Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ генетических факторов предрасположенности к рассеянному склерозу

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Анализ генетических факторов предрасположенности к рассеянному склерозу"

1 I

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ РОССИЙСКИЙ КАРДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ КОМПЛЕКС ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ КАРДИОЛОГИИ

На прав? • "^кописи

"Го ОД 3 о Ым ш

СУДОМОИНА МАРИНА АНАТОЛЬЕВНА

АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К РАССЕЯННОМУ СКЛЕРОЗУ: ГЕНОМНОЕ ТИПИРОВАНИЕ АЛЛЕЛЕЙ ГЕНА ОКВ1 И МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ ПОВТОРОВ В ГЛАВНОМ КОМПЛЕКСЕ ГИСТОСОВМЕСТИМОСТИ

03.00.04 - Биохимия; 03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2000

Работа выполнена в отделе биотехнологии Института экспериментальной кардиологии РКНПК МЗ РФ.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор О.О. Фаворова Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В.В. Носиков кандидат медицинских наук А.Ю. Постнов

Ведущая организация: Медико-генетический центр РАМН

j. СО

Защита состоится « {5 » ЦЮНЯ_2000 года в ~ часов

на заседании диссертационного совета Д 074.22.02 в Институте экспериментальной кардиологии РКНПК МЗ РФ по адресу: 121552, Москва, 3-я Черепковская улица, 15 А.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института экспериментальной кардиологии РКНПК МЗ РФ

Автореферат разослан «/^>> _2000 года

Ученый секретарь {) / -1 -/ /г ') /'/

( ({J . 1 ^ ! ! ,

диссертационного совета, ' ~

кандидат биологических наук ж ' '— ^ ^ Венгерова

/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы, цель и задачи работы. Рассеянный склероз (РС) - хроническое демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы. Основная роль в разрушении миелина принадлежит воспалительному процессу, связанному с аутоиммунными реакциями. Поражая преимущественно молодых работоспособных людей, РС представляет собой серьезную медицинскую и социальную проблему. Хотя этиология РС остается неясной, очевидно, что он относится к комплексным заболеваниям, развитие которых зависит и от генетической предрасположенности человека, и от воздействия внешней среды. Семейные исследования свидетельствуют о преимущественной роли генетических факторов в формировании восприимчивости к РС и о полигенной природе заболевания.

Для идентификации генов, определяющих предрасположенность к РС, в настоящее время используют две основные стратегии: выяснение роли того или иного гена-кандидата, выбранного исходя из возможной роли его белкового продукта в этиологии и патогенезе заболевания, и полное геномное сканирование с использованием панели анонимных генетических маркеров для идентификации областей хромосом, вовлеченных в развитие заболевания. При полном геномном сканировании локусы, сцепленные с РС, обнаружены на тринадцати хромосомах, а анализ генов-кандидатов добавил к этому списку еще три хромосомы. Выявление отдельных генов, определяющих предрасположенность к РС, осложняется существованием этнических различий в восприимчивости к РС и возможной генетической гетерогенностью анализируемых популяций и семей, которая может определяться как этнической неоднородностью, так и разной этиологией клинических форм РС. С большой степенью вероятности можно считать доказанным вовлечение в развитие РС генов главного комплекса гистосовместимости на хромосоме 6р (рис. 1), которые являются основными генами иммунного ответа человека (в первую очередь генов области Н1А класса П), а также каких-то неидентифицированных генов на хромосомах 5р и 17я. Помимо генов НЬА, в ряде работ показана роль в развитии РС генов, которые кодируют два других компонента тримолскулярных комплексов, участвующих в представлении аутоантигена при РС, - Т-клеточный рецептор и основный белок миелина.

В качестве генов-кандидатов для РС рассматриваются также и другие гены, вовлеченные в аутоиммунные реакции - в первую очередь гены цитокинов и их рецепторов. В области НЬА класса Ш главного комплекса гистосовместимости локализован кластер генов факторов некроза опухолей (ФНО), который содержит гены фактора некроза опухолей и лимфотоксинов - ключевых цитокинов при развитии РС (рис. 1).

Целью настоящей работы является анализ генетической предрасположенности к PC в русской популяции в области главного комплекса гистосовместмости. Россия относится к странам с умеренным риском PC. На 150 ООО ООО населения приходится довольно значительное число больных PC (не менее 50 ООО). Однако, для русской популяции до наших исследований не проводили геномного типирования больных PC в области HLA класса И, где локализованы основные гены-кандидаты для этого заболевания и выявлено существование этнических различий в связанных с PC аллелях. Геномного типирования в области HLA класса III, в том числе в локусе ФНО, для русской популяции больных PC также не проводилось.

Для выявления возможных факторов генетической предрасположенности к PC в русской популяции в области главного комплекса гистосовместимости ставились следующие конкретные задачи:

- геномное типирование аллелей генов DRB1 и DPB1 HLA класса II в ДНК из крови больных PC и здоровых доноров из центральной России, анализ ассоциации аллелей этих генов с PC методом «случай - контроль», а также семейный анализ сцепления аллелей гена DRB1 с PC;

- геномное типирование у больных PC и здоровых доноров из центральной России аллельных вариантов высокоинформативных полиморфных микросателлитов TNFa и TNFb в локусе ФНО в области HLA масса III и анализ ассоциации этих аллелей с PC методом «случай - контроль»;

- анализ частоты фенотипических сочетаний некоторых аллелей рассматриваемых .токусов у больных PC и здоровых доноров для оценки их неравновесного сцепления и совместного вклада в развитие генетической предрасположенности к PC в русской популяции.

Необходимой предпосылкой подобной работы является правильная постановка диагноза неврологического заболевания при формировании группы больных PC. Отбор больных с диагнозом "достоверный PC" и последующие клинические наблюдения осуществлялись на кафедре неврологии и нейрохирургии РГМУ д. м. н., профессором А.Н. Бойко. Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые проведено геномное типирование в области главного комплекса гистосовместимости для русской популяции больных PC. Двумя независимыми методами, что исключает возможность артефактов вследствие неоднородности популяции, выявлена ассоциация PC у русских с группой аллелей гена DRBI, которая соответствует серологической специфичности DR2(15). Наблюдаемые значения частот встречаемости аллелей этого гена у больных PC свидетельствуют об этнических различиях с другими исследованными популяциями европеоидов. Впервые проведенный в русской популяции семейный анализ показал

сцеплснис DR2( 15) с PC по крайней мерс для больных с возрастом начала заболевания до J 5 лет. Впервые показана слабая ассоциация РС у русских с аллслем DPB1*0401 гена DPB1, не зависимая от ассоциации с- DR2(15). Впервые проведенный при РС анализ микросатсллитных повторов в локусе фактора некроза опухолей показал ассоциацию аллеля TNFa9 с повышенным риском РС, не зависимую от DR2(15), и ассоциацию аллеля TNFa7 с пониженным риском РС, проявляющуюся только у ОЯ2(15)-позитивных индивидов. Подобная "сочетанная" ассоциация РС с двумя маркереми, не находящимися в неравновесии по сцеплению, ранее описана не была. Величина относительного риска развития РС при одновременном присутствии у индивида аллелей DR2(]5) и TNFa9 превышает 23; насколько нам известно, это самое высокое из описанных значение относительного риска для РС в зависимости от генетических факторов.

Обнаружение генов, локализованных в области главного комплекса гистосовмеетимости и вовлеченных в развитие патологических процессов при РС, полезно для дальнейшего изучения этиологии РС и особенностей его клинических форм, а также для формирования групп риска развития РС. Выявление синергических взаимодействий между маркерами заболевания расширяет возможности прогнозирования. Так, определенные фототипические комбинации маркеров DRB1 и ФНОа обладают высокой предсказательной силой при оценке риска развития РС.

Структура работы. Диссертация состоит из следующих разделов: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты и обсуждение, Выводы, Список литературы; она изложена на ¿^-^страницах, включает рисунков и /'^таблиц. Список литературы содержит £2.2- источника.

Апробация работы. Материалы работы были представлены на III конференции Международного союза биохимиков и молекулярных биологов "Молекулярное узнавание" (Сингапур, 1995), X, XI и XIII Европейских конгрессах по рассеянному склерозу (Афины, Греция, 1994; Иерусалим, Израиль, 1995; Копенгаген, Дания, 1997), VII Международном неврологическом симпозиуме "Рассеянный склероз" (Берген, Норвегия, 1996), Российском конгрессе «Новые технологии в неврологии и нейрохирургии на рубеже тысячелетий» (Ступино, 1999), IV заседании Европейского нейро-офтальмологического общества (Иерусалим, Израиль, 1999), межлабораторном семинаре Института экспериментальной кардиологии РКНПК МЗ РФ (2000).

