноопосредованных патологических реакций, направленных на разрушение миелиновой оболочки нейронов, что впоследствии приводит к необратимой потере неврологических функций и тяжелой инвалидизации [1, 2]. В мире насчитывается более 2.5 миллионов больных РС, в России около 200 тыс. человек. В ряде регионов России заболеваемость РС довольно высока и находится в пределах 35-70 случаев на 100 тыс. населения. Достаточно высокая распространенность РС в мире, а также отсутствие однозначно эффективного лечения этого заболевания, выводят проблемы изучения РС в ряд важнейших медико-биологических задач.

Лечение РС остается одной из наиболее серьезных проблем практической неврологии, однако в настоящее время появились действенные пути влияния на течение болезни. Это стало возможным благодаря разработке современных подходов, опирающихся на знание иммунопатогенеза этого заболевания. В настоящее время для лечения РС широко применяют препараты, изменяющие течение РС (ПИТРС); все они тем или иным образом влияют на развитие иммунопатологических процессов. К разрешенным к использованию ПИТРС относят следующие иммуномодулирующие препараты: глатирамера ацетат (ГА) - синтетический сополимер из остатков аланина, лизина, тирозина и глутаминовой кислоты; интерферон-бета (ИФНб); финголимод -лиганд для рецепторов сфингозин-1-фосфата; цитостатик митоксантрон и препарат моноклональных антител к молекулам интегринов — натализумаб [3-7]. Первые три из них являются препаратами первой линии при длительном патогенетическом лечении больных РС. Терапевтический эффект ГА, ИФНб и финголимода на активность РС при ремитирующем течении РС были показаны в нескольких мультицентровых рандомизированных клинических испытаниях с использованием двойного слепого метода [8-11]. Эти препараты снижают частоту и тяжесть обострений, задерживают прогрессирование нетрудоспособности и возникновение новых очагов (по данным магнитно-резонансной томографии головного мозга). Длительное наблюдение за больными, которые получают эти препараты, подтвердило, что появилась возможность реально вмешиваться в механизмы развития патологического процесса, снижая активность воспалительного и аутоиммунного процессов, приводящих к демиелинизации и аксональной дегенерации [12].

В то же время, лечение PC характеризуется выраженной гетерогенностью ответа на лечение ПИТРС: по данным различных исследований, от 30 до 50% больных (в зависимости от выбора клинических критериев оценки эффективности лечения) остаются невосприимчивыми к проводимой терапии, а в ряде случаев наблюдается устойчивая резистентность. При этом вывод о действенности терапии ПИТРС для каждого больного PC можно сделать только после длительного приема препарата. К сожалению, к тому времени, когда будет вынесено решение об отмене препарата, неврологическое состояние больного может ухудшиться. Результаты проведенных ранее исследований свидетельствует о значительной генетической детерминированности индивидуального ответа на лечение лекарственными препаратами [13]. Поскольку вариабельность ответа больных PC на лечение ПИТРС также может быть связана со сложным влиянием генетических факторов, возникла необходимость фармакогеномных исследований эффективности иммуномодулирующей терапии.

Фармакогеномику в настоящее время определяют как науку, изучающую общие аспекты наследования и функционирования многих генов, детерминирующих реакцию на действие лекарств. Одно из основных направлений фармакогеномики, фармакогенетика, изучает такие варианты последовательностей ДНК индивидов, которые обуславливают различия в процессах метаболического превращения лекарственного средства и его доставки и различия в ответе организма на действие лекарств. Эти исследования лежат в русле перспективных молекулярно-биологических исследований генома человека, направленных на решение задач молекулярной медицины. В настоящее время фармакогенетический анализ прочно вошел в практику медицины; для некоторых введенных ранее лекарственных препаратов были проведены ретроспективные исследования, основанные на предшествующих клинических исследованиях, а в протоколы многих текущих клинических исследований введен последующий фармакогенетический анализ. При этом учитывается этническая принадлежность пациентов, поскольку индивидуальные особенности процессов обмена веществ в организме представителей разных этнических групп сильно отличаются.

Фармакогеномные исследования эффективности лечения PC препаратами ПИТРС первой линии проводятся сейчас во многих странах, однако, в основном, они касаются ИФНб [14, 15]. Эффективность применения ГА при лечении PC анализировали лишь в нескольких исследованиях, в первую очередь направленных на поиск ассоциации эффективности лечения с полиморфизмом генов главного комплекса гистосовместимости (HLA, human leukocyte antigen) класса II; в единичных работах анализировали также значение полиморфизма генов, кодирующих Т-клеточный рецептор, некоторые ЦИТОКИНЫ и белки миелина [16-19].

В России ГА, зарегистрированный для применения в 1997 году, активно используется в качестве ПИТРС первой линии. Недавно ГА был разрешен для лечения больных с клинически изолированным синдромом (первый приступ PC) [20]. Хотя эффективность ГА была показана в многочисленных клинических испытаниях, степень его влияния на течение PC может варьировать у разных больных в диапазоне от высокой эффективности до полного отсутствия влияния препарата на течение заболевания Генетические варианты, влияющие на эффектность действия ГА, могут быть биологическими маркерами, определяющими выбор лекарственной терапии для конкретного больного еще до начала лечения, что является основой персонализированной медицины.

В связи с этим, целью настоящей работы является анализ совместного вклада ряда генов иммунного ответа в эффективность лечения иммуномодулирующим препаратом глатирамера ацетатом (ГА) больных PC, русских по этнической принадлежности.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи.

1. Провести геномное типирование полиморфных участков ряда генов иммунного ответа, белковые продукты которых вовлечены в механизм действия ГА, а именно генов про- и антивовоспалительных цитокинов (IFNG: rs2430561; TNF: rsl800629, IFNB1: rsl051922; TGFB1: rsl800469), рецепторов цитокинов и хемокинов (IFNAR1. rsl012335; IURA. rs6897932, CCR5\ rs333), антигена 4 цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLA4. rs231775), а также гена ГКГ класса II (HLA-DRB1) для больных PC русских по этнической принадлежности.

3. Провести сравнительный анализ как индивидуального, так и совместного вклада полиморфизма генов-кандидатов у больных РС с оптимальным ответом на лечение и больных, характеризующихся полным отсутствием ответа на лечение ГА (сравнение "крайних" групп).

4. Проанализировать возможные механизмы взаимодействия между аллелями в составе сочетаний при их выявленном совместном вкладе в эффективность лечения больных РС препаратом ГА.

Научная новизна. Впервые выполнен фармакогенетический анализ эффективности лечения РС одним из препаратов первой линии - глатирамера ацетатом -для русских по этнической принадлежности больных РС. Впервые проведено целостное систематическое исследование совместного вклада функционально значимых полиморфных участков ряда генов (а именно, девяти генов иммунного ответа) в формирование ответа на лечение препаратом ГА больных РС. Впервые параллельно проведено сравнение генетического статуса больных РС с оптимальным ответом на терапию ПИТРС как с больными РС без оптимального ответа, так с больными РС с полным отсутствием ответа (сравнение "крайних" групп). Такой анализ, направленный на кросс-валидацию результатов при двух типах сравнения, впервые позволил убедительно показать участие генов ССЯ5, Б11В1, Шв, 7ШВ1, ШАЮ и 117Ы в формировании ответа полигенной природы на лечение иммуномодулирующим препаратом. Впервые найдены композитные (составные) маркеры, носительство которых ассоциировано с различной эффективностью ответа больных РС на лечение ГА - биаллельное сочетание (ОКВ1*4+1Ь71Ы*Т), позитивно ассоциированное с оптимальным ответом на лечение ГА, и сочетание из четырех аллелей {ССЛ5*&+ОКВ1*\ 5+ТСЕВ1*Т+1РШК1*Сз), негативно ассоциированное с ним. Впервые в рамках фармакогенетического исследования проведен анализ природы кумулятивного эффекта аллелей ССУ?5*с1, ОНВ1* 15, ТСКВ1*Т и в составе аллельных сочетаний и показано, что имеет место как аддитивный, так и эпистатический (нелинейный) типы взаимодействия между исследуемыми аллелями. Практическая значимость работы. Обнаруженные би- и четырехаллельные сочетания могут служить композитными маркерами при решении вопроса о выборе ГА в качестве препарата первой линии для лечения больных РС. Эти результаты могут быть основой для создания прогностического теста, направленного на выбор одного из альтернативных иммуномодулирующих препаратов первой линии для лечения больных РС еще до назначения патогенетического лечения.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Появление науки, изучающей влияние наследственных факторов на эффективность лекарственных средств, связано с именами Archibald Garrod, William Bateson и Lucien Cuinot, впервые высказавших предположение о роли наследственности в процессах химических превращений в организме. Еще в 1902 году при изучении алькаптонурии Garrod доказал роль менделевского наследования в формировании индивидуальных особенностей процессов обмена веществ в организме пациента (см [1]) Активное развитие фармакогенетики как науки связывают с именами Werner Kalow, Friedrich Vogel и Arno Motulsky, которые развили представление о том, что в основе формирования у больных индивидуальных различий в способности метаболизировать ксенобиотики и склонности к развитию побочных реакций может лежать генетическая вариабельность [21]. Один из наиболее ярких примеров установления связи между побочным действием лекарственного препарата и генетическим дефектом связан с применением противомалярийного препарата примахина у солдат американской армии в середине XX века Было обнаружено, что у некоторых мужчин африканского происхождения стандартная доза препарата вызывает гемолиз эритроцитов. Причиной этого явилась генетически детерминированная врожденная недостаточность фермента глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы в эритроцитах людей определенного этнического происхождения, в частности, у людей африканской расы, что приводило к появлению выраженных побочных явлений, связанных с метаболизмом примахина [22] Эти наблюдения послужили основой для развития нового направления исследований - фармакогенетики. Впервые этот термин использовал F.Vogel в 1959 г.

