Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Комплексный анализ полиморфизма генов факторов роста и апоптоза и их взаимосвязь с особенностями клинического проявления и течения миомы матки

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Комплексный анализ полиморфизма генов факторов роста и апоптоза и их взаимосвязь с особенностями клинического проявления и течения миомы матки"

На правах рукописи

Сорокина Мария Вячеславовна

КОМПЛЕКСНЫЙ АНАЛИЗ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ ФАКТОРОВ РОСТА И АПОПТОЗА И ИХ ВЗАИМОСВЯЗЬ С ОСОБЕННОСТЯМИ КЛИНИЧЕСКОГО ПРОЯВЛЕНИЯ И ТЕЧЕНИЯ

МИОМЫ МАТКИ

03.02.07 - генетика

5 2015

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Белгород - 2014

005558555

005558555

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Иванов Владимир Петрович

доктор медицинских наук, профессор Лазарева Галина Анатольевна

Официальные оппоненты:

Зинчснко Рена Абульфазовна, доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук, заведующий лабораторией генетической эпидемиологии

Петрнн Александр Николаевич, доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующий лабораторией медицинских генетических технологий

Ведущая организации:

ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится « года в

часов

на заседании совета но защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук Д 212.015.13 при ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет», по адресу: 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» Минобрнауки России и на сайте: www.bsu.edu.ru.

Автореферат разослан 2015 года

И.о. ученого секретаря совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук Д 212.015.13, доктор медицинских наук

Пахомов С.П.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Миома матки - наиболее частая причина аномальных маточных кровотечений, бесплодия, привычной потери беременности, нарушения функции тазовых органов. Все эти симптомы существенно ухудшают качество жизни женщины (Сидорова И.С., 2003; Вихляева Е.М., 2004; Тихомиров A.JI., 2007; Сидельникова В.М., 2005; Буянова С.Н., 2012).

Несмотря на значительный прогресс в исследовании миомы матки, до настоящего времени нет окончательных представлений об этиологии и патогенезе данного заболевания. Однако накопленный достаточный исследовательский материал позволяет сегодня пересмотреть прежние взгляды.

В современных условиях особое значение приобретает изучение роли наследственности в возникновении миомы матки в связи с расширением возможностей не только контроля над ростом опухоли и эффективностью различного рода лечебных воздействий, но и более раннего выявления ее в группах риска с помощью современных высокотехнологичных методов и средств диагностики (Кулаков В.И., Адамян Л.В., 2000; Сидорова И.С., 2003; Савицкий Г.А., Савицкий А.Г., 2000).

В исследованиях последних лет появляются сообщения о том, что эстрогены и прогестерон воздействуют на процессы возникновения и роста миомы матки опосредовано через полипептидные факторы роста. На основании этих данных была сформулирована экстрамединовая теория, согласно которой эффекты половых стероидов проявляются через локальную продукцию факторов роста (Савицкий Г.А., Савицкий А.Г., 2000; Dixon D., Не Н. и соавт., 2000; Nowak R., 2000; Eude I., Dallot E. и соавт., 2001). Таким образом, патогенетические основы формирования миомы матки сегодня определяются повышением экспрессии факторов роста, увеличивающих митотическую активность клеток миомы и снижающих их чувствительность к апоптическому сигналу.

Молекулярно-генетические механизмы, лежащие в основе взаимодействия процессов пролиферации и апоптоза клеток лейомиомы до сих порне получили должного освещения в литературе, что определило проведение настоящего исследования.

Работа выполнена в рамках отраслевой научно-исследовательской программы ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Минздрава России (номер государственной регистрации-0120.1151658).

Цель исследования: изучить полиморфизм генов факторов роста: инсулиноподобного фактора роста - II (ИПФР-Н), факторов роста фибробластов (ФРФ) I и II типов, эпидермального фактора роста (ЭФР), трансформирующего фактора роста ßl (ТФР-ßl) и гена апоптоза (р53) у пациенток с миомой матки, оценить влияние исследуемых полиморфных вариантов генов на риск развития миомы матки и особенности течения заболевания.

Задачи исследования:

1. Оценить особенности акушерско-гинекологического, соматического статуса больных миомой матки.

2. Рассмотреть особенности течения и клинического проявления миомы матки в зависимости от наследственной отягощенности.

3. Оценить у данной категории больных полиморфизм генов факторов роста: инсулиноподобного фактора роста II типа (IGF-1I 3123 G/A), факторов роста фибробластов I и II типов (FGF I 1385 A/G, FGF 11 754C/G), эпидермапьного фактора роста (EGF 61A/G), трансформирующего фактора роста (31 (TGFp -509 С/Т) и гена апоптоза р53 (р53 72 C/G). Установить генетический риск развития миомы матки, ассоциированный с тем или иным функционально значимым полиморфизмом генов факторов роста и апоптоза.

4. На основании полученных результатов о полиморфизме генов факторов роста и апоптоза, наследственной отягощенности и особенностях анамнеза заболевания у больных миомой матки разработать критерии для вероятностного прогнозирования особенностей клинического проявления и течения заболевания.

Новизна исследования. Впервые проведено комплексное изучение полиморфизма генов факторов роста (IGF II, FGF /, FGF 11, EGF, TGF-fil) и апоптоза (р53) у пациенток с миомой матки.

Впервые проведён анализ сочетанного влияния полиморфизма генов факторов роста и апоптоза и наследственной отягощенности на клинические проявления и течение заболевания.

В результате проведенного исследования получены новые данные о значении клинико-анамнестических и наследственных факторов в генезе миомы матки.

Результаты проведенного генотипирования показали, что полиморфизм генов факторов роста (FGF II, IGF II) ассоциирован с риском возникновения миомы матки.

Выявленный дисбаланс в распределении функционально активных и функционально неполноценных аллельных вариантов исследуемых полиморфных вариантов генов факторов роста и гена белка апоптоза создаёт доказательные предпосылки для дальнейшего научного поиска с целью формирования современных представлений о молекулярно-генетических механизмах формирования миомы матки.