--

Шп DQ

HLA класса II HLA класса III

HLA класса I

"ЛТ(3 ФНО JTTa

_5'

(АС). TNFa

(TC)k TNFb

Рис. 1. Схематическое строение главного комплекса гистосовместимости, локализованного на коротком плече хромосомы 6 ( ЕШ ~ анализируемые в работе локусы )

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Использованные реактивы. В работе использованы Taq-полимераза, Т4-полинуклеотидкиназа и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты АО "Силекс М" (Москва); протеиназа К ("Boehringer"); нейлоновая мембрана Hybond N ("Amersham"). Остатьные реактивы были получены от фирм "Merck", "Sigma" или использовались отечественные квалификации осч.

Формирование групп больных PC и здоровых контролен. В анализируемую групп}' больных включено в общей сложности 258 человек (159 женщин и 99 мужчин) с достоверным диагнозом PC по критериям Позера (Poser С.М. et al, 1984), проходящих лечение в Первой городской клинической больнице Москвы. Из них 250 человек болели ремиттирующей формой заболевания, а 8 - первично прогрессирующей. Средний возраст больных - 36,4 лет, средняя длительность заболевания - 8,5 года. Все больные проживают в центральном регионе России, из них около 80% в Москве и около 10% - в Московской области. У всех больных оба родителя были русскими. Контрольную группу составили 258 здоровых по медицинским показаниям добровольцев той же этнической группы (165 женщин и 93 мужчины) из числа студентов лечебного факультета РГМУ и персонала неврологических отделений Первой городской клинической больницы (всего 133 человека),

а также доноров пункта псрелпвания крови ВОНЦ РАМН (125 человек). Средний возраст в контрольной группе - 33,1 лет. Все индивиды сообщали необходимую информацию, заполняя детальную унифицированную эпидемиологическую анкету (Boiko A.N. et al, 1995). Детскую группу, выделенную из общей выборки больных, составили 56 неродственных детей (32 девочки и 24 мальчика) русской национальности с клинически достоверным PC согласно критериям Позера (Poser С.М. et al, 1984). Средний возраст начала заболевания 11,70±0,45 (от 4 до 15) лет, все дети страдали ремитгирующей формой PC. 56 случаев детского PC были спорадическими. Две девочки страдали семейным PC (в обоих случаях были поражены матери). В семейный анализ включены данные генотипирования локуса DRB1 у 39 детей (22 девочек и 17 мальчиков со средним возрастом начала PC 11,48+0,62) и их 78 родителей.

Выделение геномной ДНК m крови. Для получения ДНК необходимой чистоты и достаточной молекулярного веса использовали модифицированный метод выделения ДНК из крови с помощью высаливания белков хлоридом натрия (Twelfth International Histocompatibility Workshop, 1996).

Геномное типнропанне локуса HLA-ORB1. Для общего типирования гена DRB1 использовали разработанную в Институте иммунологии МЗ РФ модификацию (Alexeev L. et al., 1995) стандартного метода сиквенс-слецифических праймеров (Sequence Specific Primers). Проводили двухэтапную полимеразную цепную реакцию (ПЦР), позволяющую амплифнцировать все известные аллели гена DRBI и разделить их на группы, соответствующие серологическим специфичностям otDRI до DR 16.

На первом этапе проводили стандартную общую амплификацию гена DRB1 с использованием пары праймеров, рекомендованной XI Международным рабочим совещанием по исследованию HLA (1991).

На втором этапе продукт первой ПЦР амплифицировали паратлельно с тремя групп-специфическими смесями праймеров, которые позволяют получать дискретные и достаточно хорошо (не менее чем на 10%) различающиеся по длине продукты, соответствующие отдельным группам аллелей гена DRB1. Генотип индивида устанавливали по набору амплифицированных фрагментов ДНК определенной длины при электрофоретическом разделении продуктов ПЦР в 12%-ном полиакриламидном геле (Alexeev L. et al., 1995). Образцы ДНК людей, несущих аллели DR2, анализировали далее для их разделения на группы, соответствующие специфичностям DR2(15) и DR2(16). Продукт первой стандартной реакции общей амплификации гена DRB1 для каждого ОЯ2-положительного индивида подвергали ПЦР порознь с парами праймеров для аллелей DR2(15) или DR2(16).

Присутствие продуктов ПЦР в каждой ш смесей анализировали электрофорезом в 2%-ном агарозном геле.

Геномное типирование локуса HLA-DPB1. Гснотипирование локуса DPBI HLA II класса проводили методом амплификации участка этого гена с помощью ПЦР с последующей гибридизацией продуктов амплификации с аллель-специфическими олигонуклеотидами как описано в рекомендациях XI Международного рабочего совещания по исследованию HLA (1991). Генотипы определяли по комбинации радиоавтографических сигналов при помощи компьютерной программы, разработанной в Институте трансплантационной иммунологии (Осло, Норвегия).

Анализ полиморфизма длины фрагментов локуса факторов некроза опухолей, содержащего микросателлиты TNFa и TNFb. Аллельный полиморфизм локуса ФИО определяли с помощью ПЦР по длине тандемных микросатсллитных динуклеотидных повторов (CA/TG)n и (CT/A.G)k, или микросателлитов, расположенных рядом с генами ФИО (Ncdospasov S.A., et al, 1991). Геномную ДНК амплифицировали в два этапа. Первую ПЦР проводили с парой внешних праймеров с использованием в качестве матрицы геномной ДНК. Затем аликвоты продуктов первой реакции реамплифицировали с добавлением двух вн}тренних праймеров и a-[!2P]dATP. Продукты второй амплификации обрабатывали фрагментом Кленова ДНК полимеразы I (1 ед.акт./З мкл. продукта амплификации) в присутствии 100 мкМ dATP для удаления концевого включения меченого dATP, затем смешивали с равным объемом фор.мамид-содержащего стоп-раствора и денатурировали 5 мин. при 95°С. Длину меченых фрагментов ДНК определяли высокоразрешающим электрофорезом в 10% денатурирующем полиакриламидном геле с последующим радиоавтографированием.

Статистический анализ. У больных PC и здоровых лиц определяли аллельную частоту, частоту встречаемости (фенотипическую частоту) анализируемых групп аллелей (специфичностей) (Svejgaard A., Ryder L.P. 1994) и частоту генотипов. Значение вероятности (р) оценивали с помощью анализа с поправкой по Йстсу, а при малой выборке использовали точный тест Фишера. Достоверным считали различие частот встречаемости отдельных групп аллелей или частот генотипов у больных и здоровых при значении ¿><0.05. При необходимости значение р умножали на число рассматриваемых аллелей или генотипов (т.е. проводили коррекцию на число сравнений). Силу ассоциаций выражали в значениях относительного риска (ОР), рассчитанного как относительный шанс (odds ratio) по методу Вульфа. При равенстве одной из сравниваемых величин нулю для расчета ОР и его интервала достоверности использовали метод Вульфа в модификации Холдейна (Svejgaard A., Ryder L.P., 1994).

Отклонение наблюдаемых частот генотипов от равновесия Харди-Вайнбсрга проверяли по критериям yj и G-статистики с помощью программы RxC на основе алгоритма, описанного в (Roff D.A., Bcntzen P., 1989).

При проведении анализа ассоциаций на семейном материале согласно методу AFBAC (affccted family-based method) (Falk C.T. et al, 1987), в каждой семье с больным потомком 4 родительских аллеля DRB1 делили на 2 категории - перенесенные и не перенесенные больному ребенку. Не перенесенные больным детям аллели составили контрольную группу, и связанный с гаплотипом относительный риск (haplotypc relative risk, HRR) определяли по (Thomson G, 1995). В случаях семейного PC не перенесенные гаплотипы больных родителей были исключены го контрольной группы. Анализ сцепления PC с DR2(15) проводили с помощью теста на неравновесие по переносу (transmission/disequilibrium test, TDT), основываясь на оценке числа случаев передачи аллеля DR2(15) от здоровых гетерозиготных родителей больным детям (Spielnian RS. et al, 1993), с помощью анализа х2 с поправкой по Иетсу, и достоверным считали различие числа случаев переноса при значении/><0.05.