В 60-х годах XX века продолжилось бурное развитие фармакогенетики. Дальнейшие исследования, в основном, были связаны с исследованием побочных явлений в ответ на введение ксенобиотиков и, главным образом, с исследованием влияния индивидуальных особенностей фармакокинетических процессов (всасывание препарата, его распределение, метаболизм и выведение) и фармакодинамики (эффективность и токсичность препарата), обусловленных характером функционирования различных ферментов, структурных и транспортных белков, рецепторов, ионных каналов, систем вторичных мессенджеров и т д , работа которых находится под строгим генетическим контролем.

Фармакогенетику в настоящее время определяют как науку, изучающую такие наследственные различия в последовательности ДНК индивидов, которые обуславливают различия в метаболизме лекарств и различия в ответе организма на действие лекарств [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/About/primer/pharm.html]. Основными генами-мишенями при фармакогенетических исследованиях являются гены, продукты которых играют роль в

10 процессах метаболического превращения лекарственного средства и его доставки либо участвуют в реализации эффекта препарата. Результаты проведенных исследований показали, что вклад генетических факторов в вариабельность ответа на лекарства может составлять от 20 до 95% [13]. Природа генетической вариабельности, во многом, основана на явлении генетического полиморфизма, который эволюционно сформировался в популяциях человека до появления применяемых в настоящее время фармакологических средств. К основным исследуемым типам полиморфизма относят однонуклеотидные замены (single nucleotide polymorphism, SNP), которые определяют 85-90% вариабельности генома, инсерционно-делеционные мутации, вариации числа копий отдельных участков генома (размером от 1 ООО п.н. и более) (copy number variation, CNV), тандемные повторы различной длины (мини- и микросателлиты). Полиморфизмы могут затрагивать кодирующую или регуляторную области гена. Мутации в кодирующей области гена могут менять аминокислотную последовательность белка и приводить к изменению структуры и функции белкового продукта. Мутации могут затрагивать регуляторные области гена (сайты связывания с транскрипционными факторами, энхансеры, сайленсеры), влияя на экспрессию это гена. Наконец, генетическая вариабельность может затрагивать транскрибируемую область гена, включая экзоны и интроны, 5'- и 3'- некодирующие области, что может влиять на последовательность, структуру, стабильность и функции мРНК, а также на скорость трансляции белка.

При фармакогенетических исследованиях для выявления генетических маркеров, обладающих предиктивным эффектом, используют различные геномные подходы, в первую очередь, подход ген-кандидат, когда выбор анализируемых генов осуществляется на основании функциональной роли их продуктов. В последние годы в области фармакогенетики начали использовать метод полногеномного поиска ассоциаций (genome-wide association study, GWAS), который, благодаря развитию методов высокопроизводительного геномного типирования, позволяет проводить анализ тысяч полиморфных маркеров в рамках одного исследования. Благодаря большим размерам выборок подход GWAS позволяет обнаруживать даже сравнительно слабые ассоциации полиморфных маркеров с исследуемым признаком. Так, на основании многочисленных фармакогенетических исследований ассоциации полиморфизма в генах CYP2C9 и VCORC1 с риском развития геморрагических осложнений на фоне антикоагулянтной терапии варфарином, комиссией по контролю за пищевыми продуктами и медикаментами (Food and Drug Administration, FDA) одобрено несколько фармакогенетических алгоритмов, позволяющих осуществлять индивидуальный подбор дозы препарата [23-25]

В настоящий момент фармакогенетический анализ прочно вошел в практику медицины, так для некоторых введенных ранее лекарственных препаратов были проведены ретроспективные фармакогенетические исследования, основанные на предшествующих клинических исследованиях [18, 19], а в протоколы многих текущих клинических исследований введен последующий фармакогенетический анализ. При этом учитывается этническая принадлежность пациентов, поскольку индивидуальные особенности процессов обмена веществ в организме представителей разных этнических групп сильно отличаются.

Хотя на начальном этапе развития фармакогенетические исследования касались, в основном, моногенных заболеваний, исследования, проводимые во всем мире в настоящее время, в большинстве своем, касаются лечения комплексных полигенных заболеваний, т.е. заболеваний, развитие которых обусловлено наследственной предрасположенностью с полигенным типом наследования. К таким заболеваниям относятся аутоиммунные заболевания, сердечно-сосудистые заболевания, онкологические заболевания и другие. Важно отметить, что, как правило, эти заболевания требуют длительного, а иногда и пожизненного лечения, что часто сопряжено с развитием тяжелых побочных эффектов; как следствие, успех лечения трудно предсказать на этапе назначения лекарственной терапии. В настоящее время в некоторых странах (США, Канада, Великобритания) в клиническую практику уже введены фармакогенетические алгоритмы, одобренные соответствующими комиссиями по контролю за пищевыми продуктами и медикаментами, которые учитывают генетический статус больного при назначении конкретных лекарственных препаратов для лечении таких заболеваний как миелодиспластический синдром, опухоли молочных желез, гастроинтестинальные стромальные опухоли и некоторые другие опухоли, СПИД, ревматоидный артирит, эпилепсия, шизофрения, депрессия, артериальная гипертензия и т.д. [26]. Таким образом, фармакогенетический анализ, учитывающей уникальные генетические особенности больного и индивидуальные клинико-патогенетические особенности течения заболевания, обладает возможностью в большой степени предсказывать индивидуальную чувствительность больного к исследуемому препарату для раннего назначения ему оптимальной терапии.

Благодаря достижениям молекулярной медицины, в первую очередь молекулярной биологии и генетики, а также появлению высокоэффективных технологий, персонализированный подход к лечению больного с учетом индивидуальных особенностей организма в настоящее время включает в себя не только генетические исследования. Так, областью исследований фармакогеномики, помимо фармакогенетических исследований, является также исследование других биомаркеров в

12 крови, например, матричных РНК, позволяющих судить о транскрипционной активности генов-мишеней и выявлять различия в паттернах экспрессии генов. Это также может позволить осуществлять прогнозирование эффективности лечения тем или иным препаратом и риск развития побочных явлений при различной терапии у конкретного индивида.

В последние 10 лет фармакогенетические исследования активно ведутся в отношении одного из тяжелейших социально значимых неврологических заболеваний -рассеянного склероза.

1.1. Основные аспекты пммунопатогенеза PC и подходы к его лечению иммуномодулирующимп препаратами

Рассеянный склероз (PC) - хроническое демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы (ЦНС). В патогенезе PC большую роль играет аутоиммунный воспалительный процесс, при котором в организме больного развивается комплекс иммуноопосредованных патологических реакций, направленных на разрушение миелиновой оболочки нейронов, что впоследствии приводит к необратимой потере неврологических функций и тяжелой инвалидизации [2, 27, 28].