На основании полученных клинико-анамнестических и генетических результатов исследования сформировано научное обоснование возможности прогнозирования возникновения и особенностей клинического течения заболевания.

На основе результатов проведенного генотипирования и данных о наследственной отягощенности по миоме матки были разработаны критерии индивидуального прогнозирования вероятности развития миомы матки методом линейно-регрессионого анализа. Логистический регрессионный анализ позволил построить три статистические модели для прогнозирования

вероятности развития миомы матки, оценки темпов роста узла, прогноза тактики лечения.

Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в моделировании и реализации исследования. Им проанализированы зарубежные и отечественные источники по теме диссертации, получены и оценены результаты исследования. В работах, выполненных в соавторстве, использованы результаты исследования с долей личного участия автора 90%. Автором самостоятельно проведены все этапы исследования, а именно: разработка дизайна исследования, анкетирование пациентов, выделение геномной ДНК с последующим проведением реакции ПЦР-ПДРФ, статистическая обработка всех полученных результатов.

Практическая значимость. Полученные в результате исследования данные о взаимосвязи полиморфных вариантов генов факторов роста, наследственной отягощенности и особенностей гинекологического анамнеза могут быть рекомендованы применению врачам акушерам-гинекологам и врачам-генетикам медико-генетических консультаций с целью оценки риска возникновения миомы матки, определения тактики лечения и прогноза течения заболевания у пациенток.

Результаты типирования полиморфных вариантов генов факторов роста и апоптоза создают предпосылки для дальнейшего более глубокого изучения молекулярно-генетических механизмов формирования миомы матки с целью проведения мероприятий по первичной профилактике в семьях с отягощенным анамнезом в рамках медико-генетического консультирования.

Внедрение результатов в практику здравоохранения. Результаты исследования внедрены внедрены в клинико-диагностическую практику центра медицинской диагностики «Томограф», в клинико-диагностическую практику «Центра медицинских осмотров и профилактики», медицинского центра «Медассист».

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, 3 из которых в изданиях, определённых перечнем ВАК РФ.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Полиморфные варианты генов фактора роста фибробластов II типа и инсулиноподобного фактора роста II типа ассоциированы с формированием миомы матки.

2. Полиморфизм гена белка апоптоза р53 ассоциирован с возникновением миомы матки у пациенток с наследственной отягощенностью по развитию данной патологии.

3. Степень увеличение матки за счёт миоматозных узлов ассоциирована с полиморфными вариантами генов факторов роста фибробластов I и II типов, гена белка апоптоза р53.

4. Распределение частот аллелей и генотипов исследуемых генов при миоме матки характеризуется преимущественным накоплением среди больных функционально активных аллелей генов факторов роста в сочетании с функционально неполноценными аллельными вариантами гена белка апоптоза р53.

Апробация работы. Материалы диссертационного исследования обсуждались и докладывались на И Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии» (Курск, 2011), 77-й, 78-й Всероссийской научной конференции студентов и молодых учёных с международным участием «Молодёжная наука и современность» (Курск, 2012, 2013), IV Республиканской научно-практической конференции с международным участием студентов и молодых ученых (Гомель, 2012), 76-й итоговой студенческой научно-практической конференции с международным участием, посвященной 90-летию со дня рождения проф. Л.Л. Роднянского (Красноярск, 2012), VII Международной научной конференции молодых ученых-медиков (Курск, 2013), Международной научно-практической конференции «Перспективы развития науки» (Уфа, 2014).

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического списка и приложений. Работа изложена на 129 страницах машинописного текста, содержит 34 таблицы и 14 рисунков. Библиографический список используемой литературы включает 156 источников, из которых - 97 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Клиническая характеристика пациентов

Материалом для исследования послужила популяционная выборка неродственных индивидов женского пола Центрально-Черноземного региона России, проживающих на территории города Курска и Курской области. Все обследованные, включая здоровых женщин и пациенток с миомой матки, были русской национальности. Всего было обследовано 300 человек: 180 пациенток с миомой матки и 120 женщин группы контроля. Формирование выборок больных и популяционного контроля осуществлялось сплошным методом.

Молекулярно-генетический анализ проводился на базе лаборатории медицинской генетики кафедры биологии, медицинской генетики и экологии Курского государственного медицинского университета. Все пациентки основной группы подверглись оперативному лечению согласно клиническим показаниям. Клинико-лабораторные исследования проводились на базе ОБУЗ «Областной перинатальный центр г. Курска». У всех женщин было получено добровольное информированное согласие на забор венозной крови и использование её для проведения исследований.

Всем больным миомой матки и пациенткам группы контроля проводилось типирование шести молекулярно-генетических маркеров: полиморфные варианты генов инсулиноподобного фактора роста II типа (3123 ¿/А), фактора роста фибробластов I типа (1385 А/С}), фактора роста фибробластов II типа (754 СЮ), эпидермапьного фактора роста (6Ш/А), трансформирующего фактора роста 01 (509 Т/С) и гена белка апоптоза р53 (72 в/С). Выбор данных полиморфизмов обусловлен их возможной

вовлеченностью в патогенез миомы матки за счет способности изучаемых полиморфизмов изменять экспрессию соответствующих факторов роста и белка апоптоза.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Молекулярно-генетические методы

Для проведения молекулярно-генетических исследований у всех обследуемых проводился забор венозной крови в количестве 5-10 мл в сухие пластиковые пробирки объемом 5 мл с 0,5 мл 0,5 M ЭДТА. После этого кровь замораживали при -20°С.

Выделение геномной ДНК. Выделение геномной ДНК проводили из замороженной венозной крови стандартным двухэтапным методом фенольно-хлороформной экстракции (Маниатис Т. с соавт., 1984).

Полиморфные гены, исследованные в настоящей работе. В рамках работы проводилось генотипирование 6 полиморфизмов (SNP-маркеры) 5 генов факторов роста и гена апоптоза р53: TGF/31 509Т/С (rs 1800469), EG FI 61 G/A (rS 4444903), FGF I 1385 A/G (rs 340111), FGF il 754 C/G (rs 2922979), IGF II 3123 G/A (rs 680).