Для всех описанных расчетов использовали стандартные статистические программы INSTAT, SPSS и EPI-INFO.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов DRB1 у больных PC русской национальности m центрального региона России и в контрольной группе

Биологическая функция HLA-молекул класса II состоит в представлении на поверхности антиген-презентирлтощих клеток пептидных фрагментов процсссированного антигена рецепторам Т-клеток CD8+ фенотипа, что определяет иммунологическую реакцию индивида на данный антнген. Хорошо известно, что HLA-молскулы класса II играют центральную роль в регуляции иммунного ответа. Как уже указывалось, при PC разрушение белково-липндной оболочки аксонов, по всей вероятности, происходит по аутоиммунному механизму (Бойко А.Н., Фаворова 0.0., 1995). Существенное значение для запуска и поддержания демиелинизирующего процесса при PC имеют выраженность и длительность транзиторного повышения уровней экспрессии молекул HLA класса II на эндотелии сосудов мозга, астроцитах и микроглии. Неудивительно, что высокополиморфные гены HLA- класса II стали рассматривать в качестве главных кандидатов на роль генов, определяющих предрасположенность к PC. Более того, область хромосомы 6р21, где локализованы гены HLA (рис. 1), являтся единственным локусом, совпадающим при проведении полного геномного поиска разными группами исследователей (Ebers G.C., Dyment D.A., 1998). Связь

РС с генами Н1А показана практически во всех проведенных на сегодняшний день популяционных исследованиях. При этом в сил)' неравновесия по сцеплению аллели генов ВЯ и ОСЗ составляют ассоциированный с РС «расширенный», или протяженный гаплотип, с которым, в свою очередь, могут быть сцеплены аллели других генов ГКГ. В большинстве исследований прослеживается связь РС с аллелями гена йЯВ!, соответствующими серологической специфичности ОЯ2(15). В то же время показано существование этнических различий между аллелями генов НЬА класса И, ассоциированными с РС, что определяет потребность в анализе ассоциации РС с аллелями ША в различных популяциях.

Нами проведено геномное типирование ДНК в области гена ВЯВ1 НЬА класса II для 245 больных РС русской национальности из центрального региона России и для контрольной группы из 258 здоровых доноров той же этнической группы и из того же региона. Контрольная группа соответствует группе больных также по среднему возрасту и соотношению полов. Данные по частоте встречаемости 1б-ти групп аллелей гена ОКВ1 представлены в табл. 1.

Таблица 1. Частоты встречаемости групп аллелей гена НЬА-/)/?й/ у 245 больных РС и 258

здоровых индивидов*

группы аллелей гена DRB1 (специфичности HLA-DR) число (%) индивидов относительный риск значение Р

больные РС N=245 здоровые N=258

DR1 43 (17,6) 35(13,6) >0,05

DR2 107 (43,7) 82 (31,8) 1,7 0,008

DR2(15) 100 (40,8) 63 (24,4) 2,1 0,0001

DR2(16) 9 (3,7) 23 (8,9) >0,05

DR3 50 (20,4) 53 (20,5) >0,05

DR4 59(24,1) 47(18,2) >0,05

DR5 50 (20,4) 66 (25,6) >0,05

DR5(11) 41 (16,7) 56(21,7) >0,05

DR5(12) 9(3,7) 17 (6,6) >0,05

DR6 45 (18,4) 68 (26,4) >0,05

DR6(13) 25 (10,2) 37(14,3) >0,05

DR6(14) 21 (8,6) 31 (12,0) >0,05

DR7 60 (24,5) 60 (23,3) >0,05

DR8 23 (9,4) 22 (8,5) >0,05

DR9 2 (0,8) 1 (0,4) >0,05

DR10 2 (0,8) 2 (0,8) >0,05

* При расчетах принимались как гомозиготы и учитывались один раз:

для 0112 - сочетания Ш*2(15) - 0112(15), БЯ2(15) - ОЯ2(16) и 0112(16) - 01*2(16); для 0И5 - сочетания ОИ5(11) - ОИ5(11), ОЯ5(11) - Ш15(12) и ОЯ5(12) - ОЯ5(12); для ОЯб - сочетания 01*6(13) - ОЯ6(13), 0116(13) - 0116(14) и ЭЯ6(14) - ОЯ6(14).

В последнее время, с развитием методов генотипирования, позволяющих определять

все или почти все известные в настоящее время аллели отдельных генов Н1А, многие

исследователи предпочитают анализировать частоты аллелей, а не частоты их встречаемости

(фенотипические частоты). Это увеличивает мощность определения значимости фактора риска, поскольку в расчет принимается генов вместо N индивидов. Однако, поскольку восприимчивость к заболеванию определяется как правило не генами, а их продуктами, подобное сравнение может привести к артефактам. Следуя рекомендациям Свейгаарда и Ридера (8уе)£аап1 А., 11у<1ег 1..Р., 1994), мы анализировали экспериментальные данные на фенотипическом 5ровне, сравнивая частоты встречаемости отдельных групп аллелей у больных и здоровых. При анализе частоты встречаемости принимается в расчет число носителей того или иного аллеля (специфичности) из N лиц независимо от того, являются ли они гомозигными или гетерозиготными по этому признаку.

Выявлено достоверное повышение частоты встречаемости у больных РС специфичности и особенно ее подтипа 0112(15), соответствующего группе аллелей ВЯВ1* 1501 - 1503: специфичность БЯ2 несут 43,7% больных в сравнении с 31,8% здоровых, а 0112(15) - 40,8% больных в сравнении с 24,4% здоровых (табл. 1). Значенияр в этом случае не нуждаются в коррекции на число сравнений, поскольку связь РС с 0112 и ОЯ2(15) была выявлена ранее у других европеоидов (Согарз1оп О.А.Э. е! а1, 1995). При сравнении частоты встречаемости ЭЯ2(15) у больных и здоровых р достигает чрезвычайно достоверной величины 0,0001, тогда как уровень относительного риска невелик (ОР=2,1).

В отличие от полученных нами данных, в северо- и западноевропейских популяциях значения ОР для ОИ2(15) составляют обычно 4-5, что соответствует частоте встречаемости 01*2(15) у 60-65% больных РС и примерно у 30% здоровых (01егир О., НШеП Д, 1991). Иными словами, частота встречаемости 0112(15) в этих популяциях по сравнению с русскими (см. табл. 1) существенно выше у больных РС и мало отличается в контрольной группе. Таким образом, можно констатировать существование этнических различий в ассоциации РС с ВЯ2(15) по крайней мере на количественном уровне.

Для остальных специфичностей 011, кроме ОЯ2 и 0112(15), различия в частоте встречаемости у больных РС и здоровых не достигли статистически достоверного уровня (табл. 1). Анализ, проведенный только для лиц, не несущих 0112(15), также не выявил достоверных ассоциациий РС с другими специфичностями 011.

Известно, что аллели генов НЬА фенотипически проявляются кодоминантно. Поэтому представляло интерес оценить относительный риск заболевания у гомо- и гетерозигот по специфичности 0112(15), связанной с предрасположенностью к РС. В табл. 2 представлено сравнение у всех анализированных больных РС и здоровых индивидов частот гомозигот 01£2(15)ЛЖ2(15), гетерозигот 0112(15)/не-0К2(15) и частот остальных генотипов, объединенных в третью группу.

Таблица 2. Частоты генотипов I \L.\-DRI1I у 245 больных РС и 258 здоровых индивидов*

генотипы НЬА-БК число (%) индивидов относительный риск значение Р

больные РС N=245 здоровые N=258

0К2(15)/01*2(15) 15(6,1) 4(1,6) 4,1 0,009

ОК2(15)/не-ОК2(15) 90 (36,7) 59 (22,9) 2,0 0,0009

не-0£12(15)/ не-ОЯ2(15) 140(57,1) 195 (75,6) 0,5 0,00002

*Частоты аллелей 0112(15) у больных - 24,5%, у здоровых- 15,1%.

Распределение генотипов у больных и здоровых подчиняется закону Харди -Вайнберга. Относительный риск РС для гомозигот 0112(15)/1Ж2(15) достигает величины 4,1. При этом значение р равно 0,009, и при введении поправки на число сравнений (хЗ) остается в пределах достоверности. Двукратное превышение величины относительного риска у гомозигот 0112(15)/ Б112(15) по сравнению с ОЯ2(15)-содсржащими гстсрозиготами свидетельствует об отчетливом эффекте дозы аллсля, что хорошо согласуется с кодоминантным фенотипическим проявлением аллелей генов НЬА.

Для проведении семейного анализа сцепления РС с генами ГКГ нам необходимо было собрать достаточное количество образцов ДНК больных РС и их родителей. При этом вследствие неблагоприятной демографической ситуации в России получить образцы крови обоих родителей больного достаточно сложно, и в большинстве случаев это было возможно только для больных РС детского возраста. Некоторые авторы (СЬехп А. е! а1, 1997) выделяют "детский РС" (с началом заболевания в возрасте до 15-16 лет) как отдельную форму заболевания. Поэтому прежде чем перейти к анализу в имеющейся выборке семей, мы оценили распределение аллелей гена НЬА-.ОЛВ/ у больных «детским» и «взрослым» РС. Для этого общая группа из 245 больных РС была разбита на две подгруппы, состоящие из 56 больных с началом заболевания до 15 лет и 189 больных - с началом заболевания после 15 лет (табл. 3, графы 1,2). В табл. 3 анализировали частоты аллелей, а не частоты их встречаемости, поскольку в ней представлены также результаты анализа по методу АИВАС (графы 4,5), основанного на сравнении частоты перенесенных и не перенесенных больным детям родительских аллелей (см. ниже). По сравнению со здоровыми индивидами (табл. 3, графа 3) у больных РС детей (графа 1), как и у взрослых (графа 2), наблюдается достоверно более высокая частота специфичности РЯ2 и особенно ее подтипа В1?2(15). Достоверной ассоциации РС с другими специфичностями НЬА-7ЖВ7 в исследуемых подгруппах не обнаружено.