Это тяжелое аутоиммунное заболевание преимущественно поражает людей трудоспособного возраста и разными темпами, в зависимости от формы течения болезни, ведет к необратимой инвалидности В мире насчитывается более 2,5 миллионов больных PC, в России по оценкам экспертов — порядка 130 тыс. человек. В ряде регионов России заболеваемость рассеянным склерозом довольно высока и находится в пределах 35-70 случаев на 100 тыс. населения [29]. В 80-85% случаев PC на начальных стадиях протекает волнообразно, когда периоды ухудшения состояния сменяются улучшениями, т.е. полными или частичными ремиссиями (ремитирующая форма PC, РРС). Длительность ремиссий может варьировать от нескольких месяцев до десятков лет. В последующем у большинства больных течение становиться неуклонно прогрессирующим (вторично-прогрессирующая форма PC, ВПРС). У 10-15% больных, в основном при более позднем начале заболевания, наблюдается непрерывно прогрессирующее нарастание неврологического дефицита (первично-прогрессирующая форма PC, ППРС) [30] Достаточно высокая распространенность PC в мире, а также отсутствие однозначно эффективного лечения этого заболевания, выводят проблемы изучения PC в первый ряд медико-биологических задач.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Царёва, Екатерина Юрьевна

6. выводы

1. При оценке индивидуального вклада полиморфизма генов IFNG (rs2430561), TNF (rs 1800629), IFNB1 (rsl051922), TGFB1 (rsl800469), IFNAR1 (rsl012335) IL7RA (rs6897932), CCR5 (rs333), CTLA4 (rs231775) и HLA-DRB1 в эффективность лечения иммуномодулирующим препаратом глатирамера ацетатом (ГА) больных рассеянным склерозом (PC), русских по этнической принадлежности, у больных с оптимальным ответом на лечение наблюдали значимо более высокую частоту аллелей DRB1*4, DRB1* 13 и CCR5*w (ОШ от 1.7 до 1.9), а также частоту носительства аллеля DRB1*4 (0111=1.9), чем у остальных больных (без оптимального ответа), получавших ГА. Частота аллеля CCR5*d была значимо выше в группе без оптимального ответа на ГА (0111=0.53).

2. При сравнении больных с оптимальным ответом на лечение ГА с больными, характеризующимися полным отсутствием ответа на лечение (сравнение «крайних» групп), значимых различий в распределении аллелей/генотипов анализируемых полиморфных участков не наблюдали.

3. Анализ совместного носительства аллелей/генотипов исследованных полиморфных участков выявил биаллельное сочетание (DRB1*4+IL7RA*T), значимо ассоциированное с оптимальным ответом на лечение ГА при обоих использованных типах сравнения (0111=3.7 и 2.7). Аллели IFNG*T, TNF*A, IFNAR1*C и IL7RA*T формируют ряд других биаллельных сочетаний, значимо ассоциированных с оптимальным ответом больных PC на лечение ГА при одном из использованных типах сравнения (ОШ от 1.9 до 2.7).

4. Совместное носительство в составе би- и триаллельных сочетаний, включающих аллели CCR5*d, DRB1* 15, TGFB1*Т или IFNAR1*G, а также совместное носительство всех этих четырех аллелей, ассоциированы с отсутствием оптимального ответа при обоих типах сравнения. За единственным исключением (DRB1*15+TGFB1*T), эти сочетания включают аллель CCi?5*d. Биаллельные сочетания аллеля CC#5*d с аллелем DRB1* 11 или с генотипом TNF*G/G, негативно ассоциированные с оптимальным ответом на лечение ГА, выявлены только при сравнении с больными без оптимального ответа. ОШ для всех негативных ассоциаций лежат в пределах от 0.038 до 0.5.

5. Анализ природы кумулятивного эффекта аллелей CCR5*d, DRB1* 15, TGFB1*Т и IFNAR1*G в составе сочетаний, проведенный при сравнении «крайних» групп, показал, что имеет место как аддитивный, так и эпистатический типы взаимодействия между исследуемыми аллелями.

6. Сравнение «крайних» групп, использованное для кросс-валидации результатов, полученных при сравнении больных с оптимальным ответом на лечение ГА со всеми остальными больными, позволило подтвердить ассоциацию носительства аллелей генов

115

ССЯ5, БШН, Шв, ТСРВ1, ШАШ и 117НА (позитивную или негативную) с оптимальным ответом на лечение ГА. Полученные данные свидетельствуют об участии этих генов в формировании ответа полигенной природы на лечение иммуномодулирующим препаратом ГА.

7. Биаллельное сочетание {ОКВ1*А+1Ь7КА*Т), позитивно ассоциированное с оптимальным ответом на лечение ГА, и четырехаллельное сочетание (ССЛ5*а+£Д£7*15+7и^/*Т + ШАК1*С), негативно ассоциированное с ним, значимость которых выдерживает пермутационный тест (ррет <0.05), могут служить высокоспецифичными композитными маркерами при решении вопроса о выборе ГА в качестве препарата первой линии для лечения больных РС.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе впервые проведен фармакогенетическнй анализ эффективности лечения больных PC, русских по этнической принадлежности, иммуномодулирующим препаратом длительного применения ГА. Это первое фармако генетическое исследование эффективности действия ГА, в котором на большой группе больных параллельно проанализирован как индивидуальный, так и совместный вклад функционально значимых полиморфных участков девяти генов иммунного ответа кодирующих про- и антивовоспалительные цитокины {IFNG-, 77VF; IFNB1, TGFB1), рецепторы цитокинов и хемокинов {IFNAR1, IL7RA, CCR5), антигена 4 цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLA4), а также молекулы HLA-DRB1 HLA класса II, в формирование ответа на лечение этим препаратом.

В работе проведен анализ ассоциации генетических вариантов ряда генов иммунного ответа с эффективностью лечения больных PC препаратом ГА с помощью двух типов сравнения. Сравнение группы больных PC с клинически оптимальным ответом на лечение ГА проводили как со всеми остальными больными (R vj NR), так и с больными, характеризующимися полным отсутствием ответа на лечение (R vs DNR) (сравнение «крайних» групп), что позволило осуществить кросс-валидацию результатов анализа в группах R vi NR.

При анализе роли индивидуального вклада полиморфизма исследуемых генов выявлены значимые ассоциации частот аллелей и частот носительства аллелей/генотипов генов DRB1 и CCR5 с эффективностью лечения ГА при сравнении больных PC с оптимальным ответом на терапию ГА с больными без оптимального ответа. Однако при сравнении «крайних» групп значимых различий в распределении аллелей/генотипов анализируемых полиморфных участков не наблюдали.

Анализ совместного вклада полиморфизма исследуемых генов-кандидатов при сравнении в группах больных PC с оптимальным ответом на терапию ГА с больными PC без оптимального ответа (R vs NR) позволил выявить ассоциацию носительства аллелей генов CCR5, DRB1, TNF, IFNG, TGFB1, IFNAR1 и IL 7RA (позитивную или негативную) с эффективностью ответа на лечение ГА. При этом, большинство выявленных аллельных сочетаний были негативно ассоциированы с оптимальным ответом на лечение ГА. Использование в исследовании подхода сравнение «крайних» групп для кросс-валидации результатов (сравнение R vs DNR), позволил подтвердить ассоциацию носительства аллелей генов CCR5, DRB1, IFNG, TGFB1, IFNAR1 и IL7RA (как позитивную, так и негативную) с оптимальным ответом на лечение ГА. Полученные данные

I I свидетельствуют об участии этих генов в формировании ответа полигенной природы на лечение иммуномодулирующим препаратом ГА.

Найдены сочетания аллелей носительство которых ассоциировано с различной эффективностью ответа больных РС на лечение ГА - биаллельное сочетание (ОЛВ1*4+1Ь7ВЛ*Т), позитивно ассоциированное с оптимальным ответом на лечение ГА, и четырехаллельное сочетание (ССЯ5*й+ВКВ1*\5+ТСРВ1*Т+1РШК1*С), негативно ассоциированное с ним. Эти сочетания являются высокоспецифичными и выдерживают пермутационный тест. Носительство выявленных композитных (составных) маркеров может быть определяющими при решении вопроса о выборе ГА в качестве препарата первой линии для лечения больных РС. Анализ природы кумулятивного эффекта аллелей ССУ?5*с1, /Жб./* 15, ГGFS^*T и 1РИАВ1*0 в составе аллельных сочетаний при сравнении «крайних» групп показал, что имеет место как аддитивный, так и эпистатический (нелинейный) характеры взаимодействия между исследуемыми аллелями при формировании ответа на лечение ГА.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Царёва, Екатерина Юрьевна, Москва

1. Compston A, Coles A: Multiple sclerosis. Lancet 359(9313), 1221 -1231 (2002).

2. Stadelmann С, Wegner С, Bruck W: Inflammation, demyelination, and degeneration -recent insights from MS pathology. Biochim Biophys Acta 1812(2), 275-282 (2011).

3. Lalive PH, Neuhaus O, Benkhoucha M, Burger D, Hohlfeld R, Zamvil SS, Weber MS: Glatiramer acetate in the treatment of multiple sclerosis: emerging concepts regarding its mechanism of action. CNS Drugs 25(5), 401-414 (2011).

4. Гусев ЕИ, Бойко АН: Современные подходы к использованию бета-интерферонов в лечении рассеянного склероза. Ж. Неврологии и психиатрии 11(54-59), (2000).

