Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Количественное определение возбудителей гемотрансмиссивных инфекций методом полимеразной цепной реакции на олигонуклеотидном микрочипе

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Количественное определение возбудителей гемотрансмиссивных инфекций методом полимеразной цепной реакции на олигонуклеотидном микрочипе"

На правах рукописи

Ходаков Дмитрий Андреевич

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ГЕМОТРАНСМИССИВНЫХ ИНФЕКЦИЙ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ НА ОЛИГОНУКЛЕОТИДНОМ МИКРОЧИПЕ

03.00.03. - Молекулярная биология 03.00.23. - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2009

003463547

Работа выполнена в Лаборатории биологических микрочипов Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Научный руководитель

Кандидат биологических наук

В.М. Михайлович

Официальные оппоненты

Доктор биологических наук, проф. Кандидат биологических наук

В.С. Прасолов Н.А. Черных

Ведущая организация

Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

диссертационного совета Д 002.235.01 при Учреждении Российской академии наук Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, г. Москва, ул. Вавилова, д.32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

//

<Ю

Защита состоится

года в

час на заседании

Автореферат разослан

г.

Ученый секретарь диссертационного о Кандидат химических наук

Принятые сокращения

5'-UTR- 5'- нетранслируемьш регион (5 - Untranslated Region)

dNTPs - 2'-дезоксинуклеозидтрифосфаты (2'-deoxyribonucIeozide triphosphates)

Ct-пороговый цикл флуоресценции (Threshold Cycle)

HBV - вирус гепатита В (Hepatitis В Virus)

HCV - вирус гепатита С (Hepatitis С Virus)

HIV-1 - вирус иммунодефицита человека тип 1 (Human Immunodeficiency Virus type 1) LCR - лигазная цепная реакция (Lygase Chain Reaction)

NASBA - последовательность-специфичная амплификация нуклеиновых кислот

(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) NAT - метода? изучения нуклеиновых кислот (Nucleic Acid Testing)

PCR - полимеразная цепная реакция (Polymerase Chain Reaction)

qPCR - количественная полимеразная цепная реакция с регистрацией результатов в

режиме реального времени (quantitative PCR) RT-PCR - полимеразная цепная реакция, совмещённая с обратной транскрипцией

(Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction) TMA - транскрипция-опосредованная амплификация (Transcription-Mediated

Amplification) ГЭкв - геном-эквивалент

ДНК - дезоксирибонуклеивовая кислота

НК - нуклеиновые кислоты

РНК - рибонуклеиновая кислота

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Снижение риска заражения пациентов при гемотрансфузиях является одной из актуальных проблем современной трансфузионной медицины. Решение этой проблемы представляется возможным при создании и внедрении в лабораторную практику службы крови современных быстрых надёжных и чувствительных методов обнаружения вирусов в донорской крови.

К настоящему времени значительный прогресс достигнут в разработке иммунологических методов [Brust et al., 2000, Sickinger et al., 2004], но их применение имеет существенное ограничение, в частности, эти методы не могут эффективно использоваться в период серонегативного окна, ассоциированного с инфекциями, вызванными вирусами гепатита В (HBV) и С (HCV) и иммунодефицита человека первого типа (HIV-1), а также в случае иммуновариантных и неиммуногенных форм инфекции [Soldan et al., 2001].

Методы, основанные на обнаружении нуклеиновых кислот (Nucleic Acids Testing, NAT), являются более перспективными в системе лабораторной диагностики, так как сочетают в себе высокую чувствительность и специфичность с возможностью непосредственного выявления и анализа фрагментов геномов инфекционных агентов [Allain et al., 2000, Candotti et al., 2003]. NAT-методы позволяют проводить исследования в мультиплексном формате, то есть, обнаруживать несколько генетических мишеней одновременно.

Существует ряд зарубежных коммерческих тест-систем для одновременного определения HBV, HCV и HIV-1 в донорской крови [Defoort et al„ 2000, Vet et al., 1999, Meng et al., 2001, Candotti et al., 2004, Dineva et al., 2005]. Эти системы основаны на различных методических подходах, использующих принцип последовательность-специфичной амплификации нуклеиновых кислот, таких как: полимеразная цепная реакция (Polymerase Chain Reaction - PCR, Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction - RT-PCR), лигазная цепная реакция (Lygase Chain Reaction - LCR), последовательность-специфичная амплификация нуклеиновых кислот (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification, NASBA), и транскрипция-опосредованная амплификация (Transcription-Mediated Amplification, TMA) [Allain et al., 2000}. В современных разработках, в основном, применяется метод регистрации результатов непосредственно во время протекания реакции с помощью флуоресцентных красителей, что значительно сокращает время анализа,

увеличивает чувствительность метода и позволяет проводить анализ количественно (quantitative PCR - qPCR).

К сожалению, на данный момент отечественных тест-систем, способных одновременно обнаруживать несколько генетических мишеней и пригодных для применения в системе службы крови, в частности, для обнаружения возбудителей гемотрансмиссивных инфекций, не разработано.

Необходимо отметить, что при проведении qPCR в мультиплексном формате возникает ряд трудностей: количество одновременно идентифицируемых мишеней ограничивается возможными межпраймерными взаимодействиями, а перекрывание спектров поглощения и испускания, используемых флуорофоров, не позволяет одновременно регистрировать более четырёх-пяти продуктов амплификации в одной реакции [Burucoa et al., 2008, Chen et al., 2008].

Применение олигонуклеотидных микрочипов [Sobek et al., 2006], в которых каждая ячейка представляет собой отдельный независимый реакционный элемент, для проведения мультиплексной PCR с регистрацией результатов в режиме реального времени представляется наиболее перспективным подходом для одновременного обнаружения, идентификации и количественного многопараметрического анализа различных генетических мишеней.

Цель исследования

Целью работы является разработка метода мультиплексной полимеразной цепной реакции на олигонуклеотидном микрочипе с регистрацией результатов в режиме реального времени для количественного определения возбудителей гемотрансмиссивных инфекций (HBV,HCVhHIV-1).

Задачи исследования

Для достижения цели необходимо решить следующие задачи:

1. разработать метод мультиплексной PCR на микрочипе и определить оптимальный способ регистрации продуктов амплификации в режиме реального времени;

2. провести анализ нуклеотидных последовательностей вирусных геномов (MV-1, HCV и HBV) и определить специфические мишени для конструирования праймеров;

3. определить оптимальные условия проведения количественного анализа НК вирусов HBV, HCV и HIV-1 в клинических образцах методом мультиплексной PCR на микрочипе;

4. определить диагностические характеристики разработанного метода.

Научная новизна работы

Впервые разработан метод мультиплексной PCR на микрочипе с регистрацией результатов в режиме реального времени с применением одного флуоресцентного красителя (SYBR Green I). Выполнена теоретическая и экспериментальная работа, направленная на достижение необходимых значений чувствительности, специфичности и эффективности мультиплексной PCR на микрочипе.

Впервые создан олигонуклеотидный микрочип, позволяющий проводить одновременное количественное обнаружение ДНК HBV, РНК HCV и HIV-1 в образцах плазмы крови человека. Определены диагностические характеристики разработанного метода.

Показано, что разработанный подход обладает высокой аналитической чувствительностью и специфичностью, может эффективно выполняться в мультиплексном формате и рассматриваться как универсальный инструмент для будущих разработок, нацеленных на одновременную идентификацию других генетических мишеней.

Научно-практическая значимость работы

Впервые выполнено одновременное количественное определение НК HBV, HCV и HIV-1 в образцах плазмы крови человека методом мультиплексной qPCR на олигонуклеотидном микрочипе.

Разработанным методом проанализировано 132 образца плазмы крови человека. Чувствительность и специфичность метода, на указанной выборке, составили 100 %. Предел обнаружения с вероятностью определения 95% составил 14, 10 и 15 геном-эквивалентов (ГЭкв) на реакцию для HIV-1, HBV и HCV, соответственно. Динамический диапазон количественного анализа позволяет определять НК указанных возбудителей в концентрациях от 101 до 108 ГЭкв на реакцию (для каждой из анализируемых мишеней). Полученные характеристики соответствуют современным требованиям, предъявляемым к тест-системам для количественного определения НК HIV-1, HBV и HCV в донорской крови.

Принцип пространственного разделения специфических праймеров в отдельных гелевых элементах микрочипа позволяет использовать метод мультиплексной PCR на микрочипе с регистрацией результатов в режиме реального времени как основу для разработки диагностических систем, пригодных для применения в клинико-

диагностических лабораториях. Предложенная концепция также может быть применена для выполнения широкого спектра исследований, связанных с многопараметрической идентификацией и количественным определением иных генетических мишеней.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на Международной конференции «BIOVISION 2008» (Александрия, Египет, 2008), и ежегодных отчётных конференциях аспирантов ИМБ РАН (2005 и 2006 г.г.)

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 7 печатных работ, включая 3 статьи и 4 тезисов докладов.

Объём и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на _

страницах машинописного текста и включают _рисунков и _таблиц. Диссертация

состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Экспериментальная часть», «Результаты исследований и их обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы», который содержит_наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Клнническне образцы. В работе было проанализировано 132 клинических образца плазмы крови, предварительно охарактеризованных стандартными методами ИФА и PCR. Среди изученных образцов 39 содержали HCV (генотипы 1а, 1в, 2 и За), 56 - HBV, 31 - HIV-1 (субтипы А и В) и 18 были серонегативными.