Амплификация фрагментов ДНК исследуемых генов с помощью полимеразной цепной реакции. ПЦР проводили в 12 мкл реакционной смсси, содержащей 0,5 мкл образца геномной ДНК. Смесь для амплификации включала: 67 мМ Трис-HCl рН = 8,8, 16,6 мМ сульфата аммония, 6,7 мкМ ЭДТА, 1,5-4,5 мМ MgCl2, 1 мМ Р-меркаптоэтанола, 1 мМ каждого dNTPs (dATP, dCTP, dTTP и dGTP), 15 нМ каждого из праймеров и 1U Taq-полимеразы (Центр молекулярной генетики, Москва). Для предотвращения испарения амплификационной смеси и образования конденсата на реакционную смесь наслаивали 30 мкл минерального масла.

Амплификацию проводили на многоканальном термоциклере «Терцик» (НПО «ДНК-Технология», Москва). С целью оптимизации ПЦР для каждой пары праймеров был рассчитан оптимальный температурно-временной режим отжига и подобрана соответствующая концентрация MgCh.

Рестрикционный анализ продуктов ПЦР. Для генотипирования исследуемых ДНК-маркеров использовали праймеры, описанные в литературе. Обнаружение ОНП проводилось путем обработки продуктов ПЦР специфическими эндонуклеазами согласно протоколам, описанным производителями ферментов.

После гидролиза продукты ПЦР-рестрикции разделяли с помощью электрофореза в агарозном геле различной концентрации (2-4%), приготовленном на основе ТЕ буфера (0,089М Трис-HCl, 2 мМ ЭДТА).

После электрофореза гели документировали на трансиллюминаторе в проходящем УФ свете с применением компьютерной видеосъемки на приборе GDS-8000 («UVP», США) и программного аналитического пакета Lab Works м v4.5 (США). В качестве маркера молекулярного веса использовали ДНК фага X, гидролизированную эндонуклеазой Pstl. Проводился контроль генотипирования.

Статистические методы

Формирование базы данных и статистические расчеты осуществляли с использование программы «STATISTICA 10.0». Определение фенотипических и генных частот проводили стандартными методами. Для оценки соответствия распределений генотипов ожидаемым значениям при равновесии Харди-Вайнберга (РХВ) и для сравнения распределений частот генотипов и аллелей в выборках больных и здоровых использовали критерий х2 Пирсона (Вейр Б., 1995).

Анализ ассоциации полиморфизмов исследуемых генов с предрасположенностью к развитию миомы матки. Для оценки ассоциаций молекулярно-генетических маркеров с предрасположенностью к миоме матки, а также с качественными признаками (сочетание с курением, наследственной отягощенностью, сочетание с аденомиозом), характеризующими ее клиническое течение, использовали критерий -¡С с поправкой Йетса на непрерывность, рассчитанный путем анализа таблиц сопряженности 2x2 (Реброва О.Ю., 2003). Об ассоциации аллелей или генотипов с предрасположенностью к заболеваниям судили по величине отношения шансов (OR) (Pearce N., 1993; Реброва О.Ю., 2003). Границы 95% доверительного интервала (CI) для OR вычисляли методом В. Woolf. При изучении взаимосвязей изучаемых генетических полиморфизмов с патогенетически значимыми количественными признаками, вначале оценивали характер распределения этих признаков с использованием критерия Шапиро-Уилка (Реброва О.Ю., 2006), в случае ненормального распределения количественного признака для описания применяли медиану (Me) и интерквартильный размах (Q25-Q75), а для сравнительного анализа - критерий Манна-Уитни (Реброва О.Ю., 2006).

Анализ меэкгенных взаимодействий. Межгенные взаимодействия изучали посредством сравнительного анализа парных комбинаций генотипов между группами и расчета отношения шансов с целью оценки тенденций в накоплении определенных сочетаний генотипов исследуемых генов в отличие от контроля.

Построение сети генетических ассоциаций производилась при помощи программы String 9.0 Software через интернет доступ по адресу http://string-db.org. Создание чётких ассоциативных функционально связанных гипотез по целевым генам в автоматическом режиме выполнено с помощью компьютерного комплекса BioGraph software (Universiteit Antwerpen, Belgium) по интернет адресу http://biograph.be.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Особенности акушеско-гинекологического н соматического анамнеза пациенток с миомой матки.

Нами были проанализированы характеристики менструального цикла у пациенток двух групп, полученные результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1

Характеристика менструального цикла обследуемых

Характеризующий признак Основная группа п (%) Контрольная группа П (%) X (Р)

Регулярность* 119(66,11) 98 (81,67) 8,71 (р<0,001)

Альгодисменорея * Полимеморея* 105 (58,33) 141 (78,33) 24 (20,00) 19(15,83) 43,17 (р<0,001) 113,00 (р<0,001)

Характеризующий признак М±б М±6 t-критерий (Р)

Длительность цикла 25,16 ±8,99 27,41 ±2,51 0,75 (р>0,05)

Длительность *менструального кровотечения 7,54 ±3,34 4,91 ±0,89 25,67 (р<0,01)

Примечание: * - статистически значимые отличия от контрольной группы (р<0,05).

На первом этапе был проведен сравнительный анализ основной и контрольной группы по данным акушерско-гинекологического анамнеза. Установлено, что в группе пациенток с миомой матки возраст начала половой жизни достоверно ниже - 18,61 ± 1,62 лет в сравнении с контрольной группой -19,77 ± 1,32 лет (р <0,05). У пациенток основной группы количество беременностей было достоверно больше 3,79 ± 1,58, тогда как в контрольной группе - 3,25 ± 1,4 (р <0,05). В контрольной группе число абортов (0,95 ± 1,18) и родов (1,81 ± 0,51) было статистически меньше в сравнении с основной. В основной группе среднее количество абортов составило - 1,47 ± 1,45, родов соответственно - 1,97 ± 0,64, р <0,05.