Таблица 3. Частоты аллелей (%) гена НЬА-ДДВ/ у 56 больных РС детского возраста, 189 взрослых больных РС, 258 здоровых доноров и 78 родителей больных РС детей._

Специфично- больные РС здоровые родители больных РС детей

сти HLA-DR доноры N -78

(группы дети взрослые 2Ы-516 перенесенные не перенесенные

аллелей гена 2N=112 2N-378 больным детям больным детям

DRB1) аллели аллели

N-78 N=76*

1 2 3 4 5

число (%) аллелей

DR1 10 (8,9) 36 (9,5) 46 (8,9) 7(9) 6(7,9)

DR2 32 (28,6) 98 (25,9) 102(19,8) 26 (33,3) 9(11,8)

DR2(15) 29 (25,9) 91 (24,1) 78 (15,1) 23 (29,5) 5 (6,6)

DR2(16) 3(2,7) 7(1,8) 24(4,7) 3 (3,8) 4(5,3)

DR3 10 (8,9) 50 (13,2) 58 (11,2) 4(5,1) 7 (9,2)

DR4 14(12,5) 49 (13,0) 60(11,6) 8(10,3) 11 (14,5)

DR5 15(13,4) 40 (10,6) 84 (16,3) 12(15,4) 13(17,1)

DR6 12(10,7) 29 (7,7) 71 (13,8) 6(7,7) 10(13,2)

DR6(13) 8(7,1) 17(4,5) 40 (7,8) 4 (5,2) 7 (9,2)

DR6(14) 4(3,6) 12 (3,2) 31 (6,0) 2 (2,6) 3 (3,9)

DR7 12(10,7) 54 (14,3) 70(13,6) 11(14,1) 12(15,7)

DR8 4 (3,6) 21 (5,6) 22 (4,3) 4(5,1) 5 (6,6)

DR9 0 (0,0) 2 (0,5) 1 (0,2) 0(0,0) 2 (2,6)

DR10 0 (0,0) 2 (0,5) 2 (0,4) 0 (0,0) 1(1,3)

*не перенесенные гаплотипы двух матерей, больных РС, были исключены из контрольной группы

Значения относительного риска и величины р, характеризующие связь «детского» и «взрослого» РС с группами аллелей 0112(15), представлены в табл. 4. Видно, что значения относительного риска «детского» и <®зрослого» РС близки. Ассоциация «детского» РС с ОЯ2(15) была высокодостовсрной, несмотря на относительно небольшой размер подгруппы больных РС детского возраста. Достоверной разницы между частотами 01*2 и 0112(15) в «детской» и «взрослой» подгруппах больных РС не обнаружено. Для этих подгрупп анализировали также распределение генотипов ОЯ2(15)ЮК2(15), ВК2(15)/не-М12(15) и не-0к2(15)/не-0112(15), как это делали для общей группы из 245 больных РС (см. табл. 2). В обеих подгруппах распределение генотипов подчиняется закону Харди-Вайнберга, а значения относительного риска для гомозигот Б112(15)ЛЖ2(15) примерно в два раза превышают таковые для гетерозигот В112(15)/не-ОК2(15), не различаясь достоверно между подгруппами «детского» и «взрослого» РС и общей группой. Эти результаты свидетельствуют об отсутствии существенных генетических особенностей в области ОЯВ], связанных с ранним развитием РС, и дают нам право, анализируя аллели этого гена в семьях больных РС детского возраста, с большой степенью вероятности распрострашпъ полученные выводы на больных РС всех возрастов.

Таблица 4. Сравнение частоты аллелей гена НХА ОКБ 1, соответствующих специфичности НЬА-СГ12 и ее подтипу 0112(15), в исследуемых группах (подгруппах) больных РС, их родителей и здоровых независимых доноров.___

специфичности HLA-DR (группы аллелей гена DRB1) сравниваемые группы или подгруппы относительный риск значение Р

больные РС детского возраста против здоровых индивидов (1 ув. 3) 1,6 0,04

взрослые больные РС против здоровых индивидов (2 ув. 3) 1,4 0,04

DR2 больные РС детского возраста против взрослых больных РС (1 у5. 2) >0,05

перенесенные больным РС детям родительские аллели против неперенесенных аллелей (4 ув. 5) 3,7 0,003

не перенесенные больным РС детям родительские аллели против здоровых индивидов (5 уь-. 3) >0,05

больные РС детского возраста против здоровых индивидов (1 уб. 3) 2,0 0,008

взрослые больные РС против здоровых индивидов (2 ув. 3) 1,8 0,001

DR2(15) больные РС детского возраста против взрослых больных РС (1 уб. 2) >0,05

перенесенные больным РС детям родительские аллели против неперенесенных аллелей (4 уб. 5) 5,9 0,0005

не перенесенные больным РС детям родительские аллели против здоровых индивидов (5 уб. 3) >0,05

Известно, что ассоциации между заболеванием и генетическим маркером, выявленные при анализе методом "случай - контроль", могут быть артефактом, возникающим вследствие неоднородной структуры исследуемых популяций. Чтобы избежать возможной популяционной неоднородности между больными PC и контрольной группой, мы провели генотипирование обоих родителей в 39 семьях с больным PC ребенком и использовали не перенесенные больным детям аллели гена DRB1 в качестве контрольной "популяции" по методу AFBAC (Falk С.Т. et al, 1987). Сравнение групп перенесенных и не перенесенных больным детям аллелей гена DRB1 потдвердило результаты популяционного анализа

методом «случай - контроль» и также показало высокодостоверную ассоциацию PC с DR2 и DR2(15) при отсутствии других ассоциаций (табл. 3, 4). Не выявлено достоверной разницы в распределении аллелей гена DRB1 в контрольной группе, составленной из не перенесенных больным детям аллелей, и в группе здоровых доноров (табл. 4). Можно заключить, что обнаруженная нами ассоциация PC с аллелями DRB1* 1501 - 1503 не обусловлена неоднородностью популяции, по крайней мере для больных с началом заболевания до 15 лет.

Анализ сцепления DR2(15) с PC проводили в семьях, состоящих из двух здоровых родителей и больного ребенка, с помощью теста на неравновесие по переносу (transmission/disequilibrium test - IDT) (Thomson G, 1995). Этот метод сочетает достоинства анализа сцепления (оценка сегрегации в семьях) и популяционного подхода (не требует наличия нескольких больных членов семей). Оценивали число случаев передачи DR2(15) от здоровых родителей, являющихся гетерозиготами DR2(15)/hc-DR2(15), больным детям. Из 37 имеющихся семей с двумя здоровыми родителями в 16 семьях один из родителей был гетерозиготным по DR2( 15), в 4 семьях - оба; всего анализировали 20 семей, в которых было 24 гетерозиготных родителя, несуших аллели DR2(15) (12 матерей и 12 отцов). В табл. 5 представлено распределение 80 родительских аллелей в этих семьях в зависимости от того, были ли они перенесены больному PC ребенку. Как видно из данных табл. 5, DR2(15)+ гетерозиготные родители 21 раз переносили больному PC ребенку аллели DR2(15) и только три раза - альтернативные аллели. Отличия, наблюдающиеся в сравнении с переносом от родителей прочих, т.е. hc-DR2(15) аллелей, - они были 19 раз перенесены и 37 раз не

2

перенесены - высоко достоверны; % td равен 17,2, а р равно 0,00002.

Таблица 5. Тест на неравновесие по переносу DR2(15) в 20 семьях с одним больным

родительские аллели DR2(15) He-DR2(15) *2td значение р

перенесенные больному PC ребенку 21 19 17,2 0,00002

не перенесенные больному PC ребенку 3 37

Полученные методом TDT данные доказывают наличие сцепления между группой аллелей HLA- DRBJ*l50l - 1503 и PC в русской популяции, по крайней мере для больных с возрастом начала заболевания до 15 лет. Таким образом, обнаруженная нами в популяционных исследованиях ассоциация PC с этими аллелями обусловлена их сцеплением. С помощью теста TDT были показаны ко-сегрегация и сцепление PC с DR2(15) в семьях из Исландии (Haegert DG et al, 1996) и США (Haines J.L. et al, 1998), a также с DR3 и DR4 в семьях с о.Сардиния (Marrosu M.G. et al, 1997).

Принимая во внимание центральную роль белков НЬА класса II в регуляции опосредованного Т-клетками иммунного ответа, полученные данные дают основание рассматривать ВЛВ1 в качестве одного из генов предрасположенности к РС.

Сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов ОРВ1

Область ОР расположена в главном комплексе гистосовместимости слева от 011 (рис. 1) и экспрессируется среди генов НЬА класса II в наименьшей степени. Несмотря на некоторую противоречивость данных, к настоящему времени складывается достаточно отчетливая картина, что область ОР находится за пределами ассоциированного с РС «расширенного» гаплотипа, включающего аллели О К и 0(3 (Яой М.Р. й а1, 1991). Очевидно, у западноевропейских европеоидов риск РС не связан с какими-либо аллелями из группы ОР (р1^ег Ь. й а1, 1990; Е^о\тс11 А.В. и а1., 1990). Однако исследования в других этнических группах указывают на возможную связь РС с ОР-аллелями в популяциях с низкой частотой встречаемости ОЯ2-гаплотипа (Оскксг ДЛУ е1 а1, 1993; 1ю Н. е1 а1, 1998). Имеются также данные о возможном НЬА-ОР-рсстрикгированном ответе на некоторые детерминанты протеолипидного белка миелина (Уи М. е1 а!, 1998). Таким образом, гены ОР остаются в числе кандидатов на роль генов, участвующих в развитии РС.

В настоящее время для локуса Н1.А-ОРВ1 описано более двухсот аллелей. При генстипировании 123 больных с возрастом начала заболевания после 15 лет и 120 здоровых индивидов из русской популяции Центральной России нами выявлено более 40 аллелей Ш.А-О/'В/. Не выявлены аллели, которые встречались бы только у больных РС или только у доноров. Аллели с частотой встречаемости более 5% представлены в табл. 6.

Сильных ассоциаций РС с аллелями НЬА-ВРВ1 не выявлено. Отмечена тенденция к повышению частоты аллелей ОРВ1*0301, БРВ1*0401 и БРВ1*2401 у больных РС, тогда как у доноров несколько выше частота аллелей ОРВ1*1301, ОРВ1*3301 и ОРВ1*4701. Наиболее частый аллель ОРВ1 *0401 был выявлен у 56,9% больных РС и у 42,5% контролен. Статистический анализ свидетельствует о слабом, но достоверном повышении частоты его встречаемости у больных РС с ОР—1,8; р=0,03. Распределение генотипов - гомозигот ОРВ1 *0401ЛЭРВ1 *0401, гетерозигот, содержащих ОРВ1*0401 (ОРВ1*0401/ не-ОРВ1*0401), и носителей всех не-ОРВ1*0401 аллелей - в группах больных РС и здоровых подчиняется закону Харди-Вайнберга. Повышение частоты гомозигот ОРВ1*0401Л)РВ1*0401 у больных в рассматриваемой выборке не достигает достоверного уровня.

Таблица 6. Частота встречаемости аллелей \lLk-DPBl у 123 взрослых больных РС и 120 здоровых индивидов. Приведены расчеты только для аллелей, частота встречаемости которых превышала 5% в группе больных или контролен.___

НЬА-ОРВ1 аллели число (%) индивидов относительный риск значение Р

больные РС N=123 здоровые N-120

ОРВ1*ОЮ1 7 (5,7) 7 (5,8) >0,05

ОРВ1*0201 11 (8,9) 14(11,7) >0,05

ОРВ1*0301 21(17) 16(13,3) >0,05

БРВ1*0401 70 (56,9) 51 (42,5) 1,8 0,03

ОРВ1*0402 16(13) 15(12,5) >0.05

ОРВ1*1301 3 (2,4) 9(7,5) >0,05

ОРВ1*2301 16(13) 15(12,5) >0,05

ОРВ 1*2401 8 (6,5) 4 (3,3) >0,05

ОРВ1*3201 8 (6,5) 9(7,5) >0,05

ОРВ1*3301 15 (12,2) 25 (20,8) >0,05

ОРВ1*3901 8 (6,5) 11 (9,2) >0,05

ОРВ1*4001 12 (9,8) 14(11,7) >0,05

ОРВ1*4701 3 (2,4) 6(5) >0,05

ОРВ1*5Ю1 6 (4,9) 6(5) >0,05

В соответствии с результатами предыдущего раздела, у больных РС в данной выборке также была достоверно повышена частота встречаемости аллелей группы 0112(15), выявленных у 54 больных РС (43,9%) и у 29 доноров (24,2%) - ОР.=-2,5; р-0,002. Анализ частоты встречаемости аллелей НЬА-/>А8/, проведенный в группах больных РС и здоровых, не несущих 0112(15), подтвердил ассоциацию РС с ОРВ1*0401 и не выявил достоверных ассоциациий с дрзгими аллелями ОРВ1.

Мы анализировали возможную связь с РС сочетаний аллелей 0112(15) с ОРВ1*0401 согласно рекомендациям (8уе;^аагс1 А., 11ус1ег Ь.Р., 1994), разработанным для сравнения ассоциации двух генетических факторов с заболеванием. При разбиении анализируемых групп на подгруппы индивидов, несущих четыре возможные комбинации аллелей 0112(15) и ОРВ1*0401, и использовании в качестве группы сравнения лиц, не имеющих ни ОЯ2(15), ни ОРВ1*0401, видно, что ассоциация ОРВ1*0401 с РС не зависит от 01*2(15). Сцепления между 01*2(15) и ОРВ1*0401 не было обнаружено ни у больных РС, ни в контрольной группе (табл. 7). Следовательно, аллель ОРВ 1*0401 может вносить собственный вклад в формирование риска РС в русской популяции.

Как уже говорилось выше, пока не установлено окончательно, входит ли локус НЬА-ОРВ1 в состав так называемого расширенного 0Я-0<5 гаплотнпа. В нашем исследовании мы не выявили отчетливого сцепления между ОР и ОЯ среди русских. Впервые в этой этнической группе отмечена слабая ассоциация РС с аллелем ОРВ 1*0401, проявляющаяся независимо от связи с 0112(15) - основным фактором риска РС в большинстве этнических групп.

Таблица 7. Частота фототипических сочетаний DR2(15) и DPB1*0401 у 123 взрослых больных PC и 120 здоровых контролей._

DR2(15) DP*0401 больные PC здоровые относительный риск значение р

+ + 30 14 + + VS.-- 4.0 0.001

+ - 24 15 + - VS.- - 3.0 0.011

- + 40 37 - + vs.- -2.0 0.044

- - 29 54

тесты на наличие неравновесия по сцеплению переменные таблицы 2x2

ассоциация DR2(15) с ОРВ1*0401 \ больных РС + + + - - + р>0,05

ассоциация DR2(15) с ОРВ 1*0401 V здоровых + + + - - -t- -- р> 0.05

Ассоциация аллелей DP с PC исследуется относительно недавно. Первыми были данные о связи PC с DPw4 у жителей южной части Швеции (Odum N. et al, 1988), полученные групп-епецифическим методом генотипирования. В последующем те же авторы исследовали распределение данного аллеля у японцев: у здоровых из контрольной группы частота встречаемости DPw4 оказалась значительно ниже, чем у жителей Северной Европы (16,5% и 72,3%, соответственно), но у 34 больных PC японской национальности частота экспрессии DPw4 увеличивалась до 35,3% (Odum N. et al, 1989). В нескольких исследованиях не удалось подтвердить связь PC с каким-либо аллелями из группы DP в разных этнических группах (Begovich А.В. et al, 1990; Fugger L. et al, 1990). Предполагалось, что слабая связь аллеля DP*040I с PC может быть вторична по отношению к ассоциации с ОЯ2-гаплотипом. Мы не получили данных в пользу сцепления между областями DP и DR ни у больных PC, ни у представителей контрольной группы из Центральных регионов России, а слабая ассоциация PC с DPB 1*0401 не зависела от присутствия DR2-ran.TOTHna.

Анализ полиморфизма длины фрагментов локуса факторов некроза опухолей, содержащих »шкросателлиты TNFa п TNFb

Еще одной областью главного комплекса гистоеовместимости, которая может содержать гены-кандидаты для PC, является кластер генов факторов некроза опухолей (ФИО). Известно, что ФИО является одним из ключевых цитокинов при развитиии PC, обладающим цитолитическими и иммуномодулирующими свойствами (Заргарова Т.А., Фаворова О.О., 1999). Показана способность ФНО непосредственно участвовать в демиелинизации in vitro (Selmaj R., Raine С, 1989), повышать уровни экспрессии молекул адгезии и ГКГ, а также стимулировать продукцию других активирующих цитокинов (Tracey K.J. et al, 1994).

Важную независимую роль в патогенезе PC отводят, наряду с ФИО, лимфотоксину а (ЛТа) (Заргарова Т.А., Фаворова О.О., 1999). Очевидно, что гены ФНО и .77 являются кандидатами на роль генов, влияющих на восприимчивость к PC. Локус ФНО, содержащий три гена цитокинов - ФНО, ЛТа и ЛТР, расположен в области класса III HLA в коротком плече 6-й хромосомы (рис. 1).