Референс-образцы плазмы крови человека, использованные для определения аналитической чувствительности метода, с концентрациями 3,82х I06 ГЭкв/мл (HIV-1, субтип А), 1,73х107 ГЭкв/мл (HBV) и 1,04*107 ГЭкв/мл (HCV, генотип 1а), были любезно предоставлены профессором Jacques Izopet (Лаборатория вирусологии, госпиталь университета г. Тулузы, Франция).

Работа с инфекционными образцами плазмы крови выполнялась на базе Гематологического научного центра РАМН (Лаборатория вирусных гепатитов и ВИЧ).

Бактериальные штаммы. В работе применяли бактериальные штаммы E.coli DH5a и JM109. Клетки были трансформированы плазмидами pBluescript II, с клонированным участком gag HIV-1 субтнпов А и В (штаммы VI310 и ТВ 132, соответственно).

Микробиологические методы и методы генетической инженерии. Культивирование бактериальных клеток проводили в среде LB, селекцию на среде с

антибиотиком (ампициллин), получение компетентных клеток и трансформацию проводили согласно стандартным методикам [Sambrook et al., 2001].

Выделение вирусных и бактериальных нуклеиновых кислот. Выделение вирусных нуклеиновых кислот проводили наборами реагентов для выделения ДНК/РНК (ДНК-технология, Россия) и QIAamp MinEIute Virus Spin Kit (Qiagen, Германия), согласно протоколам производителей из 100 и 200 мкл образца, соответственно. Выделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток проводили методом щелочного лизиса с последующей экстракцией фенолом и переосаждением этанолом.

Количественное определение вирусных нуклеиновых кислот. Определение концентрации вирусных нуклеиновых кислот проводили с помощью наборов реагентов RealArt™ HBV RG PCR kit (Qiagen, Германия), HIV-1 RG PCR kit (Qiagen, Германия), ГЕПАТОГЕН-Б Количественный (ДНК-Технология, Россия), ОТ-ГЕПАТОГЕН-С Количественный (ДНК-Технология, Россия), ВИЧ-ГЕН Количественный (ДНК-Технология, Россия), RealTime HIV-1 (Abbott, США) и RealTime HCV (Abbott, США), согласно инструкциям производителей. Измерения производили на приборах RotorGene 3000 (Corbet Research, Австралия) и m2000 (Abbott, США) на базе Московского городского центра профилактики и борьбы со СПИДом (Департамент здравоохранения города Москвы) и в Гематологическом научном центре РАМН.

Олигонуклеотиды к биочипы, Олигонуклеотиды синтезировали на автоматическом синтезаторе 394 DNA/RNA synthesizer (Applied Biosystems, США) стандартным фосфороамидитным методом и очищали при помощи обращенно-фазовой ВЭЖХ. Для иммобилизации в ячейках биочипа при синтезе в состав олигонуклеотидов вводили свободную аминогруппу по 5'-концевому основанию, используя 5'-Amino-Modifier С6 (Glen Research, США).

Изготовление биочипов проводили согласно ранее опубликованному протоколу [Pankov et al., 2003]. Нанесение ячеек геля на стекло проводили с использованием специальных игл диаметром 150,300 и 600 мкм.

Мультиплексная RT-PCR. Объём реакции составлял 25 мкл. Реакционная смесь содержала: PCR буфер (70мМ Трис-HCl (pH 8,6), 16,6 мМ (NH^SO-i), 3 мМ MgCI2, 0,2 мМ dNTPs, (Силекс, Россия), 0,2 мкМ праймеров для проведения реакции RT-PCR, 2 ед. ингибитора рибонуклеаз RNasIn (Fermentas, Литва), 20 ед. обратной транскриптазы M-MLV (Sileks, Россия), 5 ед. Taq полимеразы (Sileks, Россия). После предварительной инкубации при 55°С в течение 30 мин (стадия обратной транскрипции), проводили от 25 до 35 циклов амплификации (95°С - 20 с, 65°С - 30 с, 72°С - 30 с) и заключительную элонгацию в течение 5 мин при 72°С. В качестве матрицы использовали 10 мкл препарата НК, выделенного из анализируемых клинических образцов плазмы крови человека, юга же

плазмидную ДНК с клонированным gag участком HIV-1. Реакцию проводили на амплификаторе Diad DNA Engine (MJ Research, США).

Мультиплексная qPCR на биологическом микрочипе. Реакцию проводили в реакционной камере микрочипа, образованной подложкой микрочипа, покровным стеклом и прокладкой Frame-Seal In-Situ PCR (Bio-Rad, США) между ними. Обьём реакционной камеры составлял 25 мкл.

В состав реакционной смеси входил PCR буфер (Stratagene, США), 1,5 мМ MgClj, 0,2 мМ dNTPs, (Силекс, Россия), 0,2 мкМ праймеров для проведения PCR на микрочипе, 0,2 мг/мл БСА, фракция V (Sigma, США), неспецифичный флуоресцентный краситель SYBR Green I (Invitrogen, США), 2,5 ед. Hot-Start Taq полимеразы (Stratagen, США). В качестве матрицы использовали 1 мкл продукта RT-PCR реакции.

PCR на микрочипе и регистрацию флуоресценции (длина волны возбуждения - 494 нм, испускания - 518 нм, при выдержке от 100 до 500 мс) производили на специальной установке для проведения PCR на микрочипе, совмещённой с флуоресцентным микроскопом (ИМБ РАН, Россия), в следующем режиме: после стадии активации Taq полимеразы и первичной денатурации (95°С, 10 мин) проводили 35-50 трёхстадийных циклов (95°С - 30 с, 55°С - 30 с, 68°С - 45 с).

Определение предела чувствительности qPCR на микрочипе. Предел обнаружения с вероятностью выявления 95% и аналитическую чувствительность разработанной системы определяли анализом последовательных 10-ти кратных разведений референс-образцов. Каждое разведение анализировалось в 25 независимых экспериментах. Статистическую обработку результатов проводили с помощью метода пробит-анализа [Finney, 1971].

Регистрация результатов qPCR на микрочипе и обработка полученных данных.

Регистрацию и обработку флуоресцентного изображения микрочипа выполняли с помощью программы ImageExpress (ИМБ РАН, Россия).

Результаты н их обсуждение

Метод мультиплексной qPCR на микрочипе

Для одновременного количественного анализа нескольких генетических мишеней необходимо было разработать метод проведения мультиплексной PCR на микрочипе с регистрацией результатов в режиме реального времени.

Схема PCR, проводимой на микрочипе, представлена на рисунке 1. Молекулы ДНК отжигаются на специфические иммобилизованные праймеры в индивидуальных ячейках. Специфические праймеры экстендируются ДНК-полимеразой (а), образуя при этом новую

9

цепь ДНК, ковалентно фиксированную в гелевой ячейке за 5'-концевой нуклеотид. Данная цепь, в свою очередь, служит матрицей для отжига свободного праймера находящегося в растворе (Ь), после элонгации которого образуется двухцепочечная молекула ДНК, способная связывать специальный флуоресцентный краситель, тем самым, переводя его во флуоресцирующее состояние (с). Так как каждая ячейка содержит праймеры, специфичные только к одной мишени, то кинетика накопления флуоресцентного сигнала в ячейке отображает накопление соответствующего продукта амплификации.

Рисунок 1. Схема PCR на микрочипе с иммобилизованными праймерамн и выявление продукта амплификации с помощью флуоресцентного красителя SYBR Green I.A- начальные циклы амплификации. В - экспоненциальная амплификация, а) - отжиг ДНК и экстеиция иммобилизованных праймеров, Ь) - отжиг и экстенцня праймеров из раствора, с) - связывание флуоресцентного красителя с продуктом амплификации.

Выявление двухцепочечных продуктов амплификации в ячейках микрочипа происходит посредством регистрации флуоресценции неспецифичного красителя SYBR Green I (Zipper et al., 2004), связанного с данной двунитевой ДНК. Краситель SYBR Green I относится к классу асимметричных цианиновых красителей. Максимум флуоресценции в комплексе с ДНК составляет 521 нм, максимум возбуждения - 497 нм (второй максимум около 254 нм). Квантовый выход флуоресценции SYBR Green I в комплексе с ДНК составляет 80 %. Благодаря физическому разделению индивидуальных гелевых элементов микрочипа с иммобилизованными в них праймерами, стало возможным применение одного неспецифичного ДНК-связывакяцего флуоресцентного красителя (SYBR Green I) для одновременного и независимого выявления всех продуктов мультиплексной PCR. Это отличает предложенный подход от других мультиплексных систем, использующих SYBR Green 1 для общего анализа продуктов амплификации и дискриминации их методом анализа кривых плавления. Разработанный способ регистрации результатов PCR позволил

А

В

значительно упростить метод и увеличить количество одновременно идентифицируемых мишеней, так как в данном случае отпадает необходимость применения сложных и дорогих последовательность-специфичных флуоресцентных зондов, таких как Taqman, Molecular Beacon и др. Однако, при применении SYBR Green 1 следует более тщательно подходить к выбору праймеров и размера амплифицируемого фрагмента, так как любая неспецифическая амплификация, например, неспецифическая достройка димеров праймеров, будет непременно приводить к возрастанию фонового флуоресцентного сигнала.