Гинекологический анамнез был отягощен у 51 (28,33%) пациенток основной группы и у 25 (20,83%) женщин из группы контроля (р = 0,14). У пациенток основной группы достоверно чаще встречалось указание на наличие гиперплазии эндометрия в анамнезе (р = 0,04), хронического сальпинго-офорита (р = 0,02), аденомиоза по данным ультразвуковой диагностики (р = 0,01).

Выявлено, что 30 (16,67%) пациенток основной группы являлись соматически здоровыми, остальные 150 пациенток (83,33%) имели различную соматическую патологию. В контрольной группе 37 человек (30,83%) были соматически здоровы, 83 пациентки (69,17%) имели в анамнезе указание на различную соматическую патологию. Таким образом, соматически здоровых пациенток в основной группе было в 1,8 раз меньше (16,67%) по сравнению с контрольной - 30,83% (р = 0,023). Различий по возрастному составу между группами не установлено,

Среди экстрагенитальной патологии первое место, как в основной, так и в контрольной группе занимали заболевания сердечно-сосудистой системы. У пациенток основной группы наиболее часто встречались следующие

заболевания: варикозная болезнь вен нижних конечностей - 30 (16,67%), хронический пиелонефрит - 11 (6,1%) и хронический гастродуоденит -12 (6,67%). Соматический анамнез пациенток контрольной группы преимущественно был отягощен заболеваниями суставов - 11 (9,16%), почек -6 (5,0%), желудочно-кишечного тракта - 9 (7,5%).

В основной группе статистически значимые различия обнаружены по заболеваниям сердечно-сосудистой системы (гипертоническая болезнь (р = 0,01) и варикозному расширению вен нижних конечностей (р = 0,0005). У пациенток контрольной группы достоверно чаще встречались заболевания суставов (р = 0,02), вегетососудистая дистония (р = 0,015). Таким образом, отягощенный соматический анамнез достоверно превалировал у пациенток основной группы с подтверждённым диагнозом миомы матки (р = 0,023).

2. Оценка наследственной отягощенности гинекологического анамнеза в исследуемых группах.

Анализ наследственной отягощенности по гинекологическим заболеваниям показал, что гинекологический анамнез не был отягощен у 53,89% матерей пробандов основной группы, что несколько ниже по сравнению с контрольной - 60% пациенток. Результаты настоящего исследования достоверно выявили наличие наследственной предрасположенности к развитию миомы матки: 48 (26,67%) матерей пациенток основной группы страдали миомой матки (в 10,4% проводилось оперативное лечение), что достоверно выше по сравнению с группой контроля - 16(13,33%) (р = 0,01).

Пациентки с наследственной отягощенностью в сравнении с остальными пациентами основной группы отличались резистентностью к консервативному лечению и более частому осложнению заболевания болевым тазовым синдромом. Результаты сравнительного анализа представлены в таблице 2.

Отдельно нами была проанализирована распространенность онкопатологии среди родственников пробанда I и II степени родства, результаты представлены в таблице 3.

Таблица 2

Особенности течения заболевания у пациентов с наследственной отягощенностью по развитию миомы матки

Признак Количество пациентов с наследственной предрасположенностью N (%) Количество пациентов основной группы без отягощенного анамнеза N (%) х2 (Р)

Резистентность к консервативной терапии 51 (100) 9 (6,98) 3,75 (0,05)

Болевой тазовый синдром 13 (25,49) 14(10,85) 4,69 (0,03)

Таблица 3

Распространенность онкопатологии среди родственников обследуемых

Степень родства Количество пациентов основной группы N (%) Количество пациентов контрольной группы N (%) х2 (Р)

I степень* 35(19,44) 9 (7,50) 7,28 (0,01)

II степень 18 (10,00) 7 (5,83) 1,14 (0,29)

Примечание: * - статистически значимые отличия от контрольной группы (р<0,05).

В группе больных выявлена статистически значимая более высокая распространенность онкопатологии среди родственников I степени родства (р = 0,01), среди родственников II степени родства данная закономерность не выявлена.

3. Исследование роли изучаемых полиморфных вариантов в развитии миомы матки

На следующем этапе исследования был проведен сравнительный анализ частот аллелей и генотипов исследуемых полиморфных вариантов генов между группой больных миомой матки и контрольной группой. Нами было выявлено, что частота С-аллеля полиморфного варианта 754СЛИ гена ТОГ // в 3,2 раза выше в основой группе пациентов (0,761) в сравнении с группой контроля (0,239): Х~ = 10,05, р = 0,001. Аналогичная закономерность выявлена для в-аллеля полиморфного варианта 3123 С/А гена ЮР II, его частота выше у больных (0,736) в 2,78 раза в сравнении с контрольной группой (0,264): 5,1, р = 0,02. Таким образом, нами установлено, что носительство аллеля 754С РСР II ассоциируется с повышенным риском развития миомы матки (СЖ = 0,56; 95% С1 0,39-0,80). Положительная взаимосвязь в отношении предрасположенности к формированию миомы матки также установлена для аллеля 3123С ¡(¡Г // (СЖ = 0,67; 95% С1 0,47-0,95). Полученные результаты представлены на рисунке 1.

Рисунок 1. Распределение частот аллелей 754 C/G FGF1I и 3123 A/G IGFII в двух группах

754C/GFGFI!

3123 A/G IGF II

В связи с тем, что изолированный анализ распределения частот аллелей генов факторов роста и апоптоза не дает полного представления о характере взаимосвязи полиморфизмов с предрасположенностью к болезни, представлялось важным оценить влияние генотипов генов факторов роста и апоптоза на риск формирования миомы матки.