5. Pelletier D, Hafler DA: Fingolimod for multiple sclerosis. N Engl J Med 366(4), 339-347 (2012).

6. Härtung HP, Gonsette R, Konig N, Kwiecinski H, Guseo A, Morrissey SP, Krapf H, Zwingers T: Mitoxantrone in progressive multiple sclerosis: a placebo-controlled, double-blind, randomised, multicentre trial. Lancet 360(9350), 2018-2025 (2002).

7. Cohen BA, Rivera VM: PRISMS: the story of a pivotal clinical trial series in multiple sclerosis. Curr Med Res Opin 26(4), 827-838 (2010).

8. Sanford M, Lyseng-Williamson KA: Subcutaneous recombinant interferon-beta-la (Rebif(R)): a review of its use in the treatment of relapsing multiple sclerosis. Drugs 71(14), 1865-1891 (2011).

9. Kappos L, Radue EW, O'connor P, Polman C, Hohlfeld R, Calabresi P, Selmaj K, Agoropoulou C, Leyk M, Zhang-Auberson L, Burtin P: A placebo-controlled trial of oral fingolimod in relapsing multiple sclerosis. N Engl J Med 362(5), 387-401 (2010).

10. Castro-Borrero W, Graves D, Frohman TC, Flores AB, Hardeman P, Logan D, Orchard M, Greenberg B, Frohman EM: Current and emerging therapies in multiple sclerosis: a systematic review. Ther Adv Neurol Disord 5(4), 205-220 (2012).

11. Laing RE, Hess P, Shen Y, Wang J, Hu SX: The role and impact of SNPs in pharmacogenomics and personalized medicine. Curr Drug Metab 12(5), 460-486 (2011).

12. Vandenbroeck K, Urcelay E, Comabella M: IFN-beta pharmacogenomics in multiple sclerosis. Pharmacogenomics 11(8), 1137-1148 (2010).

13. Vandenbroeck K, Comabella M: Single-nucleotide polymorphisms in response to interferon-beta therapy in multiple sclerosis. J Interferon Cytokine Res 30(10), 727-732 (2010).

14. Gross R, Healy ВС, Cepok S, Chitnis T, Khoury SJ, Hemmer B, Weiner HL, Hafler DA, De Jager PL: Population structure and HLA DRB1 1501 in the response of subjects with multiple sclerosis to first-line treatments. J Neuroimmunol 233(1-2), 168-174 (2011).

15. Kalow W: Pharmacogenetics and personalised medicine. Fundam Clin Pharmacol 16(5), 337-342 (2002).

16. Alving AS, Kellermeyer RW, Tarlov A, Schrier S, Carson PE: Biochemical and genetic aspects of primaquine-sensitive hemolytic anemia. Ann Intern Med 49(2), 240-248 (1958).

17. King CR, Porche-Sorbet RM, Gage BF, Ridker PM, Renaud Y, Phillips MS, Eby C: Performance of commercial platforms for rapid genotyping of polymorphisms affecting warfarin dose. Am J Clin Pathol 129(6), 876-883 (2008).

18. Marin-Leblanc M, Perreault S, Bahroun I, Lapointe M, Mongrain I, Provost S, Turgeon J, Talajic M, Brugada R, Phillips M, Tardif JC, Dube MP: Validation of warfarin pharmacogenetic algorithms in clinical practice. Pharmacogenomics 13(1), 21-29 (2012).

19. Carlquist JF, Anderson JL: Using pharmacogenetics in real time to guide warfarin initiation: a clinician update. Circulation 124(23), 2554-2559 (2011).

20. Beaulieu M, De Denus S, Lachaine J: Systematic review of pharmacoeconomic studies of pharmacogenomic tests. Pharmacogenomics 11(11), 1573-1590 (2010).

21. Завалишин ИА, Захарова MH: Рассеянный склероз: основные аспекты патогенеза. В кн. «Рассеянный склероз и другие демиелинизирующие заболевания» под ред. Гусева ЕИ, Завалишина ИА, Бойко АН., Миклош, 60-75 (2004).

22. Гусев ЕИ, Бойко АН, Завалишин ИА, Быкова ОВ: Современная эпидемиология рассеянного склероза. В кн. «Рассеянный склероз и другие демиелинизирующие заболевания» под ред. Гусева ЕИ, Завалишина ИА, Бойко АН., Миклош, 8-29 (2004).

23. Bjartmar С, Wujek JR, Trapp BD: Axonal loss in the pathology of MS: consequences for understanding the progressive phase of the disease. J Neurol Sci 206(2), 165-171 (2003).

24. Howe CL: Immunological aspects of axon injury in multiple sclerosis. Curr Top Microbiol Immunol 318, 93-131 (2008).

25. Noseworthy JH, Lucchinetti C, Rodriguez M, Weinshenker BG: Multiple sclerosis. N Engl J Med 343(13), 938-952 (2000).

26. Tauber SC, Nau R, Gerber J: Systemic infections in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. Arch Physiol Biochem 113(3), 124-130 (2007).

27. Ascherio A, Munger KL: Environmental risk factors for multiple sclerosis. Part I: the role of infection. Ann Neurol 61(4), 288-299 (2007).

28. Ascherio A, Munger KL: Environmental risk factors for multiple sclerosis. Part II: Noninfectious factors. Ann Neurol 61(6), 504-513 (2007).

29. Dobson R, Meier UC, Giovannoni G: More to come: humoral immune responses in MS. J Neuroimmunol 240-241, 13-21 (2011).

30. Sosa RA, Forsthuber TG: The critical role of antigen-presentation-induced cytokine crosstalk in the central nervous system in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. J Interferon Cytokine Res 31(10), 753-768 (2011).

31. Кулакова ОГ, Бойко АН, Фаворова ОО: Роль цитокинов в патогенезе рассеянного склероза. В кн. «Рассеянный склероз и другие демиелинизирующие заболевания» под ред. Гусева ЕИ, Завалишина ИА, Бойко АН., Миклош, 75-92 (2004).

32. Заргарова ТАФ, О.О.: Исследование роли цитокинов при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите и рассеянном склерозе. Иммунология 5, 9-13 (1999).

33. Lovett-Racke АЕ, Yang Y, Racke МК: Thl versus Thl 7: are T cell cytokines relevant in multiple sclerosis? Biochim Biophys Acta 1812(2), 246-251 (2011).

34. Fletcher JM, Lonergan R, Costelloe L, Kinsella K, Moran B, O'farrelly C, Tubridy N, Mills KH: CD39+Foxp3+ regulatory T Cells suppress pathogenic Thl 7 cells and are impaired in multiple sclerosis. J Immunol 183(11), 7602-7610 (2009).

35. Hedegaard CJ, Krakauer M, Bendtzen K, Lund H, Sellebjerg F, Nielsen CH: T helper cell type 1 (Thl), Th2 and Thl7 responses to myelin basic protein and disease activity in multiple sclerosis. Immunology 125(2), 161-169 (2008).

36. Debruyne J, Philippe J, Dereuck J, Willems A, Leroux-Roels G: Relapse markers in multiple sclerosis: are in vitro cytokine production changes reflected by circulatory T-cell phenotype alterations? Mult Scler4(3), 193-197 (1998).

37. Soderstrom M, Hillert J, Link J, Navikas V, Fredrikson S, Link H: Expression of IFN-gamma, IL-4, and TGF-beta in multiple sclerosis in relation to HLA-Dw2 phenotype and stage of disease. Mult Scler 1(3), 173-180 (1995).

38. Dore-Duffy P, Washington R, Dragovic L: Expression of endothelial cell activation antigens in microvessels from patients with multiple sclerosis. Adv Exp Med Biol 331, 243-248 (1993).

39. Holman DW, Klein RS, Ransohoff RM: The blood-brain barrier, chemokines and multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta 1812(2), 220-230 (2011).

40. Simpson J, Rezaie P, Newcombe J, Cuzner ML, Male D, Woodroofe MN: Expression of the beta-chemokine receptors CCR2, CCR3 and CCR5 in multiple sclerosis central nervous system tissue. J Neuroimmunol 108(1-2), 192-200 (2000).

41. Balashov KE, Rottman JB, Weiner HL, Hancock WW: CCR5(+) and CXCR3(+) T cells are increased in multiple sclerosis and their ligands MIP-1 alpha and IP-10 are expressed in demyelinating brain lesions. Proc Natl Acad Sei U S A 96(12), 6873-6878 (1999).

42. Teleshova N, Pashenkov M, Huang YM, Soderstrom M, Kivisakk P, Kostulas V, Haglund M, Link H: Multiple sclerosis and optic neuritis: CCR5 and CXCR3 expressing T cells are augmented in blood and cerebrospinal fluid. J Neurol 249(6), 723-729 (2002).

43. Seamons A, Perchellet A, Goverman J: Immune tolerance to myelin proteins. Immunol Res 28(3), 201-221 (2003).

44. Moreno B, Jukes JP, Vergara-Irigaray N, Errea O, Villoslada P, Perry VH, Newman ТА: Systemic inflammation induces axon injury during brain inflammation. Ann Neurol 70(6), 932-942(2011).