Значение флуоресцентного сигнала в каждой ячейке измеряли в конце каждой стадии элонгации, когда специфический гибридизационный комплекс оставался стабильным из-за его более высокой температуры плавления по сравнению с температурами плавления коротких неспецифичных двухцепочечных последовательностей. Специфичность амплификации участков генов-мишеней в разработанном методе подтверждали анализом температур плавления продуктов реакции. На рисунках 2А и 2В изображены основиые стадии кинетики накопления флуоресцентного сигнала в линейных и логарифмических координатах, соответственно. На графиках можно выделить 4 основные стадии: предэкспоненциальная амплификация, в течение которой регистрируется только фоновая флуоресценция, экспоненциальное накопление флуоресцентного сигнала -наиболее значимый участок для проведения количественных измерений, линейная амплификация и плато. Анализ температуры плавления продукта амплификации (Рис. 2С) проводится после реакции PCR.

Рисунок 2. Кинетика накопления флуоресцентного сигнала и анализ кривой плавления продукта амслифнкацкн. А, В — кинетика накопления флуоресцентного сигнала во время различных фаз PCR, в линейных и логарифмических координатах, соответственно. С — определение температуры плавления продукта амплификации.

Обработка данных кинетики накопления флуоресцентного сигнала

Обработку первичных флуоресцентных данных (рис. ЗА) проводили после окончания реакции в программах MS Excel и Origin 6.0.

Обработка данных включала следующие этапы:

- сглаживание данных методом трёхточечной аппроксимации - для нивелирования аппаратных особенностей получения флуоресцентного изображения от цикла к циклу (рис. ЗВ);

- вычитание базового сигнала - для приведения сигналов, регистрируемых в различных ячейках микрочипа, к минимальному значению на начальных циклах амплификации, когда флуоресцентный сигнал отсутствует по определению или обусловлен неспецифической флуоресценцией на ранних циклах реакции. По сути, данный этап представляет собой вычитание усреднённого значения сигнала за первые 3-5 циклов реакции (рис. 3 С);

- нормализация амплитуды сигнала - для более точного определения порогового цикла возрастания флуоресценции, используемого дня получения количественных данных в qPCR (рис. 3 D).

Рисунок 3. Этапы обработки данных по кинетике накопления флуоресцентного сигнала. А - исходные флуоресцентные данные. В - данные после сглажнванм методом трёхточечной аппроксимации. С - данные после вычитания базового сигнала. О - нормализованные данные.

Выбор оптимальных условий проведения мультиплексной PCR на микрочипе н регистрации продуктов амплификации

Концентрация иммобилизованных праймеров

Эффективность протекания PCR реакции на микрочипе, так же как и при проведении PCR в пробирке, находится в зависимости от концентрации праймеров. Показано, что концентрация иммобилизованных праймеров влияет как на эффективность PCR на микрочипе, так и на значение абсолютного сигнала флуоресценции. На рисунке 4 отображены результаты накопления флуоресцентного сигнала в ячейках микрочипа при проведении PCR, полученные при различной концентрации иммобилизованных праймеров: 12,5; 25; 50; 100; 200 и 400 мкМ. При концентрациях от 100 до 400 мкМ значительной разницы в кинетике накопления сигналов обнаружено не было. Однако при концентрациях менее 100 мкМ наблюдали как уменьшение абсолютного сигнала флуоресценции (рис. 4А), так и увеличение значения Ct (рис. 4В). По этой причине в дальнейшей работе для иммобилизованных праймеров была выбрана концентрация 200 мкМ.

Рисунок 4. Зависимость эффективности PCR па микрочнпе от концентрации иммобилизованных праймеров (А - линейные, В - логарифмические координаты). Концентрация иммобилизованных праймеров составляла: 12,5 мкМ (■), 25 мкМ (•), 50 мкМ (А), 100 мкМ (▼), 200 мкМ (♦) и 400 мкМ (*).

Диаметр гидрогелевых ячеек микрочипа

Важную роль на эффективность протекания PCR на микрочипе играет диаметр гелевых элементов с иммобилизованными праймерами. Анализ кинетики накопления флуоресцентного сигнала в ячейках разного диаметра показал, что при увеличении диаметра ячейки увеличивался абсолютный флуоресцентный сигнал, и повышалась эффективность амплификации (рис. 5). В то же время, эффективность протекания PCR в ячейках диаметром 300 и 600 мкм была практически идентична.

номер «щл» номер цикла

Рисунок 5. Зависимость эффективности qPCR на микрочнпе от диаметра ячеек микрочнпа (А -линейные, В - логарифмические координаты). Диаметр ячеек составлял 150 мкм (В), 300 мкм (•), 600 мкм (А).

Концентрация ионов Mg2*

Было изучено влияние концентрации ионов магния в пределах от 1 до 4 мМ на эффективность протекания qPCR на микрочипе. Показано, что максимальный флуоресцентный сигнал достигается при концентрации ионов магния 1,5 мМ. При этом, изменение концентрации практически не влияло на значение порогового цикла (Рис. 6). Интересно, что полученные данные при проведении qPCR на микрочипе расходятся с таковыми зависимостями при проведении PCR в присутствии SYBR Green I в пробирке, где для увеличения эффективности qPCR требуется увеличение концентрации MgJ+ до 4 мМ из-за ингибирующего влияния красителя.

Рисунок 6. Зависимость зффекгивностя qPCR на мнкрочипе от концентрации ионов магния. А - график зависимости абсолютного флуоресцентного сигнала от концентрации ионов магния. В — значение порогового пикла флуоресценции при концентрации ионов магння 1 мМ (В), 1,5 мМ (•), 1 мМ (А), 2,5 мМ (▼) н 4 мМ (♦).

Концентрация SYBR Green I

Очевидно, что при увеличении концентрации флуоресцентного красителя должно наблюдаться повышение абсолютного флуоресцентного сигнала. Действительно, при 3-х кратном увеличении концентрации красителя значение абсолютного флуоресцентного сигнала возрастало более чем на 50%, в то же время было зарегистрировано и увеличение значения порогового цикла флуоресценции Ct (более чем на 3 цикла), что, в свою очередь, согласуется с литературными данными об ингибирующем действии высоких концентраций SYBR Green I на ДНК-полимеразу. В ходе работы показано, что рекомендуемая производителем однократная концентрация SYBR Green I, применяемая для регистрации двухцепочечной ДНК в растворе, является оптимальной и для проведения qPCR на микрочипе.

Температура отжига праймеров

При подборе оптимальных условий проведения qPCR на микрочипе был подтверждён факт, обнаруженный ранее [Strizhkov et а]., 2000], что при уменьшении температуры отжига праймеров на 5-6 °С наблюдалось значительное увеличение эффективности PCR (рис. 7А), при этом специфичность реакции оставалась прежней (рис. 7В). Корректировка температуры отжига во время амплификации производилась по отношению к теоретически рассчитанной температуре плавления иммобилизованных праймеров. Композиция геля, используемого в данной работе, отличалась от состава, использованного в работе Стрижкова, так же как и последовательности олигонукпеотидов, - тем не менее, введение корректировки температуры отжига на указанную величину повышало эффективность PCR.

Рисунок 7. Зависимость эффективности qPCR на микрочипе от температуры отжига. А - кинетика накопления флуоресцентного сигнала, В - анализ температур плавления продуктов амплификации (В - отжиг при 62 "С, • - отжиг при 55 *С).

Количественная мультиплексная PCR иа микрочипе

Бьи разработан метод qPCR на микрочипе с детекцией результатов в режиме реального времени для количественного определения НК HIV-1, HBV и HCV в образцах плазмы крови человека.

Метод включает два этапа: а) стадия мультиплексной предамплификации, совмещённая с обратной транскрипцией - RT-PCR и б) стадия мультиплексной qPCR на биологическом микрочипе, совмещённая с регистрацией результатов амплификации в режиме реального времени.

Первая стадия RT-PCR, проводимая в пробирке, предназначена для получения кДНК с РНК вирусов гепатита С и H1V-1 и корректирования динамического диапазона количественных измерений. Стратегия двустадийной PCR была применена для повышения чувствительности и специфичности системы.

На рисунке 8 представлена схема микрочипа для проведения мультиплексной qPCR и регистрации результатов в режиме реального времени. Микрочип состоял из 14 гелевых ячеек, в трёх из которых иммобилизованы праймеры, специфичные к последовательностям HIV-1, HBV и HCV. Остальные ячейки, содержащие [«специфические олигонуклеотиды, предназначены для регистрации фонового флуоресцентного сигнала.

Рисунок 8. Схема микрочипа для одновременного количественного определения HIV-1, HBV и HCV.

Выбор генетических мишеней для обпаружепня вирусных нуклеиновых кислот

Известно, что геномы вирусов гепатита В, С и H1V-1 отличаются большой вариабельностью. Для выбора оптимальных генов-мишеней бьш проведён широкомасштабный анализ вирусных нуклсотидных последовательностей. Было проанализировано 480 последовательностей геномов HIV-1, 160 и 150 геномов HCV и HBV, соответственно (http://vww.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/, http://www.ebi.ac.uk/clustalw). На рисунке 9 приведён пример множественного выравнивания последовательностей H1V-1 различных субтипов. Очевидно что, при выборе мишени для идентификации предпочтение отдавалось наиболее консервативным участкам геномов. В результате были выбраны следующие гены-мишени: gag ген - для HIV-1, 5'-нетранслируемый участок - для вируса гепатита С (5'-UTR), X ген - для вируса гепатита В. На основе последовательностей выбранных консервативных участков были сконструированы праймеры для проведения реакций амплификации (Таблица 1).