В результате статистического анализа выявлено, что частота гомозигот 754СС гена FG7;' // выше в основной группе - 100 (55,56%), = 7,1, р = 0,01. для вариантного гомозиготного генотипа данного гена 75400 Р'ОР II наоборот характерно преобладание в контрольной группе пациентов - 13 (10,83%), X' = 5,62, р = 0,018. Таким образом, было установлено, что гомозиготный генотип 754СС гена /-ТУ/''// ассоциировался с повышенным риском развития миомы матки ((Ж = 0,52; 95% С1 0,32-0,82). Частота гомозигот 7540С статистически достоверно была выше в контрольной группе (СЖ = 0,28; 95% С1 0,1-0,77), что говорит о протективной роли данного генотипа в предрасположенности к формированию миомы матки. Полученные результаты представлены на рисунке 2.

Частота гомозигот ЛА гена ЮР 11 среди пациентов контрольной группы была статистически выше в сравнении с группой больных (ОЯ = 0,28; 95% С1 0,1 1-0,72), что указывает на протективную роль данного генотипа и аллеля в предрасположенности к развитию миомы матки. Частота АА генотипа 3123 гена ЮР II в контрольной группе составила 12,5%, тогда как в основной статистически значимо ниже — 3,89%. Полученные результаты представлены на рисунке 3.

100

о

я 754 СС

■ 754 Сй

754С6

Группа 6

Группа контроля

Рисунок 2. Распределение генотипов 754 С/С /гС/*7/ в двух группах

a 3123GG ■ 3123GA ilHAA

Группу больных

Группу контроля

Рисунок 3. Распределение генотипов 3123A/G IGFII в двух группах

4. Исследование роли изучаемых полиморфных вариантов в развитии миомы матки в зависимости от наличия наследственной отягощенности

Вследствие наличия статистически подтвержденной наследственной предрасположенности к развитию миомы матки нам представлялось важным сравнить частоты генотипов исследованных полиморфных вариантов у пациентов с наследственной отягощенностью из основной группы с пациентами группы контроля. Сравнительный анализ пациенток с наследственной отягощенностью из основной и контрольной группы выявил статистически значимые различия в подгруппе пациентов с наследственной отягощенностью: частота генотипа 72СС гена р53 выше у пациентов основной группы (18,75%) в сравнении с контрольной (х2= 5,62, р = 0,018, OR = 7,91; 95% CI 0,44-36,90). Таким образом, наличие генотипа 72СС гена р53 статистически повышает риск возникновения миомы матки у пациенток с наличием наследственной отягощенности по данному заболеванию. Распределение генотипов гена р53 у пациенток с отягощенным наследственным анамнезом по миоме матки наглядно представлено на рисунке 4.

20

ю г

Группа больных

À

Группа контроля

* 72GG Ш 72CG «72СС

Рисунок 4. Распределение генотипов 72C/G гена р53 у пациентов с наследственной отягощенностью

5. Анализ ассоциации изучаемых полиморфных вариантов со степенью увеличения матки за счёт мпоматозных узлов.

На следующем этапе исследования было решено провести сравнительный анализ частот генотипов исследованных полиморфизмов генов факторов роста и апоптоза в зависимости от степени увеличения матки вследствие наличия мпоматозных узлов.

Степень увеличения матки миоматозными узлами оценивалась на основе общепринятого показателя - размер матки в неделях условной беременности. Учитывая относительную малочисленность выборок интерпретировать полученные результаты необходимо с осторожностью (таблица 4).

Таблица 4

Распределение частот генотипов полиморфных вариантов исследуемых генов в зависимости от степени увеличения размеров матки

Миома матки исОолмних и средних рачмерон размеров (N=149) Миома матки

1III Иолимор фнчм Геног1Ш1.1 больших размеров (N=31) х2 Р

и % п %

1 2 3 4 5 6 7 8 9

61ЛЛ 45 30,20 11 35,48 0,33 0,56

ЕС, Г 61 О/Л 61ЛО 75 50,34 15 48,39 0,04 0,84

6100 29 19,46 5 16,13 0,19 0,67

1385ЛЛ 19 12,75 9 29,03 5,18 0,02

гаг 1 1385 Л/С. 1385ЛО 87 58,39 14 45,16 1,82 0,18

138500 43 28,86 8 25,81 0,12 0,73

754СС 77 51,00 23 74,19 4,40 0,04

гаг/1 754 С/О 754СС 66 44,30 7 22,58 4,16 0,04

75400 6 4,70 1 3,23 0,09 0,764

509СС 81 54,36 18 58,06 0,14 0,71

таг-р -509Т/С 509ТС 60 40,27 12 38,71 0,03 0,87

509'1'Т 8 5,37 1 3,23 0,25 0,62

312300 77 51,68 16 51,61 0,04 0,99

3123 О/Л 31230Л 64 42,95 14 45,16 0,05 0,82

3123ЛЛ 8 5,37 1 3,23 0,25 0,62

720(3 64 42,95 9 29,03 1,53 0,22

1'53 72 С/О 720С 82 55,03 16 51,61 0,02 0,88

72СС 3 2,02 6 19,36 12,8 <0,0001

Сравнительный анализ показал увеличение частоты генотипа 1385 АА /■'(!/■' I в подгруппе пациенток с миомой матки больших размеров ((Ж=2,80; 95%С1 1,12-6,97). В подгруппе пациенток с миомой матки больших размеров также статистически выше частота 754СС (ОЯ=2,59; 95%С1 1,11-6,04) и 754Св

(OR = 2,60; 95% CI 1,08-6,27) генотипов FGFJI, в 6 раза выше частота 72СС р53 (OR = 10,67; 95% CI 2,72-41,81).

Пациентки основной группы, имеющие в генотипе функционально активный генотип 754СС FGF II, отличаются большими размерами матки (медиана размера матки составляет 10,00 недели, при интерквартилыюм размахе 8,00 - 12,00 недели) по сравнению с носителями генотипа 754GG из данной группы (медиана размера матки равна - 8,30 недели, нижний квартиль -8,00 недели, верхний квартиль - 10,80 недели). Результаты отображены на рисунке 5.