45. Von Büdingen HC, Bar-Or A, Zamvil SS: В cells in multiple sclerosis: connecting the dots. Curr Opin Immunol 23(6), 713-720 (2011).

46. Dhib-Jalbut S: Pathogenesis of myelin/oligodendrocyte damage in multiple sclerosis. Neurology 68(22 Suppl 3), SI3-21; discussion S43-54 (2007).

47. Lassmann H, Bruck W, Lucchinetti CF: The immunopathology of multiple sclerosis: an overview. Brain Pathol 17(2), 210-218 (2007).

48. Teitelbaum D, Meshorer A, Hirshfeld Т, Arnon R, Sela M: Suppression of experimental allergic encephalomyelitis by a synthetic polypeptide. Eur J Immunol 1(4), 242-248 (1971).

49. Arnon R: The development of Cop 1 (Copaxone), an innovative drug for the treatment of multiple sclerosis: personal reflections. Immunol Lett 50(1-2), 1-15 (1996).

50. Miller A, Spada V, Beerkircher D, Kreitman RR: Long-term (up to 22 years), open-label, compassionate-use study of glatiramer acetate in relapsing-remitting multiple sclerosis. Mult Scler 14(4), 494-499 (2008).

51. Debouverie M, Moreau T, Lebrun C, Heinzlef O, Brudon F, Msihid J: A longitudinal observational study of a cohort of patients with relapsing-remitting multiple sclerosis treated with glatiramer acetate. Eur J Neurol 14(11), 1266-1274 (2007).

52. Duda PW, Schmied MC, Cook SL, Krieger JI, Hafler DA: Glatiramer acetate (Copaxone) induces degenerate, Th2-polarized immune responses in patients with multiple sclerosis. J Clin Invest 105(7), 967-976 (2000).

53. Vieira PL, Heystek HC, Wormmeester J, Wierenga EA, Kapsenberg ML: Glatiramer acetate (copolymer-1, Copaxone) promotes Th2 cell development and increased IL-10 production through modulation of dendritic cells. J Immunol 170(9), 4483-4488 (2003).

54. Chen M, Gran B, Costello K, Johnson K, Martin R, Dhib-Jalbut S: Glatiramer acetate induces a Th2-biased response and crossreactivity with myelin basic protein in patients with MS. Mult Scler 7(4), 209-219 (2001).

55. Weder C, Baltariu GM, Wyler KA, Gober HJ, Lienert C, Schluep M, Radu EW, De Libera G, Kappos L, Duda PW: Clinical and immune responses correlate in glatiramer acetate therapy of multiple sclerosis. Eur J Neurol 12(11), 869-878 (2005).

56. Teitelbaum D, Milo R, Arnon R, Sela M: Synthetic copolymer 1 inhibits human T-cell lines specific for myelin basic protein. ProcNatl Acad Sci U S A 89(1), 137-141 (1992).

57. Aharoni R, Kayhan B, Eilam R, Sela M, Arnon R: Glatiramer acetate-specific T cells in the brain express T helper 2/3 cytokines and brain-derived neurotrophic factor in situ. Proc Natl Acad Sci U S A 100(24), 14157-14162 (2003).

58. Dhib-Jalbut S, Chen M, Said A, Zhan M, Johnson KP, Martin R: Glatiramer acetate-reactive peripheral blood mononuclear cells respond to multiple myelin antigens with a Th2-biased phenotype. J Neuroimmunol 140(1-2), 163-171 (2003).

59. Valenzuela RM, Costello K, Chen M, Said A, Johnson KP, Dhib-Jalbut S: Clinical response to glatiramer acetate correlates with modulation of IFN-gamma and IL-4 expression in multiple sclerosis. Mult Scler 13(6), 754-762 (2007).

60. Aharoni R, Teitelbaum D, Sela M, Arnon R: Copolymer 1 induces T cells of the T helper type 2 that crossreact with myelin basic protein and suppress experimental autoimmune encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sei U S A 94(20), 10821-10826 (1997).

61. Jee Y, Liu R, Bai XF, Campagnolo DI, Shi FD, Vollmer TL: Do Th2 cells mediate the effects of glatiramer acetate in experimental autoimmune encephalomyelitis? Int Immunol 18(4), 537-544 (2006).

62. Hong J, Li N, Zhang X, Zheng B, Zhang JZ: Induction of CD4+CD25+ regulatory T cells by copolymer-I through activation of transcription factor Foxp3. Proc Natl Acad Sei U S A 102(18), 6449-6454 (2005).

63. Tennakoon DK, Mehta RS, Ortega SB, Bhoj V, Racke MK, Karandikar NJ: Therapeutic induction of regulatory, cytotoxic CD8+ T cells in multiple sclerosis. J Immunol 176(11), 71197129 (2006).

64. Kala M, Rhodes SN, Piao WH, Shi FD, Campagnolo DI, Vollmer TL: B cells from glatiramer acetate-treated mice suppress experimental autoimmune encephalomyelitis. Exp Neurol 221(1), 136-145 (2010).

65. Schwartz RH: T cell anergy. Annu Rev Immunol 21, 305-334 (2003).

66. Weber MS, Prod'homme T, Youssef S, Dunn SE, Rundle CD, Lee L, Patarroyo JC, Stuve O, Sobel RA, Steinman L, Zamvil SS: Type II monocytes modulate T cell-mediated central nervous system autoimmune disease. Nat Med 13(8), 935-943 (2007).

67. Kim HJ, Ifergan I, Antel JP, Seguin R, Duddy M, Lapierre Y, Jalili F, Bar-Or A: Type 2 monocyte and microglia differentiation mediated by glatiramer acetate therapy in patients with multiple sclerosis. J Immunol 172(11), 7144-7153 (2004).

68. Ziemssen T, Kumpfel T, Klinkert WE, Neuhaus O, Hohlfeld R: Glatiramer acetate-specific T-helper 1- and 2-type cell lines produce BDNF: implications for multiple sclerosis therapy. Brain-derived neurotrophic factor. Brain 125(Pt 11), 2381-2391 (2002).

69. Chen M, Valenzuela RM, Dhib-Jalbut S: Glatiramer acetate-reactive T cells produce brain-derived neurotrophic factor. J Neurol Sci 215(1-2), 37-44 (2003).

70. Kerschensteiner M, Stadelmann C, Dechant G, Wekerle H, Hohlfeld R: Neurotrophic cross-talk between the nervous and immune systems: implications for neurological diseases. Ann Neurol 53(3), 292-304 (2003).

71. Racke MK, Lovett-Racke AE, Karandikar NJ: The mechanism of action of glatiramer acetate treatment in multiple sclerosis. Neurology 74 Suppl 1, S25-30 (2010).

72. Teitelbaum D, Brenner T, Abramsky O, Aharoni R, Sela M, Anion R: Antibodies to glatiramer acetate do not interfere with its biological functions and therapeutic efficacy. Mult Scler 9(6), 592-599 (2003).

73. Brenner T, Arnon R, Sela M, Abramsky O, Meiner Z, Riven-Kreitman R, Tarcik N, Teitelbaum D: Humoral and cellular immune responses to Copolymer 1 in multiple sclerosis patients treated with Copaxone. J Neuroimmunol 115(1-2), 152-160 (2001).

74. Ure DR, Rodriguez M: Polyreactive antibodies to glatiramer acetate promote myelin repair in murine model of demyelinating disease. FASEB J 16(10), 1260-1262 (2002).

75. Paty DW, Li DK: Interferon beta-lb is effective in relapsing-remitting multiple sclerosis II. MRI analysis results of a multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled trial. 1993 classical article. Neurology 57(12 Suppl 5), S10-15 (2001).

76. Uze G, Schreiber G, Piehler J, Pellegrini S: The receptor of the type I interferon family. Curr Top Microbiol Immunol 316, 71-95 (2007).

77. Jiang H, Milo R, Swoveland P, Johnson KP, Panitch H, Dhib-Jalbut S: Interferon beta-lb reduces interferon gamma-induced antigen-presenting capacity of human glial and B cells. J Neuroimmunol 61(1), 17-25 (1995).

78. Racke MK, Ratts RB, Arredondo L, Perrin PJ, Lovett-Racke A: The role of costimulation in autoimmune demyelination. J Neuroimmunol 107(2), 205-215 (2000).

79. Kieseier BC: The mechanism of action of interferon-beta in relapsing multiple sclerosis. CNS Drugs 25(6), 491-502 (2011).