При конструировании праймеров руководствовались принципами высокой специфичности по отношению к гену-мишени, отсутствием иеспецифических сайтов связывания праймеров и минимальными меж-, внутрипраймерными и самокомплементарными взаимодействиями. Кроме того, при разработке праймеров были учтены все известные к настоящему времени полиморфизмы в геномах вирусных субтипов. Также для успешной амплификации большинства вирусных субтипов была применена стандартная практика введения вырожденных оснований в последовательности праймеров.

Рисунок 9. Пример выравнивания последовательностей геномов HIV-1 различных субтнпов относительно субтипа A (Gen Bank № AF

Таблица 1. Последовательности специфических праймеров для количественного определения НК HIV-l, IJBV и IICV методом qPCR на микрочиле.

Праймер * Позиция * Последовательность 5'—>3'

HIV_OUT_F 762 AGAACCG(G/A)TCTACATA(G/A)TCTCTAA(G/A)G

HIVOUTR 1061 TGAGGA(G/A)GCTGCAGAATGGGA

H1VJNFJ 796 TGG(OT)CCTTGT(C/T)TTATGTCCA(G/A)AATG

HIV_IN_R 954 AGAACCAAGGGGAAGTGACATAG

HBV_OUT_F 1373 TCCATGGCTGCTAGGCTGTG

HBV_OUT_R 1584 GTGCAGAGGTGAAGCGAAGTG

HBV_IN_F_I 1431 GTCCCGTCGGCGCTGAATC

HBV_IN_R 1528 CGCGTAAAGAGAGGTGCGCC

HCV_OUT_F 69 CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGT

HCV_OUT_R 290 ACTCGCAAGCACCCTATCAGGCA

HCV_IN_FJ 146 GTCTGCGGAACCGGTGAGTACA

HCV IN_R 268 GTACCACAAGGCCTTTCGCGAC

* OUT - праймеры первой стадии RT-PCR (внешние); IN - праймеры второй стадии qPCR на микрочипе (внутренние); F - прямой праймер; R - обратный праймер; I -иммобилизованный праймер.

ь Номер позиции 5'- нуклеотида праймера в ген-кодирующей последовательности, в соответствии с номером базы данных Gen Bank. AY206658 {gag ген HIV-l, кДНК), АВ126581 (Х-ген HBV), и AF009606 (S'-UTR регион HCV).

Определение пределов обнаружения вирусных нуклеиновых кислот

Точное определение значений вирусной нагрузки в крови у инфицированных пациентов, получающих противовирусные препараты, имеет высокое прогностическое значение, особенно в стадии ремиссии. Пределы обнаружения вирусных нуклеиновых кислот определяли, анализируя последовательные десятикратные (для диапазона от 106 до 102 ГЭкв на реакцию) и двукратные (для диапазона от 10г до 10° ГЭкв на реакцию) разведения референс-образцов, содержащих известное количество вирусных НК. Пределы чувствительности с вероятностью обнаружения 95% составили 14, 10 и 15 геном-эквивалентов на реакцию для HIV, HBV и HCV, соответственно. Аналитическая чувствительность разработанной системы составила 3, 4 и 6 геном-эквивалентов на реакцию для HIV-l, HCV и HBV, соответственно. Статистическая обработка данных проводилась методом пробит-анализа. Разброс значений при определении концентраций не превышал одного порядка (1 Log) при анализе от 8 до 25 повторов для каждого образца.

Калибровочные кривые для количественного определения нуклеиновых кислот

Сопоставление значений пороговых циклов флуоресценции и исходной концентрации мишени показано на рисунке 10. Значения О, определённые из графиков, один из которых показан на рисунке 10В, были использованы для получения калибровочных кривых, представленных на рисунке 10А. Полученные схожие калибровочные кривые для Н1У-1, НВУ и НСУ свидетельствуют об одинаковой эффективности амплификации каждой из трёх мишеней и, как следствие, на возможность количественного определения каждой из мишеней по одной усреднённой калибровочной кривой.

ю 'ю0 10110! 10510ч 10s юЧо' 10* О 10 20 30 40

Количество анализируемой НК, ГЭ«в Номер цикла

Рисунок 10. А - калибровочные кривые для определения концентрации нуклеиновых кислот I1IV-1 (В), HBV (▲) и HCV (О). В - кинетика накопления флуоресцентного сигнала (в логарифмических координатах) при анализе последовательных 10-тн кратных разведении ДНК вируса гепатита В.

Динамический диапазон метода

Динамический диапазон количественного анализа позволяет определять НК в концентрациях от 101 до 10® геном-эквивалентов на реакцию для каждой из анализируемых мишеней, при количестве циклов первой стадии RT-PCR равном 23-28 (п) (Таблица 2, Рис. 11). Уменьшение количества циклов первой стадии приводило к сдвигу динамического диапазона для точного измерения более концентрированных образцов. При увеличении же количества стадий предамплификации динамический диапазон сужается, не приводя к увеличению аналитической чувствительности метода. Путём изменения количества стадий первого раунда PCR динамический диапазон метода может быть сдвинут в желаемую область измерений без каких-либо других модификаций в системе.

Таблица 2. Диагностические характеристики метола qPCR на микрочнпе для количественного определения НКIIIV-1, IÍBV н IICV.

ВиРУс чук~^.ВЕЧ S ТО™*-.» Специфичность"*. %

H.V-1 дад-рштон 14 3

HCV 54JTR 10 Л до 10® 10О 100

H8V Х-гак 15 6

" вероятность с£нару*«мм SS'S," вероятность обнаружения чувствительность я специфичиоси мтр^двяеиы на выбор'* из 132 образцов

Количество анализируемой НК, ГЭкв

Рисунок 11. Зависимость порогового цикла флуоресценции (Ct) qPCR на микрочипе от количества циклов реакции предамплификации RT-PCR (п).

Одновременный количественный анализ нуклеиновых кислот ШУ-1, НВУ и ЦСУ методом qPCR на микрочипе

На рисунке 12А представлена кинетика накопления флуоресцентных сигналов при одновременной амплификации НК ШУ-1, НВУ и НСУ на биологическом микрочипе. Фотография микрочипа была сделана в конце 22-го цикла амплификации. Значения температур плавления были определены после проведения анализа кривых плавления и составили 80, 92 и 89 °С для Н1У-1, НВУ и НСУ, соответственно (рисунок 12В). Экспериментально полученные значения полностью совпали с расчётными.

Рисунок 12. Одновременная амплификация НК вирусов Н1У-1 (Д), IIСУ (О) и ИВУ (О) (А) и анализ температур плавления продуктов реакции (В) на микрочипе. Фотография микрочнпа сделана после окончания 22 цикла ¡¡¡Ч К (С).

Для выяснения способности метода определять концентрации каждой из мишеней в присутствии избытка других нуклеиновых кислот была проанализирована серия последовательных десятикратных разведений (Ю'-Ю5) каждой из мишеней в присутствии 102 геном-эквивалентов двух других. Эксперимент был проведён при различных комбинациях НК трёх анализируемых мишеней. Калибровочные кривые и температуры плавления оставались неизменными независимо от того - одна, две или три мишени подвергались амплификации одновременно. На рисунке 13 представлен пример одновременной амплификации на биологическом микрочипе двух мишеней, разница концентраций которых составляла до 4 порядков.

Таким образом, была продемонстрирована возможность корректной одновременной количественной амплификации на биологическом микрочипе нескольких генетических мишеней вне зависимости от их концентраций.

Номер цикла

Рисунок 13. Кинетика накопления флуоресцентного сигнала при одновременной амплификации двух генетических мишеней (IIС\' - незаштрихованные маркеры, НВУ -заштрихованные маркеры) с разными концентрациями.

Исследование образцов плазмы крови человека методом мультиплексной qPCR на микрочипе

Было проанализировано 132 серологически охарактеризованных образца плазмы крови человека. Значения вирусной нагрузки, приведённые ниже, выражены в геном-эквивалентах на 1 мл исходного клинического образца.

Уровень вирусной нагрузки для 32 образцов, содержащих HIV-1, находился в пределах от 60 до 4,2 хЮ7 ГЭкв/мл. Менее 1000 ГЭкв/мл содержали пять образцов.

Из 58 образцов, содержащих вирус гепатита В, 11 имели концентрацию мишени менее 1000 ГЭкв/мл, 7 - более 107 ГЭкв/мл. Минимальная определённая концентрация ДИК HBV составила 50 ГЭкв/мл.

Из 50 проанализированных образцов плазмы крови, содержащей вирус гепатита С, минимальная концентрация РНК HCV составила 550 ГЭкв/мл, 9 образцов имели концентрацию менее 1000 ГЭкв/мл, 4 образца - более 107 ГЭкв/мл.

В четырёх из 22 образцов, содержащих как вирус гепатита С, так и ВИЧ, и в одном образце из двух, содержащих все три вируса, разница в концентрациях вирусов составляла более четырёх порядков. После анализа в трёх экспериментах расхождения значений концентраций для каждой мишени составили не более одного порядка, что говорит о хорошей воспроизводимости результатов количественного анализа.

Восемнадцать серонегатнвных образцов плазмы крови человека были проанализированы в качестве отрицательного контроля реакции. Ложноположительных результатов получено не было.

В дополнение к проведённым исследованиям, 20 образцов были зашифрованы и протестированы в формате «слепого» эксперимента. Все серопозитивные образцы были определены методом цРСЯ на микрочипе корректно, при этом, для отрицательных образцов специфической амплификации не наблюдали. Таким образом, чувствительность и специфичность разработанной системы составили 100 %. Полученные высокие результаты чувствительности и специфичности, скорее всего, объясняются малой выборкой использованных в эксперименте образцов. Очевидно, что на большей выборке эти показатели могут быть определены более точно.