754СС гак II КСКII

Рисунок 5. Размер матки в зависимости от генетического полиморфизма

754С/в гена фактора роста фибробластов II типа

20 3 1в

V 2

V

.§■ 16

10

14

a Median □ 25%-75% X MirvMax

72СС р53

72GG р53

Рисунок 6. Размер матки в зависимости от генетического полиморфизма 72C/G белка апоптоза р53

Носители функционально активного аллеля р53 72СС основной группы также отличаются большими размерами матки (медиана размера матки составляет 10,10 недели, при интерквартильном размахе 8,00 - 12,00 недели) в сравнении с носителями нормального гомозиготного генотипа (медиана размера матки равна - 7,80 недели, нижний квартиль -7,50 недели, верхний квартиль - 8,90 недели). Полученные результаты представлены на рисунке 6.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что генетические полиморфизмы генов факторов роста фибробластов I, II типов и гена р53 ассоциированы с характером поражения матки при миоме.

6. Изучение роли исследуемых полиморфных вариантов генов в развитии миомы матки на фоне аденомиоза

Среди пусковых механизмов формирования миомы матки важная роль отводится эндометриодным гетеротопиям (Тихомиров A.A. и др., 2006). В соответствии с этими результатами мы проанализировали закономерности распределения исследуемых генотипов при сочетании миомы матки с аденомиозом в сравнении с контрольной группой. Среди пациенток основной группы сочетание миомы матки и эндометриоза отмечено у 35 (19,44%) пациенток. Полученные результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5

Распределение частот генотипов полиморфных вариантов исследуемых __генов при сочетании миомы матки с аденомиозом_

Частоты генотипов

Ген Полимор физм 'Генотипы Сочетание миомы матки и аденомиоза (п=35) Контрольная группа (п=120) х2 2Р

п % п %

6 IAA 9 25,71 33 27,5 0,04 0,83

EGF 61 G/A 61AG 21 60,00 67 55,83 0,19 0,66

61GG 5 14,29 20 16,67 0,11 0,74

1385AA 3 8,57 42 35,0 9,19 0,001

FGFI 1385 A/G 1385AG 15 42,86 57 47,5 0,23 0,63

1385GG 17 48,57 21 17,5 14,14 0,0001

754CC 16 45,71 47 39,17 0,48 0,49

FGF/I 754 С/С, 754CG 18 51,43 60 50,0 0,02 0,88

754GG 1 2,86 13 10,83 2,10 0,15

509CC 16 45,71 64 53,33 0,63 0,43

TGF-ß -509T/C 509TC 17 48,57 41 34,17 2,40 0,12

509TT 2 5,72 15 12,5 1,28 0,26

3123GG 12 34,29 51 42,5 0,76 0,38

IGF И 3123 G/A 3123GA 20 57,14 54 45,0 1,60 0,21

3123AA 3 8,57 15 12,5 0,41 0,52

72GG 10 28,57 68 56,67 7,47 0,01

P53 72 C/G 72GC 19 54,28 49 40,83 1,48 0,22

72CC 6 17,15 3 2,50 8,11 0,004

-|--------г----- -- __ч,»»-.

Вариантные гомозиготные генотипы представлены в нижних ячейках соответствующих ДНК-маркеров.

2Уровш1 значимости р различий частот генотипов между группами (жирный шрифт р<0,05 ¿М)

В подгруппе пациенток с сочетанием миомы матки и аденом иоза отмечается повышение частоты вариантного гомозиготного генотипа 138500 ГС/:' / ((Ж = 4,45; 95% С1 1,97-10,04) и снижение частоты генотипа 1385АА данного гена (ОЛ = 5,74; 95% С1 1,66-19,88) в сравнении с группой контроля. В данной подгруппе также выше частота гомозиготного генотипа 72СС гена р53 (ОИ. = 7,40; 95% С1 1,90-28,84). В контрольной группе статистически выше частота нормальных гомозигот данного полиморфного варианта - 7200 (ОЯ = 3,17; 95% С1 1,42-7,08).

7. Изучение влияния межгенных взаимодействий в системе факторов роста и апоптоза на предрасположенность к формированию миомы матки

Сочетание аллельных вариантов различных генов лежит в основе наследственной предрасположенности к большинству мультифакториальных заболеваний (Бочков Н.П., 2002; Пузырев В.П., 2001).

Определенные комбинации генов, каждый из которых в отдельности характеризуется незначительным проявлением на уровне фенотипа, зачастую обладают суммарным (аддитивным) эффектом, который в совокупности с факторами внешней среды способен вызвать заболевание или предопределить его более тяжелое течение.

Поэтому анализ сопряженности среди генов факторов роста и апоптоза у пациенток с миомой матки позволяет выявить наиболее значимые комбинации, обуславливающие наследственную предрасположенность к развитию данной патологии.

Особенности взаимодействия полиморфных вариантов генотипов исследуемых генов у пациенток с миомой матки были изучены при помощи анализа парных межгенных сочетаний генотипов, результаты представлены в таблице 6.

Как видно из таблицы 6, тринадцать парных сочетаний генотипов ферментов генов факторов роста и апоптоза были статистически значимо ассоциированы с предрасположенностью к развитию миомы матки.

Наиболее патогенетически значимыми для развития миомы матки были взаимодействия генов ИОР 1, РОР II, ЮР II. При этом одни сочетания генотипов увеличивали риск развития миомы матки (ОЯ>1), другие обладали протективными свойствами в отношении риска возникновения болезни (ОЯ<1).

Таблица 6

Ассоциации парных межгенных комбинаций генотипов исследуемых генов у пациенток с миомой матки в сравнении с контрольной группой

Парные комбинации генотипов Частоты комбинаций генотипов Критерий (Ж (95%С1)

Основная группа (п=180) Контрольная группа(п=120) различий, х2(р)

п % п %

I АС + П СС | 53 29,6 21 17,5 5,66 (0,02) 1,98 (1,12-3,51)

ГОК / АС + ЮР IIСС | 56 31,3 21 17,5 7,14 (0,01) 2,15 (1,22-3,78)

РйР I АС +ЮРII ДА | 3 1,7 11 9,2 9,03 (0,01) 7,43 (0,01-0,17)

ЮР II СО + ТСР-Р1 ТТ | 4 2,2 9 7,5 4,79 (0,03) 0,28 (0,08-0,94)

ЮГ II АЛ V ГСК-^/ТТ 1 5 2,8 10 8,3 4,63 (0,03) 0,32 (0,11-0,95)

Еагвс + гс,р-р/ сс т 22 12,3 6 5,0 4,50 (0,03) 2,66 (1,05-6,78)

/•'С/-- // СС + ГОК-^/ ССТ 64 35,8 24 20,0 8,58 (0,01) 2,23 (1,29-3,83)

/ГС/Г//СС + ГСГ-/?/ ТТ 1 3 1,7 10 8,3 7,66 (0,01) 0,19 (0,05-0,70)

РСРПОО + гаг-;?/ ее 1 3 1,7 9 7,5 6,33 (0,01) 0,21 (0,06-0,79)

/С/=7/АА + £СК АА | 2 1,1 6 5,0 4,16 (0,04) 0,21 (0,04-1,08)

ГОК /СО+ 7№-/?/ ТТ 1 2 1,1 6 5,0 4,16 (0,04) 0,21 (0,04-1,08)

Р53СС + ТвР- /9/ ТТ 1 3 1,7 9 7,5 4,90 (0,03) 0,23 (0,07-0,81)

/\ЯСС + Л7К//00| 1 0,6 9 7,5 8,67 (0,001) 0,10 (0,02-0,56)

Примечание:

[ - риск развития миомы матки статистически ниже;

| - риск развития миомы матки статистически выше.

8. Вероятностное прогнозирование развития миомы матки, течения процесса и методов лечения.

В нашем исследовании было выявлено влияние ряда генов факторов роста на течение и клинические проявления миомы матки, что в совокупности с данными клинико-гснсалогичсского анализа может быть использовано для

определения риска возникновения миомы матки, а у больных с уже установленным диагнозом - для прогнозирования течения и исхода болезни.

На основе результатов проведенного генотипирования и данных о наследственной отягощенности по миоме матки были разработаны критерии индивидуального прогнозирования вероятности развития миомы матки с помощью построения интегральных показателей. Разработанные критерии представлены в таблицах 7, 8, 9.

Таблица 7

Диагностически ценные характеристики по прогнозированию

развития миомы матки

Показатели (X) Ценность признака Коэффициент регрессии (b) Р

Процент больных миомой родственников I степени родства (X)) 6,24 0,022 0,003

Доля онкологических больных среди родственников I степени родства (Х2) 4,29 0,025 0,0027

Курение пациентки (Хз) 2,32 0,82 0,017

Носительство аллеля 754С FGF II (Xj) 3,50 -1,45 0,0007

Носительство аллеля 3123G IGF II (Xs) 3,05 -1,1 0,022

Примечание: Ьо~ 1,93

Таблица 8

Диагностически ценные признаки для вероятностного прогноза ____увели^и!1П1я размсро^матки^^ год заболеванин

Показатели

Процент больных миомой родственников I степени родства(Xi)

Ценность признака

2,37

Коэффициент регрессии (Ъ)

0,58

Размеры матки при выявлении миомы (в неделях)

Ш.

4,38

-0,28

Носительство аллеля 754С FGFII (Х3)

1,49

0,05

Носительство аллеля 3123 G IGF II (Xj)

1,62

-1,01

Примечание: Ьо - -24,74

Таблица 9

Диагностически ценные характеристики для вероятностного прогноза

тактики лечения

Показатели Ценность признака Коэффициент регрессии (b)

Процент больных миомой родственников I степени родства (X/) 1,08 0,1

Размеры матки при выявлении миомы (в неделях) (Х2) 5,1 2,0

Носительство аллеля 754С FGF II (AV) 1,12 0,12

Носительство аллеля 3123G IGF II (Xj) 2,35 0,85

Примечание: Ьо = -10,8

Выводы

1. Пациенты с верифицированным диагнозом миомы матки характеризуются ранним началом половой жизни (р<0,0001), статистически большим количеством беременностей (р<0,0001), родов (р = 0,0021) и абортов (р<0,0001), более высокой частотой встречаемости воспалительных заболеваний придатков матки (р = 0,02), гиперпластических процессов эндометрия (0,04), аденомиоза (р = 0,01), отягощенным соматическим анамнезом.

2. Функционально значимые полиморфные варианты генов фактора роста фибробластов II типа 754СС FGF II (р = 0,01) и инсулиноподобного фактора роста II типа 3123АА IGF II {р = 0,01) ассоциированы с формированием миомы матки. Генотип 3123 АА IGF II играет протективную роль в развитии миомы матки. Полиморфный гомозиготный мутантный вариант 72СС гена белка апоптоза р53 ассоциирован с возникновением миомы матки у пациенток с наследственной отягощенностью по развитию данной патологии (р = 0,018). Характер поражения матки узлами миомы ассоциирован с полиморфными вариантами генов факторов роста фибробластов I и II типов, гена белка апоптоза Таким образом, установлены молекулярно-генетические маркеры развития миомы матки, значимость которых подтверждена на различных этапах статистического анализа.

3. Пациентки с наследственной отягощенностью по развитию миомы матки в сравнении с остальными пациентами основной группы отличаются резистентностью к консервативному лечению (р = 0,05) и более частому осложнению заболевания синдромом хронической тазовой боли (р = 0,03).

4. Характер выявленных ассоциаций межгенного взаимодействия выявил накопление среди пациенток с миомой матки функционально активных аллелей генов факторов роста (754С FGF II, 3123G IGFII) в сочетании с функционально неполноценным аллельным вариантом гена белка апоптоза р53 (72СС).

5. При использовании логистического регрессионного анализа были получены уравнения регрессии, включающие данные генотипирования и клинико-гснсалогичсского анализа, на основании которых возможно прогнозирование формирования миомы матки, темпа роста узлов, тактики лечения.

Практические рекомендации

1. В гинекологических стационарах и в условиях женских консультаций необходимо выделять группу повышенного риска развития миомы матки на основе проведения молекулярно-генетического тестирования полиморфных вариантов генов фактора роста фибробластов II типа и инсулиноподобного фактора роста II типа.

2. При молекулярно-генетическом обследовании пациенток с миомой матки необходимо использовать генотипы 754СС фактора роста фибробластов II типа и 72СС гена белка апоптоза р53 в качестве маркеров развития миомы матки больших и средних размеров.

3 У пациенток с наследственной отягощенностью необходимо использовать гомозиготный генотип 72СС гена белка апоптоза р53 в качестве

маркера развития миомы матки.

4. С помощью построенных статистических регрессионных моделей на основе полученных результатов возможно прогнозирование вероятности развития заболевания, проведение оценки темпа роста узлов миомы, составление прогноза тактики лечения.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Биличенко (Сорокина), М.В. Современные подходы к изучению механизмов формирования миомы матки / М.В. Биличенко, В.П. Иванов, О.Ю. Бушуева, Г.А. Лазарева, Л.А. Карагезян, Ю.В. Шинкаренко // Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии : сб. материалов II Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. - Курск, 2011. - С. 143-144.

2. Биличенко (Сорокина), М.В. Роль факторов роста в формировании миомы матки / О.Ю. Бушуева, М.В. Биличенко, В.П. Иванов, Г.А. Лазарева, Л.А. Карагезян, Ю.В. Шинкаренко // Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии: сб. материалов II Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. - Курск, 2011. - С. 148-149.

3. Биличенко (Сорокина), М.В. Изучение особенностей анамнеза и наследственной отягощенности у пациенток с миомой матки / М.В. Биличенко // Сб. материалов 76-й итоговой студенческой науч.-практ. конф. с междунар. участием, посвящ. 90-летию со дня рождения проф. Л.Л. Роднянского. -Красноярск, 2012. - С. 112-113.

4. Биличенко (Сорокина), М.В. Особенности гинекологического анамнеза и наследственной отягощенности у пациенток с миомой матки / М.В. Биличенко // Проблемы и перспективы развития современной медицины: сб. науч. ст. IV Республ. науч.-практ. конф. с междунар. участием студентов и молодых ученых. - Гомель, 2012. - Т. 1. - С. 59-61.

5. Биличенко (Сорокина), М.В. Анализ отягощенности акушерско-гинекологического анамнеза у больных миомой матки / М.В. Биличенко,

B.П. Иванов, Г.А. Лазарева, О.Ю. Бушуева // Материалы VII междунар. науч. конф. молодых ученых-медиков. - Курск, 2013.-T. 1.-С. 116-118.

6. Биличенко (Сорокина), М.В. Наследственная отягощенность соматического и гинекологического анамнеза у пациенток с миомой матки / М.В. Биличенко, О.Ю. Бушуева // Молодежная наука и современность : материалы 78-й Всерос. науч. конф. студентов и молодых учёных с междунар. участием, посвящ. 78-летию КГМУ и 80-летию со дня рождения чл.-кор. РАМН, проф. A.B. Завьялова. - Курск, 2013. - Ч. 2. - С. 9.

7. Биличенко (Сорокина), М.В. Анализ отягощенности акушерско-гинекологического и соматического анамнеза у больных миомой матки / М.В. Биличенко, О.Ю. Бушуева // Врач-аспирант. - 2013. - № 2.3 (57). -

C. 373-379.

8. Биличенко (Сорокина), M.B. Исследование ассоциации полиморфизма 3123 G/A гена IGF II с развитием миомы матки / М.В. Биличенко, О.Ю. Бушуева, В.П. Иванов, Г.А. Лазарева // Врач-аспирант.-2013.-№4.1 (59).-С. 140-144.

9. Биличенко (Сорокина), М.В. Исследование ассоциации полиморфизма 754C/G гена FGFII с развитием миомы матки / М.В. Биличенко, О.Ю. Бушуева, O.K. Кудрявцева, В.П. Иванов, Г.А. Лазарева, A.B. Полоников // Курск, науч.-практ. вести. «Человек и его здоровье».-2013.-№2.-С. 5-9.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

dNTP- дсзокситрифосфаты EFGR - рецептор эпидермального фактора роста EGF - эпидермальный фактор роста FGF I - фактор роста фибробластов I типа FGF II - фактор роста фибробластов II типа HMGIC - высокоподвижные хроматин-ассоциированные негистонные белки IGF II - инсулиноподобный фактор роста II типа

IGF 1R - рецептор инсулиноподобного

фактора роста I типа

IGFBP1-6 - связывающие белки

инсулиноподобного фактора роста I -6 типа

OR - отношение шансов

PCNA - ядерный антиген пролифери-

рующих клеток

PDFGA -тромбощггарный фактор роста TGF-P1 - трансформирующий фактор роста р 1

VEGF - сосудисто-эндотелиальный фактор роста

ГМК - гладкомышечная клетка ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ИБС - ишемическая болезнь сердца ИПФР-Н - инсулиноподобный фактор роста II типа

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

мРНК - матричная рибонуклеиновая

кислота

ОНП - алигонуклеотидная последовательность

ПК - персональный компьютер

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - матричная рибонуклеиновая кислота

СДГ - сорбитолдегидрогеназа

ТФР-р - трансформирующий фактор

роста р

ФРФ - фактор роста фибробластов ЩФ - щелочная фосфотаза ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭФР - эпидермальный фактор роста ЭЦМ - экстрацеллюлярный матрикс

Лицензия ЛР № 020862 от 30.04.99 г. Сдано в набор 12.12.2014 г. Подписано в печать 15.12.2014 г. Формат 30х42'/8 Бумага офсетная. Гарнитура Times New Rom. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 286«А». Издательство Курского государственного медицинского университета 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.