80. Mirandola SR, Hallal DE, Farias AS, Oliveira EC, Brandao CO, Ruocco HH, Damasceno BP, Santos LM: Interferon-beta modifies the peripheral blood cell cytokine secretion in patients with multiple sclerosis. Int Immunopharmacol 9(7-8), 824-830 (2009).

81. Revel M, Chebath J, Mangelus M, Harroch S, Moviglia GA: Antagonism of interferon beta on interferon gamma: inhibition of signal transduction in vitro and reduction of serum levels in multiple sclerosis patients. Mult Scler 1 Suppl 1, S5-11 (1995).

82. Chen M, Chen G, Nie H, Zhang X, Niu X, Zang YC, Skinner SM, Zhang JZ, Killian JM, Hong J: Regulatory effects of IFN-beta on production of osteopontin and IL-17 by CD4+ T Cells in MS. Eur J Immunol 39(9), 2525-2536 (2009).

83. Kozovska ME, Hong J, Zang YC, Li S, Rivera VM, Killian JM, Zhang JZ: Interferon beta induces T-helper 2 immune deviation in MS. Neurology 53(8), 1692-1697 (1999).

84. Saraste M, Irjala H, Airas L: Expansion of CD56Bright natural killer cells in the peripheral blood of multiple sclerosis patients treated with interferon-beta. Neurol Sci 28(3), 121-126 (2007).

85. Vandenbark AA, Huan J, Agotsch M, La Tocha D, Goelz S, Offner H, Lanker S, Bourdette D: Interferon-beta-la treatment increases CD56bright natural killer cells and

86. CD4+CD25+ Foxp3 expression in subjects with multiple sclerosis. J Neuroimmunol 215(1-2), 125-128(2009).

87. Martinez-Rodriguez JE, Lopez-Botet M, Munteis E, Rio J, Roquer J, Montalban X, Comabella M: Natural killer cell phenotype and clinical response to interferon-beta therapy in multiple sclerosis. Clin Immunol 141(3), 348-356 (2011).

88. Losy J, Michalowska-Wender G: In vivo effect of interferon-beta la on interleukin-12 and TGF-beta(l) cytokines in patients with relapsing-remitting multiple sclerosis. Acta "Neurol Scand 106(1), 44-46 (2002).

89. Lunemann JD, Aktas O, Gniadek P, Zschenderlein R, Zipp F: Downregulation of transforming growth factor-betal in interferon-beta la-treated MS patients. Neurology 57(6), 1132-1134(2001).

90. Viglietta V, Baecher-Allan C, Weiner HL, Hafler DA: Loss of functional suppression by CD4+CD25+ regulatory T cells in patients with multiple sclerosis. J Exp Med 199(7), 971-979 (2004).

91. Chen W, Jin W, Hardegen N, Lei KJ, Li L, Marinos N, Mcgrady G, Wahl SM: Conversion of peripheral CD4+CD25- naive T cells to CD4+CD25+ regulatory T cells by TGF-beta induction of transcription factor Foxp3. J Exp Med 198(12), 1875-1886 (2003).

92. Xystrakis E, Dejean AS, Bernard I, Druet P, Liblau R, Gonzalez-Dunia D, Saoudi A: Identification of a novel natural regulatory CD8 T-cell subset and analysis of its mechanism of regulation. Blood 104(10), 3294-3301 (2004).

93. Frisullo G, Nociti V, lorio R, Plantone D, Patanella AK, Tonali PA, Batocchi AP: CD8(+)Foxp3(+) T cells in peripheral blood of relapsing-remitting multiple sclerosis patients. Hum Immunol 71(5), 437-441 (2010).

94. Sharief MK, Semra YK: Upregulation of the inhibitor of apoptosis proteins in activated T lymphocytes from patients with multiple sclerosis. J Neuroimmunol 119(2), 350-357 (2001).

95. Sharief MK, Semra YK, Seidi OA, Zoukos Y: Interferon-beta therapy downregulates the anti-apoptosis protein FLIP in T cells from patients with multiple sclerosis. J Neuroimmunol 120(1-2), 199-207 (2001).

96. Waubant E, Goodkin D, Bostrom A, Bacchetti P, Hietpas J, Lindberg R, Leppert D: IFNbeta lowers MMP-9/TIMP-1 ratio, which predicts new enhancing lesions in patients with SPMS. Neurology 60(1), 52-57 (2003).

97. Stuve O, Chabot S, Jung SS, Williams G, Yong VW: Chemokine-enhanced migration of human peripheral blood mononuclear cells is antagonized by interferon beta-lb through an effect on matrix metalloproteinase-9. J Neuroimmunol 80(1-2), 38-46 (1997).

98. Zhao X, Nozell S, Ma Z, Benveniste EN: The interferon-stimulated gene factor 3 complex mediates the inhibitory effect of interferon-beta on matrix metalloproteinase-9 expression. FEBS J 274(24), 6456-6468 (2007).

99. Muraro PA, Leist T, Bielekova B, Mcfarland HF: VLA-4/CD49d downregulated on primed T lymphocytes during interferon-beta therapy in multiple sclerosis. J Neuroimmunol 111(1-2), 186-194 (2000).

100. Muraro PA, Liberati L, Bonanni L, Pantalone A, Caporale CM, Iarlori C, De Luca G, Farina D, Lugaresi A, Gambi D: Decreased integrin gene expression in patients with MS responding to interferon-beta treatment. J Neuroimmunol 150(1-2), 123-131 (2004).

101. Sallusto F, Lanzavecchia A: Understanding dendritic cell and T-lymphocyte traffic through the analysis of chemokine receptor expression. Immunol Rev 177, 134-140 (2000).

102. Dhib-Jalbut S, Marks S: Interferon-beta mechanisms of action in multiple sclerosis. Neurology 74 Suppl 1, SI7-24 (2010).

103. Boutros T, Croze E, Yong VW: Interferon-beta is a potent promoter of nerve growth factor production by astrocytes. J Neurochem 69(3), 939-946 (1997).

104. Biernacki K, Antel JP, Blain M, Narayanan S, Arnold DL, Prat A: Interferon beta promotes nerve growth factor secretion early in the course of multiple sclerosis. Arch Neurol 62(4), 563-568 (2005).

105. Chiba K, Adachi K: Discovery of fingolimod, the sphingosine 1-phosphate receptor modulator and its application for the therapy of multiple sclerosis. Future Med Chem 4(6), 771781 (2012).

106. Mehling M, Brinkmann V, Antel J, Bar-Or A, Goebels N, Vedrine C, Kristofic C, Kuhle J, Lindberg RL, Kappos L: FTY720 therapy exerts differential effects on T cell subsets in multiple sclerosis. Neurology 71(16), 1261-1267 (2008).

107. Mehling M, Lindberg R, Raulf F, Kuhle J, Hess C, Kappos L, Brinkmann V: Thl7 central memory T cells are reduced by FTY720 in patients with multiple sclerosis. Neurology 75(5), 403-410(2010).

108. Zhou PJ, Wang H, Shi GH, Wang XH, Shen ZJ, Xu D: Immunomodulatory drug FTY720 induces regulatory CD4(+)CD25(+) T cells in vitro. Clin Exp Immunol 157(1), 40-47 (2009).

109. Miron VE, Jung CG, Kim HJ, Kennedy TE, Soliven B, Antel JP: FTY720 modulates human oligodendrocyte progenitor process extension and survival. Ann Neurol 63(1), 61-71 (2008).

110. Yamagata K, Tagami M, Torii Y, Takenaga F, Tsumagari S, Itoh S, Yamori Y, Nara Y: Sphingosine 1-phosphate induces the production of glial cell line-derived neurotrophic factor and cellular proliferation in astrocytes. Glia 41(2), 199-206 (2003).

111. Edsall LC, Pirianov GG, Spiegel S: Involvement of sphingosine 1-phosphate in nerve growth factor-mediated neuronal survival and differentiation. J Neurosci 17(18), 6952-6960 (1997).

112. Harada J, Foley M, Moskowitz MA, Waeber C: Sphingosine-1-phosphate induces proliferation and morphological changes of neural progenitor cells. J Neurochem 88(4), 1026-1039(2004).

113. Sriram U, Barcellos LF, Villoslada P, Rio J, Baranzini SE, Caillier S, Stillman A, Hauser SL, Montalban X, Oksenberg JR: Pharmacogenomic analysis of interferon receptor polymorphisms in multiple sclerosis. Genes Immun 4(2), 147-152 (2003).

114. Fernandez O, Fernandez V, Mayorga C, Guerrero M, Leon A, Tamayo JA, Alonso A, Romero F, Leyva L, Luque G, De Ramon E: HLA class II and response to interferon-beta in multiple sclerosis. Acta Neurol Scand 112(6), 391-394 (2005).