На рисунке 14 показана корреляция значений концентраций НК Н1\М в плазме крови, определённых методом мультиплексной цРСЯ на микрочипе и с помощью коммерческих тест-систем (см. мат. и методы). Коэффициент детерминации Я2 для корреляции по Н1У-1 (Я2=0,95) несколько ниже, чем для НО/ и НВУ (0,979 и 0,987, соответственно; данные не представлены), что, очевидно, объясняется большей вариабельностью генома Н1У-1, и, как следствие, менее специфичным взаимодействием праймеров. Допускается, что после проведения анализа всех существующих генотипов вируса иммунодефицита человека возможна некоторая модификация праймерной системы, что, тем не менее, не внесёт принципиальных изменений в концепцию метода.

Рисунок 14. Корреляция значений концентраций образцов Н1У-1, определенных методом мультиплексной цРСК на микрочипе н коммерческими тест-системами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработанный метод количественного определения возбудителей гемотрансмиссивных инфекций на биологическом микрочипе является чувствительным, специфичным инструментом многопараметрического количественного анализа, позволяющим получать воспроизводимые результаты. Его дальнейшее развитие до стадии диагностической тест-системы и последующее её внедрение в клиническую лабораторную диагностику будет способствовать снижению риска передачи возбудителей гемотрансмиссивных инфекций и позволит в кратчайшие сроки определять вирусную нагрузку с целью оценки тяжести протекания заболевания и эффективности применения противовирусной терапии. Предложенный метод также может бьгть применён для выполнения широкого спектра исследований, связанных с многосторонней идентификацией и количественным определением других генетических мишеней.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод мультиплексной PCR на олигонуклеотидном микрочипе с регистрацией результатов амплификации в режиме реального времени с одним флуоресцентным красителем.

2. Изучено влияние компонентов реакционной смеси, температурно-временных режимов, концентраций иммобилизованных праймеров и размера гелевых ячеек на эффективность протекания qPCR на микрочипе и кинетику накопления флуоресцентных сигналов.

3. Создан биологический микрочип для одновременного выявления нуклеиновых кислот вирусов гепатитов В, С и иммунодефицита человека 1-го типа методом мультиплексной qPCR.

4. Разработанный метод применён для одновременного количественного анализа вирусных нуклеиновых кислот в образцах плазмы крови человека. Чувствительность и специфичность системы составили 100% (на выборке из 132 образцов), пределы количественного определения (с вероятностью обнаружения 95%) составили 14, 10 и 15 геном-эквивалентов для HIV-1, HCV и HBV, соответственно.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи

DA. Khodakov, N.V. Zakharova, D.A. Giyadunov, F.P. Filatov, A.S. Zasedatelev, V.M. Mikhailovich. An oligonucleotide microarray for multiplex real-time PCR identification of HIV-1, HBV, and HCV. // BioTechniques. -2008.-V. 44.-P. 241-248.

N.V. Zakharova, A.L. Drobyshev, D.A. Khodakov, A.I. Myznikova, I.A. Gorban. Simultaneous qualitative and quantitative identification of multiple targets by polymerase chain reaction on microarray. // Oligonucleotide Array Sequence Analysis. - Editors: M.K. Moretti and L.J. Rizzo. - Nova Science Publishers, Inc. New York. - 2008. - ISBN. 978-1-60456-542-3. - P. 385-404. А. И. Мызникова, С.АЛапа, Д.А. Грядунов, Д.А. Ходаков, A.C. Заседателев, В.М. Михайлович. Биологический микрочип для идентификации ортопоксвирусов и возбудителей, вызывающих схожую с натуральной оспой клиническую картину. // Вопросы вирусологии. - 2007. -№. 2. -Стр.41-44.

Тезисы

DA. Khodakov, N.V. Zakharova, D.A. Gryadunov, A.S. Zasedatelev, V.M. Mikhailovich. Identification and Quantification of Human Immunodeficiency Virus Type 1, Hepatitis В and С Viruses in Plasma Specimens by Real-Time On-Chip PCR. International Scientific Conference "Biovision 2008". Alexandria, Egypt. 2008.

E.E. Fesenko, D. Kireev, D.A. Gryadunov, DA. Khodakov, A.I. Myznikova, V.M. Mikhailovich, T.V. Grebennikova, A.S. Zasedatelev. Biological Microchips for genetic subtyping of Influenza A viruses. International Scientific Conference "Modern Problems in Genetics". Minsk, Belarus. 2005. A.I. Myznikova, S.A. Lapa, I.M. Susloparov, E.E. Fesenko, A.U. Kozlova, DA. Khodakov. Biological Microchip for Orthopoxvirus, Herpesvirus and Varicella-Zoster viruses differentiation. International Scientific Conference "Modem Problems in Genetics". Minsk, Belarus. 2005. M.Yu. Donnikov, A. Kirimaliev, D.A.Gryadunov, DA.Khodakov, V.M. Mikhailovich, A.S. Zasedatelev. Development of real-time on-chip polymerase chain reaction. International Scientific Conference "Modern Problems in Genetics". Minsk, Belarus. 2005.

Подписано в печать:

30.01.2009

Заказ № 1511 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ходаков, Дмитрий Андреевич

Принятые сокращения.

Введение.

Литературный обзор.

Гемотрансмиссивные инфекции: возбудители и их идентификация.

Характеристика основных инфекционных агентов, передающихся через кровь.

Вирус иммунодефицита человека (HIV).

Вирус гепатита С (HCV).

Вирус гепатита В (HBV).

Т-лимфотропные вирусы человека I и II типов (HTLV-1,2).

Вирус Эпштейна-Барр.

Вирусы простого герпеса 1 и 2 типов.

Цитомегаловирус.

Вирусы герпеса человека 6, 7 и 8 типов, парвовирус В19.

Проблема безопасности донорской крови.

Методы идентификации возбудителей гемотрансмиссивных инфекций.

Серологические методы идентификации возбудителей гемотрансмиссивных инфекций.

Методы идентификации возбудителей гемотрансмиссивных инфекций, основанные на обнаружении нуклеиновых кислот.

Амплификационные методы в скрининге донорской крови.

Амплификационные методы количественного определения нуклеиновых кислот

Количественное определение нуклеиновых кислот по "конечной точке".

Способы регистрации продуктов амплификации нуклеиновых кислот.

Количественное определение нуклеиновых кислот методом амплификации с регистрацией результатов в режиме реального времени.

Материалы и методы.

Результаты и обсуждение.

Метод мультиплексной qPCR на микрочипе.

Обработка данных кинетики накопления флуоресцентного сигнала.

Выбор оптимальных условий проведения мультиплексной PCR на микрочипе и регистрации продуктов амплификации.

Количественная мультиплексная PCR на микрочипе.

Выбор генетических мишеней для обнаружения вирусных нуклеиновых кислот.

Определение пределов обнаружения вирусных нуклеиновых кислот.

Калибровочные кривые для количественного определения нуклеиновых кислот.

Одновременный количественный анализ нуклеиновых кислот HIV-1, HBV и HCV методом qPCR на микрочипе.

Исследование образцов плазмы крови человека методом мультиплексной qPCR на микрочипе.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Ходаков, Дмитрий Андреевич

Заключение

Разработанный метод количественного определения возбудителей гемотрансмиссивных инфекций на биологическом микрочипе является чувствительным, специфичным инструментом многопараметрического количественного анализа, позволяющим получать воспроизводимые результаты. Его дальнейшее развитие до стадии диагностической тест-системы и последующее её внедрение в клиническую лабораторную диагностику будет способствовать снижению риска передачи возбудителей гемотрансмиссивных инфекций и позволит в кратчайшие сроки определять вирусную нагрузку с целью оценки тяжести протекания заболевания и эффективности применения противовирусной терапии. Предложенный метод также может быть применён для выполнения широкого спектра исследований, связанных с многосторонней идентификацией и количественным определением других генетических мишеней.

Разработан метод мультиплексной PCR на олигонуклеотидном микрочипе с регистрацией результатов амплификации в режиме реального времени с одним флуоресцентным красителем.

Изучено влияние компонентов реакционной смеси, температурно-временных режимов, концентраций иммобилизованных праймеров и размера гелевых ячеек на эффективность протекания qPCR на микрочипе и кинетику накопления флуоресцентных сигналов.

Создан биологический микрочип для одновременного выявления нуклеиновых кислот вирусов гепатитов В, С и иммунодефицита человека 1-го типа методом мультиплексной qPCR.

Разработанный метод применён для одновременного количественного анализа вирусных нуклеиновых кислот в образцах плазмы крови человека. Чувствительность и специфичность системы составили 100% (на выборке из 132 образцов), пределы количественного определения (с вероятностью обнаружения 95%) составили 14, 10 и 15 геном-эквивалентов для HIV-1, HBV и HCV, соответственно.

Благодарности

Выражаю свою глубокую благодарность моему научному руководителю. Владимиру Михайловичу Михайловичу. Я искренне признателен, Дмитрию Грядунову, Максиму Донникову, Сергею Лапе, Ольге Антоновой и Наталье Захаровой за помощь в работе, поддержку, ценные замечания при обсуждении результатов и рукописи диссертации, Сергею Панькову, Эдуарду Яковлевичу Крейндлину - за подготовку микрочипов для проведения экспериментов, Сергею Суржикову и Ирине Гречишниковой за синтез олигонуклеотидов, Александру Сергеевичу Заседателеву за помощь и поддержку.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ходаков, Дмитрий Андреевич, Москва

1. Cotter S,M,. History of transfusion medicine, Adv. Vet. Sci. Comp. Med., 1991,36:1-8.

2. Bihl F., Castelli., Marineóla F., Dodd R.Y., Brander C., Transfusion-transmittedinfections, Journal of Translational Medicine, 2007, 5:25-36.