В настоящей работе мы анализировали у больных PC аллельный полиморфмзм локуса ФНО, определяя длины тандемных микросателлитных динухлеотидных повторов (CA/TG)n и (CT/AG)k (Nedospasov S.A., et al, 1991). Эти микросателлиты, обозначенные TNFa и TNFb, расположены на расстоянии 21 нуклеотидного остатка друг от друга по цепи ДНК; определение их длины позволяет выявить 13 и 7 аллелей, соответственно (табл. 8).

Таблица 8. Варианты аллелей TNFa и TNFb.

аллели TNFa динуклеотидные повторы аллели TNFb динуклкеотидные повторы

TNFal (CA/TG)6 TNFbl (CT/AG)8.5

TNFa2 (CA/TG)7 TNFb2 (CT/AG),

TNFa3 (CA7TG)8 TNFb3 (CT/AG),,5

TNFa4 (CAVTG), TNFb4 (CT/AG),о

TNFa5 (CA/TG)i0 TNFb5 (CT/AG)io,5

TNFa6 (CA/TG)n TNFbft (CT/AG) ii

TNFa7 (CA/TG), ■> TNFb7 (CT/AG), ,.5

TNFa8 (CA/TG)|3

TNFa9 (CA/TG)i4

TNFa 10 (CA/TG),5

TNFal 1 (CA/TG)i6

TNFal 2 (CA/TG)i7

TNFal 3 (CA/TG), 8

Частоты встречаемости аллелей ТЫРа и ТЫРЬ у 202 больных РС с началом заболевания после 15 лет и 195 здоровых индивидов приведены в табл. 9. У больных РС и здоровых доноров выявлено 12 аллельных вариантов ТОТа и 5 вариантов Т№Ь. Распределение генотипов Т№а и ТОТЬ как у больных РС, так и у здоровых доноров подчиняется закону Харди-Вайнберга. Распределение аллелей ТОТЬ не различалось у больных и здоровых (табл. 9). Сравнение частот встречаемости аллелей ТОТа у больных РС и здоровых .лиц показало статистически достоверные различия для Т№а7 и Т№а9. Т№а9 присутствует у 16,3 % больных и 2,1 % контролен, в то время как ТОТа7 обнаружен у 11,9 % больных и у 27,7 % контролей. Полученные данные позволяют рассматривать Т№а9 как аллель, положительно ассоциированный с РС (ОР - 9,3; р = 0,0001), или аллель предрасположенности, тогда как аллель ТОТа7 отрицательно ассоциирован с РС и условно может быть назван протективным аллелем (ОР = 0,4; р = 0,002) (табл. 9).

Таблица 9. Частоты встречаемости аллелей микросателлитов TNFa и TNFb у 202 взрослых

больных PC и 195 здоровых индивидов

аллели TNFa и TNFb число (%) индивидов относительный риск значение Р

больные PC N=202 здоровые N=195

TNFal 8(4) 3 (1,5) >0,05

TNFa2 73 (36,1) 69 (35,4) >0,05

TNFa3 8(4) 10(5,1) >0,05

TNFa4 21 (10,4) 17 (8,7) >0,05

TNFa5 20 (9,9) 18 (9,2) >0,05

TNFa6 55 (27,2) 35 (17,9) >0,05

TNFa7 24 (11,9) 54 (27,7) 0,4 0,002*

TNFaS 2(1) 2(1) >0,05

TNFa9 33 (16,3) 4 (2,1) 9,3 0,0001*

TNFal 0 60 (29,7) 67 (34,4) >0,05

TNFal 1 58 (28,7) 64 (32,8) >0,05

TNFa 12 0 (0,0) 0 (0,0) >0,05

TNFal 3 12(5,9) 9 (4,6) >0,05

TNFbl 64 (31,7) 46 (23,6) >0,05

TNFb2 0 (0,0) 0 (0,0) >0,05

TNFb3 58 (28,7) 62 (31,8) >0,05

TNFb4 126 (62,4) 122 (62,2) >0,05

TNFb5 74 (36,6) 71 (36,4) >0,05

TNFb6 0 (0,0) 0 (0,0) >0,05

TNFb7 9 (4,5) 3(1,5) >0,05

*р с коррекцией на число сравнений

Гомозигот Т№а9/Т№а9 в исследуемой выборке не обнаружено. Относительный риск РС для гомозигот "ШЕа7/Т№а7 составляет 0,2 по сравнению с 0,4 для гетсрозигот ТМРа7/не-Т№а7, однако пограничные значения р для этих гомозигот (0,05) не позволяют делать на основании этого сопоставления каких-либо заключений (табл. 10).

Таблица 10. Частоты генотипов Т№а у 202 больных РС с возрастом начата заболевания

после 15 лет и 195 здоровых индивидов*.

генотипы TNFa число (%) индивидов относительный риск значение Р

больные PC N=202 здоровые N=195

TNFa7/ TNFa7 1 (0,5) 6(3,1) 0,2 0,05

TNFa7/He-TNFa7 23(11,4) 48 (24,6) 0,4 0,0009

ne-TNFa7/ He-TNFa7 178 (88,1) 141 (72,3) 2.8 0,0001

*Частоты аллелей TNFa7 у больных - 6,2%, у здоровых - 15,4%.

Исследования связи РС с полиморфными участками в локусе ФИО проводились для нескольких европейских популяций. Ассоциация РС с аллелями микросателлитных повторов TNFa была выявлена у шведов (Sandberg-Wollheim М. ct al, 1995) и ирландцев (Kirk C.W. et al, 1997). Однако сравнительный анализ данных, полученных разными групппами исследователей, затрудняется в силу нескольких причин. Во-первых, показано

существование достаточно сильных этнических различий в распределении!! аллелей TNFa и TNFb (Недоспасов С.А. и др., 1993). Во-вторых, локус ФНО расположен внутри ГКГ, и до сих пор не пол\чено однозначного ответа на вопрос, насколько сильно сцепление полиморфных аллелей этого локуса с аллелями HLA, и является ли ассоциация PC с аллелями локуса ФНО первичной, вторичной или дополнительной по отношению к ассоциации с аллелями HLA. Для ряда популяций европеоидов показано, что связанный с PC «расширенный» гаплотип HLA DRB1*1501,DQA1*0102,DQB1*0602,A3,B7 (DR15,A3,B7) включает микросателлитные атлели TNFal 1, TNFb4 (или TNFb6), (Epplen С. Et al, 1997; Gallagher G. et al, 1997). Другой связанный в некоторых популяциях с PC гаплотип, DR3,A1,B8, включает TNFa2 и TNFb3 (Gallagher G. et al, 1997). Для рассматриваемой в нашей работе выборки наблюдалась ассоциация TNFal 1 с DR2(15) у больных PC (р = 0,00001) и в контрольной группе (р = 0,008), а также ассоциация TNFa2 с DR3 у больных PC (р — 0,00001) и в контрольной группе (р = 0,00009), однако частота встречаемости аллелей TNFal 1 и TNFa2 у больных PC и здоровых не отличалась (табл. 9).

Таблица 11. Частоты встречаемости аллелей микросателлитов ТОТа и ТЫРЬ у 110 больных РС и 140 здоровых индивидов, не несущих аллелей специфичности РЯ2(15)_

аллели TNFa и TNFb число (%) индивидов относительный риск значение Р*

больные PC N=110 здоровые N=140

TNFal 4 (3,6) 2 (1,4) >0,05

TNFa2 43 (39,1) 52 (37,1) >0,05

TNFa3 4 (3,6) 7 (5,0) >0,05

TNFa4 15 (13,6) 11 (7,9) >0,05

TNFa5 13 (11,8) 15(10,7) >0,05

TNFa6 29 (26,4) 31 (22,1) >0,05

TNFa7 19 (17,3) 34 (24,3) >0,05

TNFa8 1 (0,9) 2(1,4) >0,05

TNFa9 17 (15,5) 3 (2,1) 8,4 0,004

TNFalO 39 (35,5) 47 (33,6) >0,05

TNFa 11 И (10) 39 (27,9) 0,3 0,01

TNFal 2 0 (0,0) 0 (0,0) >0,05

TNFal3 8 (7,3) 8 (5,7) >0,05

TNFbl 39 (35,5) 34 (24,3) >0,05

TNFb2 0 (0,0) 0 (0,0) >0,05

TNFb3 29 (26,4) 48 (34,3) >0,05

TNFb4 60 (54,.5) 81 (57,9) >0,05

TNFb5 47 (42,7) 54 (38,6) >0,05

TNFb6 0 (0,0) 0 (0,0) >0,05

TNFb7 6(5,5) 1 (0,7) >0,05

* р с коррекцией на число сравнений

Анализ, проведенный только для лиц, не несущих 01*2(15) (табл. 11), показал положительную ассоциацию с ТЫРа9, как и в общей группе, но не выявил достоверной ассоциации с Т№а7. Кроме того, в 0112(15)-негативной группе наблюдается достоверное снижение частоты встречаемости аллеля Т№а11 у больных (отрицательная ассоциация с ОР = 0,3 и р = 0,01), что, вероятнее всего, можно объяснить неравновесием по сцеплению между ОЯ2(15) и Т№а11.

Анализ возможной связи с РС сочетаний аллелей ЭЯ2(15) с ТЫЕа7 и с Т№а9 согласно (Svejgaard А., Ryder Ь.Р. 1994) хорошо согласуется с данными табл. 11 - отсутствием ассоциации РС с ТИРа7 в ОК2(15)-негативной группе при сохранении ассоциации с ТЫРа9. В нашем исследовании положительная ассоциация РС с аллелями ТЫРа9 и ОЯ2(15) проявляется независимо (табл. 12), причем совместное их присутствие определяет весьма высокий риск развития РС у индивида (относительный риск 23,5, р = 0,00002). Насколько нам известно, это самая высокая описанная величина относительного риска для РС в зависимости от генетических факторов.

Таблица 12. Частота фснотипических сочетаний ПГ*2( 15) и ТКГа9 у 189 больных РС и 181

ОЫ2(15) ТОТаЭ больные РС здоровые относительный риск значение р

+ + 15 0 + + Ув,- - 23,5 0,00002

+ ■ 64 41 + - Ув.- - 2,3 0,0007

- + 17 3 - + УБ,- - 8,3 0,0003

- - 93 137

тесты на наличие неравновесия по сцеплению переменные таблицы 2x2

ассоциация ОК2(15) с ТОТа9 у больных РС + + +- - + р>0,05

ассоциация ОИ2(15) с Т№а9 у здоровых + + + - - + р>0,05

Таблица 13. Частота фенотипических сочетаний О[Я2( 15) и ТГ\Та7 у 189 больных РС и Шздорового._

ОЯ2(15) ПЧРа7 больные РС здоровые относительный риск значение р

+ 4- 3 19 + + У5,- -0,2 0,007

+ - 76 22 + - Ув.- - 4,0 0,00001

- +- 19 34 - + Ув,- - р>0,05

- - 91 106

тесты на наличие неравновесия по сцеплению переменные таблицы 2x2

ассоциация Р1*2(15) с Т№а7 у больных РС + + + - - + р>0,05

ассоциация 0112(15) с ТЫГа7 у здоровых + + + - - + р> 0.05

Отрицательная связь TNFa7 с PC в рассматриваемой нами выборке, в полном соответствии с данными табл. 11, наблюдается исключительно у ОШ5-позитивных индивидов, что может указывать на сочетанный (комбинированный) вклад этих факторов в определение восприимчивости к РС (табл. 13).

Таким образом, на основании наших данных можно констатировать, что наблюдаемые в русской популяции ассоциации РС с маркерами в области локуса ФНО не являются следствием неравновесия по сцеплению последних с генами HLA. Предположение о том, что полиморфизм некоторых участков локуса ФНО имеет самостоятельное значение для развития РС, высказывались и другими авторами. Семейные исследования показати, что сцепление микросателлитных гаплогипов TNFabc с РС-ассоциированными "расширенными" гаплотипами HLA у европеоидов не всегда строго соблюдается, что может указывать на более высокую частоту мутаций в локусе ФНО по сравнению с другими локусами HLA (García-Merino A. et al, 1996). Некоторые гаплотипы TNFabc встречаются в составе только одного "расширенного" гаплотипа, в то время как другие входят в состав нескольких. Для популяции Северной Ирландии показана независимая от DR15 ассоциация РС с микросателлитным гаплотипом TNFal0b3dl30, при этом ассоциация с TNFalO подтвердилась и при семейном анализе методом TDT (Kirk C.W. et al, 1997). Опубликовано также сообщение о возможной сочетанной, т.е. не ограничивающейся только неравновесным сцеплением, ассоциации DR2(15) nTNFall с PC в датской популяции (Sandberg-Wollheim М. et al, 1995).

При PC обнаруживается повышение продукции ФНО в крови и спинномозговой жидкости, а также в очагах PC (Benvenuto R. et al, 1991; Rieckmann Р. et al, 1994). Ранее были опубликованы сообщения об изменениях в продукции ФНО и ЛТ у индивидов с определенными комбинациями аллелей HLA класса II и аллелей микросателлитного повтора TNFa (Jacob С.О. et al, 1990; Pociot F. et al, 1993), однако для PC подобных результатов, насколько нам известно, не описано. Очевидно, что микросателлиты TNFa могут быть маркерами РС вследствие их сцепления с генами-кандидатами ФНО и JITa Кроме того, не исключена возможность присутствия в этом локусе какого-либо другого гена, известного или неизвестного, вовлеченного в формирование предрасположенности к РС и находящегося в сцеплении с изучаемыми микросателлитами.

ВЫВОДЫ

1. Проведено геномное типирование групп аллелей гена DRBI HLA класса II у 245 больных рассеянным склерозом (PC) и 258 здоровых индивидов русской национальности из центральной России. Показано достоверное повышение частоты встречаемости у больных PC группы аллелей DR2(15), включающей аллели ДЛВ/*1501 - 1503. Распределение аллелей гена DRBI сохранялось в подгруппе из 56 больных PC с возрастом начала заболевания до 15 лет.

2. В 39 семьях больных PC с возрастом начала заболевания до 15 лет, при сравнении распределения перенесенных и не перенесенных больным детям родительских аллелей, подтверждена ассоциация PC с DR2(15). Эти данные свидетельствуют, что наблюдаемая ассоциация PC с аллелями HLA-£>/?B/*1501 - 1503, по крайней мере для больных с началом заболевания до 15 лет, не обусловлена неоднородностью популяции. Анализ неравновесия по переносу аллелей в семьях показал, что родители, являющихся гетерозиготами DR2(15)/He-DR2(15), достоверно чаще передавали больным детям DR2(15), чем друтие аллели. Таким образом, доказано сцепление DR2(15) с PC.

3. Проведено геномное типирование аллелей гена DPB1 HLA класса II у 123 взрослых больных PC и 120 здоровых индивидов. Выявлено слабое, но достоверное повышение частоты встречаемости у больных PC аллеля DPB 1*0401. Показано, что эта ассоциация проявляется независимо от DR2(15).

4. Определена частота встречаемости аллелей высокополиморфных микросатсллотных повторов TNFa и TNFb, локализованных в локусе фактора некроза опухолей в области HLA класса III, у 202 взрослых больных PC и 195 здоровых индивидов. Обнаружено достоверное повышение частоты встречаемости аллеля TNFa9 у больных PC и аллеля TNFa7 - у здоровых доноров. Показано, что положительная ассоциация TNFa9 с PC является независимой по отношению к DR2(15), в то время как отрицательная ассоциация TNFa7 с PC проявляется только у индивидов, несущих DR2(15). Распределение аллелей TNFb не различалось у больных и здоровых.

5. Полученные данные свидетельствуют о вовлечении по меньшей мере двух областей главного комплекса гистосовместимости в формирование предрасположенности к PC в русской популяции.

Список сокращений. ГКГ - главный комплекс гистосовместимости, JIT - лимфотоксин, ОР - относительный риск, ПЦР - полимеразная цепная реакция, PC - рассеянный склероз, т.п.н. -тысяч пар нуклеотидов, ФИО - фактор некроза опухолей, AFBAC - метод анализа ассоциаций на семейном материале (affected family-based method), TDT - тест неравновесия по переносу (transmission/disequilibrium test)

Список цитированной в автореферате литературы.

Бойко А.Н., Фаворова О.О. // Молекуляр. биология. 1995. Т. 29. С. 727-749

Заргарова Т.А., Фаворова 0.0. // Иммунология 1999 N5, с.9-13

Недоспасов С.А. и др. // Докл. Акад. Наук, 1993. Т. 331, С. 504-508

Alexecv L. et al // Eur. Immunogenetics. 1995. V. 22. P. 99.

Begovich A.B. et al. И Hum Immunol 1990,28: 365-372

Bcnvenuto R. et al // Clin.Exp. Immunol. 1991; 84: 97-102

Boiko A.N. ct al // In: Multiple Sclerosis Epidemiology: Analytical Approaches to Study the Etiology. Bergen, 1995: 31

Compston D.A.S. et al // Acta Neurol. Scand. 1995. V. 91. P. 43-51. Dekker J.Wet al // Tiss Antig 1993, 41: 31-36 Ebers GC, Dyment DA // Semin Neurol 1998;18(3):295-9 EpplenC. et al // Electrophoresis. 1997. V. 18. P. 1577-1585. Falk CT, Rubinstein P. // Ann Hum Genet 1987 51:227-233 FuggerL. et al//Immunogenetics 1990,32: 150-156 Gallagher G. et al // Immunogenetics. 1997. V. 45. P. 188-194. Garcia-Merino A. et al // Hum. Immunol. 1996. V. 50. 11-21. Ghezzi A. et al II Multiple sclerosis. 1997. V. 3. P. 43-46.

Groning M. // Multiple Sclerosis in Europe. / Eds. Firnhaber W., Lauer K., Darmstadt: LeuchtturnVerlag, LTV Press, 1994. P. 6266 Haegert D.G. et al. // Neurology 1996,46: 1107-1111 Haines J.L. et al. // Hum Mol Genet 1998, 7: 1229-1234 Ito H. et al // Tissue Antigens. 1998. V. 52. P. 179-182 Jacob C.O. et al // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V. 87. P. 1233-1237. Kirk C.W. et al // J. Neurol. Sci. 1997. V. 147. P. 21-25. Marrosu M.G. et al // Am. J. Hum. Genet. 1997. V. 61. P. 454-457 Nedospasov S.A. et al//¿.Immunol. 1991; 147: 1053-9 Odum N. et al // Tiss Antig 1988, 31: 235-237 Odum N. et al // J.Immunogenet. 1989, 16:467-473 Olerup O., Hillert J. // Tissue Antigens. 1991. V. 38. P. 1-15 Pociot F. et al // J. Immunol. 1993. V. 23. P. 224-231.

Poser C.M. // In: The diagnosis of multiple sclerosis. Poser CM (ed.), Thieme-Stratton NY 1984: 3-13

Rieckmann P. et al//Neurology 1994; 44: 1523-6

Roil D.A., Bentzen P. // Mol. Biol. Evol. 1989. V. 6. P. 539-545

Roth M.P. et al // J Neuroimmunol 1991, 34: 215-222

Roth M.P. ct al // In: Fimhaber W, Lauer К (eds.). Multiple sclerosis in Europe: an

epidemiological update. Darmstadt: Leuchtturm-Verlag/LTV Press, 1994: 177-178

Sandberg-Wollheim M. et al//Multiple sclerosis.. 1995. V. 1. P. 181-185.

Selmaj R„ Raine C. // Ann.Neurol. 1989; 23: 339-346

Spielman R.S. ct al//Am J Hum Genet 1993,52:506-516

Svejgaard A., Ryder L.P. // Tissue Antigens. 1994. V. 43. P. 18-27.

Thomson G. // Am J Hum Genet 1995 57:487-498

Tracey K.J. 11 In: Thompson A., ed. Handbook of cytokines. London: Acad. Press 1994: 289-305 Yu M. et al. // Hum. Immunol. 1998. V. 59. P. 15-24.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. A.Boiko,T.Dcomina, E.Gusev, O.Favorova, М.Sudomoina, R.Turetskaya. Epidemiology of multiple sclerosis in Russia and other countries of the Former Soviet Union: investigations of environmental and genetic factors. ActaNeurol Scand 1995; v.91, p.71-76.

2. М.А.Судомоина, A.H.Бойко, Р.Л.Турецкая, Е.И.Гусев, Т.Л.Демина, О.О.Фаворова. Генетический полиморфизм локуса генома человека, содержащего гены факторов некроза опухолей: новые маркеры восприимчивости к рассеянному склерозу. Докл РАН 1995; т.343, с. 119-123.

3. Gusev EI, Boiko AN, Sudomoina MA, Deomina TL, Boldyreva MN, Trophimov DYu, Alekseev LP, Favorova 00. Genetic and epidemiological risk factors of multiple sclerosis in the Russian ethnic group. Eur. J. Neurology 1996; v.3, p.18.

4. Гусев Е.И., Судомоина M.A., Бойко A.H., Турецкая Р.Л.,Демина Т.Л., Алексеев Л.П., Болдырева М.Н., Трофимов Д.Ю., Ундрицов И.М., Фаворова 0.0. Факторы генетической предрасположенности к рассеянному склерозу в области главного комплекса гистосовместимости и их возможное взаимодействие (по данным генотипирования больных русской этнической группы). Жури невропатол и психиатр 1997; т.5, с. 39-46.

5. Судомоина М.А.,Бойко А.Н., Демина Т.Л., Гусев Е.И., Болдырева М.Н., Трофимов Д.Ю., Алексеев Л.П., Фаворова 0.0. Связь рассеянного склероза в русской популяции с аллелями гена DRB1 главного комплекса гистосовместимости. Мол биология 1998; т.32, с.291-296.

6. Судомоина М.А., Бойко А.Н., Спуркланд А, Гусев Е.И., Болдырева М.Н., Трофимов Д.Ю., Алексеев Л.П., Фаворова 0.0., Вартдал Ф. Исследование полиморфизма гена DPBI главного комплеска гистосовместимости у больных рассеянным склерозом в русской популяции. Иммунология 1999; №5,с. 45-48.

7. Bikova O.V., Maslova O.I., Boiko A.N., Sudomoina M.A., Favorova 0.0. MRI and genetic peculiarities of multiple sclerisis in children. Multiple Sclerosis 1999; v. 5, p. S77.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Судомоина, Марина Анатольевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Основные стратегии поиска генов, определяющих предрасположенность к PC.

1.2. Полный геномный поиск.

1.3. Рассеянный склероз и HLA-гены главного комплекса гистосовместимости.

1.4. Рассеянный склероз и не-HLA гены, вовлеченные в аутоиммунные реакции.

1.5. Митохондриальные гены и рассеянный склероз.

1.6. Перспективы изучения генетической предрасположенности к PC.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов DRBI у больных PC русской национальности из центрального региона России и в контрольной группе.

3.2. Сравнительный анализ распределения аллелей и генотиповDPB1.

3.3. Анализ полиморфизма длины фрагментов локуса факторов некроза опухолей, содержащих микросателлиты TNFa и TNFb.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ генетических факторов предрасположенности к рассеянному склерозу"

Рассеянный склероз (PC) - хроническое воспалительное, предположительно аутоиммунное заболевание, характеризующееся многоочаговой демиелинизацией в центральной нервной системе. Для идентификации генов, определяющих генетическую предрасположенность к PC, в настоящее время используют две основные стратегии: выяснение роли того или иного гена-кандидата, выбранного исходя из возможной роли его белкового продукта в этиопатогенезе заболевания, и полное геномное сканирование с использованием панели анонимных генетических маркеров для идентификации областей хромосом, вовлеченных в развитие заболевания. При полном геномном сканировании локусы, сцепленные с PC, обнаружены на тринадцати хромосомах, а анализ генов-кандидатов добавил к этому списку еще три хромосомы. Совокупность накопленных данных доказывает полигенную природу этого комплексного заболевания. Выявление отдельных генов, определяющих предрасположенность к PC, осложняется генетической гетерогенностью анализируемых популяций и семей, которая определяется как этнической неоднородностью, так и разной этиологией клинических форм PC. Однако, с большой степенью вероятности можно считать доказанным вовлечение в развитие PC генов главного комплекса гистосовместимости хромосоме 6р, а также каких-то неидентифицированных генов на хромосомах 5р и 17q. Помимо генов HLA, в ряде работ показана роль в развитии PC генов, кодирующих два других компонента тримолекулярных комплексов, участвующих в представлении аутоантигена - Т-клеточный рецептор и наиболее изученный аутоантиген при PC - основный белок миелина.

В качестве генов-кандидатов для PC рассматриваются также и другие гены, вовлеченные в аутоиммунные реакции - в первую очередь гены цитокинов и их рецепторов. В области HLA класса III главного комплекса гистосовместимости локализован кластер генов факторов некроза опухолей (ФНО), который содержит гены фактора некроза опухолей и лимфотоксинов - ключевых цитокинов при развитии PC.

Целью настоящей работы является анализ генетической предрасположенности к PC в русской популяции в области главного комплекса гистосовместмости. Россия относится к странам с умеренным риском PC. На 150 ООО ООО населения приходится довольно значительное число больных PC (не менее 50 ООО). Однако, для русской популяции больных PC до последнего времени не проводили геномного типирования в области HLA класса II, где локализованы основные гены-кандидаты для этого заболевания и выявлено существование этнических различий в связанных с PC аллелях. Данные по серотипированию антигенов HLA класса I в России выявили положительную ассоциацию PC с В7, как это наблюдается и в других популяциях, а также ряд слабых связей с некоторыми другими А- и В-серотипами. Геномного типирования в области HLA класса III, в том числе в локусе ФНО, для русской популяции больных PC также не проводилось.

В ходе диссертационной работы проведено геномное типирование аллелей генов DRB1 и DPB1 в ДНК из крови больных PC и здоровых доноров из Центральной России, популяционный анализ ассоциации аллелей этих генов с PC, а также семейный анализ сцепления аллелей гена DRBI с PC в группе больных с дебютом заболевания до 15 лет.

Для "группы больных PC и здоровых доноров из Центральной России проведено геномное типирование аллельных вариантов высокоинформативных полиморфных микросателлитов TNFa и TNFb в локусе ФНО и популяционный анализ их ассоциации с заболеванием.

Постановку диагноза, отбор больных с диагнозом "достоверный PC" и последующие клинические наблюдения осуществлялись на кафедре неврологии и нейрохирургии РГМУ д. м. н., профессором А.Н. Бойко

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