115. Wergeland S, Beiske A, Nyland H, Hovdal H, Jensen D, Larsen JP, Maroy TH, Smievoll AI, Vedeler CA, Myhr KM: IL-10 promoter haplotype influence on interferon treatment response in multiple sclerosis. Eur J Neurol 12(3), 171-175 (2005).

116. Weinstock-Guttman B, Tamano-Blanco M, Bhasi K, Zivadinov R, Ramanathan M: Pharmacogenetics of MXA SNPs in interferon-beta treated multiple sclerosis patients. J Neuroimmunol 182(1-2), 236-239 (2007).

117. Kappos L, Weinshenker B, Pozzilli C, Thompson AJ, Dahlke F, Beckmann K, Polman C, Mcfarland H: Interferon beta-lb in secondary progressive MS: a combined analysis of the two trials. Neurology 63(10), 1779-1787 (2004).

118. Clanet M, Radue EW, Kappos L, Härtung HP, Hohlfeld R, Sandberg-Wollheim M, Kooijmans-Coutinho MF, Tsao EC, Sandrock AW: A randomized, double-blind, dose-comparison study of weekly interferon beta-la in relapsing MS. Neurology 59(10), 1507-1517 (2002).

119. Martinez A, De Las Heras V, Mas Fontao A, Bartolome M, De La Concha EG, Urcelay E, Arroyo R: An IFNG polymorphism is associated with interferon-beta response in Spanish MS patients. J Neuroimmunol 173(1-2), 196-199 (2006).

120. Cenit MD, Bianco-Kelly F, De Las Heras V, Bartoloihe M, De La Concha EG, Urcelay E, Arroyo R, Martinez A: Glypican 5 is an interferon-beta response gene: a replication study. Mult Scler 15(8), 913-917 (2009).

121. Guerrero AL, Tejero MA, Gutierrez F, Martin-Polo J, Iglesias F, Laherran E, Martin-Serradilla JI, Merino S: Influence of APOE gene polymorphisms on interferon-beta treatment response in multiple sclerosis. Neurologia 26(3), 137-142 (2011).

122. Platanias LC: Mechanisms of type-I- and type-II-interferon-mediated signalling. Nat Rev Immunol 5(5), 375-386 (2005).

123. Alvarez-Lafuente R, Garcia-Montojo M, De Las Heras V, Dominguez-Mozo MI, Bartolomé M, Arroyo R: CD46 expression and HHV-6 infection in patients with multiple sclerosis. Acta Neurol Scand 120(4), 246-250 (2009).

124. Astier AL, Meiffren G, Freeman S, Hafler DA: Alterations in CD46-mediated Trl regulatory T cells in patients with multiple sclerosis. J Clin Invest 116(12), 3252-3257 (2006)

125. Shusta EV, Zhu C, Boado RJ, Pardridge WM: Subtractive expression cloning reveals high expression of CD46 at the blood-brain barrier. J Neuropathol Exp Neurol 61(7), 597-604 (2002).

126. Tamura T, Yanai H, Savitsky D, Taniguchi T: The IRF family transcription factors in immunity and oncogenesis. Annu Rev Immunol 26, 535-584 (2008).

127. Favorov AV, Andreewski TV, Sudomoina MA, Favorova OO, Parmigiani G, Ochs MF: A Markov chain Monte Carlo technique for identification of combinations of allelic variants underlying complex diseases in humans. Genetics 171(4), 2113-2121 (2005).

128. Montalban X: Early treatment: PreCISe-ly what the patient needs. J Neurol Sci 287 Suppl 1, S2-6 (2009).

129. Фаворова OO, Кулакова ОГ, Бойко АН: Рассеянный склероз как полигенное заболевание: современное состояние проблемы. Генетика 46(3), 302-313 (2010).

130. Seboun Е, Robinson MA, Doolittle ТН, Ciulla ТА, Kindt TJ, Hauser SL: A susceptibility locus for multiple sclerosis is linked to the T cell receptor beta chain complex. Cell 57(7), 1095-1100(1989).

131. Dyment DA, Steckley JL, Morrison K, Wilier CJ, Cader MZ, Deluca GC, Sadovnick AD, Risch N, Ebers GC: TCR beta polymorphisms and multiple sclerosis. Genes Immun 5(5), 337342 (2004).

132. Barton A, Worthington J: Genetic susceptibility to rheumatoid arthritis: an emerging picture. Arthritis Rheum 61(10), 1441-1446 (2009).

133. Noble JA, Valdes AM: Genetics of the HLA region in the prediction of type 1 diabetes. Curr Diab Rep 11(6), 533-542 (2011).

134. Sadovnick AD: Genetic background of multiple sclerosis. Autoimmun Rev 11(3), 163166 (2012).

135. Marrosu MG, Murru MR, Costa G, Cucca F, Sotgiu S, Rosati G, Muntoni F: Multiple sclerosis in Sardinia is associated and in linkage disequilibrium with HLA-DR3 and -DR4 alleles. Am J Hum Genet 61(2), 454-457 (1997).

136. Weatherby SJ, Thomson W, Pepper L, Donn R, Worthington J, Mann CL, Davies MB, Fryer AA, Boggild MD, Young CA, Jones PW, Strange RC, Oilier WE, Hawkins CP: HLA-DRB1 and disease outcome in multiple sclerosis. J Neurol 248(4), 304-310 (2001).

137. Teige I, Liu Y, Issazadeh-Navikas S: IFN-beta inhibits T cell activation capacity of central nervous system APCs. J Immunol 177(6), 3542-3553 (2006).

138. Siveke JT, Hamann A: T helper 1 and T helper 2 cells respond differentially to chemokines. J Immunol 160(2), 550-554 (1998).

139. Aranami T, Yamamura T: Thl7 Cells and autoimmune encephalomyelitis (EAE/MS). Allergol Int 57(2), 115-120 (2008).

140. Favorova OO, Andreewski TV, Boiko AN, Sudomoina MA, Alekseenkov AD, Kulakova OG, Slanova AV, Gusev EI: The chemokine receptor CCR5 deletion mutation is associated with MS in HLA-DR4-positive Russians. Neurology 59(10), 1652-1655 (2002).

141. Nedwin GE, Naylor SL, Sakaguchi AY, Smith D, Jarrett-Nedwin J, Pennica D, Goeddel DV, Gray PW: Human lymphotoxin and tumor necrosis factor genes: structure, homology and chromosomal localization. Nucleic Acids Res 13(17), 6361-6373 (1985).

142. Dheen ST, Kaur C, Ling EA: Microglial activation and its implications in the brain diseases. Curr Med Chem 14(11), 1189-1197 (2007).

143. Smith JA, Das A, Ray SK, Banik NL: Role of pro-inflammatory cytokines released from microglia in neurodegenerative diseases. Brain Res Bull 87(1), 10-20 (2012).

144. He B, Navikas V, Lundahl J, Soderstrom M, Hillert J: Tumor necrosis factor alpha-308 alleles in multiple sclerosis and optic neuritis. J Neuroimmunol 63(2), 143-147 (1995).

145. Gray PW, Goeddel DV: Structure of the human immune interferon gene. Nature 298(5877), 859-863 (1982).

146. Pravica V, Asderakis A, Perrey C, Hajeer A, Sinnott PJ, Hutchinson IV: In vitro production of IFN-gamma correlates with CA repeat polymorphism in the human IFN-gamma gene. Eur J Immunogenet 26(1), 1-3 (1999).

147. Cavet J, Dickinson AM, Norden J, Taylor PR, Jackson GH, Middleton PG: Interferon-gamma and interleukin-6 gene polymorphisms associate with graft-versus-host disease in HLA-matched sibling bone marrow transplantation. Blood 98(5), 1594-1600 (2001)

148. Fujii D, Brissenden JE, Derynck R, Francke U: Transforming growth factor beta gene maps to human chromosome 19 long arm and to mouse chromosome 7. Somat Cell Mol Genet 12(3), 281-288 (1986).

149. Li MO, Wan YY, Sanjabi S, Robertson AK, Flavell RA: Transforming growth factor-beta regulation of immune responses. Annu Rev Immunol 24, 99-146 (2006).

150. Grainger DJ, Heathcote K, Chiano M, Snieder H, Kemp PR, Metcalfe JC, Carter ND, Spector TD: Genetic control of the circulating concentration of transforming growth factor type betal. Hum Mol Genet 8(1), 93-97 (1999).

151. Allan DS, Rybalov B, Awong G, Zuniga-Pflucker JC, Kopcow HD, Carlyle JR, Strominger JL: TGF-beta affects development and differentiation of human natural killer cell subsets. Eur J Immunol 40(8), 2289-2295 (2010).

152. Delvig AA, Lee JJ, Chrzanowska-Lightowlers ZM, Robinson JH: TGF-betal and IFN-gamma cross-regulate antigen presentation to CD4 T cells by macrophages. J Leukoc Biol 72(1), 163-166 (2002).