3. Offergeld R., Ritter S., Hamouda O., The Risk of Transfusion Transmitted1.fections Current Aspects, Transfus. Med. Hemother., 2006, 33:130134.

4. Goodnough L.T., Brecher M.E., Kanter M.H., and Aubuchon J.P. Transfusion

5. Medicine: blood transfusion, N. Engl. J. Med., 1999, 340:438-447.

6. Guertler L.G., Virus safety of human blood, plasma, and derived products, 2002,

7. Thrombosis research 107: 39-45.

8. Kottilil S., Jackson J.O., Polis M.A., Hepatitis B and hepatitis C in HIVinfection, 2005, Indian J. Med. Res., 121: 424-450.

9. Kim E.Y., Stanton J., Korber B.T., Krebs K., Bogdan D., Kunstman K., Wu S.,

10. Phair J.P., Mirkin C.A., Wolinsky S.M., Detection of HIV-1 p24 Gag in plasma by a nanoparticle-based bio-barcode-amplification method, Nanomed., 2008, 3(3):293-303.

11. Meyers A., Chakauya E., Shephard E., Tanzer F.L., Maclean J., Lynch A.,

12. Williamson A.L., Rybicki E.P., Expression of HIV-1 antigens in plants as potential subunit vaccines, BMC Biotechnol, 2008, 23(8):53-68.

13. Curran J.W., Jaffe H.W., Hardy A.M., Morgan W.M., Selik R.M., Dondero T.J.,

14. Epidemiology of HIV Infection and AIDS in the United States, 1988, Science, 239:610-616.

15. Mills E.J., Kelly S., Bradley M., Mollon P., Cooper C., Nachega J.,

16. Antiretroviral effects on HIV-1 RNA, CD4 cell count and progression to

17. AIDS or death: a meta-regression analysis, HIV Med., 2008 9(10):849-57.

18. Barnett D., Walker B., Landay A., Denny T.N., CD4 immunophenotyping in

19. HIV infection, Nat. Rev. Microbiol., 2008, 6(11):S7-15.

20. Jarlais D.C., Semaan S., HIV prevention for injecting drug users: the first 25years and counting, Psychosom. Med., 2008, 70(5):606-611.

21. Sickinger E., Jonas G., Yem A.W., Goller A., Stieler M., Brennan C.,

22. Liu G.J., Wang J.P., Xiao J.C., Zhao Z.W., Zheng Y.T., Preparation andcharacterization of three monoclonal antibodies against HIV-1 p24 capsid protein, Cel.l Mol. Immunol., 2007, 4(3):203-208.

23. Speth C., Bredl S., Hagleitner M., Wild J., Dierich M., Wolf H., Schroeder J.,

24. Wagner R., Demi L., Human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) Pr55gag virus-like particles are potent activators of human monocytes, Virology, 2008, 382(l):46-58.

25. Anzinger J.J., Mezo I., Ji X., Gabali A.M., Thomas L.L., Spear G.T., HIVinfection of mononuclear cells is calcium-dependent, Virus Res., 2006, 122(1-2):183-188.

26. Monath T.P., Heinz F.X., Fields virology, 1996, 3rd ed. Philadelphia:1.ppincott-Raven Publishers.

27. Boonstra A., Woltman A.M., Janssen H.L., Immunology of hepatitis B andhepatitis C virus infections, Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol., 2008, 22(6): 1049-1061.

28. Cui J., Kang X., Dai Z., Prediction of chronic hepatitis B, liver cirrhosis andhepatocellular carcinoma by SELDI-based serum decision tree classification, 2007, J Cancer Res Clin Oncol., 133(11):825-834.

29. Pol S., Mallet V.O., Improving anti-hepatitis C virus therapy, Expert Opin.

30. Biol. Ther., 2006, 6(9):923-933.

31. Ravera G., Bottaro L.C., Franceschini M., Morando A., Polo M., Zare M.,

32. Giacopelli C., Zanardi S., Reliability and diagnostic use of a test for the search of the hepatitis C virus Ag (AgHCV), Hepatogastroenterology, 2006, 53(71):753-756.

33. Kessler H.H., Santner B.I., Umlauft F., Quantitation and genotyping of

34. Hepatitis C virus RNA in sera of hemodialysis and AIDS patients, 1996, Clinical Diagnostic Virology, 5:73-78.

35. Orito E., Mizokami M., Nakano T., Serum hepatitis C virus RNA level as apredictor of subsequent response to interferon-a therapy, 1994, Journal of Medical Virology, 44:410-414.

36. Lee W. Hepatitis B Virus Infection., New England Journal of Medicine, 1997,337:1733-1745.

37. Tajiri H., Tanaka Y., Kagimoto S., Murakami J., Tokuhara D., Mizokami M.,

38. Molecular evidence of father-to-child transmission of hepatitis B virus, J. Med. Virol. 2007. 79(7):922-926.

39. Palumbo E., Hepatitis B genotypes and response to antiviral therapy, Am J.

40. Ther., 2007, 14(3):306-399.

41. Beasley R.P., Hepatitis B virus the major etiology of hepatocellularcarcinoma, Cancer, 1988, 61:1942-1956.

42. Wong D., Cheung A.M., Orourke K., et al., Effect of alpha-interferontreatment in patients with hepatitis B e antigen-positive chronic hepatitis B: a meta-analysis, Annals of Internal Medicine, 1993, 119:312-323.

43. Zuckerman A.J., Lavanchy D., Treatment options for chronic hepatitis:antivirals look promising, British Medical Journal, 1999, 319:799-800.

44. Oua J., Panb J., Nan Lina J.H., Transitional Cell Carcinoma in Dialysis

45. Patients, Eur. Urol., 2000 ,37(l):90-94.

46. Rodriguez-Frias F, Jardi R. Virologic markers of HBV infection, Gastroenterol

47. Hepatol., 2006, 29 (2): 11-19.

48. Brown J.L., Carman W.F. and Thomas H.C., The clinical significance ofmolecular variation within the hepatitis B virus genome, 1992, Hepatology, 15:144-148.

49. Chen L., Liu F, Fan X., Gao J., Chen N., Wong T., Wu J., Wen S.W.,

50. Detection of hepatitis B surface antigen, hepatitis B core antigen, and hepatitis B virus DNA in parotid tissues, Int. J. Infect. Dis., 2009, 13(l):20-23.

51. Jardi R., Rodriguez-Frias F., Schaper M., Giggi E., Tabernero D., Homs M.,

52. Esteban R., Buti M., Analysis of hepatitis B genotype changes in chronic hepatitis B infection: Influence of antiviral therapy, J, Hepatol., 2008, 49(5):695-701.

53. Palumbo E., Lamivudine for chronic hepatitis B: a brief review, Braz. J. Infect.

54. Dis., 2008, 12(5):355-357.

55. Slattery J.P., Franchini G., Gessain A., Genomic evolution, patterns of globaldissemination, and interspecies transmission of human and simian T-cell leukemia/lymphotropic viruses, Genome Res., 1999, 9:525-540.

56. Zunt J.R., Tapia K., Thiede H., Lee R., Hagan H., HTLV-2 infection ininjection drug users in King County, Washington, Scand. J. Infect. Dis., 2006, 38(8):654-663.

57. Yoshida M., Discovery of HTLV-1, the first human retrovirus, its uniqueregulatory mechanisms, and insights into pathogenesis, Oncogene, 2005, 24(39):5931-5937.

58. Burbelo P.D., Meoli E., Leahy H.P., Graham J., Yao K., Oh U., Janik J.E.,

59. Mahieux R., Kashanchi F., Iadarola M.J., Jacobson S., Anti-HTLV antibody profiling reveals an antibody signature for HTLV-I-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP), Retrovirology, 2008, 5:96-102.

60. McGeoch D.J., Rixon F.J., Davison A .J., Topics in herpesvirus genomics andevolution, Virus Res., 2006, 117(1): 90-104.

61. Cheung A., Kieff E., Long internal direct repeat in Epstein-Barr virus DNAs, J.

62. Virol., 1982, 44: 286-294.

63. Norio P., Schildkraut C.L., Plasticity of DNA Replication Initiation in Epstein

64. Barr Virus Episomes, PLoS Biol., 2004, 2(6):el52.

65. Sample J., Young L., Martin B., Chatman T., Kieff E., Rickinson A., Epstein

66. Barr virus types 1 and 2 differ in the EBNA-3A, EBNA-3B, and EBNA-3C genes, J. Virol., 1990, 64: 4084-4092.

67. Amon W., Binne U.K., Bryant H., Jenkins P.J., Karstegl C.E., Farrell P.J.,1.tic cycle gene regulation of Epstein-Barr virus, J. Virol., 2004, 78(24): 13460-13469.

68. Gulley M.L., Tang W., Laboratory assays for Epstein-Barr virus-relateddisease, J. Mol. Diagn., 2008, 10(4):279-292.

69. Baringer J.R., Herpes simplex infections of the nervous system, Neurol. Clin.,2008, 26(3):657-674.

70. Batterson W., Roizman B., Characterization of the herpes simplex virionassociated factor responsible for the induction of genes, J. Virol., 1983, 46:371-377.

71. Brideau A., Enquist L., Tirabassi. R., The role of virion membrane proteinendocytosis in the herpesvirus life cycle, J. Clin. Virol., 2000, 17:69-82.

72. Mossman K.L., Ashkar A.A., Herpesviruses and the innate immune response.

73. Viral Immunol., 2005, 18(2):267-281.

74. Griffiths P.D., Walter S., Cytomegalovirus, Curr. Opin. Infect. Dis., 2005, 183.: 241-245.

75. McDonough S., Spector D., Transcription in human fibroblasts permissivelyinfected by human cytomegalovirus strain AD 169., Virology, 1983, 125:31-46.

76. Pancholi P., Wu F., Della-Latta P., Rapid detection of cytomegalovirusinfection in transplant patients, Expert Rev. Mol. Diagn., 2004, 4(2):231-242.

77. Gratacap-Cavallier B., Bonadona A., Berthier R., Brambilla E., Seigneurin

78. J.M., Lorimier P., A simplified cytomegalovirus pp65 antigenemia assay procedure, J. Clin. Virol., 2003, 28(3):317-322.

79. Limaye A.P., Kirby K.A., Rubenfeld G.D., Leisenring W.M., Bulger E.M.,

80. Neff M.J., Gibran N.S., Huang M.L., Santo Hayes T.K., Corey L., Boeckh M., Cytomegalovirus reactivation in critically ill immunocompetent patients, JAMA, 2008, 300(4):413-422.

81. Maine G.T., Lazzarotto T., Landini M.P., New developments in the diagnosisof maternal and congenital CMV infection, Expert Rev. Mol. Diagn., 2001, 1(1): 19-29.

82. Oskay T., Karademir A., Ertiirk O.I., Association of anticonvulsanthypersensitivity syndrome with Herpesvirus 6, 7., Epilepsy Res., 2006, 70(l):27-40.

83. Levy J.A., Three new human herpesviruses (HHV6, 7, and 8), Lancet, 1997,349(9051):558-563.

84. Schleuning M., Jager G., Holler E., Hill W., Thomssen C., Denzlinger C.,

85. Human parvovirus В19 associated disease in bone marrow transplantation, Infection, 1999, 27:114-117.

86. Rebecca E., Lukehart S., Biological Basis for Syphilis, Clin Microbiol Rev.2006, 19(1):29—49.

87. Greer L., Wendel G.D., Rapid diagnostic methods in sexually transmittedinfections,. Infect. Dis. Clin. North Am., 2008, 22(4):601-617.

88. Ratnam S., The laboratory diagnosis of syphilis, Can. J. Infect. Dis. Med.

89. Microbiol., 2005, 16(1):45-51.

90. Wagner S.J, Transfusion-transmitted bacterial infection: risks, sources andinterventions, Vox Sang, 2004, 86(3): 157-163.

91. Greenwood В., Fidock D., Kyle D., Kappe S., Alonso P., Collins F., Duffy P.,

92. Malaria: progress, perils, and prospects for eradication, The Journal of Clinical Investigation, 2008, 118(4): 1266-1276.

93. Hellstern P., Solvent/detergent-treated plasma: composition, efficacy, andsafety, Curr. Opin. Hematol. 2004, ll(5):346-350.

94. Pelletier J.P., Transue S., Snyder E.L., Pathogen inactivation techniques, Best.

95. Pract. Res. Clin. Haematol., 2006, 19(l):205-242.

96. Приказ Министерства Здравоохранения Российской Федерации от 4августа 2000 № 311 «О мерах по повышению безопасности гемотрансфузий».

97. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М., Теория ипрактика иммуноферментного анализа, М.: Высш. Шк., 1991.

98. Lequin R., Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay

99. ELISA), Clin. Chem., 2005, 51(12):2415-2418.

100. Magi B., Liberatori S., Immunoblotting techniques., Methods Mol. Biol., 2005,295:227-254.

101. Kurien B.T., Scofield R.H., Western blotting, Methods, 2006, 38(4):283-293.

102. Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., Scharf S.J., Higuchi R., Horn,G.T., Mullis

103. K.B., Erlich H.A. Primer-detected enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase, Science, 1988, 239:487-491.

104. Innis MA., PCR protocols: a guide to method and applications, London,1. Academic Press 1990.

105. Berger A., Preiser W., Viral genome quantification as a tool for improvingpatient management: the example of HIV, HBV, HCV and CMV, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2002, 49: 713-721.

106. Allain J,P,. Genomic screening for blood-borne viruses in transfusion settings,

107. Clin. Lab. Haematol., 2000, 22(1): 1-10.

108. Larzul D., Guigue F., Sninsky J.J., Mack D.H., Brechot C., Guesdon J.L.,

109. Detection of hepatitis B virus sequences in serum by using in vitro enzymatic amplification, J. Virol. Methods, 1988, 20(3):227-237.

110. Garson J.A., Ring C., Tuke P., Tedder R.S., Enhanced detection by PCR ofhepatitis C virus RNA, Lancet, 1990, 336(8719):878-879.

111. Compton J., Nucleic Acid Sequence-Based Amplification, Nature, 1991, 350:91.92.

112. Fahy E., Kwoh D.Y., Gingeras T.R., Self-sustained Sequence Replication3SR): An isothermal transcription-based amplification system alternative to PCR. PCR Methods and Applications, 1991, 1: 25-33.

113. Chandra M., Keller S., Gloeckner C., Bornemann B., Marx A., New branched

114. DNA constructs, Chemistry, 2007, 13(12):3558-3564.

115. Tehe A., Maurice C., Hanson D., Borget M., Abiola N., Maran M.,

116. Quantification of HIV-1 p24 by a highly improved ELISA: Analternative to HIV-1 RNA based treatment monitoring, J Clin Virol., 2006, 37(3): 199-205.

117. Rotheram-Borus M.J., Leibowitz A.A., Etzel M.A., Routine, rapid HIV testing,

118. AIDS Educ Prev., 2006, 18(3):273-280.

119. Dohner K., Radtke K., Schmidt S., Sodeik B., Eclipse phase of herpes simplexvirus type 1 infection: Efficient dynein-mediated capsid transport without the small capsid protein VP26, J Virol., 2006,80(16):8211-8224.

120. Murphy G., Parry J. V., Assays for the detection of recent infections withhuman immunodeficiency virus type 1, Eurosurveillance, 2008, 13(36):4-10.

121. Vernet G., Molecular diagnostics in virology, J. Clin. Virol., 2004, 31(4):239247.

122. Lelie P.N., van Drimmelen H.A., Cuypers H.T., Best S.J., Stramer S.L.,

123. Sensitivity of HCV RNA and HIV RNA blood screening assays, Transfusion, 2002, 42(5):527-536.

124. Koppelman M.H., Sjerps M.C., Reesink H.W., Cuypers H.T., Evaluation of

125. COBAS AmpliPrep nucleic acid extraction in conjunction with COB AS AmpliScreen HBV DNA, HCV RNA and HIV-1 RNA amplification and detection, Vox Sang, 2005, 89(4): 193-200.

126. Katsoulidou A., Moschidis Z., Sypsa V., Chini M., Papatheodoridis G.V.,

127. Tassopoulos N.C., Mimidis K., Karafoulidou A., Hatzakis A., Analytical and clinical sensitivity of the Procleix Ultrio HIV-1/HCV/HBV assay in samples with a low viral load, Vox Sang. 2007, 92(1):8-14.

128. Ginocchio C.C., Kemper M., Stellrecht K.A., Witt D.J., Multicenter evaluationof the performance characteristics of the NucliSens HIV-1 QT assay used for quantitation of human immunodeficiency virus type 1 RNA, J. Clin. Microbiol., 2003, 41(l):164-73.

129. Elbeik T., Markowitz N., Nassos P., Kumar U., Beringer S., Haller B., Ng V.,

130. Simultaneous runs of the Bayer VERSANT HIV-1 version 3.0 and HCV bDNA version 3.0 quantitative assays on the system 340 platform provide reliable quantitation and improved work flow, J. Clin. Microbiol., 2004, 42(7):3120-3127.

131. Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P.S., Griffith, R., Simultaneousamplification and detection of specific DNA-sequences, Bio-Technology, 1992,10(4): 413-417.

132. Wittwer C. T., Herrmann M. G., Moss A. A. and Rasmussen R. P., Continuousfluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification, BioTechniques, 1997, 22:134-138.

133. Skeidsvoll J. and Ueland P. M., Analysis of Double-Stranded DNA by

134. Capillary Electrophoresis with Laser-Induced Fluorescence Detection Using the Monomeric Dye SYBR Green I, Anal. Biochem., 1995, 231:359-365.

135. Tseng S. Y., Macool D., Elliott V., Tice G., Jackson R., Barbour M. and

136. Amorese D., An homogeneous fluorescence polymerase chain reaction assay to identify Salmonella, Anal. Biochem., 1997, 245:207-212.

137. Morrison T. B., Weis J. J. and Wittwer C. T., Quantification of low-copytranscripts by continuous SYBR Green I monitoring during amplification, BioTechniques, 1998, 24:954-958.

138. Newton C. R., Graham A., Heptinstall L. E., Powell S. J., Summers C.,

139. Kalsheker N., Smith J. C. and Markham A. F., Analysis of any point mutation in DNA, The amplification refractory mutation system (ARMS), Nucleic Acids Res., 1989, 25: 2503-2516.

140. Gibellini D., Gardini F., Vitone F., Schiavone P., Furlini G., Re M.C.,

141. Simultaneous detection of HCV and HIV-1 by SYBR Green real time multiplex RT-PCR technique in plasma samples, Mol. Cell Probes., 2006, 20: 223-229.

142. Didenko V., DNA Probes Using Fluorescence Resonance Energy Transfer

143. FRET): Designs and Applications, Biotechniques, 2001, 31(5): 11061121.

144. Ranasinghe R.T. and Brown T., Fluorescence based strategies for geneticanalysis, Chem. Commun, 2005, 28(44): 5487 5502.

145. Nazarenko I. A., Bhatnagar S. K. and Hohman R. J., A closed tube format foramplification and detection of DNA based on energy transfer., Nucleic Acids Res., 1997, 25(12): 2516-2521.

146. Nuovo G. J., Hohman R. J., Nardone G. A. and Nazarenko I. A., In Situ

147. Amplification Using Universal Energy Transfer-labeled Primers, J. Histochem. Cytochem., 1999, 47:273-280.

148. Asselbergs F.A., Widmer R., Rapid detection of apoptosis through real-timereverse transcriptase polymerase chain reaction measurement of the small cytoplasmic RNA Yl, Anal Biochem., 2003, 318(2):221-229.

149. Bengra, C., Mifflin, T.E., Khripin, Y., Manunta, P., Williams, S.M., Jose,

150. P.A., and Felder, R.A., Genotyping of essential hypertensionsinglenucleotide polymorphisms by a homogeneous PCR method with universal energy transfer primers, Clin. Chem., 2002, 48:2131-2140.

151. Warden D.R. and Refsum H., Detection of Single-Nucleotide Polymorphismsby PCR with Universal Energy Transfer-Labeled Primers: Application to Folate- and Cobalamin-Related Genes, Clin. Chem., 2005, 51: 17131716.

152. Nazarenko I., Homogeneous detection of nucleic acids using self-quenchedpolymerase chain reaction primers labeled with a single fluorophore (LUX primers), Methods Mol. Biol., 2006, 335:95-114.

153. Kusser W., Use of self-quenched, fluorogenic LUX primers for geneexpression profiling, Methods Mol. Biol., 2006, 335:115-133.

154. Huygens F., Inman-Bamber J., Nimmo G.R., Munckhof W., Schooneveldt J.,

155. Harrison B., McMahon J.A., Giffard P.M., Staphylococcus aureus genotyping using novel real-time PCR formats, J. Clin. Microbiol., 2006, 44(10):3712-3719.

156. KandimallaE.R., Agrawal S., 'Cyclicons' as hybridization-based fluorescentprimer-probes: synthesis, properties and application in real-time PCR, Bioorg. Med. Chem., 2000, 8(8): 1911-1916.

157. Fiandaca M.J., Hyldig-Nielsen J.J., Gildea B.D., Coull J.M., Self-reporting

158. PNA/DNA primers for PCR analysis, Genome Res., 2001, 1(4):609-613.

159. Latorra D., Campbell K., Wolter A., Hurley J.M., Enhanced allele-specific

160. PCR discrimination in SNP genotyping using 3' locked nucleic acid (LNA) primers, Hum. Mutat., 2003, 22(l):79-85.

161. Strerath M., Detmer I., Gaster J., Marx A., Modified oligonucleotides as toolsfor allele-specific amplification, Methods Mol. Biol., 2007, 402:317-328.

162. Holland P.M., Abramson R.D., Watson R., Gelfand D.H., Detection ofspecific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'-3'exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase, Proc. Natl. Acad. Sei. U S A., 1991, 88(16):7276-7280.

163. Letertre C., Perelle S., Dilasser F., Arar K., Fach P., Evaluation of theperformance of LNA and MGB probes in 5'-nuclease PCR assays, Mol. Cell Probes., 2003, 7(6):307-311.

164. Piccirilli J.A., Krauch T., Moroney S.E. and Benner S.A., Enzymaticincorporation of a new base pair into DNA and RNA extends the genetic alphabet, Nature, 1990, 343: 33-37.

165. Moser M.J., Marshall D.J., Grenier J.K., Kieffer C.D., Exploiting the

166. Enzymatic Recognition of an Unnatural Base Pair to Develop a Universal Genetic Analysis System, Clin. Chem., 2003, 49:407-414.

167. Moser M.J. and Prudent J.R., Enzymatic repair of an expanded geneticinformation system, Nucleic Acids Research, 2003, 31(17): 5048-5053.

168. Krenke B.E., Nassif N., Sprecher C.J., Knox C., Schwandt M., Storts D.R.,

169. Developmental validation of a real-time PCR assay for the simultaneous quantification of total human and male DNA, Genetics, 2008, 3(1): 14-21.

170. Atallah Z. K., Bae J., Jansky S. H., Rouse D. I., and Stevenson W. R.,

171. Multiplex Real-Time Quantitative PCR to Detect and Quantify Verticillium dahliae Colonization in Potato Lines that Differ in Response to Verticillium Wilt, Phytopathology, 2007, 97(7): 865-872.

172. Moser M.J., Christensen D.R., Norwood D. and Prudent J.R., Multiplexed

173. Detection of Anthrax-Related Toxin Genes, J. Mol. Diagn., 2006, 8(1): 89-96.

174. Marras S.A., Tyagi S., Kramer F.R., Real-time assays with molecular beaconsand other fluorescent nucleic acid hybridization probes, Clin. Chim. Acta., 2006, 363(l-2):48-60.

175. Escaja N., Gómez-Pinto I., Rico M., Pedroso E., González C., Structures andstabilities of small DNA dumbbells with Watson-Crick and Hoogsteen base pairs, Chembiochem., 2003, 4(7):623-632.

176. Crey-Desbiolles C., Ahn D.R., Leumann C.J., Molecular beacons with ahomo-DNA stem: improving target selectivity, Nucleic Acids Res., 2005, 33(8):e77.

177. Thelwell N., Millington S., Solinas A., Booth J., Brown T., Mode of actionand application of Scorpion primers to mutation detection, Nucleic Acids Res., 2000, 28(19):3752-3761.

178. Solinas A., Brown L.J., McICeen C., Mellor J.M., Nicol J., Thelwell N.,

179. Brown T., Duplex Scorpion primers in SNP analysis and FRET applications, Nucleic Acids Res., 2001, 29(20):E96.

180. Li Q., Luán G., Guo Q., Liang J., A new class of homogeneous nucleic acidprobes based on specific displacement hybridization, Nucleic Acids Res., 2002, 30(2):E5.

181. Wolff D., Gerritzen A., Comparison of the Roche COBAS Amplicor Monitor,

182. Roche COBAS Ampliprep/COBAS Taqman and Abbott RealTime Testassays for quantification of hepatitis C virus and HIV RNA, Clin. Chem. Lab. Med., 2007, 45(7):917-922

183. Gueudin M., Plantier J.C., Lemee V., Schmitt M.P., Chartier L., Bourlet T.,

184. Ruffault A., Damond F., Vray M., Simon F., Evaluation of the Roche Cobas TaqMan and Abbott RealTime extraction-quantification systems for HIV-1 subtypes, J. Acquir. Immune. Defic. Syndr., 2007, 44(5):500-505.

185. Sarrazin C., Dragan A., Gärtner B.C., Forman M.S., Traver S., Zeuzem S.,

186. Valsamakis A., Evaluation of an automated, highly sensitive, real-time PCR-based assay (COBAS Ampliprep/COBAS TaqMan) for quantification of HCV RNA, J. Clin. Virol., 2008, 43(2): 162-168.

187. Romano J.W., van Gemen B., Kievits T., NASBA: a novel, isothermaldetection technology for qualitative and quantitative HIV-1 RNA measurements, Clin. Lab. Med., 1996, 6(1):89-103.

188. Deiman B., Jay C., Zintilini C., Vermeer S., van Strijp D., Venema F., Van de

189. Wiel P., Efficient amplification with NASBA of hepatitis B virus, herpes simplex virus and methicillin resistant Staphylococcus aureus DNA, J. Virol. Methods., 2008, 51(2):283-293.

190. Yates S., Penning M., Goudsmit J., Frantzen I., van de Weijer B., van Strijp

191. D., van Gemen B., Quantitative detection of hepatitis B virus DNA by real-time nucleic acid sequence-based amplification with molecular beacon detection, J. Clin. Microbiol., 2001, 39(10):3656-3665.

192. Rubina A.Yu., Pankov S.V., Dementieva E.I., Penkov D.N., Butygin A.V.,

193. Vasiliskov V.A., Chudinov A.V., Mikheikin A.L., Mikhailovich V.M., and Mirzabekov A.D., Hydrogel drop microchips with immobilized DNA: properties and methods for large-scale production, Analytical Biochemistry, 2004, 325:92-106.

194. Finney, D.J., Probit Analysis, 1971, Cambridge University Press, ISBN052108041X, p. 333.

195. Larionov A., Krause A., Miller W., A standard curve based method forrelative real time PCR data Processing, BMC Bio informatics, 2005, 6:6278.

196. Strizhkov B.N., Drobyshev A.L., Mikhailovich V.M., Mirzabekov A.D., PCRamplification on a microarray of gel-immobilized oligonucleotides: detection of bacterial toxin- and drug-resistant genes and their mutations. Biotechniques, 2000, 29(4):844-854.