153. Chitnis T, Khoury SJ: Cytokine shifts and tolerance in experimental autoimmune encephalomyelitis. Immunol Res 28(3), 223-239 (2003).

154. Crow MK: Type I interferon in organ-targeted autoimmune and inflammatory diseases. Arthritis Res Ther 12 Suppl 1, S5 (2010).

155. Hardy MP, Owczarek CM, Jermiin LS, Ejdeback M, Hertzog PJ: Characterization of the type I interferon locus and identification of novel genes. Genomics 84(2), 331-345 (2004).

156. Sauna ZE, Kimchi-Sarfaty C, Ambudkar SV, Gottesman MM: Silent polymorphisms speak: how they affect pharmacogenomics and the treatment of cancer. Cancer Res 67(20), 9609-9612(2007).

157. Wang GJ, Yang P, Xie HG: Gene variants in noncoding regions and their possible consequences. Pharmacogenomics 7(2), 203-209 (2006).

158. Biron CA: Role of early cytokines, including alpha and beta interferons (IFN-alpha/beta), in innate and adaptive immune responses to viral infections. Semin Immunol 10(5), 383-390 (1998).

159. Dariavach P, Mattei MG, Golstein P, Lefranc MP: Human Ig superfamily CTLA-4 gene: chromosomal localization and identity of protein sequence between murine and human CTLA-4 cytoplasmic domains. Eur J Immunol 18(12), 1901-1905 (1988).

160. Zhernakova A, Eerligh P, Barrera P, Wesoly JZ, Huizinga TW, Roep BO, Wijmenga C, Koeleman BP: CTLA4 is differentially associated with autoimmune diseases in the Dutch population. Hum Genet 118(1), 58-66 (2005).

161. Ligers A, Xu C, Saarinen S, Hillert J, Olerup O: The CTLA-4 gene is associated with multiple sclerosis. J Neuroimmunol 97(1-2), 182-190 (1999).

162. Ligers A, Teleshova N, Masterman T, Huang WX, Hillert J: CTLA-4 gene expression is influenced by promoter and exon 1 polymorphisms. Genes Immun 2(3), 145-152 (2001).

163. Cizmarevic NS, Gasparovic I, Peterlin B, Sepcic J, Rudolf G, Kapovic M, Lavtar P, Ristic S: CTLA-4 +49 A/G gene polymorphism in Croatian and Slovenian multiple sclerosis patients. Int J Immunogenet 38(5), 419-426 (2011).k

164. Favorova 00, Favorov AV, Boiko AN, Andreewski TV, Sudomoina MA, Alekseenkov AD, Kulakova OG, Gusev EI, Parmigiani G, Ochs MF: Three allele combinations associated with multiple sclerosis. BMC Med Genet 7, 63 (2006).

165. Bagos PG, Karnaouri AC, Nikolopoulos GK, Hamodrakas SJ: No evidence for association of CTLA-4 gene polymorphisms with the risk of developing multiple sclerosis: a meta-analysis. Mult Scler 13(2), 156-168 (2007).

166. Андреевский ТВ, Судомоина MA, Гусев ЕИ, Бойко АН, Алексеенков АД, Фаворова ОО: Полиморфизм A/G в положении +49 первого экзона гена CTLA4 при рассеяном склерозе у русских. Мол.биол. 36(4), 643-648 (2002).

167. Bilinska М, Frydecka I, Noga L, Dobosz T, Zoledziewska M, Suwalska К, Tutak A, Pokryszko-Dragan A: Progression of multiple sclerosis is associated with exon 1 CTLA-4 gene polymorphism. Acta Neurol Scand 110(1), 67-71 (2004).

168. Fukazawa T, Yanagawa T, Kikuchi S, Yabe I, Sasaki H, Hamada T, Miyasaka K, Gomi K, Tashiro K: CTLA-4 gene polymorphism may modulate disease in Japanese multiple sclerosis patients. J Neurol Sci 171(1), 49-55 (1999).

169. Van Veen T, Crusius JB, Van Winsen L, Xia B, Barkhof F, Salvador Pena A, Polman CH, Uitdehaag BM: CTLA-4 and CD28 gene polymorphisms in susceptibility, clinical course and progression of multiple sclerosis. J Neuroimmunol 140(1-2), 188-193 (2003).

170. Maurer M, Ponath A, Kruse N, Rieckmann P: CTLA4 exon 1 dimorphism is associated with primary progressive multiple sclerosis. J Neuroimmunol 131(1-2), 213-215 (2002).

171. Lutfalla G, Gardiner K, Proudhon D, Vielh E, Uze G: The structure of the human interferon alpha/beta receptor gene. J Biol Chem 267(4), 2802-2809 (1992).

172. Lynch M, Baker E, Park LS, Sutherland GR, Goodwin RG: The interleukin-7 receptor gene is at 5pl3. Hum Genet 89(5), 566-568 (1992).

173. Haas J, Korporal M, Schwarz A, Balint B, Wildemann B: The interleukin-7 receptor alpha chain contributes to altered homeostasis of regulatory T cells in multiple sclerosis. Eur J Immunol 41(3), 845-853 (2011).

174. Von Freeden-Jeffry U, Vieira P, Lucian LA, Mcneil T, Burdach SE, Murray R: Lymphopenia in interleukin (IL)-7 gene-deleted mice identifies IL-7 as a nonredundant cytokine J Exp Med 181(4), 1519-1526 (1995).

175. Butte MJ, Haines C, Bonilla FA, Puck J: IL-7 receptor deficient SCID with a unique intronic mutation and post-transplant autoimmunity due to chronic GVHD. Clin Immunol 125(2), 159-164 (2007).

176. Sambrook J. Fritsch E, Maniatis T: Chapter 6: Preparation and analysis of eukaryotic genomic DNA. In- Molecular Cloning. Nolan С (Ed.). Cold Spring Harbor Lab Press, NY, USA, 6.4-6.5 (2001).

177. Маниатис T, Фрич Э, Сэмбрук Э: Молекулярное клонирование, стр. 162 (1984)

178. Sandford AJ, Pare PD: Direct PCR of small genomic DNA fragments from serum Biotechniques 23(5), 890-892 (1997).

179. Yusuf S, Peto R, Lewis J, Collins R, Sleight P: Beta blockade during and after myocardial infarction: an overview of the randomized trials. Prog Cardiovasc Dis 27(5), 335-371 (1985).

180. Imyanitov EN: Use of elderly tumor-free subjects as a "supercontrol" for cancer epidemiological studies: pros and cons. Mech Ageing Dev 130(1-2), 122-127 (2009).

181. Fridkis-Hareli M, Strominger JL: Promiscuous binding of synthetic copolymer 1 to purified HLA-DR molecules. J Immunol 160(9), 4386-4397 (1998).

182. Smith KJ, Pyrdol J, Gauthier L, Wiley DC, Wucherpfennig KW: Crystal structure of HLA-DR2 (DRA*0101, DRB1*1501) complexed with a peptide from human myelin basic protein. J Exp Med 188(8), 1511-1520(1998).

183. Hestvik AL, Skorstad G, Price DA, Vartdal F, Holmoy T: Multiple sclerosis: glatiramer acetate induces anti-inflammatory T cells in the cerebrospinal fluid. Mult Scler 14(6), 749-758 (2008).

184. Fugger L, Friese MA, Bell JI: From genes to function: the next challenge to understanding multiple sclerosis. Nat Rev Immunol 9(6), 408-417 (2009).

185. Huston DP, Liu YJ: Thymic stromal lymphopoietin:a potential therapeutic target for allergy and asthma. Curr Allergy Asthma Rep 6(5), 372-376 (2006).

186. Li MO, Sanjabi S, Flavell RA: Transforming growth factor-beta controls development, homeostasis, and tolerance of T cells by regulatory T cell-dependent and -independent mechanisms. Immunity 25(3), 455-471 (2006).

187. Marie JC, Liggitt D, Rudensky AY: Cellular mechanisms of fatal early-onset autoimmunity in mice with the T cell-specific targeting of transforming growth factor-beta receptor. Immunity 25(3), 441-454 (2006).

188. Paglinawan R, Malipiero U, Schlapbach R, Frei K, Reith W, Fontana A: TGFbeta directs gene expression of activated microglia to an anti-inflammatory phenotype strongly focusing on chemokine genes and cell migratory genes. Glia 44(3), 219-231 (2003).

189. Korn T, Bettelli E, Oukka M, Kuchroo VK: IL-17 and Thl7 Cells. Annu Rev Immunol 27, 485-517(2009).

Информация о работе

Царёва, Екатерина Юрьевна
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.03

Диссертация

Фармакогеномные исследования эффективности лечения рассеянного склероза иммуномодулирующими препаратами - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы